ES2247635T3 - Anticuerpos anti-tnf/receptor de tnf y metotrexato en el tratamiento de enfermedades autoinmunes. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS PARA TRATAR Y/O PREVENIR UNA ENFERMEDAD MEDIADA POR EL TNF EN UN INDIVIDUO. SE EXPONE IGUALMENTE UNA COMPOSICION QUE COMPRENDE METOTREXATO Y UN ANTICUERPO DEL FACTOR DE NECROSIS ANTITUMORAL. LAS ENFERMEDADES MEDIADAS POR EL TNF INCLUYEN LA ARTRITIS REUMATOIDE, LA ENFERMEDAD DE CROHN Y LAS ENFERMEDADES INMUNES AGUDAS Y CRONICAS ASOCIADAS A LOS TRASPLANTES.

Description

Anticuerpos anti-TNF/receptor de TNF y metotrexato en el tratamiento de enfermedades autoinmunes.

Antecedentes de la invención

Los monocitos y macrófagos secretan las citocinas conocidas como factor de necrosis tumoral alfa (TNF\alpha) y factor de necrosis tumoral beta (TNF\beta) en respuesta a endotoxinas u otros estímulos. El TNF\alpha es un homotrímero soluble de subunidades proteicas de 17 kDa (Smith et al., J. Biol. Chem. 262: 6951-6954 (1987)). Existe también una forma precursora de TNF de 26 kDa unida a membrana (Kriegler et al., Cell 53: 45-53 (1988)). Para revisiones del TNF, véanse Beutler et al., Nature 320: 584 (1986); Old, Science 230: 630 (1986); y Le et al., Lab. Invest. 56: 234 (1987).

Células distintas de monocitos o macrófagos pueden producir también TNF\alpha. Por ejemplo, las estirpes celulares de tumor no monocítico humano producen factor de necrosis tumoral (TNF) (Rubin et al., J. Exp. Med. 164: 1350 (1986); Spriggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6563 (1987)). Los linfocitos T de sangre periférica CD4+ y CD8+ y algunas estirpes de células T y B cultivadas (Cuturi et al., J. Exp. Med. 165: 1581 (1987); Sung et al., J. Exp. Med. 168: 1539 (1988); Turner et al., Eur. J. Immunol. 17: 1807-1814 (1987)) producen también TNF\alpha.

El TNF causa acciones proinflamatorias que dan como resultado lesión de tejidos, tales como degradación de cartílago y hueso e inducción de moléculas de adhesión, induciendo actividad procoagulante sobre células endoteliales vasculares (Pober et al., J. Immunol. 136: 1680 (1986)), aumentando la adherencia de neutrófilos y linfocitos (Pober et al., J. Immunol. 138: 3319 (1987)) y estimulando la liberación de factor activador de plaquetas de macrófagos, neutrófilos y células endoteliales vasculares (Camussi et al., J. Exp. Med. 166: 1390 (1987)).

Evidencias recientes asocian el TNF con infecciones (Cerami et al., Immunol. Today 9: 28 (1988), trastornos inmunes, patologías neoplásicas (Oliff et al., Cell 50: 555 (1987)), patologías autoinmunes y patologías de injerto frente a hospedador (Piguet et al., J. Exp. Med. 166: 1280 (1987)). La asociación del TNF con cáncer y patologías infecciosas está a menudo relacionada con un estado catabólico del hospedador. Los pacientes de cáncer sufren pérdida de peso, asociada habitualmente a la anorexia.

El agotamiento extendido que está asociado al cáncer y a otras enfermedades es conocido como "caquexia" (Kern et al., J. Parent. Enter. Nutr. 12: 286-298 (1988)). La caquexia incluye pérdida progresiva de peso, anorexia y erosión persistente de la masa corporal en respuesta a un crecimiento maligno. El trastorno fisiológico fundamental puede relacionarse con una reducción de la ingesta de alimento respecto al gasto de energía. El estado caquéctico causa la mayoría de la morbilidad y mortalidad por cáncer. El TNF puede mediar la caquexia en cáncer, patologías infecciosas y otros estados catabólicos.

El TNF desempeña también un papel fundamental en la sepsis gram-negativa y en el shock endotóxico (Michie et al., Br. J. Surg. 76: 670-671 (1989); Debets et al., Second Vienna Shock Forum, pág. 463-466 (1989); Simpson et al., Crit. Care Clin. 5: 27-47 (1989)), incluyendo fiebre, malestar, anorexia y caquexia. La endotoxina activa fuertemente la producción de monocito/macrófago y la secreción de TNF y otras citocinas (Kornbluth et al., J. Immunol. 137: 2585-2591 (1986)). El TNF y otras citocinas derivadas de monocitos median las respuestas metabólicas y neurohormonales ante la endotoxina (Michie et al., New Engl. J. Med. 318; 1481-1486 (1988)). La administración de endotoxina a voluntarios humanos produce una enfermedad aguda con síntomas similares a la gripe, incluyendo fiebre, taquicardia, tasa metabólica aumentada y liberación de hormona del estrés (Revhaug et al., Arch. Surg. 123: 162-170 (1988)). El TNF en circulación aumenta en pacientes que sufren sepsis gram-negativa (Waage et al., Lancet 1: 355-357 (1987); Hammerle et al., Second Vienna Shock Forum, pág. 715-718 (1989); Debets et al., Crit. Care Med. 17: 489-497 (1989); Calandra et al., J. Infect. Dis. 161: 982-987 (1990)).

Por tanto, el TNF\alpha se ha implicado en enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, infecciones virales, bacterianas y parasíticas, malignidades y/o enfermedades neurodegenerativas, y es una diana útil para terapia biológica específica en enfermedades tales como artritis reumatoide y enfermedad de Crohn. Se han reseñado efectos beneficiosos en ensayos de etiqueta abierta con un anticuerpo monoclonal quimérico ante TNF\alpha (cA2), con supresión de la inflamación (Elliott et al., Arthritis Rheum. 36: 1681-1690 (1993); Elliott et al., Lancet 344: 1125-1127 (1994)). Véase también Van Dullemen et al., Gastroenterology 109: 129-135 (1995). Se han reseñado también resultados beneficiosos en un ensayo aleatorizado de doble ciego controlado por placebo con cA2, con supresión de la inflamación (Elliott et al., Lancet 344: 1105-1110 (1994)).

C. Bologna et al., "Association des traitements de fond dans la polyarhtrite rhumatoide", La Presse Médicale, vol. 25, nº 19, 1 de junio de 1996 (01-06-1996), páginas 876-878, XP002048553, París, Francia, sugieren estudiar las combinaciones que incluyen metotrexato (MTX) con fármacos diana tales como anticuerpos anti-CD4 o anti-TNF\alpha o el receptor soluble de TNF-\alpha.

El documento WO 96/33204 A (Kennedy Institute for Rheumatology et al.), 24 de octubre de 1996 (24-10-1996) y el documento WO 94/08619 A (The Kennedy Institute of Rheumatology), 28 de abril de 1994 (28-04-1994) se refieren al tratamiento de trastornos autoinmunes e inflamatorios utilizando un agente inhibidor de células T CD4+, tal como un anticuerpo anti-CD4 asociado a un antagonista de TNF, tal como un anticuerpo anti-TNF o receptor de TNF.

En "Tumor necrosis factor alpha (TNF) blockade enhances methotrexate (MTX) response in patients with rheumatoid arthritis (RA)", Sander Oliver; Herborn Gertraud; Rau Rolf, Arthritis & Rheumatism, 1995, ISSN 0004-3591, vol, 38, Nº 9, supl. PG S266 y "Supression of tumor necrosis factor (TNF) and TNF-mediated effector mechanisms by methotrexate (MTX) in patients with rheumatoid arthritis", Fenner Helmut; Zueger Stefan; Taylor David; Sander Oliver, Herborn; Gertraud. Arthritis & Rheumatism 1995, ISSN 0004-3591, vol. 38, nº 9, supl. PG S266, se utilizan MTX y un antagonista de TNF en el mismo estudio clínico.

El informe científico anual de 1995 del Instituto de Reumatología Mathilda y Terence Kennedy, puesto a disposición en febrero-marzo de 1996, dice que estaban en desarrollo estudios clínicos referentes a la seguridad y eficacia de la dosificación repetida con el anticuerpo cA2 anti-TNF en combinación, o comparado, con el fármaco antirreumatoide establecido MTX.

Sumario de la invención

La presente invención está basada en el descubrimiento de que el tratamiento de pacientes que sufren una enfermedad mediada por TNF con un antagonista de factor de necrosis tumoral, tal como un anticuerpo anti-factor de necrosis tumoral, como terapia coadyuvante de y/o concomitante con la terapia con metotrexato produce una reducción rápida y sostenida de los signos y síntomas clínicos de la enfermedad. La presente invención está también basada en el descubrimiento inesperado y dramático de que un régimen de dosis múltiples de antagonista de factor de necrosis tumoral, tal como un anticuerpo anti-factor de necrosis tumoral, cuando se administra adjuntamente con metotrexato a un individuo que sufre una enfermedad mediada por TNF, produce una respuesta clínica altamente beneficiosa o sinérgica durante una duración significativamente más larga comparado con la obtenida con un régimen de dosis única o múltiple del antagonista administrado solo o con la obtenida con el metotrexato administrado solo. Como resultado de la invención de la solicitante, se proporciona un método en la presente memoria para tratar y/o prevenir una enfermedad mediada por TNF en un individuo, que comprende coadministrar un anticuerpo anti-TNF o un fragmento del mismo y metotrexato al individuo en cantidades terapéuticamente eficaces. En una realización particular, el metotrexato se administra en forma de una serie de dosis bajas separadas por intervalos de días o semanas.

Se proporciona también en la presente memoria un método para tratar y/o prevenir la recurrencia de una enfermedad mediada por TNF en un individuo, que comprende coadministrar un anticuerpo anti-TNF o un fragmento del mismo y metotrexato al individuo en cantidades terapéuticamente eficaces. Las enfermedades mediadas por TNF incluyen artritis reumatoide, enfermedad de Crohn y enfermedades inmunes agudas y crónicas asociadas a un transplante alogénico (por ejemplo, transplante renal, cardiaco, de médula ósea, de hígado, pancreático, de intestino delgado, de piel o de pulmón).

Por lo tanto, en una realización, la invención se refiere a un método de tratamiento y/o prevención de artritis reumatoide en un individuo, que comprende coadministrar un anticuerpo anti-TNF o un fragmento del mismo y metotrexato al individuo en cantidades terapéuticamente eficaces. En una segunda realización, la invención se refiere a un método de tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Crohn en un individuo, que comprende coadministrar un anticuerpo anti-TNF o un fragmento del mismo y metotrexato al individuo en cantidades terapéuticamente eficaces. En una tercera realización, la invención se refiere a un método de tratamiento y/o prevención de otras enfermedades autoinmunes y/o enfermedades inmunes agudas o crónicas asociadas a un transplante en un individuo, que comprende coadministrar un anticuerpo anti-TNF o un fragmento del mismo y metotrexato al individuo en cantidades terapéuticamente eficaces.

Una realización adicional de la invención se refiere a composiciones que comprenden un anticuerpo anti-TNF o un fragmento del mismo y metotrexato.

Además de anticuerpos anti-TNF, los antagonistas de TNF incluyen un receptor p75 soluble de factor de necrosis tumoral \alpha humano o un fragmento funcional del mismo. La invención se define mediante las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-1C son un conjunto de tres gráficas que muestran los resultados frente al tiempo para el recuento de articulaciones inflamadas en pacientes de artritis reumatoide (AR) que reciben tratamiento con cA2 (1 mg/kg, 3 mg/kg o 10 mg/kg) con o sin metotrexato. Los resultados para el grupo placebo (metotrexato solo) se muestran con el grupo de 1 mg/kg. El número de pacientes con datos en cada visita de evaluación se muestra en la parte inferior de cada gráfica. Círculo blanco: - metotrexato (MTX-), círculo negro = + metotrexato (MTX+), cuadrado =
placebo.

Las Figuras 2A-2C son un conjunto de tres gráficas que muestran los resultados frente al tiempo para el recuento de articulaciones sensibles en pacientes de artritis reumatoide (AR) que reciben tratamiento con cA2 (1 mg/kg, 3 mg/kg o 10 mg/kg) con o sin metotrexato. Los resultados para el grupo placebo (metotrexato solo) se muestran con el grupo de 1 mg/kg. El número de pacientes con datos en cada visita de evaluación se muestra en la parte inferior de cada gráfica. Círculo blanco: - metotrexato (MTX-), círculo negro= + metotrexato (MTX+), cuadrado = placebo.

Las Figuras 3A-3C son un conjunto de tres gráficas que muestran los resultados frente al tiempo de la valoración global de la enfermedad por el médico en pacientes con AR que reciben tratamiento con cA2 (1 mg/kg, 3 mg/kg o 10 mg/kg) con o sin metotrexato. Los resultados para el grupo placebo (metotrexato solo) se muestran con el grupo de 1 mg/kg. El número de pacientes con datos en cada visita de evaluación se muestra en la parte inferior de cada gráfica. Círculo blanco: - metotrexato (MTX-), círculo negro = + metotrexato (MTX+), cuadrado = placebo.

Las Figuras 4A-4C son un conjunto de tres gráficas que muestran los resultados frente al tiempo de la valoración de la enfermedad por el paciente en pacientes con AR que reciben tratamiento con cA2 (1 mg/kg, 3 mg/kg o 10 mg/kg) con o sin metotrexato. Los resultados para el grupo placebo (metotrexato solo) se muestran con el grupo de 1 mg/kg. El número de pacientes con datos en cada visita de evaluación se muestra en la parte inferior de cada gráfica. Círculo blanco: - metotrexato (MTX-), círculo negro = + metotrexato (MTX+), cuadrado = placebo.

Las Figuras 5A-5C son un conjunto de tres gráficas que muestran los resultados frente al tiempo de la concentración de proteína C reactiva (PCR) en pacientes con AR que reciben tratamiento con cA2 (1 mg/kg, 3 mg/kg o 10 mg/kg) con o sin metotrexato. Los resultados para el grupo placebo (metotrexato solo) se muestran con el grupo de 1 mg/kg. El número de pacientes con datos en cada visita de evaluación se muestra en la parte inferior de cada gráfica. Círculo blanco: - metotrexato (MTX-), círculo negro = + metotrexato (MTX+), cuadrado = placebo.

Las Figuras 6A-6C son un conjunto de tres gráficas que muestran los resultados frente al tiempo del cuestionario de evaluación de la salud (CES) en pacientes con AR que reciben tratamiento con cA2 (1 mg/kg, 3 mg/kg o 10 mg/kg) con o sin metotrexato. Los resultados para el grupo placebo (metotrexato solo) se muestran con el grupo de 1 mg/kg. El número de pacientes con datos en cada visita de evaluación se muestra en la parte inferior de cada gráfica. Círculo blanco: - metotrexato (MTX-), círculo negro = + metotrexato (MTX+), cuadrado = placebo.

Las Figuras 7A-7F son un conjunto de seis gráficas que muestran la concentración sérica de cA2 en cada paciente de AR que recibe tratamiento con cA2 (1 mg/kg, 3 mg/kg o 10 mg/kg) con o sin metotrexato, representado frente al tiempo. Los datos representados son las concentraciones séricas de cA2 obtenidas justo antes de la administración de cA2 en las semanas 2, 6, 10 y 14 y después en las semanas 18 y 26. Las escalas para la concentración sérica de cA2 se condensan con las dosis mayores de cA2.

Las Figuras 8A y 8B son un conjunto de dos gráficas que muestran la concentración sérica mediana de cA2 frente al tiempo en pacientes con AR que reciben 3 mg/kg de cA2 (panel superior) o 10 mg/kg de cA2 (panel inferior) con o sin metotrexato. Cuadrado = +metotrexato, círculo o triángulo = -metotrexato.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere al descubrimiento de que los antagonistas de factor de necrosis tumoral pueden administrarse a pacientes que sufren una enfermedad mediada por TNF como terapia coadyuvante de y/o concomitante con la terapia con metotrexato, con un alivio de bueno a excelente de los signos y síntomas de la enfermedad. La presente invención se refiere también al descubrimiento de que los antagonistas de factor de necrosis tumoral pueden administrarse a pacientes que sufren una enfermedad mediada por TNF en dosis múltiples y como terapia coadyuvante de y/o concomitante con la terapia con metotrexato, con una mejora significativa en la duración de la respuesta clínica.

Como resultado de la invención de la solicitante, se proporciona en la presente memoria un método para tratar y/o prevenir una enfermedad mediada por TNF en un individuo, que comprende coadministrar metotrexato y un antagonista de factor de necrosis tumoral al individuo en cantidades terapéuticamente eficaces. El antagonista de TNF y metotrexato pueden administrarse simultánea o secuencialmente. El antagonista de TNF y metotrexato pueden administrarse cada uno en dosis únicas o múltiples. Pueden coadministrarse múltiples antagonistas de TNF con metotrexato. Pueden utilizarse otros regímenes y agentes terapéuticos en combinación con la coadministración terapéutica de antagonistas de TNF y metotrexato u otros fármacos que suprimen el sistema inmune.

Se proporciona también un método en la presente memoria para tratar y/o prevenir la recurrencia de una enfermedad mediada por TNF en un individuo, que comprende coadministrar metotrexato y un antagonista de TNF al individuo en cantidades terapéuticamente eficaces.

Como se utiliza en la presente memoria, una "enfermedad mediada por TNF" designa una patología o enfermedad relacionada con TNF. Las patologías o enfermedades relacionadas con TNF incluyen, pero sin limitación, las siguientes:

(A) patologías inmunes y autoinmunes agudas y crónicas tales como, pero sin limitación, artritis reumatoide (AR), artritis crónica juvenil (ACJ), tiroiditis, enfermedad de injerto frente a hospedador (EIFH), escleroderma, diabetes mellitus, enfermedad de Graves, alergia, enfermedad inmune aguda o crónica asociada a transplante alogénico tal como, pero sin limitación, transplante renal, transplante cardiaco, transplante de médula ósea, transplante de hígado, transplante pancreático, transplante de intestino delgado, transplante de pulmón y transplante de piel.

(B) infecciones, incluyendo, pero sin limitación, síndrome de sepsis, caquexia, colapso circulatorio y shock como resultado de infección bacteriana aguda o crónica, enfermedades parasíticas y/o infecciosas agudas y crónicas, enfermedades bacterianas, virales o fúngicas, tales como virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA) (incluyendo síntomas de caquexia, trastornos autoinmunes, complejo de demencia por SIDA e infecciones);

(C) enfermedades inflamatorias, tales como patologías inflamatorias crónicas, incluyendo patologías inflamatorias crónicas tales como, pero sin limitación, sarcoidosis, enfermedad inflamatoria crónica del intestino, colitis ulcerosa y patología o enfermedad de Crohn; patologías inflamatorias vasculares tales como, pero sin limitación, coagulación intravascular diseminada, aterosclerosis, patología de Kawasaki y síndromes de vasculitis tales como, pero sin limitación, poliarteritis nodular, granulomatosis de Wegener, púrpura de Henoch-Schönlein, artritis de células gigantes y vasculitis microscópica de los riñones; hepatitis activa crónica; síndrome de Sjögren; espondiloartropatías tales como espondilitis anquilosante, artritis y espondilitis psoriásica, artritis y espondilitis enteropática, artritis reactiva y artritis asociada a enfermedad inflamatoria del intestino; y uveitis;

(D) enfermedades neurodegenerativas incluyendo, pero sin limitación, enfermedades desmielinizantes tales como esclerosis múltiple y mielitis transversa aguda; miastenia grave; trastornos extrapiramidales y cerebelares tales como lesiones del sistema corticoespinal; trastornos de los ganglios basales o trastornos cerebelares; trastornos del movimiento hipercinéticos tales como corea de Huntington y corea senil; trastornos del movimiento inducidos por fármacos tales como los inducidos por fármacos que bloquean receptores de dopamina del sistema nervioso central (SNC); trastornos del movimiento hipocinéticos tales como enfermedad de Parkinson; parálisis supranuclear progresiva; trastornos cerebelares y espinocerebelares tales como lesiones estructurales del cerebelo; degeneraciones espinocerebelares (ataxia espinal, ataxia de Friedreich, degeneraciones corticales cerebelares, degeneraciones de sistemas múltiples (Mencel, Dejerine-Thomas, Shi-Drager y MachadoJoseph)); y trastornos sistémicos (enfermedad de Refsum, abetalipoprotemia, ataxia, telangiectasia y trastorno multisistémico mitocondrial); trastornos de la unidad motora tales como atrofias musculares neurogénicas (degeneración de las células corneales anteriores tal como esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal infantil y atrofia muscular espinal juvenil); enfermedad de Alzheimer; síndrome de Down en la mediana edad; enfermedad de cuerpos de Lewy difusos; demencia senil de tipo cuerpos de Lewy; síndrome de Wernicke-Korsakoff; alcoholismo crónico; cirrosis biliar primaria; alveolitis fibrosante criptogénica y otras enfermedades pulmonares fibróticas; anemia hemolítica; enfermedad de Creutzfeldt-Jakob; panencefalitis esclerosante subaguda; enfermedad de Hallerrorden-Spatz y demencia pugilística o cualquier subconjunto de las mismas;

(E) patologías malignas que implican tumores secretores de TNF u otras malignidades que implican TNF tales como, pero sin limitación, leucemias (aguda, mielocítica crónica, linfocítica crónica y/o síndrome mielodispástico), linfomas (de Hodgkin y no de Hodgkin tales como linfomas malignos (linfoma de Burkitt o micosis fungoide));

(F) síndromes caquécticos y otras patologías y enfermedades que implican TNF en exceso tales como, pero sin limitación, caquexia por cáncer, enfermedad parasítica e insuficiencia cardiaca; y

(G) hepatitis inducida por el alcohol y otras formas de hepatitis crónica.

Véase, por ejemplo, Berkow et al., Eds., The Merck Manual, 16ª edición, capítulo 11, pág. 1380-1529, Merck and Co., Rahway, Nueva Jersey, 1992, incorporado a la presente memoria como referencia.

Los términos "recurrencia", "exacerbación" o "recaída" se definen para abarcar la reaparición de uno o más síntomas del estado patológico. Por ejemplo, en el caso de artritis reumatoide, una recurrencia puede incluir la experiencia de uno o más de articulaciones inflamadas, rigidez matutina o sensibilidad articular.

En una realización, la invención se refiere a un método de tratamiento y/o prevención de artritis reumatoide en un individuo, que comprende coadministrar metotrexato y un antagonista de TNF al individuo en cantidades terapéuticamente eficaces.

En una segunda realización, la invención se refiere a un método para tratar y/o prevenir la enfermedad de Crohn en un individuo, que comprende coadministrar metotrexato y un antagonista de TNF al individuo en cantidades terapéuticamente eficaces.

En una tercera realización, la invención se refiere a un método para tratar y/o prevenir una enfermedad inmune aguda o crónica asociada a un transplante alogénico en un individuo, que comprende coadministrar metotrexato y un antagonista de TNF al individuo en cantidades terapéuticamente eficaces. Como se utiliza en la presente memoria, un "transplante" incluye transplante de órgano, tejido o célula, tal como transplante renal, transplante cardiaco, transplante de médula ósea, transplante de hígado, transplante pancreático, transplante de intestino delgado, transplante de piel y transplante de pulmón.

Los beneficios de la terapia de combinación con metotrexato y antagonistas de TNF incluyen altas tasas de respuesta clínica durante duraciones significativamente más largas en comparación con la obtenida con el tratamiento con cada modalidad terapéutica separadamente. Además, el metotrexato reduce significativamente la inmunogenicidad de los anticuerpos anti-TNF, permitiendo así la administración de múltiples dosificaciones de anticuerpos anti-TNF con seguridad potenciada. Los resultados descritos en la presente memoria sugieren que puede utilizarse metotrexato para reducir la inmunogenicidad de otros anticuerpos o proteínas. Basándose en los resultados descritos en la presente memoria, puede utilizarse metotrexato en otras formas de terapia de anticuerpo, tales como terapia de anticuerpo anti-IL-2. Este método es particularmente pertinente en terapias distintas de terapia de anticuerpo anti-CD4.

En una realización adicional, la invención se refiere a composiciones que comprenden metotrexato y un antagonista de TNF. Las composiciones de la presente invención son útiles para tratar un sujeto que tiene una patología o afección asociada a niveles anormales de una sustancia reactiva con un antagonista de TNF, en particular TNF en exceso o menor que los niveles presentes en un sujeto sano normal, cuando dichos niveles en exceso o reducidos aparecen en un tipo de tejido o localización sistémica, localizada o particular en el cuerpo. Dichos tipos de tejido pueden incluir, pero sin limitación, sangre, linfa, sistema nervioso central (SNC), hígado, riñón, bazo, músculo cardiaco o vasos sanguíneos, materia blanca o materia gris cerebral o de médula espinal, cartílago, ligamentos, tendones, pulmón, páncreas, ovario, testículos, próstata. Pueden localizarse también concentraciones de TNF aumentadas o reducidas respecto a los niveles normales en regiones o células específicas en el cuerpo, tales como articulaciones, conexiones nervio-vaso sanguíneo, huesos, tendones o ligamentos específicos o sitios de infección, tales como infecciones bacterianas o virales.

Antagonistas de factor de necrosis tumoral

Como se utiliza en la presente memoria, un "antagonista de factor de necrosis tumoral" reduce, bloquea, inhibe, anula o interfiere la actividad TNF in vivo. Por ejemplo, un antagonista de TNF adecuado puede unirse a TNF, e incluye anticuerpos anti-TNF y moléculas receptoras que se unen específicamente a TNF. Un antagonista de TNF adecuado puede prevenir o inhibir también la síntesis y/o liberación de TNF, e incluye compuestos tales como talidomida, tenidap e inhibidores de fosfodiesterasa tales como, pero sin limitación, pentoxifilina y rolipram. Un antagonista de TNF adecuado que puede prevenir o inhibir la síntesis de TNF y/o la liberación de TNF incluye también potenciadores del receptor de adenosina A2b y agonistas del receptor de adenosina A2b (por ejemplo, 5'-(N-ciclopropil)-carboxamidoadenosina, 5'-N-etilcarboxamidoadenosina, ciclohexiladenosina y R-N'-fenil-2-propiladenosina). Véase, por ejemplo, Jacobson (documento GB 2289218A). Un antagonista de TNF adecuado puede prevenir o inhibir también la señalización de receptor de TNF.

Anticuerpos anti-TNF

Como se utiliza en la presente memoria, un "anticuerpo anti-factor de necrosis tumoral" reduce, bloquea, inhibe, anula o interfiere la actividad TNF in vivo. Los anticuerpos anti-TNF útiles en los métodos y composiciones de la presente invención incluyen anticuerpos monoclonales, quiméricos, humanizados, de superficie modificada y recombinantes y fragmentos de los mismos, que se caracterizan por alta afinidad de unión a TNF y baja toxicidad (incluyendo respuesta de anticuerpo humano anti-múrido (HAMA) y/o anticuerpo humano anti-quimérico (HACA)). En particular, un anticuerpo en el que los componentes individuales tales como la región variable, la región constante y estructural posean individual y/o colectivamente una baja inmunogenicidad, es útil en la presente invención. Los anticuerpos que pueden utilizarse en la invención se caracterizan por su capacidad de tratar pacientes durante periodos extensos con un alivio de bueno a excelente de los síntomas y baja toxicidad. La baja inmunogenicidad y/o alta afinidad, así como otras propiedades no definidas, pueden contribuir a los resultados terapéuticos conseguidos.

Es un ejemplo de un anticuerpo monoclonal de alta afinidad útil en los métodos y composiciones de la presente invención el anticuerpo monoclonal de múrido (mAb) A2 y los anticuerpos que inhiban competitivamente in vivo la unión a TNF\alpha humano de mAb A2 de múrido anti-TNF\alpha, o un anticuerpo que tenga sustancialmente las mismas características de unión específicas, así como fragmentos y regiones de los mismos. Se describe el anticuerpo monoclonal de múrido A2, y derivados quiméricos del mismo tales como cA2, en la solicitud de EE.UU. nº 08/192.093 (presentada el 4 de febrero de 1994), la solicitud de EE.UU. nº 08/192.102 (presentada el 4 de febrero de 1994), la solicitud de EE.UU. nº 08/192.861 (presentada el 4 de febrero de 1994), la solicitud de EE.UU. nº 08/324.799 (presentada el 18 de octubre de 1994) y Le J. et al., publicación internacional nº WO 92/16553 (publicada el 1 de octubre de 1992). Es un segundo ejemplo de anticuerpo monoclonal de alta afinidad útil en los métodos y composiciones de la presente invención el mAb de múrido 195 y anticuerpos que inhiban competitivamente in vivo la unión a TNF\alpha humano de anti-TNF\alpha de múrido 195, o un anticuerpo que tenga sustancialmente las mismas características de unión específica, así como fragmentos y regiones del mismo. Otros anticuerpos monoclonales de alta afinidad útiles en los métodos y composiciones de la presente invención incluyen mAb de múrido 114 y mAb de múrido 199 y anticuerpos que inhiban competitivamente in vivo la unión a TNF\alpha humano de mAb de múrido 114 o mAb de múrido 199 anti-TNF, o un anticuerpo que tenga sustancialmente las mismas características de unión específica que mAb 114 o mAb 199, así como fragmentos y regiones del mismo. Los anticuerpos monoclonales de múrido 114, 195 y 199 y el método para producirlos se describen por Möller A. et al. (Cytokine 2(3): 162-169 (1990)). Los métodos preferidos para determinar la especificidad y afinidad de mAb mediante inhibición competitiva pueden encontrarse en Harlow et al., "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1988); Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience, Nueva York (1992, 1993); Kozbor et al., Immunol. Today 4: 72-79 (1983); Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, Nueva York (1987, 1992, 1993); y Muller, Meth. Enzymol. 92: 589-601 (1983).

Se describen en la técnica ejemplos adicionales de anticuerpos monoclonales anti-TNF que pueden utilizarse en la presente invención (véanse, por ejemplo, la solicitud de EE.UU. nº 07/943.852 (presentada el 11 de septiembre de 1992), Rathjen et al., publicación internacional nº WO 91/02078 (publicada el 21 de febrero de 1991); Rubin et al., publicación de patente OEP 0218868 (publicada el 22 de abril de 1987); Yone et al., publicación de patente OEP 0288088 (26 de octubre de 1988); Liang et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 137: 847-854 (1986); Meager et al., Hybridoma 6: 305-311 (1987); Fendly et al., Hybridoma 6: 359-369 (1987); Bringman et al., Hybridoma 6: 489-507 (1987); Hirai et al., J. Immunol. Meth. 96: 57-62 (1987); Moller et al., Cytokine 2: 162-169 (1990), cuyas referencias están enteramente incorporadas a la presente memoria como referencia.

Los anticuerpos quiméricos son moléculas de inmunoglobulina caracterizadas por dos o más segmentos o porciones derivados de diferentes especies animales. Generalmente, la región variable del anticuerpo quimérico deriva de un anticuerpo mamífero no humano, tal como un mAb de múrido, y la región constante de inmunoglobulina deriva de una molécula de inmunoglobulina humana. Preferiblemente, se selecciona una región variable con baja inmunogenicidad y se combina con una región constante humana que tiene también baja inmunogenicidad, teniendo también preferiblemente la combinación baja inmunogenicidad. Se define la "baja" inmunogenicidad en la presente memoria por elevar significativamente las respuestas HACA o HAMA en menos de aproximadamente 75%, o preferiblemente menos de aproximadamente 50% de los pacientes tratados y/o producir bajas titulaciones en el paciente tratado (menos de aproximadamente 300, preferiblemente menos de aproximadamente 100, medidas con un inmunoensayo enzimático de doble antígeno) (Elliott et al., Lancet 344: 1125-1127 (1994).

Como se utiliza en la presente memoria, el término "anticuerpo quimérico" incluye inmunoglobulinas monovalentes, divalentes o polivalentes. Es un anticuerpo quimérico monovalente un dímero (HL) formado por una cadena H quimérica asociada mediante puentes disulfuro con una cadena L quimérica. Es un anticuerpo quimérico divalente un tetrámero (H2L2) formado por dos dímeros HL asociados mediante al menos un puente disulfuro. Puede producirse también un anticuerpo quimérico polivalente, por ejemplo, empleando una región CH que agrega (por ejemplo de una cadena H de IgM o cadena \mu).

Los anticuerpos comprenden cadenas de inmunoglobulina pesada (H) y/o ligera (L) individuales. Una cadena H quimérica comprende una región de unión a antígeno derivada de la cadena H de un anticuerpo no humano específico de TNF, que está ligada al menos a una porción de una región C de cadena H humana (CH), tal como CH1 o CH2. Una cadena L quimérica comprende una región de unión a antígeno derivada de la cadena L de un anticuerpo no humano específico de TNF, ligada al menos a una porción de una región C de cadena L humana (CL).

Se han descrito en la técnica anticuerpos quiméricos y métodos para su producción (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature 312: 643-646 (1984); Neuberger et al., Nature 314: 268-270 (1985); Taniguchi et al., solicitud de patente europea nº 171496 (publicada el 19 de febrero de 1985); Morrison et al., solicitud de patente europea nº 173494 (publicada el 5 de marzo de 1986); Neuberger et al., solicitud PCT nº WO 86/01533 (publicada el 13 de marzo de 1986); Kudo et al., solicitud de patente europea nº 184187 (publicada el 11 de junio de 1986); Morrison et al., solicitud de patente europea nº 173494 (publicada el 5 de marzo de 1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson et al., publicación internacional nº PCT/US86/02269 (publicada el 7 de mayo de 1987); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218 (1987); Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988); y Harlow y Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1988).

El anticuerpo quimérico anti-TNF puede comprender, por ejemplo, dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, comprendiendo cada una de las cadenas al menos parte de una región constante humana y al menos parte de una región variable (V) de origen no humano que tiene especificidad por el TNF humano, uniéndose dicho anticuerpo con alta afinidad a un epítopo inhibidor y/o neutralizante de TNF humano, tal como el anticuerpo cA2. El anticuerpo incluye también un fragmento o un derivado de dicho anticuerpo, tal como una o más porciones de la cadena de anticuerpo, tal como las regiones constantes o variables de cadena pesada, o las regiones constantes o variables de cadena ligera.

La humanización y modificación de superficie del anticuerpo puede reducir adicionalmente la inmunogenicidad del anticuerpo. Véanse, por ejemplo, Winter (patente de EE.UU. nº 5.225.539 y EP 239.400 B1), Padlan et al. (documento EP 519596 A1) y Pedersen et al. (documento EP 592.106 A1).

Los anticuerpos preferidos útiles en los métodos y composiciones de la presente invención son anticuerpos anti-TNF quiméricos humano-múrido de alta afinidad y fragmentos o regiones de los mismos, que tienen potente actividad inhibidora y/o neutralizante in vivo contra TNF\alpha humano. Dichos anticuerpos y anticuerpos quiméricos pueden incluir los generados mediante inmunización utilizando TNF\alpha recombinante purificado o fragmentos peptídicos del mismo que comprenden uno o más epítopos.

Es un ejemplo de dicho anticuerpo quimérico cA2 y anticuerpos que inhiban competitivamente in vivo la unión a TNF\alpha humano de mAb A2 de múrido anti-TNF\alpha, mAb cA2 quimérico, o un anticuerpo que tenga sustancialmente las mismas características de unión específica, así como fragmentos y regiones de los mismos. El mAb cA2 quimérico se ha descrito, por ejemplo, en la solicitud de EE.UU. nº 08/192.093 (presentada el 4 de febrero de 1994), la solicitud de EE.UU. nº 08/192.102 (presentada el 4 de febrero de 1994), la solicitud de EE.UU. nº 08/192.861 (presentada el 4 de febrero de 1994) y la solicitud de EE.UU. nº 08/324.799 (presentada el 18 de octubre de 1994), y por Le J. et al. (publicación internacional nº WO 92/16553 (publicada el 1 de octubre de 1992); Knight, D.M. et al., (Mol. Immunol. 30: 1443-1453 (1993)); y Siegel, S.A. et al., (Cytokine 7(1): 15-25, (1995)).

El A2 quimérico anti-TNF consiste en la región variable de unión a antígeno del anticuerpo IgG1 de ratón anti-TNF humano neutralizante de alta afinidad, designado A2, y las regiones constantes de una inmunoglobulina kappa de IgG1 humana. La región Fc de IgG1 humana mejora la función efectora de anticuerpo alogénico, aumenta la semivida sérica en circulación y reduce la inmunogenicidad del anticuerpo. La avidez y la especificidad de epítopo del A2 quimérico derivan de la región variable del A2 de múrido. El A2 quimérico neutraliza el efecto citotóxico tanto de TNF humano natural como recombinante de manera dependiente de la dosis. A partir de los ensayos de unión de cA2 y TNF humano recombinante, se calculó que la constante de afinidad de cA2 era 1,8 x 10^{9} M^{-1}. Pueden encontrarse los métodos preferidos para determinar la especificidad y afinidad de mAb mediante inhibición competitiva en Harlow et al., "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1988; Colligan et al., eds., "Current Protocols in Immunology", Greene Publishing Assoc. y Wiley-Interscience, Nueva York (1992, 1993); Kozbor et al., Immunol. Today 4: 72-79 (1983); Ausubel et al., eds., "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley Intersciences, Nueva York (1987, 1992, 1993); y Muller, Meth. Enzymol. 92: 589-601 (1983).

Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "región de unión a antígeno" designa aquella porción de una molécula de anticuerpo que contiene los residuos aminoacídicos que interaccionan con un antígeno y confieren al anticuerpo su especificidad y afinidad por el antígeno. La región de anticuerpo incluye los residuos aminoacídicos "estructurales" necesarios para mantener la conformación apropiada de los residuos de unión a antígeno. Generalmente, la región de unión a antígeno será de origen múrido. En otras realizaciones, la región de unión a antígeno puede derivar e otras especies animales, tales como oveja, conejo, rata o hámster. Las fuentes preferidas para codificación de ADN de dicho anticuerpo no humano incluyen estirpes celulares que producen anticuerpo, preferiblemente estirpes celulares híbridas conocidas habitualmente como hibridomas. En una realización, es un hibridoma preferido la estirpe celular de hibridoma A2.

Un "antígeno" es una molécula o una porción de molécula capaz de unirse a un anticuerpo que es adicionalmente capaz de inducir a un animal a producir anticuerpo capaz de unirse selectivamente a un epítopo de ese antígeno. Un antígeno puede tener uno o más de un epítopo.

El término "epítopo" pretende indicar aquella porción del antígeno capaz de ser reconocida por y unirse a un anticuerpo en una o más de las regiones de unión a antígeno del anticuerpo. Los epítopos consisten habitualmente en agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activa, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Por "epítopo inhibidor y/o neutralizante" se pretende un epítopo que, cuando se une a un anticuerpo, da como resultado la pérdida de actividad biológica de la molécula que contiene el epítopo in vivo o in vitro, más preferiblemente in vivo, incluyendo la unión de TNF a un receptor de TNF. Los epítopos de TNF se han identificado en los aminoácidos 1 a aproximadamente 20, aproximadamente 56 a aproximadamente 77, aproximadamente 108 a aproximadamente 127 y aproximadamente 138 a aproximadamente 149. Preferiblemente, el anticuerpo se une a un epítopo que comprende al menos aproximadamente 5 aminoácidos de TNF en los residuos de TNF de aproximadamente 87 a aproximadamente 107, aproximadamente 59 a aproximadamente 80 o una combinación de los mismos. Generalmente, los epítopos incluyen al menos aproximadamente 5 aminoácidos y menos de aproximadamente 22 aminoácidos abarcados o superpuestos en una o más de estas regiones.

Por ejemplo, los epítopos de TNF que son reconocidos por y/o se unen con actividad anti-TNF a un anticuerpo, y fragmentos y regiones variables de los mismos, incluyen:

59-80:

Tyr-Ser-Gln-Val-Leu-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-Cys-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Leu-Thr-His-Thr-Ile (SEC ID Nº 1); y/o

87-108:

Tyr-Gln-Thr-Lys-Val-Asn-Leu-Leu-Ser-Ala-Ile-Lys-Ser-Pro-Cys-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly (SEC ID Nº 2).

Los anticuerpos anti-TNF, y fragmentos y regiones variables de los mismos, que son reconocidos por y/o se unen con actividad anti-TNF a estos epítopos bloquean la acción del TNF\alpha sin unirse al supuesto locus de unión de receptor presentado por Eck y Sprang (J. Biol. Chem. 264 (29): 17595-17605 (1989) (aminoácidos 11-13, 37-42, 49-57 y 155-157 de hTNF\alpha). Rathjen et al., publicación internacional nº WO 91/02078 (publicada el 21 de febrero de 1991), incorporada a la presente memoria como referencia, dan a conocer ligandos de THF que pueden unirse a epítopos adicionales de TNF.

Producción de anticuerpo utilizando hibridomas

Son bien conocidas en la técnica las técnicas de producción de anticuerpos contra secuencias peptídicas pequeñas que reconocen y se unen a esas secuencias en forma libre o conjugada o cuando se presentan como una secuencia nativa en el contexto de una proteína grande. Dichos anticuerpos pueden producirse mediante técnicas de hibridoma o recombinantes conocidas en la técnica.

Se han descrito también anticuerpos de múrido que pueden utilizarse en la preparación de anticuerpos útiles en los métodos y composiciones de la presente invención en Rubin et al., documento EP 0218868 (publicado el 21 de abril de 1987); Yone et al., documento EP 0288088 (publicado el 26 de octubre de 1988); Liang et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 137: 847-854 (1986); Meager et al., Hybridoma 6: 305-311 (1987); Fendly et al., Hybridoma 6: 359-369 (1987); Bringman, et al., Hybridoma 6: 489-507 (1987); Hirai et al., J. Immunol. Meth. 96: 57-62 (1987); Möller et al., Cytokine 2: 162-169 (1990).

Las fusiones celulares se consiguen mediante procedimientos estándar bien conocidos por los expertos en el campo de la inmunología. Las estirpes celulares asociadas de fusión y los métodos para fusionar y seleccionar hibridomas y examinar los mAb son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Ausubel, infra, Harlow infra y Colligan infra.

El mAb de múrido específico de TNF\alpha útil en los métodos y composiciones de la presente invención puede producirse en grandes cantidades inyectando células de hibridoma o transfectoma que secretan al anticuerpo en la cavidad peritoneal de ratones y, después de un tiempo apropiado, recogiendo el fluido ascítico que contiene una alta titulación del mAb, y aislando el mAb del mismo. Para dicha producción in vivo del mAb con un hibridoma (por ejemplo de rata o humano), las células de hibridoma se hacen crecer preferiblemente en ratones desnudos irradiados o atímicos. Como alternativa, los anticuerpos pueden producirse cultivando células de hibridoma o transfectoma in vitro y aislando el mAb secretado del medio de cultivo celular o recombinantemente en células eucarióticas o procarióticas.

En una realización, el anticuerpo utilizado en los métodos y composiciones de la presente invención es un mAb que se une a aminoácidos de un epítopo de TNF reconocido por A2, rA2 o cA2, producido por un hibridoma o por un hospedador recombinante. En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico que reconoce un epítopo reconocido por A2. En aún otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico designado como A2 quimérico (cA2).

Como ejemplos de anticuerpos útiles en los métodos y composiciones de la presente invención, el mAb A2 de múrido se produce mediante una estirpe celular designada c134A. El anticuerpo quimérico cA2 se produce por una estirpe celular designada c168A. c168A fue depositado en la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, como "Depósito de cultivo seguro (Culture Safe Deposit)".

Los "derivados" de los anticuerpos, incluyendo fragmentos, regiones o proteínas codificados por genes truncados o modificados para proporcionar especies moleculares funcionalmente similares a los fragmentos de inmunoglobulina, son también útiles en los métodos y composiciones de la presente invención. Las modificaciones incluyen, pero sin limitación, la adición de secuencias genéticas que codifican proteínas citotóxicas tales como toxinas de planta y bacterianas. Los fragmentos y derivados pueden producirse a partir de células apropiadas, como es conocido en la técnica. Como alternativa, pueden unirse anticuerpos, fragmentos y regiones anti-TNF a proteínas o compuestos citotóxicos in vitro, proporcionando anticuerpos citotóxicos anti-TNF que matarían selectivamente células que tengan TNF en su superficie.

Los "fragmentos" de anticuerpo incluyen, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')_{2} y Fv. Estos fragmentos carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se eliminan más rápidamente de la circulación y pueden tener menos unión no específica a tejido que un anticuerpo intacto (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)). Estos fragmentos se producen a partir de anticuerpos intactos utilizando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante escisión proteolítica con enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')_{2}).

Expresión recombinante de anticuerpos anti-TNF

Los anticuerpos recombinantes y/o quiméricos de múrido-humano o humano-humano que inhiben TNF pueden producirse utilizando técnicas conocidas basadas en las enseñanzas proporcionadas en la solicitud de EE.UU. nº 08/192.093 (presentada el 4 de febrero de 1994), la solicitud de EE.UU. nº 08/192.102 (presentada el 4 de febrero de 1994), la solicitud de EE.UU. nº 08/192.861 (presentada el 4 de febrero de 1994), la solicitud de EE.UU. nº 08/324.799 (presentada el 18 de octubre de 1994) y Le J. et al., publicación internacional nº WO 92/16553 (publicada el 1 de octubre de 1992). Véanse, por ejemplo, Ausubel et al., eds., "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley Interscience, Nueva York (1987, 1992, 1993) y Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1989). Véanse también, por ejemplo, Knight, D.M. et al., Mol. Immunol. 30: 1443-1453 (1993) y Siegel, S.A., et al., Cytokine 7 (1): 15-25 (1995).

El ADN que codifica un anticuerpo anti-TNF puede ser ADN genómico o ADNc que codifica al menos una de la región constante de cadena pesada (Hc), la región variable de cadena pesada (Hv), la región variable de cadena ligera (Lv) y las región constante de cadena ligera (Lc). Es una alternativa conveniente al uso de fragmentos génicos cromosómicos como fuente de ADN que codifica el segmento de unión a antígeno de región V de múrido, el uso de ADNc para la construcción de genes de inmunoglobulina quimérica, por ejemplo, como reseñan Liu et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439 (1987) y J. Immunology 139: 3521 (1987)). El uso de ADNc requiere que los elementos de expresión génica apropiados para la célula hospedadora se combinen con el gen para conseguir la síntesis de la proteína deseada. El uso de secuencias de ADNc es ventajoso frente a secuencias genómicas (que contienen intrones) porque las secuencias de ADNc pueden expresarse en bacterias u otros hospedadores que carecen de los sistemas de ayuste de ARN apropiados. Se indica un ejemplo de dicha preparación a continuación.

Debido a que el código genético está degenerado, puede utilizarse más de un codón para codificar un aminoácido particular. Utilizando el código genético, puede identificarse uno o más oligonucleótidos diferentes, cada uno de los cuales sería capaz de codificar el aminoácido. La probabilidad de que un oligonucleótido particular constituya, de hecho, la secuencia de codificación XXX real puede estimarse considerando las relaciones de apareamiento anormal de bases y la frecuencia con que se utiliza realmente un codón particular (para codificar un aminoácido particular) en células eucarióticas o procarióticas que expresan un anticuerpo anti-TNF o fragmento. Dichas "normas de uso de codón" se dan a conocer por Lathe et al., J. Mol. Biol. 183: 1-12, (1985). Utilizando las "normas de uso de códon" de Lathe, se identifica un solo oligonucleótido, o un conjunto de oligonucleótidos, que contiene la secuencia nucleotídica teórica "más probable" capaz de codificar secuencias de región variable o constante anti-TNF.

Aunque ocasionalmente una secuencia aminoacídica puede codificarse sólo por un único oligonucleótido, frecuentemente la secuencia aminoacídica puede codificarse por cualquiera de un conjunto de oligonucleótidos similares. De forma importante, mientras que todos los miembros de este conjunto contienen oligonucleótidos que son capaces de codificar el fragmento peptídico y, por tanto, contener potencialmente la misma secuencia oligonucleotídica que el gen que codifica el fragmento peptídico, sólo un miembro del conjunto contiene la secuencia nucleotídica que es idéntica a la secuencia nucleotídica del gen. Debido a que este miembro está presente en el conjunto, y es capaz de hibridar con ADN incluso en presencia de los otros miembros del conjunto, es posible emplear el conjunto no fraccionado de oligonucleótidos de la misma manera en que se emplearía un oligonucleótido único para clonar el gen que codifica la proteína.

El oligonucleótido, o conjunto de oligonucleótidos, que contiene la secuencia teórica "más probable" capaz de codificar un anticuerpo anti-TNF o fragmento que incluye una región variable o constante, se utiliza para identificar la secuencia de un oligonucleótido complementario o conjunto de oligonucleótidos que es capaz de hibridar con la secuencia "más probable", o conjunto de secuencias. Puede emplearse un oligonucleótido que contiene dicha secuencia complementaria como sonda para identificar y aislar la región variable o constante del gen anti-TNF (Sambrook et al., infra).

Se identifica (utilizando el procedimiento anteriormente descrito) un oligonucleótido adecuado, o conjunto de oligonucleótidos, que es capaz de codificar un fragmento de la región variable o constante anti-TNF (o que es complementario de dicho oligonucleótido, o conjunto de oligonucleótidos), se sintetiza y se hibrida por medios bien conocidos en la técnica frente a ADN o, más preferiblemente, una preparación de ADNc derivada de células que son capaces de expresar anticuerpos anti-TNF o regiones variables o constantes de los mismos. Las moléculas oligonucleotídicas monocatenarias complementarias de las secuencias de codificación de la región anti-TNF variable o constante "más probable" pueden sintetizarse utilizando procedimientos que son bien conocidos por los expertos en la técnica (Belagaje, et al., J. Biol. Chem. 254: 5765-5780 (1979); Maniatis et al., en: "Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expression", Nierlich, et al., eds., Acad. Press, Nueva York (1976); Wu, et al., Prog. Nucl. Acid Res. Molec. Biol. 21: 101-141 (1978); Khorana, Science 203: 614-625 (1979)). Adicionalmente, la síntesis de ADN puede conseguirse mediante el uso de sintetizadores automatizados. Se dan a conocer técnicas de hibridación de ácido nucleico por Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1989); y por Haynes, et al., en: "Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach", IRL Press, Washington, DC (1985). Técnicas tales como, o similares a, las descritas anteriormente han permitido la clonación con éxito de genes de aldehído deshidrogenasa humana (Hsu, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3771-3775 (1985)), fibronectina (Suzuki, et al., Bur. Mol. Biol. Organ. J. 4: 2519-2524 (1985)), el gen receptor de estrógeno humano (Walter, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7889-7893 (1985)), activador de plasminógeno de tipo tejido (Pennica, et al., Nature 301: 214-221 (1983)) y ADN complementario de fosfatasa alcalina de placenta humana (Keun, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8715-8719 (1985)).

En un modo de clonación alternativo de un polinucleótido que codifica una región variable o constante anti-TNF, se prepara una biblioteca de vectores de expresión clonando ADN o, más preferiblemente, ADNc (de una célula capaz de expresar un anticuerpo anti-TNF o región variable o constante) en un vector de expresión. En la biblioteca se examinan después los miembros capaces de expresar una proteína que inhiba competitivamente la unión de un anticuerpo anti-TNF, tal como A2 o cA2, y que tenga una secuencia nucleotídica que sea capaz de codificar polipéptidos que tienen la misma secuencia aminoacídica que anticuerpos anti-TNF o fragmentos de los mismos. En esta realización, se extrae el ADN, o más preferiblemente ADNc, de una célula que es capaz de expresar un anticuerpo anti-TNF o fragmento y se purifica. Se fragmenta el ADNc purificado (mediante corte, digestión con endonucleasa, etc.) para producir una agrupación de fragmentos de ADN o ADNc. Los fragmentos de ADN o ADNc de esta agrupación se clonan después en un vector de expresión para producir una biblioteca genómica de vectores de expresión, cuyos miembros contienen cada uno un fragmento de ADN o ADNc clonado único tal como en una biblioteca de fago lambda, para expresión en células procarióticas (por ejemplo bacterias) o células eucarióticas (por ejemplo células de mamífero, levadura, insecto u hongo). Véanse, por ejemplo, Ausubel, infra, Harlow, infra, Colligan, infra, Nyyssonen et al., Bio/Technology 11: 591-595 (1993); Marks et al., Bio/Technology 11: 1145-1149 (octubre de 1993). Una vez aislado el ácido nucleico que codifica dichas regiones anti-TNF variables o constantes, el ácido nucleico puede expresarse apropiadamente en una célula hospedadora, junto con otro ácido nucleico que codifica una cadena pesada o ligera constante o variable, para proporcionar anticuerpos monoclonales recombinantes que se unen a TNF con actividad inhibidora. Dichos anticuerpos incluyen preferiblemente una región variable anti-TNF de múrido o humana que contiene un residuo estructural que tiene residuos determinantes de la complementariedad que son responsables de la unión a antígeno.

Los genes humanos que codifican las regiones constantes (C) de los anticuerpos quiméricos, fragmentos y regiones de la presente invención pueden derivar de una biblioteca hepática fetal humana mediante métodos conocidos. Los genes de la región C humana pueden derivar de cualquier célula humana, incluyendo aquellas que expresan y producen inmunoglobulinas humanas. La región CH humana puede derivar de cualquiera de las clases o isotipos conocidos de las cadenas H humanas, incluyendo gamma, \mu, \alpha, \delta o \varepsilon, y subtipos de los mismos, tales como G1, G2, G3 y G4. Puesto que el isotipo de cadena H es responsable de las diversas funciones efectoras de un anticuerpo, la elección de la región CH estará guiada por las funciones efectoras deseadas, tales como fijación de complemento o actividad en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (CCDA). Preferiblemente, la región CH deriva de gamma 1 (IgG1), gamma 3 (IgG3), gamma 4 (IgG4) o \mu (IgM). La región CL humana puede derivar del isotipo de cadena L humana, kappa o lambda.

Los genes que codifican las regiones C de inmunoglobulina humana se obtienen a partir de células humanas mediante técnicas de clonación estándar (Sambrook, et al., ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989) y Ausubel et al., eds., "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley Interscience, Nueva York (1987-1993)). Los genes de la región C humana están fácilmente disponibles a partir de clones conocidos que contienen genes que representan las dos clases de cadenas L, las cinco clases de cadenas H y subclases de las mismas. Los fragmentos de anticuerpo quimérico, tales como F(ab')_{2} y Fab, pueden prepararse diseñando un gen de cadena H quimérico que está apropiadamente truncado. Por ejemplo, un gen quimérico que codifica una porción de cadena H de un fragmento F(ab')_{2}, incluiría secuencias de ADN que codifican el dominio CH1 y la región bisagra de la cadena H, seguidas por un codón de detención traduccional, proporcionando la molécula truncada.

Generalmente, los anticuerpos, fragmentos y regiones de múrido, humanos y quiméricos, se producen clonando segmentos de ADN que codifican las regiones de unión a antígeno de cadena H y L de un anticuerpo específico de TNF, y uniendo estos segmentos de ADN a segmentos de ADN que codifican regiones CH y CL, respectivamente, para producir genes que codifican inmunoglobulina de múrido, humana o quimérica. Por tanto, en una realización preferida, se crea un gen quimérico fusionado que comprende un primer segmento de ADN que codifica al menos la región de unión a antígeno de origen no humano, tal como una región V redispuesta funcionalmente con el segmento de unión (J), ligado a un segundo segmento de ADN que codifica al menos una parte de una región C
humana.

Por lo tanto, el ADNc que codifica las regiones V y C del anticuerpo y el método de producción de un anticuerpo quimérico puede implicar diversas etapas, descritas a continuación:

1.

aislamiento de ARN mensajero (ARNm) a partir de la estirpe celular productora de un anticuerpo anti-TNF y a partir de anticuerpos adicionales opcionales que suministran regiones constantes pesadas y ligeras; clonación y producción de ADNc a partir del mismo;

2.

preparación de una biblioteca de ADNc de longitud completa a partir de ARNm purificado, de la que los segmentos génicos de región V y/o C apropiados de los genes de cadena L y H pueden: (i) identificarse con sondas apropiadas; (ii) secuenciarse y (iii) compatibilizarse con un segmento génico C o V de otro anticuerpo para un anticuerpo quimérico;

3.

construcción de secuencias de codificación de cadena H o L completa mediante ligamiento de los segmentos génicos de la región V específicos clonados con el gen de la región C clonado, como se describe anteriormente;

4.

expresión y producción de las cadenas L y H en hospedadores seleccionados, incluyendo células procarióticas y eucarióticas, para proporcionar anticuerpos múrido-múrido, humano-múrido, humano-humano o humano-múrido.

Una característica común de todos los genes de cadena H y L de inmunoglobulina y sus ARNm codificados es la región J. Las regiones J de la cadena H y L tienen diferentes secuencias, pero existe un alto grado de homología de secuencia (mayor de 80%) entre cada grupo, especialmente cerca de la región C. Esta homología es explotada en este método, y pueden utilizarse secuencias consenso de las regiones J de la cadena H y L para diseñar oligonucleótidos para uso como cebadores para introducir sitios de restricción útiles en la región J para el ligamiento posterior de segmentos de la región V a segmentos de la región C humana.

Los vectores de ADNc de la región C preparados a partir de células humanas pueden modificarse mediante mutagénesis dirigida a sitio para disponer un sitio de restricción en la posición análoga en la secuencia humana. Por ejemplo, puede clonarse la región C de cadena kappa humana completa (Ck) y la región C de gamma-1 humana completa (C gamma-1). En este caso, el método alternativo basado en clones de la región C genómica como fuente de vectores de la región C no permitiría que estos genes se expresasen en sistemas bacterianos cuando las enzimas necesarias para retirar las secuencias participantes estuvieran ausentes. Los segmentos de región V clonada se escinden y se ligan con vectores de región C de cadena L o H. Como alternativa, la región C gamma-1 humana puede modificarse introduciendo un codón de terminación, generando así una secuencia génica que codifica la porción de cadena H de una molécula Fab. Las secuencias de codificación con regiones V y C ligadas se transfieren después a vehículos de expresión apropiados para expresión en hospedadores apropiados, procarióticos o eucarióticos.

Se dice que dos secuencias de ADN de codificación están "ligadas operativamente" si el ligamiento da como resultado una secuencia traducible continua sin alteración o interrupción del marco de lectura de triplete. Una secuencia de ADN de codificación está ligada operativamente a un elemento de expresión génica si el ligamiento da como resultado el funcionamiento apropiado de ese elemento de expresión génica, dando como resultado la expresión de la secuencia de codificación.

Los vehículos de expresión incluyen plásmidos u otros vectores. Se prefiere entre estos vehículos que portan una secuencia de cadena CH o CL humana funcionalmente completa, que tengan sitios de restricción apropiados introducidos por ingeniería genética de modo que cualquier secuencia de cadena VH o VL con extremos cohesivos apropiados pueda insertarse fácilmente en los mismos. Los vehículos que contienen la secuencia de cadena CH o CL humana sirven por tanto como intermedios para la expresión de cualquier cadena H o L completa deseada en cualquier hospedador apropiado.

Un anticuerpo quimérico, tal como uno de ratón-humano o humano-humano, se sintetizará típicamente a partir de genes activados por promotores génicos cromosómicos nativos de las regiones V de cadena H y L de ratón utilizadas en los constructos; el ayuste ocurre habitualmente entre el sitio donante de ayuste en la región J de ratón y el sitio aceptor de ayuste que precede a la región C humana, y también en las regiones de ayuste que aparecen en la región C humana; la poliadenilación y terminación de la transcripción aparecen en sitios cromosómicos nativos cadena abajo de las regiones de codificación humanas.

Puede recombinarse una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un fragmento de anticuerpo anti-TNF con ADN de vector según técnicas convencionales, incluyendo terminaciones de extremos romos o extremos escalonados para ligamiento, digestión con enzimas de restricción para proporcionar terminaciones apropiadas, relleno de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar uniones indeseables y ligamiento con ligasas apropiadas. Las técnicas para dichas manipulaciones se dan a conocer, por ejemplo, por Ausubel, supra, Sambrook, supra, y son bien conocidas en la técnica.

Una molécula de ácido nucleico, tal como ADN, es "capaz de expresar" un polipéptido si contiene secuencias nucleotídicas que contengan información regulatoria transcripcional y traduccional y dichas secuencias están "operativamente ligadas" a secuencias nucleotídicas que codifican el polipéptido. Un ligamiento operativo es un ligamiento en el que las secuencias de ADN regulatorias y la secuencia de ADN que se busca expresar están conectadas de tal manera que permitan la expresión génica en forma de péptidos anti-TNF o fragmentos de anticuerpo en cantidades recuperables. La naturaleza precisa de las regiones regulatorias necesarias para la expresión génica puede variar de organismo a organismo, y es bien conocida en la técnica análoga. Véanse, por ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1989); y Ausubel, eds., "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley Intersciences, Nueva York (1987, 1993).

Están disponibles muchos sistemas de vector para la expresión de genes de cadena H y L de péptido anti-TNF clonado en células de mamífero (véanse Glover, ed., "DNA Cloning", vol. II, pág. 143-238, IRL Press, Washington, DC, 1985). Pueden seguirse diferentes enfoques para obtener anticuerpos H2L2 completos. Es posible coexpresar cadenas H y L en las mismas células para conseguir la asociación y ligamiento intracelular de cadenas H y L en anticuerpos H2L2 tetraméricos completos. La coexpresión puede aparecer utilizando el mismo o diferentes plásmidos en el mismo hospedador. Los genes para ambas cadenas H y L pueden disponerse en el mismo plásmido, que se transfecta después en células, seleccionado directamente así las células que expresan ambas cadenas. Como alternativa, las células pueden transfectarse primero con un plásmido que codifica una cadena, por ejemplo la cadena L, seguido de transfección de la estirpe celular resultante con un plásmido de cadena H que contiene un segundo marcador detectable. Las estirpes celulares productoras de moléculas H2L2 mediante cualquier ruta podrían transfectarse con plásmidos que codifican copias adicionales de péptidos, cadenas H, L o H más L junto con marcadores detectables adicionales para generar estirpes celulares con propiedades potenciadas, tales como mayor producción de moléculas de anticuerpos H2L2 ensamblados o estabilidad potenciada de las estirpes celulares
transfectadas.

Moléculas receptoras

Las moléculas receptoras (también designadas en la presente memoria como receptores solubles de TNF) útiles en los métodos y composiciones de la presente invención son aquellas que se unen a TNF con alta afinidad (véase, por ejemplo, Feldmann et al., publicación internacional nº WO 92/07076 (publicada el 30 de abril de 1992), y poseen una baja inmunogenicidad. En particular, los receptores de TNF de superficie celular de 55 kDa (TNF-R p55) y de 75 kDa (TNF-R p75) son útiles en la presente invención. Las formas truncadas de estos receptores, que comprenden los dominios extracelulares (DEC) de los receptores o porciones funcionales de los mismos, son también útiles en la presente invención. Se han detectado formas truncadas de los receptores de TNF que comprenden los DEC en orina y suero en forma de proteínas de unión inhibidoras de 30 kDa y 40 kDa (Engelmann, H. et al., J. Biol. Chem. 265: 1531-1536 (1990)). Las moléculas multiméricas receptoras de TNF y moléculas de fusión inmunoreceptoras de TNF, y derivados y fragmentos o porciones de las mismas, son ejemplos adicionales de moléculas receptoras que son útiles en los métodos y composiciones de la presente invención. Las moléculas receptoras que pueden utilizarse en la invención se caracterizan por su capacidad de tratar pacientes durante periodos extensos con un buen a excelente alivio de síntomas y baja toxicidad. La baja inmunogenicidad y/o alta afinidad, así como otras propiedades no definidas, pueden contribuir a los resultados terapéuticos conseguidos.

Las moléculas multiméricas receptoras de TNF útiles en la presente invención comprenden todo o una porción funcional del DEC de dos o más receptores de TNF ligados mediante uno o más engarces polipeptídicos. Las moléculas multiméricas pueden comprender adicionalmente un péptido señal de una proteína secretada para dirigir la expresión de la molécula multimérica. Se han descrito estas moléculas multiméricas y métodos para su producción en la solicitud de EE.UU. nº 08/437.533 (presentada el 9 de mayo de 1995).

Las moléculas de fusión inmunoreceptoras útiles en los métodos y composiciones de la presente invención comprenden al menos una porción de una o más moléculas de inmunoglobulina o una porción funcional de uno o más receptores de TNF. Estas moléculas de fusión inmunoreceptoras pueden ensamblarse como monómeros o hetero- u homomultímeros. Las moléculas de fusión inmunoreceptoras pueden ser también monovalentes o multivalentes. Es un ejemplo de dicha molécula de fusión inmunoreceptora la proteína de fusión receptor de TNF/IgG.

Se han descrito en la técnica moléculas de fusión inmunoreceptoras de TNF y métodos para su producción (Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 21: 2883-2886 (1991); Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539 (1991); Peppel et al., J. Exp. Med. 174: 1483-1489 (1991); Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 215-219 (1994); Butler et al., Cytokine 6(6): 616-623 (1994); Baker et al., Eur. J. Immunol. 24: 2040-2048 (1994); Beutler et al., patente de EE.UU. nº 5.447.851 y la solicitud de patente de EE.UU. nº 08/442.133 (presentada el 16 de mayo de 1995)). Pueden encontrarse también métodos para producir moléculas de fusión inmunoreceptoras en Capon et al., patente de EE.UU. nº 5.116.964, Capon et al., patente de EE.UU. nº 5.225.538 y Capon et al., Nature 337: 525-531 (1989).

Los derivados, fragmentos, regiones y porciones funcionales de las moléculas receptoras se asemejan funcionalmente a las moléculas receptoras que pueden utilizarse en la presente invención (concretamente, se unen a TNF con alta afinidad y poseen baja inmunogenicidad). Un equivalente funcional o derivado de la molécula receptora designa la porción de la molécula receptora, o la porción de secuencia de molécula receptora que codifica la molécula receptora, que es de suficiente tamaño y secuencia para asemejarse funcionalmente a las moléculas receptoras que pueden utilizarse en la presente invención (concretamente, se une a TNF con alta afinidad y posee baja inmunogenicidad). Un equivalente funcional de la molécula receptora incluye también moléculas receptoras modificadas que se asemejan funcionalmente a las moléculas receptoras que pueden utilizarse en la presente invención (concretamente, se unen a TNF con alta afinidad y poseen baja inmunogenicidad). Por ejemplo, un equivalente funcional de la molécula receptora puede contener un codón "silencioso" o una o más sustituciones, deleciones o adiciones aminoacídicas (por ejemplo, sustitución de un aminoácido ácido por otro aminoácido ácido; o sustitución por un codón que codifica el mismo o diferente aminoácido hidrofóbico de otro codón que codifica un aminoácido hidrofóbico). Véase Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Assoc. y Wiley-Interscience, Nueva York (1989).

Metotrexato

Las formulaciones orales e intravenosas disponibles actualmente de metotrexato incluyen el paquete de dosis de metotrexato Rheumatrex® (Lederle Laboratories, Wayne, NJ); comprimidos de metotrexato (Mylan Pharmaceuticals Inc., Morgantown, WV; Roxane Laboratories, Inc., Columbus, OH); y comprimidos de metotrexato de sodio para inyección (Immunex Corporation, Seattle, WA) y metotrexato de sodio LPF® (metotrexato de sodio de inyección) (Immunex Corporation, Seattle, WA). El metotrexato está también disponible en Pharmacochemie (Holanda). Pueden utilizarse también profármacos, homólogos y/o análogos de metotrexato (por ejemplo, antagonistas de folato) en los métodos y composiciones de la presente invención. Como alternativa, pueden utilizarse otros agentes inmunosupresores (o fármacos que suprimen el sistema inmune) en los métodos y composiciones de la presente invención.

Administración

Los antagonistas de TNF, metotrexato y las composiciones de la presente invención pueden administrarse a un individuo en una variedad de modos. Las vías de administración incluyen las vías intradérmica, transdérmica (por ejemplo en polímeros de liberación lenta), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, oral, tópica, epidural, bucal, rectal, vaginal e intranasal. Puede utilizarse cualquier otra vía de administración terapéuticamente eficaz, por ejemplo, infusión o inyección intravenosa rápida, absorción a través de recubrimientos epiteliales o mucocutáneos o mediante terapia génica, en la que se administra una molécula de ADN que codifica la proteína o péptido terapéutico al paciente, por ejemplo, mediante un vector que causa que la proteína o péptido se exprese y secrete a niveles terapéuticos in vivo. Además, los antagonistas de TNF, metotrexato y composiciones de la presente invención pueden administrarse junto con otros componentes de agentes biológicamente activos, tales como tensioactivos farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, glicéridos), excipientes (por ejemplo, lactosa), portadores, diluyentes y vehículos. Si se desea, pueden añadirse también ciertos agentes edulcorantes, aromatizantes y/o colorantes.

Los antagonistas de TNF y metotrexato pueden administrarse profiláctica o terapéuticamente a un individuo. Los antagonistas de TNF pueden administrarse antes de o simultáneamente con (en la misma o diferentes composiciones) o secuencialmente con la administración de metotrexato. Por ejemplo, los antagonistas de TNF pueden administrarse como terapia coadyuvante de y/o concomitante con la terapia de metotrexato.

Para administración parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular), los antagonistas de TNF, metotrexato y las composiciones de la presente invención pueden formularse en forma de una solución, suspensión, emulsión o polvo liofilizado en asociación con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable. Son ejemplos de dichos vehículos agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y albúmina sérica humana al 5%. Pueden utilizarse también liposomas y vehículos no acuosos tales como aceites no volátiles. El vehículo o polvo liofilizado puede contener aditivos que mantienen la isotonicidad (por ejemplo, cloruro de sodio, manitol) y la estabilidad química (por ejemplo tampones y conservantes). La formulación se esteriliza mediante técnicas utilizadas habitualmente.

Los vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences", A. Osol, un texto de referencia estándar en este campo de la técnica.

Por ejemplo, se prepara una composición parenteral adecuada para administración mediante inyección disolviendo 1,5% en peso de ingrediente activo en una solución de 0,9% de cloruro de sodio.

Los antagonistas de TNF y metotrexato se administran en cantidades terapéuticamente eficaces; las composiciones de la presente invención se administran en una cantidad terapéuticamente eficaz. Como se utiliza en la presente memoria, una "cantidad terapéuticamente eficaz" es aquella en la que la administración de antagonista de TNF y metotrexato, o la administración de una composición de la presente invención, da como resultado la inhibición de la actividad biológica del TNF respecto a la actividad biológica del TNF cuando no se administran cantidades terapéuticamente eficaces de antagonista y metotrexato, o respecto a la actividad biológica del TNF cuando no se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición. Una cantidad terapéuticamente eficaz es preferiblemente la cantidad de antagonista de TNF y metotrexato necesaria para reducir significativamente o eliminar los signos y síntomas asociados a una enfermedad mediada por TNF particular. Como se utiliza en la presente memoria, una cantidad terapéuticamente eficaz no es necesariamente una cantidad tal que la administración del antagonista de TNF solo, o la adminis-
tración del metotrexato solo, deba dar necesariamente como resultado la inhibición de la actividad biológica del TNF.

Una vez se ha administrado una cantidad terapéuticamente eficaz, puede administrarse al individuo una cantidad de mantenimiento de antagonista de TNF solo, o metotrexato solo, o de una combinación de antagonista de TNF y metotrexato. Una cantidad de mantenimiento es la cantidad de antagonista de TNF, metotrexato o combinación de antagonista de TNF y metotrexato necesaria para mantener la reducción o eliminación de los signos y síntomas asociados a una enfermedad mediada por TNF particular conseguida por la dosis terapéuticamente eficaz. La cantidad de mantenimiento puede administrarse en forma de una dosis única, o una serie de dosis separadas por intervalos de días o semanas.

La dosificación administrada a un individuo variará dependiendo de una variedad de factores, incluyendo las características farmacodinámicas de los antagonistas particulares y su modo y vía de administración; el tamaño, edad, sexo, salud, peso corporal y dieta del receptor, la naturaleza y extensión de los síntomas de la enfermedad que se está tratando, el tipo de tratamiento concurrente, la frecuencia de tratamiento y el efecto deseado. Los métodos in vitro e in vivo de determinación de la inhibición del TNF en un individuo son bien conocidos por los expertos en la técnica. Dichos ensayos in vitro pueden incluir un ensayo de citotoxicidad de TNF (por ejemplo, el ensayo WEHI o un radioinmunoensayo ELISA). Los métodos in vivo pueden incluir ensayos de letalidad en roedores y/o sistemas de modelo patológico en primates (Mathison et al., J. Clin. Invest., 81: 1925-1937 (1988); Beutler et al., Science 229: 869-871 (1985); Tracey et al., Nature 330: 662-664 (1987); Shimamoto et al., Immunol. Lett 17: 311-318 (1988); Silva et al., J. Infect. Dis. 162: 421-427 (1990); Opal et al., J. Infect. Dis. 161: 1148-1152 (1990); Hinshaw et al., Circ. Shock 30: 279-292 (1990)).

El antagonista de TNF y el metotrexato pueden administrarse cada uno en dosis únicas o múltiples dependiendo de factores tales como la naturaleza y extensión de los síntomas, el tipo de tratamiento concurrente y el efecto deseado. Por tanto, pueden utilizarse otros regímenes o agentes terapéuticos (por ejemplo, regímenes de fármacos múltiples) en combinación con la coadministración terapéutica de antagonistas de TNF y metotrexato. En una realización particular, se administra un antagonista de TNF en dosis múltiples. En otra realización, se administra el metotrexato en forma de una serie de dosis bajas separadas por intervalos de días o semanas. El ajuste y manipulación de los intervalos de dosificación establecidos está bien dentro de la capacidad de los expertos en la técnica.

Habitualmente, una dosificación diaria de ingrediente activo puede ser de aproximadamente 0,01 a 100 mg por kg de peso corporal. Ordinariamente, 1 a 40 mg por kg al día administrados en dosis divididas 1 a 6 veces al día o en forma de liberación sostenida son eficaces para obtener los resultados deseados. Las segundas o posteriores administraciones pueden administrarse a una dosificación que es la misma, menor o mayor que la dosis inicial o previa administrada al individuo.

La segunda o posterior administración es preferiblemente durante o inmediatamente antes de la recaída o exacerbación de la enfermedad o síntomas de la enfermedad. Por ejemplo, la segunda y posteriores administraciones puede administrarse entre aproximadamente un día a 30 semanas desde la administración previa. Pueden suministrarse 2, 3, 4 ó más administraciones totales al individuo, según sea necesario.

Las formas de dosificación (composición) adecuadas para administración interna contienen generalmente de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 500 mg de ingrediente activo por unidad. En estas composiciones farmacéuticas, el ingrediente activo estará ordinariamente presente en una cantidad de aproximadamente 0,5-95% en peso basado en el peso total de la composición.

La presente invención se ilustrará ahora mediante el siguiente ejemplo, que no se pretende que sea limitante en modo alguno.

Ejemplos Ejemplo 1 Tratamiento clínico de artritis reumatoide mediante infusiones múltiples de un anticuerpo anti-TNF con y sin metotrexato

Se realizó un estudio aleatorizado de doble ciego controlado por placebo para evaluar la seguridad y eficacia de un anticuerpo monoclonal quimérico anti-TNF (cA2) después de múltiples infusiones de 1, 3 ó 10 mg/kg de cA2, solo o en combinación con metotrexato, comparado con múltiples infusiones de placebo en combinación con metotrexato en el tratamiento de artritis reumatoide (AR) en pacientes.

Pacientes

Se inscribieron en el estudio ciento un (101) pacientes de seis centros europeos que habían estado utilizando metotrexato durante al menos 6 meses, habían estado a una dosis estable de 7,5 mg/sem durante al menos 4 semanas, y tenían enfermedad activa (según los criterios del Colegio Americano de Reumatología) con cambios erosivos según rayos X en manos y pies. La enfermedad activa se definió mediante la presencia de seis o más articulaciones inflamadas más al menos tres de cuatro criterios secundarios (duración de la rigidez matutina \geq 45 minutos; \geq 6 articulaciones sensibles o dolorosas; velocidad de sedimentación de eritrocitos (VSE) \geq 28 mm/hora; proteína C reactiva (PCR) \geq 20 mg/l.

En pacientes que utilizan corticosteroides (\leq 7,5 mg/día) o fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), las dosis habían sido estables durante 4 semanas antes del examen. La dosis de corticosteroides permaneció estable durante la participación en el ensayo. La dosis de AINE permaneció típicamente estable también durante la participación en el ensayo.

Infusiones de estudio

Se suministró el anticuerpo monoclonal quimérico anti-TNF (cA2) en forma de una solución estéril que contenía 5 mg de cA2 por ml de solución salina tamponada con fosfato 0,01 M en cloruro de sodio 0,15 M con 0,01% de polisorbato 80, pH 7,2. Los viales de placebo contenían albúmina sérica humana al 0,1% en el mismo tampón. Antes del uso, se diluyó la cantidad apropiada de cA2 o placebo en 300 ml de solución salina estéril por el farmacéutico, y se administró por vía intravenosa mediante un filtro en línea de 0,2 \mum durante 2 horas. Las características de las bolsas de infusión de placebo y cA2 eran idénticas, y los investigadores y pacientes no sabían cuál infusión se estaba administrando.

Valoraciones

Se distribuyeron aleatoriamente los pacientes en uno de siete grupos de tratamiento. El número de pacientes en cada grupo de dosis (o tratamiento) se indica en la Tabla 1. Cada uno de los 101 pacientes recibió múltiples infusiones de 0, 1, 3 ó 10 mg/kg de cA2. Las infusiones habían de administrarse en las semanas 0, 2, 6, 10 y 14. Al inicio de la semana 0, los pacientes estaban recibiendo 7,5 mg/sem de metotrexato (Pharmacochemie, Holanda) o 3 comprimidos de placebo/semana (Pharmacochemie, Holanda). Se monitorizaron los efectos adversos en los pacientes durante las infusiones y regularmente después de ellas mediante entrevista, examen físico y ensayos de laboratorio.

Se eligieron las seis valoraciones primarias de enfermedad-actividad para permitir el análisis de la respuesta en pacientes individuales según el índice de Paulus (Paulus et al., Arthritis Rheumatism 33: 477-484 (1990). Las valoraciones contribuyentes a este índice fueron las puntuaciones de articulaciones sensibles y articulaciones inflamadas (60 y 58 articulaciones, respectivamente, caderas no evaluadas para inflamación, graduadas 0-3), la duración de la rigidez matutina (minutos), la valoración de paciente y médico de la gravedad de la enfermedad (en una escala de 5 puntos, en el intervalo desde 1 (sin síntomas) a 5 (muy grave)), y la velocidad de sedimentación de eritrocitos (VSE). Se consideró que los pacientes habían respondido si al menos cuatro de las seis variables mejoraban, definido como una mejora de al menos un 20% en las variables continuas y al menos dos grados de mejora o mejora del grado 2 a 1 en las dos valoraciones de gravedad de la enfermedad (respuestas de Paulus del 20%). Se utilizaron también mejoras de al menos un 50% en las variables continuas (respuestas de Paulus del 50%).

Otras valoraciones de enfermedad-actividad incluyeron la puntuación de dolor (0-10 cm en una escala análoga visual (EAV)), una valoración de fatiga (0-10 cm EAV) y de fuerza de agarre (0-40 kPa, media de tres medidas por mano mediante un esfigmomanómetro de manguito).

Se midió la VSE en cada sitio de estudio con un método estándar (Westergen). Se midió la proteína C reactiva (PCR) mediante nefelometría cinética (inmunoensayo polarizante fluorescente de Abbott). Véanse también Elliott et al., Lancet 344: 1105-1110 (1994); Elliott et al., Lancet 34: 1125-1127 (1994) y Elliott et al., Arthritis Rheum. 36(12): 1681-1690 (1993).

Las evaluaciones se realizaron en las semanas 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 23 y 26.

Resultados

Se distribuyeron aleatoriamente los 101 pacientes en uno de siete grupos de tratamiento (o dosis). Los pacientes inscritos en cada grupo de tratamiento se equilibraron bien para una demografía de línea base. La duración de la enfermedad y los recuentos de articulaciones inflamadas y sensibles en la línea base se equilibraron bien también entre los grupos (Tabla 1). La Tabla 1 muestra la dosis máxima de metotrexato administrada 6 meses antes de la distribución aleatoria. Las dosis máximas medianas para cada grupo estaban en el intervalo entre 10 y 15 mg/semana; no hubo diferencias significativas entre los grupos de tratamiento (p= 0,404).

TABLA 1 Recuentos de articulaciones característicos de la enfermedad en línea base

	Grupos de tratamiento
	Placebo	1 mg/kg de cA2
	MTX+	MTX+	MTX-
Duración de la enfermedad (años)
Pacientes evaluados	14	14	15
Media \pm DE	7,6\pm4,0	14,3\pm12,1	7,6\pm6,0
Mediana	6,9	11,4	5,2
Intervalo IQ	(4,3, 11,5)	(3,3, 24,7)	(3,4, 9,0)
Intervalo	(1,8, 14,2)	(0,7, 37,3)	(2,5, 21,3)
\begin{minipage}[t]{48mm}Número de articulaciones inflamadas, conjunto de articulaciones Paulus (0-58)\end{minipage}
Pacientes evaluados	14	14	15
Media \pm DE	18,1\pm8,6	16,9\pm7,8	21,2\pm11,2
Mediana	16,5	15,5	20,0
Intervalo IQ	(12,0, 25,0)	(10,0, 25,0)	(10,0, 33,0)
Intervalo	(6,0, 38,0)	(6,0, 29,0)	(7,0, 40,0)
\begin{minipage}[t]{48mm}Número de articulaciones sensibles, conjunto de articulaciones Paulus (0-60)\end{minipage}
Pacientes evaluados	14	14	15
Media \pm DE	31,5\pm14,2	19,1\pm10,7	29,9\pm17,1
Mediana	27,0	16,0	30,0
Intervalo IQ	(22,0, 44,0)	(13,0, 30,0)	(14,0, 45,0)
Intervalo	(8,0, 52,0)	(2,0, 39,0)	(6,0, 58,0)
\begin{minipage}[t]{48mm}Dosis máxima de DTX los 6 meses previos (mg/kg)\end{minipage}
Pacientes evaluados	14	14	15
Media \pm DE	13,8\pm3,9	11,6\pm3,5	12,8\pm5,6
Mediana	15,0	11,3	12,5
Intervalo IQ	(10,0, 15,0)	(10,0, 12,5)	(10,0, 15,0)
Intervalo	(7,5, 20,0)	(7,5, 20,0)	(7,5, 30,0)
MTX= metotrexato.

TABLA 1 (continuación)

	Grupos de tratamiento
	3 mg/kg de cA2
	MTX+	MTX-
Duración de la enfermedad (años)
Pacientes evaluados	15	14
Media \pm DE	12,1 \pm 9,0	7,8 \pm 4,3
Mediana	11,9	7,7
Intervalo IQ	(4,3, 16,4)	(4,6, 9,8)
Intervalo	(0,7, 30,5)	(1,4, 17,4)
\begin{minipage}[t]{58mm}Número de articulaciones inflamadas, conjunto de articulaciones Paulus (0-58)\end{minipage}
Pacientes evaluados	15	14
Media \pm DE	17,7 \pm 5,9	19,7 \pm 9,9
Mediana	16,0	17,0
Intervalo IQ	(13,0, 22,0)	(11,0, 32,0)
Intervalo	(10,0, 29,0)	(8,0, 34,0)
\begin{minipage}[t]{58mm}Número de articulaciones sensibles, conjunto de articulaciones Paulus (0-60)\end{minipage}
Pacientes evaluados	15	14
Media \pm DE	24,5 \pm 14,4	31,2 \pm 11,7
Mediana	21,0	31,0
Intervalo IQ	(12,0, 32,0)	(23,0, 39,0)
Intervalo	(10,0, 52,0)	(9,0, 52,0)
\begin{minipage}[t]{58mm}Dosis máxima de DTX los 6 meses previos (mg/kg)\end{minipage}
Pacientes evaluados	14	13
Media \pm DE	11,6 \pm 3,3	11,7 \pm 4,8
Mediana	10,0	10,0
Intervalo IQ	(10,0, 15,0)	(7,5, 12,5)
Intervalo	(7,5, 17,5)	(7,5, 25,0)
MTX= metotrexato

TABLA 1 (continuación)

	Grupos de tratamiento
	10 mg/kg de cA2	Todos los	Valor de p del efecto
		pacientes	del tratamiento
	MTX+	MTX-
\begin{minipage}[t]{38mm}Duración de la enfermedad (años)\end{minipage}
\begin{minipage}[t]{38mm}Pacientes evaluados\end{minipage}	14	15	101	0,634
Media \pm DE	11,1 \pm 7,4	9,7 \pm 7,4	10,0 \pm 7,8
Mediana	10,7	7,6	7,6
Intervalo IQ	(4,5, 15,5)	(4,9, 14,9)	(4,3, 14,4)
Intervalo	(1,4, 24,1)	(1,1, 24,3)	(0,7, 37,3)
\begin{minipage}[t]{38mm}Número de articulaciones inflamadas, conjunto de articulaciones Paulus (0-58)\end{minipage}
\begin{minipage}[t]{38mm}Pacientes evaluados\end{minipage}	14	15	101	0,643
Media \pm DE	21,1 \pm 8,2	17,8 \pm 8,7	18,9 \pm 8,7
Mediana	19,5	17,0	18,0
Intervalo IQ	(15,0, 31,0)	(11,0, 21,0)	(12,0, 25,0)
Intervalo	(10,0, 34,0)	(7,0, 41,0)	(6,0, 41,0)
\begin{minipage}[t]{38mm}Número de articulaciones sensibles, conjunto de articulaciones Paulus (0-60)\end{minipage}
\begin{minipage}[t]{38mm}Pacientes evaluados\end{minipage}	14	15	101	0,135
Media \pm DE	26,5 \pm 12,0	26,2 \pm 11,7	27,0 \pm 13,5
Mediana	25,5	23,0	25,0
Intervalo IQ	(21,0, 38,0)	(17,0, 35,0)	(15,0, 38,0)
Intervalo	(8,0, 44,0)	(11,0, 48,0)	(2,0, 58,0)
\begin{minipage}[t]{38mm}Dosis máxima de DTX los 6 meses previos (mg/kg)\end{minipage}
\begin{minipage}[t]{38mm}Pacientes evaluados\end{minipage}	14	15	99	0,404
Media \pm DE	12,7 \pm 5,0	12,5 \pm 3,0	12,4 \pm 4,2
Mediana	10,0	12,5	12,5
Intervalo IQ	(10,0, 15,0)	(10,0, 15,0)	(10,0, 15,0)
Intervalo	(7,5, 25,0)	(7,5, 20,0)	(7,5, 30,0)
MTX= metotrexato

El análisis primario preespecificado en este ensayo fue la comparación del tiempo total de respuesta clínica durante el periodo de seguimiento de 26 semanas. Los resultados del análisis primario se muestran en la Tabla 2. La duración de la respuesta de todos los grupos tratados con cA2, con la excepción del grupo de 1 mg/kg que no recibe metotrexato, mejoró significativamente (p < 0,001) comparada con el grupo placebo que recibía metotrexato solo.

1

\newpage

Las tasas de respuesta a Paulus del 20% se muestran en la Tabla 3. Los retirados se consideraron como sin respuesta posteriormente a su retirada del estudio. Con la excepción del grupo de 1 mg/kg que no recibe metotrexato, todos los grupos tratados con cA2 demostraron beneficio clínico durante 14 semanas cuando recibieron la última dosis de cA2. Se observó un beneficio clínico sostenido durante 26 semanas (la última visita de seguimiento) en pacientes que recibieron 3 ó 10 mg/kg de cA2 con metotrexato. Aproximadamente la mitad de los pacientes que recibieron 3 mg/kg de cA2 con metotrexato demostraron un beneficio clínico continuado a las 26 semanas.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3 Número de pacientes que responden según el criterio de Paulus del 20% en cada visita de evaluación

Grupos de tratamiento
Pacientes con cualquier respuesta	Placebo	1 mg/kg de cA2
	MTX+	MTX+	MTX-
	(n= 14)	(n= 14)	(n= 15)
	21%	93%	80%
	(3/14)	13/14	12/15
Valor de p frente a MTX solo		<0,001	0,006
Tiempo después de la infusión
1 semana	0%	31%	53%
	(0/14)	(4/13)	(8/15)
2 semanas	7%	64%	57%
	(1/14)	(9/14)	(8/14)
4 semanas*	0%	79%	33%
	(0/14)	11/14	(5/15)
6 semanas	0%	71%	27%
	(0/14)	10/14	(4/15)
8 semanas*	14%	64%	20%
	(2/14)	(9/14)	(3/15)
10 semanas	7%	71%	20%
	(1/14)	10/14	(3/15)
12 semanas*	7%	57%	13%
	(1/14)	(8/14)	(2/15)
14 semanas	0%	71%	7%
	(0/14)	10/14	(1/15)
16 semanas*	14%	64%	7%
	(2/14)	(9/14)	(1/15)
18 semanas	21%	50%	13%
	(3/14)	(7/14)	(2/15)
20 semanas	7%	54%	13%
	(1/14)	(7/13)	(2/15)
22 semanas	7%	46%	0%
	(1/14)	(6/13)	(0/15)
26 semanas*	7%	21%	7%
	(1/14)	(3/14)	(1/15)
*Visitas de evaluación preespecificadas para análisis.

TABLA 3 (continuación)

Grupos de tratamiento
	3 mg/kg de cA2	10 mg/kg de cA2
	MTX+	MTX-	MTX+	MTX-	Valor de p del efecto
	n= 15	n= 14	n= 13	n= 15	del tratamiento
Pacientes con cual-	80%	79%	85%	80%	<0,001
quier respuesta	12/15	11/14	11/13	12/15
Valor de p frente a	0,002	0,002	0,001	0,004
MTX solo
Tiempo después de infusión
1 semana	27%	43%	31%	60%
	(4/15)	(6/14)	(4/13)	(9/15)
2 semanas	27%	43%	62%	53%
	(4/15)	(6/14)	(8/13)	(8/15)
4 semanas*	40%	64%	54%	53%	0,002
	(6/15)	(9/14)	(7/13)	(8/15)
6 semanas	47%	50%	54%	47%
	(7/15)	(7/14)	(7/13)	(7/15)
8 semanas*	60%	71%	69%	40%	0,003
	(9/15)	10/14	(9/13)	(6/15)
10 semanas	67%	64%	69%	53%
	10/15	(9/14)	(9/13)	(8/15)
12 semanas*	67%	64%	62%	60%	<0,001
	(10/15)	(9/14)	(8/13)	(8/13)
14 semanas	60%	57%	77%	53%
	(9/15)	(8/14)	10/13	(8/15)
16 semanas*	67%	64%	54%	67%	<0,001
	10/15	(9/14)	(7/13)	10/15
18 semanas	71%	69%	62%	57%
	10/14	(9/13)	(8/13)	(8/14)
20 semanas	53%	43%	54%	53%
	(8/15)	(6/14)	(7/13)	(8/15)
22 semanas	47%	36%	54%	33%
	(7/15)	(5/14)	(7/13)	(5/15)
26 semanas*	47%	21%	54%	33%	0,013
	(7/15)	(3/14)	(7/13)	(5/15)
*Visitas de evaluación preespecificadas para análisis.

Se muestran las tasas de respuesta a Paulus del 50% en la Tabla 4. La magnitud del beneficio clínico del tratamiento con cA2 fue sustancial. La mayoría de los pacientes respondieron al tratamiento con cA2 según el criterio de Paulus del 50%.

TABLA 4 Número de pacientes que responden según el criterio de Paulus del 50% en cada visita de evaluación

	Grupos de tratamiento
	Placebo	1 mg/kg de cA2
	MTX+	MTX+	MTX-
	(n =14)	(n= 14)	(n= 15)
Pacientes con cualquier	14,3%	85,7%	40,0%
respuesta	(2/14)	(12/14)	(6/15)
Valor de p frente a MTX solo		<0,001	0,079
Tiempo después de infusión
1 semana	0,0%	7,7%	26,7%
	(0/14)	(1/13)	(4/15)
2 semanas	0,0%	21,4%	28,6%
	(0/14)	(3/14)	(4/14)
4 semanas*	0,0%	57,1%	13,3%
	(0/14)	(8/14)	(2/15)
6 semanas	0,0%	57,1%	0,0%
	(0/14)	(8/14)	(0/15)
8 semanas*	7,1%	50,0%	0,0%
	(1/14)	(7/14)	(0,15)
10 semanas	0,0%	57,1%	0,0%
	(0/14)	(8/14)	(0/15)
12 semanas*	7,1%	50,0%	6,7%
	(1/14)	(7/14)	(1/15)
14 semanas	0,0%	57,1%	6,7%
	(0/14)	(8/14)	(1/15)
16 semanas*	0,0%	64,3%	6,7%
	(0/14)	(9/14)	(1/15)
18 semanas	7,1%	50,0%	6,7%
	(1/14)	(7/14)	(1/15)
20 semanas	7,1%	53,8%	0,0%
	(1/14)	(7/13)	(0/15)
22 semanas	0,0%	38,5%	0,0%
	(0/14)	(5/13)	(0/15)
26 semanas*	0,0%	21,4%	6,7%
	(0/14)	(3/14)	(1/15)
*Visitas de evaluación preespecificadas para análisis.

TABLA 4 (continuación)

Grupos de tratamiento
	3 mg/kg de cA2	10 mg/kg de cA2
	MTX +	MTX-	MTX+	MTX-	Valor de p del efecto
	(n= 15)	(n= 14)	(n= 13)	(n= 15)	del tratamiento
Pacientes con cual-	73,3%	64,3%	76,9%	66,7%	<0,001
quier respuesta	(11/15)	(9/14)	(10/13)	(10/15)
Valor de p frente	0,001	0,008	0,002	0,009
MTX solo
Tiempo después de infusión
1 semana	0,0%	35,7%	7,7%	26,7%
	(0/15)	(5/14)	(1/13)	(4/15)
2 semanas	6,7%	28,6%	15,4%	20,0%
	(1/15)	(4/14)	(2/13)	(3/15)
4 semanas*	13,3%	28,6%	46,2%	40,0%	0,006
	(2/15)	(4/14)	(6/13)	(6/15)
6 semanas	26,7%	42,9%	38,5%	33,3%
	(4/15)	(6/14)	(5/13)	(5/15)
8 semanas*	40,0%	50,0%	69,2%	33,3%	<0,001
	(6/15)	(7/14)	(9/13)	(5/15)
10 semanas	40,0%	50,0%	69,2%	40,0%
	(6/15)	(7/14)	(9/13)	(6/15)
12 semanas*	60,0%	35,7%	61,5%	40,0%	<0,001
	(9/15)	(5/14)	(8/13)	(6/15)
14 semanas	40,0%	35,7%	61,5%	40,0%
	(6/15)	(5/14)	(8/13)	(6/15)
16 semanas*	60,0%	50,0%	53,8%	40,0%	<0,001
	(9/15)	(7/14)	(7/13)	(6/15)
18 semanas	71,4%	46,2%	61,5%	57,1%
	(10/14)	(6/13)	(8/13)	(8/14)
20 semanas	53,3%	35,7%	46,2%	40,0%
	(8/15)	(5/14)	(6/13)	(6/15)
22 semanas	46,7%	14,3%	53,8%	26,7%
	(7/15)	(2/14)	(7/13)	(4/15)
26 semanas*	40,0%	14,3%	46,2%	20,0%	0,008
	(6/15)	(2/14)	(6/13)	(3/15)
*Visitas de evaluación preespecificadas para análisis.

Proporcionalmente a las tasas de respuesta clínica mostradas en las Tablas 2-4, la mayoría de los pacientes en los grupos de tratamiento que demuestran la eficacia del tratamiento con cA2 recibieron todos 5 infusiones de cA2 (Tabla 5). La razón principal para que los pacientes no recibieran el régimen de dosis completo fue debido a la falta de eficacia en el grupo placebo (metotrexato solo) y en el grupo de 1 mg/kg que no recibía metotrexato. Los 15 pacientes del grupo de 3 mg/kg que recibieron metotrexato completaron el régimen de dosis de 5 infusiones.

TABLA 5 Número de infusiones completadas

Grupos de tratamiento
	Placebo	1 mg/kg de cA2	3 mg/kg de cA2	10 mg/kg de cA2
	MTX+	MTX+	MTX-	MTX+	MTX-	MTX+	MTX-	Valor de p del efecto
	n= 14	n= 14	n= 15	n= 15	n= 14	n= 14	n= 15	del trat.
Pacientes con infusiones completas*
5	6	12	8	15	12	12	12	0,003
infusiones	42,86%	85,71%	53,33%	100,0%	85,71%	85,71%	80,00%
4	0	1	0	0	1	1	0
infusiones	0,00%	7,14%	0,00%	0,00%	7,14%	7,14%	0,00%
3	2	1	6	0	0	1	1
infusiones	14,29%	7,14%	40,00%	0,00%	0,00%	7,14%	6,67%
2	5	0	1	0	1	0	2
infusiones	35,71%	0,00%	6,67%	0,00%	7,14%	0,00%	13,33%
1	1	0	0	0	0	0	0
infusión	7,14%	0,00%	0,00%	0,00%	0,00%	0,00%	0,00%
* \begin{minipage}[t]{150mm} Los pacientes se cuentan sólo una vez para el primer grupo para el que se califican (5 infusiones > 4 infusiones, etc...). Los pacientes se contaron sólo si habían completado la infusión entera.\end{minipage}

Los resultados de las medidas de recuentos de articulaciones inflamadas y sensibles y las valoraciones globales por médico y paciente se muestran en las Figuras 1-4. Se reseñaron los resultados medianos en la Figuras 1-4 para cada visita de evaluación basada sólo en los pacientes con los datos recogidos. Es decir, no se utilizó el enfoque avanzado a la última observación realizada para pacientes que se retiraron. En lugar de ello, el número de pacientes con datos que comprende cada punto de la gráfica se reseñó en la parte inferior de las figuras.

A pesar del número de retiradas en el grupo de placebo y el grupo de 1 mg/kg que no recibe metotrexato, los resultados en las Figuras 1-4 demuestran que el tratamiento con cA2 en combinación con metotrexato reduce profundamente la actividad patológica para todas las medidas tradicionales de actividad patológica, aproximándose a la remisión completa en muchos pacientes.

Los resultados para un marcador sérico de actividad inflamatoria utilizado habitualmente, proteína C reactiva (PCR) se muestran en la Figura 5. El tratamiento con cA2 produjo una rápida reducción de la concentración de PCR, que se mantuvo durante 26 semanas en los pacientes que recibieron 3 ó 10 mg/kg de cA2.

Los resultados del cuestionario de evaluación de la salud (CES) se muestran en la Figura 6. Esta medida de la calidad de vida/incapacidad demostró la mejora frente al tiempo correspondiente con la mejora clínica observada en pacientes tratados con cA2. En los pacientes tratados con 3 mg/kg de cA2 y metotrexato, el CES se redujo de 2,0 en la línea base a 1,1 a las 22 semanas.

Farmacocinética del cA2

Se obtuvieron las concentraciones séricas de cA2 en todos los pacientes de este estudio. Se muestra la concentración sérica en cada paciente representada frente al tiempo según el grupo de dosis de cA2 en la Figura 7. Los datos representados son las concentraciones séricas de cA2 obtenidas justo antes de la administración de cA2 en las semanas 2, 6, 10 y 14 y después en las semanas 18 y 26. Estos tiempos de muestreo se seleccionaron para demostrar mejor la estabilidad de la concentración de cA2 durante el régimen de dosis múltiples y la reducción de la concentración sérica de cA2 después de administrar la última dosis. Con fines de presentación de datos, se condensan las escalas de la concentración de cA2 para cada gráfica a medida que se aumentó la dosis de cA2.

Se observaron diferencias sustanciales para la concentración sérica de cA2 frente al tiempo en los grupos de dosis de 1 mg/kg según si los pacientes recibieron metotrexato. La mayoría de los pacientes que recibieron 1 mg/kg de cA2 con metotrexato demostraron concentraciones mensurables de cA2 durante 18 semanas, aunque parecía que había una tendencia a que la concentración se redujera con el tiempo. En marcado contraste, la mayoría de los pacientes que recibieron 1 mg/kg de cA2 sin metotrexato no fueron capaces de mantener concentraciones séricas mensurables de cA2 frente al tiempo. Como se discute en la presente memoria, la incapacidad de mantener el cA2 sérico en estos pacientes estaba asociada a una alta tasa de formación de anticuerpo neutralizante.

En contraposición con los grupos de 1 mg/kg, los pacientes que recibieron 3 mg/kg de cA2 o 10 mg/kg de cA2 fueron capaces de mantener las concentraciones séricas de cA2 durante el régimen de dosis múltiples. Sin embargo, incluso en estos grupos de dosis, había evidencia de que el tratamiento concomitante con metotrexato estaba asociado a altas concentraciones séricas de cA2. Como se muestra en la Figura 8, la concentración sérica mediana de cA2 en ambos grupos de 3 y 10 mg/kg que reciben metotrexato fue mayor que en los correspondientes grupos que no reciben metotrexato.

Respuestas inmunes a cA2

Se recogieron muestras séricas durante 26 semanas de todos los pacientes, y se analizaron los anticuerpos antiquiméricos humanos (HACA) contra cA2. Los resultados de las respuestas HACA para cada grupo de tratamiento con cA2 se muestran en la Tabla 6. Debe observarse que en diversos pacientes en el grupo de 3 mg/kg, y en la mayoría de los pacientes en el grupo de 10 mg/kg, el cA2 seguía presente en la muestra de 26 semanas y podría interferir potencialmente con la detección de HACA en el ensayo. Sin embargo, podría razonarse también que si estuvieran presentes anticuerpos neutralizantes a las 26 semanas, entonces no debería estar presente cA2. Por lo tanto, al presentar los datos en la Tabla 6, los resultados para la tasa de respuesta inmune se muestran sin incluir los pacientes con cA2 sérico a las 26 semanas e incluyendo los pacientes con cA2 sérico a las 26 semanas, suponiendo que si estaba presente cA2 a las 26 semanas, el paciente no tenía una respuesta HACA positiva.

TABLA 6 Respuestas HACA

	1 mg/kg	3 mg/kg	10 mg/kg
	MTX+	MTX-	MTX+	MTX-	MTX+	MTX-
Respuestas HACA sin incluir	2/13	8/15	0/10	3/12	0/2	1/10
pacientes con cA2 sérico	15,4%	53,3%	0%	25,0%	0%	10%
a las 26 semanas
Respuestas HACA incluyendo	2/13	8/15	0/15	3/14	0/14	1/15
pacientes con cA2^{1} sérico	15,4%	53,3%	0%	21,4%	0%	6,7%
a las 26 semanas
^{1} \begin{minipage}[t]{155mm} Los pacientes con una concentración sérica de cA2 mensurable a las 26 semanas se consideraron negativos para respuesta HACA para este análisis\end{minipage}

Los resultados de la Tabla 6 demuestran que el tratamiento concomitante con metotrexato suprime la respuesta inmune ante cA2, posibilitando conseguir una farmacocinética estable en un régimen de dosis múltiples de cA2. Se encontró también este efecto después del tratamiento combinado de anticuerpo anti-CD4/anti-TNF en ratones con artri-
tis inducida por colágeno, y se describió en la solicitud de EE.UU. nº 08/607.419, presentada el 28 de febrero de 1996.

Seguridad clínica

Dos de 86 pacientes (recibiendo la mayoría de los pacientes 5 tratamientos) experimentaron reacciones multisistemáticas relacionadas con la infusión con retratamiento. Las reacciones multisistemáticas relacionadas con la infusión incluyen dolor de cabeza, fiebre, sofocos faciales, prurito, mialgia, náusea, opresión torácica, disnea, vómitos, eritema, incomodidad abdominal, diaforesis, escalofríos, hipertensión, mareo, hipotensión, palpitaciones y somnolencia.

Pueden aparecer reacciones de hipersensibilidad, como se describe en la presente memoria, siempre que se administran materiales que contienen proteína, tal como cA2. Por tanto, no está claro si estos síntomas representan un evento inmunológico o factores físicos tales como la velocidad de infusión y la agregación de inmunoglobulina. Los investigadores han reseñado que los síntomas se solucionan en algunos pacientes reduciendo la velocidad de infusión. Los informes de la bibliografía previa indican que se han observado síntomas vasomotores en pacientes que reciben terapia de inmunoglobulina intravenosa (Berkman et al., Ann. Intern Med. 112: 278-292 (1990); Ochs et al., Lancet 2: 1158-1159 (1980)).

Un paciente desarrolló hipotensión durante las tres infusiones de 10 mg/kg de cA2. El paciente no presentó signos clínicos de hipotensión y no requirió tratamiento médico pero, para mantener los criterios de seguridad predefinidos, se interrumpió el esquema de tratamiento de este paciente.

Una paciente tratada con 3 infusiones de 10 mg/kg de cA2 y con 7,5 mg/semana de metotrexato desarrolló síntomas de sepsis como resultado de neumonía estafilocóccica 2 semanas después de su última visita del estudio, y 14 semanas después de su última infusión con cA2. Seis días después de desarrollar los síntomas, fue admitida en el hospital y tratada. Murió un día después. (Esta paciente no había procedido con la cuarta infusión por razones no relacionadas con la sepsis). Los pacientes con AR que desarrollan infecciones tienen un resultado peor del esperado. Wolfe y colaboradores han reseñado una relación observado:esperado para muerte debida a neumonía de 5,307 y una relación de observado:esperado para muerte debida a infecciones (excluyendo neumonía) de 6,213 en pacientes con AR a partir de la base de datos ARAMIS (Wolfe et al., Arthritis Rheumatism 4: 481-494 (1994)).

Un paciente experimentó una grave infección postoperatoria después de cirugía de cataratas 9 semanas después de la quinta y última infusión de 3 mg/kg de cA2 (con 7,5 mg/semana de metotrexato), que condujo a la extirpación del ojo. Este paciente estaba recibiendo prednisolona (7 mg/día). La incidencia de endoftalmitis después de la extracción de cataratas se ha reseñado que está entre 0,072 y 0,093% (Kattan et al., Ophtalmology, 98(9): 1147-1148 (1991), y puede elevarse en pacientes que reciben terapia con corticosteroides.

Ocho de los 87 pacientes (9%) desarrollaron anticuerpos de ADN bicatenario (bc) después de múltiples infusiones de cA2. Las medidas se realizaron en la línea base, la semana 8, 16 y 26 (12 semanas después de la última infusión). En estos pacientes con anticuerpos contra ADN-bc, había una tendencia hacia un nivel menor de anticuerpos en la última evaluación, siendo negativos dos pacientes.

Una paciente desarrolló disnea, dolor torácico pleurítico y un rebrote de actividad artrítica en la semana de estudio 14 (4 semanas después de la cuarta infusión de 3 mg/kg de cA2). Los síntomas se solucionaron y recibió la quinta dosis de cA2. Los síntomas volvieron 3 semanas después. El examen de las muestras de sangre en serie reveló que el ensayo de anticuerpos antinucleares y anticuerpos anti-ADN bc era negativo antes del tratamiento, pero se volvió positivo en la semana 6 del estudio. Los síntomas de la paciente respondieron a prednisolona oral 20-30 mg diarios. El diagnóstico de trabajo fue lupus sistémico eritematoso (LSE). La paciente no tiene actualmente síntomas de LSE, pero tiene AR activa.

Hasta la fecha, aunque se han detectado anticuerpos contra ADN-bc en pacientes tratados con cA2, generalmente representan aumentos transitorios y sólo un paciente ha sido sintomático. En pacientes que han tenido suficiente seguimiento, los anticuerpos anti-ADN bc se han solucionado con la interrupción del tratamiento.

En resumen, el tratamiento con cA2 es bien tolerado. Las reducciones de la actividad patológica producidas por cA2 son significativas, como apoyan los descubrimientos de una baja tasa de respuesta a placebo. Se obtienen altas tasas de respuesta clínica con un régimen de dosis múltiples de 3 mg/kg de cA2 en combinación con 7,5 mg/semana de metotrexato, y pueden mantenerse durante 26 semanas. Este régimen de dosis se considera preferible al régimen de 1 mg/kg más metotrexato debido a que se obtiene una mejor farmacocinética, virtualmente no se detectó respuesta inmune y la respuesta clínica se sostiene mejor después del último tratamiento con cA2. El beneficio clínico obtenido aumentando el régimen de dosis a 10 mg/kg de cA2 más metotrexato es similar al observado con el régimen de 3 mg/kg de cA2 más metotrexato.

Por tanto, los resultados de este estudio indican que el tratamiento con un régimen de dosis múltiples de cA2 como terapia coadyuvante de y/o concomitante con la terapia de metotrexato en pacientes con AR cuya enfermedad está controlada incompletamente por metotrexato, produce una respuesta clínica altamente beneficiosa o sinérgica que puede sostenerse durante 26 semanas. El beneficio producido por cA2 generalmente supera reducciones del 50% de las medidas tradicionales de artritis reumatoide (articulaciones inflamadas y sensibles, valoraciones globales de la enfermedad por paciente y médico) y consigue casi la remisión clínica en muchos pacientes. En consecuencia, los resultados de este estudio indican que el tratamiento con múltiples infusiones de cA2 como terapia coadyuvante de y/o conco-
mitante con la terapia de metotrexato es un enfoque terapéutico importante y eficaz para tratar la AR en pacientes.

Ejemplo 2 Tratamiento clínico de artritis reumatoide mediante infusión única de un anticuerpo anti-TNF en pacientes que reciben metotrexato

Se realizó un estudio aleatorizado de doble ciego controlado por placebo para evaluar los efectos de una infusión única de placebo, 5, 10 ó 20 mg/kg de cA2 en combinación con metotrexato administrado una dosis de 10 mg/semana, en el tratamiento de artritis reumatoide (AR) en pacientes.

Pacientes

Se inscribieron en el estudio veintiocho (28) pacientes de AR de tres centros en los Estados Unidos que, a pesar de recibir tres meses de terapia con metotrexato administrado a una dosis estable de 10 mg/semana durante al menos 4 semanas antes del examen, tenían todavía enfermedad activa según los criterios del Colegio Americano de Reumatología. La enfermedad activa se definió por la presencia de seis o más articulaciones inflamadas más al menos tres de cuatro criterios secundarios (duración de la rigidez matutina \geq 45 minutos; \geq 6 articulaciones sensibles o dolorosas; velocidad de sedimentación de eritrocitos (VSE) \geq 28 mm/hora; proteína C reactiva (PCR) \geq 20 mg/l.

Se permitió a los pacientes que tomaban AINE y corticosteroides (prednisona) en el examen continuar a dosis estables (7,5 mg/día).

Infusiones de estudio

Se suministró el anticuerpo monoclonal quimérico anti-TNF (cA2) en forma de una solución estéril que contenía 5 mg de cA2 por ml de solución salina tamponada con fosfato 0,01 M en cloruro de sodio 0,15 M con 0,01% de polisorbato 80, pH 7,2. Los viales de placebo contenían albúmina sérica humana al 0,1% en el mismo tampón. Antes del uso, se diluyó la cantidad apropiada de cA2 o placebo en 300 ml de solución salina estéril por el farmacéutico, y se administró por vía intravenosa mediante un filtro en línea de 0,2 \mum durante 2 horas. Las características de las bolsas de infu-
sión de placebo y cA2 eran idénticas, y los investigadores y pacientes no sabían cuál infusión se estaba administrando.

Valoraciones

Se distribuyeron aleatoriamente los pacientes en uno de cuatro grupos de tratamiento (7 pacientes por grupo). Cada uno de los 28 pacientes recibió una dosis única de 0, 5, 10 ó 20 mg/kg de cA2, y se siguieron durante 12 semanas. Los pacientes continuaron el tratamiento con metotrexato (Pharmacochemie, Holanda) administrado a 10 mg/semana durante el estudio. Se monitorizaron los efectos adversos en los pacientes durante las infusiones y regularmente después de ellas mediante entrevista, examen físico y ensayos de laboratorio.

La medida primaria de la respuesta clínica se definió mediante la definición preliminar de respuesta del CAR (Felson et al., Arthritis Rheumatism 38(6): 727-735 (1995)). Se consideró que los pacientes tenían respuesta si tenían un 20% de reducción del recuento de articulaciones inflamadas y sensibles y habían experimentado una reducción del 20% en 3 de las 5 valoraciones siguientes: valoración de dolor del paciente (EAV), valoración global de actividad patológica por el paciente (EAV), valoración global de actividad patológica por el médico (EAV), valoración de la función física por el paciente (CES) y un reactivo de fase aguda (VSE). La VSE se midió en cada sitio de estudio con un método estándar (Westergen).

Las evaluaciones se realizaron el día 3, y las semanas 1, 2, 4, 6, 8, 10 y 12.

Resultados

Se distribuyeron aleatoriamente los 28 pacientes en uno de cuatro grupos de tratamiento (o dosis).

Las tasas de respuesta clínica frente al tiempo mediante el criterio del 20% del CAR en cada uno de los grupos de tratamiento se muestran en la Tabla 7.

TABLA 7 Tasas de respuesta clínica (por el criterio del 20% del CAR) en pacientes que reciben 10 mg/kg de metotrexato

	Placebo	Dosis de cA2	Pacientes tratados con cA2
		5 mg/kg	10 mg/kg	20 mg/kg
Pacientes evaluados	7	7	7	7	21
Pacientes con cualquier	1 (14,3%)	6 (85,7%)	5 (71,4%)	6 (85,7%)	17 (81,0%)
respuesta
1 semana	0 (0,0%)	4 (57,1%)	2 (28,6%)	5 (71,4%)	11 (52,4%)
2 semanas	0 (0,0%)	4 (57,1%)	5 (71,4%)	5 (71,4%)	14 (66,7%)
4 semanas	1 (14,3%)	3 (42,9%)	5 (71,4%)	5 (71,4%)	13 (61,9%)
6 semanas	0 (0,0%)	3 (42,9%)	5 (71,4%)	4 (57,1%)	12 (57,1%)
8 semanas	1 (14,3%)	3 (42,9%)	4 (57,1%)	4 (57,1%)	11 (52,4%)
10 semanas	1 (14,3%)	1 (14,3%)	4 (57,1%)	3 (42,9%)	8 (38,1%)
12 semanas	1 (14,3%)	2 (28,6%)	4 (57,1%)	3 (42,9%)	9 (42,9%)

El beneficio clínico del tratamiento con cA2 fue evidente en la primera visita de evaluación en la semana uno. Aunque cada una de las 3 dosis de cA2 produjo respuestas clínicas en la mayoría de pacientes tratados, la duración de la respuesta clínica pareció estar mejor sostenida durante 12 semanas en los grupos que recibían 10 ó 20 mg/kg de cA2. La respuesta clínica se consiguió mucho más frecuentemente entre pacientes que recibían cA2 comparado con placebo. Es decir, 17/21 (81%) pacientes en los 3 grupos de cA2 consiguieron una respuesta, comparado con sólo 1/7 (14%) pacientes tratados con placebo. La magnitud de la respuesta clínica fue notable. El recuento medio de articulaciones sensibles entre pacientes tratados con cA2 se redujo de 30,1 en la línea base a 13,3 en la semana 12, y la PCR se redujo de 3,0 en la línea base a 1,1 en la semana 12.

La duración de la respuesta clínica parecía ser dependiente de la dosis. 2/6 (33%) de los pacientes que respondían tratados con 5 mg/kg de cA2 sostuvieron una respuesta durante 12 semanas de seguimiento, comparado con 7/11 (64%) de los pacientes que respondían que recibieron 10 ó 20 mg/kg. El tratamiento en todos los grupos fue generalmente bien tolerado.

En resumen, los resultados de este estudio indican que el tratamiento con cA2 como terapia coadyuvante de y/o concomitante con la terapia de metotrexato es eficaz en la reducción de los signos y síntomas de artritis reumatoide en pacientes cuya enfermedad está controlada incompletamente por metotrexato. Además, la respuesta clínica conseguida mediante este enfoque puede sostenerse durante más de 12 semanas después de un tratamiento único. En consecuencia, los resultados de este estudio indican que el tratamiento con cA2 como terapia coadyuvante de y/o concomitante con la terapia de metotrexato es un enfoque terapéutico importante y eficaz para tratar AR en pacientes.

Ejemplo 3 Tratamiento clínico de artritis reumatoide mediante la administración repetida de dosis de un anticuerpo anti-TNF en pacientes después de una dosis única. Ensayo de doble ciego controlado por placebo

Se realizó un estudio de etiqueta abierta para evaluar los efectos de infusiones repetidas de cA2 10 mg/kg en combinación con metotrexato administrado a una dosis de 10 mg/semana en el tratamiento de artritis reumatoide en pacientes.

Pacientes

Como se describe en el ejemplo 2, se realizó un estudio de cA2 de 12 semanas aleatorizado de doble ciego controlado por placebo en pacientes de AR que tenían enfermedad activa a pesar de recibir tres meses de terapia con metotrexato administrado a una dosis estable de 10 mg/sem durante al menos 4 semanas antes del examen.

En la semana 12, se ofreció a pacientes que hubieran completado el periodo de evaluación de 12 semanas y no hubieran experimentado eventos adversos que prohibieran infusiones adicionales de cA2, 3 infusiones de etiqueta abierta de cA2 adicionales, administradas a una dosis de 10 mg/kg a intervalos de 8 semanas (semanas 12, 20, 28). Se inscribieron en este estudio veintitrés (23) pacientes del estudio de 12 semanas.

Valoraciones

Se evaluaron 11/23 pacientes que entraron en este estudio de etiqueta abierta en 1 de 3 centros en los Estados Unidos, y se siguieron hasta 40 semanas después de la entrada inicial. Los pacientes continuaron el tratamiento con metotrexato administrado a 10 mg/sem durante el estudio. Los tratamientos repetidos con cA2 fueron generalmente bien tolerados. Tres pacientes tuvieron síntomas transitorios relacionados con la infusión (urticaria, somnolencia).

La medida primaria de respuesta clínica se definió mediante la definición preliminar de respuesta del CAR (Felson et al., Arthritis Rheumatism 38(6), 727-735 (1995). Se consideró que los pacientes tenían respuesta si tenían un 20% de reducción del recuento de articulaciones inflamadas y sensibles, y habían experimentado una reducción del 20% en 3 de las 5 valoraciones siguientes: valoración de dolor por el paciente (EAV), valoración global de actividad patológica por el paciente (EAV), valoración global de actividad patológica por el médico (EAV), valoración de la función física por el paciente (CES) y reactivo de fase aguda (VSE). La VSE se midió en cada sitio de estudio con un método estándar (Westergen).

Resultados

De seis pacientes que habían recibido todos cA2 durante el estudio de doble ciego descrito en el ejemplo 2 y respondido durante las 12 semanas de ese estudio, cuatro pacientes sostuvieron una respuesta durante el seguimiento de 40 semanas. De los dos pacientes restantes, un paciente sigue respondiendo en la semana 28, y un paciente entró recientemente en este ensayo de etiqueta abierta. Para los 4 pacientes que completaron las 40 semanas de seguimiento y el paciente en la semana 28, los recuentos finales de articulaciones sensibles fueron 2 y los recuentos de articulaciones inflamadas 1, comparado con una media de 23 y 29, respectivamente, en la entrada en el estudio de doble ciego descrito en el ejemplo 2. Para 4 de estos 5 pacientes, las VSR fueron de 18 mm/h y la PCR 0,7, comparado con una media de 27 y 3,9, respectivamente, a la entrada en el estudio de doble ciego descrito en el ejemplo 2.

De los dos pacientes que habían recibido cA2 durante el estudio de doble ciego descrito en el ejemplo 2 y respondido sólo hasta la semana 10 de ese estudio, un paciente respondió durante 36 semanas y un paciente sigue respondiendo en la semana 20.

De los tres pacientes que no respondieron durante el estudio de doble ciego descrito en el ejemplo 2 (2 recibieron placebos, 1 recibió 5 mg/kg de cA2), dos de estos pacientes experimentaron una respuesta clínica transitoria, y un paciente sigue respondiendo en la semana 20.

En resumen, los resultados preliminares de este estudio sugieren que la terapia coadyuvante y/o concomitante repetida con cA2 en pacientes de AR cuya enfermedad está incompletamente controlada por metotrexato puede dar como resultado una mejora clínica sustancial para una mayoría de los pacientes. Además, la respuesta clínica conseguida por este enfoque puede sostenerse durante hasta 40 semanas de seguimiento. En consecuencia, los resultados de este estudio indican que el tratamiento repetido con cA2 como terapia coadyuvante de y/o concomitante con la terapia de metotrexato es un enfoque terapéutico importante y eficaz para tratar AR en pacientes.

Claims (29)

1. Uso de un anticuerpo monoclonal anti-factor de necrosis tumoral \alpha humano o fragmento del mismo para la fabricación de un medicamento para realizar terapia coadyuvante con metotrexato de una enfermedad mediada por el factor de necrosis tumoral humano en un individuo, en el que el anticuerpo anti-factor de necrosis tumoral \alpha humano o fragmento del mismo (a) se une a un epítopo en factor de necrosis tumoral \alpha humano, (b) inhibe la unión de factor de necrosis tumoral \alpha humano a receptores de superficie celular de factor de necrosis tumoral \alpha humano, y (c) se administra a una dosis de 0,01-100 mg/kg/día.

2. El uso de la reivindicación 1 en un régimen terapéutico para tratar artritis reumatoide en un individuo, en el que en el régimen terapéutico (a) el medicamento que contiene metotrexato ha de administrarse a intervalos de semanas, y (b) el medicamento que contiene el anticuerpo anti-factor de necrosis tumoral \alpha humano, o fragmento de anticuerpo, ha de administrarse múltiples veces, estando separada cada administración (1) por un intervalo de semanas de la administración anterior.

3. Uso de un anticuerpo monoclonal anti-factor de necrosis tumoral \alpha humano o fragmento del mismo para la fabricación de un medicamento para realizar terapia coadyuvante con metotrexato en un individuo que sufre artritis reumatoide, en el que en la terapia coadyuvante el medicamento que contiene el anticuerpo anti-factor de necrosis tumoral \alpha humano o fragmento de anticuerpo ha de administrarse al individuo múltiples veces, (i) estando separada cada una de dichas administraciones por un intervalo de semanas de la administración anterior, y (ii) suministrándose 0,01-100 mg/kg/día del anticuerpo anti-factor de necrosis tumoral \alpha humano o fragmento del mismo.

4. El uso de la reivindicación 3, en el que el anticuerpo anti-factor de necrosis tumoral \alpha humano o fragmento del mismo (a) se une a un epítopo en factor de necrosis tumoral \alpha humano y (b) inhibe la unión de factor de necrosis tumoral \alpha humano a receptores de superficie celular de factor de necrosis tumoral \alpha humano.

5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que cada administración del medicamento que contiene metotrexato suministra 0,01-100 mg/kg/día de metotrexato.

6. El uso de la reivindicación 1, en el que cada administración del medicamento que contiene el anticuerpo anti-factor de necrosis tumoral \alpha humano o fragmento de anticuerpo está separada por un intervalo de un día a treinta semanas de la administración anterior.

7. El uso de la reivindicación 1, en el que la enfermedad mediada por el factor de necrosis tumoral es una enfermedad degenerativa o espondilitis anquilosante.

8. El uso de la reivindicación 1, en el que la enfermedad mediada por el factor de necrosis tumoral es artritis reumatoide.

9. El uso de la reivindicación 1, en el que la enfermedad mediada por el factor de necrosis tumoral se selecciona de artritis crónica juvenil, artritis de células gigantes, artritis psoriásica, artritis enteropática, artritis reactiva y artritis asociada a enfermedad inflamatoria del intestino.

10. El uso de la reivindicación 1, en el que la enfermedad mediada por el factor de necrosis tumoral es la enfermedad de Crohn.

11. El uso de la reivindicación 1, en el que la enfermedad mediada por el factor de necrosis tumoral es una enfermedad inmune aguda o crónica asociada a transplante.

12. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el anticuerpo anti-factor de necrosis tumoral á humano o fragmento del mismo es un anticuerpo.

13. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el anticuerpo anti-factor de necrosis tumoral á humano o fragmento del mismo es un anticuerpo quimérico.

14. El uso de la reivindicación 13, en el que el anticuerpo quimérico se une a uno o más aminoácidos del factor de necrosis tumoral \alpha humano seleccionados del grupo de aminoácidos consecutivos aproximadamente en las posiciones 87-108 o aproximadamente en las posiciones 59-80.

15. El uso de las reivindicaciones 13 ó 14, en el que el anticuerpo quimérico se une al epítopo reconocido por cA2.

16. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en el que el anticuerpo es cA2.

17. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

18. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en el que el medicamento que contiene el factor de necrosis tumoral \alpha humano o fragmento de anticuerpo se administra mediante infusión.

19. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en el que se administran 7,5 mg de metotrexato semanalmente empezando en la semana 0, y el anticuerpo anti-TNF\alpha es cA2 y se administra mediante infusión en las semanas 0, 2, 6, 10 y 14 a dosificaciones de uno de 1, 3 ó 10 mg/kg.

20. El uso de la reivindicación 19, en el que la dosificación es 3 mg/kg.

21. Uso de un receptor p75 soluble humano de factor de necrosis tumoral \alpha humano o fragmento funcional del mismo para la fabricación de un medicamento para realizar terapia coadyuvante con metotrexato de una enfermedad mediada por el factor de necrosis tumoral \alpha humano en un individuo, en el que el receptor p75 soluble humano de factor de necrosis tumoral \alpha humano o fragmento funcional del mismo (a) se une a un epítopo en factor de necrosis tumoral \alpha humano, (b) inhibe la unión de factor de necrosis tumoral \alpha humano a receptores de superficie celular de factor de necrosis tumoral \alpha humano, y (c) se administra a una dosificación de 0,01-100 mg/kg/día.

22. El uso de la reivindicación 21, en el que la enfermedad mediada por el factor de necrosis tumoral \alpha humano se selecciona de enfermedad autoinmune, enfermedad inmune aguda o crónica, enfermedad inflamatoria y enfermedad neurodegenerativa y espondilitis anquilosante.

23. El uso de la reivindicación 21, en el que la enfermedad mediada por el factor de necrosis tumoral humano es artritis reumatoide.

24. El uso de la reivindicación 21, en el que la enfermedad mediada por el factor de necrosis tumoral se selecciona de artritis crónica juvenil, artritis de células gigantes, artritis psoriásica, artritis enteropática, artritis reactiva y artritis asociada a enfermedad inflamatoria del intestino.

25. El uso de la reivindicación 21, en el que la enfermedad mediada por el factor de necrosis tumoral humano es la enfermedad de Crohn.

26. El uso de la reivindicación 21, en el que la enfermedad mediada por el factor de necrosis tumoral humano es enfermedad inmune aguda o crónica asociada a transplante.

27. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 21-26, en el que el receptor soluble humano p75 de factor de necrosis tumoral \alpha es una molécula multimérica.

28. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 21-27, en el que el receptor p75 soluble humano de factor de necrosis tumoral \alpha es una proteína de fusión soluble inmunoreceptora de factor de necrosis tumoral \alpha.

29. El uso de la reivindicación 28, en el que la proteína de fusión soluble inmunoreceptora de factor de necrosis tumoral \alpha es una proteína de fusión receptor p75 soluble de factor de necrosis tumoral \alpha/IgG.