DE69828874T2 - Zusammensetzungen und verfahren zur eliminierung unerwünschter zellen - Google Patents

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Description

  • Umfeld der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft die therapeutische Verwendung von Genen, die Syncytiuminduzierende virale Membranglykoproteine kodieren, zur selektiven Beseitigung von unerwünschten Zellen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Virale Membranglykoproteine, die Zellzellfusion vermitteln
  • Umhüllte Viren weisen Spike-Membranglykoproteine zum Anheften an die Oberflächen von Säugerzellen und zum nachfolgenden Auslösen einer Membranfusion auf, was das virale Eindringen in die Zelle ermöglicht. In einigen Viren werden Anheftung und Fusionsauslösung durch ein einzelnes virales Membranglykoprotein vermittelt, aber in anderen Viren werden diese Funktionen durch zwei oder mehr getrennte Glykoproteine bereitgestellt. Manchmal (z.B. Myxoviridae, Togaviridae, Rhabdoviridae) wird der fusionsauslösende Mechanismus nur aktiviert, nachdem das Virus durch Endozytose, bei saurem pH, in die Zielzelle eingedrungen ist.
  • Andere Viren (z.B. Paramyxoviridae, Retroviridae, Herpesviridae, Coronaviridae) können direkt mit der Membran der Zielzelle bei neutralem pH fusionieren und weisen eine damit verbundene Tendenz auf, Membranfusion zwischen infizierten Zielzellen und benachbarten, nicht infizierten Zellen auszulösen. Das sichtbare Ergebnis dieser letztgenannten Tendenz zum Auslösen von Zellzellfusionen ist die Bildung von Zellsyncytien, die bis zu 100 Nuklei enthalten (auch bekannt als Polykaryozyten oder vielkernige Riesenzellen). Die Syncytiumbildung hat den Tod der Zellen, die das Syncytium ausmachen, zur Folge. Virale Membranproteine dieser letzteren Gruppe von Viren sind von besonderem Interesse in der vorliegenden Erfindung.
  • Viren der Paramyxoviridae-Familie weisen eine starke Tendenz zur Syncytiuminduktion auf, die in den meisten Fällen von der Koexpression von zwei homooligomeren viralen Membranglykoproteinen abhängig ist, dem Fusionsprotein (F) und dem viralen Anheftungsprotein (H, HN oder G). Die Koexpression dieser gepaarten Membranglykoproteine in kultivierten Zelllinien wird zur Syncytiuminduktion benötigt, obwohl es Ausnahmen zu dieser Regel gibt, wie SV5, dessen F Protein allein zur Syncytiuminduktion ausreicht. F Proteine werden am Anfang als Polyproteinvorläufer (F0) synthetisiert, die eine Membranfusion nicht auslösen können, bis sie eine Spaltungsaktivierung durchgemacht haben. Die aktivierende Protease spaltet den F0-Vorläufer in eine extravirale F1-Domäne und eine Membran verankerte F2-Domäne, die durch eine Disulfidverbindung kovalent verknüpft bleiben. Die aktivierende Protease ist im Allgemeinen eine Serinprotease, und die Spaltungsaktivierung wird normalerweise durch eine intrazelluläre Protease im Golgi-Kompartment während des Proteintransports an die Zelloberfläche vermittelt. Als Alternative kann, dort wo das Spaltungssignal nicht durch eine Golgi-Protease erkannt wird, die Spaltungsaktivierung durch eine sezernierte Protease (z.B. Trypsin oder Plasmin) an einer extrazellulären Stelle (Ward et al., Virology, 1995, 209, S. 242–249; Paterson et al., J. Virol., 1989, 63, 1293–1301) vermittelt werden, nachdem die Virusabschnürung stattgefunden hat.
  • Die WO 94/25600 betrifft und offenbart rekombinante Antigene des Mumps Virus und deren Verwendung als Impfstoffe. Im Einzelnen offenbart das Dokument ein Experiment, in dem rekombinante Vaccinia Viren zur Impfung von Hamstern verwendet wurden, wobei die rekombinanten Viren ein einzelnes Mumps Virus Polypeptid, wie das F Protein oder HN Protein, exprimieren. Da diese Proteine in Isolation nicht fusogen sind, gibt es keine Offenbarung einer Zusammensetzung, die einen Vektor umfasst, der eine fusogene Kombination von Mumps Virus Polypeptiden exprimiert.
  • Bestimmte Mitglieder der Herpesviridae-Familie sind bekannt für ihre starke Syncytiuminduzierende Aktivität. Tatsächlich weist Varicella-Zoster Virus keinen zellfreien Zustand in Gewebekultur auf und verbreitet sich nahezu ausschließlich durch Induzieren von Zellfusion, Bildung von großen Syncytien, die schließlich den gesamten Zellrasen umfassen. gH ist ein stark fusogenes Glykoprotein, das unter den Herpesviren hoch konserviert ist. Reifung und Membranexpression von gH sind von der Koexpression des viral kodierten Chaperon Proteins gL (Duus et al., Virology, 1995, 210, 429–440) abhängig. Obwohl gH nicht das einzige, fusogene Membranglykoprotein ist, das im Herpesvirusgenom kodiert ist (von gB wurde ebenfalls gezeigt, dass es Syncytiumbildung induziert) wird es für die Expression der Virusinfektiösität (Forrester et al., J. Virol., 1992, 66, 341–348) benötigt.
  • Retroviren verwenden ein einziges homooligomeres Membranglykoprotein zum Anheften und Auslösen der Fusion. Jede Untereinheit des oligomeren Komplexes wird als ein Polyproteinvorläufer synthetisiert, der proteolytisch in einen membranverankerten (TM) und einen extraviralen (SU) Bestandteil gespalten wird, die durch kovalente und nicht kovalente Wechselwirkungen miteinander verbunden bleiben.
  • Die Spaltungsaktivierung des retroviralen Hüllpolypeptidvorläufers wird normalerweise durch eine Golgi-Protease während des Transports an die Zelloberfläche vermittelt. Es gibt inhibitorische (R) Peptide am zytoplasmatischen Teil der TM Untereinheit des Hüllglykoproteins von Maus Leukämie Virus (MLV) und Mason Pfizer Affenvirus (MPMV), die durch viral kodierte Proteinasen gespalten werden, nachdem eine Virusabschnürung stattgefunden hat. Spaltung des R Peptids ist erforderlich, um das fusogene Potenzial dieser Hüllglykoproteine vollständig zu aktivieren, und Mutanten, denen das R Peptid fehlt, zeigen eine stark erhöhte Aktivität in Zellfusionassays (Rein et al., J. Virol., 1994, 68, 1773–1781; Ragheb & Anderson, J. Virol., 1994, 68, 3220–3231; Brody et al., J. Virol., 1994, 68, 4620–4627).
  • Natürlich auftretende MLV Stämme können sich außerdem stark in ihrer Neigung zur Syncytiuminduktion in bestimmten Zelltypen oder Geweben unterscheiden. Eine MLV Variante zeigt eine starke Tendenz, die Bildung von Endothelzellsyncytien in zerebralen Blutgefäßen auszulösen, was zu intrazerebralen Blutungen und neurologischen Erkrankungen führt. Das veränderte Verhalten dieser MLV Variante kann durch Einführen einer einzelnen Punktmutation in das env Gen eines nicht neurovirulenten Stamms von Friend MLV, die eine Tryptophan-zu-Glycin Substitution bei Aminosäureposition 120 in der variablen Region des SU Glykoproteins (Park et al., J. Virol., 1994, 68, 7516–7524) ergibt, reproduziert werden. Auch von HIV Stämmen ist bekannt, dass sie sich stark in ihrer Fähigkeit unterscheiden, die Bildung von T-Zellsyncytien zu induzieren und von diesen Unterschieden ist bekannt, dass sie zu einem großen Teil durch eine Variabilität zwischen den Hüllglykoproteinen von unterschiedlichen Stämmen bestimmt werden.
  • Die Membranglykoproteine von Viren, die normalerweise Fusion bei saurem pH auslösen, fördern die Syncytiumbildung für gewöhnlich nicht. Sie können jedoch unter bestimmten Umständen Zellzellfusion auslösen. Beispielsweise wurden Syncytien beobachtet, wenn Zellen, die Influenza Hämagglutinin oder das G Protein von Vesicular Stomatitis Virus exprimieren, einer Säure ausgesetzt werden (Steinhauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 12873–12878) oder wenn die fusogenen Glykoproteine in einer sehr hohen Dichte exprimiert werden (Yang et al., Hum Gene Ther. 1995, 6, 1203–1213). Zusätzlich können säureausgelöste, fusogene virale Membranglykoproteine mutiert werden, um ihr pH-Optimum zur Fusionsauslösung zu verschieben (Steinhauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 12873–12878).
  • Die Fähigkeit von Pockenviren Zellfusion bei neutralem pH zu bewirken, korreliert stark mit einem Fehlen der HA Bildung (Ichihashi & Dales, Virology, 1971, 46, 533–543). Wildtyp Vaccinia Virus, ein HA positives Orthopockenvirus, bewirkt keine Zellfusion bei neutralem pH, aber kann durch saure pH-Behandlung von infizierten Zellen dazu induziert werden (Gong et al., Virology, 1990, 178, 81–91). Im Gegensatz dazu bewirkt Wildtyp Kaninchen Pockenvirus, dem ein HA Gen fehlt, Zellfusion bei neutralem pH. Inaktivierung der HA oder SPI-3 (Serpin) Gene in HA positiven Orthopockenviren führt jedoch zur Bildung von Syncytien durch Fusion von infizierten Zellen bei neutralem pH (Turner & Moyer, J. Virol., 1992, 66, 2076–2085). Gegenwärtige Beweise weisen darauf hin, dass die SPI-3 und HA Genprodukte über einen gemeinsamen Weg wirken, um die Aktivität der fusionsauslösenden, viralen Glykoproteine des Orthopockenvirus zu kontrollieren, wodurch eine Fusion von Zellen, die mit dem Wildtypvirus infiziert sind, verhindert wird.
  • Die Förderung der Zell-zu-Zellfusion durch ein gegebenes Virus wird stark durch den Typ der infizierten Zelle beeinflusst (Übersichtsartikel in Poste, Adv. Virus Res. 1970, 303–356). Es gibt viele bekannte Beispiele, in denen der gleiche Virusstamm eine ausgedehnte Syncytiumbildung in einem Zelltyp, aber nicht in einem anderen bewirkt, aber gleich gut in beiden Zelltypen repliziert. Von zahlreichen Wirtszellfaktoren ist bekannt, dass sie eine Rolle bei der Bestimmung der Wahrscheinlichkeit spielen, dass ein bestimmtes Paar von Zellen miteinander fusioniert, wenn einer der Fusionspartner einen bestimmten fusogenen Membranglykoproteinkomplex exprimiert. Mitwirkende Faktoren schließen die Expression von geeigneten Prozessierungsproteasen und Membranrezeptoren, die Lipidzusammensetzung der Plasmamembran (Daya et al., Virology, 1988, 163, 276–283) und die Dicke der Glykokcalyx (Poste, Adv. Virus Res. 1970, 303–356), ein.
  • Im Allgemeinen sind etablierte transformierte Zelllinien stärker für die Bildung von Syncytien empfänglich als nicht transformierte Zelllinien oder primäre Zellen. Für polarisierte Epithelzellen wurde gezeigt, dass eine basolaterale Expression von (proteolytisch aktivierten) Sendai Virus Hüllglykoproteinen erforderlich ist, um Zellfusion auszulösen. Wildtyp Sendai Virus F Glykoproteine zielen auf die apikale Domäne der polarisierten MDCK Zellen ab und induzieren keine Zellfusion, auch nicht wenn das F Glykoprotein mit Trypsin aktiviert wird. F Proteinmutanten, die bipolar an den apikalen und basolateralen Domänen abschnüren, sind jedoch in der Lage, Zellfusion von MDCK Zellen zu induzieren, vorausgesetzt, dass das basolateral exprimierte Protein in seiner aktiven Konformation vorliegt (Tashiro et al., Arch. Virol. 1992, 125, 129–139).
  • Ein Fehlen der Syncytiumbildung weist nicht notwendigerweise auf ein Fehlen einer Fusionsaktivität hin. Es gibt verschiedene Herpesviren und Paramyxoviren, die keine Syncytien ergeben, obwohl sie fusionskompetent sind. Manchmal wird der nicht-Syncytium-Phänotyp auf die Membranglykoproteine kartiert, die an der Fusionsauslösung beteiligt sind (Cai et al., J. Virol. 1988, 62, 2596–2604), aber in anderen Fällen wird er auf andere virale Gene kartiert. Die Dichte der Fusionsproteine an der Zelloberfläche ist auch ein wichtiger Entscheidungsfaktor bei der Wahrscheinlichkeit von Zellzellfusion (Gething et al., J. Cell. Biol. 1986, 102, 11–23).
  • Therapeutische Gene zur Gentherapie von Krebs
  • Versuche, menschliche bösartige Erkrankungen durch Gentherapie zu behandeln, sind bis heute unwirksam geblieben, und es gibt einen deutlichen Bedarf für bessere Vektoren und bessere therapeutische Gene. Für eine Gentherapie von Krebs sollte das ideale therapeutische Gen ein Protein kodieren, das die folgenden Eigenschaften aufweist:
    • 1. Hervorrufen eines örtlichen bystander Effekts: d.h. das Protein sollte in der Lage sein, die transduzierte Tumorzelle und seine nicht transduzierten Nachbarn zu töten.
    • 2. Hervorrufen eines systemischen bystander Effekts. Normalerweise bedeutet dies, dass die Behandlung die Wirkung hat, die Immunantwort gegen Tumorantigene oder entfernte Tumorzellen zu verstärken.
    • 3. Selektivität. Es ist wichtig, dass die Behandlung keinen übermäßigen Schaden an normalen (nicht krebsartigen) Wirtsgeweben bewirkt, insbesondere an lebensnotwendigen Organen. Selektivität kann eine innere Eigenschaft des Proteins sein, das durch das therapeutische Gen kodiert wird, und/oder aus seinem Wirkungsmechanismus entstehen. Als Alternative oder zusätzlich kann Selektivität durch zielgerichtete Vektoren erreicht werden, um sicherzustellen, dass das therapeutische Gen nicht an Nichtrielzellen geliefert wird, oder durch die Verwendung eines genregulatorischen Elements (Promoter/Enhancer/Silencer/Locus Kontrollsequenzen), die keine Genexpression in Nichtrielzellen auslösen.
  • Die gegenwärtig favorisierten Klassen von therapeutischen Genen sind:
    • (1) Gene, die Proteine kodieren, welche die Immunogenität von Tumorzellen verstärken. Diese schließen entzündungsauslösende Zytokine, T-Zell Kostimulatoren und fremde MHC-Proteine ein, die einen örtlichen bystander Effekt aufgrund der örtlichen Entzündungsantwort bilden. Die örtliche Entzündungsantwort erzeugt eine zytokinreiche Umgebung, was die Bildung eines systemischen bystander Effekts durch Heranziehen und Aktivieren von tumorspezifischen T-Zellen begünstigt.
    • (2) Gene, die Enzyme kodieren, die eine Tumorzelle empfänglich für ein "Pro-Arzneimittel" machen. Bei einem Thymidin-Kinase Gentransfer gibt es einige Nachweise für einen örtlichen bystander Effekt auf Grund des Transfers von Ganciclovir-Triphosphat (dem aktivierten Arzneimittel) durch Tight Junctions zu benachbarten Tumorzellen. Vielen Tumoren fehlen jedoch die benötigten Tight Junctions und die beobachteten örtlichen, und systemischen bystander Effekte entstehen daher vermutlich aufgrund einer örtlichen Entzündungsantwort auf Zellen, die durch das Pro-Arzneimittel getötet wurden, mit assoziierter Aktivierung von tumorreaktiven T-Zellen.
  • Gene, die technisch veränderte/zielgerichtete, fusogene virale Membranglykoproteine kodieren, können all diese drei Kriterien des räumlichen bystander Effekts, des systemischen bystander Effekts (durch Förderung einer räumlichen Entzündungsantwort, die dabei hilft, die systemische Immunität zu verstärken), und Spezifität erfüllen und sind bessere Kandidaten, als jede der vorher erwähnten Gruppen von therapeutischen Genen, wurden aber bislang noch nicht als therapeutische Gene für eine Gentherapie von Krebs verwendet. Sie haben die Fähigkeit, einen starken räumlichen bystander Effekt zu bewirken, weil sie die Fusion von genmodifizierten Zellen mit umgebenden, nicht transduzierten Zellen induzieren, was den Tod all der Zellen bewirkt, die zusammen fusioniert sind. Sie können auch technisch verändert werden, um ihr Potenzial zum Auslösen einer Zellzellfusion und damit ihre therapeutische Wirksamkeit zu verstärken. Es ist auch möglich, die Spezifität des Zellzellfusionsvorgangs technisch, durch technisches Verändern der fusogenen Proteine zu verändern, um beispielsweise sicherzustellen, dass zirkulierende Tumorzellen, welche die fusogenen Proteine exprimieren, nur mit anderen Tumorzellen fusionieren können und daher normales Wirtsgewebe nicht beschädigen.
  • Therapeutische Gene, die fusogene Membranglykoproteine kodieren
  • Replizierende Viren sind intensiv als onkolytische Mittel für eine experimentelle Krebstherapie (Russell, 1994, Semin. Cancer Biol. 5, 437–443) verwendet worden. Einige der Viren, die verwendet worden sind, sind dafür bekannt, fusogene virale Membranglykoproteine zu kodieren. Beispielsweise wurde eine Gewebskultursuspension von Mumps Viren verwendet, um 90 Patienten mit einer bösartigen Erkrankung im Endstadium durch örtliche Anwendung auf die Tumoroberfläche durch intratumorale, orale, rektale oder intravenöse Animpfung oder durch Inhalation (Asada, 1974, Cancer, 34, 1907–1928), zu behandeln. Die Toxizität war minimal, und in 37 der 90 Patienten verschwand der Tumor oder verringerte sich auf weniger als die Hälfte seiner ursprünglichen Größe. Geringere Antworten wurden in weiteren 42 Patienten beobachtet.
  • Die Tumorzerstörung war einige Tage nach Virusverabreichung maximal und wurde oft von Langzeitunterdrückung des Tumorwachstums, vielleicht aufgrund einer Stimulation der Antitumorimmunität, gefolgt.
  • Andere Viren, die fusogene virale Membranglykoproteine kodieren, die zur Krebstherapie in menschlichen Versuchspersonen oder experimentellen Mausmodellen verwendet wurden, schließen West Nile Virus, Herpes simplex Virus, Russische Ferner Osten Enzephalitis, Newcastle Krankheit Virus, Venezuelanische Pferdeenzephaloymelitis, Tollwut, Vaccinia und Varicella (Russell, 1994, Eur. J. Cancer, 30A, 1165–1171), ein. Die logische Grundlage für diese Studien war, dass viele Viren in neoplastischen Geweben schneller als in nicht transformierten Geweben replizieren und sich verbreiten und daher erwartet werden kann, dass sie mehr Schaden am Tumor als am Wirt bewirken.
  • Es ist möglich, dass die fusogenen Membranglykoproteine der Viren, die für Krebsvirotherapie verwendet wurden, zu den beobachteten therapeutischen Wirkungen beigetragen haben, dadurch dass sie bewirken, dass infizierte Tumorzellen mit ihren nicht infizierten Nachbarn fusionieren. Es ist jedoch früher noch nicht vorgeschlagen worden, dass Gene, die fusogene Membranglykoproteine kodieren, aus ihrem natürlichen Zusammenhang entfernt und in einem Vektorgenom zur Verwendung als eine therapeutische Formulierung zur Gentherapie von Krebs eingesetzt werden sollen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • In einem Aspekt stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in der Gentherapie einer bösartigen Erkrankung bereit, umfassend einen rekombinanten Nukleinsäurevektor in Beimischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei der Vektor die Expression auf einer eukaryotischen Zelloberfläche einer fusogenen Kombination von getrennten paramyxoviralen Glykoproteinen oder eines fusogenen Membranpolypeptids, das von einem einzelnen paramyxoviralen Glykoprotein verschieden ist, steuert.
  • Geeigneterweise steuert der Vektor die Expression eines Polypeptids, das mindestens einen fusogenen Anteil eines viralen fusogenen Membranglykoproteins umfasst (das als FMG abgekürzt werden kann). In einigen Ausführungsformen ist es bevorzugt, dass das Syncytium-induzierende Polypeptid in der Lage ist, eine Syncytiumbildung bei im Wesentlichen neutralem pH (d.h. pH 6–8) zu induzieren. Viele geeignete FMGs werden dem Fachmann bekannt sein, und einige sind in dem Kapitel dieser Anmeldung mit dem Titel "Hintergrund der Erfindung" aufgelistet. Ein Syncytium kann für die vorliegenden Zwecke als eine Zellzellfusion definiert werden, die in einer Gewebsbiopsie oder einer Gewebskulturprobe als eine vielkernige Region des Zytoplasmas auftritt.
  • Typischerweise wird der Vektor so angepasst sein, dass er das Syncytium-induzierende Polypeptid auf der Oberfläche einer menschlichen Zelle exprimiert, so dass das Polypeptid, wenn richtig exprimiert, bewirken kann, dass die Zelle mit anderen menschlichen Zellen, die das Syncytium-induzierende Polypeptid nicht exprimieren, fusioniert.
  • Es ist bevorzugt, dass dort, wo das Polypeptid ein virales FMG umfasst, das FMG in beträchtlicher Isolation von anderen viralen Bestandteilen exprimiert wird, mit der Ausnahme des Falles, wo diese für die fusogene Aktivität auf Zielzellen notwendig sind (z.B. den "F" und "H" Glykoproteinen der Paramyxoviridae, wobei beide für die Syncytiumbildung erforderlich sind). Die Erfindung stellt daher in einem weiteren Aspekt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, zur Verwendung in der Gentherapie einer bösartigen Erkrankung bereit, umfassend eine Kombination aus ersten und zweiten rekombinanten Nukleinsäurevektoren in Beimischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei die ersten und zweiten Vektoren zusammen die Expression auf einer eukaryotischen Zelloberfläche einer fusogenen Kombination von getrennten paramyxoviralen Glykoproteinen steuert.
  • Zusätzlich wird es häufig wünschenswert sein, das Syncytium-induzierende Polypeptid "technisch zu verändern", um seine Eigenschaften zur therapeutischen Verwendung zu optimieren, so dass der Vektor die Expression eines nicht natürlich auftretenden Polypeptids steuert. In einer bestimmten Ausführungsform wird das FMG mindestens eine fusogene Domäne eines Typ C Retrovirus Hüllproteins umfassen, wie MLV oder GaLV. Ein retrovirales Hüllprotein mit einer Deletion von allen oder fast allen Teilen der zytoplasmischen Domäne kann bevorzugt werden, wie auch das Aufweisen von hyperfusogener Aktivität für menschliche Zellen.
  • Bestimmte Modifikationen können in virale Membranglykoproteine eingeführt werden, um deren Fähigkeit, die Bildung von Syncytien zu induzieren, gründlich zu verstärken. Beispielsweise wurde von der Verkürzung der zytoplasmatischen Domänen einer Reihe von retroviralen und Herpesvirus Glykoproteinen gezeigt, dass sie deren fusogene Aktivität erhöht, manchmal mit einer gleichzeitigen Verringerung in der Effizienz, mit der sie in Viruspartikel eingebaut werden (Rein et al., J. Virol. 1994, 68, 1773–1781, Brody et al., J. Virol. 1994, 68, 4620–4627; Mulligan et al., J. Virol. 1992, 66, 3971–3975; Pique et al., J. Virol. 1993, 67, 557–561; Baghian et al., J. Virol. 1993, 67, 2396–2401; Gage et al., J. Virol. 1993, 67, 2191–2201). Zusätzlich haben TM-Domänen-Austauschexperimente zwischen MLV und HTLV-1 gezeigt, dass Hüllen, die in Zell-zu-Zellassays sehr einfach fusogen sind und auch wirksam in Viruspartikel eingebaut werden, nicht notwendigerweise Virus-zu-Zelle-Fusogenität vermitteln (Denesvre et al., J. Virol. 1996, 70, 4380–4386).
  • Es ist bekannt, dass es durch technische Veränderung von Proteinen möglich ist, neue Bindungsspezifitäten oder Proteaseabhängigkeiten in fusogene virale Membranglykoproteine einzuführen und dadurch ihre fusogenen Aktivitäten auf spezifische Zelltypen abzuzielen, welche die Zielrezeptoren oder spezifische Mikroumgebungen exprimieren, die reich an der entsprechenden, aktivierenden Protease sind (siehe "Protease Zielstrukturen" unten; auch Cosset & Russell, Gene Therapy, 1996, 3, 946–956).
  • Protease Zielstrukturen
  • Es scheint eine große Zahl von Membranproteasen zu geben, die bevorzugt auf den Oberflächen von Tumorzellen exprimiert werden. Sie sind mit einer Reihe von Vorgängen in Zusammenhang gebracht worden, die zum Fortschreiten der Erkrankung und zur Behandlungsresistenz beitragen, wie Invasion, Metastasierung oder Komplementresistenz.
  • Komplementresistenz: die menschliche Melanoma-Zelllinie SK-MEL-170 ist gegenüber komplementvermittelter Lyse resistent. Die molekulare Basis für die Komplementresistenz wurde als eine Membranprotease p65 definiert, die schnell und spezifisch C3b spaltet, das auf der Oberfläche der SK-MEL-170 Zellen abgelagert wird (Ollert et al., Cancer Res 1993, 53, 592–599).
  • Prostata spezifisches Antigen: ejakulierter Samen wird unmittelbar in ein viskoses Gel verwandelt, das sich innerhalb von 20 Minuten verflüssigt. PSA ist eine Kallikrein-ähnliche Serinprotease aus der Prostata, die an diesem Verflüssigungsvorgang durch Spalten von Semenogelin beteiligt ist, dem vorherrschenden Protein im koagulierten Teil des Ejakulats (Lilja et al., J. Clin. Invest. 1987, 80, 281–285). PSA wird ausschließlich durch Epithelzellen der Prostata gebildet und ist ein nützlicher Marker für Prostatakrebs. Von PSA wurde auch gezeigt, dass es IGFBP-3 spaltet, wodurch seine Affinität für den insulinähnlichen Wachstumsfaktor (IGF-1) (Cohen et al., J. Endocrinol. 1994, 142, 407–415) stark verringert wird. Im Plasma zirkulierendes PSA ist inaktiv, weil es an Serpine gebunden ist, aber es wurde postuliert, dass eine örtliche Freisetzung von PSA in den metastasischen Foci von Prostatakrebs zur Freisetzung von IGF-1 durch Spalten von IGFBP-Bindungsprotein 3 führen könnte, wodurch Tumorwachstum verstärkt würde (Cohen et al., J. Endocrinol. 1994 Vol. 142, S. 407–415).
  • Prokoagulierende Proteasen: Ablagerung von Fibrin auf Krebszellen kann sie vor dem Immunsystem schützen, und die Beteiligung von koagulierenden Enzymen bei der Metastasierung wurde vorgeschlagen (Dvorak, Hum. Pathol. 1987, 18, 275–284). Membran assoziierte Prokoagulanzien, die in dieser Hinsicht von Bedeutung sein können, schließen Gewebsfaktor (Edwards et al., Thromb. Haemostasis 1993, 6, 205–213), ein Enzym das Faktor X direkt aktiviert (Gordon & Cross, J. Clin. Invest. 1981, 67, 1665–1671) und eine Protease, die Prothrombin direkt in aktives Thrombin umsetzt (Sekiya et al., J. Biol. Chem. 1994, 269, 32441–32445), ein.
  • Plasminogenaktivierungssystem: Plasmin ist eine Breitband Trypsin-ähnliche Protease, die Fibrin und ECM Proteine, einschließlich Laminin, Thrombospondin und Kollagenen, abbaut und die andere latente Matrix-abbauende Proteasen, wie Kollagenasen aktiviert. Man vermutet, dass die Expression von Proteaseaktivität durch Tumorzellen deren Durchdringung der Basalmembranen, Kapillarwänden und interstitiellen Bindegeweben fördert, was es ihnen ermöglicht, sich auf andere Stellen weiter zu verbreiten und Metastasen zu etablieren (Dano et al., Adv. Cancer Res. 1985, 44, 139–266). Plasminogen ist ein häufiges Plasmaprotein (Mr = 90.000), das normalerweise in einer Konzentration von ungefähr 2 μM vorhanden ist. Die meisten analysierten Zelltypen weisen, mit Ausnahme von Erythrozyten, eine hohe Dichte von Plasminogen Bindungsstellen mit geringer Affinität (0,1–2,0 μM) auf, welche die Lysin Bindungsstellen erkennen, die mit den Kringel Domänen von Plasminogen assoziiert sind (Redlitz & Plow, Clin. Haem. 1995, 8, 313–327). Zellgebundenes Plasminogen wird durch eine Spaltung einer einzelnen Peptidbindung aktiviert, um Plasmin zu bilden, das aus einer Disulfid verknüpften schweren Kette (Mr = 60.000, enthaltend fünf Kringel Motive) und einer leichten Kette (Mr = 24.000, enthaltend die katalytische Triade der Serin Proteinase) zusammengesetzt ist. Die Aktivierung von Plasminogen zu Plasmin wird zuerst durch zellgebundenes u-PA oder t-PA (siehe unten) vermittelt. Zellgebundenes Plasmin ist aktiver als gelöstes Plasmin, und es ist gegenüber Inaktivierung durch Alpha-2-Antiplasmin, das im Serum vorhanden ist, resistent, aber es wird schnell nach der Dissoziation von der Zelle inaktiviert (Stephens et al., J. Cell Biol. 1989, 108, 1987–1995).
  • Urokinase Plasminogen Aktivator (u-PA) ist an der zellvermittelten Proteolyse während Wundheilung, Makrophageninvasion, Embryoimplantierung, Signaltransduktion, Invasion und Metastasierung beteiligt. Pro-uPA wird normalerweise durch Zellen als eine Einzelkette von 55 kDa (scuPA) freigesetzt und bindet an seinen GPI-verankerten, zellulären Rezeptor (uPAR – Kd 0,05–3,0 nM), wo es wirksam in seine aktive (zwei Ketten) Form durch Plasmin und andere Proteasen konvertiert wird.
  • Thrombin inaktiviert die aktive Form des u-PA (Ichinose et al., J. Biol. Chem. 1986, 261, 3486–3489). Die Aktivität von zellgebundenem u-PA wird durch drei Inhibitoren, PAI-1, PAI-2 und der Protease Nexin (PN) reguliert, die an das zellgebundene Enzym binden können, was zu seiner endozytischen Sequestrierung von der Zelloberfläche führt (Conese and Blasi, Clin. Haematol. 1995, 8, 365–389).
  • Bei Krebsinvasion scheint es ein komplexes Zusammenspiel zwischen den verschiedenen Bestandteilen des Plasminogen-Plasminogen Aktivatorsystems zu geben. uPAR, das sich an der Zelloberfläche zusammenballt, dient dazu, den Vorgang der Plasmin- vermittelten, perizellulären Proteolyse an der einwandernden Front des Tumors zu fokussieren. pro-u-PA, uPAR, PAI-1 und PAI-2 können in unterschiedlichen Mengen durch die Krebszellen oder durch nicht transformierte Stromazellen an der Stelle der Tumorinvasion gebildet werden, und ihre Bildung durch diese unterschiedlichen Zelltypen kann durch eine Vielzahl von Stimuli reguliert werden (Laug et al., Int. J. Cancer, 1992, 52, 298–304; Ciambrone & Mckeown-Longo, J. Biol. Chem. 1992, 267, 13617–13622; Kessler & Markus, Semin. Thromb. Haemostasis, 1991, 17, 217–224; Lund et al., EMBO J., 1991, 10, 3399–3407). Daher können verschiedene, unterschiedliche Zelltypen zur Versammlung all der Komponenten der proteolytischen Maschinerie, die für die Matrixzerstörung erforderlich ist, auf den Tumorzellen beitragen.
  • Trypsin ähnliche Proteasen: Tumor-assoziierter Trypsin Inhibitor (TATI) ist ein 6 kDa Protease Inhibitor, dessen Spiegel in Patienten mit fortgeschrittenem Krebs erhöht sind (Stenman et al., Int. J. Cancer, 1982, 30, 53–57). Bei der Suche nach der Zielprotease des TATI wurden zwei Trypsin-ähnliche Proteasen aus der Zystenflüssigkeit von mucinösen Ovartumoren aufgereinigt (Koivunen et al., J. Biol. Chem. 1989, 264, 14095–14099). Es wurde herausgefunden, dass deren Substratspezifitäten sehr ähnlich zu jenen der pankreatischen Trypsine 1 und 2 ist, und es wurde herausgefunden, dass sie wirksame Aktivatoren der Pro-Urokinase sind, aber Plasminogen nicht direkt aktivieren können.
  • Cathepsin D: dies ist eine Pepstatin-sensitive lysosomale Aspartylprotease, die in großen Mengen durch Brustkrebszellen und durch eine Vielzahl von anderen Krebszelltypen sezerniert wird. Von gereinigtem Cathepsin D und konditioniertem Medium von Cathepsin D sezernierenden Zellen ist gezeigt worden, dass sie die extrazelluläre Matrix bei pH 4,5, aber nicht bei neutralem pH abbauen (Briozzo et al., Cancer Res. 1988, 48, 3688–3692). Es wurde daher vorgeschlagen, dass das Enzym ein wichtiger Förderer der Tumorinvasion sein könnte, wenn es in eine sauren (pH < 5,5) Mikroumwelt sezerniert wird. Ein Faktor, der es von anderen Proteasenklassen unterscheidet, ist, dass es nachdem es sezerniert wurde, mit einem Abstand von der Krebszelle wirken kann.
  • Cathepsin B, L.: Leupeptin sensitive lysosomale Cysteinylproteasen, die bei sauren pH wirken.
  • Daher schließen mögliche Eigenschaften viraler FMGs, die einer Verbesserung durch technische Proteinveränderung zugänglich sind, ein:
    • (1) Der pH, bei dem die Fusion vermittelt wird (wie anderswo erklärt, vermitteln viele virale FMGs eine Fusion nur bei saurem pH, während eine Fusion bei neutralem pH oft bevorzugt sein kann);
    • (2) Aktivierung der Fusionsfunktion, wenn man sie bestimmten Proteasen aussetzt (dies kann zu einer räumlichen Aktivierung an der Oberfläche von, oder in der Nachbarschaft von Tumorzellen führen, von denen viele Tumor assoziierte Proteasen sezernieren oder exprimieren, wie in dem Kapitel der Anmeldung, das "Protease Zielstrukturen" betitelt ist, beschrieben ist, – entsprechend kann das FMG auf Tumorzellen zielgerichtet sein);
    • (3) Modifizierung von natürlichen FMGs (z.B. Aminosäuresubstitutionen, Verkürzungen, oder Herstellung von chimären FMGs) – chimäre FMGs sollten neue Bindungsspezifitäten umfassen, um die FMGs auf bestimmte Zelloberflächenmarker abzielen zu lassen oder andere wünschenswerte Eigenschaften von unterschiedlichen Proteinen zu kombinieren.
  • Zusammenfassend gibt es viele bekannte virale Membranglykoproteine oder Kombinationen von viralen Membranglykoproteinen, die, wenn sie auf der Oberfläche einer Säugerzelle exprimiert werden, in der Lage sind, zu bewirken, dass die Zelle mit Nachbarzellen fusioniert, welche die viralen Membranglykoproteine nicht exprimieren, um ein nicht lebensfähiges. Syncytium zu bilden. Die Proteine, die diesen Vorgang vermitteln, können für eine verstärkte fusogene Aktivität technisch verändert werden (z.B. durch Deletion eines Teils oder der gesamten zytoplasmatischen Domäne davon), veränderter Rezeptorspezifität (z.B. durch Fusion an Polypeptide mit anderen Bindungsspezifitäten) oder neuer Proteaseabhängigkeit.
  • Die Zusammensetzung der Erfindung kann in einem Verfahren verwendet werden (außerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Ansprüche) zur Behandlung einer bösartigen Erkrankung in einem menschlichen Patienten, umfassend Verabreichen einer rekombinanten Nukleinsäure an einen Patienten, welche die Expression eines Syncytiuminduzierenden Polypeptids in einer menschlichen Zelle steuert, so dass Zellen ("Index" Zellen) des Patienten, welche die rekombinante Nukleinsäure aufnehmen, mit Krebszellen ("Ziel" Zellen), die die bösartige Erkrankung bewirken, fusionieren.
  • Insbesondere kann die Nukleinsäure in vitro in geeignete, menschliche Indexzellen eingeführt werden (durch irgend eine der verschiedenen bekannten Standardtechniken, wie Transfektion, Transduktion oder Transformation), und die Indexzellen werden dann in den Patienten eingeführt, wo sie eine fusogene Wirkung auf Zielzellen ausüben können.
  • Die FMGs zur Verwendung in einer Erfindung können in unterschiedlichen Weisen zur Gentherapie von Krebs verwendet werden. Die primären Zielzellen, in denen die FMGs exprimiert werden (Indexzellen) können stationäre Zellen sein (z.B. die neoplastischen Zellen oder stromalen Elemente in einem festen Tumor) oder wandernde Zellen (z.B. T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und andere hämatopoetische Zellen oder wandernde neoplastische Zellen bei hämatologischen Krebserkrankungen). Die sekundären Zielzellen (mit denen die FMG-exprimierenden Zielzellen fusionieren werden) können in gleicher Weise stationär oder wandernd sein. Die Zielzellen können ex vivo oder in vivo durch FMG kodierende Vektoren transduziert werden. Jedes Vektorsystem, ob viral oder nicht viral, kann verwendet werden, um die FMG-Gene an die Zielzellen zu liefern. Zielelemente können in die Vektorformulierung eingeschlossen werden, um die Genauigkeit der Genlieferung in Zielzellen zu erhöhen, und Gewebe/Tumor-selektive, regulatorische Elemente können in das Vektorgenom eingeschlossen werden, um sicherzustellen, dass die Expression der FMG-Gene auf die gewählten Zielzellen beschränkt ist.
  • Gene, die FMGs kodieren, können daher in verschiedenen Weisen zu therapeutischen Nutzen verwendet werden. In all diesen Fällen ist es das Ziel, unerwünschte Zielzellen zu zerstören, dadurch dass man sie veranlasst, mit FMG-exprimierenden Indexzellen zu fusionieren. Die anfänglichen Zielstrukturen für einen Gentransfer sind daher die Indexzellen, aber das letztendliche Ziel der therapeutischen Strategie sind die Zellen, mit denen sie fusionieren. Viele unterschiedliche therapeutische Strategien können in Betracht gezogen werden.
  • Beispielsweise müssen dort, wo das Ziel des Protokolls ist, die neoplatischen Zellen in Patienten zu zerstören, die Indexzellen nicht neoplastisch sein. Wandernde T-Lymphozyten, die Tumor-selektive FMGs exprimieren, könnten Syncytien ausschließlich mit neoplastischen Zellen bilden. Die örtliche Expression von Tumor-selektiven (oder weniger optimal nicht selektiven) FMGs in den stromalen, vaskulären Endothel- oder neoplastischen Zellen in soliden Tumoren könnte zum Einbeziehen von benachbarten neoplastischen Zellen in die Syncytien führen.
  • Bei Leukämien oder anderen hämatogenen Krebserkrankungen kann die Expression von Leukämie selektiven FMGs in vaskulärem Endothelium oder Knochenmarks-Stromazellen zur Einbeziehung von zirkulierenden Leukämiezellen in stationäre Syncytien führen. Als Alternative könnte die Expression von Leukämie selektiven FMGs in zirkulierenden T-Zellen oder in den Leukämiezellen selbst, es den Zellen ermöglichen, einen Kern für die Bildung von Leukämiezellsyncytien in stark infiltrierten Geweben zu bilden, oder zur Einbeziehung von Leukämiezellen in rezirkulierenden Syncytien führen.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines rekombinanten Nukleinsäurevektors in der Herstellung eines Medikaments, um eine bösartige Erkrankung in einem humanen Patienten zu behandeln, bereit, wobei der Vektor die Expression einer fusogenen Kombination von getrennten paramyxoviralen Glykoproteinen oder eines fusogenen Membranpolypeptids auf einer eukaryotischen Zelloberfläche steuert, das von einem einzelnen paramyxoviralen Glykoprotein verschieden ist.
  • Zusammensetzungen gemäß der Erfindung umfassen typischerweise eine Wirtszelle, umfassend einen rekombinanten Nukleinsäurevektor, wie oben beschrieben. Die Zelle wird typischerweise eine eukaryotische Zelle sein (insbesondere eine menschliche Zelle) und wird wünschenswerterweise auf ihrer Oberfläche ein Syncytium-induzierendes Polypeptid exprimieren. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung umfassen typischerweise einen rekombinanten Nukleinsäurevektor in Beimischung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder eine eukaryotische Zelle, die einen rekombinanten Nukleinsäurevektor in Beimischung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält.
  • Ein Vektor zur Verwendung in der Erfindung kann direkt einem Patienten verabreicht werden, oder er kann unter Verwendung eines ex vivo Ansatzes verabreicht werden, wobei Zellen von einem Patienten oder Spender entfernt werden, mit dem Vektor transduziert und in den Patienten reimplantiert werden. Der Vektor, oder die Wirtszellen, die den Vektor enthalten, können prophylaktisch verabreicht werden, oder an Patienten, die eine bösartige Erkrankung oder einen anderen Zustand aufweisen, in dem eine Behandlung angemessen ist. Die Verabreichung kann die Verwendung eines Transportvehikels (z.B. eines Liposoms) umfassen, oder kann Iontophorese, Elektroporation oder andere pharmakologisch genehmigte Transportverfahren einschließen. Verabreichungswege können unter anderem intramuskuläre, intravenöse, aerosol, orale, topikale, systemische, okuläre oder intraperitoneale Wege einschließen.
  • Die Erfindung wird nun weiter durch erläuternde Beispiele und mit Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, in denen:
  • 1 bis 3 schematische Darstellungen von rekombinanten Nukleinsäurenvektoren sind: in 2 ist CMV der CMV Promoter: in den 1 und 3 ist LTR der Long Terminal Repeat; in 3 ist Phleo das Phleomycin Resistenzgen; in den 2 und 3 ist die IEGR-Verknüpfungssequenz das Proteasespaltungssignal für eine FXa Protease und * bezeichnet Stoppcodons;
  • 4 ein Immunblot von Zelllysaten ist, die aus den TELCeB6 Transfektanten, pFBH, pFBH EGFR–, pFBH XEGFR–, pFBH IGF, pFBH XIGF und der Kontrolle, nicht transfizierte TELCeB6, hergestellt wurden, getestet mit einem Anti-MV H Antiserum;
  • 5 eine Vergrößerungsansicht zeigt, die große C170 Syncytien in einem Zellzellfusionsassay nach X-gal Färbung zeigt: chimäre MV H Proteine zeigen Syncytienbildung, obwohl zu einem geringeren Grad, als die des nicht modifizierten H Proteins;
  • 6 die DNA- und Aminosäuresequenz eines verkürzten, hyperfusogenen GaLV-Hüllproteins zeigt; und
  • 7 eine schematische Darstellung von weiteren rekombinanten Nukleinsäurevektoren ist: in 7 ist das gestreifte Rechteck das FXa Spaltungssignal, das leicht schattierte Rechteck ist die reife (Reste 43–653) GaLV-Hülle und das stark schattierte Rechteck sind Reste 633–674 der Affen MLV-Hülle, poly A ist ein Polyadenylierungssignal, L ist eine Leadersequenz.
  • Beispiele
  • Demonstration der therapeutischen Verwendung von Genen, die (zielgerichtete) fusogene Membranglykoproteine für eine Gentherapie von Krebs kodieren.
  • Wenn sie gleichzeitig in der gleichen Zelle exprimiert werden, können Masern Virus F und H Glykoproteine eine Zellzellfusion mit benachbarten Zellen vermitteln, vorausgesetzt, dass die Nachbarzellen den Masern Virus Rezeptor (CD46) exprimieren. Menschliche Zellen exprimieren den CD46 Masern Virus Rezeptor, während Mauszellen dies nicht tun. In den unten beschriebenen Experimenten wird ein retroviraler Vektor, der in der Lage ist, die Masern Virus F und H Gene zu transferieren, verwendet, um das therapeutische Potenzial von Gentherapievektoren zu demonstrieren, die zielgerichtete und nicht zielgerichtete fusogene virale Membranglykoproteine für eine Krebstherapie kodieren. Die Vektoren können für einen direkten Gentransfer auf Tumorzellen oder für eine Transduktion von Nichttumorzellen verwendet werden, die dann wegen ihres selektiven Antitumoreffekts eingesetzt werden.
  • Beispiel 1 Konstruktion eines retroviralen Vektorplasmids, das Masern Virus F und H Glykoproteine kodiert.
  • Das Plasmid, das schematisch in 1 (nicht maßstabsgerecht) gezeigt ist, ist unter Verwendung von Standardklonierungsverfahren konstruiert worden. Mit Bezug auf 1, LTR = Moloney Maus Leukämievirus Long Terminal Repeat; Ψ = Moloney Maus Leukämievirus Verpackungssignal; IRES = Poliovirus innere Ribosomeintrittsstelle; H = Masern Virus H Glykoprotein kodierende Sequenz; F = Masern Virus F Glykoprotein kodierende Sequenz; PHLEO = Phleomycin Resistenzmarker; die gepunktete Linie stellt das Vektorrückgrat dar (entweder pUC- oder pBR322-basierend). Kurz gesagt, wird die kodierende Sequenz des Masern Virus H Gens aus pCGHS (Cathomen et al., 1995, Virology, 214, 628–632) in die NotI Stelle des retroviralen Vektorplasmids pGCP (das die Poliovirus innere Ribosomeintrittsstelle, flankiert durch NotI und ClaI Klonierungsstellen, enthält) kloniert. Das Masern Virus F Gen wird dann aus pCGF (Cathomen et al., 1995, Virology, 214, 628–632) in die ClaI Stelle des gleichen Vektors kloniert, 5' von der inneren Ribosomeintrittsstelle, um den Vektor zu bilden, der pHF benannt wurde. Ein selektionierbares Phleomycin Markergen wird dann in den Vektor 5' des 5' LTR eingeführt.
  • 1.2 Herstellung von retroviralen Vektorstammlösungen.
  • Das Plasmid pHF wird in amphotrophe retrovirale Verpackungszelllinien transfiziert, die von Maus Fibroblasten abgeleitet wurden. Geeignete Verpackungszelllinien sind einfach erhältlich und schließen die NIH 3T3 abgeleiteten Zelllinien PA317 und GP+env AM12 ein. Stabil transfizierte Verpackungszelllinien werden in 50 μg/ml Phleomycin selektioniert und als eine Quelle für HF retrovirale Vektoren verwendet, die in der Lage sind, die Masern Virus F und H Gene wirksam auf menschliche und Maus Zielzellen zu transferieren.
  • 1.3 Transduktion von transplantierbaren, menschlichen Tumorzelllinien, die zur Bildung von vielkernigen Syncytien durch die Induktion von Zellzellfusion führen.
  • Die HF retroviralen Vektorstammlösungen werden zum Transduzieren einer Reihe von menschlichen Tumorzelllinien verwendet, die nachfolgend auf die Bildung von vielkernigen Syncytien beobachtet werden, von der erwartet wird, dass sie 24 bis 72 Stunden nach der retroviralen Transduktion der Zellen maximal ist. Die Tumorzelllinien werden vor der Transduktion wachsen gelassen, bis sie fast konfluent sind. Beispiele für Tumorzelllinien, die für diesen Assay verwendet werden können, sind A431 (epidermoides Karzinom), HT1080 (Fibrosarkom), EJ (Blasenkarzinom), C175 (Kolonkarzinom), MCF7 (Brustkarzinom), HeLa (Zervixkarzinom), K422 (follikuläres Lymphom), U266 (Myelom). Die meisten, wenn nicht alle, der getesteten, menschlichen Tumorzelllinien durchliefen ausgedehnte Zellzellfusionen kurz nach der Transduktion mit dem HF retroviralen Vektor.
  • 1.4 Animpfung von Nacktmäusen mit transplantierbaren, menschlichen Tumorzelllinien und nachfolgender in vivo Transfer von H und F Genen in die Tumorablagerungen: Demonstration, dass fusogene Membranglykoproteine Tumorzerstörung beim Fehlen eines funktionellen Immunsystems vermitteln.
  • Mäuse werden durch subkutane Animpfung mit 107 menschlichen Tumorzellen in die Flanke herausgefordert. Geeignete Zelllinien zur Verwendung in diesen Experimenten sind oben in Abschnitt 3 aufgelistet. Zwischen einem und vierzehn Tagen nach der subkutanen Animpfung mit Tumorzellen wurden die wachsenden Tumor Xenotransplantate mit konzentrierten HF retroviralen Vektorstammlösungen oder Kontrollvektorstammlösungen, die entweder Masern F oder Masern H Glykoproteine kodieren, angeimpft. Das Tumorwachstum wird durch HF retrovirale Vektoranimpfung, aber nicht durch Animpfung von Kontrollvektoren (H oder F allein) verlangsamt oder vollständig verhindert.
  • 1.5 Transduktion von Maus Fibroblasten: Fehlen von Zellzellfusion und Abwesenheit von vielkernigen Syncytien.
  • Die HF retroviralen Vektorstammlösungen werden verwendet, um Maus NIH3T3 Fibroblasten zu transduzieren, die nachfolgend auf die Bildung von vielkernigen Syncytien beobachtet werden. Es tritt keine Zellzellfusion auf, und es werden keine vielkernigen Syncytien beobachtet.
  • 1.6 Mischen von HF transduzierten Maus Fibroblasten mit nicht transduzierten menschlichen Tumorzellen, was, durch die Induktion von Zellzellfusion zwischen HF transduzierten Maus Fibroblasten und nicht transduzierten menschlichen Tumorzellen, zur Bildung von vielkernigen Syncytien führt.
  • Die HF retroviralen Vektorstammlösungen werden verwendet, um Maus NIH3T3 Fibroblasten zu transduzieren, die nachfolgend in verschiedenen Verhältnissen von 1:1 bis 1:10.000 mit nicht transduzierten menschlichen Tumorzelllinien gemischt werden. Die gemischten Zellpopulationen werden dann in hoher Dichte ausplattiert und auf die Bildung von vielkernigen Syncytien beobachtet. Zellzellfusion tritt zwischen HF transduzierten NIH3T3 Fibroblasten und nicht transduzierten menschlichen Tumorzellen auf, was zur Bildung von mehrfachen Hybrid-Syncytien führt, wobei jede aus einer transduzierten NIH3T3 Zelle entsteht. In Kontrollkulturen, in denen nicht transduzierte NIH3T3 Zellen mit nicht transduzierten menschlichen Tumorzellen gemischt wurden, wurden Syncytien nicht beobachtet.
  • 1.7. Animpfung von Nacktmäusen mit Mischungen von HF transduzierten Maus Fibroblasten und nicht transduzierten menschlichen Tumorzellen: Demonstration, dass fusogene Membranglykoprotein exprimierende Zellen eine Tumorzerstörung durch Einbeziehen von nicht transduzierten menschlichen Tumorzellen in die Syncytien vermitteln.
  • Die HF retroviralen Vektorstammlösungen werden verwendet, um Maus NIH3T3 Fibroblasten zu transduzieren, die nachfolgend in verschiedenen Verhältnissen von 1:1 bis 1:10.000 mit nicht transduzierten menschlichen Tumorzelllinien gemischt werden. Gemischte Zellpopulationen, die 107 Tumorzellen vermischt mit von 103 bis 107 HF transduzierten NIH3T3 Zellen enthalten, werden dann subkutan in die Flanken von Nacktmäusen (BALBC nu/nu) angeimpft, und die Mäuse werden auf das Wachstum von subkutanen Tumoren beobachtet, deren Durchmesser täglich aufgezeichnet werden. Kontrollmäuse werden mit 107 nicht transduzierten menschlichen Tumorzellen herausgefordert. Das Tumorwachstum wird durch beigemischte HF transduzierte NIH3T3 Fibroblasten, welche die Masern Virus F und H Glykoproteine exprimieren, verlangsamt oder vollständig verhindert, aber nicht durch beigemischte, nicht transduzierte NIH3T3 Fibroblasten.
  • Beispiel 2 Präsentation von EGF und IGF auf Masern H Glykoprotein
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • Plasmidkonstruktion
  • Nicht modifiziertes Masern Virus (MV) F und MV H Protein wurde durch die Expressionsplasmide pCG-F bzw. pCG-H kodiert (Cathomen et al. Virology 214, S. 628, 1995). Um die chimären MV H Expressionskonstrukte herzustellen wurde zuerst die SfiI Stelle im pCG-H deletiert, so dass wir unsere präsentierten Liganden als SfiI/NotI Fragmente einführen konnten. Dies erfolgte durch Spalten von pCG-H mit SfiI, Auffüllen der kohäsiven Enden unter Verwendung des Klenow-Fragments von E. coli DNA Polymerase und dNTPs, dann Religieren des gereinigten Produkts. Dieses Konstrukt wurde getestet, um nachzuprüfen, ob es in Zellfusionsassays (siehe später) immer noch funktionsfähig war. Wir konnten nun Konstrukte herstellen, die es uns ermöglichten, Liganden als SfiI/NotI Fragmente einzufügen. Um das pCG-H SfiI/NotI Konstrukt herzustellen, das die SfiI/NotI Klonierungsstelle am C-Terminus der MV H Sequenz einführt, wurden die Oligonukleotide HXmabak (5'-CCG GGA AGA TGG AAC CAA TGC GGC CCA GCC GGC CTC AGG TTC AGC GGC CGC ATA GTA GA-3', SEQ ID NR. 1) und HSpefor (5'-CTA GTC TAC TAT GCG GCC GCT GAA CCT GAG GCC GGC TGG GCC GCA TTG GTT CCA TCT TC-3', SEQ ID NR. 2) hergestellt. Wenn sie aneinander angelagert werden, bilden diese zwei Oligonukleotide ein DNA Fragment mit XmaI und SpeI kohäsiven Enden. Dieses Fragment wurde in das XmaI/SpeI gespaltene pCG-H(Sfi-)Rückgrat ligiert. Die korrekte Sequenz des Konstrukts wurde durch DNA Sequenzierung bestätigt.
  • Um das Konstrukt pCG-H FXSfiI/NotI herzustellen, in dem es ein FXa Protease-Spaltungssignal vor der SfiI/NotI Klonierungsstelle am C-Terminus der MV H Sequenz gibt, wurden die Oligonukleotide HXmaFXbak (5'-CCG GGA AGA TGG AAC CAA TAT CGA GGG AAG GGC GGC CCA GCC GGC CTC AGG TTC AGC-3', SEQ ID NR. 3) und HNotFXfor (5'-GGC CGC TGA ACC TGA GGC CGG CTG GGC CGC CCT TCC CTC GAT ATT GGT TCC ATC TTC-3', SEQ ID NR. 4) hergestellt. Wenn sie aneinander angelagert werden, bilden diese beiden Oligonukleotide ein DNA Fragment mit XmaI und NotI kohäsiven Enden. Dieses Fragment wurde in das mit XmaI/NotI gespaltene pCG-H StiI/NotI-Rückgrat ligiert. Die korrekte Sequenz des Konstrukts wurde durch DNA Sequenzierung bestätigt. Die Konstrukte pCG-H EGFRR–, pCG-H XEGFR–, pCG-H IGF und pCG-H XIGF wurden durch Transferieren der SfiI/NotI EGF und IGF Fragmente aus pEGFR–GS1A1 (Peng, Doktorarbeit) bzw. pIGFA1 (IA) (WO 97/03357, Russell et al.) in die mit SfiI/NotI verdauten pCG-H SfiI/NotI und pCG-H FXSfiI/NotI hergestellt. 2 zeigt eine Diagrammdarstellung der vier Konstrukte.
  • Um es uns zu ermöglichen, die chimären H Proteine in Säugerzellen stabil zu exprimieren, brauchen wir einen selektionierbaren Marker im Expressionskonstrukt. Dies wurde durch Transfer des gesamten MV H Gens mit der SfiI/NotI Klonierungsstelle an seinem C-Terminus in das Hüllexpressionskonstrukt EMo1 (Cosset et al., J. Virol. 69, S. 6314, 1995) erreicht. So wurde, um pFBH SfiI/Not herzustellen, pCG-H SfiI/Not mit ClaI und SpeI geschnitten, um das H Gen mit der SfiI/NotI Klonierungsstelle freizusetzen, und EMo1 wurde mit XbaI und ClaI geschnitten, um EGF und die Mo Hüllsequenz zu entfernen, was uns das Rückgrat lieferte. Die kohäsiven Enden von beiden Fragmenten wurden am Ende unter Verwendung des Klenow-Fragments von E. coli DNA Polymerase und dNTPs aufgefüllt. Das Rückgrat wurde mit Phosphatase behandelt und die gereinigten Fragmente zusammen ligiert. Das Konstrukt wurde durch analytische Spaltungen auf die korrekte Orientierung überprüft. Um das Konstrukt pFBH FXSfiI/Not herzustellen, wurde pCG-H FXSfiI/Not mit NsiI und NotI geschnitten, um den Teil der H Sequenz mit einem FXa Protease-Spaltungssignal und der SfiI/NotI Klonierungsstelle an seinem C-Terminus freizusetzen. pFBH SfiI/Not wurde auch mit NsiI und NotI geschnitten, um uns das Rückgrat zu liefern, und die beiden Fragmente wurden zusammen ligiert. Das Konstrukt wurde durch Sequenzierung auf seine Richtigkeit überprüft. Die Konstrukte pFBH EGFR–, pFBH XEGFR–, pFBH IGF und pFBH XIGF wurden durch Übertragen der SfiI/NotI EGF und IGF Fragmente aus pEGFR–GS1A1 bzw. pIGFA1 in SfiI/NotI gespaltene pFBH SfiI/Not und pFBH FXSfiI/NotI hergestellt. 3 zeigt eine Diagrammdarstellung der vier Konstrukte. Um das Konstrukt pFBH herzustellen, in dem es keine C-terminale Verlängerung gibt, wurde pCG-H mit ClaI und SpeI geschnitten, um das H Gen freizusetzen, und EMo1 wurde mit XbaI und ClaI geschnitten, um die EGF und die Mo Hüllsequenz zu entfernen, was uns das Rückgrat ergab. Die kohäsiven Enden von beiden Fragmenten wurden am Ende unter Verwendung des Klenow Fragments von E. coli DNA Polymerase und dNTPs aufgefüllt. Das Rückgrat wurde mit Phosphatase behandelt und die gereinigten Fragmente zusammen ligiert. Das Konstrukt wurde durch analytische Spaltungen auf die korrekte Orientierung überprüft.
  • Zelllinien
  • C170 Zellen, eine menschliche Kolonkrebszelllinie (Currant et al., Br. J. Cancer 53, S. 37, 1986) und menschliche A431 Zellen (ATCC CRL1555) wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum, gezüchtet. Um einen leichten Nachweis von Zellzellfusion zu ermöglichen, wurden die C170 und A431 Zellen mit einem viralen Überstand infiziert, der von TELCeB6 bildenden Zellen (Cosset et al., ). Virol. 69, S. 6314, 1995) geerntet wurde, die ein Gen übertragen, das β Galactosidase, versehen mit einem nukleären Lokalisierungssignal, kodiert. Einzelne Kolonien von Zellen wurden hochwachsen gelassen und Klone, die sich blau färbten, herausgestochen. Diese sich blau färbenden C170 und A431 Zellen wurden in Zellfusionsassays verwendet. Die unterschiedlichen MV H Expressionskonstrukte pFBH, pFBH EGFR–, pFBH XEGFR–, pFBH IGF und pFBH XIGF (5 mg DNA) wurden in TELCeB6 Zellen (Cosset et al., J. Virol. 69, S. 7430, 1995), unter Verwendung von 30 ml Superfect (Qiagen) transfiziert. Stabile Phleomycin (50 mg/ml) resistente Kolonien wurden expandiert und zusammengefügt. Zellen wurde in DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum, gezüchtet.
  • Immunblots
  • Um Zelllysate zu erhalten, wurden TELCeB6 Zellen, die stabil mit den MV H Konstrukten transfiziert worden waren, in 20 mM Tris-HCL Puffer (pH 7,5), enthaltend 1 % Triton X-100, 0,05 % SDS, 5 mg/ml Natriumdeoxycholat, 150 mM NaCl und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, lysiert. Lysate wurden für 10 Minuten bei 4°C inkubiert und dann für 10 Minuten bei 10.000 × g zentrifugiert, um die unerwünschten Nuklei zu pelletieren. Aliquots der Zelllysate (50 μl) wurden dann auf 10 % Polyacrylamid-Gelen unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt, gefolgt durch Transfer der Proteine auf Nitrocellulosepapier (NC) (Amersham). Das NC wurde mit 5 % entrahmtem Milchpulver (Marvel) in PBS-0,1 % Tween 20 (PEST) für 30 min. bei Raumtemperatur blockiert. Die MV H Proteine wurden durch Inkubieren des NC für 3 Stunden mit einem MV H-spezifischen Kaninchenserum (1 zu 3000), das gegen ein vom Aminoterminus des H Proteins abgeleitetes Peptid hergestellt wurde (großzügige Spende von Roberto Cattaneo, Universität von Zürich) nachgewiesen. Nach intensivem Waschen mit PBST wurde das NC mit Meerrettichperoxidase-konjugierten Schwein Anti-Kaninchen Antikörpern (1 zu 3000) (DAKO, Dänemark) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proteine wurden unter Verwendung des verstärkten Chemilumineszenz Kits (Amersham, Life Science, UK) sichtbar gemacht.
  • Zellzellfusionsassays
  • Sich blau färbende C170 und A431 Zellen wurden bei 5 × 105 Zellen/Vertiefung in Platten mit sechs Vertiefungen ausgesät und bei 37°C über Nacht inkubiert. MV H Expressionskonstrukte pCG-H, pCG-H EGFR–, pCG-H XEGFR–, pCG-H IGF und pCG-H XIGF wurden in die C170 und A431 Zellen zusammen mit dem MV F Expressionskonstrukt, pCG-F, kotransfiziert. Die Transfektionen wurden unter Verwendung von 2,5 mg der relevanten Plasmide und 15 ml Superfect durchgeführt. Nach der Transfektion wurden die Zellen mit regulärem Medium für 48–72 Stunden inkubiert, bis Syncytien deutlich zu erkennen waren. Eine X-Gal-Färbung zum Nachweis der β-Galaktosidase Aktivität wurde wie vorher beschrieben (Takeuchi et al., 1994) durchgeführt. Die Fusionseffizienz wurde ausgewertet (- keine Syncytien, + deutliche Syncytien, ++ häufige Syncytien).
  • ERGEBNISSE
  • Konstruktion eines chimären MV H Expressionskonstrukts
  • Es wurde eine Reihe von Expressionskonstrukten hergestellt, die chimäre MV H Proteine kodieren, in denen die Liganden EGF und IGF an den C-Terminus des H Proteins mit oder ohne eine Faktor Xa-spaltbare Verknüpfungssequenz (2 und 3) fusioniert ist. 2 zeigt Konstrukte, die durch den CMV Promoter getrieben werden, aber diese Konstrukte enthalten keinen selektionierbaren Marker zur Selektion in Säugerzellen. Die Expression der Konstrukte in 3 wird durch einen retroviralen LTR getrieben, und diese Konstrukte enthalten einen selektionierbaren Marker Phleomycin zur Selektion in Säugerzellen.
  • Expression der chimären MV H Proteine
  • Die verschiedenen MV H Expressionskonstrukte, pFBH, pFBH EGFR–, pFBH XEGFR–, pFBH IGF und pFBH XIGF wurden stabil in TELCeB6 Zellen transfiziert. Immunblots wurden an Zelllysaten, die aus diesen stabilen TELCeB6 Transfektanden hergestellt worden waren, durchgeführt. 4 zeigt, dass alle chimären MV H Proteine in einem Grad exprimiert werden, der vergleichbar mit dem des Wildtyps MV H Proteins ist. Außerdem zeigt der Blot, dass die präsentierten Domänen nicht spontan von den chimären MV H Glykoproteinen abgespalten werden.
  • Zellzellfusionsassays
  • Die MV H Expressionskonstrukte, pCG-H, pCG-H EGFR–, pCG-H XEGFR–, pCG-H IGF und pCG-H XIGF wurden in β-Galaktosidase exprimierende C170 und A431 Zellen, zusammen mit dem MV F Expressionskonstrukt pCG-F, kotransfiziert. Die Zellen wurden 72 Stunden nach der Transfektion mit X-gal-Substrat gefärbt, um einen leichten Zellzellfusionsnachweis zu ermöglichen. Die Ergebnisse der Assays werden in Tabellen 1 und 2 und in 5 gezeigt. Die chimären MV H Proteine waren starke Auslöser für Zellzellfusion in C170 Zellen, obwohl ihre Wirksamkeit im Vergleich zum nicht modifizierten H Protein (Tabelle 1, 5) leicht verringert war. Zellzellfusion in A431 war für die chimären H Proteine nicht mehr vorhanden, im Vergleich zum nicht modifizierten MV H Protein, das ein wirksamer Auslöser für Zellzellfusion war (Tabelle 2).
  • Die Ergebnisse zeigen, dass:
    • 1) fremde Polypeptide als Fusionen an den äußersten C Terminus des MV Proteins präsentiert werden können.
    • 2) Die chimären H Glykoproteine werden effizient exprimiert und sind in Zellzellfusionsassays funktionsfähig.
    • 3) Der präsentierte Ligand kann die Spezifität von Zellzellfusion auf ein Ziel ausrichten.
  • Tabelle 1
  • Diese Tabelle zeigt die Ergebnisse der Zellzellfusion an β-Galaktosidase exprimierenden C170 Zellen. Chimäre MV H Proteine sind wirksame Auslöser von Zellzellfusion, wenn sie mit nicht modifizierten F Glykoproteinen koexprimiert werden. – = keine Syncytien, + = deutliche Syncytien, ++ = häufige Syncytien.
    Figure 00260001
  • Tabelle 2
  • Diese Tabelle zeigt die Ergebnisse des Zellzellfusionassays an β-Galaktosidase exprimierenden A431 Zellen. Das nicht modifizierte MV H Protein ist ein wirksamer Auslöser von Zellzellfusion, wenn es mit nicht modifizierten F Glykoproteinen koexprimiert wird. Chimäre MV H Proteine zeigen jedoch keine Syncytienbildung. – = keine Syncytien, + = deutliche Syncytien, ++ = häufige Syncytien.
  • Figure 00270001
  • Beispiel 3 Demonstration, dass die GALV-Hülle mit verkürztem zytoplasmatischem Anteil auf menschlichen Tumorzelllinien hyperfusogen ist
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • Verwendete Plasmide
  • Die Expressionskonstrukte des Masern Virus (MV) F und MV H Proteins wurden durch die Expressionsplasmide pCG-F bzw. pCG-H kodiert (Cathomen et al., Virology, 214, S. 628, 1995). FBdeIPGASAF kodiert die Wildtyp GALV-Hülle, und FBdeIPGASAF-fus kodiert eine C-terminal verkürzte GALV-Hülle, welcher der zytoplasmatische Anteil (siehe beigefügte Sequenz, 6) fehlt.
  • Zelllinien
  • Menschliche C170 (Durrant et al., Br. J. Cancer 53, S. 37, 1986), menschliche A431 Zellen (ATCC CRL1555), menschliche TE671 (ATCC CRL8805), menschliche Hela (ATCC, CCL2) und die Mauszelllinie NIH3T3 wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum, gezüchtet. All diese Zelllinien, außer NIH3T3, weisen Rezeptoren für die GALV-Hülle und für das MV H Glykoprotein auf.
  • Zellzellfusionsassays
  • Zellen wurden bei 5 × 105 Zellen/Vertiefung in Platten mit sechs Vertiefungen ausgesät und bei 37°C über Nacht inkubiert. Die fusogenen und nicht fusogenen Plasmide, FBdeIPGASAF und FBdeIPGASAF-fus wurden transfiziert, und die MH V und F Expressionskonstrukte pCG-H und pCG-F wurden in die Reihe von Zelllinien kotransfiziert. Transfektionen wurden unter Verwendung von 2,5 mg der relevanten Plasmide und 15 ml Superfect (Qiagen) ausgeführt. Nach der Transfektion wurden die Zellen mit regulärem Medium für 48–72 Stunden inkubiert, bis Syncytien deutlich zu sehen waren, worauf die Fusionseffizienz ausgewertet wurde (– keine Syncytien, + deutliche Syncytien, ++ häufige Syncytien).
  • ERGEBNISSE
  • Zellzellfusionsassays
  • Die fusogenen und nicht fusogenen Plasmide und die MV H und F Expressionskonstrukte wurden in eine Reihe von Zelllinien transfiziert. Die Zellen wurden für 72 Stunden stehen gelassen, bevor die Zellzellfusion ausgewertet wurde. Die Ergebnisse des Assays werden in Tabelle 3 gezeigt. Das fusogene GALV Konstrukt zeigt das gleiche Fusionsfähigkeitsmuster wie auch die MV F und H Proteine zeigen.
  • Tabelle 3
  • Diese Tabelle zeigt die Ergebnisse von Zellzellfusionsassays an einer Reihe von Zelllinien. – keine Syncytien, + deutliche Syncytien, ++ häufige Syncytien.
  • Figure 00280001
  • Beispiel 4 Präsentation von EGF auf der GALV-Hülle
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • Konstruktion der Hüllexpressionsplasmide
  • Das Hüllexpressionsplasmid GALVMoT wurde durch PCR Amplifikation der cDNA konstruiert, die GaLV env kodiert, aus dem Plasmid pMOVGaLVSEATO env (Wilson et al., J. Virol. 63, 2374–2378, 1989) unter Verwendung der Primer GalvrevXba und Galvforcla2, die am Ende mit XbaI und ClaI Restriktionsschnittstellen versehen wurden. Die PCR Produkte wurden dann, nach XbaI und ClaI Spaltung, in das Plasmid FBMoSALF ligiert.
  • Das chimäre Hüllexpressionsplasmid EXGaLVMoT wurde durch PCR Amplifikation der cDNA konstruiert, die GALV env kodiert, vom Plasmid pMOVGaLVSEATO env unter Verwendung der Primer galvslq und galvforda2. Der Primer "glavslq" wurde am Ende mit einer NotI Restriktionsschnittstelle versehen und enthielt die kodierende Sequenz für ein Faktor Xa-Spaltungssignal (IEGR). Die PCR Produkte wurden, nach NotI und ClaI Spaltung, in das Plasmid EMo ligiert. Diese Sequenzen der Primer werden unten gezeigt. Die Restriktionsenzymstellen sind unterstrichen. Die kodierende Sequenz für das Faktor Xa Spaltungssignal wird in Fettschrift gezeigt.
    galvslq 5'gcaaatctgcggccgcaatcgagggaaggagtctgcaaaataagaacccccaccag 3'
    galvforcla2 5'ccatcgattgatgcatggcccgag 3'
    galvrevxba 5'ctagctctagaatggtattgctgcctgggtcc 3'
  • Die korrekte Sequenz beider Konstrukte wurden durch Didesoxysequenzierung bestätigt. Eine Diagrammdarstellung der Konstrukte ist in 7 gezeigt.
  • Vektorherstellung
  • Die Hüllexpressionsplasmide wurden in die TELCeB6 komplementierte Zelllinie transfiziert, die ein gag-pol Expressionsplasmid und einen nls LacZ retroviralen Vektor enthält. Stabile Transfektanten wurden in 50 μg/ml Phleomycin selektioniert und vereinigt.
  • Infektion von Zielzellen
  • Nachdem die Zellen bis zur Konfluenz bei 37°C wachsen gelassen und dann für 1 bis 3 Tage bei 32°C stehen gelassen wurden, wurde der Überstand von den transfizierten TELCeB6 komplementierten Zelllinien geerntet. Das Medium wurde gewechselt, und nach Übernacht-Inkubation wurde der Überstand geerntet und durch einen 0,45 μm Filter filtriert. Die filtrierten Überstände wurden dann zum Infizieren von Zielzellen verwendet. Angeheftete Zielzellen wurden am Abend vor der Infektion in Platten mit sechs Vertiefungen bei ungefähr 105 Zellen pro Vertiefung ausplattiert und über Nacht bei 37 inkubiert und Suspensionszellen wurden eine Stunde vor Infektion in Platten mit sechs Vertiefungen bei ungefähr 106 Zellen pro Vertiefung ausplattiert. Filtrierter viraler Überstand in serumfreiem Medium wurde zu den Zielzellen hinzugefügt und für 2 bis 4 Stunden in der Gegenwart von 4 mg/ml Polybren inkubiert. Für Infektionen, die eine Spaltung mit Faktor Xa beinhalteten, wurde das Virus mit 4 mg/ml Faktor Xa-Protease in Anwesenheit von 2,5 mM CaCl2 für 90 Minuten vor der Infektion inkubiert. Der retrovirale Überstand wurde dann von den Zielzellen entfernt, das Medium wurde mit dem normalen Medium ersetzt, und die Zellen wurden bei 37°C für weitere 48 bis 72 Stunden stehen gelassen. Zum Nachweis der β-Galaktosidase Aktivität wurde danach eine X-gal-Färbung durchgeführt.
  • Ergebnisse
  • Titrierung von GaLVMoT und EXGaLVMoT auf HT1080 Zellen
  • Wenn die Vektoren auf HT1080 Zellen, einer menschlichen EGF Rezeptor positiven Zelllinie, titriert wurden, betrug der Titer von GaLVMoT 106 efu/ml, während der von EXGaLVMoT 3,6 × 103 efu/ml betrug. Wenn jedoch der Vektorüberstand vor der Infektion mit Faktor Xa-Protease inkubiert wurde, um die präsentierte Domäne abzuspalten, blieb der Titer von GaLVMoT bei 106 efu/ml, während der Titer von EXGaLVMoT auf 3,6 × 104/ml (Tabelle 4) anstieg.
  • Titrierung von GaLVMoT und EXGaLVMoT auf MDBK Zellen
  • Wenn diese Vektoren auf MDBK Zellen, einer Rinder EGF-R positiven Zelllinie, tritiert wurden, gab es ein ähnliches Ergebnis. Der Titer von EXGaLVMoT war im Vergleich zu GaLVMoT verringert, aber erhöhte sich bei Proteasespaltung (Tabelle 4) zehnfach.
  • Infektion von hämatopoetischen Zellen mit EXGaLVMoT
  • Zwei EGF-R negative, hämatopoetische Suspensionszelllinien, HMC-1 und Meg-O1, wurden mit EXGaLVMoT infiziert und ergaben Titer (ausgedrückt als Prozentsatz an blauen Zellen) von 28,8 % bzw. 31,65 %. Diese Ergebnisse sind ähnlich denen, die vorher mit dem Vektor EXA (Fielding et al., Blood 91, 1–10, 1998) veröffentlicht wurden. Zusammengenommen mit den obigen Daten für EGF-R positive Zellen legt dies nahe, dass der EXGaLVMoT ähnliche Eigenschaften wie der EXA Vektor zeigt, bei dem die präsentierte Domäne eine Verringerung der Infektivität in einer rezeptorabhängigen Weise bewirkt. Tabelle 4 Titer der GaLV Vektoren auf EGF-R positiven Zellen
    Figure 00310001
  • Schlussfolgerungen
    • 1. Wildtyp (GaLVMoT) und chimäre Gibbon Affen Leukämievirus Hüllexpressionskonstrukte wurden konstruiert und in retrovirale Vektorpartikel, die MLV gag-pol Kernpartikel enthalten, und in einen Moloney MLV nlsLacZ retroviralen Vektor eingebaut.
    • 2. Sowohl die Wildtyp- als auch EGF-chimären Vektoren sind in der Lage, menschliche Zelllinien zu infizieren.
    • 3. Der Titer der EGF-Chimäre ist in EGF-Rezeptor positiven Zelllinien erheblich verringert und kann durch Faktor Xa-Spaltung der präsentierten Domäne erhöht werden. Die größte Verringerung im Titer wird bei Zelllinien mit der höchsten Dichte an EGF-Rezeptoren gesehen.
    • 4. Daher ergibt die Präsentation von EGF als ein N-terminaler Anhang des SU-Glykoproteins vom Gibbon Affen Leukämievirus einen veränderten viralen Tropismus, der ähnlich zu dem ist, den man bei Präsentation von EGF auf den Maus Leukämievirus Hüllen sieht (Nilson et al., Gene Ther. 3, 280, 1996) und wahrscheinlich EGF-Rezeptor vermittelt ist.

Claims (10)

  1. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in der Gentherapie einer bösartigen Erkrankung, umfassend einen rekombinanten Nukleinsäurevektor in Beimischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei der Vektor die Expression auf einer eukaryotischen Zelloberfläche einer fusogenen Kombination von getrennten paramyxoviralen Glykoproteinen oder eines fusogenen Membranpolypeptids, das von einem einzelnen paramyxoviralen Glykoprotein verschieden ist, steuert.
  2. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in der Gentherapie einer bösartigen Erkrankung, umfassend eine Kombination aus ersten und zweiten rekombinanten Nukleinsäurevektoren in Beimischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei die ersten und zweiten Vektoren zusammen die Expression auf einer eukaryotischen Zelloberfläche einer fusogenen Kombination von getrennten paramyxoviralen Glykoproteinen steuern.
  3. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Vektor oder die Vektorkombination innerhalb einer Wirtszelle vorliegt.
  4. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, umfassend einen Vektor, der die Expression auf einer eukaryoten Zelloberfläche eines Masern Virus H Proteins, das an seinem C Terminus mit einem anderen Polypeptid fusioniert ist, steuert.
  5. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Vektor die Expression von wenigstens einem fusogenen Anteil eines viralen fusogenen Membranglykoproteins (FMG) steuert.
  6. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, wobei der Vektor die Expression eines nicht natürlicherweise vorkommenden Polypeptids steuert.
  7. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, wobei der Vektor oder die Vektorkombination die Expression eines fusogenen Membranglykoproteins steuert, die eine künstlich eingeführte Protease-Sensitivität oder Bindungsspezifität oder erhöhte Fusogenität aufweist:
  8. Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, umfassend eine Vielzahl von Wirtszellen, die Wirtszellen sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: neoplastischen Zellen, wandernden Zellen, T Lymphozyten, B Lymphozyten und anderen hämatopoetischen Zellen.
  9. Verwendung eines rekombinanten Nukleinsäurevektors in der Herstellung eines Medikaments, um eine bösartige Erkrankung in einem humanen Patienten zu behandeln, wobei das Medikament eine Zusammensetzung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche aufweist.
  10. Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei der Vektor in einer Wirtszelle anwesend ist.
DE69828874T 1997-03-11 1998-03-10 Zusammensetzungen und verfahren zur eliminierung unerwünschter zellen Expired - Lifetime DE69828874T2 (de)

Applications Claiming Priority (5)

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GBGB9705007.4A GB9705007D0 (en) 1997-03-11 1997-03-11 Improvements in or relating to therapeutic genes
GB9705007 1997-03-11
US4516497P 1997-04-30 1997-04-30
US45164P 1997-04-30
PCT/GB1998/000710 WO1998040492A1 (en) 1997-03-11 1998-03-10 Compositions and methods for elimination of unwanted cells

Publications (2)

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