DE2538573A1 - Uridine und diese enthaltende pharmazeutische praeparate - Google Patents

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PATENTANWÄLTE

Dlpl.-Ing. P. WIRTH ■ Dr. V. SCHMIED-KOWARZIK DIpl.-Ing. G. DANNENBERG · Dr. P. WEINHOLD · Dr. D. GUDEL

281134 6 FRANKFURT/M.

TELEFON (Oem _287oi4 GR ESCHENHEIMER STR.39

Docket: 13865A
wd/cw/um

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405 Lexington Avenue
New York, New York

U.S.A.

"Uridine und diese enthaltende pharmazeutische Präparate

Eingaben Bllndprlgung mit Kopf (Japan} 74

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Herpes simplex-Viren s^nd die Erreger für eine Anzahl von Infektionen bei Säugetier und Mensch, und zwar bei solchen Humankrankheiten, wie z.B. Keratitis, Herpes labialis(Lippenherpes),Hautherpes, Herpes zoster, Herpes genitalis, Herpes enzephalitis, Neonatalherpes» herpesartiges Nagelgeschwür und akute herpesartige Gingivostomatitis. Pockenviren, insbesondere der Variola-Virus, sind die Erreger für Pocken beim Menschen. Bis jetzt ist noch kein zufriedenstellendes Antivirusmittel, das hohe Wirksamkeit mit niedriger Toxizität verbindet, gefunden worden. Deshalb wurde bei Bemühungen, ein geeignetes Mittel zu finden, eine beträchtliche Forschungsarbeit aufgewendet.

Es ist nun gefunden worden, daß Verbindungen der Gruppe : 5'-Amino-2' , 5^!-dideoxy~5-;joduridin, 5'~Amino-2',5'-dideoxy-5-bromuridin und deren pharmazeutisch verwendbaren Säureadditionssalzen, starke Inhibitoren für den Herpes simplex-Virus darstellen und praktisch nicht toxisch sind. Der Einfachheit halber werden diese Verbindungen im folgenden als AIU und ABrIi bezeichnet. Die vorliegende Erfindung betrifft diese neuen Verbindungen und therapeutisch wertvolle Zusammensetzungen, die eine oder mehrere von diesen gegebenenfalls in Verbindung mit anderen therapeutisch aktiven Bestandteilen enthalten.

Das folgende Beispiel erläutert die Synthese von AIU und ABrU. Pharmazeutisch verwendbare Säureadditionssalze werden leicht durch Behandlung der basischen Verbindung mit Säure in wässrigen Medien mit nÄöhfolgeiidem Abdampfen des Lösungsmittels, beispielsweise durch Gefriertrocknen, hergestellt. Die Salze sind im allgemeinen löslicher als die freie Base und werden oft zur Herstellung von Dosierungsformen auf der Grundlage von Wasser, wie z.B. Augentropfen, bevorzugt. Beispielsweise kann eine

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Suspension von freiem Amin in destilliertem Wasser mit einer äquivalenten Menge an wässrigeer Säure behandelt und die entstandene Lösung mit einem Puffer, wie z.B. eine mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, stabilisiert werden,

Die Säuren, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutisch verwendbaren Säureadditionssalze verwendet werden können, sind solche, die nicht toxische Anionen enthalten und beispielsweise Chlorwasserstoff-, Schwefel-, Phosphor-, Essig-, Milch-, Zitronen-, Wein-, Oxal-, Bernstein-, Malein-, Glukon-, Zuckersäure und dergl. umfassen.

Beispiel 1 Synthese von 5¹-Amino-2^t ,^'-di

1. 5'-O-Tosyl-2'-deoxyuridin

22,8 g Deoxyuridin (100 Millimol) werden in 100 ml frisch destilliertem, trocknen Pyridin gelöst und auf Eis bei 4°C gehalten. Frisch umkristallisiertes p-Tolylsulfonylchlorid (22 g, 115 Millimol) wird separat in 100 ml kaltem Pyridin gelöst und dann langsam zu der Nukleosidlösung hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wird bei 4°C während 24 Stunden stehen gelassen und die Lösung in 400 ml Eiswasser gegossen. Diese Lösung wird dann zweimal mit 500 ml Chloroform extrahiert, die Chloroformextrakte werden kombiniert und mit 250 ml einer gesättigten Lösung von Natriumbikarbonat und 250 ml Wasser erneut extrahiert. Die Chloroformschicht wird gesammelt und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird durch Rotationsabdampfen im Vakuum entfernt, wobei 32 g eines rohen, dunkelgelben Produkts erhalten wurden. Die Umkristallisierung aus 95% Äthanol ergibt 25,3 g (66% Ausbeute) weiße Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 162⁰C.

2. 5^τ-Αζϊάο-2'-deoxyuridin

5'-O-Tosyl-2'-deoxyuridin (2,78 g, 10 Millimol) wird in 50 ml Dimethylformamid (DMF) gelöst, und 0,98 g (20 Millimol) Lithium-

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azid werden zugegeben. Die Lösung wird bei 100⁰C während 2 Stunden erhitzt, dann abgekühlt und filtriert. DMP wird im Vakuum bei'40⁰C entfernt und der gelbe Rückstand in 200 ml 50% wässrigem Methanol gelöst. 20 g Harz (Dowex 50 /E⁺J) werden hinzugefügt, und die Lösung wird während 30 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Filtration wird das Lösungsmittel durch Rotations abdampfen auf 20 bis 30 ml reduziert. Wenn die Lösung mehr und mehr konzentriert wird, bildet sich ein weißer Niederschlag. Der Niederschlag wird durch Filtration gesammelt, über KOH-Tabletten getrocknet und aus 2-Propanol umkristallisiert, wobei 2,05 g (80% Ausbeute) eines weißen Pulvers erhalten werden.

3. 5'-Amino-2'-depxyuridin

5'-Azido^'-deoxyuridin (258 mg, 1 Millimol) wird in 50 ml Äthanol gelöst, und 50 mg 10%-iger Palladium-Kohle-Katalysator werden hinzugefügt. Die Suspension wird bei atmosphärischem Druck in einer Hydrierungsvorrichtung während 2,5 Stunden gehalten, bevor sie durch Infusorienerde filtriert wird. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt, der Rückstand in Wasser gelöst und mit einer Säule von Harz (Dowex 50 /H⁺J) in' Verbindung gebracht. Nach Waschen der Säule mit 100 ml Wasser wird das 5^f -Amino-2^f-deoxyuridin mit 100 ml NH^OH (1 m) eluiert. Die Lösung wird zur Trockne abgedampft und der Rückstand aus Äthanol-Äther auskristallisiert, wobei das gewünschte Produkt (127 mg, 56%) erhalten wird.

4. 5' -Amino-2 V, 5'-dideoxy-5-.ioduridin

5'-Amino-2'-deoxyuridin (113 mg, 0,5 Millimol) wird in 25 ml Natriumacetatpuffer (0,1 m) bei einem pH-Wert von 5,0 gelöst. Quecksilber-II-acetat(636 mg,2,0 Millimol)wird hinzugefügt und die Lösung bei 55⁰C während 8 Stunden erhitzt. Nach Abkühlen wird der Überschuß an Quecksilberionen durch Behandlung mit Harz (Chelex 100 - 3 g) entfernt. Das Harz wird durch Filtration entfernt, und 20 ml einer Lösung von J₂ (0,1 m) in 95?6 Äthanol werden hinzugefügt. Die NUkIeOsId-J₂-Mischung wird bei

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Zimmertemperatur während 2 Stunden gehalten und dann dreimal mit 25 ml Chloroform extrahiert. Die wässrige Lösung wird zur Trockne abgedampft und der Rückstand in Äthanol gelöst. Das Produkt wird aus Äthanol-Äther-Petroläther (1:1:1) auskristallisiert, wobei 141 mg (80% Ausbeute) des Produkts erhalten werden.

Beispiel 2 Synthese von 5^t-Amino-2^>,5^f-dideoxv-5-bromuridin

Zu einer Lösung von 5'-Amino-2·-deoxyuridin (0,113 g,0,5 Milliraol) in 100 ml Natriumacetatpuffer (0,05 m) mit einem pH-Wert von 6,0 werden 0,8 g (2,5 Millimol) Quecksilber-II-acetat hinzugefügt. Die Lösung wird bei 60°C während 5 Stunden erhitzt und auf Eis abgekühlt. 20 g Harz (Chelex 100) werden zugegeben, und die Aufschlämmung bei O⁰C während 15 Minuten gerührt. Das Harz wird durch Filtration entfernt, und 0,177 g (1,0 Millimol) N-Bromsuccinamid werden hinzugefügt. Die Lösung wird bei Zimmertemperatur während 30 Minuten gerührt. Das Ausmaß der Bromierung wird spektrophotometrisch bei 300 mn verfolgt und die Reaktion durch die Zugabe von Analin-Äthanol beendet, als die Absorption ein gleichbleibendes erhöhtes Niveau erreicht. Die Reaktionsmischung wird direkt auf eine Säule (2 χ 15 cm) von Harz (Dowex 50 ßi⁺j gebracht, die Säule mit 200 ml Wasser gewä-. sehen und mit Ammoniumhydroxyd (1 m) eluiert. Das Lösungsmittel wird bei 40°C unter reduziertem Druck entfernt und der Rückstand aus Äthanol-Äther auskristallisiert, wobei 100 mg (69%) des gewünschten Produkts erhalten wurden.

Beispiel 3 Säureadditionssalze

Eine Gesamtmenge von 177 mg (0,5 Millimol) 5^!-Amino-2^f,5·-dideoxy-5-joduridin wird in destilliertem Wasser suspendiert, und 0,55 mg HCl (1 m) wurden langsam unter Rühren hinzugefügt, um eine Lösung des Aminhydrochloridsalzes zu erhalten. Das Salz wird durch Gefriertrocknen gewonnen.

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Andere Säuradditionssalze, insbesondere die Salze von Schwefel-, Phosphor-, Essig-, Milch-, Zitronen- und Weinsäure, werden auf ähnliche Weise hergestellt.

Die Salze der entsprechenden Bromverbindung werden auch durch das gleiche Verfahren hergestellt.

Die erfindungsgemäßen Produkte können allein verabreicht werden, im allgemeinen aber werden sie mit pharmazeutisch verwendbaren, nicht toxischen Trägern verabreicht, wobei die Anteile aufgrund der Eignung und chemischen Natur des speziellen Trägers, der gewählten Verabreichungsart und der üblichen pharmazeutischen Praxis bestimmt werden. Beispielsweise können sie zur Bekämpfung verschiedener Infektionen oder Erhaltung therapeutisch wirksamer Mengen im Blut oder Gewebe oral in Form von Tabletten oder Kapseln, die solche Arzneimittelträger,wie Stärke, Milchzucker, bestimmte Tonarten und dergl., enthalten,verabreicht werden.Sie können einen erst' im Darm löslichen Überzug haben,damit sie gegenüber der Säure und Verdauungsenzymen des Magens beständiger sind.Zur intravenösen und intramuskulären Verabreichung können sie in Form einer sterilen Lösung,die andere andere gelöste Stoffe, z.B. genügend Salz oder Glukose, enthält, um die Lösung isotonisch zu machen, verwendet werden. Es ist eine Vielzahl von Dosierungsformen möglich.

Der behandelnde Arzt bzw. Tierarzt bestimmt die Dosierung, die wirksam ist. Dies hängt von solchen Faktoren, wie dem Alter und Gewicht des Patienten, dem Grad und dem Ort der Infektion und der gewählten Dosierungsform, ab. Dosierungseinheiten, die etwa 25 bis 250 mg enthalten, sind geeignet.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen ergeben bei Affen-Verozellen, die mit Herpes simplex infiziert wurden, bei einer Konzentration von nur 40 λΜο! eine Inhibierung von etwa 90%. Es ist,selbst bei einer Behandlung mit so hohen Mengen wie etwa 200 /uMol,keine

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Zytotoxizität feststellbar. Vergleichsverbindungen, die als Mittel zur Wirkung gegen den Virus vorgeschlagen worden sind, verbinden nicht diese hohe Wirksamkeit mit niedriger Toxizität. Beispielsweise ist Idoxuridin -wenn es auch eine hohe Wirksamkeit bei relativ geringen Mengen zeigt - fast total zytotoxisch bei einer Konzentration von 50 /uMol.

Es wurden Standardverfahren angewendet, um den Virus und die Verozellen zu erhalten, und zwa-r unter anderem Wachstum und Titration durch Plaqueproben sowie die Reproduktion des Virus in Gegenwart der Testverbindungen. Die Zellen wurden in einem Dulbecco-Medium mit 10^-igem fötalen Kalbsserum gehalten und infiziert.

Zur Untersuchung wurden die Zellen mit dem Virus in einem Verhältnis von etwa 10 Plaque-bildenden Einheiten pro Zelle infiziert. Der Virusimpfstoff wurde nach einstündiger Adsorption bei 37⁰C abgezogen. Ein geeignetes Volumen des die zu untersuchende Verbindung enthaltenden Mediums wurde hinzugefügt. Nach etwa 36 bis 48 Stunden bei 37⁰C wurden die infizierten Zellen gefroren, bis sie zur Titration geeignet waren.

In ähnlichen Untersuchungen wurde dieses Fehlen der Zytotoxizität bei einer Vielzahl von Zellkulturen von Säugetieren, einschließlich solcher von Menschen, Mäusen, Hamstern und Hühnchen, gezeigt.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen 5'-Amino-2',5'-dideoxy-5-joduridin (AIU) und die entsprechende Bromverbindung (ABrU) sowie die pharmazeutisch verwendbaren Salze dieser Verbindungen sind insbesondere zur Behandlung von Herpes simplex keratitis bei Säugetieren und Menschen geeignet.

Zur Zeit umfaßt die allgemein anerkannte Therapie für akute Herpes simplex keratitis die Verwendung von 5-Jod-deoxy-uridin (JdUrd). Obgleich sich der klinische Wert dieser Verbindung

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als gut erwiesen hat, besteht ein Bedarf für eine alternative Antivirentherapie gegen herpesartige Augeninfektionen. Es sind JdUrd-beständige Arten des Herpes simplex-Virus Typ 1 gefunden worden. Außerdem weist die Verbindung eine beträchtliche Zytotoxizität auf. Dies zeigt sich in unerwünschten Nebenwirkungen, wie beispielsweise der Entwicklung von Follikel- und Papillarkonjunktivitis und punktierter Epithelkeratopathie.

Aus diesen und anderen Gründen einschließlich der Teratoenizität von IdUrd, die bei neugeborenen Ratten nach innertherapeutischer Verabreichung gefunden wurden und auch bei tragenden Kaninchen, die das Arzneimittel in ähnlichen Dosen, wie sie zu klinischen Zwecken für Menschen verwendet werden, örtlich in das Auge erhielten, sind Anstrengungen unternommen worden, austauschbare Therapien zu finden.

Ein Vorteil von AIU wurde bei der Behandlung von Kaninchen gefunden. Bei dieser Untersuchung wurden 40 Kaninchen experimentell mit Herpes simplex keratitis zweiseitig infiziert. Diese wurden in 5 sich entsprechende Gruppen von 8 Stück eingeteilt. Jede Gruppe wurde im Doppelblindversuch lokal mit Tropfen in 4-Stundenintervallen während 72 Stunden behandelt, womit 24 Stunden nach der Infektion begonnen wurde. Die verabreichten Lösungen waren;

1- Kochsalz;

2. IdUrd, 1 mg/ml;

3. AIU, 1 mg/ml;

4. AIU, 4 mg/ml;

5. AIU, 8 mg/ml.

Jedes Auge wurde täglich während 14 Tagen untersucht und von zwei Ophthalmologen eingestuft. IdUrd und AIU waren mit einer Dosis von 8 mg/ml therapeutisch am wirksamsten. Obgleich IdUrd die unmittelbarste Wirkung hatte, traten nach Beendigung der Behandlung neue Geschwüre auf. Diese Wirkung wurde mit AIU nicht

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beobachtet. Das AIU in einer Menge von 1 und 4 mg/ml war weniger stark als die konzentrierteren Dosiseinheiten, zeigten aber eine größere Heilkraft als die Vergleichsgruppe.

Im Vergleich zu IdUrd weist AIU eine viel geringere teratologische Wirkung bei säugenden Mäusen auf, als es bei IdUrd der Fall ist. Dies wurde durch eine Untersuchung gezeigt, bei welcher 6 Käfige mit 10 Mäusen (1 bis 2 Tage alt) mit einem Muttertier in jedem Käfig in 5 Gruppen eingeteilt und die Mäuse einmal am Tag während der 5 darauffolgenden Tage, wie unten angegeben, injiziert wurden.

I	PBS	Vergleich
II	AIU	250 mg/kg
III	AIU	450 mg/kg
IV	IdUrd	125 mg/kg
V	IdUrd	250 mg/kg

Die Vergleichstiere wurden mit einer mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung behandelt. Die Gruppen I bis V enthielten 2 Mäuse in jedem Käfig. Aufgrund des "Mutter"-Effekts überlebten nur 14 Mäuse. Diese wurden am 25-sten Tag nach Beginn der Behandlung seziert.

Die Augen wurden herausgenommen und mit 10%-igem Formalin fixiert. Die Mäuse, die mit IdUrd behandelt worden waren, wogen etwa 20 bis 30% weniger als die Vergleichstiere, und ein vermehrtes Wachstum des Fells war festzustellen. Bei visueller Beobachtung wirkten die Mäuse krank. Die mit AIU behandelten Mäuse machten dagegen einen gesunden Eindruck und wogen etwa genausoviel wie die Vergleichstiere.

Bei den mit UdUrd behandelten Mäusen waren Anzeichen von Unterentwicklung der Hornhaut des Auges, des Ziliarkörpers und grauem Star gegeben. Es lag eine deutliche Verminderung der Netzhautweite vor. Die auffallendsten Veränderungen waren in der

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peripheralen Netzhaut:

1. Dünnerwerden und Wellen der äußeren Kernschicht;

2. Verschwinden der äußeren Plexiformschicht;

3. Störung der beiden netzartigen Schichten, zerstreute Kerne der äußeren Kernschicht im Bereich der inneren Kernschicht und

4. Hypoplasie der Stäbchen und Zäpfchen und hauptsächlich peripherale Aplasie der Stäbchen und Zäpfchen wurde beobachtet. Diese Veränderungen waren bei einer Dosierung von 250 mg/kg IdUrd verstärkt und bei 125 mg IdUrd weniger deutlich.

Alle obigen Untersuchungen weisen deutliche Vorteile der erfindungsgemäßen Verbindungen im Vergleich zu den derzeitigen anerkannten therapeutischen Mitteln auf.

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Claims (3)

Patentansprüche

1. Pharmazeutisches Präparat, dadurch gekennzeichnet, daß 5'-Amino-2',5'-dideoxy-5-Joduridin und/oder 5'-Amino-2',5'-dideoxy-5-bromuridin bzw. die pharmazeutisch verwendbaren Säureadditionssalze von diesen zusammen mit einem pharmazeutisch verwendbaren Träger enthält.

2. 5'-Amino-2^I,5'-dideoxy-5-joduridin bzw. die pharmazeutisch verwendbaren Säureadditionssalze von diesem.

3. 5^!-Αΐηίηο-2',5^f-dideoxy~5-bromuridin bzw. die pharmazeutisch verwendbaren Säureadditionssalze von diesem.

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