KR20150095668A

KR20150095668A - 규정된 입체화학을 갖는 환식 퓨린 다이뉴클레오타이드를 포함하는 조성물, 그리고 이의 제조 방법 및 용도

Info

Publication number: KR20150095668A
Application number: KR1020157015489A
Authority: KR
Inventors: 주니어 토마스 더블유. 두벤스키; 데이비드 비. 캔; 메레디스 라이 링 레옹; 에드워드 에밀 레멘스; 로라 힉스 글릭먼
Original assignee: 아두로 바이오테크, 인코포레이티드
Priority date: 2012-12-13
Filing date: 2013-12-13
Publication date: 2015-08-21
Also published as: AU2018203682B2; EP2931738B1; JP2016503029A; SG10201704611WA; EA201590396A1; AU2013358892B2; SI2931738T1; BR112015013440A2; AU2013358892A1; PL2931738T3; WO2014093936A1; US9695212B2; US10414789B2; SG11201502796RA; US20170283454A1; JP6333843B2; BR112015013440B1; CN105008381A; NZ707561A; HUE043262T2

Abstract

본 발명의 목적은 STING(인터페론 유전자의 자극물질)으로서 공지된 최근에 개발된 세포질 수용체를 통해 DC를 활성화하는 신규하고 높은 활성의 환식-다이-뉴클레오타이드(CDN) 면역 자극물질을 제공하는 것이다. 특히, 본 발명의 CDN은 STING-의존적 TBK1 활성화를 유도하는 1종 이상의 환식 퓨린 다이뉴클레오타이드를 포함하는 조성물의 형태로 제공되고, 조성물에 존재하는 환식 퓨린 다이뉴클로타이드는 실질적으로 순수한 Rp,Rp 또는 Rp,Sp 입체입체이성질체, 특히 실질적으로 순수한 Rp,Rp 또는 RpSp CDN 티오포스페이트 부분입체이성체이다.

Description

규정된 입체화학을 갖는 환식 퓨린 다이뉴클레오타이드를 포함하는 조성물, 그리고 이의 제조 방법 및 용도{COMPOSITIONS COMPRISING CYCLIC PURINE DINUCLEOTIDES HAVING DEFINED STEREOCHEMISTRIES AND METHODS FOR THEIR PREPARATION AND USE}

본원은 미국 가출원 제61/737,006호(2012년 12월 13일에 출원) 및 미국 가출원 61/790,514호(2013년 3월 15일에 출원)(모든 표, 도면 및 특허청구범위를 포함하여 이들 각각은 본 명세서에 그 전문이 포함됨)에 대한 우선권을 주장한다.

본 발명의 배경기술의 하기 설명은 독자가 본 발명을 이해하는 것을 돕도록 단지 제공되고, 본 발명에 대한 선행 기술을 기술하거나 구성하는 것으로 인정되지 않는다.

인간 면역계는 일반적으로 "선천성 면역" 및 "적응 면역"이라 칭하는 2개 암(arm)으로 분할될 수 있다. 면역계의 선천성 암은 보체 시스템 및 케모카인/사이토카인 시스템; 및 비만 세포, 대식세포, 수지상 세포(dendritic cell: DC) 및 천연 살해 세포를 포함하는 다수의 특수 세포 유형을 포함하는 다수의 가용성 인자를 통해 초기 염증 반응을 주로 담당한다. 반대로, 적응 면역 암은 항원에 대한 면역학적 기억에서 중요한 역할을 하는 CD8+ 및 CD4+ T 세포 반응과 함께 지연된 및 더 오래 지속하는 항체 반응을 포함한다. 면역계의 제3 암은 γδ T 세포 및 제한된 T 세포 수용체 레퍼토리를 갖는 T 세포, 예컨대 NKT 세포 및 MAIT 세포를 포함하는 것으로 확인될 수 있다.

항원에 대한 효과적인 면역 반응을 위해, 항원 제시 세포(antigen presenting cell: APC)는 항원을 처리하고 적절한 MHC 상황에서 항원을 T 세포에 나타내어야 하고, 이후 이 세포는 세포독성 및 보조 T 세포의 T 세포 자극을 발생시킬 것이다. 항원 제시 후, APC와 T 세포 둘 다에 대한 공동자극 분자의 성공적인 상호작용이 일어나야 하거나 활성화가 중단될 것이다. GM-CSF 및 IL-12는 많은 종양 모델에서 효과적인 전염증성 분자로서 작용한다. T 세포의 활성화에 필요한 효과적인 항원 제시 세포에 대한 이의 성숙을 활성화하는 데 추가의 신호가 필요하지만, 예를 들어 GM-CSF는 골수성 전구체 세포를 증식시키고 수지상 세포(DC)로 분화하도록 유도한다. 효과적인 면역 치료에 대한 장벽은 표적화된 항원에 대한 관용성을 포함하고, 이것은 적절한 규모 및 기능의 세포독성 CD8 T 세포의 유도, 악성 세포의 부위로의 생성된 T 세포의 불량한 통행(trafficking) 및 유도된 T 세포 반응의 불량한 지속성을 제한할 수 있다.

종양 세포 잔해를 식세포 작용시키는 DC는 주조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex: MHC) 제시에 대해 물질을 처리하고, 공동자극 분자의 발현을 상향조절하고, 국소 림프절로 이동하여 종양 특이적 림프구를 자극한다. 이 경로는 종양 관련 항원에 반응하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 증식 및 활성화를 발생시킨다. 실제로, 이러한 세포는 환자의 혈액, 림프 조직 및 악성 병변에서 흔히 검출될 수 있다.

면역 관문(checkpoint) 저해제 또는 다른 치료와의 조합을 통해 치료학적 백신접종의 효력을 - 직접적으로 또는 간접적으로 - 강화시키는 조합 치료 섭생과 함께 면역-회피에 기반하는 기전에 대한 새로운 통찰은 효과적인 항종양 면역을 유도하는 백신의 개발을 위한 기초로서 작용한다. CDN 환식-다이-AMP(리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)에 의해 생산됨) 및 이의 유사체 환식-다이-GMP(레지오넬라 뉴모필라에 의해 생산됨)는 STING로서 공지된 PRR(병원균 인식 수용체(Pathogen Recognition Receptor))에 결합하는 PAMP(병원균 관련 분자 패턴(Pathogen Associated Molecular Pattern))로서 숙주 세포에 의해 인식된다. STING는, IFN-β 및 선천성 면역을 강하게 활성화는 다른 IRF-3 의존적 유전자 생성물을 유도시키는, TANK 결합 키나제(TANK binding kinase: TBK1)-IRF3 신호전달 축을 활성화하는 숙주 포유동물 세포의 세포질에서의 어답터 단백질이다. STING는 세포내 병원균에 의한 감염을 감지하고 반응하여 IFN-β의 생성을 유도하여, 항원 특이적 CD4 세포와 CD8 T 세포 둘 다, 및 병원균 특이적 항체로 이루어진 적응 보호 병원균 특이적 면역 반응을 발생시키는, 숙주 시토졸 감시 경로의 성분인 것으로 현재 인식된다. 환식 퓨린 다이뉴클레오타이드의 예는 예를 들어 미국 특허 제7,709458호 및 제7,592,326호; 제WO2007/054279호; 및 문헌[Yan et al., Bioorg. Med. Chem Lett. 18: 5631 (2008)](이들 각각은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)에 약간 자세히 기재되어 있다.

전통적인 치료학적 접근법에 다루기 힘들 수 있는 암과 같은 질병을 치료하기 위한 면역학적 전략을 위한 개선된 조성물 및 방법에 대한 수요가 여전하다.

본 발명의 목적은 STING(인터페론 유전자의 자극물질(Stimulator of Interferon Gene))로서 공지된 최근에 개발된 세포질 수용체를 통해 DC를 활성화하는 신규하고 높은 활성의 환식-다이-뉴클레오타이드(cyclic-di-nucleotide: CDN) 면역 자극물질을 제공하는 것이다. 특히, 본 발명의 CDN은 STING-의존적 TBK1 활성화를 유도하는 1종 이상의 환식 퓨린 다이뉴클레오타이드를 포함하는 조성물의 형태로 제공되고, 조성물에 존재하는 환식 퓨린 다이뉴클로타이드는 실질적으로 순수한 Rp,Rp 또는 Rp,Sp 입체입체이성질체, 특히 실질적으로 순수한 Rp,Rp 또는 RpSp CDN 티오포스페이트 부분입체이성체이다.

제1 양상에서, 본 발명은 1종 이상의 환식 퓨린 다이뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 제공하고, 조성물에 존재하는 환식 퓨린 다이뉴클로타이드는 실질적으로 순수한 Rp,Rp 또는 Rp,Sp 부분입체이성체, 또는 이의 프로드럭 또는 약제학적으로 허용되는 염이다. STING-의존적 TBK1 활성화를 유도하는 이 조성물은 1종 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있고, 본 명세서에 기재된 애주번트로서의 이의 용도가 발견될 수 있다. 하기 기재된 바와 같은 환식 퓨린 다이뉴클레오타이드의 티오포스페이트 유도체가 특히 바람직하다.

애주번트로서의 이의 역할에서, 소정의 실시형태에서 본 조성물은 백신(들)을 사용하는 치료학적 또는 예방학적 전략에서 애주번트로서 사용될 수 있다. 따라서, 실질적으로 순수한 Rp,Rp 또는 Rp,Sp 부분입체이성체, 또는 이의 프로드럭 또는 약제학적으로 허용되는 염은 1종 이상의 미리 결정된 항원에 대한 면역 반응을 자극하도록 선택된 1종 이상의 백신과 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 실질적으로 순수한 Rp,Rp 또는 Rp,Sp 부분입체이성체, 또는 이의 프로드럭 또는 약제학적으로 허용되는 염은 이러한 백신과 함께 또는 이것 이외에 제공될 수 있다.

이러한 백신(들)은 관심 대상 항원을 포함하는 불활화된 또는 약독화된 박테리아 또는 바이러스, 정제된 항원, 항원을 발현하고/하거나 분비하도록 재조합으로 조작된 생 바이러스 또는 박테리아 전달 벡터, 항원이 장입되거나 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물로 형질감염된 세포를 포함하는 항원 제시 세포(APC) 벡터, 리포솜 항원 전달 비히클 또는 항원을 코딩하는 네이키드 핵산 벡터를 포함할 수 있다. 이 목록은 제한인 것으로 의도되지 않는다. 예의 방식으로, 이러한 백신(들)은 GM-CSF, CCL20, CCL3, IL-12p70, FLT-3 리간드 중 1종 이상을 발현하고 분비하는 불활화된 종양 세포를 또한 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 애주번트 및 비히클을 포함하는 제제에서 다양한 장관외(즉, 비경구적) 및 비장관외 경로에 의해 이를 필요로 하는 개체에게 투여될 수 있다. 바람직한 경로는 장관외이고, 피하, 정맥내, 근육내, 동맥내, 진피내, 척추강내 및 경막외 투여 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 피하 투여에 의한 투여가 특히 바람직하다. 바람직한 약제학적 조성물은 수성 또는 수중유 에멀션으로서 제형화된다.

본 발명의 조성물은 하나 이상의 추가의 약제학적 활성 성분, 예컨대 애주번트, 지질, 예컨대 디기토닌, 리포솜, CTLA-4 및 PD-1 경로 길항제, PD-1 경로 차단제, 선천성 면역을 유도하는 불활화된 박테리아(예를 들어, 불활화된 또는 약독화된 리스테리아 모노사이토게네스), 톨 유사 수용체(Toll-like Receptor: TLR), (NOD) 유사 수용체((NOD)-like receptor: NLR), 레티노산 유도성 유전자-기반(RIG)-I 유사 수용체(Retinoic acid inducible gene-based (RIG)-I-like receptor: RLR), C형 렉틴 수용체(C-type lectin receptor: CLR)를 통해 선천성 면역 활성화를 매개하는 조성물, 병원균 관련 분자 패턴("PAMP"), 화학치료제 등을 포함할 수 있거나 이들과 함께 투여될 수 있다.

하기 기재된 바대로, 1종 이상의 지질과 제형화된 환식 퓨린 다이뉴클로타이드는 개선된 수지상 세포 활성화 활성을 포함하는 개선된 특성을 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 1종 이상의 CDN 및 1종 이상의 지질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 소정의 바람직한 실시형태에서, 1종 이상의 CDN은 디기토닌, 리포솜 제제 및/또는 수중유 에멀션과 제형화된다. 청구항 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 조성물은 CTLA-4 길항제 및 TLR-4 효현제 중 1종 이상을 더 포함한다.

바람직한 실시형태에서, 1종 이상의 티오포스페이트 환식 퓨린 다이뉴클레오타이드는 c-다이-AMP 티오포스페이트, c-다이-GMP 티오포스페이트, c-다이-IMP 티오포스페이트, c-AMP-GMP 티오포스페이트, c-AMP-IMP 티오포스페이트 및 c-GMP-IMP 티오포스페이트 또는 이들의 조합(이들의 프로드럭 및 약제학적으로 허용되는 염 포함)으로 이루어진 군으로부터 선택된 실질적으로 순수한 Rp,Rp 또는 Rp,Sp 티오포스페이트 부분입체이성체를 포함한다.

관련 양상에서, 본 발명은 개체에서 면역 반응을 유도하거나 자극하거나 보조하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 1종 이상의 환식 퓨린 다이뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하되, 조성물에 존재하는 티오포스페이트 환식 퓨린 다이뉴클로타이드는 실질적으로 순수한 Rp,Rp 또는 Rp,Sp 부분입체이성체 또는 이의 프로드럭 또는 개체에 대한 약제학적으로 허용되는 염이다. 바람직한 투여 경로는 장관외이다. 상기 기재된 바대로, 이러한 환식 퓨린 다이뉴클레오타이드의 티오포스페이트 유도체가 특히 바람직하다.

소정의 실시형태에서, 상기 방법은 암의 치료 방법이다. 예의 방식으로, 본 발명의 실질적으로 순수한 Rp,Rp 또는 Rp,Sp 부분입체이성체, 또는 이의 프로드럭 또는 약제학적으로 허용되는 염은 당해 분야에 공지된 1종 이상의 암 백신 조성물과 함께 또는 이것 이외에 제공될 수 있다. 이러한 치료를 받는 환자는 결장직장 암 세포, 기관 식도 편평 암, 폐암, 뇌암, 간암, 위암, 육종, 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 난소암, 자궁암, 유방암, 흑색종, 전립선암, 췌장 암종 및 신장 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 겪을 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은 병원균에 대한 면역 반응을 유도하거나 자극하거나 보조하는 방법이다.

또 다른 관련 양상에서, 본 발명은 STING에 결합하는 1종 이상의 환식 퓨린 다이뉴클레오타이드를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 STING-의존적 TBK1 활성화를 유도하는 방법에 관한 것이고, 조성물에 존재하는 환식 퓨린 다이뉴클로타이드는 실질적으로 순수한 Rp,Rp 또는 Rp,Sp 부분입체이성체 또는 이의 프로드럭 또는 개체에 대한 약제학적으로 허용되는 염이다. 바람직한 투여 경로는 장관외이다. 상기 기재된 바대로, 이러한 환식 퓨린 다이뉴클레오타이드의 티오포스페이트 유도체가 특히 바람직하다.

본 명세서에 기재된 방법은 암 항원을 발현하는 암 세포를 제거하거나 사멸하기 위한 포유동물에 투여되는 일차 치료 전에 또는 후에 본 발명의 유효량의 실질적으로 순수한 CDN 또는 이의 프로드럭 또는 약제학적으로 허용되는 염을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 수술전 항암(neoadjuvant) 치료로서 제공될 수 있지만; 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 일차 치료 후에 투여된다. 다양한 실시형태에서, 일차 치료는 포유동물로부터 암 세포를 제거하는 수술, 포유동물에서 암 세포를 사멸하는 방사선 치료, 또는 수술과 방사선 치료 둘 다를 포함한다.

다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 Th2 면역에 대한 Th1 면역의 이동이 임상적 이익을 부여하는 장애의 치료를 위해 본 발명의 유효량의 실질적으로 순수한 CDN을 포유동물에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 세포 매개 면역(Cell-mediated immunity: CMI)은 사이토카인 IL-2, 인터페론(IFN)-γ 및 종양 괴사 인자(TNF)-α를 생성하는 TH1 CD4+ T 림프구와 관련된다. 반대로, 체액성 면역은 IL-4, IL-6 및 IL-10을 생성하는 TH2 CD4+ T 림프구와 관련된다. TH1 반응에 대한 면역 편차는 통상적으로 세포독성 T 세포 림프구(CTL), 천연 살해(NK) 세포, 대식세포 및 단핵구의 활성화를 생성한다. 일반적으로, Th1 반응은 세포내 병원균(숙주 세포 내에 있는 바이러스 및 박테리아) 및 종양에 더 효과적이지만, Th2 반응은 유충 및 독소를 포함하는 세포외 박테리아, 기생충에 더 효과적이다. 또한, 선천성 면역의 활성화는 T 보조 1형 및 2형(Th1/Th2) 면역계 균형을 정상화하고 면역글로불린(Ig) E 의존적 알레르기 및 알레르기 천식을 발생시키는 Th2 유형 반응의 과도한 반응을 억제하는 것으로 예상된다.

도 1은 CDN의 일반 구조를 도시한 도면;
도 2는 c-다이-GMP(화합물 11A) 및 c-다이-AMP(화합물 10A)의 구조를 도시한 도면;
도 3은 Rp,Rp-c-다이-GMP-티오포스페이트(화합물 11B) 및 Rp,Rp-c-다이-AMP-티오포스페이트(화합물 10B)의 구조를 도시한 도면;
도 4는 Rp,Sp-c-다이-GMP-티오포스페이트(화합물 11C) 및 Rp,Sp-c-다이-AMP-티오포스페이트(화합물 10C)의 구조를 도시한 도면;
도 5는 Sp,Sp-c-다이-GMP-티오포스페이트 및 Sp,Sp-c-다이-AMP-티오포스페이트의 구조를 도시한 도면;
도 6은 c-다이-AMP 및 c-다이-AMP-티오포스페이트에 대한 합성 반응식을 도시한 도면;
도 7은 모 CDN 및 상응하는 다이티오 유도체 분자의 부분입체이성질체에 의한 항원 제시 세포에서의 IFN-β 유도를 도시한 도면;
도 8은 뱀독 포스포다이에스테라제에 의한 치료 후 CDN 부분입체이성질체에 의한 항원 제시 세포에서의 IFN-β 유도를 도시한 도면;
도 9는 CDN 치료와 조합되어 백신접종 후 10일에 PBMC에서 측정된 OVA 특이적 CD4 및 CD8 T 세포 반응을 도시한 도면;
도 10은 CDN 치료와 조합되어 백신접종 후 PBMC에서 측정된 SIVgag 특이적 CD4 및 CD8 T 세포 반응을 도시한 도면;
도 11은 리스테리아-OVA 시험감염 쥣과 모델에서 CDN에 의해 유도된 보호를 도시한 도면;
도 12는 쥣과 전립선암 모델에서 GVAX로 제형화된 CDN에 의해 유도된 항종양 효율을 도시한 도면;
도 13은 본 발명의 CDN의 2'-O-치환기 프로드럭 유사체를 도시한 도면;
도 14는 본 발명의 CDN의 O- 또는 S-치환기 프로드럭 유사체의 합성을 도시한 도면;
도 15는 c-다이-GMP의 모노-2'-O-미리스토일 c-다이-GMP 프로드럭 형태의 투여 후 인간 단구성 세포주에서의 IFN-β 유도를 도시한 도면;
도 16은 c-다이-GMP의 모노-2'-O-미리스토일 c-다이-GMP 프로드럭 형태에 의한 백신접종 후 OVA 특이적 CD8 T 세포 반응을 도시한 도면.

본 발명은 최근에 개발된 STING(인터페론 유전자의 자극물질)로서 공지된 세포질 수용체를 통해 DC를 자극하는 신규하고 매우 활성인 환식-다이-뉴클레오타이드(CDN) 면역 자극물질의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 CDN은 STING-의존적 TBK1 활성화를 유도하는 1종 이상의 환식 퓨린 다이뉴클레오타이드를 포함하는 조성물의 형태로 제공되고, 조성물에 존재하는 환식 퓨린 다이뉴클로타이드는 실질적으로 순수한 Rp,Rp 또는 Rp,Sp 입체입체이성질체, 특히 실질적으로 순수한 Rp,Rp 또는 RpSp CDN 티오포스페이트 부분입체이성체이다.

애주번트의 설계 및 개발에 대한 최근의 통찰은 병원균 관련 분자 패턴(PAMP)으로 공지된 보존된 미생물 구조가 숙주 세포 패턴 인식 수용체(PRR)에 의해 감지되어, 하류 신호전달 캐스케이드를 촉발하여 사이토카인 및 케모카인의 유도 및 특이적 적응 면역 반응의 개시를 발생시킨다는 기본적인 이해로 알려져 있다. 어떻게 선천성 면역계가 미생물의 PAMP 보체에 의해 고안되는지는 침입한 병원균이 질병을 야기하는 것에 싸우는데 적절한 적응 반응의 전개를 형성한다. 애주번트 설계의 목적은 원하는 반응을 개시하도록 지정된 PRR 또는 규정된 PAMP에 특이적인 합성 분자를 선택하는 것이다. 애주번트, 예컨대 모노포스포릴 지질 A(MPL) 및 CpG는 MyD88 및 Trif 어답터 분자를 통해 신호전달하고 NF-kB 의존적 전염증성 사이토카인의 유도를 매개하는 막관통 PRR의 종류인 톨 유사 수용체(TLR)에 의해 인식된 PAMP이다. MPL(TLR-4 효현제) 및 CpG(TLR-9 효현제)는 임상적으로 진전된 애주번트이고 FDA에 의해 승인되거나 곧 승인 예정인 백신의 성분이다. 세포 표면(예를 들어, TLR-4) 및 엔도솜(예를 들어, CpG)에 존재하는 TLR이 세포외 및 공포 병원균을 감지하는 반면, 바이러스 및 세포내 박테리아를 포함하는 다수의 병원균의 생산적 성장 주기는 시토졸에서 발생한다. 세포외, 공포 및 시토졸 PRR의 구획화는 선천성 면역계가 시토졸을 모니터링함으로써 병원균 미생물과 비병원균 미생물 사이를 구별한다는 가설을 발생시켰다. 당해 분야의 당업자에게 PRR에 특이적인 효현제가 세포내 병원균에 대한 보호 면역의 전개를 개시하는 시토졸 감시 경로를 포함하고 백신 설계와 관련된다는 것이 명확해야 한다. 이 동일한 표적화 리간드는 종양 특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 필요로 하는 것으로 알려진, 효과적인 백신 표적화 악성종양의 전개에서 또한 필수적일 것이다.

시토졸 감시 경로(Cytosolic Surveillance Pathway: CSP)의 활성화가 세포내 병원균에 대한 보호 면역의 개발에 필수적이다. CSP는 TANK 결합 키나제(TBK-1)/IRF-3 신호전달 축의 활성화 및 IFN-β 및 다른 동시조절된 유전자의 유도를 발생시키는, 박테리아, 바이러스 및 원생동물 병원균을 검출한다. 바이러스 핵산과 박테리아 핵산 둘 다가 이 경로를 활성화하고, IFN-β의 유도는 MyD88이고 Trif 독립적이다. I형 인터페론은 대개 주로 숙주 항바이러스 반응으로 생각되지만, IFN-β의 유도는 리스테리아 모노사이토게네스(Lm)인 세포내 박테리아로 감염된 대식세포에서 시토졸 성장의 특징이다. 마우스 리스테리아증 모델에서의 널리 공지된 이분법은, 야생형 Lm이 박테리아 시험감염에 대해 마우스를 보호하는 강력한 CD4 및 CD8 T 세포 면역을 프라이밍하는 반면, 리스테리올리신 O(LLO) 결실된 Lm에 의한 백신접종은 기능적 T 세포를 유발하지 않거나 보호 면역을 유도하지 않는다는 점이다. 이 차이는 기능적 T 세포 매개 보호 면역을 유발시키도록 숙주 세포 유전자의 발현 및 Lm에 의한 시토졸 접근에 대한 필요요건의 증거이다. 감염된 숙주 세포에서의 IFN-β의 수준은 항생제를 포함하는 구조적으로 비연관된 작은 분자를 분비하는 Lm 다중약물 유출 펌프(multidrug efflux pump: MDR)에 의해 조절된다. IFN-β는 파고라이소솜(phagolysosome)에 국한된 Lm LLO 돌연변이체에 의해 감염된 숙주 세포에서 유도되지 않는다. IFN-β의 정상 수준은 모든 TLR 매개 신호전달에서 결핍된 감염된 MyD88 ^- ^/- Trif ^- ^/- 대식세포에서 유도된다. 이 데이터는 Lm이 야생형 Lm에 의한 감염에 반응하여 TLR을 고용하지만, 숙주 세포 CSP가 IFN-β의 유도와 상관된 보호 면역의 전개에 필요하다는 것을 나타낸다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "환식-다이-뉴클레오타이드"("CDN")는 2개의 퓨린 뉴클레오타이드 사이에 2'-5' 및/또는 3'-5' 포스포다이에스터 연결을 포함하는 분자의 종류를 의미한다. 이것은 2'-5'-2',5', 2'-5'-3'5' 및 3',5'-3',5' 연결을 포함한다. CDN은 2개의 시토졸 PRR, DDX41 및 STING의 직접 결합을 통해 시토졸 감시 경로를 활성화한다. Lm 및 다른 세포내 박테리아에 의한 감염에 대한 I형 인터페론 반응은 c-다이-AMP 또는 이의 관련 환식 다이뉴클레오타이드(CDN), c-다이-GMP의 분비, 및 시토졸 감시 경로의 최근 규정된 수용체인 STING(인터페론 유전자의 자극물질( St imulator of Interferon Gene)) 및 DDX41 및 DEAD(아스파르테이트-글루타메이트-알라닌-아스파르테이트) 박스 헬리카제(helicase)에 대한 이의 직접 결합으로부터 생긴다. CDN은 대부분의 박테리아에 의해 발현된 제2 메신저이고, 바이오필름의 운동성 및 형성을 포함하는 다양한 과정을 조절한다. CDN은 DDX41에 높은 친화도로 결합하고 STING 어답터 단백질과 복합체 형성하여, TBK1/IRF3 신호전달 경로의 활성화, 및 IFN-β 및 선천성 면역을 강하게 활성화하는 다른 IRF-3 의존적 유전자 생성물의 유도를 발생시킨다.

네이티브 CDN 분자는 상기 네이티브 CDN 분자를 함유하는 백신 제제를 차지하는 숙주 세포, 예를 들어 항원 제시 세포에 존재하는 포스포다이에스테라제에 의한 분해에 민감한다. 애주번트가 이의 규정된 PRR 표적에 결합하고 활성화할 수 없으므로, 규정된 애주번트의 효력은 이러한 분해에 의해 감소할 수 있다. 더 낮은 애주번트 효력은 측정된 항원 특이적 면역 반응의 규모에 의해 정의된, 더 약한 백신 효력과 상관된, 예를 들어 선천성 면역의 서명 분자(예를 들어, IFN-β)의 더 적은 양의 유도된 발현에 의해 측정될 수 있다.

본 발명에서, c-다이-AMP 및 c-다이-GMP의 다이티오-다이포스페이트 유도체가 제공된다. c-다이-AMP 및 c-다이-GMP 분자의 상기 다이티오-다이포스페이트 유도체에 대한 합성 공정은 c-다이-AMP 및 c-다이-GMP 분자의 Rp,Rp, Sp,Sp 및 Rp,Sp 다이티오-다이포스페이트 유도체를 포함하는 부분입체이성체의 혼합물을 생성시킨다. c-다이-GMP의 Rp, Rp 및 Rp, Sp 다이티오-다이포스페이트 유도체를 함유하는 부분입체이성체의 상기 혼합물이 비강내 경로에 의해 마우스에 투여될 때 염증성 세포를 기관지폐포 공간으로 동원하고 활성화한다는 것이 이전에 나타났다. 그러나, c-다이-GMP의 이러한 다이티오-다이포스페이트 유도체가 모 c-다이-GMP 분자와 비교하여 면역 반응의 자극과 관련하여 어떠한 이점을 제공한다는 증가가 없고, 사실 이러한 다이티오-다이포스페이트 c-다이-GMP 제조는 모 c-다이-GMP 분자와 비교하여 오직 유사하거나 더 약한 효력을 갖는다.

정의

"투여"는, 인간, 포유동물, 포유동물 대상체, 동물, 수의학 대상체, 위약 대상체, 조사 대상체, 실험 대상체, 세포, 조직, 장기, 또는 생물학적 유체와 관련하여 본 명세서에서 사용되면서, 제한 없이 대상체, 세포, 조직, 장기, 또는 생물학적 유체 등과의 외인성 리간드, 시약, 위약, 소분자, 약제학적 물질, 치료학적 물질, 진단 물질, 또는 조성물의 접촉을 의미한다. "투여"는 예를 들어 치료학적, 약동학적, 진단학적, 조사, 위약 및 실험 방법을 의미할 수 있다. 세포의 치료는 세포와의 시약의 접촉, 및 유체와의 시약의 접촉(여기서, 유체는 세포와 접촉함)을 포괄한다. "투여"는 또한 예를 들어 시약, 진단학적, 결합 조성물, 또는 다른 세포에 의한 세포의 실험실내 및 생체외 치료를 포괄한다. "함께 투여한다"는 2종 이상의 물질이 단일 조성물로서 투여된다는 것을 의미하도록 의도되지 않는다. 단일 조성물로서의 투여가 본 발명에 의해 고려되지만, 이러한 물질은 동일한 또는 상이한 시간에 있거나, 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로에 의할 수 있는 별개의 투여로서 단일 대상체에 전달될 수 있다.

"효현제"는, 리간드 및 수용체와 관련되면서, 수용체를 자극하는 분자, 분자의 조합, 복합체, 또는 시약의 조합을 포함한다. 예를 들어, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)의 효현제는 GM-CSF, GM-CSF의 뮤테인 또는 유도체, GM-CSF의 펩타이드 모방체, GM-CSF의 생물학적 기능을 모방하는 소분자, 또는 GM-CSF 수용체를 자극하는 항체를 포함할 수 있다.

"길항제"는, 리간드 및 수용체와 관련되면서, 수용체를 저해하고/하거나 상호작용하고/하거나, 하향조절하고/하거나 탈감작화하는 분자, 분자의 조합, 또는 복합체를 포함한다. "길항제"는 수용체의 구성적 활성을 저해하는 임의의 시약을 포함한다. 구성적 활성은 리간드/수용체 상호작용의 존재 하에 나타나는 것이다. "길항제"는 또한 수용체의 자극된(또는 제어된) 활성을 저해하거나 방지하는 임의의 시약을 포함한다. 예의 방식으로, GM-CSF 수용체의 길항제는, 임의의 제한을 의미하지 않으면서, 리간드(GM-CSF)에 결합하여 이것이 수용체에 결합하는 것을 방지하는 항체, 또는 수용체에 결합하여 리간드가 수용체에 결합하는 것을 방지하는 항체를 포함하거나, 항체는 불활성 입체구성으로 수용체를 잠근다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "유사체" 또는 "유도체"는, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질에 관련되어, 원래의 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질과 유사하거나 동일한 기능을 보유하지만, 원래의 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 유사하거나 동일한 아미노산 서열 또는 구조를 반드시 포함하는 것은 아닌 다른 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 의미한다. 유사체는 바람직하게는 하기 중 적어도 하나를 만족시킨다: (a) 원래의 아미노산 서열과 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질성 물질, (b) 엄격한 조건 하에 원래의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 단백질성 물질; 및 (c) 원래의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 단백질성 물질.

"항원 제시 세포"(APC)는 T 세포에 항원을 제시하도록 사용되는 면역계의 세포이다. APC는 수지상 세포, 단핵구, 대식세포, 변연부 쿠퍼(Kupffer) 세포, 미세아교세포, 랑게르한스 세포, T 세포 및 B 세포를 포함한다. 수지상 세포는 적어도 2개의 계통에서 발생한다. 제1 계통은 프레-DC1, 골수성 DC1 및 성숙 DC1을 포함한다. 제2 계통은 CD34⁺CD45RA^- 초기 전구세포 다능성 세포, CD34⁺CD45RA⁺ 세포, CD34⁺CD45RA⁺CD4⁺ IL-3Rα⁺ 프로-DC2 세포, CD4⁺CD11c^- 형질세포 모양 프레-DC2 세포, 림프성 인간 DC2 형질세포 모양 유래 DC2 및 성숙 DC2를 포함한다.

"약독화" 및 "약독화된"은 숙주에 대한 독성을 감소시키도록 변형된 감염성 유기체 등에서의 박테리아, 바이러스, 기생충, 감염성 유기체, 프리온, 종양 세포, 유전자를 포함한다. 숙주는 인간 또는 동물 숙주, 또는 장기, 조직, 또는 세포일 수 있다. 박테리아는, 비제한적인 예를 제공하면서, 숙주 세포에 대한 결합을 감소시키기 위해, 하나의 숙주 세포로부터 다른 숙주 세포로의 확산을 감소시키기 위해, 세포외 성장을 감소시키기 위해, 또는 숙주 세포에서의 세포내 성장을 감소시키기 위해 약독화될 수 있다. 약독화는 예를 들어 독성, LD₅₀, 장기로부터의 청소율의 지표(indicum) 또는 표시, 또는 경쟁 지수를 측정함으로써 평가될 수 있다(참조, 예를 들어, Auerbuch, et al. (2001) Infect. Immunity 69:5953-5957). 일반적으로, 약독화는 적어도 25%; 더 일반적으로 적어도 50%; 가장 일반적으로 적어도 100%(2배); 보통 적어도 5배; 더 보통 적어도 10배; 가장 보통 적어도 50배; 대개는 적어도 100배; 더 대개는 적어도 500배; 가장 대개는 적어도 1000배; 일반적으로 적어도 5000배; 더 일반적으로 적어도 10,000배; 가장 일반적으로 적어도 50,000배; 가장 대개는 적어도 100,000배로 LD₅₀의 증가 및/또는 청소율의 증가를 발생시킨다.

"정제된" 및 "단리된"은 지정된 종이 조성물에 존재하는 종의 적어도 50%를 차지하고, 더 대개는 적어도 60%를 차지하고, 통상적으로 적어도 70%를 차지하고, 더 통상적으로 적어도 75%를 차지하고, 가장 통상적으로 적어도 80%를 차지하고, 보통 적어도 85%를 차지하고, 더 보통 적어도 90%를 차지하고, 가장 보통 적어도 95%를 차지하고, 관습적으로 적어도 98중량% 이상을 차지한다는 것을 의미한다. 물, 완충제, 염, 세제, 환원제, 프로테아제 저해제, 안정화제(첨가된 단백질, 예컨대 알부민을 포함) 및 부형제의 중량은 순도의 결정에서 일반적으로 사용되지 않는다.

"특이적으로" 또는 "선택적으로" 결합한다는, 리간드/수용체, 핵산/상보성 핵산, 항체/항원 또는 다른 결합 쌍(예를 들어, 사이토카인 수용체에 대한 사이토카인)(각각 일반적으로 본 명세서에서 "표적 바이오분자" 또는 "표적"이라 칭함)을 언급할 때, 단백질 및 다른 생물물질의 이종성 집단에서 표적의 존재와 관련된 결합 반응을 나타낸다. 특이적 결합은 또한 예를 들어 고안된 방법의, 항체의 항원 결합 부위로부터 유래된 결합 화합물, 핵산 리간드, 항체, 또는 결합 조성물이 비표적 분자에 의한 친화도보다 대개는 적어도 25% 초과, 더 대개는 적어도 50% 초과, 가장 대개는 적어도 100%(2배) 초과, 보통 적어도 10배 초과, 더 보통 적어도 20배 초과, 가장 보통 적어도 100배 초과인 친화도로 이의 표적에 결합한다는 것을 의미할 수 있다.

"리간드"는 표적 바이오분자에 결합하는 소분자, 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 사카라이드, 다당류, 글라이칸, 당단백질, 당지질 또는 이들의 조합을 의미한다. 이러한 리간드가 수용체의 효현제 또는 길항제일 수 있지만, 리간드는 또한 효현제 또는 길항제가 아니고, 효현제 또는 길항제 특성을 갖지 않는 결합제를 포함한다. 이의 동족(cognate) 표적에 대한 리간드의 특이적 결합은 대개 "친화도"의 면으로 표시된다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 리간드는 약 10⁴M^-1 내지 약 10⁸M^-1의 친화도로 결합한다. 친화도는 K_d = k_off/k_on(k_off는 해리 속도 상수이고, K_on은 결합 속도 상수이며, K_d는 평형 상수임)으로 계산된다.

친화도는 다양한 농도(c)에서 표지된 리간드의 결합 분획(r)을 측정함으로써 평형에서 계산될 수 있다. 데이터는 스캐차드(Scatchard) 식 r/c = K(n-r)(여기서, r은 = 평형 시 결합 리간드의 몰/수용체의 몰이고; c = 평형 시 유리 리간드 농도이며; K = 평형 결합 상수이고; n = 수용체 분자당 리간드 결합 부위의 수임)을 이용하여 그래프 표시된다. 그래프 분석에 의해, r/c는 X축에 대해 Y축으로 작도화되어, 따라서 스캐차드 도면을 작도시킨다. 스캐차드 분석에 의한 친화도 측정은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[van Erp et al., J. Immunoassay 12: 425-43, 1991; Nelson and Griswold, Comput. Methods Programs Biomed. 27: 65-8, 1988]을 참조한다. 대안에서, 친화도는 등온 적정 열량법(isothermal titration calorimetry: ITC)에 의해 측정될 수 있다. 통상적인 ITC 실험에서, 리간드의 용액은 이의 동족 표적의 용액으로 적정된다. 이의 상호작용 시 방출된 열(ΔH)은 시간에 따라 모니터링된다. 연속적인 양의 리간드가 ITC 세포로 적정되면서, 흡수되거나 방출된 열의 분량은 결합의 양에 정비례한다. 시스템이 포화에 도달하면서, 오직 희석 열이 관찰될 때까지 열 신호가 감소한다. 이후, 세포에서 리간드 및 결합 파트너의 비율에 대한 각각의 주입으로부터의 열의 작도로부터 결합 곡선을 얻는다. 결합 곡선을 적절한 결합 모델로 분석하여 K_B, n 및 ΔH를 결정한다. K_B = 1/K_d를 유의한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "대상체"는 인간 또는 비인간 유기체를 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 기재된 방법 및 조성물은 인간 및 수의학 질병 둘 다에 적용 가능하다. 소정의 실시형태에서, 대상체는 "환자", 즉 질병 또는 병증에 대한 의학 관리를 받는 살아 있는 인간이다. 이는 병리학의 징후에 대해 조사된 규정된 질병을 갖지 않는 사람을 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 표적화된 특정한 암의 기존 진단을 갖는 대상체가 바람직하다. 본 명세서에 기재된 조성물에 의한 치료에 바람직한 암은 전립선암, 신장 암종, 흑색종, 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 두경부암, 폐암 및 유방암을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

"치료학적 유효량"은 환자 이익을 나타내는 데 충분한, 즉 치료하고자 하는 병증의 증상의 감소, 예방 또는 경감을 발생시키는 시약 또는 약제학적 조성물의 양으로 정의된다. 물질 또는 약제학적 조성물이 진단학적 물질을 포함하는 경우, "진단학적 유효량"은 신호, 이미지 또는 다른 진단학적 매개변수를 생성하기에 충분한 양으로 정의된다. 약제학적 제제의 유효량은 개체의 감수성의 정도, 개체의 연령, 성별 및 체중, 및 개체의 특이체질 반응과 같은 인자에 따라 변할 것이다. "유효량"은 제한 없이 의학 병증 또는 장애의 증상 또는 징후, 또는 이의 원인 과정을 경감시키거나, 역전시키거나, 완화시키거나, 예방하거나, 진단할 수 있는 양을 포함한다. 명확히 또는 문맥상 달리 기술되지 않은 한, "유효량"은 병증을 경감시키기에 충분한 최소량으로 제한되지 않는다.

(병증 또는 질병과 관련하여) "치료" 또는 "치료하는"은 유리한 또는 원하는 결과 및 바람직하게는 임상 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위해, 질병과 관련하여 유리한 또는 원하는 결과는 하기 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다: 질병의 예방, 질병과 관련된 병증의 개선, 질병의 치유, 질병의 중증도의 감소, 질병의 진행의 지연, 질병과 관련된 하나 이상의 증상의 경감, 질병을 겪는 사람의 삶의 질의 증가 및/또는 생존 연장. 마찬가지로, 본 발명의 목적을 위해, 병증과 관련된 유리한 또는 원하는 결과는 하기 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다: 병증의 예방, 병증의 개선, 병증의 치유, 병증의 중증도의 감소, 병증의 진행의 지연, 병증과 관련된 하나 이상의 증상의 경감, 병증을 겪는 사람의 삶의 질의 증가 및/또는 생존 연장. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 조성물이 암의 치료에 사용되는 실시형태에서, 유리한 또는 원하는 결과는 하기 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다: 신생 또는 암성 세포의 증식의 감소(또는 파괴), 암에서 발견되는 신생 세포의 전이의 감소, 종양의 크기의 수축, 암으로부터 생긴 증상의 감소, 암으로 고생하는 사람의 삶의 질의 증가, 질병을 치료하는데 필요한 다른 약제의 용량의 감소, 암의 진행의 지연 및/또는 암을 앓는 환자의 생존의 연장. 문맥에 따라, 대상체의 "치료"는, 예를 들어 대상체가 시약의 투여에 의해 경감될 것으로 예상되는 장애를 포함하는 상황에서, 대상체가 치료를 필요로 한다는 것을 의미할 수 있다.

"정제된" 및 "단리된"은, 폴리펩타이드를 언급할 때, 폴리펩타이드가 이것이 자연에서 관련된 다른 생물학적 거대분자의 실질적인 부재 하에 존재한다는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "정제된"은 확인된 폴리펩타이드가 존재하는 폴리펩타이드의 대개는 적어도 50%를 차지하고, 더 대개는 적어도 60%를 차지하고, 통상적으로 적어도 70%를 차지하고, 더 통상적으로 적어도 75%를 차지하고, 가장 통상적으로 적어도 80%를 차지하고, 보통 적어도 85%를 차지하고, 더 보통 적어도 90%를 차지하고, 가장 보통 적어도 95%를 차지하고, 관습적으로 적어도 98중량% 이상을 차지한다는 것을 의미한다. 물, 완충제, 염, 세제, 환원제, 프로테아제 저해제, 안정화제(첨가된 단백질, 예컨대 알부민을 포함) 및 부형제 및 분자량이 1000 미만인 분자의 중량은 폴리펩타이드 순도의 결정에서 일반적으로 사용되지 않는다. 예를 들어, 코바치(Covacci) 등에 허여된 미국 특허 제6,090,611호에서 순도의 설명을 참조한다.

"펩타이드"는 아미노산이 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 아미노산의 짧은 서열을 의미한다. 펩타이드는 다른 모이어티, 예컨대 거대분자, 지질, 올리고사카라이드 또는 다당류 및/또는 폴리펩타이드에 결합되거나 유리될 수 있다. 펩타이드가 폴리펩타이드 사슬로 편입된 경우, 용어 "펩타이드"는 구체적으로 아미노산의 짧은 서열을 의미하도록 여전히 사용될 수 있다. "펩타이드"는 펩타이드 결합 또는 몇몇 다른 유형의 연결에 의해 다른 모이어티에 연결될 수 있다. 펩타이드는 적어도 2개의 길이의 아미노산이고, 일반적으로 약 25개 미만의 길이의 아미노산이고, 최대 길이는 관습 또는 맥락의 기능이다. 용어 "펩타이드" 및 "올리고펩타이드"는 상호 교환적으로 사용될 수 있다.

"단백질"은 일반적으로 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 아미노산의 서열을 의미한다. 단백질은 또한 폴리펩타이드의 3차원 구조를 의미할 수 있다. "변성 단백질"은 일부 잔류 3차원 구조를 갖는 부분적으로 변성된 폴리펩타이드, 또는 대안적으로 필수적으로 무작위인 3차원 구조, 즉 완전 변성을 의미한다. 본 발명은 예를 들어 당화, 인산화, 황산화, 이황화 결합 형성, 탈아미드화, 이성질체화를 포함하는 폴리펩타이드 변이체, 신호 또는 선도 서열 처리에서의 절단 지점, 공유 및 비공유 결합된 보조인자, 산화된 변이체 등의 시약 및 이들을 사용하는 방법을 포함한다. 이황화 결합된 단백질의 형성이 기재되어 있다(예를 들어, 문헌[Woycechowsky and Raines (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4:533-539; Creighton, et al. (1995) Trends Biotechnol. 13:18-23] 참조).

"재조합"은, 예를 들어 핵산, 세포, 동물, 바이러스, 플라스미드, 벡터 등과 관련하여 사용될 때, 외인성 비네이티브 핵산의 도입, 네이티브 핵산의 변경, 또는 전부 또는 부분적으로 재조합 핵산, 세포, 바이러스, 플라스미드, 또는 벡터로부터의 유도체화에 의한 변형을 나타낸다. 재조합 단백질은 예를 들어 재조합 핵산, 바이러스, 플라스미드, 벡터 등으로부터 유도된 단백질을 의미한다. "재조합 박테리아"는 게놈이 재조합 방법, 예를 들어, 돌연변이, 결실, 삽입 및/또는 재배열에 의해 조작되는 박테리아를 포함한다. "재조합 박테리아" 또한 재조합 게놈외 핵산, 예를 들어, 플라스미드 또는 제2 염색체를 포함하도록 변형된 박테리아, 또는 기존의 게놈외 핵산이 변경된 박테리아를 포함한다.

"샘플"은 인간, 동물, 위약, 또는 조사 샘플, 예를 들어, 세포, 조직, 장기, 유체, 가스, 에어로졸, 슬러리, 콜로이드, 또는 응고 물질로부터의 샘플을 의미한다. "샘플"은 예를 들어 인간 또는 동물로부터의 제거 없이 생체내 시험될 수 있거나, 실험실내 시험될 수 있다. 샘플은 예를 들어 조직학적 방법에 의해 처리 후 시험될 수 있다. "샘플"은 또한 예를 들어 유체 또는 조직 샘플을 포함하는 세포, 또는 유체 또는 조직 샘플로부터 분리된 세포를 의미한다. "샘플"은 또한 인간 또는 동물로부터 새로 채취한 세포, 조직, 장기 또는 유체, 또는 처리되거나 저장된 세포, 조직, 장기 또는 유체를 의미할 수 있다.

"백신"은 예방 백신을 포함한다. 백신은 또한 치료학적 백신, 예를 들어, 백신에 의해 제공된 항원 또는 에피토프와 관련된 병증 또는 장애를 포함하는 포유동물에 투여되는 백신을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "항체"는 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들 또는 이의 단편으로부터 유래하거나, 이들 후에 모델링되거나, 실질적으로 이들에 의해 코딩된 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 예를 들어, 문헌[Fundamental Immunology, 3rd Edition, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993); Wilson (1994; J. Immunol. Methods 175:267-273; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25:85-97]을 참조한다. 용어 항체는 항원 결합 부분, 즉 "항원 결합 부위"(예를 들어, 단편, 하위서열, 항원에 결합하는 능력을 보유하는 상보성 결정 구역(CDR)), 예를 들어 (ⅰ) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CHl 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ⅱ) F(ab')2 단편, 힌지 구역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (ⅲ) VH 및 CHl 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 구역(CDR)을 포함한다. 단일 사슬 항체는 또한 용어 "항체"에 참조로 포함된다.

환식 퓨린 다이뉴클레오타이드

본 명세서에 기재된 바대로, 본 발명은 STING-의존적 TBK1 활성화를 유도하는 입체화학적으로 정제된 환식 퓨린 다이뉴클레오타이드, 그리고 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.

원핵세포 및 진핵세포는 세포 신호전달 및 세포내 및 세포간 연통을 위해 다양한 작은 분자를 사용한다. cGMP, cAMP 등과 같은 환식 뉴클레오타이드는 원핵세포 및 진핵세포에서 조절 및 개시 활성을 갖는 것으로 공지되어 있다. 진핵세포와 달리, 원핵세포는 또한 조절 분자로서 환식 퓨린 다이뉴클레오타이드를 사용한다. 원핵세포에서, 2개의 GTP 분자의 고려사항은 박테리아에서 중요한 조절물질을 나타내는 c-다이GMP를 생성시키는 효소 다이구아닐레이트 사이클라제(DGC)에 의한 촉매이다.

최근 업적은 CDN, 예컨대 환식 다이GMP 또는 이의 유사체가 또한 환자에서 면역 또는 염증성 반응을 자극하거나 증대시키거나 포유동물에서 애주번트로서 작용함으로써 백신에 대한 면역 반응을 증대시킬 수 있다는 것을 제시한다. 병원균 유래 DNA의 시토졸 검출은 TANK 결합 키나제 1(TBK1) 및 이의 하류 전사 인자, IFN 조절 3(IRF3)을 통한 신호전달을 요한다. STING(IFN 유전자의 자극물질; MITA, ERIS, MPYS 및 TMEM173으로도 공지됨)라 불리는 막관통 단백질은 이 환식 퓨린 다이뉴클레오타이드에 대한 신호전달 수용체로서 작용하여, TBK1-IRF3 신호전달 축의 자극 및 STING-의존적 I형 인터페론 반응을 발생시킨다. 예를 들어, 도 1을 참조한다. 문헌[Burdette et al., Nature 478: 515-18, 2011]은 STING가 다른 비연관 뉴클레오타이드 또는 핵산이 아니라 환식 다이구아닐레이트 모노포스페이트에 직접적으로 결합한다는 것을 나타낸다.

백신 제제의 목표는 통상적으로 관심 대상 항원을 보유하는 병원균, 종양 세포 등에 신속히 반응하는 기억 T 세포 및/또는 B 세포의 충분한 집단을 생성할 수 있는 항원 및 애주번트의 조합을 제공하는 것이다. 본 발명은 1종 이상의 환식 퓨린 다이뉴클레오타이드를 포함하는 애주번트 조성물을 제공하는 방법(여기서, 조성물에 존재하는 환식 퓨린 다이뉴클로타이드는 실질적으로 순수한 Rp,Rp 또는 Rp,Sp 부분입체이성체임), 이의 제조 방법 및 동물에서 면역 반응을 자극하는 이의 사용 방법에 관한 것이다.

바람직한 환식 퓨린 다이뉴클로타이드는 c-다이-AMP, c-다이-GMP, c-다이-IMP, c-AMP-GMP, c-AMP-IMP 및 c-GMP-IMP 및 이들의 유사체(본 명세서에서 "티오포스페이트"라 칭하는 포스포로티오에이트 유사체를 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않음)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. CDN 티오포스페이트의 일반 구조는 도 1에 제공된다. 이 도면에서, B1 및 B2는 염기 모이어티를 나타낸다. 포스포로티오에이트는 이웃 산소 중 하나가 황으로 대체된 일반 뉴클레오타이드의 변이체이다. 뉴클레오타이드간 결합의 황화는 5'에서 3'로의 및 3'에서 5'로의 DNA POL 1 엑소뉴클레아제, 뉴클레아제 S1 및 P1, RNase, 혈청 뉴클레아제 및 뱀독 포스포다이에스테라제를 포함하는 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제의 작용을 극적으로 감소시킨다. 또한, 지질 이중층을 횡단하는 가능성이 증가한다.

본질적으로 키랄인 포스포로티오에이트 연결. 당업자는 이 구조에서의 포스페이트가 각각 R 또는 S 형태로 존재할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, Rp,Rp, Sp,Sp 및 Rp,Sp 형태가 가능하다. 각각의 경우에, 이 분자의 실질적으로 순수한 Rp,Rp 및 Rp,Sp 부분입체이성체가 바람직하다. 이러한 CDN 티오포스페이트 분자의 예는 본 명세서의 도 2 내지 도 6에 도시되어 있고, 이는 Rp,Rp-c-다이-아데노신 모노포스페이트; Rp,Sp-c-다이-아데노신 모노포스페이트; Rp,Rp-c-다이-구아노신 모노포스페이트 및 Rp,Sp-c-다이-구아노신 모노포스페이트의 티오포스페이트 형태를 나타낸다. 이들 도면에서, 포스페이트 중심의 입체화학은 적절한 바대로 R 또는 S로 표시된다.

바람직한 환식 퓨린 다이뉴클로타이드는 또한 CDN의 2'-O-치환기 형태, 특히 CDN 티오포스페이트를 포함한다. 추가의 안정성 및 생체이용률은 리보스 모이어티의 2'-OH의 치환에 의해 제공될 수 있다. 이러한 2'-O-치환기 유사체의 예가 도 11에 도시되어 있다. 본 명세서에 수정 가능한 치환기는 제한 없이 할로겐, 하이드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아실(-C(0)R_aa), 카복실(-C(0)0-R_aa), 지방족 기, 지환족 기, 알콕시, 치환된 옥시(-0-R_aa), 아릴, 아르알킬, 헤테로사이클릭 라디칼, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 아미노(-N(R_bb)(R_cc)), 이미노(=NR_bb), 아미도(-C(0)N(R_bb)(Rc_C) 또는 -N(R_bb)C(0)R_aa), 아지도(-N₃), 나이트로(-N0₂), 사이아노(-CN), 카브아미도(-OC(0)N(R_bb)(R_cc) 또는 -N(R_bb)C(0)OR_aa), 유레이도(-N(R_bb)C(0)-N(Rbb)(Rcc)), 티오유레이도(-N(R_bb)C(S)N(R_bb)(R_cc)), 구아니디닐(-N(R_bb)C(=NR_bb)N(R_bb)(R_cc)), 아미디닐(-C(=NR_bb)N(R_bb)(Rc_C) 또는 -N(R_bb)C(=NR_bb)(R_aa)), 티올(-SR_bb), 설피닐(-S(0)R_bb), 설포닐(-S(0)₂R_b) 및 설폰아미딜(-S(0)₂N(R_bb)(Rc_C) 또는 -N(R_bb)S(0)₂R_bb)를 포함한다. R_aa, R_bb 및 R_cC가 각각 독립적으로, H, 임의로 연결된 화학 작용기 또는 추가의 치환기인 경우, 바람직한 목록은 제한 없이 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, 지방족, 알콕시, 아실, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 지환족, 헤테로사이클릭 및 헤테로아릴알킬을 포함한다. 본 명세서에 기재된 화합물 내의 선택된 치환기는 반복되는 정도로 존재한다.

또 다른 바람직한 환식 퓨린 다이뉴클로타이드는 또한 개선된 생체이용률을 갖는 프로드럭을 유리하게 제공할 수 있는 CDN의 S-치환기 형태, 특히 CDN 티오포스페이트를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "프로드럭"은 고안된 화합물의 변형을 의미하고, 여기서 변형된 화합물은 신체 내에서(예를 들어, 표적 세포 또는 표적 장기에서) 효소 또는 비효소 반응을 통해 비변형 형태로 다시 전환된다. 소정의 실시형태에서, 하나의 리보스에서의 하이드록실은 프로드럭 이탈기를 포함한다. 프로드럭은 약물의 물리화학적, 생물역학적 및 약동학적 특성을 변형시킬 수 있다. 전통적인 프로드럭은 활성 약물을 형성하기 위해 생체내 형질전환을 겪음으로써 활성화된 약물로서 분류된다. 프로드럭 개발의 이유는 통상적으로 불량한 수성 용해도, 화학 불안정성, 낮은 경구 생체이용률, 혈액 뇌 장벽 침투의 결여 및 모 약물과 관련된 높은 초회 통과 대사이다. 적합한 프로드럭 모이어티는, 예를 들어, 문헌["Prodrugs and Targeted Delivery," J. Rautico, Ed., John Wiley & Sons, 2011]에 기재되어 있다.

이러한 프로드럭 유사체의 예는 도 12에 도시되어 있다. 개선된 친유성을 갖는 이 프로드럭 형태는 표적 유기체에 존재하는 에스테라제의 작용을 통해 활성 형태로 분해될 수 있다. 본 명세서에 수정 가능한 치환기는 제한 없이 할로겐, 하이드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아실(-C(0)R_aa), 카복실(-C(0)0-R_aa), 지방족 기, 지환족 기, 알콕시, 치환된 옥시(-0-R_aa), 아릴, 아르알킬, 헤테로사이클릭 라디칼, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 아미노(-N(R_bb)(R_cc)), 이미노(=NR_bb), 아미도(-C(0)N(R_bb)(Rc_C) 또는 -N(R_bb)C(0)R_aa), 아지도(-N₃), 나이트로(-N0₂), 사이아노(-CN), 카브아미도(-OC(0)N(R_bb)(R_cc) 또는 -N(R_bb)C(0)OR_aa), 유레이도(-N(R_bb)C(0)-N(Rbb)(Rcc)), 티오유레이도(-N(R_bb)C(S)N(R_bb)(R_cc)), 구아니디닐(-N(R_bb)C(=NR_bb)N(R_bb)(R_cc)), 아미디닐(-C(=NR_bb)N(R_bb)(Rc_C) 또는 -N(R_bb)C(=NR_bb)(R_aa)), 티올(-SR_bb), 설피닐(-S(0)R_bb), 설포닐(-S(0)₂R_b) 및 설폰아미딜(-S(0)₂N(R_bb)(Rc_C) 또는 -N(R_bb)S(0)₂R_bb)를 포함한다. R_aa, R_bb 및 R_cC가 각각 독립적으로, H, 임의로 연결된 화학 작용기 또는 추가의 치환기인 경우, 바람직한 목록은 제한 없이 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, 지방족, 알콕시, 아실, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 지환족, 헤테로사이클릭 및 헤테로아릴알킬을 포함한다. 본 명세서에 기재된 화합물 내의 선택된 치환기는 반복되는 정도로 존재한다. 바람직한 치환기는 메틸, 아이소프로필 및 t-뷰틸을 포함한다. 뉴클레오타이드의 프로드럭 형태는 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Nucleotide Prodrugs for HCV Therapy, Sofia, M.J., Antiviral Chem and Chemother., 2011, 22: 23-49; Nucleoside, Nucleotide, and Non-Nucleoside Inhibitors of Hepatitis C Virus NS5B RNA - Dependent RNA - Polymerase, Sofia, M.J., et al., J. Med. Chem., 2012, 55: 2481-2531]을 참조한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "알킬"은 24개 이하의 탄소 원자를 함유하는 포화 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 의미한다. 알킬기의 예는 제한 없이 메틸, 에틸, 프로필, 뷰틸, 아이소프로필, n-헥실, 옥틸, 데실, 도데실 등을 포함한다. 알킬기는 통상적으로 1개 내지 약 24개의 탄소 원자, 더 통상적으로 1개 내지 약 12개의 탄소 원자를 포함하고, 1개 내지 약 6개의 탄소 원자가 더 바람직하다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "저급 알킬"은 1개 내지 약 6개의 탄소 원자를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 알킬기는 1개 이상의 추가의 치환기를 임의로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "알케닐"은 24개 이하의 탄소 원자를 함유하고 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 사슬 라디칼을 의미한다. 알케닐기의 예는 제한 없이 에테닐, 프로페닐, 뷰테닐, 1-메틸-2-뷰텐-1-일, 다이엔, 예컨대 1,3-뷰타다이엔 등을 포함한다. 알케닐기는 통상적으로 2개 내지 약 24개의 탄소 원자, 더 통상적으로 2개 내지 약 12개의 탄소 원자를 포함하고, 2개 내지 약 6개의 탄소 원자가 더 바람직하다. 본 명세서에서 사용되는 알케닐기는 1개 이상의 추가의 치환기를 임의로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "알키닐"은 24개 이하의 탄소 원자를 함유하고 적어도 1개의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 사슬 라디칼을 의미한다. 알키닐기의 예는 제한 없이 제한 없이 에티닐, 1-프로피닐, 1-뷰티닐 등을 포함한다. 알키닐기는 통상적으로 2개 내지 약 24개의 탄소 원자, 더 통상적으로 2개 내지 약 12개의 탄소 원자를 포함하고, 2개 내지 약 6개의 탄소 원자가 더 바람직하다. 본 명세서에서 사용되는 알키닐기는 1개 이상의 추가의 치환기를 임의로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "아실"은 유기산으로부터 하이드록실기의 제거에 의해 형성되고 일반식 -C(O)-X(여기서, X는 통상적으로 지방족, 지환족 또는 방향족임)를 갖는 라디칼을 의미한다. 예는 지방족 카보닐, 방향족 카보닐, 지방족 설포닐, 방향족 설피닐, 지방족 설피닐, 방향족 포스페이트, 지방족 포스페이트 등을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 아실기는 추가의 치환기를 임의로 포함할 수 있다.

용어 "지환족"은 고리가 지방족인 환식 고리계를 의미한다. 고리계는 적어도 1개의 고리가 지방족인 1개 이상의 고리를 포함할 수 있다. 바람직한 지환족은 고리에서 약 5개 내지 약 9개의 탄소 원자를 갖는 고리를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 지환족 기는 추가의 치환기를 임의로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "지방족"은 임의의 2개의 탄소 원자 사이의 포화가 단일, 이중 또는 삼중 결합인 24개 이하의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 의미한다. 지방족 기는 바람직하게는 1개 내지 약 24개의 탄소 원자, 더 통상적으로 1개 내지 약 12개의 탄소 원자를 함유하고, 1개 내지 약 6개의 탄소 원자가 더 바람직하다. 지방족 기의 직쇄 또는 분지쇄 사슬은 질소, 산소, 황 및 인을 포함하는 1개 이상의 이종원자가 개재될 수 있다. 이종원자가 개재된 이러한 지방족 기는 제한 없이 폴리알콕시, 예컨대 폴리알킬렌 글라이콜, 폴리아민 및 폴리이민을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 지방족 기는 추가의 치환기를 임의로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "알콕시"는 알킬기와 산소 원자 사이에 형성된 라디칼을 의미하고, 산소 원자는 알콕시기를 모 분자에 부착시키도록 사용된다. 알콕시기의 예는 제한 없이 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 아이소프로폭시, n-뷰톡시, sec-뷰톡시, tert-뷰톡시, n-펜톡시, 네오펜톡시, n-헥속시 등을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 알콕시기는 추가의 치환기를 임의로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "아미노알킬"은 아미노 치환된 C＼-Cn 알킬 라디칼을 의미한다. 라디칼의 알킬 부분은 모 분자와 공유 결합을 형성한다. 아미노기는 임의의 위치에 위치할 수 있고, 아미노알킬기는 알킬 및/또는 아미노 부분에서 추가의 치환기로 치환될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "아르알킬" 및 "아릴알킬"은 C＼-Cn 알킬 라디칼에 공유 결합된 방향족 기를 의미한다. 생성된 아르알킬(또는 아릴알킬)기의 알킬 라디칼 부분이 모 분자와 공유 결합을 형성한다. 예는 제한 없이 벤질, 펜에틸 등을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 아르알킬기는, 라디칼 기를 형성하는, 알킬기, 아릴기 또는 이들 기 둘 다에 부착된 추가의 치환기를 임의로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "아릴" 및 "방향족"은 1개 이상의 방향족 고리를 갖는 단환식 또는 다환식 탄소환식 고리계 라디칼을 의미한다. 아릴기의 예는 제한 없이 페닐, 나프틸, 테트라하이드로나프틸, 인다닐, 인데닐 등을 포함한다. 바람직한 아릴 고리계는 1개 이상의 고리에서 약 5개 내지 약 20개의 탄소 원자를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 아릴기는 추가의 치환기를 임의로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "할로" 및 "할로겐"은 불소, 염소, 브롬 및 요오드로부터 선택된 원자를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "헤테로아릴" 및 "헤테로방향족"은 단환식 또는 다환식 방향족 고리, 고리계 또는 축합 고리계를 포함하는 라디칼을 의미하고, 여기서 고리 중 적어도 1개는 방향족이고 1개 이상의 이종원자를 포함한다. 헤테로아릴은 또한 1개 이상의 축합 고리가 이종원자를 함유하지 않는 고리계를 포함하는 축합 고리계를 포함하는 것으로 의도된다. 헤테로아릴기는 통상적으로 황, 질소 또는 산소로부터 선택된 1개의 고리 원자를 포함한다. 헤테로아릴기의 에는 제한 없이 피리디닐, 피라지닐, 피리미디닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 아이소옥사졸릴, 티아다이아졸릴, 옥사다이아졸릴, 티오페닐, 퓨라닐, 퀴놀리닐, 아이소퀴놀리닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조옥사졸릴, 퀴녹살리닐 등을 포함한다. 헤테로아릴 라디칼은 직접적으로 또는 연결 모이어티, 예컨대 지방족 기 또는 헤테로 원자를 통해 모 분자에 부착될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 헤테로아릴기는 추가의 치환기를 임의로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "헤테로아릴알킬"은 공유 부착된 C_1-C₁₂ 알킬 라디칼을 추가로 포함하는 상기 정의된 헤테로아릴기를 의미한다. 생성된 헤테로아릴알킬기의 알킬 라디칼 부분은 모 분자와 공유 결합을 형성할 수 있다. 예는 제한 없이 피리디닐메틸, 피리미디닐에틸, 나프티리디닐프로필 등을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 헤테로아릴알킬기는 헤테로아릴 부분 또는 알킬 부분 중 하나 또는 둘 다에서 추가의 치환기를 임의로 포함할 수 있다.

상기 기재된 바대로, 바람직한 환식 퓨린 다이뉴클로타이드는 또한 CDN의 프로드럭 형태, 특히 CDN 티오포스페이트를 포함한다. 프로드럭은 약물의 물리화학적, 생물역학적 및 약동학적 특성을 변형시킬 수 있다. 전통적인 프로드럭은 활성 약물을 형성하기 위해 생체내 형질전환을 겪음으로써 활성화된 약물로서 분류된다. 프로드럭 개발의 이유는 통상적으로 불량한 수성 용해도, 화학 불안정성, 낮은 경구 생체이용률, 혈액 뇌 장벽 침투의 결여 및 모 약물과 관련된 높은 초회 통과 대사이다. 적합한 프로드럭 모이어티는, 예를 들어, 문헌["Prodrugs and Targeted Delivery," J. Rautico, Ed., John Wiley & Sons, 2011]에 기재되어 있다.

환식 퓨린 다이뉴클로타이드와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "실질적으로 순수한"은 상기 도면에서 표시된 키랄 중심에서 다른 가능한 입체화학에 비해 적어도 75% 순수한 Rp,Rp 또는 Rp,Sp 형태를 의미한다. 예의 방식으로, "실질적으로 순수한 Rp,Rp c-다이-GMP 티오포스페이트"는 c-다이-GMP 티오포스페이트의 Rp,Sp 및 Sp,Sp 형태와 관련하여 적어도 75% 순수할 것이다. 바람직한 실시형태에서, 실질적으로 순수한 환식 퓨린 다이뉴클로타이드는 적어도 85% 순수하고, 적어도 90% 순수하고, 적어도 95% 순수하고, 적어도 97% 순수하고, 적어도 99% 순수하다. 본 발명의 실질적으로 순수한 환식 퓨린 다이뉴클로타이드 제조가 "입체화학적으로 순수하지만", 이는 이 키랄 중심에서 특정한 입체화학을 갖는 제제 내에 모든 CDN이 그외 동일하다는 것을 나타내도록 의도되지 않는다. 예를 들어, 실질적으로 순수한 환식 퓨린 다이뉴클로타이드 제제는 Rp,Rp c-다이-GMP 티오포스페이트 및 Rp,Rp c-다이-AMP 티오포스페이트의 조합을 함유할 수 있고, 여전히 실질적으로 순수한 환식 퓨린 다이뉴클로타이드 제제일 수 있다. 이러한 제제는 또한 환자 치료에 유리한 하기 기재된 바와 같은 다른 성분을 포함할 수 있고, 단 제제 내에 모든 CDN은 이 키랄 중심에서 특정한 입체화학을 가져야 한다.

본 명세서에 기재된 CDN 조성물은 적절한 면역 반응을 유도하거나 변형시키거나 자극하기에 충분한 양으로 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 부형제와 조합되어 숙주에 투여될 수 있다. 면역 반응은 제한 없이 특이적 면역 반응, 비특이적 면역 반응, 특이적 반응과 비특이적 반응 둘 다, 선천성 반응, 일차 면역 반응, 적응 면역, 2차 면역 반응, 기억 면역 반응, 면역 세포 활성화, 면역 세포 증식, 면역 세포 분화 및 사이토카인 발현을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, CDN 조성물은 1종 이상의 미리 결정된 항원에 대한 면역 반응을 자극하도록 의도된 백신; 애주번트; CTLA-4 및 PD-1 경로 길항제, 지질, 리포솜, 화학치료제, 면역조절 세포주 등을 포함하는 1종 이상의 추가의 조성물과 함께 투여된다.

CDN 조성물은 추가의 치료학적 또는 예방학적 조성물 전에, 후에 및/또는 이것과 함께 투여될 수 있다. 이는 제한 없이 B7 공동자극 분자, 인터류킨-2, 인터페론-γ, GM-CSF, CTLA-4 길항제, OX-40/OX-40 리간드, CD40/CD40 리간드, 사르그라모스팀, 레바미솔, 백시니아 바이러스, 바실 칼메테-구에린(BCG: Bacille Calmette-Guerin), 리포솜, 알룸, 프로인트 완전 또는 불완전 애주번트, 해독 내독소, 미네랄 오일, 표면 활성 물질, 예컨대 리포레시틴, 플루로닉 폴리올, 다중음이온, 펩타이드, 및 오일 또는 탄화수소 에멀션을 포함한다. 항체 반응에 대해 세포용해 T 세포 반응을 우선적으로 자극하는 T 세포 면역 반응을 유도하기 위한 캐리어가 바람직하지만, 반응 유형 둘 다를 자극하는 것이 또한 사용될 수 있다. 상기 물질이 폴리펩타이드인 경우, 폴리펩타이드 그 자체 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 투여될 수 있다. 캐리어는 세포, 예컨대 항원 제시 세포(APC) 또는 수지상 세포일 수 있다. 항원 제시 세포는 대식세포, 수지상 세포 및 B 세포와 같은 세포 유형을 포함한다. 다른 전문적 항원 제시 세포는 단핵구, 변연부 쿠퍼 세포, 미세아교세포, 랑게르한스 세포, 상호교차(interdigitating) 수지상 세포, 여포성 수지상 세포 및 T 세포를 포함한다. 조건적 항원 제시 세포가 또한 사용될 수 있다. 조건적 항원 제시 세포의 예는 성상교세포, 여포성 세포, 내피세포 및 섬유아세포를 포함한다. 캐리어는 폴리펩타이드를 발현하거나 폴리뉴클레오타이드를 전달하도록(백신접종된 개체의 세포에서 이후 발현됨) 형질전환된 박테리아 세포일 수 있다. 애주번트, 예컨대 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄은 면역 반응을 촉발하거나, 증대시키거나, 연장시키는 백신의 능력을 증가시키도록 첨가될 수 있다. 별도로 또는 기재된 조성물과 조합되어 사용되는, 추가의 물질, 예컨대 사이토카인, 케모카인 및 박테리아 핵산 서열, 예컨대 CpG, 톨 유사 수용체(TLR) 9 효현제, 및 TLR 2, TLR 4, TLR 5, TLR 7, TLR 8, TLR9에 대한 추가의 효현제, 예를 들어 리포단백질, LPS, 모노포스포릴 지질 A, 리포타이코산, 이미퀴모드, 레시퀴모드는 또한 가능한 애주번트이다. 애주번트의 다른 대표적인 예는 퀼라야 사포나리아(Quillaja saponaria) 및 코리네박테리아 파르붐의 껍질로부터 정제된 균질한 사포닌을 포함하는 합성 애주번트 QS-21을 포함한다(McCune et al., Cancer, 1979; 43:1619). 애주번트가 최적화로 처리된다고 이해될 수 있다. 즉, 당업자는 사용하기 위한 최선의 애주번트를 결정하기 위해 일상적인 실험에 참여할 수 있다.

추가의 치료학적 물질과의 동시 투여를 위한 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, NY; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA).

애주번트

상기 기재된 환식 퓨린 다이뉴클로타이드(들) 이외에, 본 발명의 조성물은 불활화된 종양 세포(들)에 존재하는 암 항원에 반응하도록 면역계를 자극하도록 작용할 수 있는 1종 이상의 추가의 물질을 더 포함할 수 있다. 이러한 애주번트는 선천성 면역을 유도하는 지질, 리포솜, 불활화된 박테리아(예를 들어, 불활화된 또는 약독화된 리스테리아 모노사이토게네스), 톨 유사 수용체(TLR), (NOD) 유사 수용체(NLR), 레티노산 유도성 유전자-기반(RIG)-I 유사 수용체(RLR) 및/또는 C형 렉틴 수용체(CLR)를 통해 선천성 면역 활성화를 중재하는 조성물을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. PAMP의 예는 리포단백질, 리포폴리펩타이드, 펩티도글라이칸, 지모산, 리포다당류, 나이세리알 포린, 플라겔린, 프로필린, 갈락토세라마이드, 뮤라밀 다이펩타이드를 포함한다. 펩티도글라이칸, 리포단백질 및 리포타이코산은 그램 양성의 세포벽 성분이다. 리포다당류는 대부분의 박테리아에 의해 발현되고, MPL이 일례이다. 플라겔린은 병원균 및 공생 박테리아에 의해 분비된 박테리아 플라겔라의 구조적 성분을 의미한다. α-갈락토실세라마이드(α-GalCer)는 천연 살해 T(NKT) 세포의 활성물질이다. 뮤라밀 다이펩타이드는 모든 박테리아에 공통인 생물활성 펩티도글라이칸 모티프이다. 이 목록은 제한인 것으로 의도되지 않는다. 바람직한 애주번트 조성물은 하기 기재되어 있다.

CTLA-4 및 PD-1 경로 길항제

CTLA-4는 적응 면역 반응의 중요한 음성 조절물질인 것으로 생각된다. 활성화 T 세포는 CD28보다 높은 친화도로 항원 제시 세포에서 CD80 및 CD86에 결합하는 CTLA-4를 상향조절하여, T 세포 자극, IL-2 유전자 발현 및 T 세포 증식을 저해한다. CTLA4 봉쇄의 항종양 효과는 대장암종, 전이성 전립선암 및 전이성 흑색종의 쥣과 모델에서 관찰되었다.

이플리무맙(Yervoy(상표명)) 및 트레멜리무맙은 인간 CTLA4에 결합하고 CD80 및 CD86과의 이의 상호작용을 방지하는 인간화 단일클론 항체이다. 이플리무맙 및 트레멜리무맙을 사용한 I상 및 II상 연구는 암 환자에서 임상 활성을 나타냈다. 유사한 전략에 의해 표적화될 수 있는 다른 음성 면역 조절물질은 프로그래밍된 세포 사멸 1, B 및 T 림프구 감쇠물질(attenuator), 형질전환 성장 인자 베타 β, 인터류킨-10 및 혈관 내피 성장 인자를 포함한다.

PD-1은 활성화 T 세포에서 발현된 적응 면역 반응의 다른 음성 조절물질이다. PD-1은 B7-H1 및 B7-DC에 결합하고, PD-1의 참여는 T 세포 활성화를 억제한다. 항종양 효과는 PD-1 경로 봉쇄로 입증되었다. BMS-936558, MK3475, CT-011, AMP-224 및 MDX-1106은 본 발명에서 용도가 확인될 수 있는 PD-1 경로 차단제의 예인 문헌에서 보고되어 있다.

TLR 효현제

본 명세서에서 사용되는 용어 "톨 유사 수용체"(또는 "TLR")는 미생물 생성물을 감지하고/하거나 적응 면역 반응을 개시시키는 단백질의 톨 유사 수용체 패밀리의 구성원 또는 이의 단편을 의미한다. 일 실시형태에서, TLR은 수지상 세포(DC)를 활성화한다. 톨 유사 수용체(TLR)는 미생물 병원균을 인식하는 선천성 면역계의 센서로서 초기에 확인된 패턴 인식 수용체의 패밀리이다. TLR은 류신 농후 반복부의 엑토도메인, 막관통 도메인 및 세포내 TIR(Toll/IL-1R) 도메인을 함유하는 보존된 막 폭에 걸친 분자의 패밀리를 포함한다. TLR은 대개 "PAMP"(병원균 관련 분자 패턴)라 칭하는 미생물에서의 구별되는 구조를 인식한다. TLR에 대한 리간드 결합은 염증 및 면역에 관여하는 인자의 생성을 유도하는 세포내 신호전달 경로의 캐스케이드를 작동시킨다.

인간에서, 10개의 TLR이 확인되었다. 세포의 표면에서 발현된 TLR은 TLR-1,-2,-4,-5 및 -6을 포함하는 반면, TLR-3, -7/8 및 -9는 ER 구획으로 발현된다. 인간 수지상 세포 하위세트는 구별되는 TLR 발현 패턴에 기초하여 확인될 수 있다. 예의 방식으로, DC의 골수성 또는 "전통적인" 하위세트(mDC)는 자극될 때 TLR 1-8을 발현하고, 활성화 마커(예를 들어 CD80, CD86, MHC I형 및 II형, CCR7), 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 캐스케이드가 생성된다. 이 자극 및 생성된 발현의 결과는 항원 특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포 프라이밍이다. 이 DC는 항원을 흡수하고 이를 T 세포에 적절한 형태로 제시하는 증대된 역량을 획득한다. 반대로, DC의 형질세포 모양 하위세트(pDC)는 활성화 시 NK 세포 및 T 세포의 생성된 활성화로 TLR7 및 TLR9만을 발현한다. 종양 세포의 염색이 DC 기능에 부정적으로 영향을 미칠 수 있으므로, TLR 효현제에 의한 DC의 활성화가 암의 치료에 대해 면역치료 접근법에서 항종양 면역을 프라이밍하는 데 유리할 수 있다는 것이 제시되었다. 방사선 및 화학치료를 이용한 유방암의 성공적인 치료가 TLR4 활성화를 필요로 한다는 것이 또한 제시되었다.

당해 분야에서 공지된 TLR 효현제 및 본 발명에서의 확인된 용도는 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다:

Pam3Cys, TLR-1/2 효현제;

CFA, TLR-2 효현제;

MALP2, TLR-2 효현제;

Pam2Cys, TLR-2 효현제;

FSL-1, TLR-2 효현제;

Hib-OMPC, TLR-2 효현제;

폴리리보신산:폴리리보사이티드산(폴리 I:C), TLR-3 효현제;

폴리아데노신-폴리유리딜산(폴리 AU), TLR-3 효현제;

폴리-L-라이신 및 카복시메틸셀룰로스로 안정화된 폴리이노신산-폴리사이티딜산(힐토놀(Hiltonol)(등록상표)), TLR-3 효현제;

모노포스포릴 지질 A(MPL), TLR-4 효현제;

LPS, TLR-4 효현제;

박테리아 플라겔린, TLR-5 효현제;

시알릴-Tn(STn), 다수의 인간암 세포에서 MUC1 뮤신과 관련된 탄수화물 및 TLR-4 효현제;

이미퀴모드, TLR-7 효현제;

레시퀴모드, TLR-7/8 효현제;

록소리빈, TLR-7/8 효현제; 및

비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드(CpG-ODN), TLR-9 효현제.

이의 애주번트 품질로 인해, TLR 효현제는 바람직하게는 다른 백신, 애주번트 및/또는 면역 조절물질과 함께 사용되고, 다양한 조합으로 조합될 수 있다. 따라서, 소정의 실시형태에서, STING에 결합하고 STING-의존적 TBK1 활성화를 유도하는 환식 퓨린 다이뉴클레오타이드 및 본 명세서에 기재된 수지상 세포 유도, 동원 및/또는 성숙을 자극하는 1종 이상의 사이토카인을 발현하고 분비하는 불활화된 종양 세포는 치료학적 목적을 위해 1종 이상의 TLR 효현제와 함께 투여될 수 있다.

지질 및 리포솜

리포솜은 인지질의 1층("단층") 이상의 층("다층")으로 형성된 소포이다. 인지질 빌딩 블록의 양친매성 특성으로 인해, 리포솜은 통상적으로 친수성 외부면을 제시하고 친수성 코어를 둘러싸는 친수성 층을 포함한다. 친수성/소수성 성분의 편입에서의 리포솜의 다양성, 이의 비독성 성질, 생체분해, 생체적합성, 애주번트성, 세포 면역의 유도, 지속된 방출의 특성 및 대식세포에 의한 즉각적 흡수는 이를 항원의 전달을 위한 매력적인 후보물질로 만든다.

WO2010/104833(그 전문이 본 명세서에서 참조문헌으로 포함됨)은 하기를 리포솜 제제를 기술한다:

a) 수성 비히클;

b) (ⅰ) 다이미리스토일포스파티딜콜린("DMPC"),

(ⅱ) 다이미리스토일포스파티딜글라이세롤("DMPG"), 다이미리스토일트라이메틸암모늄 프로판("DMTAP"), 또는 DMPG와 DMTAP 두 가지 모두, 및

(ⅲ) 적어도 1종의 스테롤 유도체

를 포함하는 리포솜; 및

c) 1% 내지 100%의 상기 적어도 1종의 스테롤 유도체에 공유 연결된 1종 이상의 면역원성 폴리펩타이드(들) 또는 탄수화물(들).

상기 언급된 "면역원성 폴리펩타이드(들) 또는 탄수화물(들)"과 함께 또는 이것 없이 베시백스(VesiVax)(등록상표)(Molecular Express, Inc.)라 본 명세서에서 칭하는 이러한 리포솜 제제는 1종 이상의 추가의 성분, 예컨대 펩티도글라이칸, 리포펩타이드, 리포다당류, 모노포스포릴 지질 A, 리포타이코산, 레시퀴모드, 이미퀴모드, 플라겔린, 비메틸화 CpG 모티프를 함유하는 올리고뉴클레오타이드, 베타-갈락토실세라마이드, 뮤라밀 다이펩타이드, 올-트랜스 레티노산, 이중 가닥 바이러스 RNA, 열 충격 단백질, 다이옥타데실다이메틸암모늄 브로마이드, 양이온성 계면활성제, 톨 유사 수용체 효현제, 다이미리스토일트라이메틸암모늄프로판 및 노드 유사 수용체 효현제를 함유할 수 있다. 유리하게, 이 리포솜 제제는 본 발명에 따라 1종 이상의 환식 퓨린 다이뉴클레오타이드를 전달하기 위해 사용될 수 있다.

더욱이, 상기 기재된 리포솜 제제가 면역원성 폴리펩타이드 또는 탄수화물을 리포솜에 부착시키기 위한 앵커로서 "스테로이드 유도체"를 사용하지만, 스테로이드는 비접합 스테로이드, 예컨대 콜레스테롤로서 단순히 제공될 수 있다.

지질 혼합물로부터 리포솜을 제조하는 적합한 방법은 공지된 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Basu & Basu, Liposome Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology ), Humana Press, 2002; Gregoriadis, Liposome Technology, 3 ^rd Edition, Informa HealthCare, 2006]을 참조한다. 바람직한 방법은 상기 문헌에 기재된 압출, 균질화 및 음파처리 방법을 포함한다. 지질 혼합물의 건조, 이후의 수성 비히클 중의 수화 및 음파처리에 의한 리포솜의 형성을 포함하는 본 발명에서 사용하기 위한 리포솜의 예시적인 방법이 WO2010/104833에 기재되어 있다.

소정의 실시형태에서, 리포솜은 특정한 평균 크기 범위 내에 제공된다. 예를 들어, 사전 선택된 기공 크기를 갖는 막을 통해 리포솜을 포함하는 수성 비히클을 압출시키고 막을 통해 흐르는 재료를 수집함으로써 리포솜 크기가 선택될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 리포솜은 직경이 실질적으로 50 내지 500㎚, 더 바람직하게는 직경이 실질적으로 50 내지 200㎚, 가장 바람직하게는 직경이 실질적으로 50 내지 150㎚이도록 선택된다. 본 맥락에서 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "실질적으로"는 적어도 75%, 더 바람직하게는 80%, 가장 바람직하게는 적어도 90%의 리포솜이 지정된 범위 내에 있다는 것을 의미한다.

본 발명에서 용도가 확인될 수 있는 다른 지질 및 지질 유사 애주번트는 수중유(o/w) 에멀션(참조, 예를 들어, 문헌[Muderhwa et al., J. Pharmaceut. Sci. 88: 1332-9, 1999]), 베시백스(등록상표) TLR(Molecular Express, Inc.), 디기토닌(참조, 예를 들어, 미국 특허 5,698,432) 및 글루코피라노실 지질(예를 들어, 미국 특허 출원 20100310602 참조)을 포함한다.

화학치료제

추가의 실시형태에서, 상기 방법은 추가의 치료로서 유효량의 1종 이상의 화학치료제를 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 실시형태에서, 1종 이상의 화학치료제는 아비라테론 아세테이트, 알트레타민, 언하이드로빈블라스틴, 아우리스타틴, 벡사로텐, 비칼루타마이드, BMS 184476, 2,3,4,5,6-펜타플루오로-N-(3-플루오로-4-메톡시페닐)벤젠 설폰아마이드, 블레오마이신, N,N-다이메틸-L-발릴-L-발릴-N-메틸-L-발릴-L-프롤릴-L-프롤린-t-뷰틸아마이드, 카켁틴, 세마도틴, 클로람부실, 사이클로포스파마이드, 3',4'-다이데하이드로-4'-데옥시-8'-노르빈-칼레우코블라스틴, 도세탁솔, 도세탁셀, 사이클로포스파마이드, 카보플라틴, 카르무스틴, 시스플라틴, 크립토피신, 사이클로포스파마이드, 사이타라빈, 다카바진(DTIC), 닥티노마이신, 다우노루비신, 데시타빈 돌라스타틴, 독소루비신(아드리아마이신), 에토포사이드, 5-플루오로유라실, 피나스테라이드, 플루타마이드, 하이드록시유레아 및 하이드록시유레아탁산, 이포스파마이드, 리아로졸, 로니다민, 로무스틴(CCNU), MDV3100, 메클로르에타민(질소 머스타드), 멜팔란, 미보불린 이세티오네이트, 리족신, 세르테네프, 스트렙토조신, 미토마이신, 메토트렉세이트, 탁산, 닐루타마이드, 오나프리스톤, 파클리탁셀, 프레드니무스틴, 프로카바진, RPR109881, 스트라무스틴 포스페이트, 타목시펜, 타소네르민, 탁솔, 트레티노인, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신 설페이트 및 빈플루닌으로부터 선택된다.

면역조절 세포주

"불활화된 종양 세포"는 세포 분열을 방지하도록 처리되는 종양 세포("자가"이든 또는 환자에 "동종이계"이든)를 의미한다. 본 발명의 목적을 위해, 이러한 세포는 이의 면역원성 및 이의 대사 활성을 보존한다. 이러한 종양 세포는 암 치료의 일부로서 환자 내에 발현된 전이유전자를 발현하도록 유전자 변형된다. 따라서, 본 발명의 조성물 또는 백신은 치료를 겪은 환자에 자가 또는 동종이계인 신생(예를 들어, 종양) 세포를 포함하고, 가장 바람직하게는 환자에게 고통스러운 동일한 일반 유형의 종양 세포이다. 예를 들어, 흑색종을 앓는 환자는 통상적으로 흑색종으로부터 유래된 유전자 변형 세포가 투여될 것이다. 조사의 이용과 같은 본 발명에서 사용하기 위한 종양 세포의 불활화 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.

본 발명의 불활화된 종양 세포는 1종 이상의 공동자극 분자 또는 물질과 함께 환자에 투여된다. 바람직한 공동자극 물질은 수지상 세포 유도, 동원 및/또는 성숙을 자극하는 1종 이상의 사이토카인을 포함한다. 이러한 공동자극 물질을 평가하는 방법은 문헌에 널리 공지되어 있다. DC의 유도 및 성숙은 통상적으로 소정의 막 분자, 예컨대 CD80 및 CD86의 발현 증가 및/또는 자극 후 전염증성 사이토카인, 예컨대 IL-12 및 I형 인터페론의 분비에 의해 평가된다.

바람직한 실시형태에서, 불활화된 종양 세포 그 자체는 수지상 세포 유도, 동원 및/또는 성숙을 자극하는 1종 이상의 사이토카인을 발현하고 분비하도록 변형된다. 본 발명은 예시적인 면에서 GM-CSF의 사용과 관련하여 기재되어 있다. 따라서, 예의 방식으로, 종양 세포는 미국 특허 제5,637,483호, 제5,904,920호, 제6,277,368호 및 제6,350,445호 및 미국 특허 공보 20100150946호(이들 각각은 본 명세서에서 참조문헌으로 명확히 포함됨)에 기재된 바대로 GM-CSF를 코딩하는 전이유전자를 발현할 수 있다. 췌장암의 치료를 위한 GM-CSF를 발현하는 유전자 변형 암 세포 또는 "사이토카인을 발현하는 세포 백신"의 형태가 미국 특허 제6,033,674호 및 제5,985,290호(이들 둘 다 본 명세서에서 참조문헌으로 명확히 포함됨)에 기재되어 있다.

GM-CSF 대신에 또는 이것과 함께 이러한 불활화된 종양 세포 및/또는 방관자(bystander) 세포에 의해 발현될 수 있는 다른 적합한 사이토카인은 CD40 리간드, IL-12, CCL3, CCL20 및 CCL21 중 1종 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이 목록은 제한인 것으로 의도되지 않는다.

대상체에 투여되는 불활화된 종양 세포가 관심 대상 1종 이상의 사이토카인을 발현하는 것이 바람직하지만, 종양 세포주는 수지상 세포 유도, 동원 및/또는 성숙을 자극하는 1종 이상의 사이토카인을 발현하고 분비하는 불활화된 방관자 세포주가 동반될 수 있다. 방관자 세포주는 수지상 세포 유도, 동원 및/또는 성숙을 자극하는 모든 사이토카인을 제공할 수 있거나, 불활화된 종양 세포에 의해 발현되고 분비된 수지상 세포 유도, 동원 및/또는 성숙을 자극하는 사이토카인을 보충할 수 있다. 예의 방식으로, 면역조절 사이토카인을 발현하는 방관자 세포주는 미국 특허 제6,464,973호 및 제8,012,469호, 문헌[Dessureault et al., Ann. Surg. Oncol. 14: 869-84, 2007, 및 Eager and Nemunaitis, Mol. Ther. 12: 18-27, 2005](이들 각각 본 명세서에서 참조문헌으로 명확히 포함됨)에 개시되어 있다.

"과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 폴리펩타이드"는 면역조절 활성을 갖고 젠뱅크 수탁번호 AAA52122.1에 적어도 약 85%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 사이토카인 또는 이의 단편을 의미한다.

백신

소정의 실시형태에서, CDN 조성물은 1종 이상의 미리 결정된 항원에 대한 면역 반응을 자극하도록 의도된 1종 이상의 백신과 함께 투여된다. 본 발명에서의 용도가 확인될 수 있는 표적 항원의 예는 하기 표에 기재되어 있다. 표적 항원은 또한 표에 기재된 항원의 면역학적으로 활성인 부분을 포함하는 단편 또는 융합 폴리펩타이드일 수 있다. 이 목록은 제한인 것으로 의도되지 않는다.

적합한 항원이 당해 분야에 공지된 다른 유기체는 클라미디아 트라초마티스(Chlamydia trachomatis), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)(그룹 A 스트렙), 스트렙토코커스 아갈락티아(Streptococcus agalactia)(그룹 B 스트렙), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 에스체리치아 콜라이, 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 나이세리아 고노르헤아에(Neisseria gonorrheae), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 살모넬라 종(티피(typhi), 티피무리움(typhimurium)을 포함), 엔테리카(헬리코박터 파일로리(Helicobactor pylori), 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 및 다른 그룹 D 쉬겔라 종을 포함), 부르크홀데리아 말레이(Burkholderia mallei), 부르크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei), 클레브시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia), 클로스트리듐 종(클로스트리듐 디피실(C. difficile)을 포함), 비브리오 파라하에몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 및 비브리오 불니피쿠스(V. vulnificus)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이 목록은 제한인 것으로 의도되지 않는다.

약제학적 조성물

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "약제학적"은 질병의 치유, 치료 또는 예방에서 사용하기 의해 의도되고 처방 또는 비처방 약물 제품으로서 미국 식품의약청(또는 이의 미국 이외의 유사기관)이 승인 과정에 놓인 화학 물질을 의미한다. 이러한 조성물의 제제 및 투여를 위한 기법에 대한 상세내용은 문헌[Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21^st Edition (Mack Publishing Co., Easton, PA) 및 Nielloud and Marti-Mestres, Pharmaceutical Emulsions and Suspensions: 2^nd Edition (Marcel Dekker, Inc, New York)]에서 확인될 수 있다.

본 개시내용의 목적을 위해, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 애주번트 및 비히클을 함유하는 제제 중에 경구, 장관외, 흡입 스프레이, 국소 또는 직장을 포함하는 다양한 방식에 의해 투여될 수 있다. 여기서 사용되는 용어 장관외는 다양한 점적 기법과 함께 피하, 정맥내, 근육내, 동맥내, 진피내, 척추강내 및 경막외 주사를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 명세서에서 사용되는 동맥내 및 정맥내 주사는 카테타를 통한 투여를 포함한다. 관상동맥내 스텐트 및 관상동맥내 저장소를 통한 투여가 또한 고려된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 경구는 설하 또는 협측 경로에 의한 경구 섭취 또는 전달을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 경구 투여는 유체 드링크, 에너지 바 및 환제 제제를 포함한다.

약제학적 조성물은 의도되는 투여 방법에 적합한 임의의 형태일 수 있다. 경구 용도에 사용될 때, 예를 들어, 정제, 트로키(troche), 로젠지, 수성 또는 오일 현탁액, 분산성 분말 또는 과립, 에멀션, 경질 또는 연질 캡슐, 시럽 또는 엑릭시르제(elixir)가 제조될 수 있다. 경구 용도에 의도되는 조성물은 약제학적 조성물의 제조를 위해 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 따라 제조될 수 있고, 이러한 조성물은 맛있는(palatable) 제제를 제공하기 위해 감미료, 향로, 착색제 및 보존제를 포함하는 1종 이상의 물질을 함유할 수 있다. 정제의 제조에 적합한 비독성의 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합된 약물 화합물을 함유하는 정제가 허용된다. 이 부형제는 예를 들어 불활성 희석제, 예컨대 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토스, 인산칼슘, 인산나트륨; 과립화제 및 붕해제, 예컨대 옥수수 전분 또는 알긴산; 결합제, 예컨대 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 및 활택제; 예컨대 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 탤크일 수 있다. 정제는 코팅되지 않거나, 위장관에서 붕해 및 흡수를 지연시키고/시키거나 더 긴 기간 동안 지속된 작용을 제공하는 장용 코팅, 결장 코팅 또는 마이크로캡슐화를 포함하는 공지된 기법에 의해 코팅될 수 있다. 예를 들어, 시간 지연 물질, 예컨대 글라이세릴 모노스테아레이트 또는 글라이세릴 다이스테아레이트가 단독으로 또는 왁스와 함께 사용될 수 있다.

경구 용도를 위한 제제는 또한 약물 화합물이 불활성 고체 희석제, 예를 들어 인산칼슘 또는 카올린과 혼합된 경질 젤라틴 캡슐 또는 활성 성분이 물 또는 오일 매질, 예컨대 땅콩유, 액체 파라핀 또는 올리브유와 혼합된 연질 경질 젤라틴 캡슐로서 제시될 수 있다.

약제학적 조성물은 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 혼합되어 수성 현탁액으로서 제형화될 수 있다. 이러한 부형제는 현탁제, 예컨대 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸스 검 및 아카시아 검, 및 분산제 또는 습윤제, 예컨대 천연 발생 포스파타이드(예를 들어, 레시틴), 알킬렌 옥사이드와 지방산의 축합 생성물(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트), 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알코올의 축합 생성물(예를 들어, 헵타데카에틸렌옥시세타놀), 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분 에스터의 축합 생성물(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트)을 포함한다. 수성 현탁액은 또한 1종 이상의 보존제, 예컨대 에틸 또는 n-프로필 p-하이드록시-벤조에이트, 1종 이상의 착색제, 1종 이상의 향료 및 1종 이상의 감미료, 예컨대 수크로스 또는 사카린을 함유할 수 있다.

활성 성분을 식물성 오일, 예컨대 아라키스유, 올리브유, 참깨유 또는 코코넛유 또는 광유, 예컨대 액체 파라핀에 현탁시킴으로써 오일 현탁액은 제형화될 수 있다. 경구 현탁액은 점증제(thickening agent), 예컨대 비즈왁스, 경질 파라핀 또는 세틸 알코올을 함유할 수 있다. 맛있는 경구 제제를 제공하기 위해 감미료, 예컨대 상기 기재된 것 및 향료를 첨가할 수 있다. 이 조성물은 항산화제, 예컨대 아스코르브산의 첨가에 의해 보존될 수 있다.

물의 첨가에 의한 수성 현탁액의 제조에 적합한 본 개시내용의 분산성 분말 및 과립은 분산제 또는 습윤제, 현탁제, 및 1종 이상의 보존제와 혼합되어 활성 성분을 제공한다. 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제는 상기 기재된 것에 의해 예시된다. 추가의 부형제, 예를 들어 감미료, 향료 및 착색제가 또한 존재할 수 있다.

본 개시내용의 약제학적 조성물은 또한 수중유 에멀션의 형태일 수 있다. 유상은 식물성 오일, 예컨대 올리브유 또는 아라키스유, 광유, 예컨대 액체 파라핀 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적합한 유화제는 천연 발생 검, 예컨대 아카시아 검 및 트라가칸스 검, 천연 발생 포스파타이드, 예컨대 대두 레시틴, 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 에스터 또는 부분 에스터, 예컨대 소르비탄 모노올레이트, 및 이 부분 에스터와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트를 포함한다. 에멀션은 또한 감미료 및 향료를 함유할 수 있다.

시럽 및 엘릭시르제는 감미료, 예컨대 글라이세롤, 소르비톨 또는 수크로스와 제형화될 수 있다. 이러한 제제는 또한 보호제(demulcent), 보존제, 향료 또는 착색제를 함유할 수 있다.

본 개시내용의 약제학적 조성물은 무균 주사용 제제, 예컨대 무균 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 형태일 수 있다. 이 현탁액은 상기 기재된 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 무균 주사용 제제는 또한 비독성의 장관외로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 무균 주사용 용액 또는 현탁액, 예컨대 1,3-뷰탄-다이올 중의 용액이거나 동결건조 분말로서 제조될 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매 중에서 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 무균 고정유가 용매 또는 현탁 매질로서 관습적으로 사용될 수 있다. 이 목적을 위해, 합성 모노글라이세라이드 또는 다이글라이세라이드를 포함하는 임의의 완화성 고정유가 사용될 수 있다. 또한, 지방산, 예컨대 올레산이 마찬가지로 주사제의 제제에 사용될 수 있다.

단일 제형을 제조하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 숙주 및 특정한 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 인간에 대한 경구 투여에 의도되는 시간 방출 제제는 전체 조성물의 약 5 내지 약 95%로 변할 수 있는 적절하고 편리한 양의 담체 재료와 배합된, 대략 20 내지 500㎎의 활성 물질을 함유할 수 있다. 투여에 대해 쉽게 측정 가능한 양을 제공하는 약제학적 조성물이 제조되는 것이 바람직하다. 통상적으로, 전신으로 투여되는 유효량은 약 0.1㎎/㎏ 내지 약 100㎎/㎏이고, 예를 들어, 대상체(예를 들어, 포유동물, 예컨대 인간)의 연령 및 체중, 치료를 요하는 정확한 병증 및 이의 중증도, 투여 경로를 포함하는 다수의 인자에 따라 달라지고, 궁극적으로 주치의 또는 수의사의 결정에 따를 것이다. 그러나, 당해 분야의 당업자가 잘 이해하는 것처럼 임의의 특정한 환자에 대한 특정한 용량 수준이 사용된 특정한 화합물의 활성, 치료되는 개체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이; 투여 시간 및 경로; 배출 속도; 이전에 투여된 다른 약물; 및 치료를 받은 특정한 병증의 중증도를 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 것이라고 이해할 것이다.

상기 기재된 바대로, 경구 투여에 적합한 본 개시내용의 제제는 분말 또는 과립으로서; 수성 또는 비수성 액체 중의 용액 또는 현탁액으로서, 또는 수중유 액체 에멀션 또는 유중수 액체 에멀션으로서 미리 결정된 양의 활성 성분을 각각 함유하는 별개의 단위, 예컨대 캡슐, 샤세(cachet) 또는 정제로서 제시될 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 환약, 연약(electuary) 또는 페이스트로서 투여될 수 있다.

임의로 1종 이상의 보조 성분과 함께 압축 또는 성형에 의해 정제를 제조할 수 있다. 결합제(예를 들어, 포비돈, 젤라틴, 하이드록시프로필 에틸 셀룰로스), 활택제, 불활성 희석제, 보존제, 붕해제(예를 들어, 나트륨 스타치 글라이콜레이트, 가교결합 포비돈, 가교결합 나트륨 카복시메틸 셀룰로스) 표면 활성제 또는 분산제와 임의로 혼합된, 자유 유동 형태, 예컨대 분말 또는 과립의 활성 성분을 적합한 기계에서 압축함으로써 압축 정제를 제조할 수 있다. 불활성 액체 희석제로 습윤된 분말화 화합물의 혼합물을 사용하여 적합한 기계에서 성형 정제를 제조할 수 있다. 원하는 방출 프로필을 제공하기 위한 변하는 비율의 예를 들어 하이드록시프로필 메틸셀룰로스를 사용하여 내부의 활성 성분의 느리거나 제어된 방출을 제공하도록 정제를 임의로 코팅하거나 분할선 형성하거나 제형화할 수 있다. 정제는 위 이외의 장관의 부분에서 방출을 제공하도록 장용 또는 결장 코팅이 임의로 제공될 수 있다. 이는 이러한 화합물이 산 가수분해될 때 화학식 1의 화합물로 특히 유리하다.

입에서의 국소 투여에 적합한 제제는 향 기제, 보통 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸스 중에 활성 성분을 포함하는 로젠지; 불활성 기제, 예컨대 젤라틴 및 글라이세린 또는 수크로스 및 아카시아 중에 활성 성분을 포함하는 파스틸(pastille); 및 적합한 액체 담체 중에 활성 성분을 포함하는 구강세정제를 포함한다.

직장 투여를 위한 제제는 예를 들어 코코아 버터 또는 살리실레이트를 포함하는 적합한 기제를 갖는 좌제로서 제시될 수 있다.

질내 투여에 적합한 제제는 활성 성분 이외에 당해 분야에서 적절한 것으로 공지된 이러한 담체를 포함하는 페서리(pessary), 탐폰(tampon), 크림, 겔, 페이스트, 폼(foam) 또는 스프레이 제제로서 제시될 수 있다.

장관외 투여에 적합한 제제는 제제가 의도되는 수혜자의 혈액과 등장성이 되게 하는 항산화제, 완충제, 세균발육저지제(bacteriostat) 및 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 등장성 무균 주사 용액; 및 현탁제 및 점증화제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 무균 현탁액을 포함한다. 제제는 단일 용량 또는 다중 용량 밀봉 용기, 예를 들어, 앰플 및 바이알로서 제시될 수 있고, 사용 직전에 무균 액체 담체, 예를 들어 주사용수의 첨가만을 요하는 동결 건조(동결건조된) 조건에서 저장될 수 있다. 주사 용액 및 현탁액은 상기 기재된 종류의 무균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바대로, 약제학적으로 허용되는 염은 아세테이트, 피리딘, 암모늄, 피페라진, 다이에틸아민, 니코틴아마이드, 폼산, 유레아, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 아연, 리튬, 신남산, 메틸아미노, 메탄설폰산, 피크르산, 타르타르산, 트라이에틸아미노, 다이메틸아미노 및 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 추가의 약제학적으로 허용되는 염은 당해 분야의 당업자에 공지되어 있다.

특정한 환자에 대한 유효량은 치료되는 병증, 환자의 전체 건강, 투여 경로 및 용량, 및 부작용의 중증도와 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 치료 및 진단의 방법에 대한 가이드라인이 이용 가능하다(예를 들어, 문헌[Maynard, et al. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FL; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK] 참조).

유효량은 일 용량으로 제공될 수 있지만, 일 용량으로 제한되지는 않는다. 따라서, 투여는 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회, 12회, 13회, 14회, 15회, 16회, 17회, 18회, 19회, 20회 이상의 약제학적 조성물의 투여일 수 있다. 본 방법에서 1회 초과의 약제학적 조성물의 투여가 존재할 때, 투여는 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분 이상의 시간 간격으로, 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 24시간 등의 시간 간격으로 벌어질 수 있다. 시간의 맥락에서, 용어 "약"은 30분 내의 플러스 또는 마이너스 임의의 시간 간격을 의미한다. 투여는 또한 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일 및 이들의 조합의 시간 간격으로 벌어질 수 있다. 본 발명은 시간상 동등하게 벌어진 투약 간격으로 제한되지 않지만, 동등하지 않은 간격에서의 투약을 포함한다.

예를 들어, 1회/주, 2회/주, 3회/주, 4회/주, 5회/주, 6회/주, 7회/주, 2주 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 5주마다 1회 등의 투약 스케줄이 본 발명에 이용 가능하다. 투약 스케줄은 예를 들어 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월 및 12개월의 전체 기간 동안의 투약을 포함한다.

상기 투약 스케줄의 주기가 제공된다. 주기는 예를 들어 약 7일마다; 14일마다; 21일마다; 28일마다; 35일마다; 42일마다; 49일마다; 56일마다; 63일마다; 70일마다; 등 반복될 수 있다. 비투약 간격은 주기 사이에 발생할 수 있고, 간격은 예를 들어 약 7일; 14일; 21일; 28일; 35일; 42일; 49일; 56일; 63일; 70일; 등일 수 있다. 본 맥락에서, 용어 "약"은 플러스 또는 마이너스 1일, 플러스 또는 마이너스 2일, 플러스 또는 마이너스 3일, 플러스 또는 마이너스 4일, 플러스 또는 마이너스 5일, 플러스 또는 마이너스 6일, 또는 플러스 또는 마이너스 7일을 포함한다.

기재된 바대로, 본 발명의 조성물은 바람직하게는 장관외 또는 장관내 전달을 위한 약제학적 조성물로서 제형화된다. 동물에 대한 투여를 위한 통상적인 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 비히클, 예컨대 수성 용액, 비독성 부형제, 예컨대 염, 보존제, 완충제 등을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 15 th Ed ., Easton ed., Mack Publishing Co., pp 1405-1412 및 1461-1487 (1975); The National Formulary XIV , 14 th Ed ., American Pharmaceutical Association, Washington, DC (1975)]을 참조한다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글라이콜, 폴리에틸렌 글라이콜, 식물성 오일 및 주사용 유기 에스터, 예컨대 에틸올레이트를 들 수 있다. 수성 담체는 물, 알코올성/수성 용액, 식염수, 장관외 비히클, 예컨대 염화나트륨. 링거 덱스트로스 등을 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양소 보충제(replenisher)를 포함한다. 보존제는 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제 및 불활성 가스를 포함한다. 약제학적 조성물의 다양한 성분의 pH 및 정확한 농도는 당해 분야의 통상의 기술에 따라 조정된다.

특정한 백신의 반복 투여는(상동성 부스팅) 체액성 반응을 부스팅하는 데 효과적인 것으로 입증되었다. 벡터에 대한 이전의 면역이 강건한 항원 제시 및 적절한 염증성 신호의 생성을 손상시키는 경향이 있으므로, 이러한 접근법은 세포 면역을 부스팅하는 데 효과적이 아닐 수 있다. 이 문제를 피하는 일 접근법은 상이한 항원 전달 시스템을 사용하는 백신의 순차 투여(비상동성 부스팅)이다. 비상동성 부스팅 섭생에서, 적어도 하나의 프라임 또는 부스트 전달은 본 명세서에 기재된 불활화된 종양 세포/환식 퓨린 다이뉴클레오타이드 조성물의 전달을 포함한다. 섭생의 비상동성 암은 하기 전략 중 하나 이상을 사용한 항원의 전달을 포함할 수 있다:

관심 대상 항원을 포함하는 불활화된 또는 약독화된 박테리아 또는 바이러스, 이는 병원균 침입을 증가시키는 데 있어서 이들이 비효과적 또는 비효율적이게 만드는 몇몇 변성 조건으로 처리된 입자임;

정제된 항원, 이는 통상적으로 병원균 또는 병원균을 함유하는 조직 샘플, 또는 이들의 재조합 버전의 세포 배양물로부터 정제된 천연 생성 항원임;

대상체의 숙주 세포에서 항원을 발현하고/하거나 분비하도록 재조합으로 조작된 생 바이러스 또는 박테리아 전달 벡터. 이 전략은 (예를 들어, 유전자 조작을 통해) 바이러스 또는 박테리아 벡터가 비병원균성 및 비독성이 되도록 약독화하는 것에 의존한다;

항원이 장입되거나 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물로 형질감염된 세포를 포함하는 항원 제시 세포(APC) 벡터, 예컨대 수지상 세포(DC) 벡터(예를 들어, 거세 저항 전이성 전립선암의 치료를 위한 프로벤지(Provenge)(등록상표)(Dendreon Corporation));

리포솜 항원 전달 비히클; 및

유전자 총, 전기천공, 박테리아 고스트, 마이크로구, 마이크로입자, 리포솜, 다중양이온성 나노입자 등에 의해 투여될 수 있는 네이키드 DNA 벡터 및 네이키드 RNA 벡터.

프라임 백신 및 부스트 백신은 하기 경로 중 임의의 하나 또는 이들의 조합에 의해 투여될 수 있다. 일 양상에서, 프라임 백신 및 부스트 백신은 동일한 경로로 투여된다. 다른 양상에서, 프라임 백신 및 부스트 백신은 상이한 경로로 투여된다. 용어 "상이한 경로"는 신체의 상이한 부위, 예를 들어, 경구, 비경구, 장관내, 장관외, 직장, 절내(intranode)(림프절), 정맥내, 동맥, 피하, 근육내, 종양내, 종양주변, 종양내, 점적(infusion), 점막, 비강, 뇌척수 공간 또는 뇌척수액 등, 및 상이한 방식, 예를 들어, 경구, 정맥내 및 근육내를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

프라임 또는 부스트 백신의 유효량은 일 용량으로 제공될 수 있지만, 일 용량으로 제한되지는 않는다. 따라서, 투여는 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회, 12회, 13회, 14회, 15회, 16회, 17회, 18회, 19회, 20회 이상의 백신의 투여일 수 있다. 본 방법에서 1회 초과의 백신의 투여가 존재할 때, 투여는 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분 이상의 시간 간격으로, 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 24시간 등의 시간 간격으로 벌어질 수 있다. 시간의 맥락에서, 용어 "약"은 30분 내의 플러스 또는 마이너스 임의의 시간 간격을 의미한다. 투여는 또한 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일 및 이들의 조합의 시간 간격으로 벌어질 수 있다. 본 발명은 시간상 동등하게 벌어진 투약 간격으로 제한되지 않지만, 예컨대 1일, 4일, 7일 및 25일의 투여로 이루어진 프라이밍 스케줄(단지 비제한적인 예를 제공함)로 이루어진 동등하지 않은 간격에서의 투약을 포함한다.

참조문헌

실시예

하기 실시예는 본 발명을 예시하도록 작용한다. 이 실시예는 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다.

실시예 1. 일반적 방법

액상 올리고뉴클레오타이드 합성에 적합한 무수 용매 및 시약을 구입하고 무수 기법을 이용하여 건조 아르곤 또는 질소 하에 취급하였다. 아미다이트 커플링 반응 및 고리화를 건조 아르곤 또는 질소 하에 무수 아세토나이트릴 또는 피리딘 중에 수행하였다. 건조 피리딘 중의 모든 반응을 위한 출발 물질을 피리딘으로부터 농축(3회)에 의해 건조시켰다. 다이클로로메탄 중의 메탄올의 구배를 이용하여 플루카(Fluka) 60Å 고순도 등급 또는 머크(Merck) 등급 9385 실리카를 사용하여 제조용 실리카 겔 섬광 크로마토그래피를 수행하였다. 1.0㎖/분 흐름에서의 10mM TEAA 및 아세토나이트릴의 구배를 이용하여 배리언 마이크로소브(Varian Microsorb) 100-10 C₁₈ 250x4.6㎜ 칼럼에서 254㎚에서 모니터링하는 프로스타 330 포토다이오드 검정 검출기가 구비된 배리언 프로스타(Varian ProStar) 210 HPLC 시스템에서 분석용 HPLC를 수행하였다. 유속 50㎖/분에서의 10mM TEAA 및 아세토나이트릴의 구배를 이용하여 배리언 마이크로소브 60-8 C-18 41.6x250㎜ 칼럼에서 254㎚에서 모니터링하는 SPD-20A UV/Vis 검출기가 구비된 시마즈(Shimadzu) 제조용 LC20-AP HPLC 시스템에서 제조용 HPLC를 수행하였다. 약 3%(중량/중량)의 로딩에서 C-18 Sep-Pak(워터스(Waters))를 이용하는 고상 추출을 수행하였다. 시마즈 LC20D 분석용 HPLC를 사용하여 PDA, MS 및 ELSD 검출에 의한 단일 쿼드러플 시마즈 2010EV 기기에서 LC/MS(ESI/APCI)를 얻었다. 예일대학교(코네티컷주 뉴헤븐)의 WM 케크 재단 생명공학 자원 실험실(WM Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory)로부터 고해상 FT-ICR 질량 분광법을 얻었다. 브루커(Bruker) 400MHz 또는 배리언 이노바(Varian Inova) 500MHz 분광기에서 ¹H 및 ³¹P NMR 스펙트럼을 획득하였다. ³¹P NMR은 간접적으로 D2O 중의 다이옥산에 대해 참조된다.

HPLC 정제된 환식 다이뉴클레오타이드 및 유도체의 배정이 표 1에 요약되어 있고 실시예에 자세히 기재되어 있다.

[표 1]

실시예 2. 10a의 합성.

환식-다이-AMP의 하기 합성이 도 6에 도식적으로 기재되어 있고, 가프니(Gaffney) 등[c-다이-GMP 및 [Rp,Rp] 및 [Rp,Sp] 티오포스페이트 유사체의 1 플라스크 합성. Organic Letters 12, 3269-3271 (2010)]이 보고한 환식-다이-GMP의 합성의 변형이다.

a) 2-클로로-5,6-벤조-1,3,2-다이옥사포스포린-4-온(2)에 의한 1의 포스피틸화 및 CH2Cl2/헥산(1:1)에 의한 고체-액체 추출은 5'-DMT-3'-H-포스포네이트 4를 생성시킨다.

15㎖의 무수 다이옥산 및 5㎖의 건조 피리딘 중의 1(3.94g, 5mmol)의 용액에 2-클로로-5,6-벤조-1,3,2-다이옥사포스포린-4-온(2)의 다이옥산 중의 5.6㎖(7.0mmol)의 1.25M 스톡 용액을 교반하면서 첨가하였다. 15분 후, 반응물을 1㎖의 물로 급랭시키고 혼합물을 10㎖의 0.25M NaHCO3에 부은 후 에틸 아세테이트로 추출(3x15㎖)하였다. 유기상을 건조(Na2SO4)시키고 농축시켜 3.8g을 생성시켰다. 고체를 100㎖의 CH2Cl2/헥산(1:1)으로 미분쇄하고 여과시키고 잔류 고체를 건조시켜 미세한 백색 분말(3.5g)을 생성시키고, 이것은 0.5% 트라이에틸아민과 CH2Cl2 중의 5% CH3OH로 용리시키면서 TLC(Rf=0.1)에서 1 스팟으로 실행되었다.

b) 실리카 겔에 흡착된 중탄산나트륨(NaHSO4-SiO2)에 의한 탈트리틸화 및 5'-OH-3'-H-포스포네이트(5)의 침전.

85㎖의 다이클로로메탄 및 0.072㎖의 물(4mmole) 중의 4(1.74g, 2mmol)의 용액에 0.55g의 NaHSO4-SiO2(2.4mmol H⁺/gr NaHSO4-SiO2)를 첨가하였다. 35분 동안 실온에서 교반한 후 반응을 완료시켰다(0.5% TEA와 CH2Cl2 중의 10% MeOH에서의 TLC). NaHSO4-SiO2를 여과로 제거하고 CH2Cl2로 세척(3x5㎖)하였다. 100㎖의 헥산:톨루엔(1:1)을 첨가하고 5분 동안 와류시키고 용매를 경사여과하였다(2회 반복). 증발하여 고체로서 0.92g의 5를 생성하였다. 분석용 HPLC는 96.4%의 순도를 나타냈다. 음성 모드에서의 LC/MS는 m/z (M-1) 548.2를 확인시켜주었다(C₂₃H₃₁N₅O₇PSi^-에 대한 계산치: 548.2).

c) 커플링, 산화 및 탈트리틸화

DMT-rA(bz)-βCE-TBDMS-포스포르아미다이트(3)(3.5g, 3.6mmole)를 20㎖의 건조 아세토나이트릴로 3회 공증발시키고, 마지막 회차에 약 10㎖ 용적이 남았고, 여기에 10개의 3Å 분자체를 첨가하였다. 용액을 건조 아르곤 하에 정치시켰다.

1.6g의 H-포스포네이트(5)를 무수 CH3CN으로 3회 증발시키고, 마지막 회차에 100㎖가 남았다. 이 용액을 주사기를 통해 건조된 포스포르아미다이트 용액에 첨가한 후 1.4g의 피리디늄 트라이플루오로아세테이트(무수 피리딘으로부터 3x20㎖를 증발시킴으로써 건조됨)를 첨가하였다. 20분 후, 3㎖의 5.5M tert-뷰틸하이드로퍼옥사이드를 첨가하고 30분 동안 교반하였다. 빙욕에서 냉각시킨 후, 1㎖의 물 중의 0.3g의 NaHSO3을 첨가하고 혼합물을 5분 동안 교반하였다. 이후, 용매를 증발시키고 잔류물을 20㎖(CH₂Cl₂/MeOH, 98:2) 중에 채웠다. 체를 여과시키고 용매를 81㎖의 CH₂Cl₂로 전환시켰다. NaHSO₄-SiO₂(513㎎) 및 물(65마이크로리터)을 첨가하고 반응물을 40분 동안 교반하였다. 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시키고, 패드를 CH₂Cl₂로 세척하고, 여과액을 증발시켜 미정제 7a를 생성하였다. 음성 모드에서의 LC/MS는 m/z (M-1) 1148.5(C₄₉H₆₄N₁₁O₁₄P₂Si₂ ^-에 대한 계산치: 1148.37)인 것으로 확인되었다.

d) 선형 이합체(7a)의 고리화 및 산화는 8a를 생성시킨다.

미정제 7a(무수 피리딘으로부터 증발에 의해 건조되어 최종 증발 후 100㎖가 남음)에 DMOCP(1.9g, 10.15mmol)를 첨가하였다. 12분 후, 반응물을 물(2.3g)로 급랭시킨 직후 요오드(0.96g, 3.78mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 0.6g NaHSO₃을 함유하는 400㎖의 물에 부었다. 5분 교반한 후, 11.2g의 NaHCO₃을 분액으로 첨가하고 용액을 5분 동안 교반하였다. 혼합물을 500㎖의 에틸 아세테이트/에터(3:2)로 2회 분배하였다. 유기층을 합하고, 건조(Na₂SO₄)시키고 증발시켰다. 톨루엔(3x10㎖)을 첨가하고 증발시켜 잔류 피리딘을 제거하여 황색 내지 갈색의 고체로서 2.37g의 8a를 생성하였다. 음성 모드에서의 LC/MS는 m/z (M-1) 1146.6(C₄₉H₆₂N₁₁O₁₄P₂Si₂ ^-에 대한 계산치: 1146.4)인 것으로 확인되었다.

e) 농축 수산화암모늄에 의한 미정제 8a의 탈보호는 미정제 9a를 생성시키고 제조용 HPLC는 순수한 형태의 9a를 생성시킨다.

200㎖의 두꺼운 벽의 유리 압력 관 내에서 600㎎의 8a에 40㎖의 메탄올 및 40㎖의 농축 수성 암모니아를 첨가하고, 생성된 혼합물을 50℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 진공 하에 농축시키고 잔류물을 에틸 아세테이트(3x10㎖)로 세척하여 510㎎의 미정제 9a를 생성하였다.

10mM 트라이에틸암모늄 아세테이트 중의 4㎖의 20% CH3CN 중의 미정제 9a의 102㎎의 분획을 제조용 HPLC 칼럼에 적용하고 물 중의 아세토나이트릴 및 10mM 트라이에틸암모늄 아세테이트의 구배(50㎖/분 흐름에서 20분에 걸쳐 20→50% CH3CN)를 이용하여 용리시켰다. 순수한 9a를 함유하는 HPLC 분획을 풀링하고 증발시켜 CH3CN을 제거하고 동결건조시켜 잔류 물 및 휘발성 완충제를 제거하여 비스-트라이에틸암모늄염으로서 32㎎의 순수한 9a를 생성하였다. 음성 모드에서의 LC/MS는 m/z (M-1) 885.5(C₃₂H₅₁N₁₀O₁₂P₂Si₂ ^-에 대한 계산치: 885.3)인 것으로 확인되었다. (하기 c-다이-GMP 및 다이티오-c-다이-GMP 시리즈에 기재된 바대로 마지막 단계 후까지 제조용 HPLC 정제를 또한 연기할 수 있다).

f) 트라이에틸아민 트라이하이드로플루오라이드에 의한 9a의 TBS기의 탈보호, TEAB에 의한 중화 및 C-18 Sep-Pak에 의한 고상 추출은 비스-트라이에틸암모늄 염으로서 순수한 10a를 생성시킨다.

20㎎의 9a에 0.25㎖의 트라이에틸아민 트라이하이드로플루오라이드를 첨가하였다. 혼합물을 48시간 동안 진탕기에 놓고, 이때 100마이크로리터의 1M 트라이에틸암모늄 비카보네이트로 중화된 10마이크로리터의 샘플의 분석용 HPLC는 출발 물질의 소모 및 단일 새로운 생성물의 출현을 나타낸다. 이후, 반응 혼합물을 10 x 용적의 차가운 1M 트라이에틸암모늄 비카보네이트에 교반하면서 적하하였다. 이후, 중화된 용액을 워터스 C-18 Sep-Pak에 로딩하고, 6 용적의 10mM 트라이에틸암모늄 아세테이트로 칼럼을 세척한 후, 생성물을 CH3CN:트라이에틸암모늄 아세테이트(1:1)로 용리시켰다. CH3CN을 회전증발을 통해 제거하고 수성 샘플을 동결건조시켜 비스-트라이에틸암모늄염으로서 14㎎의 10a를 생성시켰다. 음성 모드에서의 10a의 HRMS는 m/z (M-H) 657.0985(C₂₀H₂₃N₁₀O₁₂P₂ ^-에 대한 계산치: 657.0978)인 것으로 확인되었다. ¹H NMR (D₂O) 45℃ δ (ppm) 8.34 (s, 2H), 8.11 (s, 2H), 6.15 (s, 2H), 4.34 (m, 4H), 4.15 (m, 2H), 3.77 (m, 2H), 3.19 (q, J = 7Hz), 1.27 (t, J = 7Hz). ³¹P NMR (D2O) 25℃. δ (ppm) -1.74.

실시예 3. 10b 및 10c의 합성.

하기 합성은 도 6에 도식적으로 기재되어 있디.

a) 상업적으로 이용 가능한 DMT-rA(bz)-βCE-TBDMS-포스포르아미다이트(3)의 가수분해, β-제거 및 생성된 5'-DMT-3'-H-포스포네이트(4)의 실리카 크로마토그래피:

50㎖의 아세토나이트릴 중의 DMT-rA(bz)-βCE-TBDMS-포스포르아미다이트(3)(11g, 11.1mmole)의 용액에 물(0.36㎖, 20mmole, 1.8당량) 및 피리디늄 트라이플루오로아세테이트(2.3g, 11.9mmole, 1.07당량)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반한 후, tert-뷰틸아민(50㎖)을 첨가하고 추가로 10분 동안 계속해서 교반하였다. 이후, 혼합물을 폼(foam)으로 농축시키고, 이 폼을 다이클로로메탄 중에 채우고 다이클로로메탄 중의 5% 내지 10% MeOH의 구배로 용리되는 실리카 겔 칼럼에 적용하였다. 원하는 생성물을 함유하는 칼럼 분획을 풀링하고 농축시켜 폼(6.68g, 7.8mmole, 70% 수율)으로서 5'-DMT-3'-H-포스포네이트(4)를 생성하였다.

b) 5'-OH-3'-H-포스포네이트(5)의 탈트리틸화 및 침전:

60㎖의 다이클로로메탄 및 1.4㎖의 물(78mmole, 10당량) 중의 4(6.68g, 7.8mmol)의 용액에 다이클로로메탄(73mmole, 9.35당량) 중의 6% 다이클로로아세트산의 100㎖의 분획을 첨가하였다. 실온에서 10분 동안 교반한 후, 피리딘(11.2㎖, 139mmole, DCA에 기초하여 1.9당량)을 첨가하여 산을 급랭시키고 혼합물을 농축하여 황색 내지 오렌지색의 유리로서 5를 생성하였다. 유리를 약 20㎖의 다이클로로메탄 중에 채우고 500㎖의 7:3 헥산:다이에틸에터에 교반하면서 적하하여 원하는 5'-OH-3'-H-포스포네이트(5)를 침전시켰다. 상청액을 침전물(이들 대부분은 플라스크의 벽에 달라붙는 검을 형성함)로부터 경사여과시키고 감압 하에 건조시켜 과립형 슬러리를 형성하였다. 이 슬러리를 40㎖의 건조 아세토나이트릴로 3회 증발시키고, 마지막 회차에 약 12㎖가 남았다.

c) 아세토나이트릴 중의 포스포르아미다이트(3)의 건조 용액의 제조, 5'-OH-3'-H-포스포네이트(5)에 의한 커플링, 및 황화(선형 이합체 티오포스페이트(6b)를 생성시킴), 및 탈트리틸화(7b를 생성시킴).

DMT-rA(bz)-βCE-TBDMS-포스포르아미다이트(3)(9.08g, 9.36mmole, H-포스포네이트(5)에 기초한 1.2당량)를 40㎖의 건조 아세토나이트릴로 3회 공증발시키고, 마지막 회차에 약 20㎖의 용적이 남았고, 여기에 10개의 3Å 분자체를 첨가하였다. 용액이 건조 아르곤 하에 남았다.

포스포르아미다이트(3)의 용액에 건조 아르곤 하에 (b로부터의) 5를 첨가하였다. 실온에서 10분 동안 교반한 후, (다이티오 유사체로의 전환을 위해) 반응 혼합물의 절반을 아르곤 하에 제2 반응 용기로 옮기고, 3-((N,N-다이메틸아미노메틸리덴)아미노-3H-1,2,4-다이티아졸-5-티온(0.88g, 4.29mmol, 1.1당량)을 첨가하였다. 실온에서 교반한 30분 후, -20℃에서 냉동기에 놓아 반응을 중지시켰다. 냉동기에서 48시간 초과 동안 저장하면서, 황색의 침전물이 용액으로부터 분리되었다. 혼합물을 여과시키고 여과액을 폼(3.9g)으로 농축시키고, 50㎖의 CH2Cl2 중에 용해시키고 100㎕의 물로 처리한 직후 800㎎의 NaHSO4-실리카로 처리하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하고 여과시켜 실리카를 제거하였다. 이후, 60㎖의 헥산을 여과액에 첨가하고 하부 상이 용액으로부터 빠져나왔다. 오일을 분리하고 증발시켜 3.1g의 미정제 7b를 생성시켰다.

d) 선형 이합체(7b)의 고리화, 황화 및 실리카 크로마토그래피는 8b 및 8c의 혼합물을 생성시킨다.

7b(3.05g, 2.6mmol)를 무수 피리딘으로부터 증발에 의해 건조시킨 후(200㎖의 피리딘을 첨가하고 회전증발시켜 120㎖가 남았음), DMOCP(1.68g, 9.1mmol, 3.5당량)를 첨가하였다. 12분 후, 반응물을 물(1.63g, 91mmol)로 급랭시킨 직후 0.675g(3.0mmol, 1.2당량)의 3-H-1,2-벤조다이티올-3-온을 첨가하였다. 반응 혼합물을 500㎖의 0.25M 중탄산나트륨에 부은 후 에틸아세테이트/다이에틸에터(3:2)로 2x500㎖ 추출하였다. 유기층을 합하고 건조(Na2SO4)시키고 진공 하에 증발시켰다. 톨루엔(3x10㎖)을 첨가하고 증발시켜 잔류 피리딘을 제거하였다. 잔류물을 실리카 칼럼에 적용하고 CH2Cl2 중의 0 내지 10%의 CH3OH의 구배로 용리시켜 부분입체이성체 8b 및 8c를 대부분 함유하는 전체 1.47g을 생성시켰다.

e) 농축 수산화암모늄에 의한 8b 및 8c의 혼합물의 탈보호는 9b 및 9c를 생성시키고 제조용 HPLC를 통한 분리는 순수한 형태의 9b 및 9c를 생성시킨다.

유리 압력 관에서의 230㎎의 8b 및 8c의 혼합물에 16㎖의 메탄올을 첨가한 후 16㎖의 농축 수성 암모니아를 첨가하고, 생성된 혼합물을 50℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 진공 하에 농축시키고 잔류물을 에틸 아세테이트(3x10㎖)로 세척하여 210㎎의 9b 및 9c의 미정제 혼합물을 생성시켰다. 9b/9c 혼합물에 대한 음성 모드에서의 LC/MS는 m/z (M-1) 917(C₃₂H₅₁N₁₀O₁₀P₂S₂Si₂ ^-에 대한 계산치: 917.2)인 것으로 확인되었다.

제조용 HPLC를 통한 9b/9c의 혼합물의 분리. 10mM 트라이에틸암모늄 아세테이트 중의 4㎖의 30% CH3CN 중의 9b 및 9c의 미정제 혼합물의 105㎎의 분획을 제조용 HPLC 칼럼에 적용하고, 아세토나이트릴 및 10mM 트라이에틸암모늄 아세테이트의 구배(50㎖/분 흐름에서 20분에 걸쳐 30→50% CH3CN)를 이용하여 용리시켰다. 순수한 9c를 함유하는 것으로부터 순수한 9b를 함유하는 HPLC 분획을 분리하였다. 혼주된 분획을 증발시켜 CH3CN을 제거하고 동결건조시켜 잔류 물 및 휘발성 완충제를 제거하여 비스-트라이에틸암모늄염으로서 18㎎의 9b 및 14㎎의 9c를 생성시켰다.

f) 트라이에틸아민 트라이하이드로플루오라이드에 의한 9b의 TBS기의 탈보호, TEAB에 의한 중화 및 C-18 Sep-Pak에 의한 고상 추출(SPE)은 비스-트라이에틸암모늄염으로서 순수한 10b를 생성시킨다.

8㎎의 9b에 0.4㎖의 트라이에틸아민 트라이하이드로플루오라이드를 첨가하였다. 혼합물을 16시간 동안 진탕기에 놓고, 이때 100마이크로리터의 1M 트라이에틸암모늄 비카보네이트(TEAB)로 중화된 5마이크로리터의 샘플의 분석용 HPLC는 출발 물질의 소모 및 단일 새로운 생성물의 출현을 나타낸다. 이후, 반응 혼합물을 교반하면서 약 10 x 용적의 차가운 1M 트라이에틸암모늄 비카보네이트에 적하하였다. 이후, 중화된 용액을 워터스 C-18 Sep Pak에 로딩하고, 6 용적의 10mM 트라이에틸암모늄 아세테이트로 칼럼을 세척한 후, 생성물을 CH3CN:10mM 트라이에틸암모늄 아세테이트(1:5)로 용리시켰다. CH3CN을 회전증발을 통해 제거하고, 수성 샘플을 동결건조시켜 비스-트라이에틸암모늄염으로서 6㎎의 10b를 생성시켰다. 음성 모드에서의 10b의 HRMS는 m/z (M-H) 689.0526(C₂₀H₂₃N₁₀O₁₀P₂S₂ ^-에 대한 계산치: 689.0521)인 것으로 확인되었다. ¹H NMR (D₂O) 35℃ δ 8.39 (s, 2H), δ 8.16 (s, 2H), δ 6.16 (s, 2H), δ 4.97-5.03 (m, 2H), δ 4.78 (m, 2H), δ 4.50-4.55 (m, 4H), δ 4.04-4.08 (m, 2H), δ 3.20 (q, J = 7Hz), δ 1.27 (t, J = 7Hz). ³¹P NMR (D2O) 25℃. δ (ppm) 54.41.

g) 트라이에틸아민 트라이하이드로플루오라이드에 의한 9c의 TBS기의 탈보호, TEAB에 의한 중화 및 C-18 Sep-Pak에 의한 고상 추출은 비스-트라이에틸암모늄염으로서 순수한 10c를 생성시킨다.

6㎎의 9c에 0.3㎖의 트라이에틸아민 트라이하이드로플루오라이드를 첨가하였다. 혼합물을 16시간 동안 진탕기에 놓고 (f)에서처럼 적은 분취량의 후처리는 출발 물질의 소모 및 단일 새로운 생성물의 출현을 나타낸다. 이후, 반응 혼합물을 교반하면서 약 10 x 용적의 차가운 1M 트라이에틸암모늄 비카보네이트에 적하하였다. 이후, 중화된 용액을 워터스 C-18 Sep Pak에 로딩하고, 6 용적의 10mM 트라이에틸암모늄 아세테이트로 칼럼을 세척한 후, 생성물을 CH3CN:10mM 트라이에틸암모늄 아세테이트(1:5)로 용리시켰다. CH3CN을 회전증발을 통해 제거하고 수성 샘플을 동결건조시켜 비스-트라이에틸암모늄염으로서 4㎎의 10c를 생성시켰다. 음성 모드에서의 10c의 HRMS는 m/z (M-H) 689.0524(C₂₀H₂₃N₁₀O₁₀P₂S₂ ^-에 대한 계산치: 689.0521)인 것으로 확인되었다. ¹H NMR (D₂O) 35℃ δ (ppm) 8.50 (s, 2H), δ 8.37 (s, 2H), δ 8.20 (s, 2H), δ 8.10 (s, 2H), δ 6.17 (s, 2H), δ 6.14 (s, 2H), δ 5.06-5.07 (m, 2H), δ 4.96-5.02 (m, 2H), δ 4.87-4.93 (m, 2H), δ 4.75 (m, 2H), δ 4.34-4.56 (m, 10H), δ 3.98-4.13 (m, 2H), δ 3.20 (q, J = 7Hz), δ 1.27 (t, J = 7Hz). ³¹P NMR (D2O) 25℃. δ (ppm) 54.54, 54.84, 55.92 (마이너).

실시예 4. (11a), (11b) 및 (11c)의 합성.

생물학적 시험에 대해 97% 이상의 순도를 성취하기 위해 11a, 11b 및 11c를 재결정화 대신에 최종 생성물의 제조용 HPLC 정제의 부가(하기 예시됨)로 가프니 등이 기재한 바대로 합성하였다. 대안적으로, 도 6, 실시예 2 및 실시예 3에서 아데노신 시리즈에 대해 기재된 바대로 고리화 및 탈보호 단계 후에 제조용 HPLC 정제를 실행할 수 있다.

11a

3㎖의 10mM 트라이에틸암모늄 아세테이트 중의 11a의 100㎎의 분획을 제조용 HPLC 칼럼에 적용하고, 물 중의 아세토나이트릴 및 10mM 트라이에틸암모늄 아세테이트의 구배(50㎖/분 흐름에서 22분에 걸쳐 0% 내지 10% CH3CN 구배)를 이용하여 용리시켰다. 순수한 11a를 함유하는 HPLC 분획을 풀링하고 CH3CN을 회전증발을 통해 제거하고 잔류하는 수성 샘플을 동결건조시켜 비스-트라이에틸암모늄염으로서 40㎎의 순수한 11a를 생성시켰다. 음성 모드에서의 11a의 HRMS는 m/z (M-H) 689.0893(C₂₀H₂₃N₁₀O₁₄P₂ ^-에 대한 계산치: 689.0876)인 것으로 확인되었다. ¹H NMR (D₂O) 45℃ δ (ppm) 8.05 (s, 2H), 5.98 (s, 2H), 4.90 (m, 2H), 4.76 (m, 2H), 4.41 (m, 2H), 4.33 (m, 2H), 4.09 (m, 2H), 3.19 (q, J = 7Hz, 6H), 1.28 (t, J = 7Hz, 9H). 31P NMR (D2O) 25℃. δ (ppm) -1.24.

11b

10mM 트라이에틸암모늄 아세테이트 중의 3㎖의 6% CH3CN 중의 농후한 11b의 100㎎의 분획을 제조용 HPLC 칼럼에 적용하고, 물 중의 아세토나이트릴 및 10mM 트라이에틸암모늄 아세테이트의 구배(50㎖/분 흐름에서 22분에 걸쳐 6% 내지 18% CH3CN 구배)를 이용하여 용리시켰다. 순수한 11b를 함유하는 HPLC 분획을 풀링하고 CH3CN을 회전증발을 통해 제거하고 잔류하는 수성 샘플을 동결건조시켜 비스-트라이에틸암모늄염으로서 40㎎(40% 수율)의 순수한 11b를 생성시켰다. 음성 모드에서의 11b의 HRMS는 m/z (M-H) 721.0446(C₂₀H₂₃N₁₀O₁₂P₂S₂ ^-에 대한 계산치: 721.0419)인 것으로 확인되었다. ¹H NMR (D₂O) 45℃ δ 8.05 (s, 2H), 5.98 (s, 2H), 5.03 (m, 2H), 4.77 (m, 4H), 4.10 (m, 2H), 4.08 (m, 2H), 3.19 (q, J = 7Hz, 6H), 1.28 (t, J = 7Hz, 9H). ³¹P NMR (D2O) 25℃. δ 54.87.

11c

10mM 트라이에틸암모늄 아세테이트 중의 3㎖의 6% CH3CN 중의 60㎎의 농후한 11c를 제조용 HPLC 칼럼에 적용하고, 물 중의 아세토나이트릴 및 10mM 트라이에틸암모늄 아세테이트의 구배(50㎖/분 흐름에서 22분에 걸쳐 6% 내지 18% CH3CN 구배)로 용리시켰다. 순수한 11c를 함유하는 HPLC 분획을 풀링하고 CH3CN을 회전증발을 통해 제거하고 잔류하는 수성 샘플을 동결건조시켜 비스-트라이에틸암모늄염으로서 30㎎(50% 수율)의 순수한 11c를 생성시켰다. 음성 모드에서의 11c의 HRMS는 m/z (M-2H) 360.0171(C₂₀H₂₂N₁₀O₁₂P₂S₂ ^-2에 대한 계산치: 360.0173)인 것으로 확인되었다. ¹H NMR (D₂O) 55℃ δ (ppm) 8.13 (s, 2H), 8.03 (s, 2H), 5.97 (m, 2H), 5.06-5.12 (br, 4H), 4.98-5.00 (m, 2H), 4.81-4.83 (m, 2H), 4.04-4.08 (m, 4H), 3.20 (q, J = 7Hz), 1.27 (t, J = 7Hz). 31P NMR (D2O) 25℃. δ (ppm) 54.77, 56.00.

실시예 5. CDN에 의한 인터페론 유도

애주번트 효력의 특징으로서 비변형된 c-다이-GMP 분자에 대한 각각의 Rp, Rp 다이티오 c-다이-GMP 유도체 분자에 의해 유도된 항원 제시 세포에서의 IFN-β의 상대 수준을 결정하기 위해, 마우스 유래 H-2b 제한된 마우스 수지상 세포주인 1x10⁵개의 DC2.4 세포를 5, 20 및 100μM의 c-다이-GMP, Rp, Rp 및 Rp 또는 Sp 다이티오-다이포스페이트 c-다이-GMP, 및 c-다이-AMP, Rp, Rp 또는 Rp, Sp 다이티오-다이포스페이트 c-다이-AMP 분자 또는 HBSS와 5% CO2로 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 30분 후, 세포를 세척하고 10% FBS를 함유하는 RPMI 배지로 대체하였다. 유도된 IFN-β의 수준을 측정하기 위해, 각각의 샘플로부터의 세포 배양 유체를 4시간 후 수집하고, 10㎕를 RPMI 배지 + 10% FBS 중에 배양된 5x10⁴개의 L929-ISRE 루시퍼라제 리포터 세포에 첨가하였다. 항온처리 4시간 후 IFN-β 제제의 상대 수준은 상대 광 단위(relative light unit: RLU)를 측정함으로써 결정되었다.

도 7에 도시된 바대로, Rp, Rp 다이티오 c-다이-GMP 및 Rp, Rp 다이티오 c-다이-AMP 부분입체이성체는 c-다이-GMP 또는 c-다이-AMP 비변형된 환식 다이뉴클레오타이드 분자보다 상당히 더 높은 수준의 IFN-β를 유도하였다. 추가로, Rp, Sp 다이티오 c-다이-GMP 및 Rp, Sp 다이티오 c-다이-AMP 부분입체이성체에 의해 유도된 IFN-β의 수준은 Rp, Rp 다이티오 c-다이-GMP 및 Rp, Rp 다이티오 c-다이-AMP 부분입체이성체, 및 네이티브 c-다이-GMP 및 c-다이-AMP 분자 둘 다에 의해 유도된 수준보다 낮았다. 이 결과는 Rp, Rp 다이티오 c-다이-GMP 및 Rp, Rp 다이티오 c-다이-AMP 부분입체이성체의 정제된 제제가 비변형된 c-다이-GMP 및 c-다이-AMP 분자, 및 Rp, Sp 다이티오 유도체보다 선천성 면역 반응을 더 심오하게 활성화한다는 것을 나타낸다. c-다이-GMP와 c-다이-AMP 둘 다의 Rp, Sp 티오 유도체는 선천성 면역 반응을 불량하게 활성화하였다. Rp, Sp 다이티오-다이포스페이트 c-다이-GMP 또는 Rp, Sp 다이티오-다이포스페이트 c-다이-AMP 또는 c-다이-GMP 또는 c-다이-AMP 분자와 비교하여, 유도된 IFN-β 발현의 규모에 의해 나타난 것처럼, 선천성 면역 반응의 증가된 활성화의 특성으로 인해, 애주번트에 대한 바람직한 실시형태가 Rp, Rp 다이티오-다이포스페이트 c-다이-GMP 또는 Rp, Rp 다이티오-다이포스페이트 c-다이-AMP 환식 다이뉴클레오타이드라는 것이 당업자에게 명확할 것이다.

실시예 6. 포스포다이에스테라제에 의한 CDN의 분해

비변형된 네이티브 c-다이-GMP 및 c-다이-AMP와 비교하여 Rp, Rp 다이티오-다이포스페이트 c-다이-GMP 및 c-다이-AMP 유도체의 증가된 효력에 대한 하나의 기전은 숙주 세포 포스포다이에스테라제에 의한 분해에 대한 다이티오 변형된 유도체의 저항일 수 있다. 이 기전에 대한 시험으로서, Rp, Rp 다이티오 c-다이-GMP, 비변형된 c-다이-GMP 및 또한 Rp, Rp 다이티오 c-다이-AMP 및 c-다이-AMP 분자를 37℃에서 밤새 1㎎의 뱀독 포스포다이에스테라제(SVPD)와 함께 및 이것 없이 항온처리하였다. 이 항온처리 기간 후, 반응에서의 SVPD 효소를 불활화하고 100℃에서 10분 동안 항온처리에 의해 제거하고 샘플을 이후 14,000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. IFN-β 발현의 수준에 의해 측정된 선천성 면역을 활성화하는 샘플의 상대 역량을 시험하기 위해, 1x10⁵개의 DC2.4 세포를 5% CO2로 37℃에서 30분 동안, 이 환식 다이뉴클레오타이드 제제와 항온처리된 샘플로부터 처리된, 100μM의 Rp, Rp 다이티오-다이포스페이트 c-다이-GMP 및 c-다이-AMP 유도체 및 비변형된 네이티브 c-다이-GMP 및 c-다이-AMP와 항온처리하였다. 30분 후, 세포를 세척하고 10% FBS를 함유하는 RPMI 배지로 대체하고 다른 4시간 동안 항온처리하였다. 이후, 배양 유체를 수확하고 10㎕의 이 유체를 10% FBS를 함유하는 RPMI 배지 중에 성장된 5x10⁴개의 L929-ISRE 루시퍼라제 리포터 세포에 첨가하였다. IFN-β 발현의 상대 수준은 리포터 세포주에서 4시간 항온처리 후 상대 광 단위(RLU)를 측정함으로써 결정되었다.

도 8에 도시된 바대로, Rp, Rp 다이티오-다이포스페이트 c-다이-GMP("RR-CDG") 또는 Rp, Rp 다이티오-다이포스페이트 c-다이-AMP("RR-CDA")를 함유하는 세포 중의 IFN-β 발현의 수준은, 환식 다이뉴클레오타이드가 SVPD와 항온처리되는지와 무관하게, 동등하였다. 반대로, IFN-β 발현의 수준은, 이 효소와 항온처리되지 않은 c-다이-GMP 또는 c-다이-AMP를 함유하는 배양물과 비교하여, SVPD와 이전에 항온처리된 c-다이-GMP("CDG") 또는 c-다이-AMP("CDA")를 함유하는 배양물 중에 상당히 더 낮았다. 더욱이, SVPD와 항온처리되지 않은 환식 다이뉴클레오타이드를 함유하는 배양물에서, IFN-β 발현의 수준은 c-다이-GMP 또는 c-다이-AMP와 비교하여 Rp, Rp 다이티오-다이포스페이트 c-다이-GMP 또는 Rp, Rp 다이티오-다이포스페이트 c-다이-AMP로 더 컸다. 이 데이터는 c-다이-GMP 또는 c-다이-AMP와 비교하여 Rp, Rp 다이티오-다이포스페이트 c-다이-GMP 또는 Rp, Rp 다이티오-다이포스페이트 c-다이-AMP의 증가된 효력을 추가로 지지한다.

실시예 7. CDN에 의한 면역 반응 유도

비변형된 c-다이-GMP 분자에 비해 Rp, Rp 다이티오 c-다이-GMP의 증대된 생체내 면역원성을 시험하기 위해, OVA 특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응은 CDN 치료와 함께 백신접종 후 10일에 PBMC에서 측정되었다. 10㎍의 OVA 단백질(엔도핏(EndoFit) OVA, 인비보겐(InVivogen)) 및 아다박스(Addavax)(2% 스쿠알렌 최종)를 100㎕의 전체 용적에서 25㎍ 또는 5㎍의 환식 다이뉴클레오타이드와 합하여 백신을 제조하였다. 5마리의 암컷 C57BL/6 마우스의 그룹(H-2b)을 백신 제제에 의한 꼬리의 하부에서 한번 피하로(s.c) 면역화하고, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 구획에서의 OVA 특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응은 10일 후에 ELISpot 분석에 의해 결정되었다. 연령 일치 나이브 C57BL/6 마우스로부터 단리된 1x10⁵개의 PBMC 및 1x10⁵개의 비장세포 영양 세포를 비자극하거나 1μM의 MHC II형 펩타이드(OVA265-280 TEWTSSNVMEERKIKV) 또는 MHC I형(OVA257-264 SIINFEKL) 펩타이드로 밤새 자극하고, IFN-γ 스폿 형성 세포가 하기 기재된 바대로 측정되었다.

도 9에 도시된 바대로, CD4+ 및 CD8+ OVA 특이적 T 세포 반응은 동일한 양의 환식 다이뉴클레오타이드 애주번트를 함유하는 제제 중에 비변형된 c-다이-GMP와 비교하여 Rp, Rp 다이티오 c-다이-GMP를 함유하는 백신으로 면역화된 마우스에서 더 큰 규모이었다. 더욱이, 항원 특이적 CD8+ T 세포 반응의 규모는 5㎍ 또는 25㎍의 비변형된 c-다이-GMP를 함유하는 백신 제제로 면역화된 마우스와 비교하여 5㎍의 Rp, Rp 다이티오 c-다이-GMP를 함유하는 백신 제제로 면역화된 마우스에서 더 컸다.

실시예 8. CDN에 의한 T 세포 반응 유도

비변형된 c-다이-GMP 분자에 대한 Rp, Rp 다이티오 c-다이-GMP의 면역원성을 추가로 평가하기 위해, SIV gag 특이적 CD8+ 및 CD4+ T 세포 반응을 측정하였다. 그룹마다 5마리의 C57BL/6 마우스를, 10㎍의 SIV gag 단백질과 2%의 수 중 스쿠알렌 중에 제형화된, 1㎍의 Rp, Rp 다이티오 c-다이-GMP 또는 식염수 대조군으로 피하로 2회 면역화하였다. 백신접종을 20일에 분리하고 비장을 제2 백신접종 후 6일에 수확하였다. 면역 반응은 IFNγ ELISpot 검정에 의해 SIV gag 특이적 CD8(AL11, SIV gag_312-322, A) 및 CD4(DD13, SIV gag_300-312, B) T 세포 에피토프로 측정되었다. 플레이트를 스캐닝하고 웰당 스폿 형성 세포(SFC)를 이뮤노스팟(ImmunoSpot) 분석기(CTL)를 사용하여 계수하였다.

도 10에 도시된 바대로, RR c-다이-GMP로 면역화된 동물은 식염수 대조군을 받은 동물과 비교하여 상당히 더 높은 SIV gag 특이적 CD8 및 CD4 T 세포 반응을 유도하였다. 이 결과는 RR c-다이-GMP 유도체를 갖는 백신 제제가 생체내 SIV gag 특이적 CD4 및 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다. 당업자는 이러한 환식 다이뉴클레오타이드가 더 높은 규모의 백신 유도된 면역 반응 및 또한 필적하게 더 낮은 용량 수준의 애주번트를 갖는 더 높은 규모의 백신 유도된 면역 반응에 의해 나타난 바대로 증가된 효력을 가지므로, Rp, Rp 다이티오포스페이트 c-다이-GMP 또는 Rp, Rp 다이티오포스페이트 c-다이-AMP를 함유하는 백신 제제가 바람직하다는 것을 인식할 것이다.

실시예 9. CDN에 의한 보호 면역의 유도

비변형된 c-다이-GMP에 대해 Rp, Rp 다이티오 c-다이-GMP에 의해 유도된 증대된 면역원성 및 수반하는 보호 면역을 확립하기 위해, OVA 특이적 CD8 T 세포 반응은 PBMC에서 측정되고 보호 면역은 치사 박테리아 시험감염에 대해 평가되었다. 100㎕의 전체 용적에서 10㎍의 OVA 단백질(엔도핏 OVA, 인비보겐) 및 아다박스(2% 스쿠알렌 최종)를 25㎍의 환식 다이뉴클레오타이드와 합하여 백신을 제조하였다. 5마리의 암컷 C57BL/6 마우스의 그룹(H-2^b)을 백신 제제에 의해 꼬리의 하부에서 피하로(s.c) 2회 면역화하였다. 프라임 면역화와 부스트 면역화 사이의 간격은 36일이었다. PBMC에서의 OVA₂₅₇ 특이적 CD8 T 세포 반응의 기억 단계와 증식 단계 둘 다의 규모는 부스트 백신접종 27일 후 및 OVA 발현 야생형 리스테리아 모노사이토게네스(WT Lm-OVA)의 2X 치사 용량(LD)₅₀ 용량(1x10⁵개의 콜로니 형성 단위; CFU)에 의한 시험감염 3일 후 둘 다에서 세포내 사이토카인 염색(ICS) 분석에 의해 정량화되었다. ICS 분석을 위해, 연령 일치 나이브 C57BL/6 마우스로부터 단리된 1x10⁵개의 비장세포 영양 세포와 합쳐진 시험 마우스로부터의 1x10⁵개의 PBMC를 비자극하거나 브레펠딘(Brefeldin) A의 존재 하에 5시간 동안 1μM의 MHC I형 펩타이드(OVA_257-264 SIINFEKL)로 자극하고, IFN-γ 생성을 BD FACSVerse에서 유세포 분석기에 의해 측정하였다.

도 11a에 도시된 바대로, Rp, Rp 다이티오-다이포스페이트 c-다이-GMP로 애주번트화된 백신으로 면역화된 마우스는 비변형된 c-다이-GMP로 애주번트화된 백신으로 면역화된 마우스와 비교하여 더 높은 규모의 OVA 특이적 CD8 T 세포 기억을 생성시켰다. Rp, Rp 다이티오-다이포스페이트 c-다이-GMP 애주번트화 백신에 의한 면역화에 의해 유도된 OVA 특이적 기억 CD8 T 세포는 비변형된 c-다이-GMP로 애주번트화된 백신으로 면역화된 마우스에서 OVA 특이적 기억 CD8 T 세포의 증식 수준과 비교하여 동족 OVA 항원을 발현하는 병원균에 의한 시험감염 후 더 높은 규모로 증식하였다. 도 11b에 도시된 FACS 도면은 OVA 특이적 CD8 T 세포 기억의 규모가 Rp, Rp 다이티오-다이포스페이트 c-다이-GMP 애주번트화 백신으로 면역화된 마우스로부터의 PBMC에서의 전체 CD8 T 세포 집단의 30%에 도달한다는 것을 나타낸다. 효과적인 면역화에 대한 골드 스탠다드는 독성 병원균에 의한 후속 시험감염에 대해 보호를 부여할 수 있는지를 시험하는 것이다. Rp, Rp 다이티오 c-다이-GMP 및 비변형된 c-다이-GMP 애주번트화 백신의 상대 효과를 시험하기 위해, 마우스를 부스트 면역화 27일 후에 2X LD₅₀ 용량(1x10⁵의 CFU)의 OVA 발현 야생형 리스테리아 모노사이토게네스(WT Lm-OVA)의 정맥내 주사로 시험감험시켰다. 3일 후에, 뇌-심장 인퓨젼 한천 배지에서 WT Lm-OVA 시험감염 3일 후에 시험 마우스로부터 수확된 비장의 균질액의 희석액을 도말하고 37℃에서 밤샘 항온처리 후 콜로니의 수를 정량화함으로써 보호 면역을 결정하였다. 도 11c는 Rp, Rp 다이티오-다이포스페이트 c-다이-GMP 애주번트화 백신에 의한 마우스의 면역화가 독성 병원균 시험감염에 대한 완전 보호(검출 한계(LOD) 미만)를 제공한다는 것을 나타낸다. 동족 항원에 의한 시험감염 시 증식하고 병원균 시험감염에 대해 완전 보호를 제공하는 높은 규모 CD8 T 세포 기억 풀의 유도에 의해 나타난 바대로, 풍부한 백신 효력을 부여하는 특성으로 인해 애주번트에 대한 바람직한 실시형태가 Rp, Rp 다이티오-다이포스페이트 c-다이-GMP 또는 Rp, Rp 다이티오-다이포스페이트 c-다이-AMP 환식 다이뉴클레오타이드라는 것이 당업자에게 명확할 것이다.

실시예 10. CDN에 의한 효과적인 항종양 면역의 유도

Rp, Rp 다이티오 c-다이-AMP 및 비변형된 c-다이-AMP 유도체의 상대 생체내 항종양 효율을 전립선암의 피하 마우스 모델에서 평가하였다. 유도체 분자를 GM-CSF(GVAX)를 발현하는 1x10⁶개의 조사된 전체 TRAMP-C2 쥣과 전립선 종양 세포와 제형화하였다. 5마리의 수컷 C57BL/6 마우스의 그룹을 발바닥에서 1x10⁵개의 TRAMP-C2 종양 세포로 피하로 이식하였다. 종양 이식 4일 및 11일 후, 마우스에 GVAX 단독 또는 RR-CDA 또는 CDA와 제형화된 GVAX로 옆구리에 피하로 백신접종을 투여하고 HBSS 대조군과 비교하였다. 종양 성장을 캘리퍼스에 의해 모니터링하고 종양 용적을 계산하였다.

도 12에 도시된 바대로, 종양 이식 후 52일에, GVAX + RR-CDA로 백신접종된 마우스는 GVAX 단독 또는 비변형된 c-다이-AMP 유도체와 제형화된 GVAX와 비교하여 증가된 항종양 효율로 HBSS 대조군과 비교하여 유의적인 종양 성장 저해를 나타냈다. 이 데이터는 쥣과 전립선암 모델에서 비변형된 c-다이-AMP 분자와 비교하여 Rp, Rp 다이티오 c-다이-AMP 유도체 분자의 증가된 항종양 효력을 나타낸다.

실시예 11. CDN의 프로드럭 형태.

프로드럭 전략은 세포 또는 전달 리포솜의 이중층으로의 분할을 수월하게 하는 매력적인 방법을 제공한다. C-12 내지 C-18 카복실산에 의한 c-다이-GMP, c-다이-AMP 및 다이티오-유사체의 리보스 2'-OH의 아실화는 귀중한 프로드럭으로서 작용하였다. 2의 예는 도 13에 도시되어 있고 실시예에 기재되어 있다.

(a) 11a로부터의 모노-2'-O-미리스토일 c-다이-GMP 12의 합성.

11a의 비스트라이에틸아민염(8㎎, 9.0마이크로몰)에 0.3㎖의 DMF, 30마이크로리터의 피리딘 및 15㎎의 미리스트산 무수물(34마이크로몰)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하고 이후 60℃에서 0.5시간 동안 가열하였다. 주요 생성물 12의 질량은 음성 모드에서의 LC/MS에 의해 m/z (M-1) 889(C₃₄H₄₉N₁₀O₁₅P₂ ^-에 대한 계산치: 899.3)로 확인되었다. 증발 후, 잔류물을 10mM TEAA 중의 30% CH3CN 중에 채우고 여과시키고 구배 용리(20㎖/분의 흐름에서 20분에 걸쳐 10mM TEAA 중의 30 내지 60% CH3CN)로 20㎜ 제조용 C-18 HPLC 칼럼에서 정제하였다. 원하는 생성물을 포함하는 분획을 합하고 회전증발시키고 동결건조시켜 3㎎의 모노-2'-O-미리스토일 c-다이-GMP(12)를 생성하였다. 음성 모드에서의 12의 HRMS는 m/z (M-2) 449.1389(C₃₄H₄₈N₁₀O₁₅P₂ ^-2에 대한 계산치: 449.1393)인 것으로 확인되었다 ¹H NMR (DMSO + 1% D2O) 25℃ δ (ppm) 7.98 (s, 2H), 5.98 (s, 1H), 5.73 (d, 1H), 5.66 (s, 1H), 4.74 (d, 2H), 4.54 (s, 1H), 4.23 (s, 1H), 3.81-3.99 (br, 4H), 2.55 (s, 2H), 1.44 (s, 2H), 0.85 (t, 3H). (니트 DMSO 중의 10.61, 7.33 및 6.55에서의 NMR 피크는 1% D₂O의 첨가에서 교환되었다). 미리스토일기의 메틸렌은 DMSO 및 상부방향 트라이에틸암모늄 아세테이트 피크에 의해 모호하였다. NMR은 2'-OH에서의 모노아실화와 일치하였다. ³¹P NMR (D₂O) 25℃. δ (ppm) -1.37, -2.06.

(b) 11b로부터의 모노-2'-O-미리스토일 [Rp,Rp] 다이티오포스페이트 c-다이-GMP(13)의 합성.

11b의 비스트라이에틸아민염(12㎎, 13.0마이크로몰)에 0.3㎖의 DMF, 30마이크로리터의 피리딘, 15㎎의 미리스트산 무수물(34마이크로몰) 및 촉매 DMAP를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하고 이후 60℃에서 2시간 동안 가열하였다. 용매를 회전증발에 의해 제거하고, 잔류물을 10mM TEAA 중의 50% MeOH 중에 채우고 여과시키고 20㎜ 제조용 C-18 HPLC 칼럼(5분 동안 10mM TEAA 등용매 중의 50% MeOH, 이어서 10분 동안 100% MeOH 및 이후 10분 동안 100% MeOH로의 구배)에서 정제하였다. 원하는 생성물은 이 메탄올 시스템에서 늦게 용리되었다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 합하고 회전증발시키고 이후 동결건조시켜 4㎎의 모노-2'-O-미리스토일 [Rp,Rp] 다이티오포스페이트 c-다이-GMP(13)를 생성하였다. 음성 모드에서의 13의 HRMS는 m/z (M-2) 465.1148(C₃₄H₄₈N₁₀O₁₃P₂S₂ ^-2에 대한 계산치: 465.1165)인 것으로 확인되었다. ¹H NMR (DMSO + 1% D₂O) 25℃ δ (ppm) 8.01 (s, 2H), 5.97 (d, 1H), 5.73 (d, 2H), 5.71 (m, 2H), 5.00 (m, 1H), 4.85 (m, 1H), 4.56 (m, 1H), 4.10-4.18 (m, 4H), 3.97 (m, 2H), 3.84-3.87 (m, 1H), 3.16 (s, 1H), 3.05 (d, 2H), 1.47 (br, 2H), 0.85 (t, 3H). (니트 DMSO 중의 10.60, 7.53, 6.90 및 6.63에서의 NMR 피크는 1% D₂O의 첨가에서 교환되었다). 미리스토일기의 메틸렌은 DMSO 및 상부방향 트라이에틸암모늄 아세테이트 피크에 의해 모호하였다. NMR은 2'-OH에서의 모노아실화와 일치하였다. ³¹P NMR (CD₃OD) 25℃. δ (ppm) 56.66, 55.46.

각각 CDN 티오포스페이트 및 포스페이트에 대한 황 또는 산소의 아실옥시알킬 유도체화를 이용한 유사한 프로드럭 접근법을 또한 이용할 수 있다. 도 14에서의 아실옥시알킬 구조는 HIV 및 HBV 감염을 치료하기 위해 사용된 효과적인 뉴클레오사이드 유사체 프로드럭인 아데포비어(Adefovir)와 유사하였다. 일단 세포 내에서 세포내 에스테라제가 2'-OH 또는 포스페이트(티오포스페이트)에 존재하는 아실 또는 아실옥시알킬기를 분해시키고 비유도체화된 환식 다이뉴클레오타이드를 재생할 것이다.

실시예 12. CDN 프로드럭의 약동학적 활성.

선천성 면역 반응을 활성화하는 c-다이-GMP의 프로드럭 형태의 상대 효력을 결정하기 위해, 인간 단핵구 세포주에서 유도된 IFN-β의 상대 수준을 평가하였다. 이 실험을 위해, 4x10⁵개의 THP1-블루 인간 단핵구를 IRF 유도성 분비된 배아 알칼리 포스파타제 리포터 유전자(인비보겐)로 형질감염시키고 100μM의 c-다이-GMP, 모노-2'-O-미리스토일 c-다이-GMP 또는 HBSS와 5% CO2로 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 30분 후, 세포를 세척하고 10% FBS를 함유하는 RPMI 배지에서 96웰 접시에 도말하고 5% CO2로 37℃에서 항온처리하였다. 각각의 샘플로부터의 세포 배양 상청액을 4시간 후 수집하였다. 10㎕의 세포 배양 상청액을 퀀티-블루(QUANTI-Blue) 시약(인비보겐)에 첨가하고 15분 내지 30분 동안 항온처리하였다. 모델 680 분광계(바이오라드(BioRad))를 사용하여 655㎚에서의 흡광도를 측정하였다.

도 15에 도시된 바대로, 모노-2'-O-미리스토일 c-다이-GMP("모노-2'-O-미리스토일 CDG") 유도체는 c-다이-GMP 비변형된 환식 다이뉴클레오타이드 분자를 초과하고 인간 단핵구 세포주에서의 배경(HBSS) 수준을 초과하는 상당히 더 높은 수준의 IFN-β를 유도하였다. 추가로, 이 데이터는 인간 단핵구 세포주에서 Rp, Sp 다이티오 c-다이-GMP 및 c-다이-GMP 비변형된 분자에 비해 Rp, Rp 다이티오 c-다이-GMP 유도체 분자의 더 우수한 유도를 나타낸다. 이 결과는 모노-2'-O-미리스토일 c-다이-GMP 유도체의 정제된 제제가 인간 세포주에서 선천성 면역 반응을 활성화할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 13. CDN 프로드럭에 의한 면역 반응의 유도

생체내 면역 반응을 유도하는 모노-2'-O-미리스토일 c-다이-GMP("모노-2'-O-미리스토일 CDG") 유도체의 능력을 평가하기 위해, OVA 특이적 CD8 T 세포 반응을 CDN 치료와 함께 제2 백신접종 7일 후에 비장세포에서 측정하였다. OVA 특이적 면역 반응을 자극하는 것에 비해 모노-2'-O-미리스토일 c-다이-GMP의 능력을 시험하기 위해, 100㎕의 전체 용적에서 10㎍의 OVA 단백질(엔도핏 OVA, 인비보겐) 및 아다박스(2% 스쿠알렌 최종)를 0(대조군) 또는 5㎕의 모노-2'-O-미리스토일 c-다이-GMP 유도체("모노-2'-O-미리스토일 CDG")와 합해서 백신을 제조하였다. 5마리의 암컷 C57BL/6 마우스의 그룹(H-2b)을 백신 제제에 의해 꼬리의 하부에서 2회 피하로(s.c) 면역화하고 비장에서의 OVA 특이적 CD8+ T 세포 반응을 7일 후에 세포내 사이토카인 염색에 의해 결정하였다. 1x10⁶개의 비장세포를 자극하지 않거나 1μM의 MHC I형(OVA257-264 SIINFEKL; SL8) 펩타이드로 밤새 자극하고, IFN-γ 생성을 BD FACSVerse에서 유세포 분석기에 의해 측정하였다.

도 16에 도시된 바대로, 모노-2'-O-미리스토일 c-다이-GMP 유도체를 함유하는 백신이 대조군 백신과 비교하여 더 높은 면역 반응을 유도하였다. 이 결과는 모노-2'-O-미리스토일 c-다이-GMP 유도체를 함유하는 백신이 동물 모델에서 매우 강력한 적응 면역 반응을 자극할 수 있다는 것을 나타낸다.

당해 분야의 당업자는 목적을 실행하고 언급된 목표 및 이점, 및 이에 고유한 것을 얻기 위해 본 발명이 매우 적합하다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 본 명세서에 제공된 예는 바람직한 실시형태를 대표하고 예시적이고 본 발명의 범위에 대한 제한으로서 의도되지 않는다.

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그러므로, 당해 분야의 당업자는 본 개시내용이 기초하는 개념이 본 발명의 몇몇 목적을 실행하기 위한 다른 구조, 방법 및 시스템의 설계를 위해 기초로서 용이하게 이용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 이러한 동등한 구성이 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않는 한, 특허청구범위가 이것을 포함하는 것으로 간주된다는 것이 중요하다.

당해 분야의 당업자가 본 발명을 만들고 사용하기에 충분하게 상세히 본 발명이 기재되어 있고 예시되어 있지만, 다양한 대안, 변형 및 개선이 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어남이 없이 명확해야 한다. 본 명세서에 제공된 예는 바람직한 실시형태를 대표하고 예시적이며 본 발명의 범위에 대한 제한으로서 의도되지 않는다. 이것 내의 변형 및 다른 용도가 당해 분야의 당업자에게 발생할 것이다. 이 변형은 본 발명의 정신 내에 포함되고 특허청구범위에 의해 한정된다.

본 발명의 범위 및 정신을 벗어남이 없이 본 명세서에 개시된 본 발명에 다양한 치환 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 당해 분야에서의 당업자에게 명확할 것이다.

본 명세서에 언급된 모든 특허 및 공보는 본 발명이 속하는 당해 분야의 당업자의 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 공보는 각각의 개별적인 공보가 구체적으로 및 개별적으로 참조문헌으로 포함된 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 본 명세서에서 참조문헌으로 포함된다.

본 명세서에서 예시적으로 기재된 본 발명은 본 명세서에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 구성요소 또는 구성요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에 실행될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 각각의 경우에 본 명세서에서 임의의 용어 "포함하는", "로 필수적으로 이루어진" 및 "로 이루어진"은 다른 2개의 용어 중 하나로 대체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한이 아니라 설명의 면에서 사용될 수 있고, 도시되거나 기재된 특징 또는 이의 일부의 임의의 등가물을 배제한 이러한 용어 및 표현의 사용에서 의도가 없지만, 청구된 본 발명의 범위 내에 다양한 변형이 가능한 것으로 인식된다. 따라서, 본 발명이 바람직한 실시형태에 의해 구체적으로 개시되어 있지만, 본 명세서에서 개시된 개념의 임의의 특징, 변형 및 변경은 당해 분야의 당업자에게 의존될 수 있고, 이러한 변형 및 변경이 첨부된 특허청구범위에 의해 한정된 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려되어야 하는 것으로 이해되어야 한다.

다른 실시형태는 하기 특허청구범위 내에 기재되어 있다.

Claims

조성물로서,
STING-의존적 TBK1 활성화를 유도하는 1종 이상의 환식 퓨린 다이뉴클레오타이드 또는 이의 프로드럭 또는 약제학적으로 허용되는 염을 포함하되, 상기 조성물에 존재하는 환식 퓨린 다이뉴클로타이드는 실질적으로 순수한 Rp,Rp 또는 Rp,Sp 부분입체이성체, 또는 이의 프로드럭 또는 약제학적으로 허용되는 염이고, 상기 환식 퓨린 다이뉴클레오타이드는 바람직하게는 티오포스페이트 환식 퓨린 다이뉴클레오타이드인 것인 조성물.
제1항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제를 더 포함하는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 1종 이상의 미리 결정된 항원에 대한 면역 반응을 자극하도록 선택된 1종 이상의 백신을 더 포함하는 조성물.
제3항에 있어서, 상기 백신(들)은 관심 대상 항원을 포함하는 불활화된 또는 약독화된 박테리아 또는 바이러스, 정제된 항원, 상기 항원을 발현하고/하거나 분비하도록 재조합으로 조작된 생 바이러스 또는 박테리아 전달 벡터, 상기 항원이 장입되거나 상기 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물로 형질감염된 세포를 포함하는 항원 제시 세포(APC) 벡터, 리포솜 항원 전달 비히클 또는 상기 항원을 코딩하는 네이키드 핵산 벡터를 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백신(들)은 GM-CSF, CCL20, CCL3, IL-12p70, FLT-3 리간드 중 1종 이상을 발현하거나 분비하는 불활화된 종양 세포를 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 애주번트, 지질, 이중층간 가교결합된 다층 소포, 생체분해성 폴리(D,L-락트산-코-글라이콜산)[PLGA]-기반 또는 폴리무수물-기반 나노입자 또는 마이크로입자 및 나노다공성 입자 지지 지질 이중층, CTLA-4 및 PD-1 경로 길항제, PD-1 경로 차단제, 선천성 면역을 유도하는 불활화된 박테리아(예를 들어, 불활화된 또는 약독화된 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)), 톨 유사 수용체(Toll-like Receptor: TLR), (NOD) 유사 수용체((NOD)-like receptor: NLR), 레티노산 유도성 유전자-기반(RIG)-I 유사 수용체(Retinoic acid inducible gene-based (RIG)-I-like receptor: RLR), C형 렉틴 수용체(C-type lectin receptor: CLR)를 통해 선천성 면역 활성화를 매개하는 조성물, 병원균 관련 분자 패턴("PAMP(pathogen-associated molecular pattern)") 또는 화학치료제를 더 포함하는 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 티오포스페이트 환식 퓨린 다이뉴클레오타이드는 c-다이-AMP 티오포스페이트, c-다이-GMP 티오포스페이트, c-다이-IMP 티오포스페이트, c-AMP-GMP 티오포스페이트, c-AMP-IMP 티오포스페이트 및 c-GMP-IMP 티오포스페이트; 이들의 조합; 이들의 프로드럭; 및/또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 실질적으로 순수한 Rp,Rp 또는 Rp,Sp 티오포스페이트 부분입체이성체를 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 티오포스페이트 환식 퓨린 다이뉴클로타이드는 1종 이상의 지질과 제형화된 것인 조성물.
제8항에 있어서, 상기 1종 이상의 지질은 디기토닌을 포함하는 것인 조성물.
제8항에 있어서, 상기 1종 이상의 지질은 리포솜을 형성하는 것인 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 티오포스페이트 환식 퓨린 다이뉴클레오타이드는 나노입자로서 제형화된 것인 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 애주번트를 더 포함하는 조성물.
제12항에 있어서, 상기 1종 이상의 애주번트는 CpG 및/또는 모노포스포릴 지질 A를 포함하는 것인 조성물.
개체에서 암에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로서,
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 상기 개체에게 장관외로 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 조성물은 불활화된 종양 세포 또는 개체의 암에 일치한 상이한 종양 세포 유형의 혼합물을 포함하는 것인 방법.
제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 종양 세포는 결장직장 암 세포, 기관 식도 편평 암 세포, 폐암 세포, 뇌암 세포, 간암 세포, 위암 세포, 육종 세포, 백혈병 세포, 림프종 세포, 다발성 골수종 세포, 난소암 세포, 자궁암 세포, 유방암 세포, 흑색종 세포, 전립선암 세포, 췌장 암종 세포 및 신장 암종 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
개체에서 병원균에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로서,
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 상기 개체에게 장관외로 투여하는 단계를 포함하는 방법.
개체에서 STING-의존적 TBK1 활성화를 유도하는 방법으로서,
STING에 결합하는 1종 이상의 티오포스페이트 환식 퓨린 다이뉴클레오타이드를 상기 개체에게 장관외로 투여하는 단계를 포함하되, 상기 조성물에 존재하는 티오포스페이트 환식 퓨린 다이뉴클로타이드는 실질적으로 순수한 Rp,Rp 또는 Rp,Sp 부분입체이성체인 것인 방법.
제18항에 있어서, 상기 1종 이상의 티오포스페이트 환식 퓨린 다이뉴클레오타이드는 c-다이-AMP 티오포스페이트, c-다이-GMP 티오포스페이트, c-다이-IMP 티오포스페이트, c-AMP-GMP 티오포스페이트, c-AMP-IMP 티오포스페이트 및 c-GMP-IMP 티오포스페이트 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 실질적으로 순수한 Rp,Rp 또는 Rp,Sp 부분입체이성체를 포함하는 것인 방법.
제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 티오포스페이트 환식 퓨린 다이뉴클로타이드는 1종 이상의 지질과 제형화된 것인 방법.
제20항에 있어서, 상기 1종 이상의 지질은 디기토닌을 포함하는 것인 방법.
제20항에 있어서, 상기 1종 이상의 지질은 리포솜을 포함하는 것인 방법.
제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 애주번트를 더 포함하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 1종 이상의 애주번트는 CpG 및/또는 모노포스포릴 지질 A를 포함하는 것인 방법.
제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 백신을 상기 환자에 투여하는 단계를 더 포함하되, 상기 백신(들)은 1종 이상의 항원을 발현하는 병원균에 대한 면역 반응을 자극하도록 선택된 1종 이상의 항원을 포함하는 것인 방법.
제25항에 있어서, 상기 백신(들)은 관심 대상 항원을 포함하는 불활화된 또는 약독화된 박테리아 또는 바이러스, 정제된 항원, 상기 항원을 발현하고/하거나 분비하도록 재조합으로 조작된 생 바이러스 또는 박테리아 전달 벡터, 상기 항원이 장입되거나 상기 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물로 형질감염된 세포를 포함하는 항원 제시 세포(APC) 벡터, 리포솜 항원 전달 비히클 또는 상기 항원을 코딩하는 네이키드 핵산 벡터를 포함하는 것인 방법.
제18항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 티오포스페이트 환식 퓨린 다이뉴클레오타이드는 나노입자로서 제형화된 것인 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료에서 사용하기 위한 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 병원균에 대한 면역 반응의 유도에서 사용하기 위한 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 개체에서 STING-의존적 TBK1 활성화의 유도에서 사용하기 위한 조성물.