DE3639780A1 - Arzneimittel zur behandlung von viruserkrankungen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Behandlung von Erkrankungen, die durch Viren mit RNA-abhängiger DNA-Polymerase, insbesondere Human-Immunodeficiency- Viren (HIV) hervorgerufen werden, z. B. von AIDS oder ARC (AIDS-Related Complex) und damit verbundenen neurologischen Komplikationen.

Seit 1984, als die Erreger von Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS) isoliert wurden, wird in großem Umfang nach einem geeigneten Arzneimittel gesucht, welches bei dieser in der Regel lethal verlaufenden Erkrankung wirksam ist. Zwar wurden einige wenige erfolgversprechende Mittel vorgeschlagen, der Nachweis ihrer Wirksamkeit durch klinische Versuche steht jedoch noch aus. Es besteht daher großer Bedarf an einem derartigen Arzneimittel, insbesondere an einem Arzneimittel mit einem ausreichend großen therapeutischen Index, also einem Abstand zwischen wirksamer Dosis und toxischer Dosis, der eine einfache Verabreichung des Medikaments ermöglicht ohne die Gefahr, hierbei schon in den toxischen Bereich zu geraten.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, dieses Problem zu lösen.

Erfindungsgemäß gelingt dies durch ein Arzneimittel zur Behandlung von Viruserkrankungen, deren Erreger für ihre Vermehrung eine RNA-abhängige DNA-Polymerase benötigen, insbesondere solche, die durch das Human-Immunodeficiency- Virus (HIV) hervorgerufen werden, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es als Wirkstoff mindestens eine Verbindung der allgemeinen Formel

in der B einen Guanin- oder Hypoxanthinrest und X einen Azido- oder -OCH₃-Rest oder ein Fluoratom bedeuten oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, gegebenenfalls zusammen mit üblichen pharmazeutischen Träger- und Verdünnungsmitteln enthält. Bei den erfindungsgemäßen Wirkstoffen handelt es sich um die 9-(β-D-2-deoxyribofuranosyl)- nucleoside der Guanosin- bzw. Inosinreihe.

Der bevorzugte Wirkstoff des erfindungsgemäßen Arzneimittels ist 3′-Azido-2′,3′-dideoxy-guanosin.

Der bevorzugte Wirkstoff gemäß der Erfindung und seine Herstellung sind bekannt aus J. of Org. Chem., 43, 3044 bis 3048 (1978). Die Herstellung erfolgt danach im Prinzip durch Transglykolsylierung des entsprechenden 5′-O-Acetyl- oder 5′-O-Trimethylsilyl-3′-azido-3′-deoxythymidins mit silyliertem N²-Plamitolylguanin in Gegenwart von Trimethylsilyl-trifluoromethansulfonat als Katalysator. Die entsprechende Hypoxanthinverbindung läßt sich in analoger Weise unter Verwendung des entsprechenden Palmitoyl-hypoxanthins erhalten. Alternativ können diese Verbindungen erhalten werden, aus der Reaktion der 1-O-Methyl-5-O-(4-methylbenzoyl)-3-azido-2,3-dideoxy-D- ribofuranose, erhalten nach der Vorschrift von N. B. Dyatkina und A. V. Azhayev in Synthesis, 1984, S. 961, durch Umsetzung mit silyliertem Guanin bzw. Hypoxanthin unter Zuhilfenahme eines Katalysators wie Trimethylsilyltrifluoromethansulfonat nach der Vorschrift von H. Vorbrüggen, K. Krokiewicz und B. Benna (1981), Chem. Ber., 114, 1234. Die entsprechenden Verbindungen mit einer Fluor- oder Methoxylgruppe in Position 3 des 2-Deoxyribofuranosylgerüstes lassen sich aus 3′-Fluor-3′-deoxy- bzw. 3′-O-Methyl-3′-deoxythymidin durch dieselbe Transglykosidierungsreaktion erhalten. Dabei dient 2,3′-Anhydro- 1-(2-deoxy-β-D-xylofuranosyl)-thymin (kurz genannt o²,o³′-Cyclothymidin), hergestellt nach G. Kowollik, K. Gaertner und P. Langen in Tetrahedron Letters, 1969, S. 3863, wieder als Ausgangsmaterial. Durch Umsetzung mit Natriummethylat wird es in das 3′-O-Methyl-3′-deoxythymidin umgesetzt. Zur Darstellung des 3′-Fluor-3′-deoxythymidins wird das Cyclothymidin nach der von G. Kowollik, G. Etzold, M. von Janta, Lipinski, K. Gaertner und P. Langen angegebenen Vorschrift in J. Prakt. Chemie (1973), 315, S. 895, mit HF und AlF₃ umgesetzt. Alternativ kann das Cyclothymidin auch mit KF in Gegenwart des Kronenäthers 18-Kron-6 in Dimethylformamid oder Dioxan umgesetzt werden. Außerdem lassen sich die Hypoxanthinverbindungen auch aus den entsprechenden Adeninverbindungen, die z. T. aus der obigen Literaturstelle bekannt sind, durch Desaminierung mit salpetriger Säure oder Nitrosylchlorid herstellen.

Die Wirksamkeit der Wirkstoffverbindung des erfindungsgemäßen Arzneimittels wurde in einem biologischen System festgestellt, bei welchem das aus Patienten mit AIDS und ARC isolierte HIV auf Humanzellinien gezüchtet wurde. Die in vitro-Pathogenität des so gezüchteten HIV wurde unter Verwendung von MT₄-Zellen, einer T₄- Zellinie, für welche HIV cytophathisch ist, bestimmt. Die MT₄-Zellinie ist beschrieben in Science, Vol. 229 (09. August 1985), Seiten 563-566. Der cytophathologische Effekt wurde dabei durch Messung des Thymidineinbaus in die Zelle verfolgt. Wurden die erfindungsgemäßen Wirkstoffe, insbesondere das 3′-Azido-2′,3′- dideoxyguanosin, den mit HIV inokulierten MT₄-Zellen zugesetzt, so gelang es bereits mit nanomolaren Konzentrationen des Wirkstoffes, den durch das Virus hervorgerufenen cytopathologischen Effekt zu verhüten.

Im gleichen System erfolgte auch die Toxizitätsbestimmung. Hierbei wurden MT₄-Zellen dem im erfindungsgemäßen Arzneimittel als Wirkstoffe enthaltenen Nukleosidanalogen in Abwesenheit von HIV ausgesetzt und wiederum die Toxizität anhand des Einbaus von Thymidin bestimmt. Aus der so bestimmten Konzentration für die Erzielung einer antiviralen Wirksamkeit im Vergleich zu der für einen toxischen Effekt erforderlichen Menge an Wirkstoff wurde ein in vitro therapeutischer Index bestimmt. Dieser therapeutische Index ist für die bevorzugte 3′-Azido-2′,3-dideoxyguanosinverbindung bei der verwendeten humanen Zellinie gleich oder größer 10³.

Die Versuche wurden so durchgeführt, daß Proben des Überstandes der das Virus erzeugenden Zellinie in schrittweiser Verdünnung in Mikrotiterplatten eingebracht wurden, welche die Zellinie MT₄ enthalten. Gleichzeitig wurde in die Mikrotiterplatten radioaktiv markiertes Thymidin gegeben und der Einbau dieser Substanz, der der Lebenstätigkeit dieser Zellen parallel läuft, gemessen. Unter dem Einfluß toxischer Konzentrationen an Wirkstoff gemäß der Erfindung oder cytopathischer Mengen an Virus enthaltenden Flüssigkeit sinkt der Einbau an radioaktiv markiertem Thymidin entsprechend.

In Fig. 1 der Zeichnung wird der Einfluß unterschiedlicher Verdünnungen des HIV-Virus enthaltenden Überstandes der Virus produzierenden Zellinie (unterschiedliche Viruskonzentration) auf den Thymidineinbau in MT₄-Zellen graphisch dargestellt. Die Einbaukurve zeigt, daß bis zu einer Verdünnung 1 : 30 die Pathogenität der HIV-Viren zu einem sehr geringen Thymidineinbau führt. Erst bei weiterer Verdünnung steigt der Thymidineinbau (Thymidin Uptake) entsprechend an und erreicht einen Höchstwert bei einer Verdünnung des virushaltigen Überstandes von 1 : 10 000.

Fig. 1 zeigt also, daß bei einer Verdünnung des Kulturüberstandes von 1 : 40 noch eine nahezu maximale Pathogenität des HIV auf die MT₄-Zellen vorliegt. Die Untersuchung der Wirksamkeit der Wirkstoffe des erfindungsgemäßen Arzneimittels erfolgte bei dieser Virusverdünnung, indem eine vorgemischte Lösung von Virusverdünnung und des zu untersuchenden Wirkstoffes der Zellinienprobe zugesetzt und wiederum der Thymidineinbau bestimmt wurde. Die Ergebnisse dieser Versuche mit der bevorzugten Verbindung sind in Fig. 2 gezeigt. Fig. 2 stellt graphisch den Zusammenhang zwischen der Menge an zugegebenem Wirkstoff in µg/ml und der Thymidineinbaurate in cpm (counts pro Minute) dar. Die mit -HIV bezeichnete Kurve wurde in Abwesenheit des Virus aufgenommen, die Kurve +HIV in Anwesenheit des Virus. Sie zeigt, daß eine Konzentration von 0,3 µg/ml des Wirkstoffes die Zellen mit halbmaximaler Wirkung gegen den pathogenen Effekt einer 1 : 40-Verdünnung von HIV-Stammflüssigkeit schützt.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können den Wirkstoff in freier Form oder in Form eines physiologisch verträglichen Salzes enthalten, und zwar in Form einer Verbindung oder eines Gemisches von Verbindungen der allgemeinen Formel. Zusätzlich kann das Arzneimittel die für die jeweils beabsichtigte Verabreichungsform üblichen pharmazeutischen Zusatzstoffe und Verdünnungsmittel enthalten. Die Verabreichung kann oral, parenteral, intrathekal oder intravenös erfolgen. Die orale Verabreichung wird bevorzugt.

Beispiel

Die Synthese des 3′-Fluor-2′,3′-dideoxyguanosins erfolgt in Analogie zu der des 3′-Azido-2′,3′-dideoxyguanosins [Imazawa und Eckstein, J. Org. Chem., 43 (1978), 3044] durch Transglycosidierung von 3′-Fluor-3′-deoxythymidin [synthetisiert nach G. Etzold et al., Tetrahedron, 27 (1971), 2463] mit Palmitoylguanin in Acetonitril unter Rückfluß für 60 Minuten mit Bis(trimethylsilyl)-acetamid und Trifluormethylmethansulfonsäure-trimethylsilylester. Bei Chromatographie an Kieselgel wird ein Produkt erhalten, das im Dünnschichtchromatogramm (CHCl₃/MeOH, 9 : 1) einen etwas größeren R_F-Wert (0,43) als Thymidin (0,38) hat. Dieses wird in mit NH₃ gesättigtem MeOH bei 50°C über Nacht umgesetzt. Nach Eindampfen wird der Rückstand in H₂O/MeOH gelöst und auf einer LiChroprep-RP-18-Säule mit einem Gemisch aus 50 mM Triäthylammoniumbicarbonat (pH 7,5) und 6% Acetonitril aufgetrennt. Nach Eindampfen und nochmaligem Eindampfen mit MeOH erhält man einen Rückstand. Die Substanz wird in MeOH/H₂O durch Aufkochen herausgelöst. Nach Abfiltrieren wird eingedampft, wobei 9-(3-Fluor-2′,3′-dideoxy-β-D- ribofuranosyl)guanin auskristallisiert; mp<230°, ¹H NMR (DMSO) δ, 6,15 ppm (dd, 1 H, J_3′H,F=53 Hz, H-3′), 4,14 (dm, 1 H, J_4′H,3′F=32 Hz, H-4′). HPLC-Analyse auf ODS-Hypersil mit einem linearen Gradienten aus 100 mM Triäthylammoniumbicarbonat (pH 7,5) und Acetonitril (0 bis 15% in 15 Minuten): Retentionszeit 8,8 Minuten für das α-Anomere, 6,8 Minuten). Ausbeute ca. 15%.

Die antivirale Aktivität von 3′-Fluor-2′,3′-dideoxyguanosin wurde, wie in der Beschreibung auf Seite 7 für Fig. 2 erklärt, durch Untersuchung des (³H)-Thymidin- Einbaus in die DNA von HIV-infizierten MT₄-Zellen im Vergleich zu uninfizierten MT₄-Zellen bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt.

Claims (2)

1. Arzneimittel zur Behandlung von Viruserkrankungen, deren Erreger für ihre Vermehrung eine RNA-abhängige DNA-Polymerase benötigen, insbesondere solche, die durch das Human-Immunodeficiency-Virus (HIV) hervorgerufen werden, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff mindestens eine Verbindung der allgemeinen Formel in der B einen Guanin- oder Hypoxanthinrest und X einen Azido- oder -OCH₃-Rest oder ein Fluoratom bedeuten oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, gegebenenfalls zusammen mit üblichen pharmazeutischen Träger- und Verdünnungsmitteln enthält.

2. 3′-Azido-2′,3′-dideoxy-guanosin.