CN112770771A - 包含干扰素基因刺激蛋白激动剂的免疫佐剂及疫苗组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含干扰素基因刺激蛋白激动剂的免疫佐剂组合物及疫苗组合物，由于确认到本发明的包含干扰素基因刺激蛋白激动剂的免疫佐剂组合物及疫苗组合物不仅能够有效激活体内的多种免疫反应，而且具有能够显著减少结核分枝杆菌感染的效果，因此，当与结核分枝杆菌及其他病原菌的疫苗一同使用时，预期可通过显著提高现有用于预防感染的疫苗效果来有效减少多种病原菌的感染。
Description
技术领域
本发明涉及包含干扰素基因刺激蛋白激动剂的免疫佐剂组合物、疫苗组合物及利用其的感染性疾病的预防方法。
并且，本发明涉及包含干扰素基因刺激蛋白激动剂及免疫佐剂的疫苗组合物及利用其的感染性疾病的预防方法。
背景技术
在开发疫苗的过程中将使用各种策略。虽然由活细菌或减毒细菌制备的疫苗非常有效，但是，因存在失效的隐患、间或性自我复制等问题而经常产生安全性问题。当使用由死细菌制备的疫苗时，虽然对治疗有效果，但是，存在其中包含如LPS的毒性物质或存在活细菌的问题(Ryan EJ et al.，2001)，并且，为了克服上述局限性而开发的DNA疫苗在进入宿主的基因组(genome)的情况下也具有增加突变(mutagenic)的发生率或成为致癌基因(oncogenic)的可能性。相反，在亚单位(Subunit)疫苗的情况下，由于使用纯化抗原，因此，相比于其他疫苗更为安全。但是，由于上述纯化抗原通常缺乏免疫原性，因此，为了增加免疫原性而需要强力的免疫佐剂(adjuvant)。
另一方面，环二鸟苷酸(c-di-GMP，cyclic diguanylate)首先被鉴定为调节木醋杆菌(Acetobacter xylinum)中纤维素生成的细胞内信号传导物质。据报道，通过上述c-di-GMP的信号传导并不存于真核生物中，仅特征性地存在于细菌中。细菌内的c-di-GMP在信号传导过程中起到第二信使(second messenger)的作用，尤其，对细菌的生存起到非常重要的作用，例如，调节细菌的运动性(motility)、粘结性(adhesioin)、细胞之间的相互作用(communication)、生物膜(biofilm)形成、细胞之外的多糖类(exopolysaccharide)合成等。重要的是，源自上述菌的c-di-GMP作为宿主的细胞质传感器(cytosolic sensor)的干扰素基因刺激蛋白(Stimulator of IFN gene，STING)的配体(ligand)，通过TBK1-IRF3诱导Type I IFN的生成和NF-kB每个细胞因子(cytokine)的生成，最近发现，如c-di-GMP的干扰素基因刺激蛋白激动剂(agonist)可增加抗原特异性T细胞(antigen-specific T cell)和体液性免疫反应(humoral immune response)。
因此，为了确认干扰素基因刺激蛋白激动剂是否可用作疫苗的免疫佐剂，本发明人进行了本实验。
发明内容
技术问题
本发明为解决如上所述的现有技术问题而提出，本发明的目的在于，提供包含干扰素基因刺激蛋白激动剂作为有效成分的免疫佐剂组合物及在上述组合物中还包含抗原的疫苗组合物。
但是，本发明所要实现的技术目的并不限于上述提及的问题，本发明所属技术领域的普通技术人员可通过以下记载明确理解未提及的其他问题。
技术方案
本发明提供免疫佐剂(adjuvant)组合物，其包含干扰素基因刺激蛋白激动剂(Stimulator of interferon genes agonist)作为有效成分。
并且，本发明提供感染性疾病的预防方法，其包括向个体给药干扰素基因刺激蛋白激动剂(Stimulator of interferon genes agonist)及抗原的步骤。
发明的效果
由于确认到本发明的包含干扰素基因刺激蛋白激动剂的免疫佐剂组合物及疫苗组合物不仅能够有效激活体内的多种免疫反应，而且具有能够显著减少结核分枝杆菌感染的效果，因此，当与结核分枝杆菌及其他病原菌的疫苗一同使用时，预期可通过显著提高现有用于预防感染的疫苗效果来有效减少多种病原菌的感染。
附图说明
图1的A部分为示出用于验证c-di-GMP作为免疫佐剂功效的实验设计的图，图1的B部分为示出在基于ESAT-6抗原以单磷酰基脂质A(MPL)或c-di-GMP免疫化的小鼠的脾细胞中通过ESAT-6蛋白刺激后确认IFN-γ的生成能力的结果的图，图1的C部分为示出在免疫化的小鼠中确认生成ESAT-6抗原特异性抗体的结果的图，图1的D部分为示出对浸润(infiltration)到免疫化的小鼠的脾脏和肺组织的记忆型(memory)T细胞进行分析的结果的图。
图2的A部分为示出多功能(multifunctional)T细胞的分析方法的图，图2的B部分为示出在基于ESAT-6抗原以单磷酰基脂质A(MPL)或c-di-GMP免疫化的小鼠的肺和脾细胞中通过ESAT-6蛋白刺激诱导的抗原特异性多功能(multifunctional)T细胞的比率的图。
图3的A部分及图3的B部分为示出使基于ESAT-6抗原以单磷酰基脂质A(MPL)或c-di-GMP免疫化的小鼠感染结核分枝杆菌16周后通过组织病理学分析肺组织的结果的图，图3的C部分为示出在肺和脾测定结核分枝杆菌的细菌数量的结果的图。
图4的A部分为示出用于确认对于c-di-GMP和现有的单磷酰基脂质A(MPL)免疫佐剂的协同效果而实验设计的图，图4的B部分为示出在免疫化的小鼠中分析T细胞的活性的结果的图，图4的C部分为示出按时期确认免疫化的小鼠生成ESAT-6抗原特异性抗体的结果的图，图4的D部分为示出分析免疫化的小鼠中的胚中心(germinal center)相关T细胞和B细胞的比率的结果的图。
图5的A部分为示出使基于ESAT-6抗原以单磷酰基脂质A(MPL)或c-di-GMP/单磷酰基脂质A(MPL)免疫化的小鼠感染结核分枝杆菌4周后通过组织病理学分析肺组织的结果的图，图5的B部分为示出测定在肺中增殖的结核分枝杆菌数量的结果的图，图5的C部分为示出使已免疫化的小鼠感染结核分枝杆菌4周后在肺和脾中离体分离细胞并通过ESAT-6蛋白刺激分析抗原特异性多功能(multifunctional)T细胞的结果的图。
图6为示出在基于ESAT-6抗原以c-di-GMP和/或在稳定的角鲨烯水包油纳米乳液中配制而成的吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA-SE)免疫化的小鼠的肺和脾细胞中通过ESAT-6蛋白刺激诱导的抗原特异性多功能(multifunctional)T细胞的比率的图。
图7为示出在已免疫化的小鼠中分析T细胞的活性的结果的图。
图8为示出在基于ESAT-6抗原单独以吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA-SE)或以c-di-GMP和在稳定的角鲨烯水包油纳米乳液中配制而成的吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA-SE)免疫化的小鼠的肺和脾中测定结核分枝杆菌数量的结果的图。
具体实施方式
以下，参照附图，说明本申请所记载的多个实例。在以下说明中，为了完全理解本发明而记载了多种特殊细节，例如，特殊形式、组合物及工序等。但是，特定实例可以与其他公知方法及形式一同实施，而无需一个以上的特殊细节。在其他例中，未以特殊细节描述公知的工序及制备技术，以免不必要地混淆本发明。在本说明书全文中，对“一实例”或“实例”的引用是指结合实例记载的特定特征、形式、组成或特性包括在本发明的一个以上的实例中。因此，贯穿本说明书在各处表达的“一实例”或“实例”的情况不一定表示本发明的相同实例。另外，在一个以上的实例中，特定特征、形式、组成或特性可通过任何适当方法组合。
除非在说明书中存在特定含义，否则本说明书中所使用的所有科学性术语及技术性术语均具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的含有相同的含义。
本发明提供包含干扰素基因刺激蛋白激动剂(Stimulator of interferon genesagonist)作为有效成分的免疫佐剂(adjuvant)组合物及包含干扰素基因刺激蛋白激动剂(Stimulator of interferon genes agonist)和抗原作为有效成分的疫苗组合物。
根据本发明一实例，优选地，上述干扰素基因刺激蛋白激动剂为可以激活(activation)干扰素基因刺激蛋白信号传导(signaling)的DNA、RNA、蛋白质、肽切片、化合物等，更优选地，可以为c-di-GMP、cGAMP、cGAMP、c-di-GAMP、c-di-AMP、cGAMP、10-(羧甲基)9(10H)吖啶酮(CMA)(10-(carboxymethyl)9(10H)acridone(CMA))、5，6-二甲基呫吨酮-4-乙酸(5，6-Dimethylxanthenone-4-acetic acid-DMXAA)、甲氧基酮(methoxyvone)、6，4’-二甲氧基黄酮(6，4’-dimethoxyflavone)、4’-甲氧基黄酮(4’-methoxyflavone)、3’，6’-二羟基黄酮(3’，6’-dihydroxyflavone)、7，2’-二羟基黄酮(7，2’-dihydroxyflavone)、黄豆苷元(daidzein)、刺芒柄花素(formononetin)、雷杜辛7-甲基醚(retusin 7-methylether)及呫吨酮(xanthone)等，但不限于此，只要是可以与干扰素基因刺激蛋白相结合并激活信号传导的物质即可。
根据本发明再一实例，上述免疫佐剂组合物还可包含现有已知的其他免疫佐剂，优选地，作为其他佐剂可包含单磷酰基脂质A(MPL，monophosphoryl lipid A)及在稳定的水包角鲨烯油纳米乳剂中配制而成的吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA-SE，GlucopyranosylLipid Adjuvant，formulated in a stable nano-emulsion of squalene oil-in-water)中的至少一种。
根据本发明另一实例，优选地，虽然上述免疫佐剂可封入在脂质体(liposome)中，但不限于此，只要是容易注入体内的形态即可。
根据本发明另一实例，上述抗原为病原菌特异性抗原，优选地，可以为结核分枝杆菌特异性抗原，更优选地，可以为ESAT-6抗原，对于上述抗原并无限制，只要是用于现有的亚单位(Subunit)疫苗中的抗原即可。
根据本发明另一实例，其特征在于，上述疫苗组合物用于预防结核分枝杆菌的感染。
本发明的组合物可包含一种以上具有预防病原菌效果的公知的有效成分。
并且，除上述记载的有效成分外，本发明的组合物还可通过包含一种以上药学上可接受的载体来制备。作为药学上可接受的载体可通过混合盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、蔗糖溶液、甘油、乙醇及这些成分中的一种以上成分来使用，可根据需求添加其他通常使用的添加剂，例如，抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂等。并且，可通过附加稀释剂、分散剂、表面活性剂、结合剂及润滑剂来配制成如水溶液、悬浮液、乳浊液等注射用剂型、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。进一步地，可利用所属领域的适当的方法或Remington'sPharmaceutical Science(最新版)、Mack Publishing Company、Easton PA所公开的方法根据每种疾病或成分来配制。
本发明的组合物可根据预期方法进行口服给药或非口服给药(例如，适用于静脉内、皮下、腹腔内、肌肉内或局部)，给药量的范围根据给药对象的体重、年龄、性别、健康状态、饮食、给药时间、给药方法、排泄率及疾病的严重程度而产生变化。
并且，本发明提供预防感染性疾病例如预防感染结核分枝杆菌的方法，其包括向个体给药干扰素基因刺激蛋白激动剂(Stimulator of interferon genes agonist)及抗原的步骤。
并且，本发明提供预防感染性疾病例如预防感染结核分枝杆菌的方法，其还包括向个体追加给药单磷酰基脂质A(MOL，monophosphoryl lipid A)及在稳定的角鲨烯水包油纳米乳液中配制而成的吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA-SE，Glucopyranosyl LipidAdjuvant，formulated in a stable nano-emulsion of squalene oil-in-water)中的一种以上的免疫佐剂的步骤。
上述免疫佐剂和干扰素基因刺激蛋白激动剂可同时或依次给药。
并且，当给药上述免疫佐剂和干扰素基因刺激蛋白激动剂时，可有效预防多种结核分枝杆菌的感染，尤其，相比于单独使用免疫佐剂的情况，可通过显著增加脾及肺中的多功能T细胞的生成来显著增加现有的抗原佐剂效果，从而可以更有效地预防结核分枝杆菌，例如高病原性结核分枝杆菌，优选HN878菌株(strain)的感染。
优选地，上述个体为包括人在内的哺乳类，可以为具有被感染性疾病，例如结核分枝杆菌感染可能性的个体，在此情况下，抗原可以为结核抗原。
并且，除干扰素基因刺激蛋白激动剂(Stimulator of interferon genesagonist)及抗原外，本发明可以与用于预防现有的感染性疾病的物质，例如用于预防结核病的物质同时使用。
并且，本发明提供干扰素基因刺激蛋白激动剂的免疫佐剂用途；以及预防干扰素基因刺激蛋白激动剂(Stimulator of interferon genes agonist)及抗原的感染性疾病，例如结核病的用途。
并且，本发明提供用于制备干扰素基因刺激蛋白激动剂的免疫佐剂的用途；以及用于制备干扰素基因刺激蛋白激动剂(Stimulator of interferon genes agonist)及抗原的疫苗的用途。
本发明的实施方式
以下，通过实施例进一步详细说明本发明。这些实施例仅用于进一步详细说明本发明，对于所属技术领域的普通技术人员显而易见的是，根据本发明的主旨，本发明的范畴不受这些实施例的限制。
实施例
实施例1：确认干扰素基因刺激蛋白激动剂作为免疫佐剂的作用
为了确认是否可以将干扰素基因刺激蛋白激动剂(STING，Stimulator ofinterferon genes)用作用于结核分枝杆菌的免疫佐剂(adjuvant)而进行了以下实验。
1.1.实验动物
使用没有特定病原体的生后6周龄雌性C57BL/6小鼠(Japan SLC，Inc.Shijuoka，Japan)进行实验，在韩国延世大学临床医学研究中心内的ABSL-3生物危害动物实验室的有限空间中，通过提供无菌的销售用饲料和水来饲养小鼠。
1.2.实验设计
为了确认是否可以单独使用一种干扰素基因刺激蛋白激动剂(STING，Stimulatorof interferon genes)的c-di-GMP(invivogen)作为免疫佐剂(adjuvant)而进行了动物实验。具体实验方法示于图1的A部分，作为c-di-GMP的比较对照组，使用了用作现有的免疫佐剂的TLR4激动剂(agonist)的单磷酰基脂质A(MPL，monophosphoryl lipid A)。各个免疫佐剂与ESAT-6蛋白一同或单独配制(formulation)成二甲基双十八烷基铵(DDA，Dimethyldioctadecylammonium)脂质体(liposome)来使用。
如图1的A部分所示，在小鼠感染结核分枝杆菌10周之前，通过使用MPL/DDA、ESAT-6+MPL/DDA或ESAT-6+c-di-GMP/DDA以3周为间隔进行3次肌肉注射(intramuscularinjection)来对小鼠进行免疫化，在小鼠感染结核分枝杆菌之前，对一部分小鼠实施安乐死后，通过从脾和肺中分离脾细胞和肺细胞来一同进行了离体(ex vivo)实验。每个分离的细胞以普通方法传代及培养。以下实施例1.3详细记载了免疫化方法。接着，确认因抗原刺激引起的IFN-γ生成能力和通过ESAT-6蛋白免疫化浸润(infiltration)到脾和肺的记忆型(memory)T细胞的增加。并且，调查了最近报道的对于防止结核尤为重要的多功能CD4+T细胞的形成能力。而且，在感染结核分枝杆菌后第16周，分析了脾和肺内的细菌数量和肺的炎症程度。
1.3.免疫化
通过分别对实验中所使用到小鼠的背部以3周为间隔肌肉注射3次实验用疫苗组合物来对小鼠进行免疫化。以最终浓度为5mg/mL的方式稀释二甲基双十八烷基铵脂质体后，在加热至65℃的同时进行超声处理(sonication)来溶解，然后以体积为2：1的方式与各个免疫佐剂相混合制备。将每只小鼠的注射体积设置为最终达到200μl，每次注射包含1μl的ESAT-6蛋白作为抗原。作为阴性对照组，向肌肉内注射了未包含抗原的单磷酰基脂质A/二甲基双十八烷基铵。
1.4.通过ESAT-6抗原的IFN-γ生成能力确认
为了通过与用作现有的免疫佐剂的单磷酰基脂质A/二甲基双十八烷基铵免疫佐剂进行比较来验证c-di-GMP/DDL免疫佐剂影响已免疫化的抗原产生免疫原性的功效，分别在小鼠实验组中分析了抗原特异性IFN-γ生成能力。利用ESAT-6蛋白离体(ex vivo)刺激以与实施例1.2相同的方法获得的小鼠脾细胞，并通过酶联免疫吸附测定法(ELISA，enzyme-linked immunosorbent assay)在被刺激的细胞中确认抗原特异性IFN-γ生成能力。其结果示于图1的B部分。
如图1的B部分所示，经确认，针对ESAT-6蛋白刺激，利用ESAT-6+c-di-GMP/DDA疫苗组合物免疫化的实验组均生成抗原特异性IFN-γ。其中，ESAT-6+c-di-GMP/DDA疫苗组合物将c-di-GMP用作免疫佐剂，在通过上述ESAT-6+c-di-GMP/DDA疫苗组合物进行免疫化的实验组中确认到，相比于现有的佐剂，IFN-γ生成能力显著增加。
1.5.抗原特异性抗体生成能力确认
为了验证c-di-GMP/DDL免疫佐剂对抗原特异性抗体生成能力产生影响的功效，在最终完成共3次的免疫化的时间点，通过分离各个小鼠的血清(serum)来确认了抗体生成(antibody production)程度。将1μg/ml浓度的ESAT-6蛋白添加到96-孔板后，通过在常温条件下进行2小时的反应来填充各个孔(well)，随后，向填充的孔添加各个实验组的小鼠血清。而且，将与辣根过氧化物酶(HRP，horseradish peroxidase)相结合的抗-IgG(sigma)、抗-IgG1(BD Bioscience)或抗-IgG2c(Southern Biotech)添加到每个孔来进行反应后，通过酶联免疫吸附测定法(ELISA，enzyme-linked immunosorbent assay)确认生成的抗原特异性抗体的生成能力。其结果示于图1的C部分。
如图1的C部分所示，不仅在Total IgG，而且在与TH2免疫(immunity)相关的IgG1和与报道的对于防止结核尤为重要的Th1免疫相关的IgG2c中均确认到了比现有的免疫佐剂进一步提升的抗体生成能力。
1.6.在将c-di-GMP作为免疫佐剂使用的情况下确认被诱导的T细胞的种类及数量
通常，当感染结核分枝杆菌时，结核分枝杆菌抗原特异性T细胞通过复制及分化形成效应型(effector)T细胞，当上述效应型T细胞失去免疫反应时，大部分将会死亡，而一部分形成为长时间持续的记忆型T细胞。众所周知，以这种方式形成的记忆型T细胞在快速形成后天性防御免疫和维持T细胞的记忆方面起到重要的作用。因此，在将单磷酰基脂质A(MPL)或c-di-GMP用作免疫佐剂并通过ESAT-6蛋白进行免疫化时，为了验证是否对记忆型T细胞产生影响而进行了实验。为了实验，使用PBS对以与实施例1.2相同的方法获得的小鼠的脾细胞和肺细胞洗涤2次后进行离心分离，在离心分离的细胞中处理抗-CD3-BV421(BDBioscience)、抗-CD4-PerCP-Cy5.5(BD Bioscience)、抗-CD8-APC-Cy7(BD Bioscience)、抗-CD44-PE(ebioscience)、抗-CD62L-FITC(ebioscience)、抗-CD127-APC(ebioscience)等抗体后，在4℃的温度条件下进行30分钟的反应。利用PBS洗涤数次完成反应的细胞来从中去除未结合的抗体，随后，利用流式细胞分析仪(FACS verse，BD)分析效应型(effector)T细胞(Teff，CD3+CD4+CD62L-CD44+CD127)、效应型(effector)/记忆型(memory)T细胞(Tem，CD3+CD4+CD62L-CD44+CD127+)、中央记忆型(central memory)T细胞(Tcm，CD3+CD4+CD62L+CD44+CD127+)及幼稚型(naive)T细胞(
CD3+CD4+CD62L+CD44-CD127+)。其结果示于图1的D部分。
如图1的D部分所示，经确认，相比于将单磷酰基脂质A(MPL)用作免疫佐剂的情况，在将c-di-GMP用作免疫佐剂来进行免疫化时，在小鼠的脾及肺细胞中，CD4+/CD8+的效应型(effector)/记忆(memory)T细胞均显著增加。
1.7.在将c-di-GMP作为免疫佐剂使用的情况下确认被诱导的T细胞的活性
据报道，多功能(multifunctional)T细胞(同时分泌IFN-γ、TNF-α和/或IL-2的T细胞)为防御结核分枝杆菌所必要的免疫学指标，因此在将c-di-GMP用作免疫佐剂的情况下，确认是否生成多功能T细胞。利用ESAT-6蛋白对通过与实施例1.2相同方法分离的小鼠的肺细胞和脾细胞进行刺激。而且，为了防止生成的细胞因子(cytokine)向细胞外分泌，在用GolgiSto(BD Bioscience)处理细胞后，在37℃的温度条件下进行12小时的反应，随后，用PBS洗涤2次。在洗涤的细胞中处理抗-CD4-PerCP-Cy5.5(BD Bioscience)、抗-CD8-APC-Cy7(BD Bioscience)、抗-CD44-v450(BD Bioscience)等抗体后，在4℃的温度条件下进行30分钟的反应，并通过PBS洗涤来去除未结合的抗体。而且，为了提高细胞的渗透性(permeability)，向细胞添加Cytofix/Cytoperm(BD Bioscience)后，在4℃的温度条件下进行30分钟的反应，随后，再次用PBS进行洗涤，在洗涤的细胞中追加处理抗-IFN-γ-PE(BDBioscience)、抗-IL-2-PE-Cy7(BD Bioscience)、抗-TNF-α-APC(BD Bioscience)等抗体并在4℃的温度条件下进行30分钟的反应。利用Perm/Wash溶液(BD Bioscience)对完成反应的细胞进行数次洗涤后，通过流式细胞分析仪进行分析，其结果示于图2的A部分。而且，根据流式细胞分析仪分析的结果，利用流式细胞分析软件(FlowJo software)的门控方法(gating strategy)进行追加分析，其结果示于图2的B部分。
如图2的B部分所示，经确认，在将c-di-GMP或单磷酰基脂质A(MPL)用作免疫佐剂的两种情况下，确认到同时分泌IFN-γ、TNF-α及IL-2三种类细胞因子的T细胞均有所增加。尤其，在肺细胞中，与将单磷酰基脂质A作为免疫佐剂使用的情况相比，通过ESAT-6+c-di-GMP/DDA组合物免疫化的组中的抗原特异性多功能T细胞的生成显著增加。由此，可确认到如下情况，即，相比于现有的单磷酰基脂质A(MPL)，干扰素基因刺激蛋白激动剂可增加预防及治疗结核分枝杆菌所需的多功能(multifunctional)T细胞的生成，因此，相比于现有的免疫佐剂，更适用于预防及治疗结核分枝杆菌的疫苗。
1.8.结核分枝杆菌培养及空气感染
将高病原性结核分枝杆菌的Mycobacterium tuberculosis HN878菌株在7H9-OADC培养基(broth)中培养15日。而且，收集培养的细菌后，用6mm的玻璃珠轻轻涡旋(vortexing)来破碎细菌。对破碎的细菌进行离心分离来沉积细胞聚集物后收集上清液，将收集的上清液分注并在﹣70℃的温度条件下进行保存。当进行实验时，将保存的菌进行解冻后，在Middlebrook 7H11 Agar(Difco，Detroit，MI，USA)中依次稀释并培养，从而确认细菌的数量，为了使小鼠感染，在声波浴(sonic bath)中将结核分枝杆菌轻轻超声处理后，利用PBS(pH 7.2)进行稀释，从而获得预期数量的结核分枝杆菌。结核分枝杆菌的感染为如下方式，即，利用空气感染装置Glas-Col inhalation device(Terre Haute，IN)进行空气感染，使得每只小鼠感染200个～250个结核分枝杆菌。
1.9.组织病理学分析及结核分枝杆菌感染抑制效果的确认
为了确认将c-di-GMP作为免疫佐剂使用的免疫化反应对抑制结核分枝杆菌感染是否有效，使用了与实施例1.8相同方法，用结核分枝杆菌感染小鼠，并在小鼠感染16周后，对感染的小鼠进行安乐死并从各个小鼠实验组中摘出了肺组织。而且，保存在10％中和福尔马林(neutral-buffered formalin)后，固定于石蜡中。将固定的肺组织制成4～5mm厚度的切片，并用Hematoxylin&Eosin(H&E)进行染色。其结果示于图3的A部分。而且，根据染色的结果，利用ImageJ software program(National Institute of Health，MD，USA)对产生炎症部分的面积进行数值化。其结果示于图3的B部分。并且，通过PBS提取粘附在安乐死的小鼠的肺和脾的结核分枝杆菌来获得均质悬浮液，分别将各个均质悬浮液逐步进行稀释后，在Middlebrook 7H11Agar(Difco，Detroit，MI，USA)中培养来确认感染的结核分枝杆菌的数量，感染的结核分枝杆菌的数量以整个肺或脾组织平均log10CFU±标准偏差来表示。其结果示于图3的C部分。
如图3的B部分所示，经确认，在利用免疫佐剂免疫化的小鼠肺组织中，相比于仅利用免疫佐剂的阴性对照组，炎症有所减少，尤其，相比于利用ESAT-6+MPL/DDA疫苗组合物免疫化的实验组，利用ESAT-6+c-di-GMP/DDA疫苗组合物免疫化的实验组可进一步减少炎症。
并且，如图3的C部分所示，经确认，相比于仅利用免疫佐剂免疫化的阴性对照组，利用ESAT-6+c-di-GMP/DDA疫苗组合物免疫化的实验组中感染的结核分枝杆菌数量显著减少。由此，可确认到如下情况，即，将c-di-GMP单独用作免疫佐剂可有效预防高病原性结核分枝杆菌HN878 strain的感染。
通过上述结果，如c-di-GMP(cyclic diguanylate)的干扰素基因刺激蛋白激动剂不仅单独具有免疫佐剂性(adjuvanticity)，而且，相比于作为现有免疫佐剂的单磷酰基脂质A(MPL)，可确认到其效果更加明显。并且，可通过将干扰素基因刺激蛋白激动剂单独用作免疫佐剂来有效预防多种结核分枝杆菌的感染。
实施例2：干扰素基因刺激蛋白激动剂和免疫佐剂的协同效果的确认
为了确认在同时使用干扰素基因刺激蛋白激动剂(Stimulator of interferongenes(STING)agonist)和作为已知免疫佐剂(adjuvant)的单磷酰基脂质A(MPL)时的协同效果而进行了以下实验。
2.1.实验动物
使用没有特定病原体的生后6周龄雌性C57BL/6小鼠(Japan SLC，Inc.Shijuoka，Japan)进行实验，在韩国延世大学临床医学研究中心内的ABSL-3生物危害动物实验室的有限空间中，通过提供无菌的销售用饲料和水来饲养小鼠。
2.2.实验设计
为了确认在同时使用c-di-GMP(invivogen)和已知免疫佐剂的情况下是否产生协同效果而进行了动物实验。具体实验方法示于图4的A部分。作为实验组，通过将c-di-GMP和单磷酰基脂质A(MPL)一同配制于二甲基双十八烷基铵脂质体来使用。
如图4的A部分所示，在小鼠感染结核分枝杆菌10周之前，通过将各个疫苗组合物以3周为间隔进行3次肌肉注射(intramuscular injection)来对小鼠进行免疫化，在小鼠感染结核分枝杆菌之前，对一部分小鼠实施安乐死后，通过从脾和肺中分离脾细胞和肺细胞来一同进行了离体(ex vivo)实验。每个分离的细胞以普通方法传代及培养。以下实施例2.3详细记载了免疫化方法。接着，确认因抗原刺激引起的IFN-γ生成能力和通过ESAT-6蛋白免疫化浸润(infiltration)到脾和肺的记忆型(memory)T细胞的增加。并且，调查了最近报道的对于防止结核尤为重要的多功能CD4+T细胞的形成能力。而且，在感染结核分枝杆菌后第4周，分析了脾和肺内的细菌数量和肺的炎症程度。
2.3.免疫化
通过分别对实验中所使用到小鼠的背部以3周为间隔肌肉注射3次实验用疫苗组合物来对小鼠进行免疫化。以最终浓度为5mg/mL的方式稀释二甲基双十八烷基铵脂质体后，在加热至65℃的同时进行超声处理(sonication)来溶解，然后以体积为2：1的方式与各个免疫佐剂相混合制备。将每只小鼠所注射的体积最终为200μl，每次注射包含1μl的ESAT-6蛋白作为抗原。作为阴性对照组，向肌肉内注射了未包含抗原的单磷酰基脂质A/二甲基双十八烷基铵。
2.4.CD4+/CD8+T细胞的活性确认
为了确认复合免疫佐剂是否对T细胞的活性产生影响，利用作为T细胞的活性标记的CD44、PD-1、CD62L、CD127通过与实施例1.11相同方法确认T细胞的活性。其结果示于图4的B部分。
如图4的B部分所示，经确认，相比于单独使用免疫抗原
的情况，当复合使用c-di-GMP和单磷酰基脂质A(MPL)时，脾中CD8+T细胞的数量增加，在CD4+T细胞的情况下，脾和肺中的CD44+PD-1+、CD62L－CD127－T细胞的数量均显著增加。
2.5.抗原特异性抗体生成能力确认
为了验证复合免疫佐剂影响抗原特异性抗体生成能力的功效，在在最终完成共3次的免疫化的时间点，通过分离各个小鼠的血清(serum)来确认了抗体生成(antibodyproduction)程度。将1μg/ml浓度的ESAT-6蛋白添加到96-孔板后，通过在常温条件下进行2小时的反应来填充各个孔(well)，随后，向填充的孔添加各个实验组的小鼠血清。而且，将与辣根过氧化物酶(HRP，horseradish peroxidase)相结合的抗-IgG(sigma)、抗-IgG1(BDBioscience)或抗-IgG2c(Southern Biotech)添加到每个孔来进行反应后，通过酶联免疫吸附测定法(ELISA，enzyme-linked immunosorbent assay)确认生成的抗原特异性抗体的生成能力。其结果示于图4的C部分。
如图4的C部分所示，经确认，相比于单独使用免疫佐剂的情况，当复合使用c-di-GMP和单磷酰基脂质A(MPL)的复合免疫佐剂时，不仅在Total IgG，而且在与TH2免疫(immunity)相关的IgG1和与报道的对于防止结核尤为重要的Th1免疫相关的IgG2c中均确认到了进一步提升的抗体生成能力，由此，可诱导均匀的免疫反应。
2.6.胚中心相关细胞的确认
胚中心(GC，germinal center)位于次级淋巴组织(secondary lymphoid tissue)B细胞的滤胞(folicle)中，众所周知，胚中心相关B细胞在调节防御性体液免疫方面起到重要的功能性成熟过程，例如，体细胞高频突变(somatic hypermutation)和B细胞的记忆(memory)形成。并且，作为抑制CD4+T细胞，滤泡辅助型(follicular helper)T细胞(TFH)为增加B细胞的抗体反应的重要细胞，滤泡辅助型T细胞的CXCR5基因的表达在向B细胞区域移动并与同源(cognate)B细胞的相互作用中起到重要作用。因此，为了使通过体液免疫而具有高亲和性的效应因子(effector)持续稳定，增加可诱导胚中心的免疫反应的滤泡辅助型T细胞的活性尤为重要。因此，为了确认本发明的复合免疫佐剂是否激活滤泡辅助型T细胞，通过从完成免疫化的小鼠中分离脾细胞并利用流式细胞分析仪确认了胚中心相关细胞。其结果示于图4的D部分。
如图4的D部分所示，经确认，相比于将单磷酰基脂质A(MPL)单独作为免疫佐剂使用的实验组，在使用c-di-GMP和单磷酰基脂质A(MPL)的复合免疫佐剂的实验组的情况下，CD4+CXCR5+PD-1+滤泡辅助型细胞和B220+CD138+浆细胞(plasma cell)的数量显著增加。这可能是因为通过c-di-GMP的干扰素基因刺激蛋白信号传导(signaling)的介入而产生的影响。相反，作为胚中心相关细胞的CD4+CD44hiCXCR5+GL7+滤泡辅助型细胞(GC TFH cell)和CD19+B220+Fas+GL7+B细胞(GC B cell)稍有增加，但并无较大的差异。
2.7.结核分枝杆菌的培养及空气感染
将高病原性结核分枝杆菌的Mycobacterium tuberculosis HN878菌株在7H9-OADC培养基(broth)中培养15日。而且，收集培养的细菌后，用6mm的玻璃珠轻轻涡旋(vortexing)来破碎细菌。对破碎的细菌进行离心分离来沉积细胞聚集物后收集上清液，将收集的上清液分注并在﹣70℃的温度条件下进行保存。当进行实验时，将保存的菌进行解冻后，在Middlebrook 7H11 Agar(Difco，Detroit，MI，USA)中依次稀释并培养，从而确认细菌的数量，为了使小鼠感染，在声波浴(sonic bath)中将结核分枝杆菌轻轻超声处理后，利用PBS(pH 7.2)进行稀释，从而获得预期数量的结核分枝杆菌。结核分枝杆菌的感染为如下方式，即，利用空气感染装置Glas-Col inhalation device(Terre Haute，IN)进行空气感染，使得每只小鼠感染200个～250个结核分枝杆菌。
2.8.组织病理学分析及结核分枝杆菌感染抑制效果的确认
为了确认将c-di-GMP作为免疫佐剂使用的免疫化反应对抑制结核分枝杆菌感染是否有效，使用了与实施例2.7相同的方法，用结核分枝杆菌感染小鼠，并在小鼠感染4周后，对感染的小鼠进行安乐死并从各个小鼠实验组中摘出了肺组织。而且，保存在10％中和福尔马林(neutral-buffered formalin)后，固定于石蜡中。将固定的肺组织制成4～5mm厚度的切片，并用Hematoxylin&Eosin(H&E)进行染色。其结果示于图5的A部分。并且，通过PBS提取粘附在安乐死的小鼠的肺和脾的结核分枝杆菌来获得均质悬浮液，分别将各个均质悬浮液逐步进行稀释后，在Middlebrook 7H11 Agar(Difco，Detroit，MI，USA)中培养来确认感染的结核分枝杆菌的数量，感染的结核分枝杆菌的数量以整个肺或脾组织平均log10CFU±标准偏差。其结果示于图5的B部分。
如图5的A部分所示，经确认，在利用复合免疫佐剂免疫化的小鼠肺组织中，相比于仅利用单磷酰基脂质A(MPL)免疫佐剂的实验组，炎症有所减少。
并且，如图5的B部分所示，经确认，相比于仅利用单磷酰基脂质A(MPL)免疫佐剂的实验组，利用复合免疫佐剂免疫化的实验组中感染的结核分枝杆菌数量显著减少。由此，可确认到如下情况，即，相比于单独使用的情况，在将c-di-GMP和单磷酰基脂质A(MPL)作为免疫佐剂复合使用的情况下，可有效预防高病原性结核分枝杆菌HN878 strain的感染。
2.9.在使用复合免疫佐剂的情况下确认被诱导的T细胞的活性
据报道，多功能T细胞(同时分泌IFN-γ、TNF-α和/或IL-2的T细胞)为防御结核分枝杆菌所必要的免疫学指标，因此在使用复合免疫佐剂的情况下，确认是否生成多功能T细胞。使免疫化的小鼠感染结核分枝杆菌4周后，利用ESAT-6蛋白对通过与实施例2.2相同方法分离的小鼠的肺细胞和脾细胞进行刺激。而且，为了防止生成的细胞因子(cytokine)向细胞外分泌，在用GolgiSto(BD Bioscience)处理细胞后，在37℃的温度条件下进行12小时的反应，随后，用PBS洗涤2次。在洗涤的细胞中处理抗-CD4-PerCP-Cy5.5(BD Bioscience)、抗-CD8-APC-Cy7(BD Bioscience)、抗-CD44-v450(BD Bioscience)等抗体后，在4℃的温度条件下进行30分钟的反应，并通过PBS的洗涤来去除未结合的抗体。而且，为了提高细胞的渗透性(permeability)，向细胞添加Cytofix/Cytoperm(BD Bioscience)后，在4℃的温度条件下进行30分钟的反应，随后，再次用PBS进行洗涤，在洗涤的细胞中追加处理抗-IFN-γ-PE(BD Bioscience)、抗-IL-2-PE-Cy7(BD Bioscience)、抗-TNF-α-APC(BDBioscience)等抗体并在4℃的温度条件下进行30分钟的反应。利用Perm/Wash溶液(BDBioscience)对完成反应的细胞进行数次洗涤后，通过流式细胞分析仪进行分析，根据流式细胞分析仪分析的结果，利用流式细胞分析软件(FlowJo software)的门控方法(gatingstrategy)进行追加分析，其结果示于图5的C部分。
如图5的C部分所示，经确认，相比于单独使用免疫佐剂的实验组，在将c-di-GMP和单磷酰基脂质A(MPL)均作为复合免疫佐剂使用的情况下，CD4+IFN-γ+TNF-α+IL-2+、CD4+IFN-γ+TNF-α+及CD4+IFN-γ+IL-2+的多功能(multifunctional)T细胞显著增加。
通过上述结果可确认到如下情况，即，当与如c-di-GMP的干扰素基因刺激蛋白激动剂一同复合使用如单磷酰基脂质A(MPL)的现有的免疫佐剂时，其效果显著增加。并且，经确认，当同时使用免疫佐剂和干扰素基因刺激蛋白激动剂时，可有效预防结核分枝杆菌的感染。
实施例3：干扰素基因刺激蛋白激动剂与现有免疫佐剂的协同效果的确认
为了确认在同时使用干扰素基因刺激蛋白激动剂(STING，Stimulator ofinterferon gene)和作为现有已知的免疫佐剂(adjuvant)的在稳定的角鲨烯水包油纳米乳液中配制而成的吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA-SE，Glucopyranosyl Lipid Adjuvant，formulated in a stable nano-emulsion of squalene oil-in-water)时的协同效果而进行了以下实验。
3.1.在使用干扰素基因刺激蛋白激动剂及在稳定的角鲨烯水包油纳米乳液中配制而成的吡喃葡萄糖基脂质佐剂的情况下确认被诱导的T细胞的活性
为了确认复合免疫佐剂是否对T细胞的活性产生影响，在通过单一免疫佐剂或复合免疫佐剂免疫化的小鼠感染结核分枝杆菌之前分离其脾及肺。而且，利用流式细胞分析仪确认在离体(ex vivo)处理ESAT-6肽库(peptide pool)或蛋白质后所诱导的抗原及T细胞的生成。详细的实验方法与实施例1.7所记载的方法相同。其结果示于图6。
如图6所示，经确认，在所有实验组中，相比于单独使用在稳定的角鲨烯水包油纳米乳液中配制而成的吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA-SE)免疫化的组，在利用c-di-GMP及在稳定的角鲨烯水包油纳米乳液中配制而成的吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA-SE)的复合免疫佐剂免疫化的组中的CD4+IFN-γ+TNF-α+的多功能T细胞的生成显著增加。
并且，为了进一步验证对于(1)阴性对照组、(2)结核分枝杆菌(tuberculosis)单独处理组、(3)BCG(bacille de Calmette-Guerin vaccine)单独处理组、(4)BCG prime、ESAT-6及在稳定的角鲨烯水包油纳米乳液中配制而成的吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA-SE)处理组、(5)BCG prime、ESAT-6、在稳定的角鲨烯水包油纳米乳液中配制而成的吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA-SE)及干扰素基因刺激蛋白激动剂(c-di-GMP)处理组、(6)ESAT-6及在稳定的角鲨烯水包油纳米乳液中配制而成的吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA-SE)处理组、(7)ESAT-6、干扰素基因刺激蛋白激动剂及在稳定的角鲨烯水包油纳米乳液中配制而成的吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA-SE)处理组等7个处理阻的功效，在最终完成共3次的免疫化的时间点，对小鼠实施安乐死后，通过与实施例1.5、实施例1.7及实施例1.11相同方法确认T细胞的活性。其中，免疫化通过肌肉注射进行。其结果示于图7。
如图7所示，经确认，相比于单独使用复合免疫佐剂的情况，当复合使用c-di-GMP和在稳定的角鲨烯水包油纳米乳液中配制而成的吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA-SE)时，如IFN-γ、TNF-α、IL-2等的细胞因子(cytokine)的分泌有所增加。
通过上述结果，可以确认若将在稳定的角鲨烯水包油纳米乳液中配制而成的吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA-SE)及干扰素基因刺激蛋白激动剂用作复合免疫佐剂，则可有效预防结核分枝杆菌的感染。
3.2.在使用干扰素基因刺激蛋白激动剂及在稳定的角鲨烯水包油纳米乳液中配制而成的吡喃葡萄糖基脂质佐剂的情况下确认结核分枝杆菌感染抑制效果
为了确认通过复合免疫佐剂的免疫反应是否具有抑制结核分枝杆菌感染的效果，在小鼠感染结核分枝杆菌10周之前，通过将(1)单独的BCG(bacille de Calmette-Guerinvaccine)、(2)ESAT-6及在稳定的角鲨烯水包油纳米乳液中配制而成的吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA-SE)、(3)ESAT-6、干扰素基因刺激蛋白激动剂及在稳定的角鲨烯水包油纳米乳液中配制而成的吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA-SE)的疫苗组合物以3周为间隔进行3次肌肉注射(intramuscular injection)来对小鼠进行免疫化，通过与实施例2.7相同方法使小鼠感染结核分枝杆菌，并经过4周后对感染的小鼠进行安乐死，通过PBS提取粘附在各个小鼠的肺的结核分枝杆菌来获得均质悬浮液，分别将各个均质悬浮液逐步进行稀释后，在Middlebrook 7H11Agar(Difco，Detroit，MI，USA)中培养来确认感染的结核分枝杆菌的数量，感染的结核分枝杆菌的数量以整个肺或脾组织平均log10CFU±标准偏差来表示。其结果示于图8。
如图8所示，经确认，相比于单独将在稳定的角鲨烯水包油纳米乳液中配制而成的吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA-SE)作为免疫佐剂使用的实验组，在将c-di-GMP和吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA-SE)作为复合免疫佐剂同时使用的情况下，感染的结核分枝杆菌数量显著减少。因此，在将c-di-GMP和在稳定的角鲨烯水包油纳米乳液中配制而成的吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA-SE)作为复合免疫佐剂使用时，可有效预防高病原性结核分枝杆菌HN878strain的感染。
可通过上述结果确认到如下情况，即，当复合使用如c-di-GMP的干扰素基因刺激蛋白激动剂与如单磷酰基脂质A(MPL)及在稳定的角鲨烯水包油纳米乳液中配制而成的吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA-SE)等的现有免疫佐剂时，其效果显著增加。尤其，最近发现，在结核分枝杆菌的预防及治疗过程中，CD4+IFN-γ+TNF-α+的多功能T细胞的生成必不可少，相比于单独使用其他现有免疫佐剂的情况，本发明的干扰素基因刺激蛋白激动剂可显著增加脾和/或肺中的多功能(multifunctional)T细胞的生成。根据上述结果，在使用免疫佐剂的情况下，若追加使用干扰素基因刺激蛋白激动剂，则可显著增加对于结核分枝杆菌的预防及治疗效果低下的免疫佐剂的效果，由此，包含干扰素基因刺激蛋白激动剂的复合免疫佐剂可有效预防多种结核分枝杆菌的感染。
以上详细说明了本发明的特定部分，对于本发明所属领域的普通技术人员而言，上述具体技术仅为优选实例，而本发明的范围不限于此。因此，本发明的实际范围应由所附发明要求保护范围及其等同技术方案加以定义。
Claims (16)
1.一种免疫佐剂组合物，其特征在于，包含干扰素基因刺激蛋白激动剂作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的免疫佐剂组合物，其特征在于，上述干扰素基因刺激蛋白激动剂包含选自由c-di-GMP、cGAMP、3’3’-cGAMP、c-di-GAMP、c-di-AMP及2’3’-cGAMP组成的组中的一种以上。
3.根据权利要求1所述的免疫佐剂组合物，其特征在于，上述干扰素基因刺激蛋白激动剂为选自由c-di-GMP、cGAMP、3’3’-cGAMP、c-di-GAMP、c-di-AMP、2’3’-cGAMP、10-(羧甲基)9(10H)吖啶酮、5，6-二甲基呫吨酮-4-乙酸、甲氧基酮、6，4’-二甲氧基黄酮、4’-甲氧基黄酮、3’，6’-二羟基黄酮、7，2’-二羟基黄酮、黄豆苷元、刺芒柄花素、雷杜辛7-甲基醚及呫吨酮组成的组中的一种以上。
4.根据权利要求1所述的免疫佐剂组合物，其特征在于，上述组合物还包含单磷酰基脂质A及在稳定的角鲨烯水包油纳米乳液中配制而成的吡喃葡萄糖基脂质佐剂中的一种以上的免疫佐剂。
5.根据权利要求4所述的免疫佐剂组合物，其特征在于，上述免疫佐剂封入在脂质体中。
6.一种疫苗组合物，其特征在于，包含干扰素基因刺激蛋白激动剂及抗原作为有效成分。
7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在于，上述干扰素基因刺激蛋白激动剂为选自由c-di-GMP、cGAMP、3’3’-cGAMP、c-di-GAMP、c-di-AMP及2’3’-cGAMP组成的组中的一种以上。
8.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在于，上述干扰素基因刺激蛋白激动剂为选自由c-di-GMP、cGAMP、3’3’-cGAMP、c-di-GAMP、c-di-AMP、2’3’-cGAMP、10-(羧甲基)9(10H)吖啶酮、5，6-二甲基呫吨酮-4-乙酸、甲氧基酮、6，4’-二甲氧基黄酮、4’-甲氧基黄酮、3’，6’-二羟基黄酮、7，2’-二羟基黄酮、黄豆苷元、刺芒柄花素、雷杜辛7-甲基醚及呫吨酮组成的组中的一种以上。
9.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在于，上述组合物还包含单磷酰基脂质A及在稳定的角鲨烯水包油纳米乳液中配制而成的吡喃葡萄糖基脂质佐剂中的一种以上的免疫佐剂。
10.根据权利要求9所述的疫苗组合物，其特征在于，上述免疫佐剂封入在脂质体中。
11.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在于，上述抗原为结核分枝杆菌特异性抗原。
12.根据权利要求11所述的疫苗组合物，其特征在于，上述结核分枝杆菌特异性抗原为ESAT-6。
13.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在于，上述疫苗组合物用于预防结核分枝杆菌的感染。
14.一种感染性疾病的预防方法，其特征在于，包括向个体给药干扰素基因刺激蛋白激动剂及抗原的步骤。
15.根据权利要求14所述的感染性疾病的预防方法，其特征在于，包括向个体追加给药单磷酰基脂质A及在稳定的角鲨烯水包油纳米乳液中配制而成的吡喃葡萄糖基脂质佐剂中的一种以上的免疫佐剂的步骤。
16.根据权利要求14或15所述的感染性疾病的预防方法，其特征在于，上述感染性疾病为结核病。
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