DE60221724T2

DE60221724T2 - Anti-HIV Substanz

Info

Publication number: DE60221724T2
Application number: DE60221724T
Authority: DE
Inventors: Manabu Ashiya-shi Wada; Naokou Ashiya-shi Wada
Original assignee: JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2001-02-20
Filing date: 2002-02-15
Publication date: 2008-06-05
Anticipated expiration: 2022-02-16
Also published as: AU784414B2; JP4034530B2; JP2002356442A; US20070190077A1; CN100479857C; US20020193304A1; DE60221724D1; US20100135989A1; KR20020068299A; CN1371747A; KR100858862B1; BR0200495A; EP1232755A2; EP1232755A3; EP1232755B1; AU1558902A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screening nach Anti-HIV-Mitteln und die Verwendung bestimmter Ligandenmoleküle, die an CD87 binden, zur Herstellung von pharmazeutischen Mitteln zum Hemmen der Reproduktion von HIV in einem Individuum, das mit dem Virus infiziert ist.
Hintergrund der Erfindung
HIV, das Virus, das das erworbene Immundefektsyndrom (AIDS) verursacht, ist ein RNA-Virus, das zum Lentivirus der Retroviridiae-Familie gehört. Die Infektion und Reproduktion von HIV findet folgendermaßen statt. Zunächst bindet ein Hüllprotein des HIV-Partikels, gp120 (Glycoprotein 120) an die Oberfläche von Zielzellen. Das so gebundene Gp120 und CD4 binden dann an einen Chemokin-Rezeptor (hauptsächlich an CCR5 auf Makrophagen oder CXCR4 auf T-Zellen), der als Co-Rezeptor dient und bilden einen aus gp120, CD4 und dem Chemokin-Rezeptor bestehenden Komplex aus. Anschließend bindet ein anderes Hüllprotein, gp41, an die Plasmamembran der Zielzelle. Dies führt zu einer Fusion des Hüllproteins mit der Zellmembran und der Kern des Virus dringt dabei in die Zelle ein. Wenn das HIV einmal in der Zelle ist, wird es ausgepackt und eine doppelsträngige Provirus-DNA wird unter Verwenden des RNA-Genoms als Templat mit Hilfe der ReversenTranskriptase, die durch das Virus eingebracht wurde, synthetisiert. Die Provirus-DNA wird dann mit Hilfe der Integrase, einem ebenfalls viralen Enzym, in die chromosomale DNA der Wirtszelle integriert. Unter Verwenden der LTR (lange terminale Wiederholung, long terminal repeat) am 5'-Ende des Provirus als Promotor ergibt die Transkription des eingeschlossenen Provirus virale mRNA. In diesem Prozess werden verschiedene mRNAs mit unterschiedlicher Länge erzeugt, die in zwei Gruppen, d.h. mRNAs für die Synthese viraler Proteine und eine, die als virale genomische RNA verwendet wird, eingeteilt werden. Die viralen Proteine schließen beispielsweise Strukturproteine für die Ausbildung von Viruspartikeln und Proteine zur Beschleunigung der Replikation des Virus ein. Beispielsweise bindet ein virales Protein Tat an die 5'-LTR-Region des Provirus, das in das Wirtsgenom eingebaut ist, und erhöht dadurch die Produktion viraler RNA-Transkripte um das Hundertfache. Zum anderen verbinden sich die Strukturproteine zur Ausbildung der Viruspartikel mit der viralen, genomischen RNA innerhalb der Zelle, in der Nähe der Zellmembran, um die Viruspartikel zusammenzubauen. Die so zusammengebauten Partikel werden dann durch Knospung aus der Zelle freigesetzt. Die Mechanismen des Zusammenbauens und Knospens sind derzeit nicht allgemein bekannt. In den freigesetzten Partikeln wird eine Protease aktiviert, es findet das Prozessieren statt, und hierdurch werden reife infektiöse Viruspartikel erzeugt. Das HIV reproduziert sich schnell durch Wiederholen des gesamten Prozesses, der aus dem Binden an das CD4 auf den Zielzellen, dem Einbauen in die chromosomale DNA des Wirts, der Replikation, dem Knospen und der Reifung besteht. Gleichzeitig mit der Reproduktion des HIV erfolgt die Zerstörung der CD4-positiven Zellen des Wirts. Um damit fertig zu werden, löst der Wirt eine schnelle Vermehrung frischer CD4-positiver Zellen aus, um so den Verlust auszugleichen. Das dynamische Gleichgewicht, das dadurch bereitgestellt wird, wird mehrere Jahre lang nach der Infektion fortdauern, früher oder später jedoch wird die Versorgung mit CD4-positiven Zellen den Verlust nicht mehr auffangen können, was zu einem vollständigen Zusammenbruch des Immunsystems und dem Auftreten verschiedener Symptome von AIDS führt.
Bei einem Individuum, das mit HIV infiziert ist, laufen verschiedene Immunreaktionen ab, um sich von dem HIV zu befreien. Zum Beispiel werden unter anderem neutralisierende Antikörper gegen die viralen Antigene produziert und die infizierten Zellen durch zytotoxische T-Zellen eliminiert. Es ist auch bekannt, dass einige humorale Faktoren, die von CD8-positiven Zellen produziert werden, eine wichtige Rolle dabei spielen, die Individuen, die mit HIV infiziert sind, in der Zeitspanne zu halten, in der noch keine Symptome zu sehen sind. [Levy, J.A., et al., Immunol. Today, 17:217–224 (1996), Fauci, A.S., Nature, 384:539–534 (1996)]. Von diesen Faktoren wurden bislang Chemokine (RANTES, MIP-α, 1β, SDF-1) und IL-16 identifiziert. Sie stellen jedoch keine ausreichende Grundlage bereit, die dafür erforderlich ist, die von CD8-positiven Zellen stammende anti-HIV-Aktivität vollständig zu erklären, was eine Beteiligung einiger nicht identifizierter HIV unterdrückender Faktoren vermuten lässt.
Chemokine wirken dabei, ein Eindringen des HIV in die Zielzellen (Makrophagen und T-Zellen) zu hemmen. Andererseits liegen jedoch auch Berichte vor, die nahe legen, dass Chemokine die Replikation des HIV in Makrophagen beschleunigen. IL-16 ist dafür bekannt, den Prozess der Transkription des HIV zu unterdrücken, es ist jedoch vermutlich eine sehr hohe Konzentration notwendig, um irgendeine solche Wirkung auszuüben. Obwohl Versuche unternommen wurden, diese Verbindungen als Therapeutika gegen AIDS zu entwickeln, hat keine dieser Verbindungen das Stadium praktischer Anwendungen erreicht. Zum anderen wird erwartet, dass einige der nicht identifizierten anti-HIV-Faktoren den Prozess der Transkription des HIV hemmen. Solange solche Faktoren jedoch unidentifiziert bleiben, bleibt jeder ihrer Wirkmechanismen lediglich reine Spekulation.
Nachstehend sind die Grade der Hemmung der Reproduktion von HIV mit Faktoren, die von Organismen stammen und von denen bis jetzt berichtet wurde, dass sie eine inhibitorische Aktivität auf HIV ausüben, zusammengefasst.

(1) RANTES (MW = 7.851): In einem, in dem PM1-Zellen und ein HIV-1_BaL-Stamm verwendet werden; 5 % bei 0,78 ng/ml (= 0,1 nM), 50 % bei 1,56 ng/ml (= 0,2 nM) und 90 % bei 3,12 ng/ml (= 0,4 nM) [Cocchi, F. et al., Science 270: 1811–1815 (1995)].
(2) MW-1 α (MW = 7.717): In dem gleichen System, wie es oben für RANTES verwendet wird; 0 % bei 3,12 ng/ml, 5 % bei 6,25 ng/ml (= 0,8 nM) und 50 % bei 12,5 ng/ml (= 1,6 nM) [Cocchi, F. et al., supra].
(3) MW-1 β (MW = 7.819): In dem gleichen System, wie es oben für RANTES verwendet wird; 0 % bei 0,78 ng/ml, 5 % bei 1,56 ng/ml (= 0,2 nM), 15 % bei 3,12 ng/ml (= 0,4 nM) und 60 % bei 6,25 ng/ml (= 0,8 nM) [Cocchi, F. et al., supra].
(4) IL-16 (MW = 12.422): 61 % bei 40–70 ng/ml (~ 1 nM) und 76 % bei 400~700 ng/ml (= 10 nM), entsprechend für das Tetramer und 50 % bei 20 μg/ml das Monomer [Baier, M. et al., Nature, 378:563 (1995); Amiel, C. et al., J. Infect. Dis., 179:83–91 (1999)].
(5) MDC (MW = 7.936): 29 % bei 25 ng/ml (= 3,15 nM), 50 % bei 50 ng/ml (= 6,3 nM) und 78 % bei 200 ng/ml (= 25 nM) [Pal, R. et al., Science 278:695–698 (1997)].
(6) SDF-1 (MW = 8.698): 30 % bei 500 ng/ml (= 57,5 nM) und entsprechend 60 % bei 1 μg/ml (= 115 nM), wenn es als Grad der Hemmung des Eindringens des Virus gemessen wird und 80–85 % bei 700 μg/ml (80,5 nM), wenn es als Grad der Hemmung der Reproduktion gemessen wird [Oberlin, E. et al., Nature, 382:833–835 (1996)].

Neuerdings haben Inhibitoren der Reversen Transkriptase (die die Ausbildung von Proviren hemmen) und Protease-Inhibitoren (die die Reifung der Viruspartikel hemmen) praktische Anwendung als Therapeutika gegen AIDS gefunden. Derzeit sind daher sechs auf Nukleosiden basierende Inhibitoren der Reversen Transkriptase, zwei nicht auf Nukleosiden basierende Inhibitoren der Reversen Transkriptase und fünf Protease-Inhibitoren kommerziell erhältlich. Eine Kombinationstherapie aus drei Arzneimitteln (HAART: hochwirksame, antiretrovirale Therapie, highly active antiretroviral therapy), bei der eine Kombination aus drei dieser Arzneimittel (in der Regel zwei Inhibitoren der Reversen Transkriptase und ein Protease-Inhibitor) verwendet wird, wurde verfügbar gemacht, wodurch es möglich wird, die Mengen an Viren im Blut auf unterhalb einer nachweisbaren Grenze zu verringern.
Jedoch ist es nicht einmal mit einer solchen Kombinationstherapie aus drei Arzneimitteln möglich, HIV vollständig aus infizierten Individuen zu entfernen. Um die Entwicklung von AIDS zu verhindern, müssen daher diejenigen Individuen, die mit HIV infiziert sind, ihr Leben lang diese Arzneimittel einnehmen. Um wirksam zu sein, müssen solche Arzneimittel in großen Mengen eingenommen werden, und der Zeitplan der Einnahme jedes dieser Arzneimittel wird starr festgesetzt werden. Es ist manchmal schwierig, diese unter Befolgung des vorgegebenen Zeitplans einzunehmen, wodurch es zu einer schlechten Compliance und verringerten therapeutischen Effekten kommt. Zudem ist es für diese Arzneimittel nicht ungewöhnlich, ernsthafte Nebenwirkungen zu verursachen.
Die WO-A-96/13160 offenbart ein in vitro-Verfahren zum Hemmen der Infektiosität von Humanem Immundefekt-Virus (HIV) in einer Flüssigkeit, die HIV enthalten kann, durch Aussetzen der Flüssigkeit gegen einen Urokinasetyp Plasminogenaktivator mit einer Konzentration und für eine Zeitdauer, die ausreicht, um das HIV in der Flüssigkeit zu inaktivieren. Es wird insbesondere eine anti-HIV-Aktivität von HMW-uPA berichtet, worin das uPA so definiert ist, dass es zumindest die katalytische Domäne der B-Kette enthält. Aus der WO-A-96/13160 kann jedoch nicht abgeleitet werden, dass Aminosäuren der A-Kette als wesentlicher Bestandteil vorhanden sein müssen, um eine anti-HIV-Aktivität zu erreichen.
Zum anderen finden bei HIV ziemlich häufig Mutationen statt. Insbesondere bei einer Behandlung mit nur einem einzigen Arzneimittel wird deshalb innerhalb weniger Monate ein resistenter Stamm des Virus entstehen. Und ein resistenter Virus reproduziert sich schnell, wenn eine Arzneimittelbehandlung unterbrochen wird, wodurch das Arzneimittel unwirksam wird, selbst wenn die gleiche Behandlung wieder aufgenommen wird. Zudem erlangt ein Virus, der gegen ein Arzneimittel resistent wurde, oft eine Resistenz gegen mehrere Arzneimittel, also auch gegen andere anti-HIV-Arzneimittel, die über den gleichen Wirkmechanismus wirken. Es ist daher entscheidend, die Entstehung resistenter HIV zu verhindern, um eine Entwicklung von AIDS zu unterbinden und dieses behandeln zu können. Zu diesem Zweck ist es wichtig, HIV in mehr als einem Stadium seines Lebenszyklus zu unterdrücken. Es werden daher neue Arten von Arzneimitteln notwendig, die die HIV-Reproduktion in einem anderen Stadium als denjenigen, in denen derzeit anti-HIV-Arzneimittel eingesetzt werden, hemmen. In diesem Zusammenhang wird erwartet, dass einige humorale Faktoren, die von CD8-positiven Zellen produziert werden, potentielle Verbindungen für neuartige Therapeutika gegen AIDS darstellen, da solche Faktoren, obwohl ihre Mechanismen unbekannt sind, eine signifikante Rolle beim Unterdrücken der HIV-Reproduktion spielen.
Wenn eine ernsthafte Nebenwirkung oder ein resistenter HIV während einer AIDS-Behandlung auftritt, ist es erforderlich, die zu verabreichenden Arzneimittel zu ändern. Derzeit gibt es jedoch nur eine dürftige Auswahl. Daher besteht der Bedarf nach anti-HIV-Arzneimitteln, die mit einem unterschiedlichen Wirkmechanismus wirken als denjenigen, die bei herkömmlichen Arzneimitteln bekannt sind, um so die Auswahl von Therapeutika gegen AIDS zu erweitern und die Probleme mit resistenten HIV zu vermeiden.
Unter diesen Umständen hat die vorliegende Erfindung die Aufgabe, eine neue Art eines Anti-HIV-Mittels bereitzustellen, das mit einem Wirkmechanismus wirkt, der sich von denjenigen, die bereits klinisch genutzt werden oder in der Entwicklung sind, unterscheidet.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegenden Erfinder isolierten CD8-positive Zellen aus einem Menschen, der mit HIV infiziert ist, und immortalisierten und klonierten diese unter Verwenden von HTLV-1 und reinigten anschließend einen unbekannten Faktor, der anti-HIV-Aktivität in dem Überstand der Zellen zeigte, und untersuchten dessen Struktur und Funktionen. Als Ergebnis hat sich offenbart, dass der Faktor das amino-terminale Fragment (ATF: amino-terminal fagment) des Hochmolekulargewichts-Urokinasetyp Plasminogenaktivators war. Es wurde auch gefunden: (1) dass der Faktor anti-HIV-Aktivität bei einer überraschend niedrigen Konzentration (0,74 ng/ml) zeigte, (2) dass er sowohl bei Makrophagen-tropischen und T-Zell-tropischen Stämmen von HIV wirksam war und (3) dass es wahrscheinlich war, dass der Faktor spätere Stadien als das Stadium der Translation der viralen mRNA in dem Lebenszyklus des HIV, insbesondere die Stadien des Zusammenbauens der Viruspartikel oder das Knospen, unterdrückte. Während ATF die Eigenschaft besitzt, spezifisch an CD87 auf der Oberfläche von Zellen zu binden, wurde unter Verwenden von Urokinase aus dem Urin gesunder Menschen auch gefunden, dass der Hochmolekulargewichts-Urokinasetyp Plasminogenaktivator (HMW-uPA), von dem bekannt ist, dass er einen ATF-Rest an einem Ende seines Moleküls einschließt und ein Ligandenmolekül für CD87 ist, auch eine anti-HIV-Aktivität besaß. Daneben wurde bestätigt, dass ATF, das durch Zersetzen der Urokinase aus dem Urin gesunder Menschen erhalten und ebenso anti-HIV-Aktivität besaß. Zudem wurde gefunden, dass anti-CD87-Antikörper eine ATF-gleiche anti-HIV-Aktivität besaßen und dass die anti-HIV-Aktivität von ATF durch das gleiche Zielmolekül wie dasjenige des anti-CD87-Antikörpers (d.h. CD87) vermittelt wurde. Diese Feststellungen machen klar, dass es möglich ist, die Reproduktion von HIV durch Blockieren von CD87 durch In-Kontakt-Bringen von CD87 auf potentiellen HIV-Wirtszellen mit einem spezifisch bindenden Ligandenmolekül, wie beispielsweise ATF, HMW-uPA oder Fragmenten oder Analoga davon zu unterdrücken.
Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zum Screening, wie es in Anspruch 1 definiert ist, und die Verwendung eines Ligandenmoleküls, das an CD84 bindet, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Unterdrücken der Reproduktion von HIV in einem Menschen, der mit HIV infiziert ist, worin das Ligandenmolekül eines ist, wie es in den Ansprüchen 2 bis 6 definiert ist, gerichtet.
Die vorliegende Erfindung beschreibt daher ein anti-HIV-Mittel, das als Wirkstoff ein Ligandenmolekül, das an CD87 bindet, umfasst. Das Ligandenmolekül kann insoweit ein Fragment des Hochmolekulargewichts-Urokinasetyp Plasminogenaktivators, als dass das Fragment eine spezifische Bindungsaffinität an CD87 besitzt. Des Weiteren können das Ligandenmolekül, das amino-terminale Fragment (ATF) des Hochmolekulargewichts-Urokinasetyp Plasminogenaktivators sowie ein Fragment von ATF mit einer spezifischen Bindungsaffinität an CD87 sein. Andere Beispiele für das Ligandenmolekül schließen einen anti-CD87-Antikörper (monoklonal oder polyklonal) sowie ein Fragment eines anti-CD-87-Antikörpers mit einer spezifischen Bindungsaffinität an CD87 ein.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff ein Ligandenmolekül, das an CD87 bindet, umfasst. Beispiele für solche Ligandenmoleküle sind oben angegeben. Von diesen Ligandenmolekülen sind ATF und Fragmente davon mit spezifischer Bindungsaffinität an CD87 besonders bevorzugt.
Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zum Screening nach einem anti-HIV-Mittel gerichtet, das das voneinander getrennte In-Kontakt-Bringen der zu testenden Verbindungen mit CD87 und das Auswählen einer Verbindung von diesen Verbindungen, die spezifisch an CD87 bindet, umfasst.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ferner ein Verfahren zum Behandeln eines Menschen, der mit HIV infiziert ist, um die Reproduktion von HIV in dem Menschen zu unterdrücken, dass das Verabreichen einer die Reproduktion von HIV unterdrückende Menge eines Ligandenmoleküls, das an CD87 bindet, an den Menschen umfasst. Beispiele für solche Ligandenmoleküle sind oben angegeben.
Die vorliegende Erfindung ist ferner auf die Verwendung eines Ligandenmoleküls, das an CD87 bindet, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Unterdrücken der Reproduktion von HIV in einem Menschen, der mit HIV infiziert ist, gerichtet, wobei das Ligandenmolekül, das an CD87 bindet, ein Fragment oder ein Analogon des Hochmolekulargewichts-Urokinasetyp Plasminogenaktivators ist, wobei das Fragment die Aminosäuren 21 bis 155 der Prepro-Urokinase (sc-uPA) umfasst und nicht über die Aminosäure 178 des sc-uPA hinausgeht. Beispiele für solche Ligandenmoleküle sind oben angegeben.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 veranschaulicht die Primärstrukturen des Urokinasetyp Plasminogenaktivators und ATF.
2 veranschaulicht die Struktur von pSEAP-Basic.
3 veranschaulicht die Struktur von pREP7.
4 veranschaulicht die Struktur von pSBR.
5 veranschaulicht die Struktur von pNL4-3 und die mittels PCR amplifizierte Region.
6 veranschaulicht die Struktur von pSBR-HIV.
7 ist ein Graph, der die anti-HIV-Aktivität der Eluatfraktionen von einer Hydroxyapatit-Säule und die den Fraktionen entsprechende Proteinkonzentration veranschaulicht.
8 ist ein SDS/PAGE-Elektropherogramm der Eluatfraktionen von einer Hydroxyapatit-Säule.
9 ist ein Graph, der die anti-HIV-Aktivität der Eluatfraktionen von einer HiPrep Sephacryl S-100-Säule, die mit einem Quellmaterial aus Urokinase aus humanem Urin beladen wurde, und die den Fraktionen entsprechenden Proteinkonzentrationen veranschaulicht.
10 ist ein SDS/PAGE-Elektropherogramm der Eluatfraktionen von einer HiPrep Sephacryl S-100-Säule, die mit einem Quellmaterial aus Urokinase aus humanem Urin beladen wurde.
11 ist ein Graph der das Ergebnis eines anti-HIV-Aktivitäts-Tests (p17) in einer Co-Kultur (T-Zelllinien) veranschaulicht.
12 ist ein Graph der das Ergebnis eines anti-HIV-Aktivitäts-Tests (p17) in einer Co-Kultur (Makrophagen-Linien) veranschaulicht.
13 ist ein Graph der das Ergebnis eines SEAP-Reporterassays (p17) in der Kultur nicht infizierter Zellen (MC141) veranschaulicht.
14 ist ein Graph der das Ergebnis eines SEAP-Reporterassays in der Kultur nicht infizierter Zellen (CL35) veranschaulicht.
15 ist ein Graph, der das Ergebnis eines Tests einer vorübergehenden Transfektion mit infektiöser HIV-DNA veranschaulicht.
16 ist ein Graph, der das Ergebnis eines Tests mit einer Einzelkultur chronisch infizierter Zellen (U1) veranschaulicht.
17 ist ein Graph, der das Profil der Menge an HIV über die Tage nach einer akuten Infektion veranschaulicht.
18 ist eine Gruppe von Graphen, die getrennt voneinander die Unterdrückung der viralen Reproduktion durch ATF an verschiedenen Tagen nach der Infektion veranschaulichen.
19 ist ein Graph, der die Wirkung von anti-CD87-Antikörpern auf die anti-HIV-Aktivität von ATF in T-Zelllinien veranschaulicht.
20 ist ein Graph, der die Wirkung von anti-CD87-Antikörpern auf die anti-HIV-Aktivität von ATF in Makrophagen-Linien veranschaulicht.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
CD87, eines der CD-Antigene, ist ein Membranprotein ohne eine intrazelluläre Domäne und gehört zu einer GPI-(Glycosylphosphatidylinositol-) Ankertyp-Familie. Es wird auf der Oberfläche von Zellen, wie beispielsweise T-Zellen und Monozyten (einschließlich Makrophagen) exprimiert. Es ist bekannt, dass dieses Protein eine hohe Affinität an Pro-Urokinase sowie an den Hochmolekulargewichts-Urokinasetyp Plasminogenaktivator besitzt und dass es als Rezeptor auf der Oberfläche solcher Zellen, wie beispielsweise T-Zellen und Monozyten, dient. Humanes CD87 wird zunächst in einer Prepro-Form synthetisiert, die aus den Aminosäuren 1 bis 335 besteht, von der der Signalpeptidrest (die Aminosäuren 1 bis 22) und die carboxyl-terminalen Aminosäuren (306 bis 355) während des Prozessablaufs abgeschnitten werden. An den so erzeugten Carboxyl-Terminus (305 Gly) wird ein Glykolipid (GPI) angehängt, durch das das Protein an der Zellmembran befestigt wird. Bei CD87 spielt die N-terminale Domäne 1 (1 bis 92 von CD87) eine Hauptrolle bei der Bindung an Ligandenmoleküle, wie beispielsweise Pro-Urokinase und Hochmolekulargewichts-Urokinasetyp Plasminogenaktivator [Seki et al., Seikagaku, 71(5):350–352 (1999)].
HIV wird in zwei Unterarten, HIV-1 und HIV-2, eingeteilt. Sowohl HIV-1 als auch HIV-2 sind Typen eines Virus, der durch Knospen aus dem Wirt freigesetzt wird und sie sind genetisch gesehen nahezu ununterscheidbar. Sie teilen einen gemeinsamen Lebenszyklus und reproduzieren sich auf die gleiche Weise. Daher besteht in Zusammenhang mit anti-HIV-Arzneimitteln kein Bedarf, diese zu unterscheiden und derzeit werden sie bei der Behandlung mit herkömmlichen anti-HIV-Arzneimitteln generell als äquivalent angesehen. In der vorliegenden Beschreibung schließt der Begriff „HIV" sowohl „HIV-1" als auch „HIV-2" ein, soweit es nicht anders angegeben ist.
Der Hochmolekulargewichts-Urokinasetyp Plasminogenaktivator (HMW-uPA) (1(b); Aminosäuren 21 bis 178 und Aminosäuren 179 bis 431) ist ein Protein, das aus zwei Peptidketten besteht, die durch eine Disulfidbrücke miteinander verbunden sind. Die Ketten, Lang-A und -B, werden durch enzymatische Spaltung (mit Plasmin, Kallikrein, Cathepsin usw.) zwischen den Aminosäuren 178 und 179 der Pro-Urokinase, die durch Entfernen des N-terminalen Signalpeptids (Aminosäuren 1 bis 20) aus einem Einzelkettenprotein, das Prepro-Urokinase (sc-uPA) (1(a); Aminosäuren 1 bis 431) genannt wird, ausgebildet wird, ausgebildet. HMW-uPA schließt eine EGF-gleiche Domäne, eine Kringle-Domäne und eine Urokinaserezeptor (CD87)-Bindungsdomäne ein.
HMW-uPA wird dann in vivo zwischen den Aminosäuren 155 und 156 gespalten, wobei der Niedrigmolekulargewichts-Urokinasetyp Plaminogenaktivator (LMW-uPA) (1(c); Aminosäuren 156 bis 178 und Aminosäuren 179 bis 431) und das amino-terminale Fragment (ATF) (1(d); Aminosäuren 21 bis 155), das keine Plasminogenaktivator-Aktivität besitzt, entstehen. Während der Inkubation in, z.B. phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 8, findet auch eine Spaltung zwischen den Aminosäuren 155 und 156 statt. ATF kann somit durch eine einfache Inkubation von HMW-uPA in einer Pufferlösung (25–37°C) erzeugt werden. Das ATF schließt die vollständige EGF-gleiche Domäne, die vollständige Kringle-Domäne und die vollständige Urokinaserezeptor (CD87)-Bindungsdomäne ein. In dem Sequenzprotokoll sind die für sc-uPA codierende Nukleotidsequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz entsprechend als SEQ ID NO:1 und NO:2 angegeben, In den als SEQ ID NO:1 und NO:2 angegebenen Sequenzen entsprechen die Aminosäuren 1 bis 20 dem Signalpeptid, die Aminosäuren 21 bis 431 Pro-Urokinase, die Aminosäuren 21 bis 431 (mit einer Spaltung zwischen den Aminosäuren 178 und 179) HMW-uPA, die Aminosäuren 21 bis 155 ATF und die Aminosäuren 156 bis 431 (mit einer Spaltung zwischen den Aminosäuren 178 und 179) entsprechend LMW-uPA.
Die Übertragung von HIV zwischen Menschen erfolgt durch Makrophagen-tropische HIV. Nach dem Ablauf einer Zeitspanne nach der Infektion tritt T-Zell-tropisches HIV bei Infizierten auf, was als Faktor angesehen wird, der mit einer schlechten Prognose in Zusammenhang steht. CD87 tritt auf sowohl T-Zellen als auch Makrophagen auf und ATF unterdrückt die Reproduktion von HIV in sowohl mit HIV infizierten T-Zellen als auch Makrophagen, indem es die Freisetzung von HIV aus diesen Zellen unterdrückt. Das bedeutet, dass ATF unabhängig von der verstrichenen Zeitspanne effektiv als anti-HIV-Mittel als anti-HIV-Mittel wirken kann. Daneben ist ATF sogar bei einer sehr geringen Konzentration (0,74 ng/ml) wirksam. Daher wird eine Menge von ATF, die an einen Patienten verabreicht werden soll, kleiner sein als die von herkömmlichen anti-HIV-Arzneimitteln. Dies könnte eine weniger physikalische Belastung für die Patienten erzeugen, die durch die Verabreichung des Mittels verursacht wird. HMW-uPA, das ATF an seinem N-Terminus einschließt, besitzt auch anti-HIV-Aktivität, obwohl diese schwächer ist als die von letzterem, und kann auf die gleiche Weise wie ATF verwendet werden. Wenn es einmal an einem infizierten Patienten verabreicht wurde, zeigt HMW-uPA erwartungsgemäß nicht nur als intaktes Molekül, sondern auch in Form von ATF, das durch Spaltung im Körper erzeugt wird, anti-HIV-Aktivität. Zum anderen ist der anti-CD87-Antikörper, der die Reproduktion von HIV in mit HIV infizierten T-Zellen unterdrückt, zum Unterdrücken der Reproduktion von HIV nach dem Entstehen T-Zell-tropischer HIV nach der Infektion nützlich.
Die nachstehend beschriebenen Ergebnisse geben an, dass ATF, das einer der Wirkstoffe des anti-HIV-Mittels der vorliegenden Erfindung ist, den Lebenszyklus des Virus in späteren Stadien als demjenigen der Translation von viraler mRNA, insbesondere in den Stadien des Zusammenbauens der Viruspartikel oder des Knospens, unterdrückt, was ein zu den Wirkmechanismen, die von anderen anti-HIV-Arzneimitteln bekannt sind, unterschiedlicher Wirkmechanismus ist. ATF beeinflusst nicht das Wachstum von Wirtszellen und zeigt somit keine Anzeichen von Zytotoxizität. Somit wird ATF, das in Kombination mit herkömmlichen anti-HIV-Arzneimitteln verwendet wird, das dynamische Gleichgewicht der Reproduktion von HIV in einem infizierten Patienten in die Richtung zu Gunsten des Letzteren verschieben und es gleichzeitig leichter machen, das Auftreten resistenter Viren und Probleme durch Nebenwirkungen zu vermeiden und daher eine verbesserte Therapie gegen AIDS bereitstellen.
<Natürlich vorkommendes ATF und rekombinantes ATF>
In der vorliegenden Erfindung kann ATF beispielsweise aus dem Urokinasetyp Plasminogenaktivator, der aus dem Urin eines gesunden Menschen erhalten wurde, hergestellt werden [Stoppelli, P.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4939–4943 (1985)]. HMW-uPA wird zum Beispiel für 8 Stunden oder langer in 50 mM Phosphatpuffer, pH 8, der 0,2 M Natriumchlorid enthält, inkubiert und die Reaktionsprodukte werden einer Gelfiltration (z.B. Sephadex G-100) unterzogen. ATF wird durch Auftrennen der Eluatfraktionen, die dem letzten Peak (Peak 3: ATF) in der UV-Absorptionskurve aus den Fraktionen, die den vorausgehenden Peaks, d.h. Peak 1 (HMW-uPA) und Peak 2 (LMW-uPA) entsprechen, erhalten. Eine weitere Reinigung kann durchgeführt werden, indem die ATF enthaltenden Fraktionen einer Ionenaustauschchromatographie (z.B. Mono S HR5/5-Säule 50 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,8, mit einem Natriumchloridgradienten von 0–1,0 M) unterzogen werden.
ATF kann auch als rekombinantes Peptid erzeugt werden, indem eine ATF enthaltende DNA in einen geeigneten Expressionsvektor eingebaut wird und anschließend in geeigneten Wirtszellen (z.B. E. coli-, Hefe- oder Säugerzellen) mit dem Vektor transformiert wird. Da natürlich vorkommendes ATF keine Zuckerketten besitzt, weist ein rekombinantes ATF, das von den Zellen produziert wurde, die unter Verwenden der cDNA, die für natürlich vorkommendes ATF codiert, transformiert wurden, die gleiche Struktur auf und besitzt daher die gleiche Aktivität wie natürlich vorkommendes ATF. Fragmente von ATF HMW-uPA mit der Fähigkeit, spezifisch an CD87 zu binden, können beispielsweise durch partielle Modifikation von ATF oder HMW-uPA, zum Beispiel durch Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten aus einem Terminus ihrer Moleküle, hergestellt werden.
<Verfahren zum Screening nach Ligandenmolekülen>
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Screening nach einem anti-HIV-Mittel, das das voneinander getrennte In-Kontakt-Bringen der zu testenden Verbindungen mit CD87 und das Auswählen einer Verbindung von den Verbindungen, die spezifisch an CD87 bindet, umfasst, kann unter Verwenden von Zellen, die CD87 an ihrer Oberfläche tragen (T-Zellstämme, Makrophagenstämme) durchgeführt werden. Die spezifische Bindung einer getesteten Verbindung an CD87 kann durch Anwenden eines gewünschten, im Stand der Technik zum Nachweis einer spezifischen Bindung von Ligandenmolekülen an ihre Rezeptoren bekannten Verfahrens nachgewiesen werden. Zum Beispiel wird eine Verbindung, die getestet werden soll, mit CD87, das mit rekombinanten Techniken hergestellt wurde, vermischt, inkubiert und anschließend eine Immunpräzipitation mit anti-CD87-Antikörpern unterworfen.
Durch Nachweisen der Co-Präzipitation der Verbindung kann das Auftreten einer spezifischen Bindung bestimmt werden.
Das erfindungsgemäße anti-HIV-Mittel kann denjenigen, die mit HIV infiziert sind, auf parenteralem Weg, wie beispielsweise einer Injektion oder Einimpfung, sowie durch transnasale oder transpulmonale Anwendung verabreicht werden. Wenn das erfindungsgemäße anti-HIV-Mittel in Form einer Injektion zubereitet wird, kann es als eine Zubereitung, die beispielsweise für intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre oder subcutane Injektion geeignet ist, bereitgestellt werden. Für die Injektion kann das anti-HIV-Mittel der vorliegenden Erfindung in Form einer sterilen, wässrigen oder nicht-wässrigen Lösung, Suspension oder Emulsion bereitgestellt werden. Beispiele für wässrige Medien schließen Wasser und wässrige Lösungen aus einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen, inerten, gelösten Substanzen, z.B. Salze, Polysaccharide oder Polyalkohole, ein. Sie können mit pharmazeutisch verträglichen Puffer auf einen pH-Wert innerhalb eines geeigneten Bereichs eingestellt werden. Beispiele für solche Medien schließen eine Lösung von Natriumchlorid, Ringer-Glucose-Lösung, Glucose-Lösung und eine Lactat-Tinger Lösung ein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Um die Stabilität während der Lagerung der Zubereitung zu verbessern, kann diese lyophilisiert werden.
Als nicht wässriges Medium für eine injizierbare Zubereitung kann wie gewünscht jedes beliebige nicht wässrige Medium, das gewöhnlich in parenteralen Anwendungen verwendet wird, beispielsweise Polyalkohole, zum Beispiel Glycerin und Propylenglykol, Polyethylenglykol, Pflanzenöle (z.B. Olivenöl, Sojabohnenöl, Rapsöl), organischer Ether, zum Beispiel Ethyloleat, verwendet werden.
Wenn das erfindungsgemäße anti-HIV-Mittel in Form einer Einimpfung bereitgestellt wird, kann jeder Träger für eine fortwährende Freisetzung verwendet werden, der eine anhaltende Freisetzung des verwendeten CD87-Ligandenmoleküls, wie beispielsweise ATF, etabliert. Es wird bevorzug, einen solchen Träger zu verwenden, der zu einer Verringerung der Häufigkeit und/oder Dosis des verabreichten Ligandenmoleküls, zu einer Vereinfachung der Handhabung und zu einer verbesserten und/oder anhaltenden Wirkung führen würde. Beispiele für solche Träger schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Liposome, Mikrokugeln und Mikrokapseln aus natürlichen oder synthetischen Polymeren. Weitere Beispiele für Träger, die für eine anhaltende und verzögerte Freisetzung in den meisten Umgebungen geeignet sind, schließen Gelatine, Gummiarabikum, Xanthan-Polymer, Polyessigsäure, Polyglycolsäure und Lactat-/Polyglycolat-Copolymer ein.
Eine transnasale oder transpulmonale (Inhalation) Anwendung ist ein besonders wirksamer Weg der Verabreichung, um die Belastung für den Patienten, die von der Verabreichung der Arzneimittel herrührt, zu verringern. Für eine transnasale oder transpulmonale (Inhalation) Anwendung kann das anti-HIV-Mittel der vorliegenden Erfindung in jeder Form, die zum Sprühen und Inhalieren als feine Partikel geeignet ist, wie beispielsweise eine Lösung oder ein Pulver, vorliegen. Beispiele für solche Zubereitungen schließen ein trockenes Pulver, das aus der Mischung eines CD87-Ligandenmoleküls, wie beispielsweise ATF, und einem Träger mit einem Partikeldurchmesser von 10 μm oder weniger besteht, ein. Beispiele für solche Träger, die zu diesem Zweck verwendet werden, schließen Monosaccharide, wie beispielsweise Glucose und Fructose, Disaccharide, wie beispielsweise Lactose, Maltose und Sucrose, Polysaccharide, wie beispielsweise Stärke, Cellulose, Hyaluronsäure, Chitin und Chitosan, Zuckeralkohole, wie beispielsweise Sorbitol und Mannitol, organische Bindemittel, wie beispielsweise Cellulosederivate, z.B. Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Methylcellulose und Hydroxyethylcellulose, sowie Polyvinylpyrrolidon und Polyvinylalkohol, nicht-ionischem oberflächenaktive Stoffe, Proteine, wie beispielsweise Gelatine, Casein, und synthetische Polymere, wie beispielsweise Polyethylenglykol ein. Ein weiteres Beispiel für die Zubereitung einer transnasalen oder transpulmonalen Anwendung ist ein CD87-Ligandenmolekül, z.B. trockenes ATF, das in Fluorkohlenwasserstofftreibgas suspendiert ist.
In der vorliegenden Erfindung beträgt die Wirkstoffdosis des anti-HIV-Mittels pro Körpergewicht eines infizierten Patienten ungefähr 10 μg–10 mg/kg/Tag bei ATF, 10 μg–10 mg/kg/Tag bei HMW-uPA und 10 μg–10 mg/kg/Tag bei einem anti-CD87-Antikörper.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden unter Bezugnahme auf Arbeitsbeispiele ausführlich beschrieben werden. Die vorliegende Erfindung soll durch die Beispiele jedoch nicht eingeschränkt werden.
Nachstehend sind die Materialien und Verfahren angegeben, die zur Reinigung, zur Identifizierung von ATF und zur Bestimmung der anti-HI V-Aktivitt von ATF, HMW-uPA und anti-CD87-Antikörper verwendet wurden.
<Materialien>
1) Plasmide

(i) pNL4-3: Es wurde das Plasmid, das bei NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Katalog-Nr. 114 hinterlegt wurde, verwendet (5). Das ist ein Plasmid, das durch Einbauen von proviraler, genomischer DNA aus HIV-1, die aus dem Genom einer mit HIV-1 infizierten Person isoliert worden war, in den Plasmidvektor pUC18 konstruiert worden war [Adachi, A. et al., J. Virol., 59(2):284–291 (1986)]. Die Transfektion einer Zelle mit diesem Plasmid wird bewirken, dass die Zelle infektiöse HIV-1-Viren produziert
(ii) pSBR-HIV: Das ist ein Plasmid, das durch Einbauen der LTR-Region von pNL4-3 als Promotor in das Grund-Plasmid pSEAP-Basic (CLONTECH, Palo Alto, CA, USA) an einer Position stromaufwärts von dessen Reportergen, d.h. dem Gen der sekretorischen, alkalischen Phosphatase (SEAP), und ferner durch Einbauen eines Hygromycinresistenzgens als Selektionsmarker konstruiert wurde.

Dieses Plasmid wurde nach dem folgenden Verfahren hergestellt:

(a) Verdauen von pSEAP-Basic (2) (CLONTECH) mit NotI und SalI, um einen Bereich (2, angegeben durch den Bogen), einschließlich des SEAP-Gens, herauszuschneiden und Versehen seiner NotI-Stelle mit Hilfe der T4-Polymerase mit glatten Enden,
(b) separat davon, Verdauen von pREP7 (3) (INVITROGEN, 9704CH, Groningen, Niederlande) mit SalI und ClaI, um einen Bereich (3, angegebenen durch den Bogen), einschließlich des Hygromycinresistenzgens (Hygromycin), ColE1 und des Ampicillinresistenzgens (Amp) herauszuschneiden, und Versehen seiner ClaI-Stelle mit Hilfe der T4-Polymerase mit glatten Enden,
(c) Ligieren des oben in (a) erhaltenen Fragments mit dem oben in (b) erhaltenen Fragment, um pSBR (4) zu konstruieren,
(d) PCR-Amplifizieren von HIV-LTR aus pNL4-3 unter Verwenden von Primern mit entsprechend einer angeknüpften Xhol- oder HindIII-Stelle (5) und Verdauen des PCR-Produkt mit XhoI und HindIII, und
(e) Verdauen des oben in (c) erhaltenen pSBR mit HindIII und anschließend Einschleusen des oben in (d) erhaltenen HIV-LTR in das Produkt dieses Verdaus, um pSBR-HIV (6) zu konstruieren.

Nach den obigen Angaben wurde pSBR-HIV als Beispiel eines Typs von Plasmiden, die HIV-LTR als Promotor besaßen und ein Reportergen (in dem Beispiel SEAP) exprimierten, konstruiert. Jedes andere Plasmid, das HIV-LTR als Promotor hat und ein geeignetes Reportergen exprimieren kann, kann konstruiert und in gleicher Weise verwendet werden.
2) Zellen

(i) HUT.78: Es wurden die Zellen, die bei NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Katalog-Nr. 89 hinterlegt worden waren, verwendet. Das ist eine CD4-positive T-Zelllinie, die aus peripherem Blut eines Patienten mit Sézary-Syndrom, einem chronischen Hautlymphom, etabliert worden war. Die Zellen wurden in RPMI1640-Medium, das 10 % FKS (Gibco/BRL) enthielt, kultiviert.
(ii) U937: Es wurden die Zellen, die bei ATCC (American Type Culture Collection), Katalog-Nr. CRL-1593.2 und auch bei National Institute of Health Sciences (Japan), JCRB Katalog-Nr. 9021 hinterlegt worden waren, verwendet. Das ist eine CD4-positive Monoblastenlinie, die aus Aszites eines Patienten mit echtem histiozytischem Lymphom etabliert worden war. Die Zellen wurden in RPMI1640-Medium, das 10 % FKS enthielt, kultiviert.
(iii) TALL-1: Es wurden die Zellen, die bei National Institute of Health Sciences (Japan), JCRB Katalog-Nr. 0086 hinterlegt worden waren, erworben. Das ist eine CD4-positive T-Zelllinie, die aus peripherem Blut eines Patienten mit akuter lymphozytischer Leukämie etabliert worden war. Die Zellen wurden in RPMI1640-Medium, das 10 % FKS enthielt, kultiviert.
(iv) T4/NL4-3: Die Zelllinie wurde durch Transfizieren von TALL-1-Zellen mit pNL4-3 erzeugt. Dies ist eine Zelllinie, die chronisch mit HIV-1 infiziert ist. Die Zellen wurden in RPMI1640-Medium, das 10 % FKS und 5 μM AZT enthielt, kultiviert.
(v) U1: Es wurden die Zellen, die bei NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Katalog-Nr. 165 hinterlegt worden waren, verwendet. Das ist eine Zelllinie, die chronisch mit Makrophagen-tropischen HIV-1 infiziert ist, die durch Infizieren von U937-Zellen mit einem HIV-1-Stamm, der klinisch aus peripherem Blut einer Person, die mit HIV-1 isoliert worden war, erzeugt wurden [Chen, B.K., et al., J. Virol., 68(2):654–660 (1994)]. Die Zellen wurden in RPMI1640-Medium, das 10 % FKS und 5 μM AZT enthielt, kultiviert.
(vi) Diese Zelllinie wurde durch Einschleusen des HIV-LTR-SEAP-Reportergens in HUT.78-Zellen durch Transfizieren dieser Zellen mit pSBR-HIV erzeugt. Dies ist ein Transfektant, der beständig SEAP exprimiert. Die Zellen wurden in RPMI1640-Medium, das 10 % FKS und 300 μg/ml Hygromycin enthielt, kultiviert.
(vii) CL35: Diese Zelllinie ist ein Transfektant, der beständig SEAP exprimiert und durch Einschleusen des HIV-LTR-SEAP-Reportergens in U937-Zellen durch Transfizieren dieser Zellen mit pSBR-HIV erzeugt wurde. Die Zellen wurden in RPMI1640-Medium, das 10 % FKS und 300 μg/ml Hygromycin enthielt, kultiviert.
(viii) Clone#62: Diese wurden durch zunächst Isolieren von CD8-positiven T-Zellen aus peripherem Blut eines mit HN-1 infizierten japanischen Patienten mit einer lang andauernden, symptomfreien Vorgeschichte, durch positive Selektion unter Verwenden von magnetischen Kügelchen, die mit anti-CD8-Antikörper beschichtet waren, und anschließend Immortalisieren der erhaltenen Zellen durch In-Kontakt-Bringen dieser Zellen mit einer gleichen Anzahl an Zellen einer HTLV-1 produzierenden T-Zelllinie, MT-2 (bestrahlt mit 100 rad) und schließlich, nach 1-monatiger Kultur, Klonieren mit Hilfe limitierender Verdünnung erhalten. Der Überstand der Kultur dieses Klons zeigt eine wirksame SHIF- (löslicher, die Reproduktion von HIV hemmender Faktor, soluble, HIV reproduction inhibiting factor) Aktivität. Die Zellen wurden durch Passagieren in RPMI1640-Medium, das 15 % FKS, 10 Einheiten/ml IL-2 und 10 % mit PMBC (humane, periphere, mononukleäre Blutzellen) konditioniertem Medium enthielt, gehalten.
(ix) PMBC: Diese wurde durch Reinigung eines Leukozytenfilms aus gespendetem Blut unter Verwenden von Ficoll-Plaque (Amersham Pharmacia) erhalten. Vor der Verwendung als konditioniertes Medium, wurde dieses drei Tage lang in RPMI1640-Medium, das 3 μg/ml PHA, 1 Einheit/ml IL-2 und 10 % FKS enthielt, und weitere sechs Tage nach dem Austauschen des Mediums gegen das gleiche Medium, jedoch ohne PHA, kultiviert.

<Zubereitung des Überstands einer CD-8-positiven Klonkultur>
Clone#62, der durch Passagieren in RPMI1640-Medium beibehalten wurde, wurde 3 bis 4 Tage lang nach dem Austausch des Mediums gegen PM 1000-Medium (Eiken Kagaku), das 5 % FKS und 10 Einheiten/ml IL-2 enthielt, kultiviert. Eine Hälfte des Mediums wurde gesammelt und die Zellkultur nach Zugabe der gleichen Menge des frischen Mediums fortgesetzt. Der gesammelte Überstand wurde durch 0,22 μm-Filter filtriert, um alle Niederschläge zu entfernen, und bei –80°C gelagert.
<Messung der anti-HIV-Aktivität>
1) Co-Kultur-Test:
In einem Co-Kultur-Test wird eine Zellmischung die aus Zellen aus einer Zelllinie, die chronisch mit HIV infiziert ist, und jenen, einer nicht-infizierten Zelllinie, kultiviert. Dies bietet ein Testsystem an, dass alle Stadien des viralen Lebenszyklus, der die Adsorption des Virus an nicht-infizierte Zellen, die Infektion, die Replikation des Virus in den infizierten Zellen und die Freisetzung der Viruspartikel umfasst, einschließt. Daher kann unter Verwenden eines solchen Co-Kultur-Systems die anti-virale Aktivität einer gegebenen Testverbindung unabhängig von dem Stadium, in welchem die Verbindung wirkt, durch Messen der Menge an Viren, die aus den Zellen freigesetzt wurden, und Vergleichen der gemessenen Werte zwischen den beiden Bedingungen, der An- und Abwesenheit der Testverbindung, nachgewiesen werden. Daneben kann die anti-HIV-Aktivität einer Testverbindung für T-Zell-tropische HIV und entsprechend Makrophagen-tropische HIV durch Verwenden einer Kombination aus T-Zelllinien (HUT.78 und T4/NL4-3) oder Makrophagen-Linien (U1 und U937) als Kombination von chronisch infizierten Zellen und nicht-infizierten Zellen bewertet werden.
Testverfahren: In eine Platte mit 48 Vertiefungen wurden 300 μl einer Probe, die mit PM 1000-Medium und 100 μl RMPI1640-Medium, das 6 ng/ml TNF α und 20 % FKS enthielt, verdünnt worden war, eingebracht. Zu diesen wurden 100 μl HUT.78-Zellen, die mit OPTI-MEM 1-Medium auf 2 × 10⁵ Zellen eingestellt worden waren und 100 μl T4/NL4-3-Zellen, die mit RPMI1640-Medium zu 5 × 10⁴ Zellen/ml suspendiert worden waren (infizierte T4/NL4-3: nicht-infizierten HUT.78 = 1:4) zugegeben und die Mischung drei Tage lang kultiviert. Eine Hälfte des Kulturüberstands wurde dann gegen frisches Medium, das die gleiche Konzentration der Probe enthielt, ausgetauscht und die Kultur drei weitere Tage lang fortgesetzt. Der Überstand der Sechs-Tage-Kultur wurde gesammelt und auf die Menge des Virus (p17) und die Menge an HIV-LTR-Transkript (SEAP) gemessen. Für die Messung wurden ein HIV p17-Antigen-ELISA-Kit (Eiken Kagaku) und ein chemilumineszierendes Kit für einen SEAP-Reportergen-Test (ROCHE) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Zu den Zellen, die sechs Tage lang inkubiert worden waren, wurden 50 μl MTS-Testreagens (wasserlösliches Tetrazoliumsalz) (PROMEGA) gegeben. Die Mischung wurde weitere vier Stunden lang kultiviert, um eine Farbentwicklung zuzulassen und die optische Dichte wurde bei 490 nm gemessen, und soll die Anzahl an lebenden Zellen zu dem Zeitpunkt, an dem die Messungen durchgeführt wurden, wiedergeben.
Auf die gleiche Weise wurde ein andere Co-Kultur-System, das aus U1 (chronisch infizierter Zelllinie) und U937 (nicht-infizierte Zelllinie) (U1:U937 = 1:4) bestand, ebenso dem Test unterzogen.
2) Einzelkultur-Test der chronisch infizierten Zellen:
Um Informationen darüber zu sammeln, in welchem Stadium des HIV-Lebenszyklus HIV von ATF unterdrückt wird, als Grundlage der insgesamt beobachteten anti-HIV-Aktivität von ATF, wurde ATF in einem Einzel-Kultur-System, das aus chronisch infizierten U1-Zellen bestand, auf seine anti-HIV-Aktivität getestet. Da bekannt war, dass in U1-Zellen keine Mehrfachinfektion mit HIV auftreten würde, würde jede in dem Einzelkultur-System der U1-Zellen nachgewiesene anti-HIV-Aktivität einen Beweis dafür erbringen, dass ATF in dem Stadium der Transkription der DNA des HIV-Provirus oder in späteren Stadien wirkt. In eine Platte mit 48 Vertiefungen wurden 300 μl einer Probe, die mit PM 1000-Medium und 200 μl RPMI1640-Medium, das 6 ng/ml TNF α und 15 % FKS enthielt, verdünnt worden war, eingebracht. Zu diesen wurden 100 μl chronisch infizierte Zellen (U1), die mit OPTI- MEM 1-Medium auf 2 × 10⁵ Zellen eingestellt worden waren, gegeben und die Mischung wurde drei Tage lang kultiviert. Eine Hälfte des Kulturüberstands wurde dann gegen frisches Medium, das die gleiche Konzentration der Probe enthielt, ausgetauscht und die Kultur drei weitere Tage lang fortgesetzt. Der Überstand der Sechs-Tage-Kultur wurde gesammelt und auf die Menge des Virus (p17) gemessen.
3) Vorübergehende Transfektion mit infektiöser HIV-DNA:
Es ist möglich, künstlich infektiöse HIV-DNA in das Stadium von dessen Eindringen in den Zellkern einzubringen, indem die virale DNA mit Hilfe von Liposomen mit Gewalt in die Zelle eingeschleust wird. Unter Verwenden dieses Systems ist es möglich, eine gegebene Testverbindung auf die unterdrückende Aktivität in späteren Stadien des HIV-Lebenszyklus als demjenigen des Eindringens in die Wirtszellen zu untersuchen.
Testverfahren: Vier μg infektiöse HIV-1-DNA (pNL4-3) und 10 μl DMRIE-C-Reagens (GIBCO/BRL) wurden miteinander vermischt. Die Mischung wurde zum Transfizieren von 2 × 10⁶ MC141-Zellen verwendet. Vierundzwanzig Stunden später wurden die Zellen gesammelt und ihre Dichte mit OPTI-MEM 1-Medium auf 2 × 10⁵ Zellen/ml eingestellt. In eine Platte mit 48 Vertiefungen wurden 300 μl einer Probe, die mit PM 1000-Medium und 200 μl RPMI1640-Medium, das 6 ng/ml TNF α und 15 % FKS enthielt, verdünnt worden war, eingebracht. Zu diesen wurden 100 μl transfizierte MC141-Zellen (2 × 10⁵ Zellen) und die Mischung drei Tage lang kultiviert. Eine Hälfte des Kulturüberstands wurde dann gegen frisches Medium, das die gleiche Konzentration der Probe enthielt, ausgetauscht und die Kultur vier weitere Tage lang fortgesetzt. Der Überstand wurde acht Tage nach der Transfektion gesammelt und auf die Menge des Virus (p17) und die Menge an HIV-LTR-Transkript (SEAP) gemessen.
4) SEAP-Reporter-Test in nicht-infizierten Zellen:
In nicht mit HIV infizierten Zellen (MC141-Zellen und CL35-Zellen), in die das HIV-LTR-SEAP-Reportengen eingeschleust wurde, löst eine Stimulation mit TNF α eine Aktivierung des HIV-Promotors LTR aus, was zur Expression des Gens der sekretorischen, alkalischen Phosphatase, das stromabwärts von dem Promotor eingebaut ist, führt. Diese Zellen können daher dazu verwendet werden zu untersuchen, ob eine gegebene Testverbindung eine hemmende Aktivität in dem Stadium der Transkription des Provirus in dem HIV-Lebenszyklus bewirkt, ohne dass daran eine wirkliche Reproduktion von HIV beteiligt ist. Der Grad der Aktivität der HIV-LTR-Transkription kann durch Messen der Menge an SEAP in dem Kulturüberstand bestimmt werden.
Testverfahren: In eine Platte mit 96 Vertiefungen wurden 50 μl einer Probe, die mit serum-freiem PM 1000-Medium und 25 μl RMPI1640-Medium, das 6 ng/ml TNF α und 20 % FKS enthielt, verdünnt worden war, eingebracht. Anschließend wurden diese mit 25 μl MC141-Zellen oder CL35-Zellen, die mit OPTI-MEM 1-Medium (GIBCO/BRL) auf eine Dichte von 2 × 10⁵ Zellen/ml zubereitet worden waren, angeimpft. Die Zellen wurden entsprechend mit oder ohne ATF kultiviert und der Überstand der Sechs-Tage-Kultur wurde gesammelt und unter Verwenden des chemilumineszierenden Kits für den SEAP-Reportergen-Test auf die darin enthaltene Menge an SEAP gemessen.
5) Test der hemmenden Aktivität auf die Reproduktion von HIV bei akuter Infektion (Transfektionstest):
Vier μg infektiöse HIV-1-DNA (pNL4-3) und 10 μl DMRIE-C-Regans (GIBCO/BRL) wurden miteinander vermischt und die Mischung wurde dazu verwendet, 2 × 10⁶ HUT.78-Zellen zu transfizieren. Vierundzwanzig Stunden später wurden die Zellen gesammelt, mit OPTI-MEM 1-Medium gewaschen und auf eine Dichte von 2 × 10⁵ Zellen/ml eingestellt. In eine Platte mit 48 Vertiefungen wurden 300 μl PM 1000-Medium, das eine schrittweise verdünnte Probe oder eine Pufferlösung enthielt, und 200 μl RPMI1640-Medium, das 6 ng/ml TNF α und 15 % FKS enthielt, eingebracht. Zu diesen wurden 100 μl der transfizierten HUT.78-Zellen (2 × 10⁵ Zellen/ml) gegeben und die Mischung wurde vier Tage lang kultiviert. Eine Hälfte des Mediums wurde dann gesammelt und gegen frisches Medium, das die gleiche Konzentration der Probe oder des Puffers enthielt, ausgetauscht. Nach der Infektion wurde die Kultur zwölf Tage lang fortgesetzt, während denen alle vier Tage wiederholt Proben genommen und die Hälfte des Mediums ausgetauscht wurde.
Der Test wurde mit Zweifachbestimmung (n = 2) durchgeführt, wobei die Menge an Viren in dem Kulturüberstand unter Verwenden des HIV p17-Antigen-ELISA-Kits (Eiken Kagaku) gemessen wurde.
6) Untersuchung der Wirkung von anti-CD87-Antikörper auf die anti-HIV-Aktivität von ATF
Da bekannt war, dass ATF und HMW-uPA spezifisch an CD87 auf der Zelloberfläche binden, wurde erwartet, dass die anti-HIV-Aktivität, die sowohl bei ATF als auch bei HMW-uPA beobachtet wurde, über ihre Bindung an CD87 vermittelt wurde. Um dies zu bestätigen wurde eine Untersuchung durchgeführt, um zu bestimmen, ob die anti-CD87-Antikörper die anti-HIV-Aktivität von ATF blockieren könnten.
Testverfahren: In eine Platte mit 48 Vertiefungen wurden 300 μl monoklonale anti-CD87-Antikörper, die mit PM1000-Medium (# 3936: AMERICAN DIAGNOSTICA INC.) und 100 μl RPMI1640-Medium, das 6 ng/ml TNF α und 20 % FKS enthielt, verdünnt worden waren, eingebracht. Zu diesen wurden 100 μl MC141-Zellen, die mit OPTI-MEM 1-Medium auf eine Dichte von 2 × 10⁵ Zellen/ml eingestellt worden waren, und 100 μl T4/NL4-3-Zellen, die mit 5 × 10⁴ Zellen/ml in RPMI1640-Medium suspendiert worden waren, gegeben und die Mischung zwei Stunden lang kultiviert (die Endkonzentration des Antikörpers betrug 10 μg/ml). Zwei Stunden später wurden 12 μl einer Probe, die ATF enthielt (die Endkonzentration von ATF betrug annähernd 3,3 ng/ml), zugegeben. Nach dreitägiger Kultur wurde eine Hälfte des Kulturüberstands gegen frisches Medium, das die gleiche Konzentration des Antikörpers und der Probe enthielt, ausgetauscht und die Kultur drei weitere Tage lang fortgesetzt. Der Überstand der Sechs-Tage-Kultur wurde gesammelt und die darin enthaltene Virusmenge (p17) gemessen. Als Kontrollen wurden ähnliche Kulturen unter Verwenden von Medien, die entsprechend weder einen noch beide von dem Antikörper und ATF enthielten, und eines Mediums, das nicht-spezifisches IgG anstelle des anti-CD87-Antikörpers enthielt, durchgeführt.
Auf die gleiche Weise wurde eine Untersuchung mit einem Co-Kultur-System, das aus infizierten U1- und nicht-infizierten CL35-Zellen bestand (U1:CL35 = 1:4), durchgeführt.
<Zubereitung eines Faktors mit anti-HIV-Aktivität>
Der gesamte, unten angegebene Reinigungsprozess wurde bei 4°C durchgeführt, soweit es nicht anders angegeben ist.

1) Zunächst wurde 1 N Salzsäure zu dem Überstand gegeben, um den pH des letzteren auf 2,5 einzustellen, und der Überstand wurde 24 Stunden lang bei 4°C stehen gelassen. Durch diese Behandlung wurden potentielle Risiken einer viralen Infektion ausgeschlossen und das im Überfluss vorhandene Interferon γ wurde inaktiviert. Anschließend wurde 1 N Hydroxidlösung dazugegeben, um den pH der Mischung auf 3,8 einzustellen. Fünfhundert ml des pH-behandelten Kulturüberstands wurden auf eine SP Sepharose High Performance-(AMERSHAM PHARMACIA) Säule (26 mm × 10 cm), die mit 25 mM Acetatpuffer (pH 3,8), der 50 mM Natriumchlorid enthielt, äquillibriert worden war, geladen. Nach Waschen mit 175 ml des gleichen Puffers wurde die Säule mit 175 ml 50 mM HEPES/NaOH- Puffer (pH 7,4) (E1) und anschließend mit 175 ml 50 mM HEPES/NaOH-Puffer (pH 7,4), der 250 mM Natriumchlorid enthielt, (E2) eluiert. Bei jeder Fraktion wurde durch eine NAP-5-Säule der Puffer ausgetauscht und die Fraktion einem Test auf ihre anti-HIV-Aktivität bei einer Konzentration von 50 % unterzogen.
2) Es wurde gefunden, dass die Aktivität in der E2-Fraktion aus der SP Sepharose High Performance-Säule gesammelt war. Zu den beiden Anteilen der E2-Fraktionen (die 11 des Kulturüberstands entsprechen) wurde bis zu einer Erdkonzentration von 500 mM Natriumchlorid gegeben. Die Lösung wurde auf eine Blue Sepharose 6FF-(AMERSHAM PHARMACIA) Säule (26 mm × 10 cm), die mit 50 mM HEPES/NaOH-Puffer (pH 7,4), der 50 mM Natriumchlorid enthielt, äquillibriert worden war, geladen. Nach Waschen mit 175 ml des gleichen Puffers wurde die Säule mit 200 ml 50 mM HEPES/NaOH-Puffer (pH 7,4), der 1,8 mM Natriumchlorid und 0,1 % CHAPS enthielt, (E1) eluiert. Bei der Fraktion wurde durch eine NAP-5-Säule der Puffer ausgetauscht und die Fraktion einem Test auf ihre anti-HIV-Aktivität bei einer Konzentration von 33 % unterzogen.
3) Es wurde gefunden, dass die Aktivität in der E1-Fraktion aus der Blue Sepharose 6FF-Säule gesammelt war. Die Fraktion wurde auf eine HiPreP Butyl 4FF-(AMERSHAM PHARMACIA) Säule (16 mm × 10 cm), die mit 50 mM HEPES/NaOH-Puffer (pH 7,4), der 1,8 mM Natriumchlorid und 0,1 % CHAPS (P) enthielt, äquillibriert worden war, geladen. Nach Waschen mit 50 ml des gleichen Puffers (W) wurde die Säule mit 100 ml von 0,1 CHAPS/Wasser (E) eluiert. Bei der Fraktion wurde durch eine NAP-5-Säule der Puffer ausgetauscht und die Fraktion einem Test auf ihre anti-HIV-Aktivität bei einer Konzentration von 33 % unterzogen.
4) Es wurde gefunden, dass die Aktivität in den nicht adsorbierten Fraktionen (P und W) aus der Butyl Sepharose-Säule gesammelt war. Zu den drei Anteilen der nicht-adsorbierten Fraktionen (die 3 l des Kulturüberstands entsprechen) wurde bis zu einer Endkonzentration von 2 M Natriumchlorid gegeben. Die Lösung wurde auf eine HiPreP Phenyl (HighSub) 6FF-(AMERSHAM PHARMACIA) Säule (16 mm × 10 cm), die mit 50 mM HEPES/NaOH-Puffer (pH 7,4), der 2 M Natriumchlorid und 0,1 % CHAPS (P) enthielt, äquillibriert worden war, geladen. Nach Waschen mit 175 ml des gleichen Puffers wurde die Säule mit 150 ml 50 mM HEPES/NaOH-Puffer (pH 7,4), der 250 mM Natriumchlorid und 0,1 % CHAPS enthielt, (E1) und weiter mit 100 ml 0,1 CHAPS/Wasser (E2) eluiert. Bei den Fraktionen wurde durch eine NAP-5-Säule der Puffer ausgetauscht und die Fraktion einem Test auf ihre anti-HIV-Aktivität bei einer Konzentration von 25 % unterzogen.
5) Es wurde gefunden, dass die Aktivität in der E1-Fraktion gesammelt war. Die Fraktion wurde auf eine Hydroxyapatit-(CHT-2, 20 μm; BioRad) Säule (10 mm × 10 cm), die mit 10 mM HEPES/NaOH-Puffer (pH 7,3), der 0,1 % CHAPS enthielt, äquillibriert worden war, geladen. Nach Waschen mit 50 ml des gleichen Puffers (W) wurde die Säule mit 200 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,3), der 0,1 % CHAPS enthielt, (E200) eluiert. Bei der Fraktion wurde durch eine NAP-5-Säule der Puffer ausgetauscht und die Fraktion einem Test auf ihre anti-HIV-Aktivität bei einer Konzentration von 25 % unterzogen.
6) Es wurde gefunden, dass die Aktivität in der nicht adsorbierten Fraktion (P) von der Hydroxyapatit-Säule gesammelt war. Unter Verwenden einer CentriPlus-10 (MW 10.000 geschnitten) – Ultrafiltrationsmembran (AMICON MILLIPORE) wurde die Fraktion auf das annähernd Vierzigfache eingeengt. Die eingeengte, aktive Fraktion (3,75 ml) wurde auf eine HiPrep Sephacryl S-100 HR-(AMERSHAM PHARMACIA) Säule (16 mm × 60 cm), die mit 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,4), der 0,1 % CHAPS und 5 Glycerin enthielt, äquillibriert worden war, geladen. Die Säule wurde mit 144 ml des gleichen Puffers eluiert und das Eluat wurde in jeweils 2,5 ml gesammelt. Bei den Fraktionen wurde durch eine NAP-5-Säule der Puffer ausgetauscht und die Fraktion einem Test auf ihre anti-HIV-Aktivität bei einer Konzentration von 12,5 % unterzogen.
7) Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt, anschließend zweifach mit 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,4), der 0,1 % CHAPS enthielt, verdünnt und auf eine Resource S-(AMERSHAM PHARMACIA) Säule (0,64 × 3 cm), die mit dem gleichen Puffer äquillibriert worden war, geladen. Nach Waschen mit 10 ml des gleichen Puffers wurde die Säule mit 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,4), der 0,1 % CHAPS enthielt, mit einem Natriumchlorid-Gradienten von 0–500 mM (25 ml insgesamt) eluiert und das Eluat wurde in jeweils 1 ml gesammelt. Die Fraktionen wurden einem Test auf ihre anti-HIV-Aktivität bei einer Konzentration von 2,5 % unterzogen.
8) Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt. Drei Anteile der aktiven Resource 5-Fraktionen (die 9 l des Kulturüberstands entsprechen) wurden 2,5-fach mit 10 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6,35), der 0,1 % CHAPS enthielt, verdünnt und auf eine Hydroxyapatit-(CHT-2, 20 μm; BioRad) Säule (0,5 × 5 cm), die mit dem gleichen Puffer äquillibriert worden war, geladen. Nach Waschen mit 5 ml des gleichen Puffers wurde die Säule mit einem Kaliumphosphat-Gradienten von 10 mM–400 mM (pH 6,35) (insgesamt 25 ml), der 0,1 % CHAPS enthielt, eluiert und das Eluat wurde in jeweils 0,5 ml gesammelt.

Die Fraktionen wurden einem Test auf ihre anti-HIV-Aktivität bei einer Konzentration von 1 % unterzogen.
Bei jeder Fraktion wurde die Bestimmung der anti-viralen Aktivität unter Verwenden von p17-Antigenen, die in dem Kulturüberstand eines Co-Kultur-Systems, das aus einer chronisch mit HIV infizierten Zelllinie und einer nicht-infizierten Zelllinie (1:4) bestand, freigesetzt worden waren, durchgeführt.
In den Fällen, wo die Probenkonzentration 5 % oder mehr betrug, wurde bei der Probe der Puffer durch eine NAP-5-Säule (AMERSHAM PHARMACIA), die mit dem Medium äquillibriert worden war, gegen serum-freies PM1000-Medium ausgetauscht, um jeglichen Einfluss des aus dem Verfahren der Chromatographie stammenden überschüssigen Salzes auszuschließen. Wenn die Probenkonzentrationen kleiner als 5 % war, wurde die Probe direkt aufgeladen und die Fraktionen, die bei einem Blinddurchlauf der Chromatographie erhalten wurden, als Kontrollen verwendet, um jeglichen Einfluss des aus dem Verfahren der Chromatographie stammenden Salzes auszuschließen.
Die Ergebnisse sind in den 7 und 8 gezeigt. In 7 geben entsprechend die ausgefüllten Quadrate die anti-virale Aktivität für die getesteten Fraktionen, die gestrichelte Linie die Kurve der UV-Absorption des Eluats und die ansteigende Linie die Konzentration von Kaliumphosphat, die jeder Fraktion entspricht, wieder. 8 zeigt die SDS/PAGE-Elektrophorese (reduzierende Bedingung) der Fraktionen 8 bis 19. Wie in den 7 und 8 zu sehen ist, wurden die Banden von ungefähr 18 kDa in den Fraktionen nachgewiesen, die anti-HIV-Aktivität zeigen, wie bezüglich der Hemmung der freigesetzten p17 bestimmt wurde.

9) Die aktiven Fraktionen wurde unter Verwenden einer Centricon-10 (MW 10.000 geschnitten) – Ultrafiltrationsmembran (MILLIPORE) um das 15-Fache eingeengt. Zu zwei der eingeengten Anteile der aktiven Fraktionen aus der Hydroxyapatit-Säule (entsprechend 181 des Kulturüberstands) wurde Trifluoressigsäure (TFA) einer Endkonzentration von 0,2 gegeben, und die Mischung auf eine Resource RPC-(AMERSHAM PHARMACIA) Säule (0,64 × 3 cm), die mit 0,2 % Trifluoressigsäure/Wasser äquillibriert worden war, geladen. Nach Waschen mit 5 ml des Puffers wurde die Säule mit 5 ml eines Eluenten mit einem Gradienten von bis zu 0,2 % TFA/30 % Acetonitril, dann mit 15 ml eines Eluenten mit einem Gradienten von bis zu 0,2 % TFA/50 % Acetonitril und letztlich mit 5 ml eines Eluenten mit einem Gradienten von bis zu 0,2 % TFA/100 % Acetonitril eluiert und das Eluat wurde in jeweils 0,5 ml gesammelt. Die Reverse Phase-Säulenchromatographie wurde bei 10°C durchgeführt. Die anti-HIV-Aktivität wurde bei einer Konzentration von 0,2 % bestimmt. Als Ergebnis wurden auch Banden von 18 kDa auf einer SDS/PAGE in den entsprechenden Eluatfraktionen aus dieser Resource RPC-Säule, die anti-HIV-Aktivität zeigten, nachgewiesen.

Die aktiven Fraktionen, die gesammelt und bei reduziertem Druck getrocknet wurden, ergaben 0,9 μg (500 pmol) des 18 kDa-Proteins. Bei einem Aktivitätstest wurde dieses Protein in einem Phosphatpuffer (PBS), der 0,5 BSA und 0,1 % CHAPS enthielt, gelöst. Für die Sequenzierung wurde das Protein in einem SDS-PAGE-Probenpuffer gelöst.
<Aminosäuresequenzierung>
Ein Teil des 18 kDa-Proteins, das oben gereinigt wurde, wurde einer SDS-PAGE, die mit Coomassie Brilliant Blue (CBB) gefärbt wurde, unterzogen und die entsprechenden Banden herausgeschnitten. Das aus dem Gel herausgeschnittene Stück wurde direkt trypsiniert und einer Peptid-Kartierung unterzogen. Drei der erhaltenen Peaks wurden auf einer Sequenziervorrichtung auf ihre Aminosäuresequenz analysiert. Als Ergebnis wurden die folgenden inneren Sequenzen gefunden.

– die Aminosäuresequenzen, die als SEQ ID NO: 3 angegeben sind (Fragment 1)
– die Aminosäuresequenzen, die als SEQ ID NO: 4 angegeben sind (Fragment 2)
– die Aminosäuresequenzen, die als SEQ ID NO: 5 angegeben sind (Fragment 3)

Die Aminosäuresequenzen der Fragmente 1, 2 und 3 passten mit der Sequenz des amino-terminalen Fragments (ATF, auch „lange A-Kette genannt") des Urokinasetyp Plasminogenaktivators zusammen. Die Ergebnisse der Peptid-Kartierung und der Aminosäuresequenzierung ergaben, dass das oben gereinigte Protein ATF war.
<Reinigung von ATF aus Urokinase-Quellmaterial>
In der aktiven Fraktion wurde keine Bande nachgewiesen, die dem Einzelketten-Urokinasetyp Plasminogenaktivator, dem HMW-uPA oder dem LMW-uPA, entsprach. Dies lässt dringend vermuten, dass ATF die anti-HIV-Aktivität zeigte. Die vorliegenden Erfinder haben dann ATF aus Quellmaterial aus Urokinase aus humanem Urin zubereitet und dessen anti-HIV-Aktivität bewertet, wie nachfolgend beschrieben ist.
Ein 4,5 ml-Aliquot des Quellmaterials aus Urokinase aus humanem Urin (JUN-9604) (das annähernd 50.000 Einheiten Urokinase enthielt), das von Seishin Factory of JCR Pharmaceuticals Co. Ltd. hergestellt worden war, wurde auf eine HiPrep Sephacryl S-100-Säule (16 mm × 60 cm), die mit 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,4), der 0,1 % CHAPS und 100 mM Natriumchlorid enthielt, äquillibriert worden war, geladen. Die Säule wurde mit 144 ml des gleichen Puffers eluiert und das Eluat wurde in jeweils 2,5 ml gesammelt. Die Aktivität wurde bei einer Konzentration von 1 % gemessen.
Als Ergebnis der Analyse wurde gefunden, dass das obige Urokinase-Quellmaterial, das HMW-uPA, LMW-uPA und ATF mit Anteilen von ungefähr 9:1:1 umfasste. Von den Fraktionen aus der HiPrep Sephacryl S-100-Sule zeigten diejenigen, die nur ATF (Nr. 27 bis 33) enthielten, eine wirksame anti-HIV-Aktivität (Hemmung der freigesetzten p17) (9 und 10). Dies gibt an, dass ATF eine anti-HIV-Aktivität besaß, wie aus dem vorhergehenden Test erwartet wurde, der mit löslichem, die Reproduktion von HIV unterdrückenden Faktor, der aus dem Überstand von Clone#62 gereinigt worden war, durchgeführt worden war.
Neben der anti-HIV-Aktivität von ATF wurde auch gefunden, dass die Fraktionen, die HMW-uPA (Nr. 15 bis 18) enthielten, ebenfalls anti-HIV-Aktivität (p17) besaßen, obwohl diese schwächer als die von ATF (9 und 10) war.
<Ergebnisse des Tests auf die anti-HIV-Aktivität von ATF in Co-Kultur-Systemen>
Das gereinigte ATF verringerte die enge von p17, das in dem Überstand der Co-Kultur, die aus entweder den T-Zelllinien oder den Makrophagen-Linien bestand, erschien, in Abhängigkeit von der Konzentration. Der Grad der Hemmung bei einer Konzentration von 1,5 ng/ml betrug ungefähr 40 % (11 und 12).
Da die Zugabe von ATF die Proliferationsrate der kultivierten Zellen nicht änderte, im Vergleich zu der Kontrolle (11 und 12), war es klar, dass ATF nicht die Zellproliferation beeinflusste und nicht zytotoxisch war. Diese Erkenntnisse geben an, dass sich die anti-HIV-Aktivität, die bei ATF beobachtet wird, nicht aus einer Art Zytotoxizität ergibt, dass ATF bei sehr kleinen Konzentrationen anti-HIV-Aktivität zeigt und dass ATF im Wesentlichen eine vergleichbare Aktivität gegen sowohl T-Zell-tropische HIV und Makrophagen-tropische HIV zeigt.
<Ergebnisse des SEAP-Reportertests und einer Kultur nicht-infizierter Zellen>
Siehe 13 und 14. In dem SEAP-Reportertest in der Einzelkultur von MC141- und CL35-Zellen beeinflusste ATF nicht die Menge an alkalischer Phosphatase in dem Kulturüberstand von beiden Arten von Zellen (13 und 14). Dies gibt an, dass ATF nicht die Reproduktion von HIV in den Stadien der von HIV-LTR als Promotor geförderten Transkription der Translation, die darauf folgt, hemmt. Bei den beschriebenen Bedingungen wurde auch bestätigt, dass ATF nicht die Proliferationsrate der Zellen beeinflusst (13 und 14).
<Ergebnisse der vorübergehenden Transfektion mit infektiöser HIV-DNA>
Siehe 15. Auch in dem Test unter Verwenden von MC141-Zellen, die vorübergehend mit infektiöser HIV-DNA (pNL4-3), transfiziert sind, unterdrückten 1,5 ng/ml ATF die Freisetzung von HIV-p17 in den Kulturüberstand um ungefähr 60 %. ATF hatte jedoch keine Wirkung auf die Expression von SEAP und damit auf die die Transkription fördernde Aktivität von LTR. Bei keinen der Zellen wurde ein Einfluss auf die Proliferationsrate beobachtet.
Die Tatsache, dass die Freisetzung von p17 durch ATF gehemmt wurde, während das Ausmaß der durch LTR geförderten Transkription nicht durch ATF beeinflusst wurde, gibt an, dass die bei ATF beobachtete anti-HIV-Aktivität nicht aus irgendeiner Hemmung in den Stadien der durch LTR geförderten Transkription, der durch HIV-tat geförderten Transkription oder einer nachfolgenden Translation herrührte und legt nahe, dass die beobachtete anti-HIV-Aktivität das Ergebnis einer Hemmung in etwas späteren Stadien der nachfolgenden Translation, d.h. des Zusammenbauens oder des Knospens des HIV-Partikels war.
<Ergebnisse des Tests mit einer Einzelkultur chronische infizierter Zellen>
Siehe 16. In dem Einzelkultur-Test chronisch infizierter Zellen (U1) hemmten 1,5 ng/ml ATF die Freisetzung des viralen Antigens p17 in den Kulturüberstand um ungefähr 50 %. Intrazelluläres p17 wurde jedoch nicht von ATF beeinflusst. Bei keinen Zellen wurde die Proliferationsrate durch ATF beeinflusst.
Da bekannt ist, dass bei U1-Zellen eine Mehrfachinfektion mit HIV stattfindet, ist die in einer Einzelkultur von U1-Zellen nachweisbare anti-HIV-Aktivität auf diejenige Aktivität begrenzt, die in dem Stadium der Transkription der proviralen DNA oder in späteren Stadien wirkt. Die Unterdrückung der Freisetzung der Viruspartikel (p17) in der Einzelkultur er U1-Zellen durch ATF gibt daher an, dass ATF eine unterdrückende Aktivität auf das Stadium der Transkription der proviralen DNA oder spätere Stadien besitzt. Da ATF zum anderen nicht die Menge an intrazellulärem p17 beeinflusst, ist offensichtlich, dass ATF keines der Stadien von der Transkription der DNA des HIV-Provirus bis zur Translation der HIV-mRNA beeinflusst. Dieses Ergebnis bei dem Einzelkulturtest der chronisch infizierten Zellen ist das gleiche Ergebnis, das bei dem vorstehend aufgeführten vorübergehenden Transfektionstest erhalten wurde. Diese Erkenntnisse lassen dringend vermuten, dass ATF etwas spätere Stadien nach der Translation der HIV-mRNA, d.h. vom Zusammenbauen des HIV-Partikels bis zum Knospen der Viruspartikel, unterdrückt.
<Ergebnis des Tests zur hemmenden Aktivität auf die Reproduktion von HIV bei akuter Infektion (Transfektionstest)>
Siehe 17, die das Profil der Virusmenge über die Tage nach Kulturbeginn veranschaulicht. In der Figur ist zu sehen, dass, in der Kontrollgruppe, die Menge der Viren während der Zeitspanne von dem 8. bis 12. Tag nach Kulturbeginn schnell zunahm. Es wurde ein nur geringer Einfluss durch die verwendeten Puffer festgestellt. Andererseits war die Geschwindigkeit der Reproduktion der Viren bei den ATF-Gruppen deutlich verringert und es wurde gefunden, dass die Unterdrückung der viralen Reproduktion abhängig von den ATF-Konzentrationen war. Zudem nahm die Geschwindigkeit der Unterdrückung der Reproduktion der Viren im Verlauf der Kultivierungstage zu (siehe 18) und zeigt nach 12 Tagen der Infektion entsprechend mehr als 75 % bei 0,74 ng/ml ATF und mehr als 87 % bei 2,22 ng/l ATF.
<Wirkung von anti-CD87-Antikörpern auf die anti-HIV-Aktivität von ATF>
Siehe 19. In dem Co-Kultur-System von T-Zelllinien, T4/NL4-3 und MC141 wurde, unabhängig von dem verwendeten Medium, d.h. einem Medium, das nur 3,3 ng/ml ATF enthielt, oder einem Medium, das sowohl 3,3 ng/ml ATF und 10 μg/ml monoklonalen Antikörper gegen CD87, der der Rezeptor für ATF und HMW-uPA ist, enthielt, eine nahezu gleiche Unterdrückung der Freisetzung von p17 in den Kulturüberstand beobachtet. Zum anderen wurde bei 10 μg/ml anti-CD87-Antikörpern selbst eine anti-HIV-Aktivität gefunden, die größtenteils mit derjenigen von 3,3 ng/ml ATF vergleichbar ist. Da vergleichbare Ausmaße der Unterdrückung der Freisetzung von p17 mit Medien, die anti-CD87-Antikörper oder ATF oder beide enthielten, beobachtet wurden, wird in Betracht gezogen, dass sowohl ATF als auch anti-CD87-Antikörper durch ein gemeinsames Zielmolekül auf der Zelle wirken. Daneben ergab die Kultur, die in der Gegenwart von nicht-spezifischem igG anstelle des anti-CD87-Antikörpers durchgeführt wurde, das gleiche Ergebnis wie das, das in einer Kultur ohne jeglichen Antikörper erhalten wurde. Diese Feststellung gibt an, dass die beobachtete anti-HIV-Aktivität des anti-CD87-Antikörpers von dessen Spezifität abhängt. Daher wird in Betracht gezogen, dass der Antikörper die Freisetzung des HIV durch spezifisches Binden an CD87 auf der Zelle unterdrückte. Es wird vermutet, dass die Feststellung, dass die Zugabe von ATF zu dem Medium, das anti-CD87-Antikörper enthielt, keine Verstärkung der Unterrückung der Freisetzung von HIV bewirkte, davon herrührt, dass ATF von einer Bindung an CD87, die bereits durch anti-CD87-Antikörper blockiert worden waren, abgehalten wird. Da sowohl die anti-CD87-Antikörper als auch ATF eine anti-HIV-Aktivität (p17) in den T-Zelllinien zeigen und beide Verbindungen sind, die spezifisch an CD87 binden, geben die oben erhaltenen Testergebnisse, was noch wesentlicher ist, an, dass die spezifische Bindung von CD87 an seine Ligandenmoleküle die Unterdrückung der Freisetzung von HIV (in dem Stadium des Zusammenbauens oder Knospens), über einen noch unbekannten Mechanismus in der Zellen, bewirkt.
Zum anderen blockierte die Zugabe von anti-CD87-Antikörpern in dem Co-Kultur-System, das aus den Makrophagen-Linien U1 und U937 (siehe 20) besteht, nahezu vollständig die anti-HIV-Aktivität von ATF. Daneben zeigten die anti-CD87-Antikörper keine anti-HIV-Aktivität in diesen Zelllinien. Diese Ergebnisse unterscheiden sich daher von den oben mit den T-Zelllinien erhaltenen Ergebnissen. Dieser Unterschied kann jedoch wie folgt erklärt werden: aus manchen Gründen zeigten die anti-CD87-Antikörper keine anti-HIV-Aktivität auf Makrophagen und bewirkten einfach eine Blockierung von CD87 und verhinderten dadurch eine Bindung von ATF an CD87 in einer Zellkultur in einem Medium, das sowohl ATF als auch den anti-CD87-Antikörper enthielt. Die vorhergehende Schlussfolgerung, dass ATF die Reproduktion von HIV über die Bindung von CD87 unterdrückt, auch durch die Tatsache gestützt, dass die anti-HIV-Aktivität von ATF durch anti-CD87-Antikörpern in den Makrophagen-Linien blockiert wurde.
CD87 sowie sein Komplex ist auf einer sphingolipid-reichen Zelloberflächenstruktur, die „Lipidfloß" genannt wird, angeordnet [Koshelnic, Y. et al., Thromb. Haemost., 82(2):305–311(1999)], wohingegen berichtet wird, dass das Knospen des HIV selektiv in dem Bereich des Lipidfloßes stattfindet [Nguyen, D.H. et al., J. Virol., 74(7):3264–3272 (2000)]. Daneben ist bekannt, dass Thy-1, das auch in dem Bereich des Lipidfloßes angeordnet ist, selektiv von HIV in dessen Hülle aufgenommen wird [Nguyen, D.H. et al., J. Virol., 74(7):3264–3272 (2000)]. Diese Berichte und die Erkenntnisse aus den Versuchen der vorliegenden Erfinder zusammengenommen lassen einen wahrscheinlichen Mechanismus vermuten, nach dem Ligandenmoleküle an CD87, wie Beispielsweise ATF, das Knospen von HIV durch eine Wirkung, über CD87, auf die Molekülbestandteile des Lipidfloßes hemmen.
<Zubereitung Beispiel 1> Zubereitung für eine intravenöse, subcutane oder intramuskuläre Injektion
Gemäß der folgenden Formel werden die notwendigen Mengen der Bestandteile miteinander vermischt, um eine Lösung auszubilden und die Lösung wird durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,22 μm sterilfiltriert, um so eine angestrebte Zubereitung herzustellen.

ATF 10 mg

Mannitol 50 mg

destilliertes Wasser auf 1 ml
<Zubereitung Beispiel 2> Zubereitung für eine intravenöse, subcutane oder intramuskuläre Injektion
Gemäß der folgenden Formel werden die notwendigen Mengen der Grundbestandteile miteinander vermischt, um eine Lösung auszubilden. Nach der Zugabe von ATF wird die Lösung auf das entsprechende Volumen gebracht und durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,22 μm sterilfiltriert, um so eine angestrebte Zubereitung herzustellen.

ATF 50 mg

Natriumchlorid 8,6 mg

Kaliumchlorid 0,3 mg

Calciumchlorid 0,33 mg

destilliertes Wasser für die Injektion auf 1 ml
<Zubereitung Beispiel 3> Zubereitung für eine intravenöse, subcutane oder intramuskuläre Injektion

Gemäß der folgenden Formel werden die notwendigen Mengen der Grundbestandteile miteinander vermischt, um eine Lösung auszubilden. Nach der Zugabe von ATF wird die Lösung auf das entsprechende Volumen gebracht und durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,22 μm sterilfiltriert, um so eine angestrebte Zubereitung herzustellen.

ATF	50 mg
Natriumchlorid	8,3 mg
Kaliumchlorid	0,3 mg
Calciumchlorid	0,33 mg
Natriumhydrogenphosphat·12H₂O	1,8 mg
1 N Salzsäure	q.s. (pH 7,4)
destilliertes Wasser für die Injektion	auf 1 ml

<Zubereitung Beispiel 4> Zubereitung für eine intravenöse, subcutane oder intramuskuläre Injektion

ATF	50 mg
Natriumchlorid	8,3 mg
Kaliumchlorid	0,3 mg
Calciumchlorid	0,33 mg
Glucose	0,4 mg
Natriumhydrogenphosphat·12H₂O	1,8 mg
1 N Salzsäure	q.s. (pH 7,4)
destilliertes Wasser für die Injektion	auf 1 ml

<Zubereitung Beispiel 5> Zubereitung für eine pulmonale Verabreichung
Gemäß der folgenden Formel werden ATF und Lactose eingewogen und in 120 ml gereinigtem Wasser gelöst, um eine Sprühlösung bereitzustellen und mit einem herkömmlichen Verfahren einer Sprühtrocknung unterworfen, um eine Zubereitung für eine pulmonale Verabreichung auszubilden.

ATF 100 mg

Lactose (Monohydrat) 2900 mg

Gesamt 3000 mg
<Zubereitung Beispiel 6> Zubereitung für eine pulmonale Verabreichung
Gemäß der folgenden Formel werden ATF und Hydroxypropylcellulose eingewogen und in 120 ml gereinigtem Wasser gelöst, um eine Sprühlösung bereitzustellen und mit einem herkömmlichen Verfahren einer Sprühtrocknung unterworfen, um eine Zubereitung für eine pulmonale Verabreichung auszubilden.

ATF 100 mg

Hydroxypropylcellulose 2900 mg

Gesamt 3000 mg
<Zubereitung Beispiel 7> Zubereitung für eine pulmonale Verabreichung
Gemäß der folgenden Formel werden ATF und hydriertes Lecithin eingewogen und in 120 ml gereinigtem Wasser gelöst, um eine Sprühlösung bereitzustellen und mit einem herkömmlichen Verfahren einer Sprühtrocknung unterworfen, um eine Zubereitung für eine pulmonale Verabreichung auszubilden.

ATF 100 mg

Hydriertes Lecithin 2900 mg

Gesamt 3000 mg
<Zubereitung Beispiel 8> Zubereitung für eine pulmonale Verabreichung
Gemäß der folgenden Formel werden ATF, Hydroxypropylcellulose und D-Mannitol eingewogen und in 90 ml gereinigtem Wasser gelöst, um eine Sprühlösung bereitzustellen und mit einem herkömmlichen Verfahren einer Sprühtrocknung unterworfen, um eine Zubereitung für eine pulmonale Verabreichung auszubilden.

ATF 240 mg

Hydriertes Lecithin 129 mg

D-Mannitol 2631 mg

Gesamt 3000 mg
Die vorliegende Erfindung stellt einen neuartigen Typ eines anti-HIV-Mittels bereit, das die Reproduktion von HIV in einem infizierten Patienten durch einen zu den Wirkmechanismen, die bei herkömmlichen Arzneimitteln bekannt sind, unterschiedlichen Wirkmechanismus unterdrückt. Daher dient die vorliegende Erfindung dazu, die Auswahl therapeutischer Mittel gegen AIDS zu erweitern, wobei sowohl die Prophylaxe vor und die Behandlung nach dem Ausbruch der Erkrankung angestrebt wird und dadurch die Wirksamkeit der AIDS-Therapien in Kombination mit herkömmlichen anti-HIV-Arzneimitteln verbessert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Screening nach einem Anti-HIV-Mittel, umfassend das getrennte Inkontaktbringen von Verbindungen, die getestet werden sollen, mit CD87 und Auswählen einer Verbindung, die spezifisch an CD87 bindet, aus den Verbindungen.
Verwendung eines Ligandenmoleküls, das an CD87 bindet, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Unterdrücken der Reproduktion von HIV in einem Menschen, der mit HIV infiziert ist, wobei das Ligandenmolekül, das an CD87 bindet, ein Fragment des Hochmolekulargewichts-Urokinasetyp Plasminogenaktivators ist, wobei das Fragment die Aminosäuren 21 bis 155 der Preprourokinase (sc-uPA) umfasst und nicht über Aminosäure 178 des sc-uPA hinausgeht.
Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei das Ligandenmolekül, das an CD87 bindet, ATF ist.
Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei das Ligandenmolekül, das an CD87 bindet, ein Fragment des ATF ist, wobei das Fragment eine spezifische Bindungsaffinität an CD87 besitzt.
Verwendung eines Ligandenmoleküls, das an CD87 bindet, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Unterdrücken der Reproduktion von HIV in einem Menschen, der mit HIV infiziert ist, wobei das Ligandenmolekül, das an CD87 bindet, ein Anti-CD87-Antikörper ist.
Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei das Ligandenmolekül, das an CD87 bindet, ein Fragment eines Anti-CD87-Antikörpers ist, wobei das Fragment eine spezifische Bindungsaffinität an CD87 besitzt.