JP4887284B2 - 癌細胞の増殖を阻害するための、または癌細胞のアポトーシスを増大させるための方法 - Google Patents
癌細胞の増殖を阻害するための、または癌細胞のアポトーシスを増大させるための方法 Download PDFInfo
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Description
技術分野
本発明は、癌を阻害および処置するための環状ジヌクレオチド、例えば、c−ジ−GMPおよびそのアナログの使用に関する。特に、環状ジヌクレオチドは、基礎的および成長因子が誘導するヒト癌細胞の増殖を阻害する。
実験データは、アポトーシスおよびDNA修復の調節に作用する体細胞遺伝子の変化の蓄積に関連して、正常な大腸粘膜から腺腫様ポリープないし癌に進行する結果として、ほとんどの大腸癌が生じることを示す(Kinzlerら,1996;およびJassら,2002)。これらの変化は、癌遺伝子、腫瘍抑制因子およびミスマッチ修復遺伝子の突然変異およびメチル化を含む(Kinzlerら,1996;およびJassら,2002)。環境因子(例えば、糞便の胆汁酸濃度)は、この過程を進めるのに重要な役割を果たす(Hillら,1975;Reddyら,1977;Hill,1991;およびLichtensteinら,2000)。
本発明は、有効量の環状ジ−GMPもしくはその環状ジヌクレオチドアナログをその必要のある患者へ投与することにより、癌細胞の増殖を阻害するかまたは癌細胞のアポトーシスを増大させるための方法を提供する。
図1は、増加濃度のc−ジ−GMPが、基礎的ならびにアセチルコリンおよびEGFが刺激する大腸癌細胞の増殖を阻害することを示すグラフである。水、アセチルコリン(300μM)およびEGF(1ng/ml)を用いて、H508細胞を5日間、37℃で処理した。スルホローダミンブルー(SRB)比色アッセイ(Skehanら,1990)により、細胞増殖を測定した。結果は3つの別個の実験の平均±S.E.Mである。*および**は、水、アセチルコリンおよびEGF単独の存在下で観察されたものよりも有意に異なる値を示す(それぞれp<0.05および0.005、対応のないスチューデントのt−検定)。
意外にも、本発明は、環状ジ−GMP(c−ジ−GMP)が、M3ムスカリン性(M3R)もしくは上皮成長因子受容体(EGFR)を発現している大腸癌細胞の増殖を直接阻害し得ること、または大腸癌細胞のアポトーシスを直接増大もしくは誘導し得ることを見出した。異なる器官における細胞成長の新生物調節、すなわち、成長因子が刺激する細胞増殖は同様であるので、大腸癌細胞についての結果は、M3ムスカリン性および/またはEGF受容体を発現する他の癌細胞にも適用できると考えられる。EGFが刺激する癌細胞の増殖を阻害する剤、例えば、環状ジ−GMPおよびその環状ジヌクレオチドアナログは抗癌剤として用いられ得る。非限定的な例は、膵臓、乳房(Berquinら,2005;Perezら,1984;Imaiら,1982)、肺、脳(Zhangら,2004)、前立腺(Daviesら,1988;Eatonら,1988)、扁平細胞(例えば、皮膚の扁平細胞癌腫、口腔粘膜、食道;Kamataら,1986)、リンパ球(例えば、ホジキン病)および白血球(例えば、白血病;Ovalら,1991;Spengemanら,2005)に由来する癌細胞を含むが、これらに限定されない。さらに、細胞アポトーシスに至る基礎的な細胞増殖の阻害は、癌細胞の多くの型において同様であるとも考えられ得る。
本実施例に記載の実験において、c−ジ−GMP(≦50AM)は、インビトロでの癌細胞増殖の阻害に関して顕著な特性を有することが示される。c−ジ−GMPは、ヒト大腸癌(H508)細胞の基礎的および成長因子(アセチルコリンおよび上皮成長因子)が誘導する細胞増殖を共に阻害する。毒性研究により、正常ラット腎細胞およびヒト神経芽腫細胞を生体に関連する用量でc−ジ−GMPへ曝露させても全く細胞傷害性を示さないことが、明かとなった。
化学物質および試薬
純粋で高収率のc−ジ−GMPジアンモニウム塩の調製をもたらす最近記載された新規方法を用いて、純粋形態のc−ジ−GMPを合成した(Hayakawaら,2003;およびHyodoら,2004)。構造的に関連するヌクレオチド(グアノシン3’,5’−環状一リン酸(cGMP)およびグアノシン5’−一リン酸(5’−GMP);共にSigmaから))も調べた。ダルベッコ変法イーグル培地、MEM非必須アミノ酸、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびG418はGibcoBRLから得た。他の全ての化学物質はSigmaまたはFisherから得た。
10%のウシ胎児血清(FBS)(Biowhittaker)を加えたRPMI1640(ATCC)中でH508ヒト大腸癌細胞を成長させた。トリプシン処理した後、接着培養物を集密以下(subconfluence)で週に1回継代した。培養物をインキュベーター中、5%のCO2および95%の空気の雰囲気下、37℃で維持した。
スルホローダミンB(SRB)比色アッセイ(Skehanら,1990)を用いて、細胞増殖を測定した。細胞を約10%の集密で96−ウェルプレート(Corning Glass Works,Corning,NY)中に播種し、次いで、24時間付着させた。成長培地を除去し、次いで、FBS不含かつ指示された濃度の試験物質を含む新鮮な培地を加えた。5%のCO2および95%の空気の雰囲気下、指示された時間の間、37℃で細胞をインキュベーションした。インキュベーションした後、1%の酢酸中に溶解させた0.4%(w/v)のSRBを用いて細胞を30分間処理した。緩衝化されていない10mMのトリス塩基を用いて、蛋白質に結合した色素を抽出した。コンピューターに接続した96−ウェルマイクロタイタープレートリーダーを用いて、560nmにおける吸光度を測定した。
個々の細胞株におけるc−ジ−GMPの毒性を試験した。これらの研究では、Alamar blueアッセイを用いて、NRK52E細胞(正常ラット腎細胞)における急性(24および72時間)毒性を測定した。NRK52E細胞は、NRKと呼ばれる混合培養物から元々クローニングされたラット腎尿細管上皮細胞株である。Alamar blueアッセイを細胞株の増殖を測定するために設計し、そしてそれを用いて、様々な化学物質の細胞傷害性を慣例的に測定する。Alamar blue色素は、REDOX指標として機能し、および細胞の代謝還元に関する適切な酸化−還元範囲における蛍光および比色の変化の両方を示す。ほとんどの生細胞に対してその毒性は少ない。
化学毒性を評価するために、96−ウェル組織培養プレート(Costar)中にほぼ集密でプレートしたNRK52E細胞を用いて、Alamar blueアッセイを行った。組織培養フラスコ中、10%のFBSおよびペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM中にて、細胞を維持した。トリプシン処理により細胞を回収し、基本培地中に再懸濁し、次いで、カウントした。NRK52E細胞を4〜5×104細胞/ウェルの密度でプレートした。24時間の接着/順化期間の後に、その組織培養培地を吸引し、次いで、適切な試験溶液と交換した。ほとんどの実験については、各溶液につき8ウェルを用いた。すなわち、8つの複製ウェルの1つのカラムにて各溶液を試験した。一般に、各実験は以下の設計;プレート用のベースライン対照として用いる1つのカラム(細胞なし,プラスチック表面のみ)、負対照として用いる1つのカラム(血清含有基本培地)、溶媒対照として用いる1つのカラム(DMEM培地,無血清)、細胞死の正対照として用いる1つのカラム(細胞の浸透圧破壊をもたらす滅菌脱イオン水)を利用し、および8つのカラムを用いて様々な濃度のc−ジ−GMP(2μM〜400μM)を試験した。プレートを24もしくは72時間インキュベーションし、次いで、位相差顕微鏡で観察した。全ての溶液を吸引し、次いで、Alamar blue色素(10容量%)含有の新鮮なDMEMと交換した。プレートを37℃でさらに6時間インキュベーションし、その後、蛍光プレートリーダー(Cytofluor)を用いて蛍光を測定した。生の蛍光単位としてデータを集め、そしてそれを、各群につき全8ウェルからの平均値を用いて、溶媒対照のパーセントとして表した(平均蛍光試験/平均蛍光対照×100=対照蛍光%)。
細胞増殖への潜在的効果を評価するために、NRK52E細胞を用いてAlamar blueアッセイを行った。毒性アッセイについて記載のように細胞を回収し、次いで、96−ウェル組織培養プレート中に約3×103細胞/ウェルの密度で播種し、次いで、96時間にわたって評価した。血清含有DMEM基本培地中、細胞を3時間付着させた。付着させた後、その培地を吸引し、次いで、毒性アッセイについて記載した設計に従った試験溶液と交換し、各溶液にAlamar blue色素を(10容量%として)加えた。24、48、72および96時間目に、蛍光プレートリーダー(Cytofluor)でAlamar blue色素の還元を測定した。形態観察も行って、細胞パターンが蛍光データに適合するかを確かめた。データを生の蛍光単位として集め、そしてそれを、各時間枠において、各群につき用いた全8ウェルからの平均値を用いて、溶媒対照のパーセントとして表した(平均蛍光試験/平均蛍光対照×100=対照蛍光%)。Alamar blueそれ自体がある種の成長および阻害効果を及ぼさないことを確かめるためのさらなるチェックとして、Alamar blueなしの培地中に、より低い密度で細胞をプレートし、72時間曝露させることによっても、実験を行った。72時間の成長期間の後、培地を吸引し、次いで、Alamar blue(10容量%)含有の新鮮なDMEMを全てのウェルに加えた。細胞をAlamar blue溶液中でさらに6時間インキュベーションし、次いで、蛍光を測定し、次いで、データを収集し、次いで、記載のように表した。
10%のFBS、ペニシリン(100IU/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)およびL−グルタミン(2mM)を加えたDMEM/Ham’s F−12(1:1)培地中でSH−SY5Yヒト神経芽腫細胞を培養し;その細胞培養培地を2日ごとに交換した。加湿インキュベーター中、37℃、95%の空気−5%のCO2中で培養物を維持した。96ウェルプレートについて約1000〜7000細胞/ウェルをアッセイするために、標準曲線の直線範囲を定めた。記載した全てのデータはこの範囲内であった。MTSアッセイ濃度応答曲線は以下のように行った:1800細胞/ウェルを96ウェルプレート中にプレートした。30時間後、毒物不含(対照)か、または様々な濃度の毒物を含むよう、培地を変えた。次いで、細胞を48時間曝露させ、培地を除去し、次いで、フェノールレッドなしの100μlの最小必須培地および20μlのMTS試薬を加えた。細胞をインキュベーションし、次いで、2時間後、ELx808マイクロプレートリーダー(Bio−Tek Instruments,Winooski,VT)で、490nmにて、プレートを測定した。Prismソフトウェア(GraphPad,San Diego,CA)を用いて、非線形回帰により、EC50値を決定した。
全グラフは、3つの別個の実験の平均±S.E.M.を示す。等しい分散をもつ正規分布を仮定する、スチューデントの対応のない両側t−検定を用いて、統計的計算を行った。アスタリスクの数により統計的有意性が示される(*,p<0.05,**,p<0.005)。
c−ジ−GMPはヒト大腸癌細胞の増殖を阻害する
M3ムスカリン性(M3R)および上皮成長因子(EGF)受容体(EGFR)を発現する中程度に分化したヒト盲腸腺癌に由来する細胞(H508細胞)の基礎的および成長因子が刺激する増殖について、c−ジ−GMPの潜在的治療作用を調べた(Chengら,2003)。有効なスルホローダミンB(SRB)比色アッセイ(Skehanら,1990)を用いて、細胞増殖を測定した。単独かまたは増加濃度のc−ジ−GMP(0.5〜50μM)を加えた成長刺激因子、アセチルコリン(300μM)およびEGF(1ng/ml)の不在または存在下でH508細胞をインキュベーションした。5日間インキュベーションした後、試験した最大濃度、50μMのc−ジ−GMPは、基礎的なH508細胞増殖を約15%だけ減少させた(図1;対照と比較してp<0.05,スチューデントの対応のないt−検定)。顕著には、増加濃度の環状ジヌクレオチドは、漸次、アセチルコリンおよびEGFが誘導する細胞増殖を阻害した(図1;刺激因子単独と比較して,p<0.05〜0.01)。さらに、50μMのc−ジ−GMPを用いると、アセチルコリンおよびEGFが誘導する増殖は基礎レベルまで減少した(p<0.01)。より低い濃度のc−ジ−GMPは基礎的な増殖を有意には改変しないので、これらのより低い濃度はアポトーシスを誘導しないと考えられる。しかし、50μMのc−ジ−GMPでは、基礎的な増殖は阻害され、このことは、細胞の顕微鏡試験により観察されなかったが、アポトーシスが関与しているかもしれないことを示す。
NRK細胞をc−ジ−GMPに24時間曝露させた場合、細胞傷害性の証拠はほとんどなかった(表1)。曝露期間を72時間に増大させた場合、200および400μMのc−ジ−GMPで毒性が観察された(表1)。200μMのc−ジ−GMPを用いると、72時間の集密および非集密細胞において、蛍光がそれぞれ36および14%減少した。20、40、100μMの化合物に曝露させた細胞では、溶媒対照と比較して蛍光は減少しなかった。比較のために、正対照(脱イオン水)は、対照に対して蛍光を100%減少し、最大の細胞傷害性を示した。故に、全ての関連する生物学的濃度では、c−ジ−GMPは正常ラット腎細胞に対して全く細胞傷害性を示さない。
3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−5−(3−カルボキシメトキシフェニル)−2−(4−スルホフェニル)−2H−テトラゾリウム(MTS)アッセイは、細胞増殖、細胞傷害性および生存を測定するための定量的比色アッセイである。生細胞においてのみ、MTSをホルマザン産物に変換する。MTSは、3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)に類似しており、細胞傷害性アッセイにおいて広く用いられる。その違いは、MTS試薬用のホルマザン産物は培地に可溶であるが、MTT試薬は可溶でないということである。
環状ジヌクレオチドがヒト大腸癌細胞の増殖を阻害する分子機序の測定
実施例1の結果は、環状−ジ−GMPが基礎的および成長因子が誘導する大腸癌細胞の増殖を阻害することを示す。本実施例では、H508および他の大腸癌細胞株においてこれらの作用の用量依存性、再現性および機序をさらに探究することが提案される。細胞周期の進行およびアポトーシスに関する細胞シグナル伝達および核変換に対する環状−ジ−GMPの作用を調べる前に、蛍光および放射標識した環状−ジ−GMPを用いて、形質膜に結合するか、または大腸癌細胞に入り、および細胞内部位で作用する環状−ジ−GMPの能力またはその能力がないことを直接測定することが提案される。標識した環状ジヌクレオチドが大腸癌細胞に入るか否かを調べること、およびアフィニティクロマトグラフィーを用いてその分子が形質膜またはサイトゾル中の特定分子と相互作用するか否かを測定することも提案される。
実施例1の実験で用いた大腸癌細胞株、H508細胞は、中程度に分化したヒト盲腸腺癌に由来し、ならびにM3RおよびEGFRを発現する(Fruchtら,1999;およびChengら,2003)。実施例1における知見の再現性を確認するため、および他の大腸癌細胞株にそれらを拡大適用するために、本発明者らは、成長因子受容体を様々に発現する他のヒト大腸癌細胞株に対する環状ジヌクレオチドおよびアナログ(例えば、cGMP)の作用を調べることを提案する。特に、M3RおよびEGFRも発現するHT−29細胞(Fruchtら,1999)、ムスカリン性受容体を発現しないSNU−C4(Fruchtら,1999)ならびに高レベルのEGFR発現を有するがM3Rを発現しないSW480細胞が用いられ得る。これらの成長因子に対する受容体の発現は、刺激に対する細胞応答を決定する。
個別支払い制の供給元、ARC,Incから得た放射標識c−ジ−GMP(3H−c−ジ−GMP)を用いて、環状ジヌクレオチドが細胞に結合するかまたは細胞に入るか否かを測定する。癌細胞を、振盪水浴中、100μMの標識c−ジ−GMPを含有する培地中でインキュベートし、次いで、様々な時間(0、0.5、1、2、4、6および8時間)にアッセイする。細胞懸濁液を遠心分離し、結合していないc−ジ−GMPを除去し、次いで、細胞ペレットをPBSで洗浄し、強固に結合していないc−ジ−GMPを除去し、次いで、保持する。この「洗液」、全細胞試料のアリコート、超音波処理した溶解物に由来する上清、および超音波処理した溶解物に由来する細胞ペレットをシンチレーションカクテル(Scinti−Safe Econol)へ加え、次いで、各試料の放射能(3H−c−ジ−GMPの量を示す)を液体シンチレーションカウンティングにより測定する。加えて、標識−c−ジ−GMPの完全性(結合しているまたは結合していない)をHPLCにより確認する。個々の実験において、特異的結合(または細胞取り込み)は、非特異的結合もしくは取り込みを阻害する高濃度の非標識c−ジ−GMPの存在下、放射性リガンド結合の量として推定する。特異的結合もしくは取り込みを、全結合もしくは取り込みの値から非特異的なものを差し引くことにより決定する。
細胞外環状−ジ−GMPはH508細胞増殖を改変するので、本発明者らは、これらの効果が、環状−ジ−GMPと表面受容体の相互作用およびそれらの結合のいずれかが調節上の変化をもたらすことによってか、細胞へ取り込まれ細胞機能を調節することによってか、またはその両機序により介されると考える。3H−c−ジ−GMPシグナルが全細胞溶解物中よりも「洗液」中においてより少ないならば、このことは、c−ジ−GMPが細胞と関連することを示唆するだろう。シグナルが細胞溶解物の上清中よりも細胞溶解物のペレット中においてより大きいならば、このことは、c−ジ−GMPが細胞膜に関連することを示唆するだろう。しかし、超音波処理した溶解物に由来する細胞ペレット中よりも超音波処理した溶解物に由来する上清中においてシグナルがより大きいならば、このことは、c−ジ−GMPが主に細胞内にあることを示唆する。その正確な取り込み機序は知られていないが、例えば、それが特異的または非特異的取り込みであるか否かというような将来の研究において取り組まれよう。このアプローチは、環状−ジ−GMPの細胞内レベルの測定を可能にする。過去の研究は、環状−ジ−GMPが真核細胞に入り得ることを示しているが、大腸癌細胞は研究されていない(Steinbergerら,1999)。結果が、環状−ジ−GMPが細胞へ入るが、飽和が生じることを示すならば、このことは、環状−ジ−GMPが、拡散ではなくむしろ飽和性受容体もしくはチャネルを介して細胞へ入ることを示唆するだろう。環状−ジ−GMPが分子上の炭素ではなく窒素もしくは酸素を介して水素結合により受容体に結合し得ることが考えられ、故に、用いる標識方法が結合活性を阻害するとは考えられない。概して、これらの研究は、環状−ジ−GMP、細胞外分子が細胞表面に結合するかまたは実際に細胞へ入るか否かを確証するために重要である。
放射標識した環状−ジ−GMPの代替的アプローチとして、蛍光標識した環状−ジ−GMP(例えば、2’−O−ピレニルメチル−環状−ジ−GMP)を用いて、蛍光を分光法(375nm)により検出する。対照として、上清中に検出される環状−ジ−GMPが細胞溶解に起因する可能性を排除するために、(i)DNAのDAPI染色および蛍光分光法もしくは電子分光法、ならびに(ii)独占的な細胞質蛋白質についてのアッセイ(例えば、LDH)(Sigmaキット)を行う前に、細胞懸濁液を試験する。アフィニティクロマトグラフィーについては、カラムをコーティングするために用いる最初の濃度、200μMが有効な結合のためには低すぎることが見出される場合には、バッファー中の環状−ジ−GMP(3.625mg/5ml)の1mM溶液を用いて、実験を繰り返す。
頻繁には、哺乳類細胞において、抗増殖剤は、G1期細胞周期停止を惹起する。増殖の停止は、抗増殖剤の最終結果であるが、細胞周期停止の機序は、細胞型および剤の作用の分子機序に応じて様々である。実施例1の結果は、環状−ジ−GMPが基礎的および成長因子が誘導する大腸癌細胞の増殖を阻害することを示す。特に、H508ヒト大腸癌細胞を用いた実験は、環状ジヌクレオチドがアセチルコリンおよびEGFが誘導するH508細胞増殖を阻害することを示す。環状ジヌクレオチドがムスカリン性もしくはEGF受容体阻害剤として作用すること、または該剤が受容体後のシグナル伝達を遮断することは可能であるが、可能性は低い。例えば、H508大腸癌細胞において、増加濃度の環状−ジ−GMPは、アセチルコリンもしくはEGFのいずれかが誘導するp44/42MAPK(Erk1/2)のリン酸化を阻害しない。故に、本発明者らは、既にジャーカット細胞において示されているように、該剤は、細胞周期停止を誘導することにより、さらに下流に作用する可能性が高いと考える。それにも関わらず、環状ジヌクレオチドの受容体もしくは受容体後の作用を排除するために、M3RおよびEGFR活性化の両方に共通のシグナル伝達段階に対するその作用を調べることが提案される。これらの段階は、p44/42MAPKのリン酸化に加えて、EGFR Tyr992および転写因子p90RSKのリン酸化を含む。
p90RSK活性化を含む、大腸癌細胞におけるEGFRおよびp44/42MAPKシグナル伝達の活性化は、これらの蛋白質のリン酸化を測定するための免疫ブロッティングにより行う。フローサイトメトリー細胞分析のために、細胞をトリプシン処理し、PBSで洗浄し、次いで、70%のエタノール中、1時間、−20℃で固定する。固定された細胞をPBSで洗浄し、次いで、RNase(0.05%)およびTritonX−100(0.5%)を含有するPBSと共に30分間37℃でインキュベーションし、次いで、ヨウ化プロピジウムで染色する。染色された細胞を、Greenebaum Cancer Centerの中心施設にて利用できるFACScanフローサイトメーター(Becton−Dickinson,San Jose,CA)を用いて選別する。細胞数をDNA含量に対してプロットする。1試料あたり少なくとも10,000個の細胞をカウントする。細胞周期調節蛋白質の活性化は、サイクリンA、サイクリンE、サイクリンD1、Cdk2、Cdk4、p21、p27およびp53に対する市販の抗体を用いる免疫ブロッティングを利用して調べる。α−チューブリン発現は、蛋白質ローディングを制御するために用いられる。免疫複合体は、化学発光の増強を用いて可視化される。アポトーシスの活性化は、カスパーゼ−3活性化のための市販のアッセイキット(不活性型p32から活性型p17の変換の測定)を用いて測定する。
上記したように、環状−ジ−GMPでの処理が成長因子とその受容体の相互作用を改変すること、または受容体後の細胞質シグナル伝達に作用することは期待されない。剤が核レベルでさらに下流の成長因子の効果を阻害する可能性が高い。特に、これらの効果は、細胞周期停止およびアポトーシスへの効果を含む可能性がある。前者は、Go/Gi期での環状−ジ−GMPが誘導する細胞周期停止を含んでもよい。さらに、環状ジ−GMPの添加は、免疫ブロッティングにより分析されるように、サイクリンA、サイクリンD1およびサイクリンEの細胞レベルを抑制してもよい。対照的に、環状−ジ−GMPの添加は、Cdk阻害剤(p21、p27、p57およびp53)の発現を増大してもよい。
提案された実験を行うに当たっての困難は予期されない。同様に、細胞周期進行もしくはアポトーシスにおける環状−ジ−GMPが誘導する変化についてのアッセイが一般的に用いられる。大腸癌細胞における細胞周期停止への環状ジヌクレオチドの作用を測定するために用いられてもよい別のアプローチは、インビトロCdkキナーゼ活性アッセイを行うことである(Panら,2002)。このアッセイにおいて、環状−ジ−GMPが直接Cdkを阻害するか否かが測定できる。アポトーシスアッセイのための代替的アプローチとして、FITC−標識アネキシンVおよびヨウ化プロピジウム(PI)染色の組み合わせを用いて、非アポトーシスの生細胞、早期アポトーシス細胞、および後期アポトーシスもしくはネクローシス細胞を同定してもよい。対照細胞に対する環状−ジ−GMP−処理細胞の、赤色(PI取り込み)から緑色(FITC)の蛍光を区別するフローサイトメトリー分析は、アポトーシスに対する剤の作用を評価するための別の機序を提供する。(アポトーシス細胞を定義する)アネキシンVposおよびPInegのパーセンテージを用いて、環状−ジ−GMPが誘導するアポトーシスについての用量応答および経時変化を測定する。
アゾキシメタン(AOM)齧歯類大腸癌モデルにおける新生物変化を阻害するための環状ジヌクレオチドの効力の測定
実施例1における結果は、環状−ジ−GMPがインビトロで大腸癌細胞の増殖を阻害することを示す。大腸の異常増殖の進行を予防もしくは阻害するための環状−ジ−GMPの使用可能性を調べるための本実施例において、大腸癌の確立された齧歯類モデルである、AOMが誘導する上皮内異常増殖−異常腺窩巣(ACF)およびβ−カテニンが蓄積する腺窩(BCAC)の発達を用いる。ACF単独では前癌病変を示すのに不十分であり得るので(Paulsenら,2001;およびYamadaら,2003)、BCACも大腸発癌の初期段階を示すために用いる(Yamadaら,2000および2003;およびTakahashiら,2000)。癌誘発剤(AOM)、次いで、経口環状−ジ−GMPおよびビヒクルを用いてA/Jマウスを処置した後、(a)ACFおよびBCACの発達における減少により測定される環状−ジ−GMPの抗−新生物作用、ならびに(b)環状ジヌクレオチドでの処置が、細胞増殖(5−ブロモ−2’−デオキシウリジン(BrdUrd)標識)および/またはアポトーシス(ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ介在ニック末端標識アッセイ(TUNEL))の一般的な組織学的指標を変化させるかどうかを測定する。容易に入手可能なこの系統(Jackson Labs)は、AOMが誘導する発癌に対して非常に感受性であるために(Papanikolaouら,1998;およびBoivinら,2003)、A/Jマウスをこれらの研究のために選択した。
AOMは、上皮内異常増殖もしくは明らかな腫瘍の発達が評価できる前にマウスに悪影響を与えるかもしれない毒性物質である。血液レベルが100μMに達することに基づき、経口環状−ジ−GMPの適切な開始用量を算出した。これは、インビトロでの有効濃度の2倍である。算出は、環状ジヌクレオチドの推定される経口バイオアベイラビリティに応じて異なる。試験物質を食品へ添加する際に付随する、経口用量の送達における不確実性を回避するために、経口胃カニューレを用いて、毎朝(月曜〜金曜)、環状−ジ−GMPを送達する。環状−ジ−GMPが100%のバイオアベイラビリティであれば、100μMの血液レベルに達するために、30gの動物に相当する経口用量は2.2mgである。マウスにおいて毒性を惹起することなく異常増殖を軽減するのに十分な環状−ジ−GMPの経口投与量を決定するために、本発明者らは、用量範囲研究を提案し、25、50および100%のバイオアベイラビリティを説明する。従って、少数の動物(10/研究群)を用いる4週間のパイロット研究において、PBS中に新たに溶解した、30gの体重のマウス、1日あたり、0、2.2、4.4および8.8mgの経口環状−ジ−GMPと併用される10mg/kgのAOMの効果を調べる。測定されるべき毒性のパラメーターは、体重、外見、直腸出血および生存を含む。4週間後、最後の環状−ジ−GMP投与の2時間後に、動物を屠殺する。摘除した大腸を、異常増殖(ACFおよびBCAC)の組織学的徴候について調べる。また、動物を屠殺する場合、環状−ジ−GMPレベルを測定するために血液を採取する。
発癌物質で処置した齧歯類において、ACFおよびBCACは、肉眼で特定できる最も初期の新生物病変である(Paulsenら,2001;Yamadaら,2000および2003;Boivinら,2003;およびBird,1987)。マウスにおいて、BCACは、ACFよりも信頼性のある異常増殖の指標である(Paulsenら,2001;およびYamadaら,2000および2003)。本明細書中のこれらの研究が異常増殖の有効な組織学的マーカーを確実に利用できるために、摘除した大腸をACFおよびBCACの両方について調べる。初めの一連の実験は、AOMおよび環状−ジ−GMPで短期処置した後のマウスと比較した場合に、ACFおよびBCACの発達に差異があるか否かを測定する。異常増殖の発達に対して領域特異的効果があるか否かを測定するために、これらの分析および長期研究のために提案されたものについて、小腸、近位1/2の大腸および遠位1/2の大腸を別々に評価および検討する。
短期研究
2週間の順化期間の後、標準的な市販の食飼を自由に摂取させた1〜2月齢のA/Jマウスを、AOM[10mg/kg、腹腔内、1週間の間隔をあけて2回]を用いて処置し、およびビヒクル[0.1mlのリン酸バッファー生理的食塩水(PBS)]もしくは環状−ジ−GMPのいずれかを月曜〜金曜まで毎日投与(合計=10日)する。点滴1時間前に、AOMを新鮮なPBS中に溶解する。AOMの提案される用量は、齧歯類における先の大腸癌研究(Ochiaiら,2001;Birdら,1987および1997)、および上記のような環状−ジ−GMPのものから選択した(環状−ジ−GMP用量は、用量範囲実験の結果に基づいて変更されてもよいことに留意すること)。2週間の処置期間から4週間後、CO2窒息によりマウスを安楽死させ、次いで、大腸を摘除し、次いで、10%のホルマリン中に固定する。固定した組織を、組織学的実験のために染色する(ACF用に0.25%のメチレンブルーおよびBCAC用にアビジン−ビオチン免疫ペルオキシダーゼ法)。動物の数は以下に記載の算出により決定したが、AOMもしくは環状−ジ−GMPの毒性が早死をもたらすならば、用量範囲研究に基づいて、その数を増大してもよい。
2週間の順化の後、1〜2月齢のマウスを、AOM(10mg/kg、腹腔内、注入ごとに1週間の間隔をあけて8回)を用いて処置し、およびビヒクル(PBS)もしくは環状−ジ−GMP(8週間の間、月曜〜金曜までの毎日)のいずれかを投与する。マウスが肛門出血を発症した場合か、または大腸癌の明らかな証拠を発症しないならば初めのAOM注入から25週間後に、マウスを屠殺する。エンドポイントは、このマウス大腸癌モデルを用いた以前の研究(Papanikolaouら,1998)に基づいて選択した。安楽死の2時間前に、マウスにBrdUrd(50mg/kg体重、腹腔内)を投与し、S期細胞を標識する(Waliら,2002)。安楽死させた後、腸を切除し、次いで、短期研究について記載したように処理し、縦方向に切断し、次いで、紙上に横たえ、肉眼的病変をカウントする。処置期間にわたって同じエンドポイントを用いて、摘除した大腸において、ウェスタンおよびノーザンブロットならびにリアルタイムPCRにより、細胞増殖およびアポトーシスに関連する選択された遺伝子の活性化および発現を測定する。
ここで提案する全研究における1群あたりのマウスの数は、0.8の統計的検出能(0.20の□エラーおよび<0.05の□エラー)に基づいて結果の再現性を確実にするために必要とされる数の試料サイズ算出に基づく。AOMおよび環状−ジ−GMPを用いたマウスの短期および長期処置の効果を比較するために、各マウスにおけるACF、BCACおよび腫瘍の数を結果の判定として用いる。AOMおよびビヒクル(PBS)で処置したマウスを、AOMおよび環状−ジ−GMPで処置したマウスと比較する。この比較についてのACFおよびBCACの数の平均の差異を、対応のないt−検定を用いて測定する。等しい分散を仮定して、1群あたり20匹のマウスを用いて、0.05の(片側)有意レベルで大きな差異(エフェクトサイズ0.8)を検出する約80%の検出能が提供される(Cohen,1988)。例えば、AOMで処置したマウスにおけるACFの数の平均が36.4(SD=2.4)であるならば(Papanikolaouら,1998)、AOMおよび環状−ジ−GMPで処置したマウスにおけるACFの平均数において12%の減少を検出する80%の検出能を有し得る。これらの算出は、最高10%の動物が(麻酔、毒性もしくは予期せぬ原因により)未熟に死亡してもよいことを考慮している。AOMで処置したマウスにおけるBCACの発達について、限られた公開データがある(Yamadaら,2000および2003;ならびにTakahashiら,2000)。上記したように、DCTを用いる提案された用量範囲研究により、研究群の動物の数が変更されてもよい。
動物モデルの選択
AOMは、齧歯類においてACF、BCACおよび大腸癌を確実に誘導する合成アルキル化剤および発癌物質である(Papanikolaouら,1998;Ochiaiら,2001;およびYamadaら,2003)。AOM齧歯類モデルは、ヒト大腸癌において観察される病理学的および遺伝学的変化を模倣する(Kinzlerら,1996;Wangら,1998;およびGudaら,2001)。環状−ジ−GMPでの処置が、AOMが誘導するACF、BCAC(短期研究)および大腸腫瘍(長期研究)の発達に作用するか否かが測定できるので、マウス大腸癌モデルは特に有用である。細胞増殖およびアポトーシスに関連する遺伝子の発現も調べる。
IACUCに認可された麻酔剤(ケタミン/キシロシン(xylosine))を投与した後、標準的技法を用いて大腸を切除し、次いで、氷冷PBSを管腔に流し、糞便を除去する。大腸を縦方向に切断し、次いで、顕微鏡用スライド上にセットし、粘膜にスライドアップし、次いで、中和した10%のホルマリン中で1時間固定し、次いで、70%のエタノール中、−20℃で貯蔵する。全スライドに固定したマウス大腸組織を、0.25%のメチレンブルーを用いて30秒間染色し、冷PBSを用いて脱染し、次いで、解剖顕微鏡(Zeiss Stemi DV−4)を20〜40×の倍率で用いて透視することによりACFについて調べる。本出願については、ACFを、「メチレンブルーでより強く染まる上皮細胞の肥厚層を有し、多くの場合、スリット状の管腔開口部を有し、さらなる腺窩周囲空間を有し、および顕微鏡の焦点面から隆起している、その領域にあるほとんどの腺窩よりも大きな1またはそれ以上の腺窩」と定義する(Boivinら,2003)。ACFについて評価した後、組織をPBSで脱染し、次いで、標準的な技法を用いてβ−カテニンについての免疫組織化学により、BCACを同定する(Waliら,2002;Paulsenら,2001;およびTakahashiら,2000)。簡潔に言うと、パラフィン包埋したホルマリン固定セクションを、脱パラフィンし、再水和し、次いで、クエン酸バッファー中、マイクロ波により、抗原回復を行う(Waliら,2002;およびTakahashiら,2000)。モノクローナルβ−カテニン抗体(Transduction Laboratories)、ヤギ抗マウス抗体および染色キットは市販されている。ACFの数、ACF中の異常な腺窩の総数およびBCACの数を、各マウスに由来する大腸の近位および遠位の半分ずつならびに小腸においてカウントする。スライドを評価する研究者は、処置(すなわち、対照もしくは環状−ジ−GMP)について知らされていない。
増殖の指標として、屠殺2時間前に、マウスにBrdUrd(50mg/kg)の腹腔内注入をし、S期細胞を標識する。抗−BrdUrd(Sigmaキット)を用いて免疫染色した後、1000個の細胞中のBrdUrd−陽性の核の数をカウントすることにより、BrdUrd−標識を測定する(データはBrdUrd陽性のパーセントとして示される)(Waliら,2002)。これらの分析では、研究者は処置(すなわち、PBSもしくは環状−ジ−GMP)について知らされていない。アポトーシスの指標として、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ介在ニック末端標識アッセイ(TUNEL,Intergen)を用いることが提案される。BrdUrdおよびTUNEL標識では、粘膜筋層から大腸管腔に及ぶ完全な腺窩のみがカウントされる(Waliら,2002)。
動物の体重を毎週測定する。生存を、処置開始(2週目)から27週目までの日において測定し、次いで、カプラン・マイヤー法により分析する。
腺腫および腺癌の組織学的定義は、コンセンサスリコメンデーション(Mouse Models of Human Cancers Consortium ;Boivinら,2003)に準拠する。腫瘍の数を、各マウスに由来する大腸においてカウントする。肉眼で見える腫瘍を摘除し、次いで、二分する。腫瘍の半分を、室温で一晩、中和した10%のホルマリン中に固定し、次いで、標準的技法により組織学用に処理する。他の半分は、70%のエタノール中に固定し、次いで、蛋白質およびRNAを抽出する。腫瘍が肉眼的に検出されない場合、0.25%のメチレンブルーを用いて組織を染色し、次いで、低倍率で調べる(Ochiaiら,2001)。
AOMマウス大腸癌モデルを用いて、提案される実験では、腺腫、腺癌および隣接する「正常」組織において、細胞増殖に関与することが知られている遺伝子発現を比較する。特に、この一連の実験において、ウェスタンブロッティングを用いて蛋白質を調べ、ならびにノーザンブロッティングおよびリアルタイム−PCRを用いて、細胞増殖の調節に関与することが知られているp90RSKおよび下記の選択されたp90RSK活性化の遺伝子標的(Frodinら,1999):cAMP応答エレメント結合蛋白質(CREB)(Gintyら,1994;およびXingら,1996);NF−κB(Ghodaら,1997;およびSchoutenら,1997);およびc−Fos(Xingら,1996)についてのmRNAを調べる。適切な抗体が入手できるならば、脱パラフィンした組織ブロックについて免疫組織化学を用いる。
先の技法の限られた出発物質、結果のより大きな直線性(銀粒子は飽和し、およびはるかに狭い直線範囲を有する)およびより大きな感受性を考慮すると、多くの点で、定量的リアルタイムRT−PCRはノーザンブロッティングより好ましい。ゲノムDNAを混入することによる増幅を防ぐために、フォワードおよびリバースプライマーを異なるエキソンに配置する。得られた物質を標準化するために、TaqmanリボソームRNAコントロール用試薬(VIC−標識;Applied Biosystems,Inc.)を用いる。定量的RT−PCRをTaqManリアルタイムPCR装置で行う。エキソン−エキソン境界の情報は、SangerCenterから得る。RNA配列およびエキソン−エキソン境界の情報を、定量的PCRプライマーデザインソフトウェアに入力する。許容されるプライマーおよびプローブセットは、製造元の推奨条件内(プライマーのTm,58〜60℃;プローブのTm,プライマーのものより10℃以上高いもの)で探索する。5’−末端のレポーターとしてFAMを用いて、および3’−末端のクエンチャーとしてTAMRAもしくはBH1を用いて、プローブを標識する。
細胞増殖の減少(細胞周期停止)、アポトーシスの増大またはその両方のために、大腸腫瘍形成の阻害が生じてもよい。補足的アプローチを用いて、環状−ジ−GMPが、AOMマウス大腸癌モデルにおいてアポトーシスを増大するか否かを測定する。DNA鎖切断を有する細胞が、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ介在ニック末端標識(TUNEL;Apoptagキット,Intergen)により、摘除した大腸において同定される。カスパーゼ、特にカスパーゼ−3は、アポトーシス調節において重要な役割を果たす(Cohen,1997)。カスパーゼ−3の活性化を、市販の抗血清および試薬を用いる標準的免疫組織化学を利用して、脱パラフィンした組織ブロックにおいて調べる(Feldsteinら,2003)。ウェスタンおよびノーザンブロッティングならびにRT−PCRを用いて、p21およびp53を含むアポトーシスに関連する蛋白質および遺伝子の発現も調べる。
必要に応じて様々な方法を用いて、数値データの有意性を決定する。平均間の有意性は、多重比較のためにボンフェローニ補正を行うスチューデントの対応のないt−検定により決定するか、或いは分散分析、次いで、ダネット検定により決定する。ネステッドデザイン用(for Nested design)ANOVAを用いて、BrdUrd標識に対する処置効果を調べる。チューキーの方法を用いて、多重比較に適合させる。ノンパラメトリッククラスカル−ワリス検定を用いて、正規分布していない変数(例えば、群間のACF、BCACおよび腫瘍の数の比較)を分析する。ウェスタンおよびノーザンブロットならびに他の数以外のデータを少なくとも3回繰り返して行い、結果の再現性を検証する。蛋白質または遺伝子発現レベルにおける変化の定量化のために、ブロットの密度測定を行い、次いで、スチューデントの対応のないt−検定により比較する。<0.05のP値は、有意であると見なされる。
環状−ジ−GMPを用いたこれらの提案される用量範囲研究(D.2.a.iを参照のこと)は、毒性を伴うことなく新生物病変の数を軽減する最も適切な用量を決定できる。
Berquin IM, Pang, B. , Dziubinski, M. L. , Scott, L. M., Chen, Y. Q. , Nolan, G. P. , Ethier, S. P. Y-box-binding protein 1 confers EGF independence to human mammary epthelial cells.Oncogene (Feb 21, 2005)
Claims (4)
- 癌細胞の増殖を阻害するための、または癌細胞のアポトーシスを増大させるための医薬の調製における、環状ジ−GMPの使用。
- 増殖が阻害されるかまたはアポトーシスが増大される癌細胞が大腸癌細胞である、請求項1記載の使用。
- 増殖が阻害されるかまたはアポトーシスが増大される癌細胞が、膵臓、乳房、肺、脳、前立腺、扁平細胞、リンパ球および白血球に由来する癌細胞からなる群より選択される、請求項1記載の使用。
- 癌細胞の増殖を阻害するための、または癌細胞のアポトーシスを増大させるための医薬組成物であって、環状ジ−GMPおよび医薬上許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤を含む、医薬組成物。
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