JP2001525816A - 治療における腫瘍壊死因子アルファおよび血管内皮成長因子の抑制 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 個体においてＴＮＦ媒介疾患を治療および／または予防する方法を開示する。また、ＴＮＦαアンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニストを含有してなる組成物を開示する。ＴＮＦ媒介疾患には、リューマチ性関節炎、クローン病、ならびに移植に関連する急性および慢性の免疫疾患が含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】 治療における腫瘍壊死因子アルファおよび血管内皮成長因子の抑制 発明の背景 単球とマクロファージは、エンドトキシンその他の刺激に応答して、腫瘍壊死 因子アルファ（ＴＮＦα）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）およびインター ロイキン−６（ＩＬ−６）として知られるサイトカインを分泌する。ＴＮＦαは １７ｋＤタンパク質サブユニットの可溶性ホモ三量体である（Ｓｍｉｔｈら，Ｊ ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：６９５１〜６９５４（１９８７））。ＴＮＦの 膜結合型２６ｋＤ前駆体も存在する（Ｋｒｉｅｇｌｅｒら，Ｃｅｌｌ，５３：４ ５〜５３（１９８８））。ＴＮＦの総説については、Ｂｅｕｔｌｅｒら，Ｎａｔ ｕｒｅ，３２０：５８４（１９８６）；Ｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：６３ ０（１９８６）；およびＬｅら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，５６：２３４（１９ ８７）を参照のこと。 単球やマクロファージ以外の細胞もＴＮＦαを産生する。例えば、ヒト非単球 腫瘍細胞系はＴＮＦαを産生する（Ｒｕｂｉｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６ ４：１３５０（１９８６）；Ｓｐｒｉｇｇｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：６５６３（１９８７））。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋末 梢血Ｔリンパ球といくつかの培養ＴおよびＢ細胞系（Ｃｕｔｕｒｉら，Ｊ．Ｅｘ ｐ．Ｍｅｄ．，１６５：１５８１（１９８７）；Ｓｕｎｇら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ ｄ．，１６８：１５３９（１９８８）；Ｔｕｒｎｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕ ｎｏｌ．，１７：１８０７〜１８１４（１９８７））もＴＮＦαを産生する。 ＴＮＦαは、軟骨および骨の崩壊（Ｓａｋｌａｔｖａｌａ，Ｎａｔｕｒｅ，３ ２２：５４７〜５４９（１９８６）；Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ，Ｎａｔｕｒｅ，３１ ９：５１６〜５１８（１９８６））、接着分子の誘導や、血管内皮細胞に対する 凝血促進活性を誘導したり（Ｐｏｂｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３６：１ ６８０（１９８６））、好中球とリンパ球の接着性を増大させたり（Ｐｏｂｅｒ ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８：３３１９（１９８７））、マクロファージ 、好中球および血管内皮細胞からの血小板活性化因子の放出を刺激する（Ｃａｍ ｕｓｓｉら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６６：１３９０（１９８７））など、組 識損傷をもたらす前炎症性作用を引き起こす。 ＴＮＦαと感染症（Ｃｅｒａｍｉら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，９：２８ （１９８８））、免疫疾患、腫瘍性の病状（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ）（Ｏｌｉ ｆｆら，Ｃｅｌｌ，５０：５５５（１９８７））、自己免疫疾患および移植片対 宿主疾患（Ｐｉｇｕｅｔら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６６：１２８０（１９８ ７））とを結びつける証拠がある。ＴＮＦαの癌および感染病との関連性は、し ばしば宿主の異化状態に関連する。癌患者は、通常食欲不振を伴う体重減少を起 こす。 癌と他の疾患に伴う広範な消耗は、「悪液質」として知られている（Ｋｅｒｎ ら，Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｅｎｔｅｒ．Ｎｕｔｒ．，１２：２８６〜２９８（１９ ８８））。悪液質には、悪性腫瘍に呼応した漸進的体重減少、食欲不振、細身の 体重の持続的侵食が含まれる。悪液質状態は、高い癌罹患率および死亡率の原因 になる。ＴＮＦαは、癌、感染病および他の異化状態での悪液質に関与するとい う証拠がある（例えば、ＢｅｕｔｌｅｒおよびＣｅｒａｍｉ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：６２５〜６５５（１９８９）を参照されたい）。 ＴＮＦαは、発熱、倦怠感、食欲不振および悪液質を含むグラム陰性敗血症と 内毒素性ショックに中心的役割を果たすと考えられる（Ｍｉｃｈｉｅら，Ｂｒ． Ｊ．Ｓｕｒｇ．，７６：６７０〜６７１（１９８９）；Ｄｅｂｅｔｓら，Ｓｅｃ ｏｎｄ Ｖｉｅｎｎａ Ｓｈｏｃｋ Ｆｏｒｕｍ，４６３〜４６６頁（１９８９ ）；Ｓｉｍｐｓｏｎら，Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｃｌｉｎ．，５：２７〜４７（１ ９８９））。内毒素は、ＴＮＦαと他のサイトカイン類の単球／マクロファージ 産生および分泌を強く活性化する（Ｋｏｒｎｂｌｕｔｈら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ．，１３７：２５８５〜２５９１（１９８６））。ＴＮＦαと他の単球由来サイ トカイン類は、内毒素に対する代謝および神経ホルモン反応を媒介する（Ｍｉｃ ｈｉｅら，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１８：１４８１〜１４８６（１ ９８８））。ヒトのボランティアに対する内毒素の投与は、発熱、頻脈、代謝速 度の増加とストレスホルモン放出の増加を含むインフルエンザ様の症状を伴う急 性疾患を引き起こす（Ｒｅｖｈａｕｇら，Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．，１２３：１６ ２〜１７０（１９８８））。グラム陰性敗血症にかかった患者では、循環ＴＮＦ αが増加する（Ｗａａｇｅら，Ｌａｎｃｅｔ，１：３５５〜３５７（１９８７） ；Ｈａｍｍｅｒｌｅら，Ｓｅｃｏｎｄ Ｖｉｅｎｎａ Ｓｈｏｃｋ Ｆｏｒｕｍ ，７１５〜７１８頁（１９８９）；Ｄｅｂｅｔｓら，Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅ ｄ．，１７：４８９〜４９７（１９８９）；Ｃａｌａｎｄｒａら，Ｊ． Ｉｎｆ ｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６１：９８２〜９８７（１９９０））。 このようにＴＮＦαは、炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス、細菌および寄 生虫感染症、悪性腫瘍および／またはニューロジェネレイティブ（ｎｅｕｒｏｇ ｅｎｅｒａｔｉｖｅ）疾患と関連づけられており、慢性関節リウマチやクローン 病などの疾患において特異的生物学的療法の有用な標的である。ＴＮＦαに対す るキメラモノクローナル抗体（ｃＡ２）を用いたオープンラベル（ｏｐｅｎ−ｌ ａｂｅｌ）試験では、慢性関節リウマチ（Ｅｌｌｉｏｔｔら，Ａｒｔｈｒｉｔｉ ｓ Ｒｈｅｕｍ．，３６：１６８１〜１６９０（１９９３）；Ｅｌｌｉｏｔｔら ，Ｌａｎｃｅｔ，３４４：１１２５〜１１２７（１９９４））とクローン病（Ｖ ａｎ Ｄｕｌｌｅｍｅｎら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１０９：１２ ９〜１３５（１９９５））における炎症の抑制と再発後の再治療の成功と共に、 有益な効果が報告されている。ｃＡ２を用いた無作為二重盲プラセボ対照試験に おける有益な結果も、炎症の抑制と共に、慢性関節リウマチで報告されている（ Ｅｌｌｉｏｔｔら，Ｌａｎｃｅｔ，３４４：１１０５〜１１１０（１９９４）） 。これらの有益な効果は、一部には、炎症性細胞の滑膜への移行量の減少と、Ｉ Ｌ−１などの炎症誘発性サイトカイン類の放出の抑制によって媒介される（Ｂｒ ｅｎｎａｎら，Ｌａｎｃｅｔ，２：２４４〜２４７（１９８９）；Ｆｅｌｄｍａ ｎｎら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４：３９７〜４４０（１９９６ ）；Ｐａｌｅｏｌｏｇら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，３９：１０８２ 〜１０９１（１９９６））。 血管透過性因子またはバスキュロトロピン（ｖａｓｃｕｌｏｔｒｏｐｉｎ）と しても知られる血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、拡散性の内皮細胞特異的有糸 分裂促進性血管由来因子であり、これは血管の透過性を増加させることもできる （Ｆｅｒｒａｒａ，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．，３６ （２）：１２７〜１３７（１９９５））。ＶＥＧＦは、４つのイソ型からなる約 ３４〜４５ｋＤａのジスルフィド結合型ホモ二量体糖タンパク質である（成熟モ ノマー中に１２１、１６５、１８９または２０６アミノ酸残基を含む）（例えば Ｆｅｒｒａｒａ，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．，３６： １２７〜１３７（１９９５）；Ｄｖｏｒａｋら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，１４６ （５）：１０２９〜１０３９（１９９５）；Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ ｅｍ．，２７１：６０３〜６０６（１９９６）を参照されたい）。ＶＥＧＦ₁₂₁ とＶＥＧＦ₁₆₅の大部分とが可溶型として分泌されるのに対し、ＶＥＧＦ₁₈₉とＶ ＥＧＦ₂₀₆は細胞に結合したままである（例えば、Ｆｅｒｒａｒａ，Ｂｒｅａｓ ｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．，３６：１２７〜１３７（１９９５） ；Ｄｖｏｒａｋら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，１４６（５）：１０２９〜１０３９ （１９９５）；Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：６０３〜６ ０６（１９９６）を参照されたい）。 ＶＥＧＦは、膜貫通型チロシンキナーゼレセプター、ｆｍｓ様チロシンキナー ゼレセプター（Ｆｌｔ）（ｄｅＶｒｉｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：９８９ 〜９９１（１９９２）；Ｓｈｉｂｕｙａら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，５：５１９〜５ ２４（１９９０））およびキナーゼインサートドメイン含有レセプター（ｋｉｎ ａｓｅ ｉｎｓｅｒｔ ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏ ｒ）（ＫＤＲ）（Ｔｅｒｍａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．，１８７：１５７９〜１５８６（１９９２））と相互作用するこ とにより、内皮細胞の増殖を刺激し、微小血管の透過性を増加させる。ＫＤＲの ネズミホモログは、胎仔肝キナーゼレセプター（Ｆｌｋ）である（Ｑｕｉｎｎら ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７５３３〜７５３７ （１９９３））。（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔ ｒｅａｔ．，３６：１２７〜１３７（１９９５）；Ｄｖｏｒａｋら，Ａｍ．Ｊ． Ｐａｔｈ．，１４６（５）：１０２９〜１０３９（１９９５）も参照されたい。 ）。 最近得られた証拠により、ＶＥＧＦと、血管新生に関係する一連の疾患の病因 とを関連付けている。例えば、ＶＥＧＦは、充実性腫瘍、腹水腫瘍、治癒途中の 創傷、慢性関節リウマチ、乾癬および糖尿病性網膜症の慢性的血管透過性亢進お よび血管新生と関連づけられている（例えばＢｒｏｗｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ．，１５４（６）：２８０１〜２８０７（１９９５）；Ｄｖｏｒａｋら，Ｉｎｔ ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０７：２３３〜２３５（１ ９９５）；Ｆｅｒｒａｒａ，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ ．，３６（２）：１２７〜１３７（１９９５）；Ａｉｅｌｌｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２（２３）：１０４５７〜１０４６１（ １９９５）；Ａｄａｍｉｓら，Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．，１１４：６ ６〜７１（１９９６）：Ｋｏｃｈら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：４１４９ 〜４１５６（１９９４）；Ｐｅａｃｏｃｋら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５： １１３５〜１１３８（１９９２）を参照されたい）。 ＶＥＧＦ発現は、例えば癌、増殖性網膜症、乾癬および慢性関節リウマチ（Ｒ Ａ）などの病的状態では上昇すると報告されている（例えばＣｌａｆｆｅｙら， Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．，１５（２）：１６５〜１７６ （１９９６）；Ｋｏｃｈら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：４１４９〜４１５ ６（１９９４）を参照されたい）。例えば血清ＶＥＧＦレベルはＰＯＥＭＳ（多 発性神経障害、臓器巨大症、内分泌障害、Ｍタンパク質および皮膚変化）症候群 を持つ人々では健常者より高いと報告されている（Ｋｏｎｄｏら，Ｂｉｏｃｈｉ ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２２１：２１１〜２１４（１９９４）；Ｓｏ ｕｂｒｉｅｒら，Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕｍ．，３９：Ｓ１３１（１９９６）；Ｗａ ｔａｎａｂｅら，Ｌａｎｃｅｔ，３４７：７０２（１９９６））。 ＶＥＧＦタンパク質とＶＥＧＦ ｍＲＮＡはＲＡ患者の滑膜中でマクロファー ジと管壁細胞に局在化されており、ＶＥＧＦレセプターはＶＥＧＦの標的と推定 されるＲＡ滑膜内皮細胞によって発現される（Ｋｏｃｈら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ．，１５２：４１４９〜４１５６（１９９４）；Ｆａｖａら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ ｄ．，１８０：３４１〜３４６（１９９４））。慢性低酸素症に呼応したＶＥＧ Ｆ産生量の増加が報告されており（Ｔｕｄｅｒら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ ．，９５：１７９８〜１８０７（１９９５））、関節内圧が滑膜毛細血管圧を上 回る場合、ＲＡでは低酸素状態が優勢である（Ｂｌａｋｅら，Ｌａｎｃｅｔ，８ ６３３：２８９〜２９３（１９８９））。 ＲＡの動物モデルでは、血管新生の阻害物質が、パンヌス形成を抑制し、血清 ＶＥＧＦ濃度を低下させる共に、疾患の発症を防止し、慢性関節炎を有意に抑制 することが見出されている（Ｏｌｉｖｅｒら，Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏ ｌ．，１５７：２９１〜２９９（１９９４）；Ｏｌｉｖｅｒら，Ｃｅｌｌｕｌａ ｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６：１９６〜２０６（１９９６））。 しかしながら、慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患の治療には改良された方 法が望ましい。 発明の要約 本発明は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）アンタゴニストと血管内皮増殖因子（ ＶＥＧＦ）アンタゴニストをその個体に治療有効量または相乗作用量で同時投与 するステップを含む、治療または予防の必要を有する個体の腫瘍壊死因子媒介性 疾患を治療および／または予防する方法を提供する。また本発明は、ＴＮＦαア ンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニストとをその個体に治療有効量で同時投与す るステップを含む、治療または予防の必要を有する個体のＴＮＦ媒介性疾患の再 発を治療および／または予防する方法をも提供する。ＴＮＦ媒介性疾患としては 、リューマチ性関節炎、クローン病、同種移植（例えば腎臓、心臓、骨髄、肝臓 、膵臓、小腸、皮膚または肺移植）に伴う急性および慢性免疫疾患が挙げられる 。 一態様として、本発明は、ＴＮＦαアンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニスト とを個体に治療有効量で同時投与するステップを含む、個体のリューマチ性関節 炎を治療または予防（例えばその再発を予防）する方法に関する。第二の態様と して、本発明は、ＴＮＦαアンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニストとをその個 体に治療有効量で同時投与するステップを含む、個体のクローン病を治療および ／または予防（その再発を予防など）する方法に関する。第三の態様として、本 発明は、ＴＮＦαアンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニストとをその個体に治療 有効量で同時投与するステップを含む、個体において移植に伴う急性または慢性 免疫疾患を治療および／または予防する方法に関する。 ＴＮＦαアンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニストとの治療的同時投与に組み 合わせて、他の治療養生および他の治療薬を使用できる。例えば、具体的態様と して、メトトレキサートがＴＮＦαアンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニス トと共に治療有効量または相乗作用量で同時投与される。 さらに、本発明は、例えば、治療用の、または前記疾患治療用薬剤を製造する ための、ＴＮＦαアンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニストとを含有した組成物 に関する。具体的態様として、本組成物は、さらにメトトレキサートを含有する 。 本発明で有用なＴＮＦαアンタゴニストとしては、抗ＴＮＦα抗体とその抗原 結合性断片；ＴＮＦαに特異的に結合するレセプター分子；ＴＮＦα合成、ＴＮ Ｆα放出または標的細胞に対するその作用を阻止および／または抑制する化合物 、例えばサリドマイド、テニダップ（ｔｅｎｉｄａｐ）、ホスホジエステラーゼ 阻害剤（例；ペントキシフィリン、ロリプラム）、Ａ２ｂアデノシンレセプター アゴニストおよびＡ２ｂアデノシンレセプターエンハンサー数など；ＴＮＦαレ セプターシグナル伝達を阻止および／または抑制する化合物、例えばマイトジェ ン活性化プロテイン（ＭＡＰ）キナーゼ阻害剤など；膜ＴＮＦα切断をブロック および／または抑制する化合物、例えばメタロプロテイナーゼ阻害剤など；ＴＮ Ｆα活性をブロックおよび／または抑制する化合物、例えばアンギオテンシン変 換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（例；カプトプリル）；ＴＮＦαの産生および／または 合成をブロックおよび／または抑制する化合物、例えばＭＡＰキナーゼ阻害剤な どが含まれる。 本発明で有用なＶＥＧＦアンタゴニストとしては、抗ＶＥＧＦ抗体とその抗原 結合性断片；ＶＥＧＦに特異的に結合するレセプター分子；ＶＥＧＦ機能を阻止 および／または抑制する化合物（例えばスラミン、プロテインチロシンキナーゼ （ＰＴＫ）阻害剤（例えば、ラベンズスチンＡ（ｌａｖｅｎｄｕｓｔｉｎ Ａ） ）；ＶＥＧＦレセプターまたはその細胞外ドメインへのＶＥＧＦの結合を阻止お よび／または抑制する化合物（例えば血小板因子４（ＰＦ−４））；ＶＥＧＦレ セプターシグナル伝達をブロックおよび／または妨害する化合物；ＶＥＧＦ活性 化をブロックおよび／または妨害する化合物（例えばミトラマイシン）が挙げら れる。本発明で有用なＶＥＧＦアンタゴニストとしては、ＶＥＧＦの産生および ／または合成を駆動するシグナルのアンタゴニストである物質、例えばＴＧＦβ またはそのリガンドを減少および／またはブロックする物質が挙げられる。 図面の簡単な説明 本発明の上記およびその他の目的、特徴および利点は、同じ参照符号はどの図 面でも同じ部分を指す添付の図面に示すように、下記の本発明の好ましい態様の より具体的な説明から明らかになるだろう。図面は必ずしも一定の縮尺で描かれ ているわけではなく、本発明の原理を説明することに重点が置かれている。 図１は、ＴＮＦαまたはＩＬ−１αの非存在下または存在下での刺激後に単球 細胞、内皮細胞およびＲＡ線維芽細胞によって分泌される、ＥＬＩＳＡで決定し たＶＥＧＦ濃度を示すグラフである。各値は、３回の測定の平均±ＳＤであり、 ３回の同様の実験の代表例である。 図２Ａは、年齢と性別が合致した非関節炎患者とＲＡ患者における、ＥＬＩＳ Ａで決定した血清ＶＥＧＦ濃度を示すグラフである。 図２Ｂは、血清ＶＥＧＦ濃度とＣ反応性タンパク質レベルとの間の相関度を示 すグラフである。 図３は、プラセボ、１ｍｇ／ｋｇ抗ＴＮＦα抗体ｃＡ２または１０ｍｇ／ｋｇ 抗ＴＮＦα抗体ｃＡ２の点滴後のＲＡ患者における、ＥＬＩＳＡで決定した血清 ＶＥＧＦレベルを示すグラフである。 図４Ａは、３ｍｇ／ｋｇの抗ＴＮＦα抗体ｃＡ２（第０、２、６、１０および １４週に点滴）、メトトレキサート（７．５ｍｇ／週）またはｃＡ２とメトトレ キサートの組み合わせによる治療後のＲＡ患者における血清ＶＥＧＦレベルを示 すグラフである。 図４Ｂは、メトトレキサート（７．５ｍｇ／週）のみ、もしくは１ｍｇ／ｋｇ 、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの抗ＴＮＦα抗体ｃＡ２（第０、２、６、 １０および１４週に点滴）とメトトレキサート（７．５ｍｇ／週）との併用によ る治療後のＲＡ患者における血清ＶＥＧＦレベルを示すグラフである。 発明の詳細な説明 本明細書に記載された研究は、ＶＥＧＦの産生がＴＮＦαやＩＬ−１などの前 炎症サイトカインによって誘導されうることと、生体内でのＴＮＦα活性のブロ ックがＶＥＧＦの循環濃度を低下させることを示す。血管新生に関連する疾患で は、循環中に存在する過剰のＶＥＧＦが患部組織で産生されるようである。ＶＥ ＧＦは強力で特異的な血管新生の誘導物質なので、循環ＶＥＧＦの低下は血管新 生を起こす傾向の低下を反映する。したがってＴＮＦαの長期にわたるブロック は患部組織における新生血管形成を、それゆえ細胞質量を減少させうる。 リューマチ性関節炎病変の顕著な特徴は、顕著な新しい造血（ｎｅｗ ｂｌｏ ｏｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に関連し、それゆえ栄養素と細胞の移入を永続させ る侵襲性パンヌスと共に、血液からの炎症細胞の浸潤、および最終的には骨と軟 骨の破壊につながる炎症反応である。ＶＥＧＦは、血管新生の強力な誘導物質で あり、ＲＡにおける血管の形成と微小血管内皮の活性化に関連づけられていた。 本明細書に記載されたデータは、ＶＥＧＦ血清濃度が進行中のＲＡ患者では健 常者でのＶＥＧＦ血清濃度と比較して有意に上昇し、またそれが、ＲＡにおける 炎症と疾患活動度のマーカーであるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）と相関するこ とを示す。ＣＲＰの産生は、前炎症サイトカイン類によって調節され、その総産 生量は疾患の進行速度とよく相関する。さらに、疾患症状の軽減につながる抗Ｔ ＮＦαモノクローナル抗体によるＲＡ患者の処置は、血清ＶＥＧＦ濃度の有意で 持続的な低下をもたらす。抗ＴＮＦαモノクローナル抗体とメトトレキサートと の併用によるＲＡ患者の処置は、抗ＴＮＦα抗体のみまたはメトトレキサートの みで処置された患者と比較して、より持続的な血清ＶＥＧＦレベルの低下をもた らす。血清ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦの合成を反映するであろうため、生体内でのＶ ＥＧＦ産生はサイトカイン依存的であることが示唆される。 ＶＥＧＦは、増加した血管透過性の誘導と血管液の周辺組織への漏出をもたら す。リウマチ様関節では、血管外液の存在が詳細に実証されており、臨床的には 関節滲出液として明らかである。さらにまた、抗ＴＮＦα抗体によるＲＡ患者の 治療が、ＭＲＩ撮像法によって決定される関節液含量の減少をもたらすことも確 認されている（Ｋａｌｄｅｎ−Ｎｅｍｅｔｈら，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｉｎｔ． ，１６：２１９（１９９７））。これは、ＶＥＧＦが、抗ＴＮＦαによる処置後 に迅速に減少するＲＡでの関節の腫脹にもある役割を果たすことを示唆している 。 また本データは、ＲＡにおける血清ＶＥＧＦ濃度上昇の一因であるとの仮説を 立て得る単球細胞、内皮細胞および滑膜線維芽細胞が、ＶＥＧＦを構成的に分泌 することと、ＲＡ滑膜細胞による自発的なＶＥＧＦの放出が、サイトカイン活性 の阻害物質、すなわち抗ＴＮＦα抗体とＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（Ｉ Ｌ−１ｒａ）の存在下で著しく減少することを示す。ＩＬ−１ｒａと抗ＴＮＦα 抗体による滑膜細胞からのＶＥＧＦ分泌の減少は、インビボでの血清ＶＥＧＦ産 生が炎症誘発性サイトカインによって調節されることの証拠となる。 コラゲナーゼ／ＤＮアーゼ消化によるＲＡ滑膜細胞の単離は、主として単核細 胞とそれより少ない程度の線維芽細胞とからなる不均質な細胞集団を与える（Ｂ ｒｅｎｎａｎら，Ｌａｎｃｅｔ，２：２４４〜２４７（１９８９）；Ｂｕｃｈａ ｎら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７３：４４９〜４５５（１９８８ ））。これらの細胞を長期間（最長９日間）培養すると、接着性線維芽細胞様細 胞の出現を伴って、ＣＤ１４＋、ＣＤ４５＋およびＣＤ３＋細胞数の減少が起こ る。最も早いＶＥＧＦの細胞培養上清への検出可能な放出は、２４時間時点で観 察された。しかしながら、ＲＡ滑膜細胞の培養上清中のＴＮＦαレベルが迅速（ 播種後２時間以内）に増加した後、培養５〜６日までに検出不可能なレベルに戻 るのとは対照的に、培養中のＶＥＧＦレベルは単離の９日後でさえ増加しつづけ た（Ｂｕｃｈａｎら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７３：４４９〜４ ５５（１９８８））。マクロファージ様細胞は、ＲＡ滑膜外植片培養におけるＴ ＮＦαの主な供給源であるが、ＶＥＧＦは、単球細胞と線維芽細胞の両方によっ て放出される。これは、ＴＨＰ−１細胞と滑膜線維芽細胞を用いた本明細書に記 載のデータと一致する。 ＶＥＧＦ分泌に関して、ＴＮＦαとＩＬ−１に対するＲＡ滑膜線維芽細胞、内 皮細胞および単球細胞の弁別的なインビトロ感受性は、血清ＶＥＧＦの減少が、 抗ＴＮＦα抗体によるＴＮＦα活性のインビボブロックと、ＴＮＦαブロックの 結果起こるＩＬ−１活性のインビボブロックに続いて、単球／マクロファージと 微小血管内皮細胞によるＶＥＧＦ産生量が減少する結果であることを示唆してい る。滑膜外植片培養は、マクロファージ様細胞（これはＴＮＦαに応答してＶＥ ＧＦを放出する）と線維芽細胞（この細胞からの分泌は、ＩＬ−１のみによって 誘導される）の両方からなる。これらの細胞は、細胞上清へのＶＥＧＦ放出に様 々な度合いの貢献をする。このように、ＲＡ患者におけるＶＥＧＦ産生の最適な 阻害には、ＴＮＦα活性とＩＬ−１活性の両方のブロックが必要でありうる。 滑膜線維芽細胞はＴＮＦαに応答して有意な量のＶＥＧＦを分泌しえなかった ものの、ＩＬ−１がこれらの細胞にとって強力な刺激物質であることが見出され たし、かつ抗ＴＮＦα抗体処理はＴＮＦαの下流のサイトカイン類のカスケード を不活性化するので、線維芽細胞によるＶＥＧＦの放出へのさらなる間接的影響 がありうる（Ｂｒｅｎｎａｎら，Ｌａｎｃｅｔ，２：２４４〜２４７（１９８９ ））。抗ＴＮＦα抗体による血清ＶＥＧＦ濃度の不完全な減少は、きっと、ＶＥ ＧＦ産生のサイトカイン非依存性成分、例えは、低酸素症によるものなどのイン ビボの存在によるものであろう（Ｂｌａｋｅら，Ｌａｎｃｅｔ，８６３３：２８ ９〜２９３（１９８９）；およびおＴｕｄｅｒら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ ．，９５：１７９８〜１８０７（１９９５））。さらにまた、単球細胞、内皮細 胞および線維芽細胞は、外からの刺激がなくても有意な量のＶＥＧＦを放出する 。 これらの結果は、ＴＮＦαとＩＬ−１とを含む前炎症性サイトカイン類が試験 管内と生体内でＶＥＧＦ産生の調節に関与することを明らかに示している。とり わけ、抗ＴＮＦα抗体処置後の血清濃度の減少から判断されるように、ＴＮＦα は生体内でＶＥＧＦ産生を調節することから、抗ＴＮＦα抗体治療法の利益の一 部が血管新生の減少によるものでありうることと、長期間にわたるＴＮＦαブロ ックが新生血管形成を、したがってパンヌスの細胞量とその破壊能力とを減少さ せうることが示唆される。 したがって、ＶＥＧＦと血管形成経路の他の成分とは、ＲＡにおいて、抗ＴＮ Ｆα療法による相乗作用を樹立するのに適した標的である。したがって、本発明 は、ＴＮＦαアンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニストとを個体に治療有効量ま たは相乗作用量で同時投与するステップを含む、個体のＴＮＦ媒介性疾患を治療 および／または予防する方法を包含する。さらに本発明は、ある個体のＴＮＦ媒 介性疾患の再発を治療および／または予防する方法であって、ＴＮＦαアンタゴ ニストとＶＥＧＦアンタゴニストとをその個体に治療有効量で同時投与すること を含んでなる方法に関する。ＴＮＦαアンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニスト とは、同時にまたは逐次的に投与できる。ＴＮＦαアンタゴニストとＶＥＧＦア ンタゴニストとは、それぞれ単回で、または複数回に分割して投与できる。複数 のＶＥＧＦアンタゴニストと複数のＴＮＦアンタゴニストとを同時投与できる。 他の治療養生と治療薬とをＴＮＦαアンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニストと の治療的同時投与に組み合わせて使用できる。例えば、具体的態様として、メト トレキサートを治療有効量または相乗作用量で、ＴＮＦαアンタゴニストおよび ＶＥＧＦアンタゴニストと同時投与する。 本明細書でいう「ＴＮＦ媒介性疾患」とは、ＴＮＦ関連病または疾患を指す。 ＴＮＦ関連病または疾患として、限定されないが、下記のものが挙げられる： （Ａ）炎症性疾患、限定されないが、急性および慢性免疫ならびに自己免疫疾 患など、限定されないが、リューマチ性関節炎（ＲＡ）、若年性慢性関節炎（Ｊ ＣＡ）、脊椎関節症、甲状腺炎、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、強皮症、糖尿 病、グレーブス病、アレルギーなど；例えば限定されないが、腎移植、心臓移植 、骨髄移植、肝臓移植、膵臓移植、小腸移植、肺移植および皮膚移植などの同種 移植に伴う急性または慢性免疫疾患；限定されないが、サルコイドーシス、慢性 炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病または疾患などの慢性炎症病；血管炎 症病、例えば播種性血管内凝固、アテローム性動脈硬化、川崎病、例えば限定さ れないが、結節性多発性動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、ヘノッホ−シェーンライ ン紫斑病、巨細胞性動脈炎、腎臓の微視的脈管炎などの脈管炎症候群；慢性活動 性肝炎：シェーグレン症候群；脊椎関節症、例えば限定されないが、強直性脊椎 炎、乾癬性関節炎と脊椎炎、腸性関節炎と脊椎炎、活動性関節炎と炎症性腸疾患 に伴う関節炎など；ならびにブドウ膜炎など； （Ｂ）感染症、限定されないが、例えば、急性または慢性細菌感染による敗血 症症候群、悪液質、循環虚脱およびショック、急性および慢性寄生虫性疾患およ び／またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などの細菌、ウイルスまたは菌類性 の感染性疾患、（悪液質、自己免疫障害、ＡＩＤＳ痴呆症候群および感染症の症 状を含む）後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）など； （Ｃ）神経変性疾患、例えば多発性硬化症や急性横断性脊髄炎など（ただしこ れらに限らない）の脱髄疾患；重症筋無力症；皮質脊髄系の損傷などの錐体外路 系および小脳性疾患；大脳基底核の障害または小脳障害；ハンチントン舞踏病や 老年性舞踏病などの多動性運動障害；薬物誘発性運動障害、例えば中枢神経系（ ＣＮＳ）ドーパミンレセプターをブロックする薬物によって誘導されるものなど ；パーキンソン病などの減動性運動障害；進行性核上麻痺；小脳および脊髄小脳 性障害、例えば小脳の非構造的（ａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ）病変など；脊髄小脳 変性症（脊髄性運動失調、フリードライヒ失調症、小脳皮質変性、多系統変性（ マンセル、デジェリーヌ−トーマス、シ−ドレーガー、マシャドヨセフ）；全身 性障害（レフサム病、無β−リポ蛋白血症、運動失調、毛細血管拡張症、ミトコ ンドリアマルチシステム障害）；運動単位の障害、例えば神経原性筋萎縮症（筋 萎縮性側索硬化症、乳児脊髄筋萎縮、若年性脊髄性筋萎縮症などの前角細胞変性 ）など；アルツハイマー病；中年のダウン症候群；広汎性レビ小体疾患；レビ小 体型の老人性痴呆症；ウェルニッケ・コルサコフ症候群；慢性アルコール中毒症 ；原発性胆汁性肝硬変；特発性線維性肺胞炎と他の線維性肺疾患；溶血性貧血； クロイツフェルト・ヤコブ病；亜急性硬化性全脳炎、ハレルフォルデン・スパッ ツ病；ボクサー痴呆など、またはそれらの任意のサブセット； （Ｄ）悪性疾患、例えばＴＮＦα分泌性腫瘍またはＴＮＦαが関与する他の悪 性腫瘍など、例えば白血病（急性、慢性骨髄性、慢性リンパ球性および／または 骨髄異形成症候群）；リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、例えば悪 性リンパ腫（バーキットリンパ腫または菌状息肉症）など）； （Ｅ）過剰なＴＮＦαが関与する悪液質症候群とその他の病状および疾患、例 えば、限定されないが、癌、寄生虫性疾患および心不全の悪液質； （Ｆ）アルコール性肝炎と他の型の慢性肝炎； （Ｇ）血管新生またはＶＥＧＦ／ＶＰＦ産生が役割を果たす疾患、例えば、限 定されないが、眼新生血管形成、乾癬、十二指腸潰瘍、女性生殖路の血管新生、 慢性関節炎、例えば変形性関節症絨毛結節性滑膜炎や血友病性関節炎などの出血 性疾患に伴う慢性関節炎など。 例えば、参考文献として本明細書に取り込まれる、Ｂｅｒｋｏｗら編，Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ，第１６版，第１１章，１３８０〜１５２９頁（Ｍ ｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．社，ニュージャージー州ローウェイ，１９９２）を参 照されたい。 「再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）」「再燃」または「再発（ｒｅｌａｐｓｅ） 」という用語は、その疾患状態の１以上の症状の再顕現を包含するものとする。 例えばリューマチ性関節炎の場合、再発としては、腫れ上がった関節、朝のこわ ばりまたは関節圧痛の１以上の経験を挙げることができる。 一態様として、本発明は、ＴＮＦαアンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニスト をその個体に治療有効量または相乗作用量で同時投与するステップを含む、個体 のリューマチ性関節炎を治療および／または予防する方法に関する。 第二の態様として、本発明は、ＴＮＦαアンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニ ストをその個体に治療有効量または相乗作用量で同時投与するステップを含む、 個体のクローン病を治療および／または予防する方法に関する。 第三の態様として、本発明は、ＴＮＦαアンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニ ストをその個体に治療有効量または相乗作用量で同時投与するステップを含む、 個体における同種移植に伴う急性または慢性免疫疾患を治療および／または予防 する方法に関する。本明細書で用いられる「移植」としては、腎臓移植、心臓移 植、骨髄移植、肝臓移植、膵臓移植、小腸移植、皮膚移植、肺移植などの器官、 組織または細胞移植が含まれる。 具体的態様として、本発明の方法はさらに、メトトレキサートをその個体に治 療有効量または相乗作用量で投与するステップを含む。 ＴＮＦαアンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニストによる併用療法の利益は、 それぞれのアンタゴニスト単独による治療で得られるものと比較して有意に改善 された応答である。ＴＮＦαアンタゴニストと、メトトレキサートと、ＶＥＧＦ アンタゴニストとによる併用療法も、それぞれの薬物単独での治療で得られるも のと比較して有意に改善された応答を与える。例えば、ＶＥＧＦアンタゴニスト は、相乗効果が達成するように、ＴＮＦαアンタゴニストまたはＴＮＦαアンタ ゴニストとをメトトレキサートとを組み合わせて投与できる。また、同じ治療応 答を得るのに、より低い投与量を使用することができるので、治療効果と毒性効 果の間の治療ウィンドウが広がる。また、より低い投与量は、患者にとってより 低い経済的費用をもたらすことにもなり、副作用が減る可能性もある。さらにメ トトレキサートは抗ＴＮＦα抗体の免疫原性を低下させることにより、安全性の 増した抗ＴＮＦα抗体の投与を可能にする。 また、本発明は、ＴＮＦαアンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニストとを含有 した組成物に関する。具体的態様として、本組成物は、さらにメトトレキサート を含有する。本発明の組成物は、ＴＮＦαアンタゴニストと反応する物質の異常 なレベル、とりわけ正常で健康な対象中に存在する過剰レベルのＴＮＦαと関係 する病状または状態の対象の処置に有用であり、ここでかかる過剰レベルまたは 減少したレベルは、局所もしくは特定の、全身の組織タイプまたは身体の位置で 起こる。かかる組織タイプとしては、限定されないが、例えば、血液、リンパ、 中枢神経系（ＣＮＳ）、肝臓、腎臓、脾臓、心筋または血管、脳または脊髄白質 または灰白質、軟骨、靭帯、腱、肺、膵臓、卵巣、精巣、前立腺が含まれ得る。 正常レベルに対する増加したＴＮＦα濃度は、関節、神経血管接合部、骨、特定 の鍵もしくは靭帯などといった身体の特定の領域または細胞、または細菌もしく はウイルス感染などの感染部位にも局在しうる。本発明の組成物は前記疾患を治 療するための薬剤の製造にも使用できる。 腫瘍壊死因子αアンタゴニスト 本明細書で用いられる「腫瘍壊死因子αアンタゴニスト」は、インビボでＴＮ Ｆα活性を減少、ブロック、抑制、抑止または妨害する。例えば好適なＴＮＦα アンタゴニストはＴＮＦαを結合でき、抗ＴＮＦα抗体、その抗原結合性断片お よびＴＮＦαに特異的に結合するレセプター分子と誘導体が含まれる。好適なＴ ＮＦαアンタゴニストは、ＴＮＦα合成および／またはＴＮＦα放出を阻止また は抑制することもでき、サリドマイド、テニダップ（ｔｅｎｉｄａｐ）、ホスホ ジエステラーゼ阻害剤、例えば、限定されないが、ペントキシフィリンやロリブ ラムなどの化合物が含まれる。ＴＮＦα合成および／またはＴＮＦα放出を阻止 または抑制できる好適なＴＮＦαアンタゴニストには、Ａ２ｂアデノシンレセプ ターエンハンサーとＡ２ｂアデノシンレセプターアゴニスト（例えば５’−（Ｎ −シクロプロピル）カルボキシアミドアデノシン、５’−Ｎ−エチルカルボキシ アミドアデノシン、シクロヘキシルアデノシン、Ｒ−Ｎ⁶−フェニル−２−プロ ピルアデノシン）も含まれる。例えば、その教示はすべて参考文献として本明細 書に取り込まれるＪａｃｏｂｓｏｎ，ＧＢ２２８９２１８Ａを参照されたい。好 適なＴＮＦαアンタゴニストは、ＴＮＦαレセプターシグナル伝達を阻止または 抑制することもでき、マイトジェン活性化プロテイン（ＭＡＰ）キナーゼ阻害剤 が含まれる（例えばＳＢ２０３５８０；ＬｅｅおよびＹｏｕｎｇ，Ｊ．Ｌｅｕｋ ｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．，５９：１５２〜１５７（１９９６）であり、その教示 はすべて参考文献として本明細書に取り込まれる）。他の好適なＴＮＦαアンタ ゴニストには、膜ＴＮＦα切断を減少、ブロック、抑制、抑止または妨害する物 質、例えば、限定されないが、メタロプロテイナーゼ阻害剤；ＴＮＦα活性を減 少、ブロック、抑制、抑止または妨害する物質、例えば、限定されないが、カプ トプリル、エナラプリル、リシノプリルなどのアンギオテンシン変換酵素（ＡＣ Ｅ）阻害剤；ＴＮＦα産生および／または合成を減少、ブロック、抑制、抑止ま たは妨害する物質、例えば、限定されないが、ＭＡＰキナーゼ阻害剤がある。Ｔ ＮＦαアンタゴニストは米国特許出願第０８／６９０，７７５号明細書（１９９ ６年８月１日出願）、米国特許出願第０８／６０７，４１９号明細書（１９９６ 年２月２８日出願）、国際公開第９５／０９６５２号パンフレット（１９９５年 ４月１３日公開）、米国特許出願第０８／４０３，７８５号明細書（１９９３年 １０月６日出願）、国際公開第９４／０８６１９号パンフレット（１９９４年４ 月２８日公開）、米国特許出願第０７／９５８，２４８号明細書（１９９２年１ ０月８日出願）にも記述されている。これらの参考文献はすべてそのまま参照に より本明細書に組み込まれる。 抗ＴＮＦα抗体 本明細書で用いられる抗腫瘍壊死因子α抗体は、インビボでのＴＮＦα活性を 減少、ブロック、抑制、抑止または妨害する。好ましい一態様として、本抗体は 、抗原を特異的に結合する。本抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでも よく、抗体という用語はポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を包含 するものとする。ポリクローナルおよびモノクローナルという用語は、抗体調製 物の均一性の程度をいい、特定の生産方法に限定されないものとする。 好適な抗体は、入手可能であるか、適当な免疫原、例えば単離および／または 組換え抗体あるいはその一部（合成ペプチドなどの合成分子を含む）に対して、 または組換え抗原を発現させる宿主細胞に対して生じさせることができる。また 、組換え抗原を発現させる細胞、トランスフェクト細胞などは免疫原として、ま たはレセプターを結合する抗体の選別に使用できる（例えばＣｈｕｎｔｈａｒａ ｐａｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：１７８３〜１７８９（１９９４）； およびＣｈｕｎｔｈａｒａｐａｉら，米国特許第５，４４０，０２１号を参照さ れたい）。 免疫抗原の調製とポリクローナルおよびモノクローナル抗体生産は、任意の適 当な技術を使って行いうる。様々な方法が記述されている（例えばＫｏｈｌｅｒ ら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５〜４９７（１９７５）およびＥｕｒ．Ｊ．Ｉ ｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１〜５１９（１９７６）；Ｍｉｌｓｔｅｉｎら，Ｎａ ｔｕｒｅ，２６６：５５０〜５５２（１９７７）；Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉら，米国 特許第４，１７２，１２４号；Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＤ．Ｌａｎｅ，１９８ ８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（コール ドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨー ク州）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ ｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２７，‘９４年夏）、Ａｕ ｓｕｂｅｌら編（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社、ニューヨーク州ニューヨ ーク）第１１章（１９９１）を参照されたい）。一般に、ハイブリドーマは適当 な不死細胞株（例えばＳＰ２／０などの骨髄腫細胞株）を抗体産生細胞と融合す ることによって生産できる。抗体産生細胞、好ましくは脾臓またはリンパ節のも のは、目的の抗原で免疫した動物から得ることができる。融合細胞（ハイブリド ーマ）は、選択培養条件を使って単離し、限界希釈法でクローン化できる。所望 の特異性を持つ抗体を産生する細胞は、適当なアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）で 選択できる。 例えば組換え抗体またはその一部をライブラリーから選択する方法、例えばフ ァージディスプレイ法による方法（例えばＷｉｎｔｅｒｓら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３〜４５５（１９９４）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏ ｍら，国際公開第９３／０６２１３号パンフレット；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら， 米国特許第５，５６５，３３２号明細書；国際公開第９４／１３８０４パンフレ ット（１９９４年６月２３日公開）；Ｋｒｅｂｂｅｒら，米国特許第５，５１４ ，５４８号明細書；Ｄｏｗｅｒら，米国特許第５，４２７，９０８号明細書を参 照されたい）や、ヒト抗体の全レパートリーを産生できるトランスジェニック動 物（例えばマウス）の免疫化による方法（例えばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１〜２５５５（１９ ９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５〜２５８（１ ９９３）；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら，欧州特許第ＥＰ０４６３１５１Ｂ１号 明細書；Ｌｏｎｂｅｒｇら，米国特許第５，５６９，８２５号明細書；Ｌｏｎｂ ｅｒｇら，米国特許第５，５４５８０６号明細書：Ｓｕｒａｎｉら，米国特許第 ５，５４５，８０７号明細書を参照されたい）などが挙げられ、必要な特異性を 持つ抗体（ヒト抗体を含む）を生産または単離する他の適当な方法を使用できる 。 単鎖抗体およびキメラ、ヒト化または霊長類化（フレームワーク変更を伴うま たは伴わないＣＤＲ移植抗体）もしくはベニヤード（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体、 ならびに異なる種に由来する部分を含有するキメラ、ＣＤＲ移植またはベニヤー ド単鎖抗体なども、本発明および用語「抗体」に包含される。これらの抗体の様 々な部分は従来の技術により互いに化学的に結合することができ、または遺伝子 工学的技術を使って連続した一タンパク質として製造することができる。例えば 、連続したタンパク質を製造するために、キメラ鎖またはヒト化鎖をコードする 核酸を発現させることができる。例えばＣａｂｉｌｌｙら，米国特許第４，８１ ６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら，欧州特許番号０，１２５，０２３Ｂ１；Ｂｏ ｓｓら，米国特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓら，欧州特許番号０，１２ ０，６９４Ｂ１；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら，ＷＯ８６／０１５３３；Ｎ ｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら，欧州特許番号０，１９４，２７６Ｂ１；Ｗｉｎ ｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号；Ｗｉｎｔｅｒ，欧州特許番号０，２ ３９，４００Ｂ１；Ｑｕｅｅｎら，米国特許第５，５８５，０８９号；Ｑｕｅｅ ｎら，欧州特許番号０，４５１，２１６Ｂ１；Ａｄａｉｒら，ＷＯ９１／０９９ ６７、１９９１年７月１１日公開；Ａｄａｉｒら，欧州特許番号０，４６０，１ ６７Ｂ１；Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．ら，欧州特許番号０，５１９，５９６Ａ１を 参照のこと。また、霊長類化抗体については、Ｎｅｗｍａｎ，Ｒ．ら，ＢｉｏＴ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１４５５〜１４６０（１９９２）を、単鎖抗体につ いては、Ｈｕｓｔｏｎら，米国特許第５，０９１，５１３号；Ｈｕｓｔｏｎら， 米国特許第５，１３２，４０５号；Ｌａｄｎｅｒら，米国特許第４，９４６，７ ７８号およびＢｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３〜４２６ （１９８８）を参照のこと。 また、キメラ、ヒト化、霊長類化、ベニヤードまたは単鎖抗体などの断片を含 む、抗体の抗原結合性断片も製造できる。例えば抗原結合性断片には、Ｆｖ、Ｆ ａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）₂断片などの断片が含まれるが、これらに限 らない。抗原結合性断片は例えば酵素による切断や組換え技術によって製造でき る。例えばパパインまたはペプシンによる切断はそれぞれＦａｂ断片またはＦ（ ａｂ’）₂断片を生成しうる。抗体は、１以上のストップコドンが本来の終止部 位の上流に導入されている抗体遺伝子を用いて、様々な短縮型としても製造でき る。例えばＦ（ａｂ’）₂重鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、重鎖のＣＨ₁ド メインとヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むように設計できる。 本発明で有用な抗−ＴＮＦα抗体は、ＴＮＦαへの高親和性結合と低い毒性（ ヒト抗−ネズミ抗体（ＨＡＭＡ）および／またはヒト抗−キメラ抗体（ＨＡＣＡ ）応答を含む）を特徴とする。とりわけ、可変領域、定常領域およびフレームワ ークなどの個々の成分が個別におよび／または全体として低い免疫原性を持つ抗 体は、本発明で有用である。本発明で使用できる抗体は、長期間にわたる患者の 治療に使用でき、その間、良好ないし優れた症状の軽減と低い毒性を示すそれら の能力を特徴とする。低い免疫原性および／または高い親和性とその他の不確定 な特性が、達成される治療結果に貢献しうる。「低い免疫原性」とは、本明細書 では、治療された患者の約７５％未満、好ましくは約５０％未満で有意なＨＡＣ ＡまたはＨＡＭＡ応答を引き起こすこと、および／または、治療された患者で低 い力価（二重抗原酵素免疫アッセイで測定して約３００未満、好ましくは約１０ ０未満）を生じさせることと定義される（Ｅｌｌｉｏｔｔら，Ｌａｎｃｅｔ，３ ４４：１１２５〜１１２７（１９９４）；これは文献として本明細書において援 用される）。 具体的態様として、その抗−ＴＮＦα抗体は、キメラモノクローナル抗体ｃＡ ２（もしくはその抗原結合性断片）またはネズミモノクローナル抗体Ａ２（もし くはその抗原結合性断片）であるか、キメラ抗体ｃＡ２、ネズミモノクローナル 抗体Ａ２もしくはそれらの抗原結合性断片、それらは、キメラ抗体ｃＡ２または ネズミモノクローナル抗体Ａ２もしくはそれらの抗原結合性断片によって結合さ れるものと同じまたは機能的に等価なヒトＴＮＦα上のエピトープと反応する抗 体もしくは抗原結合性断片を含んでおり、それらのものと類似するエピトープ特 異性を有する。キメラ抗体ｃＡ２またはネズミモノクローナル抗体Ａ２のものと 類似するエピトープ特異性を持つ抗体には、ヒトＴＮＦαへの結合に関してキメ ラ抗体ｃＡ２またはネズミモノクローナル抗体Ａ２（もしくはそれらの抗原結合 性断片）と競争できる抗体が含まれる。かかる抗体もしくは断片は、上述のよう に得ることができる。キメラ抗体ｃＡ２、ネズミモノクローナル抗体Ａ２および これらの抗体を得る方法は、米国特許出願第０８／１９２，０９３号（１９９４ 年２月４日出願）、米国特許出願第０８／１９２，１０２号（１９９４年２月４ 日出願）、米国特許出願第０８／１９２，８６１号（１９９４年２月４日出願） 、米国特許出願第０８／３２４，７９９号（１９９４年１０月１８日出願）、Ｌ ｅ，Ｊ．ら，国際公開番号ＷＯ９２／１６５５３（１９９２年１０月１日公開） 、Ｋｎｉｇｈｔ，Ｄ．Ｍ．ら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３０：１４４３〜１ ４５３（１９９３）、およびＳｉｅｇｅｌ，Ｓ．Ａ．ら，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，７ （１）：１５〜２５（１９９５）にも記載されている。これらの文献はそれぞれ 参照により本明細書において全て援用される）。 キメラ抗体ｃＡ２は、Ａ２と名づけられた高親和性中和マウス抗−ヒトＴＮＦ αＩｇＧ１抗体の抗原結合性可変領域と、ヒトＩｇＧ１、カッパ免疫グロブリン の定常領域とからなる。ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域は、同種抗体エフェクター機能を 改善し、循環血清半減期を増加させ、抗体の免疫原性を減少させる。キメラ抗体 ｃＡ２の結合力とエピトープ特異性はネズミ抗体Ａ２の可変領域に由来する。特 定の態様として、ネズミ抗体Ａ２の可変領域をコードする核酸の好ましい供給源 はＡ２ハイブリドーマ細胞株である。 キメラＡ２（ｃＡ２）は、天然ヒトＴＮＦαと組換えヒトＴＮＦαのどちらの 細胞傷害作用も用量依存的に中和する。キメラ抗体ｃＡ２と組換えヒトＴＮＦα の結合アッセイから、キメラ抗体ｃＡ２の親和定数は１．０４×１０¹⁰Ｍ^-1と計 算された。モノクローナル抗体の特異性と親和力を競争的阻害によって決定する 好ましい方法は、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，１９８８ ；Ｃｏｌｌｉｇａｎら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍ ｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ社，ニューヨーク（１９９２，１９９３ ）；Ｋｏｚｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，４：７２〜７９（１９８３ ）；Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ社， ニューヨーク（１９８７，１９９２，１９９３）；およびＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔ ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９２：５８９〜６０１（１９８３）に見出すことができ る。これらの文献は参照により本明細書において全て援用される。 具体的態様として、ネズミモノクローナル抗体Ａ２は、ｃ１３４Ａと名づけら れた細胞系によって生産される。キメラ抗体ｃＡ２は、ｃ１６８Ａと名づけられ た細胞系によって生産される。 抗−ＴＮＦα抗体（もしくはその抗原結合性断片）のさらなる例は、当技術分 野に記載がある（例えば、米国特許第５，２３１，０２４号；Ｍ⁶ｌｌｅｒ，Ａ ．ら，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，２（３）：１６２〜１６９（１９９０）；米国特許出 願第０７／９４３，８５２号（１９９２年９月１１日出願）；Ｒａｔｈｊｅｎら ，国際公開番号ＷＯ９１／０２０７８（１９９１年２月２１日公開）；Ｒｕｂｉ ｎら，ＥＰＯ特許公開第０２１８８６８号（１９８７年４月２２日公開）；Ｙｏ ｎｅら，ＥＰＯ特許公開第０２８８０８８号（１９８８年１０月２６日）；Ｌｉ ａｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１３７：８ ４７〜８５４（１９８６）；Ｍｅａｇｅｒら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，６：３０５ 〜３１１（１９８７）：Ｆｅｎｄｌｙら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，６：３５９〜３ ６９（１９８７）；Ｂｒｉｎｇｍａｎら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，６：４８９〜５ ０７（１９８７）；およびＨｉｒａｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，９ ６：５７〜６２（１９８７）を参照のこと。これらの文献は参照により本明細書 において全て援用される）。 本明細書で使用する、用語「抗原結合領域」とは、抗体分子のうち、抗原と相 互作用するアミノ酸残基を含み、その抗体に抗原に対する特異性と親和性とを付 与する部分を指す。抗原結合領域には、抗原結合残基の適切なコンフォメーショ ンを維持するのに必要な「フレームワーク」アミノ酸残基が含まれる。 抗原という用語は、抗体によって結合されうる分子または分子の一部であって 、その抗原のエピトープに選択的に結合できる抗体を動物に産生させることもで きるものを指す。抗原は１以上のエピトープを持ちうる。 エピトープという用語は、抗原のうち、抗体によって認識され、抗体によって 、その抗体の抗原結合領域の１以上で結合されうる部分を指すものとする。通常 、エピトープは、アミノ酸や糖側鎖などといった分子の化学的に活性な表面配置 からなり、特定の三次元構造上の特徴と、特定の電荷特徴とを持つ。「阻害およ び／または中和エピトープ」とは、抗体によって結合されたときに、インビボま たはインビトロで、より好ましくはインビボで、そのエピトープを含有する分子 の生物学的活性、例えば、ＴＮＦαのＴＮＦαレセプターへの結合などの喪失を もたらすエピトープを意味する。 ＴＮＦαレセプター分子 本発明の方法と組成物に有用なＴＮＦαレセプター分子は、高い親和性でＴＮ Ｆαを結合し（例えばＦｅｌｄｍａｎｎら，国際公開番号ＷＯ９２／０７０７６ （１９９２年４月３０日公開）；Ｓｃｈａｌｌら，Ｃｅｌｌ，６１：３６１〜３ ７０（１９９０）；およびＬｏｅｔｓｃｈｅｒら，Ｃｅｌｌ，６１：３５１〜３ ５９（１９９０）を参照のこと。これらの文献は参照により本明細書において全 て援用される）かつ低い免疫原性を持つものである。とりわけ、５５ｋＤａＴＮ Ｆα細胞表面レセプター（ｐ５５ＴＮＦ−Ｒ）と７５ｋＤａＴＮＦα細胞表面レ セプター（ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ）が本発明で有用である。これらレセプターの細胞 外ドメイン（ＥＣＤ）または機能的なその一部を含有する、これらレセプターの 短縮型（例えば、Ｃｏｒｃｏｒａｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２３ ：８３１〜８４０（１９９４）を参照のこと）も本発明で有用である。ＥＣＤを 含有するＴＮＦαレセプターの短縮型は、３０ｋＤａおよび４０ｋＤａＴＮＦα 阻害性結合タンパク質として尿と血清中に検出されている（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１５３１〜１５３６（１９９０ ））。ＴＮＦαレセプター多量体分子とＴＮＦα免疫レセプター融合分子および それらの誘導体と断片もしくは一部は、本発明の方法と組成物に有用なＴＮＦα レセプター分子のさらなる例である。本発明で使用できるＴＮＦαレセプター分 子は、長期間にわたる患者の治療に使用でき、その間、良好ないし優れた症状の 軽減と低い毒性を示すそれらの能力を特徴とする。低い免疫原性および／または 高い親和性とその他の不確定な特性が、達成される治療結果に貢献しうる。 本発明で有用なＴＮＦαレセプター多量体分子は、１以上のポリペプチドリン カーまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの他の非ペプチドリンカーを 介して連結された２以上のＴＮＦαレセプターのＥＣＤの全体または機能的部分 を含有する。該多量体分子はさらに、その多量体分子の発現を方向付けるために 、分泌性タンパク質のシグナルペプチドを含みうる。これら多量体分子とそれら の製造方法は、米国特許出願第０８／４３７，５３３号（１９９５年５月９日出 願）に記載されており、その内容は参考により本明細書において全て援用される 。 本発明の方法と組成物で有用なＴＮＦα免疫レセプター融合分子は、１以上の 免疫グロブリン分子の少なくとも一部分と、１以上のＴＮＦαレセプターの全部 または機能的一部分とを含有する。これらの免疫レセプター融合分子は単量体と して、またはヘテロもしくはホモ多量体として組み立てることができる。また免 疫レセプター融合分子は、一価でも多価でもよい。かかるＴＮＦα免疫レセプタ ー融合分子の例は、ＴＮＦαレセプター／ＩｇＧ融合タンパク質である。 ＴＮＦα免疫レセプター融合分子とそれらの製造方法は当技術分野に記載があ る（Ｌｅｓｓｌａｕｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２１：２８８３〜 ２８８６（１９９１）；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１０５３５〜１０５３９（１９９１）；Ｐｅｐｐｅｌ ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１４８３〜１４８９（１９９１）；Ｋｏｌｌ ｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：２１５〜２１９ （１９９４）；Ｂｕｔｌｅｒら，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，６（６）：６１６〜６２３ （１９９４）；Ｂａｋｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：２０４０ 〜２０４８（１９９４）；Ｂｅｕｔｌｅｒら，米国特許第５，４４７，８５１号 ；および米国特許出願第０８／４４２，１３３号（１９９５年５月１６日出願） 、これらの文献は参照により本明細書において全て援用される）。免疫レセプタ ー融合分子の製造方法は、Ｃａｐｏｎら，米国特許第５，１１６，９６４号；Ｃ ａｐｏｎら，米国特許第５，２２５，５３８号；およびＣａｐｏｎら，Ｎａｔｕ ｒｅ，３３７：５２５〜５３１（１９８９）にも見出しうる。これらの文献は参 照により本明細書において全て援用される。 ＴＮＦαレセプター分子の機能的同等物、誘導体、断片または領域とは、ＴＮ Ｆαレセプター分子またはＴＮＦαレセプター分子をコードするＴＮＦαレセプ ター分子配列のうち、本発明で使用できるＴＮＦαレセプター分子に機能的に類 似する（例えば高い親和性でＴＮＦαを結合し、低い免疫原性を有する）のに足 りるサイズと配列とを持つ部分を指す。ＴＮＦαレセプター分子の機能的同等物 には、本発明で使用できるＴＮＦαレセプター分子に機能的に類似する（例えば 高い親和性でＴＮＦαを結合し、低い免疫原性を有する）修飾ＴＮＦαレセプタ ー分子も含まれる。例えば、ＴＮＦαレセプター分子の機能的同等物は「サイレ ント」コドンまたは１以上のアミノ酸置換、欠失もしくは付加（例えば、ひとつ の酸性アミノ酸で他のひとつの酸性アミノ酸を置換；もしくは、疎水性アミノ酸 をコードするひとつのコドンを、同じまたは異なる疎水性アミノ酸をコードする 他のひとつのコドンで置換）を含有しうる。Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅ ｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓ ｃｉｅｎｃｅ社，ニューヨーク（１９８９）を参照のこと。 ＶＥＧＦアンタゴニスト 本明細書でいう、「血管内皮増殖因子アンタゴニスト」は、インビボでＶＥＧ Ｆ活性合成またはレセプターシグナル伝達を減少、ブロック、阻害、抑止または 妨害する。ＶＥＧＦアンタゴニストには、抗ＶＥＧＦ抗体とその抗原結合性断片 ；ＶＥＧＦに特異的に結合するレセプター分子と誘導体；およびＶＥＧＦレセプ ターアンタゴニストが含まれる。ＶＥＧＦアンタゴニストには、ＶＥＧＦ機能を 減少、阻害、ブロック、抑止または妨害する薬剤が含まれ、例えばスラミンやプ ロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）インヒビター（例えばラベンズスチンＡ（ ｌａｖｅｎｄｕｓｔｉｎ Ａ））などがあるが、これらに限らない。例えば、Ｗ ａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，２８： １５２３〜１５２９（１９９６）：およびＨｕら，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａ ｃｏｌ．，１１４：２６２〜２６８（１９９５）を参照のこと。ＶＥＧＦアンタ ゴニストには、また、ＶＥＧＦレセプターまたはその細胞外ドメインへのＶＥＧ Ｆの結合を減少、阻害、ブロック、抑止または妨害する薬剤が含まれ、例えば血 小板因子４（ＰＦ−４）などがあるが、これに限らない。例えば、Ｇｅｎｇｒｉ ｎｏｖｉｔｃｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：１５０５９〜１５０６ ５（１９９５）を参照のこと。ＶＥＧＦアンタゴニストには、ＶＥＧＦレセプタ ーシグナル伝達を減少、阻害、ブロック、抑止または妨害する薬剤と、ＶＥＧＦ 活性化を減少、阻害、ブロック、抑止または妨害する薬剤が含まれ、例えばミト ラマイシンなどがあるが、これに限らない。例えば、Ｒｙｕｔｏら，Ｊ．Ｂｉｏ ｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１（４５）：２８２２０〜２８２２８（１９９６）を参照 のこと。ＶＥＧＦアンタゴニストには、ＶＥＧＦの産生を減少、阻害、ブロック 、抑止または妨害する薬剤が含まれ、例えばＴＧＦβまたはそのリガンドを阻害 、ブロック、抑止または妨害する化合物（例えば抗体を含む薬物とその他の薬剤 ）などがある。例えば、Ｆｒａｎｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：１ ２６０７〜１２６１３（１９９５）；およびＰｅｒｔｏｖａａｒａら，Ｊ．Ｂｉ ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：６２７１〜６２７４（１９９４）を参照のこと。さ らにＶＥＧＦアンタゴニストには、ＶＥＧＦの産生および／または合成を駆動す るシグナルのアンタゴニストである薬剤が含まれる。 抗−ＶＥＧＦ抗体 本明細書でいう、抗−ＶＥＧＦ抗体（もしくはその抗原結合性断片）は、イン ビボでＶＥＧＦ活性を減少、ブロック、阻害、抑止または妨害する。抗体と抗原 結合性断片は上述のとおりである。例えば、該抗体はポリクローナルでもモノク ローナルでもよい。上述のように、該抗体は単鎖キメラ、ヒト化、霊長類化また はベニヤード抗体であってよい。かかる抗体または断片は上述のように得ること ができる。抗−ＶＥＧＦ抗体（およびその抗原結合性断片）は、ＶＥＧＦへの高 親和性結合（例えばＶＥＧＦ₁₂₁、ＶＥＧＦ₁₆₅、ＶＥＧＦ₁₈₉またはＶＥＧＦ₂₀₆ への高親和性結合）と低い毒性（ＨＡＭＡおよび／またはＨＡＣＡ応答を含む） とを特徴とするものが有利である。可変領域、定常領域およびフレームワークな どの個々の成分が個別におよび／または全体として低い免疫原性を有する抗体は 、とりわけ有用である。特定の態様として、抗−ＶＥＧＦ抗体（およびその抗原 結合性断片）は、それらが長期間にわたる患者の治療に使用でき、その間、良好 ないし優れた症状の軽減と低い毒性を示すことを特徴とする。低い免疫原性およ び／または高い親和性とその他の不確定な特性が、達成される治療結果に貢献し うる。 抗−ＶＥＧＦ抗体（もしくはその抗原結合性断片）の例は当技術分野に記載が ある（例えば、Ａｓａｎｏら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４（５）：４７５〜４８ ０（１９９５）；およびＫｉｍら，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，７：５３〜 ６４（１９９２）を参照のこと；これらの文献は参照により本明細書において全 て援用される）。 ＶＥＧＦレセプター分子 本発明において有用なＶＥＧＦレセプター分子は、特異的にＶＥＧＦに結合し 、低い免疫原性を有する。好ましくは、ＶＥＧＦレセプター分子は、ＶＥＧＦに 対する高親和性結合を特徴とする。ＶＥＧＦレセプター分子には、チロシンキナ ーゼレセプター、ＫＤＲ、Ｆｌｋ（例えば、Ｆｌｋ−１）およびＦｌｔ（例えば 、Ｆｌｔ−１およびＦｌｔ−４）等のＶＥＧＦレセプターが含まれる（例えば、 Ｌｅｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１９８８〜 １９９２（１９９６）；ｄｅＶｒｉｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：９８９〜 ９９１（１９９２）；Ｑｕｉｎｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ，９０：７５３３〜７５３７（１９９３）；Ｓｈｉｂｕｙａら，Ｏｎｃｏ ｇｅｎｅ，５：５１９〜５２４（１９９０）；およびＴｅｒｍａｎら，Ｂｉｏｃ ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８７：１５７９〜１５８ ６（１９９２）を参照のこと、これらの文献は、本明細書中で参照により全て援 用される）。ＶＥＧＦレセプター分子には、また、ＶＥＧＦレセプター多量体分 子およびＶＥＧＦ免疫レセプター融合分子、ならびにそれらの誘導体および断片 もしくは一部が含まれる。 ＶＥＧＦレセプター多量体分子は、１以上のリンカーを介して連結した２以上 のＶＥＧＦレセプターの全てもしくは機能性部分を含み得る。ＶＥＧＦレセプタ ー多量体分子は、さらに、その多量体分子の発現を方向づけるための、分泌性タ ンパク質のシグナルペプチドを含み得る。 ＶＥＧＦ免疫レセプター融合分子は、１以上の免疫グロブリン分子の少なくと も一部分および１以上のＶＥＧＦレセプターの全てもしくは機能性部分を含み得 る。ＶＥＧＦ免疫レセプター融合分子は、単量体、またはヘテロ多量体もしくは ホモ多量体として組み立て得る。ＶＥＧＦ免疫レセプター融合分子は、また、一 価または多価であり得る。ＶＥＧＦ免疫レセプター融合分子の例は、Ａｉｅｌｌ ｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２（２３）：１０４ ５７〜１０４６１（１９９５）に記載されており、その教示は、参照により本明 細書中で全て援用される。また、Ａｉｅｌｌｏら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． ，３３１：１４８０〜１４８７（１９９４）；およびＰａｒｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ ．Ｃｈｅｍ．，２６９：２５６４６〜２５６５４（１９９４）を参照のこと。そ の教示は、参照により本明細書中で全て援用される。 ＶＥＧＦレセプター分子の機能性同等物、誘導体、断片もしくは領域とは、Ｖ ＥＧＦレセプター分子の一部、または、本発明において用い得る、機能的にＶＥ ＧＦレセプター分子に類似する（例えば、ＶＥＧＦに特異的に結合し、低い免疫 原性を有する）ための充分なサイズおよび配列である、ＶＥＧＦレセプター分子 をコードするＶＥＧＦレセプター分子配列の一部を指す。ＶＥＧＦレセプター分 子の機能性同等物は、また、本発明において用い得るＶＥＧＦレセプター分子と 機能的に類似する（例えば、ＶＥＧＦに特異的に結合し、低い免疫原性を有する ）改変ＶＥＧＦレセプター分子を含む。例えば、ＶＥＧＦレセプター分子の機能 性同等物には、「サイレント」コドンまたは１以上のアミノ酸置換、欠失もしく は付加を含み得る。例えば、ＶＥＧＦレセプター分子の機能性同等物は、ひとつ の酸性アミノ酸の他のひとつの酸性アミノ酸への置換、または、同じもしくは異 なる疎水性アミノ酸をコードするひとつのコドンの疎水性アミノ酸をコードする 他のひとつのコドンへの置換を含み得る。Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．およびＷｉｌｅｙ〜Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅ ｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照のこと。 ＴＮＦαレセプター分子を調製するための本明細書に記載する技術は、本発明 に用い得るＶＥＧＦレセプター分子を調製する際に用いられ得る。 メトトレキサート 現在入手可能な経口用および静脈注射用のメトトレキサートの組成物には、ル ーマトレックス（登録商標）メトトレキサート用量パック（Ｌｅｄｅｒｌｅ Ｌ ａｂｏｒａｔｒｉｅｓ，Ｗａｙｎｅ，ＮＪ）；メトトレキサート錠（Ｍｙｌａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，Ｍｏｒｇａｎｔｏｗｎ，ＷＶ； Ｒｏｘａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ） ；および注射用ナトリウムメトトレキサート錠ならびに注射（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）およびナトリウムメトトレキ サートＬＰＦ（登録商標）（ナトリウムメトトレキサート注射）（Ｉｍｍｕｎｅ ｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）が含まれる。メトトレキ サートは、ファルマコケミエ（オランダ）からも入手可能である。メトトレキサ ートプロドラッグ、ホモログおよび／またはアナログ（例えば、葉酸アンタゴニ スト）も、本発明に用い得る。他方、他の免疫抑制剤（もしくは免疫系を抑制す る薬物）を本発明に用い得る。 投与 本発明のＴＮＦαアンタゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニスト、メトトレキサー トおよび組成物を、種々の方法で個体に投与し得る。投与の経路としては、皮内 経路、経皮経路（例えば、徐放性ポリマー中で）、筋内経路、腹膜内経路、静脈 内経路（点滴および／またはボーラス注射を含む）、皮下経路、経口経路、局所 経路、硬膜外経路、頬面経路、直腸経路、経膣経路および鼻腔内経路が含まれる 。他の適する投与経路も、例えば、上皮内層または皮膚粘膜内層を通して吸収さ せるために用い得る。本発明のＴＮＦαアンタゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニス ト、および組成物を、遺伝子治療よっても投与し得る。該遺伝子治療では、特定 の治療的タンパク質もしくはペプチドをコードするＤＮＡ分子を、例えば、特定 のタンパク質もしくはペプチドをインビボで発現させ、治療的レベルで分泌させ るベクターを介して、患者に投与する。また、本発明のＴＮＦαアンタゴニスト 、ＶＥＧＦアンタゴニスト、メトトレキサートおよび組成物を、製薬学上許容し 得る界面活性剤（例えば、グリセリド）、賦形剤（例えば、ラクトース）、担体 、希釈剤および媒体等の他の生物学的に活性な薬剤成分と共に投与し得る。所望 により、特定の甘味剤、着香剤および／または着色剤も添加し得る。 本発明のＴＮＦαアンタゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニスト、メトトレキサー トおよび組成物を、予防的にもしくは治療的に個体に投与し得る。ＴＮＦαアン タゴニストを、ＶＥＧＦアンタゴニストの投与の前に、その投与と同時に（同じ 組成物もしくは異なる組成物中で）またはその投与に続けて投与し得る。ＴＮＦ アンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニストを、また、メトトレキサートの投 与の前に、その投与と同時に（同じ組成物もしくは異なる組成物中で）またはそ の投与に続けて投与し得る。例えば、ＴＮＦアンタゴニストおよびＶＥＧＦアン タゴニストを、メトトレキサート治療に対する付加治療および／または同時治療 として投与し得る。 非経口（例えば、静脈内、皮下、筋内）投与では、本発明のＴＮＦαアンタゴ ニスト、ＶＥＧＦアンタゴニスト、メトトレキサートおよび組成物を、製薬学上 許容し得る非経口媒体と共に、溶液、懸濁液、エマルジョンもしくは凍結乾燥粉 末として処方し得る。かかる媒体の例示は、水、生理的食塩水、リンガー溶液、 デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンである。リポソームおよび 固定油等の非水系媒体も用い得る。媒体または凍結乾燥粉末は、等張性（例えば 、塩化ナトリウム、マンニトール）および化学的安定性（例えば、緩衝液および 保存剤）を維持する添加物を含み得る。該組成物は、通常用いられる技術で殺菌 される。 適する医薬用担体は、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．編，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ｍａｃｋ Ｐ ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０）に記載されてい る。 例えば、注射による投与に適する非経口組成物は、０．９％塩化ナトリウム溶 液中に活性な成分を１．５重量％溶解することにより調製される。 ＴＮＦαアンタゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニストおよびメトトレキサートは 、治療上の有効量でもしくは共同作用的な量で投与される；本発明の組成物は、 治療上の有効量でもしくは共同作用的な量で投与される。本明細書中で用いられ ている、治療上の有効量とは、ＴＮＦαアンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴ ニストの治療上の有効量が同時に投与されない場合のＴＮＦαおよびＶＥＧＦの 生物学的活性と比較して、または組成物の治療上の有効量が投与されない場合の ＴＮＦαおよびＶＥＧＦの生物学的活性と比較して、ＴＮＦαアンタゴニストお よびＶＥＧＦアンタゴニストの同時投与、または本発明の組成物の投与によりＴ ＮＦαおよびＶＥＧＦの生物学的活性が阻害される量である。治療上の有効量と は、また、ＴＮＦαアンタゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニストおよびメトトレキ サートの同時投与により、ＴＮＦαアンタゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニストお よびメトトレキサートの治療上の有効量が同時に投与されない場合のＴＮＦαお よびＶＥＧＦの生物学的活性と比較して、ＴＮＦαおよびＶＥＧＦの生物学的活 性が阻害される量である。治療上の有効量とは、特定のＴＮＦ媒介疾患に関連す る症状を共同作用的にもしくは有意に低減もしくは除去するために必要なＴＮＦ αアンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニストの量である。治療上の有効量と は、また、特定のＴＮＦ媒介疾患に関連する症状を共同作用的にもしくは有意に 低減もしくは除去するために必要なＴＮＦαアンタゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴ ニストおよびメトトレキサートの量である。本明細書中で用いられている、治療 上の有効量は、ＴＮＦαアンタゴニスト単独の投与、ＶＥＧＦアンタゴニスト単 独の投与、またはメトトレキサート単独の投与により、ＴＮＦαもしくはＶＥＧ Ｆの生物学的活性が必ず阻害されなければならないという量ではない。 いったん治療上の有効量もしくは共同作用的な量を投与すれば、ＴＮＦαアン タゴニスト単独の維持量、ＶＥＧＦアンタゴニスト単独の維持量、メトトレキサ ート単独の維持量、またはその組み合わせの維持量を個体に投与し得る。維持量 とは、治療上の有効投与量によりなされた症状の低減もしくは除去を維持するた めに必要なＴＮＦαアンタゴニストの量、ＶＥＧＦアンタゴニストの量、メトト レキサートの量、またはその組み合わせの量である。維持量は、単回投与、また は一連の投与または日もしくは週ごとに分けられた投与の形で投与され得る。 個体に投与される用量は、特定の治療的薬剤の薬力学的特性、ならびにその様 式および投与経路；レシピエントのサイズ、年齢、健康、性別、体重および食事 ；治療される疾患の症状の性質および程度、同時治療の種類、治療の頻度、なら びに所望の効果を含む種々の因子に依存して変化するであろう。インビトロおよ びインビボでのＴＮＦαの阻害を測定する方法は、当業者によく知られている。 かかるインビトロでのアッセイは、ＴＮＦ細胞毒性アッセイ（例えば、ＷＥＨＩ アッセイもしくはラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ）を含み得る。インビボで の方法は、げっ歯動物死亡率アッセイ、霊長類病理学モデル系（例えば、Ｍａｔ ｈｉｓｏｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８１：１９２５〜１９３７（１ ９８８）；Ｂｅｕｔｌｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８６９〜８７１（１９ ８５）；Ｔｒａｃｅｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３３０：６６２〜６６４（１９８７） ；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７：３１１〜３１８ （１９８８）；Ｓｉｌｖａら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６２：４２１〜 ４２７（１９９０）；Ｏｐａｌら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６１：１１ ４８〜１１５２（１９９０）：およびＨｉｎｓｈａｗら，Ｃｉｒｃ．Ｓｈｏｃｋ ，３０：２７９〜２９２（１９９０））および／または関節炎のげっ歯動物モデ ル（Ｗｉｌｌｉａｍｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８ ９：９７８４〜９７８８（１９９２））を含み得る。リュウーマチ性関節炎を有 する患者において、ＴＮＦαのブロック（ｂｌｏｃｋａｄｅ）は、ＩＬ−６およ びＣ−反応性タンパク質レベルを監視することにより監視し得る（Ｅｌｌｉｏｔ ｔら，Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕｍ．，３６：１６８１〜１６９０（１９９３））。Ｖ ＥＧＦ阻害の測定法は、また、当業者によく知られている（例えば、ＥＬＩＳＡ ）。 ＴＮＦαアンタゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニストおよびメトトレキサートを 、症状の性質および程度、同時治療の種類および所望の効果等の因子に依存して 、単回もしくは複数回の用量で投与し得る。このように、他の治療的養生法また は薬剤（例えば、複数薬物養生法）を、ＴＮＦαアンタゴニスト、ＶＥＧＦアン タゴニストおよびメトトレキサートの治療的投与と組み合わせて用い得る。確立 された投与量範囲の調節および操作は、当業者の能力内に充分存在する。 通常、活性な成分の１日の用量は、体重１ｋｇ当たり約０．０１〜１００ｍｇ であり得る。普通、１日１〜６回の分割投与でもしくは放出が維持される形態で 、１日に１ｋｇ当たり１〜４０ｍｇが、所望の結果を得るのに効果的である。第 ２回目の投与または続く投与では、個体に対し投与された初期もしくは以前の用 量と同じか、少ないもしくは多い用量で投与し得る。 第２回目の投与または続く投与は、疾患もしくは疾患の症状が再発もしくは再 燃する間またはその直前が好ましい。例えば、第２回目の投与および続く投与は 、以前の投与から約１日〜３０週の間に与え得る。必要に応じて、２回投与、３ 回投与、４回投与もしくはよりトータルな投与量を個体にとらせ得る。 内部投与に適する投薬形態（組成物）は、一般に、単位当たり活性な成分を約 ０．１ｍｇ〜約５００ｍｇ含有する。これら医薬組成物において、普通、活性な 成分は、組成物全量に対し約０．５〜９５重量％の量で存在するであろう。 ここで、本発明を以下の実施例により示すが、本発明は、いかようにも、限定 されることを意図するものではない。 実施例 実施例１ 抗−ＴＮＦα抗体を用いたＲＡ患者の治療 方法 患者 進行中のリューマチ性関節炎（ＲＡ）を有する７３人の患者を、抗−ＴＮＦα 抗体の多中心無作為化プラセボコントロール二重盲検臨床試験に登録した。全患 者は、ジ アメリカン カレッジ オブ ルーマトロジー（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉ ｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）の基準に適合した （≧６ヵ月の間の進行中のＲＡ、少なくとも１つの疾患緩和薬物による治療に失 敗および手足のＸ線撮影で糜爛性疾患の証拠）（Ａｒｎｅｔｔら，Ａｒｔｈ．Ｒ ｈｅｕｍ．，３１：３１５〜３２４（１９８８））。また、全患者は、以前に平 均３つの疾患緩和薬物の投与を受けたことがあり、試験への無作為化および登録 の少なくとも４週間前にその治療を停止した（Ｅｌｌｉｏｔｔら，Ｌａｎｃｅｔ ：１１０５〜１１１０（１９９４））。進行中の疾患を、６以上の肥大した関節 の存在および４つの二次的基準（朝の硬直の持続≧４５分；≧６の脆いもしくは 痛い関節；赤血球沈降速度（ＥＳＲ）≧２８ｍｍ／ｈ；Ｃ−反応性タンパク質（ ＣＲＰ）≧２０ｍｇ／１（Ｅｌｌｉｏｔｔ Ｍ．Ｊ．ら，Ｌａｎｃｅｔ，３４４ ：１１０５〜１１１０（１９９４））の内の少なくとも３つにより定義した。 試験点滴 キメラモノクローナル抗−ＴＮＦα抗体ｃＡ２を、１ｍｌの０．０１％ポリソ ルベート８０添加０．１５Ｍ塩化ナトリウムの０．０１Ｍリン酸−緩衝化生理的 食塩水、ｐＨ７．２（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｉｎｃ．，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）当 たり５ｍｇのｃＡ２を含有する滅菌溶液として供給した。プラセボ用バイアルで は、同じ緩衝液に０．１％ヒト血清アルブミンを含有させた。使用前に、ｃＡ２ またはプラセボの適当量を、薬剤師により滅菌生理的食塩水中で３００ｍｌに希 釈させ、２時間かけて０．２μｍ直列型フィルターを介して静脈内に投与した。 プラセボおよびｃＡ２点滴袋の特性は同一であり、かつ研究者および患者は、い ずれの点滴が投与されているか不知であった。 治療プロトコルおよび血清検体 患者を、プラセボ、１ｍｇ／ｋｇの抗−ＴＮＦαモノクローナル抗体ｃＡ２ま たは１０ｍｇ／ｋｇの抗−ＴＮＦαモノクローナル抗体ｃＡ２の単回点滴に対し 無作為化した。血清検体を７３人の患者中６９人から入手した。プラセボ（ｎ＝ ２４）または１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝２４）もしくは１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝２１）で のｃＡ２の投与前または投与後４週間までの血清検体を採取し、５３人の健常者 と比較した。 細胞の調製 全関節置換を受けたＲＡ患者から得た滑膜検体を、５ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラ ゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）および１５０μｇ／ｍｌのＩ型ＤＮアーゼ（Ｓｉ ｇｍａ，ＵＫ）で消化した（Ｂｒｅｎｎａｎ Ｆ．Ｍ．ら，Ｌａｎｃｅｔ ２： ２４４〜２４７（１９８９））。組織を、２００μｌのナイロンメッシュを通し てピペットで取り、単独もしくは１０μｇ／ｍｌのＩＬ−１レセプターアンタゴ ニスト（ＩＬ−１ｒａ；Ａ．Ｂｅｒｇｅｒ博士、Ｕｐｊｏｈｎ研究所，MI提供） と共に、１０μｇ／ｍｌの抗−ＴＮＦαモノクローナル抗体ｃＡ２の存在下もし くは非存在下で、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｂｅ ｌｇｉｕｍ）添加ＲＰＭＩ中、６０ｍｍ²のウェルにて細胞を培養した。線維芽 細胞のコンフルエントな単層が得られるまで滑膜細胞を継続的に培養して、滑膜 線維芽細胞を選抜した。接着細胞を、０．０５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴ Ａを用いて、さらに継代し、ＲＰＭＩおよび１０％ＦＣＳ中で培養した。ヒト皮 膚微小血管内皮細胞系ＨＭＥＣ−１は、疾患の制御および予防センター（Ｃｅｎ ｔｒｅ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉ ｏｎ）（Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）からの提供であり、ヒト単球細胞系ＴＨＰ−１ は、米国組織培養物所蔵所（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）からの提供であった。 接着細胞（内皮細胞および線維芽細胞）を、２００ｍｍ²のウェルにて、コンフ ルエントな密度で培養した。ＴＨＰ−１細胞を、０．５×１０⁶／６０ｍｍ² ウェルの密度で懸濁した。ＴＮＦα（Ｗ．Ｓｔｅｃ教授，分子および巨大分子研 究センター（Ｃｅｎｔｒｅ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｍａｃｒｏｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｕｄｉｅｓ），Ｌｏｄｚ，Ｐｏｌａｎｄから提供））ま たはＩＬ−１α（ホフマン ラ ロシュ，ＵＳＡから提供）の存在下または非存 在下において、５％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ中で７２時間、細胞を刺激した。 ＶＥＧＦアッセイおよび統計分析 培養上清中のＶＥＧＦならびに血清検体を、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ ）（Ｒ＆Ｄシステムズ，ＵＫ）により検定した。入力変数として個人データを用 い、群内での比較をウイルコクソンサイン順位検定により患者データを解析し、 また、応答変数として０週からの変化％を用い、治療群間での比較をマン−ホワ イトニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）Ｕ検定により患者データを解析した。治 療群間でのＲＡ滑膜細胞によるＶＥＧＦ放出の差を、マン−ホワイトニーＵ検定 により評価した。多数群間での比較を、ボンフェロニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ） 修正を用いて調節した。 ＥＳＲおよびＣＲＰ評価 ＥＳＲを、標準法（Ｗｅｓｔｅｒｇｅｎ）により測定した。ＣＲＰレベルを、 等級（ｒａｔｅ）比濁計（アボット蛍光偏光免疫アッセイ）により測定した。ま た、Ｅｌｌｉｏｔｔら，Ｌａｎｃｅｔ ３４４：１１０５〜１１１０（１９９４ ）；Ｅｌｌｉｏｔｔら，Ｌａｎｃｅｔ ３４４：１１２５〜１１２７（１９９４ ）；およびＥｌｌｉｏｔｔら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．３６（１２） ：１６８１〜１６９０（１９９３）を参照のこと。それらの引用文献は、参照に より本明細書中で全て援用される。 結果 血清ＶＥＧＦレベルは、ＲＡ患者で増加した：抗−ＴＮＦα抗体による治療の効 果 合計で、年齢および性別がそろった非関節炎の５３人のヒトならびに進行中の ＲＡを有する６９人の患者において、血清ＶＥＧＦ濃度をＥＬＩＳＡにより測定 した。ＣＲＰとＶＥＧＦとの間の相関の程度を評価するため、非媒介変数データ についてケンダル（Ｋｅｎｄａｌｌ）順位相関係数を計算した。 ５３人の非関節炎のヒトのメジアン血清ＶＥＧＦレベルは、１６０ｐｇ／ｍｌ （四分位数間領域１２２−２６６ｐｇ／ｍｌ）に等しかった。対照的に、進行中 のＲＡを有する６９人の患者の血清ＶＥＧＦ濃度は、著しく増加し（メジアン５ ０３ｐｇ／ｍｌ、領域３０７−８８７ｐｇ／ｍｌ、非ＲＡに対しｐ＜０．００１ ；図２Ａ）、循環しているＣＲＰ値と相関したが（ケンダル順位相関係数０．２ ５２，ｐ＜０．０１；図２Ｂ）、肥大した関節または早朝の硬直の数等の疾患の 個人の臨床媒介変数とは相関しなかった。 抗−ＴＮＦαによるＲＡ患者の治療により、有意に血清ＶＥＧＦが減少した（ 図３）。値は、各治療群についてのメジアンの変化％の計算前の、各患者に対す る点滴前からの変化として表した。群内の比較についてウイルコクソンサイン順 位検定を用いてデータを解析し（^*ｐ≦０．０５，^**ｐ≦０．０１，^***ｐ≦０． ００１）、また、治療群間の比較についてマン−ホワイトニーＵ検定によりデー タを解析した（＋ｐ≦０．０５，＋＋＋ｐ≦０．００１）。多数群間の比較につ いての有意な値を、ボンフェロニ修正を用いて調節した。 １ｍｇ／ｋｇのｃＡ２の投与を受けた患者において、ＶＥＧＦ濃度における最 も初期の変化は、点滴後１週間で観察され、減少は２週目に最高に達し（３０％ 、点滴前に対しおよびプラセボにおける変化に対しｐ＜０．００１）、その後、 血清ＶＥＧＦ濃度は、治療前の値に戻った。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２の投与を受 けた患者において、血清ＶＥＧＦ濃度における変化は、３週目に最高に達し（４ ２％低下、点滴前に対しおよびプラセボにおける変化に対しｐ＜０．００１）、 抗−ＴＮＦα投与の４週後においてさえ、血清ＶＥＧＦ濃度は、有意に点滴前の 値以下であった（図３）。 滑膜細胞によるＶＥＧＦ分泌は、前炎症性サイトカインに依存する。 ＲＡにおけるＶＥＧＦ発現が、ＴＮＦαおよびＩＬ−１に直接依存しているか どうかを決定するため、解離したＲＡ滑膜細胞（１×１０⁶細胞／ｍｌ；ＲＡ関 節由来）を、サイトカイン生物−活性の阻害剤（単独または１０μｇ／ｍｌのＩ Ｌ−１ｒａと共に、１０μｇ／ｍｌのｃＡ２）の存在下もしくは非存在下に、２ 日間培養した。培養上清中のＶＥＧＦ濃度を、ＥＬＩＳＡにより測定した。サイ トカイン阻害剤の非存在下におけるＶＥＧＦ放出に対する統計分析を、マン−ホ ワイトニーＵ−検定により実施した。結果を表１に示した。表の値は、ｎｇ／ｍ ｌ ＶＥＧＦであり、１実験当たり１〜６回の測定による、５〜６回の実験の典 型例である。 合計２９／３２の実験で、単離後約１２時間の培養上清において検出された免 疫反応性タンパク質により、滑膜細胞が自発的にＶＥＧＦを放出することを見出 した。１０μｇ／ｍｌの抗−ＴＮＦα抗体ｃＡ２存在下において、培養の２日目 におけるメジアンのＶＥＧＦの放出は、メジアン値で３．２９ｎｇ／ｍｌから２ ．５６ｎｇ／ｍｌへと、２２％低下した（６回の実験の平均）が、この減少は、 統計的に有意ではなかった（表参照のこと）。しかしながら、第２回目の一揃い の実験では、ｃＡ２（１０μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１ｒａ（１０μｇ／ｍｌ） の組み合わせの添加により、３．９５ｎｇ／ｍｌから１．９１ｎｇ／ｍｌへと、 ＶＥＧＦの産生が著しく減少した（５回の実験の平均；阻害５２％、未処理細胞 からの放出に対しｐ＜０．０５；表参照のこと）。同様に、播種の５日後、ＶＥ ＧＦ放出は、ｃＡ２およびＩＬ−１ｒａにより、１３．３ｎｇ／ｍｌから９．５ ｎｇ／ｍｌへと減少した（平均阻害２９％、未処理細胞からの放出に対しｐ＜０ ．０１；２回の実験の平均）。 ＴＮＦαは、単球および内皮細胞からのＶＥＧＦ放出を誘発するが、滑膜線維芽 細胞からは誘発しない。 ＲＡ関節においてＶＥＧＦを発現することができるとして知られている細胞（ Ｋｏｃｈら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：４１４９〜４１５６（１９９４） ：およびＦａｖａら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：３４１〜３４６（１９９ ４））からのＶＥＧＦ産生のサイトカイン依存性についても、調査した。単球細 胞（ＴＨＰ−１）、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ−１）およびヒトＲＡ滑膜 線維芽細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαまたはＩＬ−１αの存在下または非存 在下において、７２時間インキュベートした。上清中へのＶＥＧＦ放出を、ＥＬ ＩＳＡにより測定した。 ＲＡ滑膜線維芽細胞および単球ＴＨＰ−１は、自発的にＶＥＧＦを放出した（ 図１）。また、微小血管内皮細胞も、本質的に多量のＶＥＧＦタンパク質を放出 することを見出した（図１）。しかしながら、ＴＨＰ−１単球細胞からのＶＥＧ Ｆ分泌は、ＴＮＦαにより著しく増加し（２．６１倍増加）、ＩＬ−１αによっ ては増加しなかったが、ＴＮＦαに対するＲＡ滑膜線維芽細胞の応答は、ＩＬ− １αにより誘発されるより（２．２３倍増加；図１）低かった（１．２９倍増加 ）。対照的に、内皮細胞は、ＴＮＦαおよびＩＬ−１αに対しほとんど等しい応 答性であった（それぞれ３．３７倍および３．２２倍増加；図１）。これらのデ ータは、ＲＡ関節に存在する細胞の代表例である細胞型からのＶＥＧＦ放出は、 前炎症性サイトカインにより誘発され得ること、および、ＴＮＦαおよびＩＬ− １は、異なる細胞亜型からのＶＥＧＦ放出を区別して調節するということを示唆 する。 実施例２ 抗−ＴＮＦα抗体をメトトレキサートと組み合わせて使用することに よるＲＡ患者の治療 方法 患者 少なくとも６ヶ月間メトトレキサートを使用しており、７．５ｍｇ／週のメト トレキサートの安定的な投与を４週間行われてきた、４３人の進行中のＲＡ患者 を、メトトレキサート治療に付随した抗−ＴＮＦα抗体の、多中心無作為化プラ セボ制御二重盲検臨床試験に登録した。すべての患者はジ アメリカン カレッ ジ オブ ルーマトロジーの基準（≧６ヶ月の間の進行中のＲＡ、少なくとも１ つの疾患緩和薬物による治療に失敗および手足のＸ線撮影上に糜爛性疾患の証拠 （Ａｒｎｅｔｔら，Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕｍ．、３１：３１５〜３２４（１９８８ ））に適合していた。６つ以上の肥大した関節に加えて、４つの二次的基準（朝 の硬直の持続≧４５分；≧６の脆いもしくは痛い関節：赤血球沈降速度（ＥＳＲ ）≧２８ｍｍ／ｈ；Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）≧２０ｍｇ／ｌ（Ｅｌｌｉ ｏｔｔ Ｍ．Ｊ．ら、Ｌａｎｃｅｔ、３４４：１１０５〜１１１０（１９９４） ）のうちの少なくとも３つが見られることにより、進行中の疾患であると定義し た。 試験点滴 キメラモノクローナル抗−ＴＮＦα抗体ｃＡ２を、１ｍｌの０．０１％ポリソ ルベート８０を添加した０．１５Ｍ塩化ナトリウムの０．０１Ｍリン酸−緩衝化 生理的食塩水、ｐＨ７．２（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｉｎｃ．，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｐ Ａ）当たり５ｍｇのｃＡ２を含有する滅菌溶液として供給した。プラセボ用バイ アルでは、同じ緩衝液に０．１％ヒト血清アルブミンを含有させた。使用前に、 ｃＡ２またはプラセボの適当量を、薬剤師により滅菌生理的食塩水中で３００ｍ ｌに希釈させ、２時間かけて０．２μｍ直列型フィルターを介して静脈内に投与 した。プラセボおよびｃＡ２点滴袋の特性は同一であり、かつ研究者および患者 は、いずれの点滴が投与されているか不知であった。 治療プロトコル及び血清検体 患者は七つの治療群の一つに無作為化された。各投与（又は治療）群における 患者数を表２に示す。４３人の各患者に対して、０、１、３又は１０ｍｇ／ｋｇ のｃＡ２のいずれかの複合的な点滴を行った。点滴は、０、２、６、１０及び１ ４週目とした。０週目の開始時において、患者は７．５ｍｇ／週のメトトレキサ ート（ファルマコケミエ、オランダ）、又はプラセボタブレット３錠／週（ファ ルマコケミエ、オランダ）を受けていた。面接、身体検査及び研究所での試験に より、点滴期間を通して、及びその後も規則的に患者の副作用について監視した 。初期点滴の前及び初期点滴後２８週目までの血清検体を得た。 ＶＥＧＦアッセイ、ＥＳＲ及びＣＲＰ評価、並びに統計的解析を、実施例１に 記載のように行った。 結果 ｃＡ２およびメトトレキサートの組み合わせによるＲＡ患者の治療により、ｃ Ａ２単独またはメトトレキサート単独のいずれかを受けた患者と比較して血清Ｖ ＥＧＦレベルの低下がより長期化した（図４Ａおよび図４Ｂ）。たとえば、３ｍ ｇ／ｋｇのｃＡ２単独の点滴では循環ＶＥＧＦレベルが顕著に低下したものの、 これらの値は最終点滴後には点滴前の濃度に戻った（２０週目の血清ＶＥＧＦレ ベルは点滴前の８７％に等しかった。）。対照的に、メトトレキサートと一緒に ｃＡ２を与えられた患者では、循環ＶＥＧＦレベルの低下はｃＡ２の最終点滴後 ６週間でさえ続いた（２０週目の血清ＶＥＧＦレベルは点滴前の５６％に等しか った。図４Ａ）。この効果はｃＡ２の投与量に依存していた。即ち、１ｍｇ／ｋ ｇのｃＡ２をメトトレキサートと組み合わせて与えられた患者よりも、３又は１ ０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２をメトトレキサートと組み合わせて与えられた患者の方が 、血清ＶＥＧＦレベルの低下がより長く維持されていた（図４Ｂ）。 要約 実施例１及び２の結果は、ＴＮＦαやＩＬ−１等の前炎症性サイトカインは、 ＲＡの発病の間、血管形成やＶＥＧＦの主な媒介物を調節すること、及びサイト カイン活性のブロックは新血管形成を調節することを示している。特に、抗−Ｔ ＮＦα抗体による治療後の血清濃度の低下から判断されるように、ＴＮＦαは、 インビボでのＶＥＧＦの産生を調節し、このことは、抗−ＴＮＦα抗体による治 療の利点の一部は血管形成の減少によるかもしれないこと、長期間のＴＮＦαの ブロックは新血管形成を低減できる、それによりパナスの細胞量及びその破壊能 力を低減できることを示唆する。ＶＥＧＦは、ＲＡにおいて抗−ＴＮＦα治療と の相乗作用を達成するための適切な治療標的であり、長期間の利益に結びつく。 均等物 当業者であれば、単なる日常的な実験手法により、本明細書に記載の発明の特 定の態様についての多くの均等物を認識し、又は確認することができるであろう 。かかる均等物は、以下の請求の範囲に包含されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 １０１ Ａ６１Ｐ 37/02 37/02 43/00 43/00 １１１ １１１ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 パレオログ，エバ，マリア 英国，ロンドン ダブリュー５ ３ジェイ アール イーリング，デラメア ロード 36

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．治療上の有効量で、個体に対し腫瘍壊死因子アルファアンタゴニストおよび 血管内皮成長因子アンタゴニストを同時投与することを含む、その必要がある個 体において腫瘍壊死因子媒介疾患を治療または予防する方法。 ２．腫瘍壊死因子媒介疾患が、自己免疫疾患、急性もしくは慢性の免疫疾患、炎 症性疾患および神経変性疾患からなる群より選ばれるものである、請求項１記載 の方法。 ３．さらに、治療上の有効量で個体に対しメトトレキサートを投与することを含 む請求項１記載の方法。 ４．腫瘍壊死因子アルファアンタゴニストが、腫瘍壊死因子アルファ合成、腫瘍 壊死因子アルファ放出または標的細胞におけるその作用を予防または阻害する、 請求項１記載の方法。 ５．腫瘍壊死因子アンタゴニストアルファが、抗−腫瘍壊死因子アルファ抗体も しくはその抗原結合性断片である、請求項４記載の方法。 ６．抗体が、キメラ抗体である請求項５記載の方法。 ７．抗体が、キメラｃＡ２抗体もしくはその抗原結合性断片である、請求項６記 載の方法。 ８．抗体が、キメラｃＡ２抗体もしくはその抗原結合性断片のヒト腫瘍壊死因子 アルファへの結合を競争的に阻害する、抗体もしくはその抗原結合性断片である 、請求項６記載の方法。 ９．腫瘍壊死因子アルファアンタゴニストが、腫瘍壊死因子アルファと結合する レセプター分子である、請求項４記載の方法。 １０．レセプター分子が、腫瘍壊死因子アルファレセプター／免疫グロブリンＧ 融合タンパク質である、請求項９記載の方法。 １１．腫瘍壊死因子アルファアンタゴニストが、ホスホジエステラーゼ阻害剤で ある、請求項４記載の方法。 １２．ホスホジエステラーゼ阻害剤が、ペントキシフィリンである、請求項１１ 記載の方法。 １３．腫瘍壊死因子アルファが、サリドマイドである、請求項４記載の方法。 １４．血管内皮成長因子アンタゴニストが、抗−血管内皮成長因子抗体もしくは その抗原結合性断片である、請求項１記載の方法。 １５．腫瘍壊死因子アルファアンタゴニストが、抗−腫瘍壊死因子アルファ抗体 もしくはその抗原結合性断片であり、かつ血管内皮成長因子アンタゴニストが、 抗−血管内皮成長因子抗体もしくはその抗原結合性断片である、請求項１記載の 方法。 １６．治療上の有効量で、個体に対し腫瘍壊死因子アルファアンタゴニストおよ び血管内皮成長因子アンタゴニストを同時投与することを含む、その必要がある 個体においてリュウーマチ性関節炎を治療または予防する方法。 １７．さらに、治療上の有効量で個体に対しメトトレキサートを投与することを 含む請求項１６記載の方法。 １８．腫瘍壊死因子アルファアンタゴニストが、抗−腫瘍壊死因子アルファ抗体 もしくはその抗原結合性断片である、請求項１６記載の方法。 １９．抗体が、キメラ抗体である請求項１８記載の方法。 ２０．血管内皮成長因子アンタゴニストが、抗−血管内皮成長因子抗体もしくは その抗原結合性断片である、請求項１６記載の方法。 ２１．腫瘍壊死因子アルファアンタゴニストが、抗−腫瘍壊死因子アルファ抗体 もしくはその抗原結合性断片であり、かつ血管内皮成長因子アンタゴニストが、 抗−血管内皮成長因子抗体もしくはその抗原結合性断片である、請求項１６記載 の方法。 ２２．治療上の有効量で、個体に対し腫瘍壊死因子アルファアンタゴニストおよ び血管内皮成長因子アンタゴニストを同時投与することを含む、その必要がある 個体においてクローン病を治療または予防する方法。 ２３．さらに、治療上の有効量で個体に対しメトトレキサートを投与することを 含む請求項２２記載の方法。 ２４．腫瘍壊死因子アルファアンタゴニストが、抗−腫瘍壊死因子アルファ抗体 もしくはその抗原結合性断片である、請求項２２記載の方法。 ２５．抗体が、キメラ抗体である請求項２４記載の方法。 ２６．血管内皮成長因子アンタゴニストが、抗−血管内皮成長因子抗体もしくは その抗原結合性断片である、請求項２２記載の方法。 ２７．腫瘍壊死因子アルファアンタゴニストが、抗−腫瘍壊死因子アルファ抗体 もしくはその抗原結合性断片であり、かつ血管内皮成長因子アンタゴニストが、 抗−血管内皮成長因子抗体もしくはその抗原結合性断片である、請求項２２記載 の方法。 ２８．治療上の有効量で、個体に対し腫瘍壊死因子アルファアンタゴニストおよ び血管内皮成長因子アンタゴニストを同時投与することを含む、その必要がある 個体において移植に関連する急性もしくは慢性の免疫疾患を治療または予防する 方法。 ２９．移植が、腎臓移植、心臓移植、骨髄移植、肝臓移植、膵臓移植、小腸移植 、皮膚移植および肺移植からなる群より選ばれるものである、請求項２８記載の 方法。 ３０．さらに、治療上の有効量で個体に対しメトトレキサートを投与することを 含む請求項２９記載の方法。 ３１．腫瘍壊死因子アルファアンタゴニストが、抗−腫瘍壊死因子アルファ抗体 もしくはその抗原結合性断片である、請求項２９記載の方法。 ３２．抗体が、キメラ抗体である請求項３１記載の方法。 ３３．血管内皮成長因子アンタゴニストが、抗−血管内皮成長因子抗体もしくは その抗原結合性断片である、請求項２９記載の方法。 ３４．腫瘍壊死因子アルファアンタゴニストが、抗−腫瘍壊死因子アルファ抗体 もしくはその抗原結合性断片であり、かつ血管内皮成長因子アンタゴニストが、 抗−血管内皮成長因子抗体もしくはその抗原結合性断片である、請求項２９記載 の方法。 ３５．腫瘍壊死因子アルファアンタゴニストおよび血管内皮成長因子アンタゴニ ストを含有してなる組成物。 ３６．腫瘍壊死因子アルファアンタゴニストが、抗−腫瘍壊死因子アルファ抗体 もしくはその抗原結合性断片である、請求項３５記載の組成物。 ３７．抗体が、キメラ抗体である請求項３６記載の組成物。 ３８．血管内皮成長因子アンタゴニストが、抗−血管内皮成長因子抗体もしくは その抗原結合性断片である、請求項３５記載の組成物。 ３９．腫瘍壊死因子アルファアンタゴニストが、抗−腫瘍壊死因子アルファ抗体 もしくはその抗原結合性断片であり、かつ血管内皮成長因子アンタゴニストが、 抗−血管内皮成長因子抗体もしくはその抗原結合性断片である、請求項３５記載 の組成物。 ４０．さらに、メトトレキサートを含有してなる請求項３５記載の組成物。 ４１．自己免疫疾患、急性もしくは慢性の免疫疾患、炎症性疾患および神経変性 疾患等の腫瘍壊死因子媒介疾患を治療または予防するための、請求項３５〜４０ のいずれか記載の組成物。 ４２．リューマチ性関節炎を治療または予防するための、請求項３５〜４０のい ずれか記載の組成物。 ４３．移植に関連する急性もしくは慢性の免疫疾患を治療または予防するための 、請求項３５〜４０のいずれか記載の組成物。 ４４．自己免疫疾患、急性もしくは慢性の免疫疾患、炎症性疾患および神経変性 疾患等の腫瘍壊死因子媒介疾患を治療または予防するための組成物の製造のため の、腫瘍壊死因子アルファアンタゴニストおよび血管内皮成長因子アンタゴニス トの使用。 ４５．リューマチ性関節炎を治療または予防するための組成物の製造のための、 腫瘍壊死因子アルファアンタゴニストおよび血管内皮成長因子アンタゴニストの 使用。 ４６．移植に関連する急性もしくは慢性の免疫疾患を治療または予防するための 組成物の製造のための、腫瘍壊死因子アルファアンタゴニストおよび血管内皮成 長因子アンタゴニストの使用。