DE2915254C2

DE2915254C2 -

Info

Publication number: DE2915254C2
Application number: DE2915254A
Authority: DE
Inventors: Albert Stanley Prof. Yardley Birmingham Gb Jones; Richard Thomas Selly Oak Birmingham Gb Walker; Philip Jeffrey Edmonton Alberta Ca Barr; Erik De Prof. Leuven Be Clercq
Original assignee: University of Birmingham
Current assignee: Berlin Chemie AG
Priority date: 1978-04-24
Filing date: 1979-04-14
Publication date: 1990-07-12
Also published as: FR2432526A1; SE7903541L; GB1601020A; BE875773A; JPS642599B2; CA1117108A; NL192793C; IT7909403A0; NL192793B; JPS554364A; CH643273A5; IT1165954B; FR2432526B1; US4424211A; DE2915254A1; NL7903029A; SE445832B

Description

Die Erfindung bezieht sich auf das E-5-(2-Bromvinyl)-2′- desoxyuridin und das E-5-(2-Jodvinyl)-2′-desoxyuridin. Diese chemischen Verbindungen lassen sich durch folgende Strukturformel, worin Hal Brom oder Jod bedeutet, veranschaulichen:

Untersuchungen haben ergeben, daß E-5-(2-Bromvinyl)-2′-desoxyuridin und E-5-(2-Jodvinyl)-2′- desoxyuridin als Arzneimittel insbesondere antivirale Aktivität besitzen, die stark selektiv gegen das Virus Herpes simplex wirkt. Diese Verbindungen haben darüber hinaus eine bemerkenswerte geringe Toxizität, so daß sich ein hoher Antiviral-Index gegen diese Virusart ergibt. Die neuen Verbindungen sind infolgedessen hervorragend brauchbar für die Behandlung von durch das Herpes simplex-Virus verursachte Infektionskrankheiten bei Menschen und Tieren.

Es sind schon andere Desoxyuridin-Derivate mit antiviraler Aktivität bekannt. So konnte beispielsweise für 2′-Desoxy- 5-joduridin (Prusoff und Goz, Handbook of Experimental Pharmacology, Teil II of Antineoplastic and Immunosuppressive Agents, Editors: A. C. Sartorelli und D. G. Johns, Springer- Verlag, New York, 1975, Seiten 272-347) und für 2′-Desoxy- 5-vinyluridin (Cheng et al, Antimicrobical Agents und Chemotherapy, Vol. 10, 1, 119-122 (1976)) antivirale Aktivität ermittelt werden. Allerdings sind die antiviralen Aktivitäten dieser bekannten Verbindungen nicht sehr spezifisch; die Verbindungen wirken gleich gut gegen verschiedene DNS- Viren, wie Vaccinia und Herpes simplex.

Auch ist die Toxizität dieser Verbindungen, speziell die Toxizität von 2′-Desoxy-5-joduridin, unerwünscht hoch. Im Hinblick auf diesen Stand der Technik überraschend wurde nun gefunden, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen E-5-(2-Bromvinyl)-2′-desoxyuridin und E-5-(2-Jodvinyl)-2′- desoxyuridin eine ausgeprägt selektive antivirale Wirkung gegen eine einzige Virus-Art (Herpes simplex) besitzen und daß ihre Toxizität (in Zellkultur) außerordentlich niedrig ist.

Ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen E-5-(2-Halogenvinyl)- 2′-desoxyuridine ergibt sich in der Weise, daß man ein geschützte Hydroxygruppen aufweisendes reaktives 2-Desoxy-D-erythro-pentofuranosyl-Derivat mit einem Bis- (trialkyl)-silyl-Derivat von E-5-(2-Halogenvinyl)-uracil umsetzt und danach die Trialkylsilylgruppen und die Schutzgruppen an den Hydroxylgruppen entfernt.

Die Erfindung umfaßt weiterhin Arzneimittel, insbesondere für die Behandlung von durch das Virus Herpes simplex verursachte Infektionskrankheiten, die E-5-(2-Bromvinyl)-2′- desoxyuridin oder E-5-(2-Jodvinyl)-2′-desoxyuridin als Wirkstoff enthalten. Zur Fertigung dieses erfindungsgemäßen Arzneimittels wird E-5-(2-Bromvinyl)-2′-desoxyuridin oder E-5-(2-Jodvinyl)-2′-desoxyuridin mit für die anwendungsfertige Darreichungsform üblichen Zusatzstoffen konfektioniert.

Es wird nachstehend die chemische Darstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen näher beschrieben.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform für die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen werden eine geschützte Hydroxylgruppen aufweisende reaktive 2-Desoxy-D-erythro-pentofuranosyl-Verbindung der Formel (II) und eine Bis-(trialkyl)-silyl-Verbindung eines E-5-(2-Halogenvinyl)-uracils der Formel (III) miteinander kondensiert, und von der resultierenden Molekülverbindung werden die Trialkylsilylgruppen und die Schutzgruppen an den Hydroxylgruppen entfernt.

In diesen Formeln bedeuten R einen Alkylrest, vorzugsweise Methyl-; R¹ einen leicht austauschbaren Rest, vorzugsweise entweder Methoxy- (wenn es sich bei der Verbindung (II) um ein Gemisch von α- und β-Anomeren handelt) oder Chlor- (wenn es sich bei der Verbindung (II) um das α-Anomer handelt); R² und R³ die Hydroxylgruppe schützende Reste, vorzugsweise p-Toluoyl-; und Hal ein Brom- oder Jodatom.

Wenn die Verbindung (II) mit Chlor als R¹-Rest verwendet wird, kann man als Katalysator eine Lewis-Säure verwenden, notwendig ist dies jedoch nicht. Falls eine Verbindung (II) mit dem Methoxy-Rest R¹ eingesetzt wird, ist ein Lewis- Säure-Katalysator erforderlich. Geeignete Lewis-Säure- Katalysatoren sind beispielsweise Molekularsiebe, Zinn(IV)- und Quecksilber(II)-Halogenide, zum Beispiel die Chloride und Bromide, sowie Trimethylsilylperfluoralkylsulfonate.

Die Menge an eingesetztem Katalysator hängt von dem speziell gewählten Katalysator ab. Wenn man Quecksilberhalogenide benutzt, erhält man häufig beste Ergebnisse mit geringen Mengen, beispielsweise weniger als ein Zehntel molare Verhältnismengen, vorzugsweise mit einer Hundertstel molaren Verhältnismenge.

Für guten Verlauf der Reaktion ist die Auswahl des Lösungsmittels nicht wesentlich; es ist allerdings erforderlich, daß das eingesetzte Lösungsmittel inert ist gegenüber den Ausgangssubstanzen und den Produkten, und bevorzugt sollte ein solches Lösungsmittel verwendet werden, das sowohl die beiden Ausgangsverbindungen (II) und (III) als auch, sofern vorhanden, den Katalysator in einer ausreichenden Menge löst. Um sicher zu gehen, daß die Lösungsmittel gegenüber der Verbindung (III) inert sind, sollten sie möglichst stark getrocknet werden. Beispiele für geeignete Lösungsmittel sind Acetonitril, flüssige aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol und Toluol, und halogenierte Alkane, wie beispielsweise Dichlormethan, 1,2-Dichlorethan und Tetrachlorkohlenstoff.

Die Temperatur, bei der die Reaktion durchgeführt wird, ist unkritisch; da sich jedoch die Zuckerderivate (II) bei höheren Temperaturen leicht zersetzen, ist es vorteilhafter, die Reaktion bei Zimmertemperatur oder darunter liegenden Temperaturen vorzunehmen.

Die Reaktion sollte in trockener Atmosphäre stattfinden, um der Hydrolyse der Trialkylsilyl-Verbindung durch Luftfeuchtigkeitt vorzubeugen.

Die Zeitdauer für die Reaktion hängt von dem speziell eingesetzten Katalysator und dem verwendeten Lösungsmittel ab. Man kann den Ablauf der Reaktion durch Dünnschichtchromatographie verfolgen, und man läßt die Reaktion solange vonstatten gehen, bis das Maximum an Produktausbeute erreicht ist. Danach wird das Reaktionsgemisch zu einem Rohprodukt aufgearbeitet, das anschließend durch Kristallisation oder Chromatographie gereinigt wird.

Die Schutzgruppen können nach bekannten Standard-Methoden entfernt werden; man spaltet beispielsweise die Trialkylsilylgruppen und die die Hydroxylgruppen schützenden Reste durch Hydrolyse oder Alkoholyse ab. Bei der beschriebenen Arbeitsweise entsteht gewöhnlich ein Gemisch aus α- und β-Anomeren in einem anteiligen Verhältnis, das auch von dem Katalysator abhängt.

Es ist gewöhnlich zweckmäßig, das b-Anomer, d. i. die gewünschte Form der E-5-(2-Halogenvinyl)-2′-desoxyuridin, aus dem Gemisch der Anomeren abzutrennen. Man kann die β-Anomeren aus dem gereinigten Anomeren-Gemisch abscheiden und führt im allgemeinen zweckmäßig diese Abtrennung aus, bevor die an den Hydroxylgruppen ansitzenden Schutzgruppen entfernt werden.

Diese Abtrennung aus dem Anomeren-Gemisch kann durch fraktionierte Kristallisation und/oder Chromatographie an Silicagel vorgenommen werden. Das spezielle Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, das für diese Trennvorgänge eingesetzt wird, hängt davon ab, welche spezielle Schutzgruppe an den Hydroxylgruppen vorhanden ist (sofern die Hydroxyl-Schutzgruppen noch vorhanden sind). Im Einzelfall kann man beispielsweise durch Vorversuche auf Dünnschichtchromatographie-Platten die geeigneten Lösungsmittelgemische ermitteln. Die abgetrennten Anomeren kann man bei diesen Versuchen mittels NMR-Spektroskopie charakterisieren.

Wenn als R²- und R³-Schutzgruppen die bevorzugten p-Toluoyl- Reste vorhanden sind, so arbeitet man, wenn man das reine geschützte β-Anomer zu erhalten wünscht, vorzugsweise so, daß man zunächst das rohe Reaktionsprodukt unter Verwendung von Benzol : Ethylacetat als Eluierungsmittel an Silicagel chromatographiert und so ein gereinigtes Anomeren-Gemisch gewinnt und dann anschließend aus Methanol kristallisiert. Das reine geschützte β-Anomer kristallisiert aus dieser Lösung bevorzugt aus. Es kann dann anschließend zu dem E-5-(2-Halogenvinyl)-2′-desoxyuridin hydrolysiert werden.

Die Ausgangsmaterialien für die Verbindung der Formel (II) sind früher bereits beschrieben worden. Man kann ausgehen von 2-Desoxy-D-erythro-pentofuranose, diese an der 1-Hydroxylgruppe methylieren, die Schutzgruppen für die Hydroxylgruppen in 3- und 5-Stellung einbauen und, falls erforderlich, die 1-Methoxygruppe durch Chlor ersetzen (vergleiche zum Beispiel C. C. Bath, in Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry, von Tipson R. S., und Zorbach W. W. eds., Interscience, Vol. 1 521-522 (1968).

Bei der Ausgangsverbindung der Formel (III) handelt es sich um eine neue chemische Verbindung.

Verbindungen der Formel (III) können durch Umsetzung eines E-5-(2-Halogenvinyl)-uracils mit einem Silylierungsmittel, wie beispielsweise Hexamethyldisilazan oder Trimethylchlorsilan oder Gemischen dieser Silylierungsmittel hergestellt werden.

Aus der Publikation von R. C. Bleackley, A. S. Jones und R. T. Walker in Tetrahedron, Band 32 (1976), Seite 2795 ff, ist die Herstellung von E-5-(2-Bromvinyl)uracil und 5-Vinyluracil beschrieben, die als Vorstufen für die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen dienen. Die von einem der Erfinder mitpublizierte Druckschrift lehrt allerdings weder die Herstellung von E-5-(2-Jodvinyl)uracil noch die Umsetzung der E-5-(2-Halogenvinyl)uracile zu den entsprechenden Trimethylsilyl- geschützten Verbindungen und noch weniger deren Umsetzung mit einem geschützten speziellen Zucker zu den Verbindungen der vorliegenden Erfindung.

Aus der Publikation von J. Perman, R. A. Sharma und M. Bobek in Tetrahedron Letters 1976, Seite 2427 ff ist die Herstellung von 5-Ethinyl-2′-desoxyuridin beschrieben, von dem die Autoren hoffen, daß es analog zu ähnlichen Systemen auch eine antivirale Wirkung gegenüber Herpes simplex Viren I und II hat. Ausgangspunkt für diese Verbindung ist das 5-Formyluracil, das über eine Witting-Reaktion mit nachfolgender Silyletherbildung, Kondensation mit einem geschützten Zucker, Abspaltung der Schutzgruppen, nochmalige Silylierung und Umsetzung mit Phenyllithium in das 5-Ethinyl-2′-desoxyuridin umgesetzt wird. Die Gesamtausbeute dieser sechstufigen Synthese zu einem Stoff mit "antiviralen" Eigenschaften beträgt 5,8% der Theorie.

In den nachstehenden Beispielen sind die chemische Synthese und physikalische Konstanten des Endprodukts sowie die Herstellung von Ausgangsverbindungen der Formel (III) näher erläutert.

Beispiel 1 Herstellung von E-5-(2-Bromvinyl)-uracil

5-Vinyluracil (2,75 g, 20 mMol) wurde in trockenem Dimethylformamid (250 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurde eine Lösung von Brom (3,2 g, 20 mMol) in trockenem Dimethylformamid (30 ml) hinzu gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde geschüttelt, bis es farblos war, und dann 1 Stunde lang bei 100°C erhitzt. Danach wurde die Lösung unter vermindertem Druck zu einem braunen Öl eingedampft. Dem Öl wurde Wasser (30 ml) zugesetzt. Die resultierende rosa gefärbte Suspension wurde filtriert, und der schwach rosa gefärbte feste Rückstand ergab, aus Methanol umkristallisiert, E-5-(2-Bromvinyl)-uracil (3,62 g, Ausbeute 84%).
NMR: ε (d₆DMSO): 11,2 (2-H, bd, N-H's), 7,7 (1-H, d, H-6, J=6 Hz) 7,3 (1-H, E-(trans)vinylisches H-2′, J=13 Hz), 6,8 ppm (1-H, E-(trans)vinylisches H-1′, J=13 Hz).
UV: λmax 290 nm (ε, 9,930), 251 nm (ε, 17,500), λmin 275 nm (ε, 8,280) bei pH-1, gmax 305 (ε, 11,400), 267 nm (ε, 15,400), λmin 290 nm (ε, 10,500) bei pH-13.

Herstellung von E-5-(2-Bromvinyl)-3′,5′-di-O-p-toluoyl-2′- desoxyuridin und dessen α-Anomer

E-5-(2-Bromvinyl)-uracil (3,62 g, 16,7 mMol) wurde in Hexamethyldisilazan (15 ml) suspendiert, und es wurde Trimethylsilylchlorid (0,1 ml) zugegeben. Die Suspension wurde 1 Stunde lang unter Rückfluß am Sieden gehalten. Dabei bildete sich eine klare Lösung. Überschüssiges Lösungsmittel wurde bei 120-130°C unter Hochvakuum in einem Kugelrohrofen destilliert. Dabei wurde die bistrimethylsilylierte Verbindung als farbloses Öl erhalten (5,04 g, Ausbeute 84%).
NMR: δ (CCl₄): 8,05 (1-H, s, H-6), 6,83 (2-H, s, vinylische H's), 0,38, 0,30 ppm (18H, 2s, Me₃Si- an -2-O- und 4-O-) (Me₄Si externer Standard).

Das bistrimethylsilylierte E-5-(2-Bromvinyl)-uracil (5,04 g, 14 mMol) wurde in trockenem Dichlorethan (50 ml) gelöst, und es wurde eine Lösung von 1-Chlor-2-desoxy-3,5-di-O- p-toluoyl-a-D-erythro-pentofuranose (4,0 g, 12,6 mMol) in trockenem Dichlorethan (50 ml) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 8 Stunden lang bei 22°C mit einem Magnetrührer gerührt und dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Das resultierende Öl wurde auf eine Silicagel- Säule aufgegeben, und unter Verwendung von Benzol-Ethylacetat (7 : 3) als Laufmittel wurde das Nucleosid-Produkt in einer Gesamtausbeute von 5,3 g (88%) gewonnen.

Die NMR-spektroskopische Untersuchung ergab, daß das Verhältnis der Anomeren 1,3 : 1, α : β, betrug. Anschließende Säulenchromatographie-Behandlung mit Chloroform/Propan-2-ol (99 : 1) ergab eine stärkere Auftrennung der Anomeren. Das weiter laufende Nucleosid wurde aus Methanol umkristallisiert, und man erhielt das β-Anomer in Form von farblosen Kristallen.
NMR: δ (CDCl₃): 8,28 (1-H, s, N-H), 7,94 (4-H, d, aromatische H's), 7,41 (1-H, s, H-6), 7,26 (5-H, m, aromatische H's und E-vinylisches H-2′′), 6,40 (1-H, t, H-1′), 6,08 (1-H, d, E-vinylisches H-1′′, J=13 Hz), 5,62 (1-H, d, H-3′), 4,72 (2-H, dd, H-5′), 4,54 (1-H, m, H-4′), 2,7 (2-H, bm, H-2′), 2,42 ppm (6-H, s, CH₃′s).
UV: max 244 nm (ε, 37,400), 286 nm (sh) (ε, 8,550) in Ethanol.
Schmp. 186-188° (Zers.).

Das α-Anomer fiel beim Umkristallisieren aus Methanol in Form von weißen Nadeln an.

Herstellung von E-5-(2-Bromvinyl)-2′-desoxyuridin

In einer Lösung von Natriummethoxid in Methanol (15 ml, 0,1 M) wurde E-5-(2-Bromvinyl)-2′-desoxy-3′,5′-di-O-p-toluoyluridin (0,924 g, 1,6 mMol) gelöst, und man ließ das Gemisch 24 Stunden lang bei 22° stehen. Durch vorsichtige Zugabe von Ionenaustauscherharz (H + Form) (Dowex®50) wurde die Lösung auf pH 6 neutralisiert und anschließend zu einem weißen Feststoff eingedampft. Die feste Masse wurde mit Äther (3×10 ml) verrieben, und nach Trocknen im Vakuum wurde rohes E-5-(2-Bromvinyl)-2′-desoxyuridin (508 mg, Ausbeute 94%) erhalten. Das Rohprodukt wurde aus Methanol-Wasser umkristallisiert, und es wurden weiße Nadeln mit einem Schmelzpunkt von 123-125°C (Z.) erhalten.
NMR: δ (d₆DMSO): 11,24 (1=H, s, N-H), 8,08 (1-H, s, H-6), 7,24 (1-H, d, E-vinylisches H-2′′), 6,81 (1-H, d, E-vinylisches H-1′′, J=13 Hz), 6,10 (1-H, t, H-1), 5,18 (1-H, d, OH-3′), 5,02 (1-H, t, OH-5′), 4,22 (1-H, m, H-3′), 3,78 (1-H, m, H-4′), 3,58 (2-H, m, H-5), 2,12 ppm (2-H, m, H-2′).
UV: λmax 253 nm (ε, 13,100), 295 nm (ε, 10,300), λmin 274 nm (7,500) in Ethanol.

Das a-Anomer ließ sich in analoger Weise freisetzen.

Beispiel 2 Herstellung von E-5-(2-Jodvinyl)-uracil

In trockenem Dimethylformamid (40 ml) wurde 5-Vinyluracil (1,1 g, 8 mMol) gelöst. Dieser Lösung wurde eine Lösung von Jodmonochlorid (1,28 g, 8 mMol) in trockenem Dimethylformamid (20 ml) zugesetzt. Man ließ das Reaktionsgemisch unter gelegentlichem Schütteln 30 Minuten lang stehen und erhitzte dann 30 Minuten lang auf 100°C. Anschließend wurde die Lösung unter vermindertem Druck eingedampft. Es wurde ein braunes Öl erhalten, dem Wasser (20 ml) zugesetzt wurde. Die resultierende dunkelbraune Suspension wurde filtriert. Der braune Feststoff wurde gesammelt und getrocknet, und man erhielt rohes E-5-(2-Jodvinyl)-uracil (1,6 g, Ausbeute 76%). Dieses Produkt wurde ohne weitere Reinigung in der folgenden Verfahrensstufe eingesetzt.
NMR: δ (d₆DMSO): 11,1 (2-H, bd, N-H′s), 7,7 (1-H, d, H-6, J=6 Hz), 7,2 ppm (2-H's, vinylische H's)
UV: λmax 294 nm (ε, 9,900), 250 nm (ε, 15,200), λmin 278 nm (ε, 9,250) bei pH-1, λmax 310 nm (ε, 12,200), λmax 262 nm (ε, 15,850), λmin 290 nm (ε, 10,050) bei pH-13.

Herstellung von E-5-(2-Jodvinyl)-3′,5′-di-O-p-toluoyl-2′- desoxyuridin und dessen α-Anomer

E-5-(2-Jodvinyl)-uracil (1 g, 3,8 mMol), wurde in Hexamethyldisilazan (8 ml) suspendiert, und es wurde Trimethylsilylchlorid (0,1 ml) zugesetzt. Man ließ die Suspension 1 Stunde lang unter Rückfluß sieden; dabei bildete sich eine klare Lösung. Überschüssiges Lösungsmittel wurde im Hochvakuum entfernt, und der ölige Rückstand wurde bei 130-160°C im Hochvakuum in einem Kugelrohrofen destilliert. Dabei wurde das bistrimethylsilylierte Derivat in Form eines gelben Öls gewonnen (554 mg, Ausbeute 36%).
NMR: δ (CCl₄): 8,0 (1-H, s, H-6), 7,2 (1-H, d, E-(trans)vinylisches H-2′, J=15 Hz), 6,8 (1-H, d, E-(trans)vinylisches H-1′, J=15 Hz), 0,4, 0,3 ppm (18-H, 2s, Me₃Si- an 2-O- und 4-O-).

Die vinylischen Kopplungskonstanten von 15 Hz zeigten, daß die Konfiguration um die Doppelbindung die E-Konfiguration war.

Die Kondensation der bistrimethysilylierten Verbindung mit 1-Chlor-2-desoxy-3,5-di-O-p-toluoyl-α-D-erythro-pentofuranose wurde in gleicher Weise wie zuvor im Zusammenhang mit der 5-(2-Bromvinyl)-Verbindung beschrieben, vorgenommen. Durch Säulenchromatographie mit Benzol-Ethylacetat (8 : 2 als Laufmittel wurde die α- und β-Anomeren voneinander getrennt. Das tiefer fließende Nucleosid wurde aus Methanol umkristallisiert, und man erhielt das β-Anomer in Form von farblosen Kristallen.
NMR: δ (CDCl₃): 8,5 (1-H, bs, N-H), 6,45 ppm (2-H, m, H-1′ und E-(trans)vinylisches H-1′′).
UV: λmax 242 nm (ε, 33,950), λmax 295 nm (ε, 9,650), λmin 272 nm (ε, 7,850) in Ethanol.

Das α-Anomer wurde aus Methanol umkristallisiert und fiel in Form von weißen Nadeln an.

Herstellung von E-5-(2-Jodvinyl)-2′-desoxyuridin

In einer Lösung von Natriummethoxid in trocknem Methanol (3 ml, 0,1 M) wurde E-5-(2-Jodvinyl)-2′-desoxy-3′,5′-di- O-p-toluoyl-uridin (84 mg, 0,14 mMol) gelöst, und man ließ das Gemisch 5 Stunden lang bei 22°C stehen. Die Lösung wurde durch vorsichtige Zugabe von Ionenaustauscherharz (H + Form) (Dowex®50) auf pH 6 neutralisiert und dann eingedampft, und es wurde ein gelbes Öl erhalten. Dieses wurde mit Methanol versetzt und erneut eingedampft, und man erhielt in Form von fahlgelbem Feststoff rohes E-5-(2-Jodvinyl)- 2′-desoxyuridin (22 mg, Ausbeute 42%).
NMR: δ (d₆DMSO): 11,6 (1-H, bs, N-H), 8,08 (1-H, s, H-6), 7,17 (2-H, s, vinylische H's), 6,14 ppm (1-H, H-1′, J=6 Hz).
UV: gmax 250 nm (ε, 14,100), λmax 295 nm (ε, 11,450), λmin 275 nm (ε, 8,450) in Ethanol.

In gleicher Weise ließ sich das α-Anomer freisetzen.

Nachfolgend wird über eine Reihe von biologischen Tests berichtet, die die spezielle antivirale Wirkung und den hohen Antiviral-Index erfindungsgemäßer Verbindungen veranschaulichen.

In diesen Tests wurde der Effekt von E-5-(2-Halogenvinyl)- 2′-desoxyuridinen und verwandten Verbindungen auf Wachstum und Ausbeute von Viren in Zellkulturen untersucht.

Die folgenden Verbindungen wurden geprüft: 2-Desoxy-5-vinyl- uridin (hergestellt nach der Vorschrift von Bobek et al: J. Org. Chem. 40, 2377-2379 (1975); 5-(1-Chlorvinyl)-2′-desoxyuridin (wie üblich hergestellt); E-5-(2-Bromvinyl)-2′- desoxyuridin (hergestellt gemäß vorstehendem Beispiel 1); E-5-(2-Jodvinyl)-2′-desoxyuridin (hergestellt gemäß vorstehendem Beispiel 2); 2-Desoxy-5-ethynyluridin (hergestellt nach der Vorschrift von Bobek et al: Tetrahedron Letters, 28, 2427-2430, (1976); und 2-Desoxy-5-joduridin. Sofern nichts anderes gesagt ist, handelte es sich bei allen Verbindungen um die β-Anomeren.

5-(1-Chlorvinyl)-2′-desoxyuridin wurde durch Einwirkung von HCl auf 2′-desoxy-5-ethynyluridin gewonnen. Die physikalischen Konstanten dieser Verbindungen waren die folgenden:
Schmp. 108-110°C (Z.).
NMR: δ (d₆DMSO): 11,2 (1-H, bs, N-H), 8,37 (1-H, s, H-6), 6,43 (1-H, s, vinylisches H, trans zum heterocyclischen Ring), 6,18 (1-H, t, H-1′), 5,54 (1-H, s, vinylisches H, cis zum heterocyclischen Ring), 5,1 (2-H, bs, O-H), 4,25 (1-H, m, H-3′), 3,86 (1-H, m, H-4′), 3,70 (2-H, m, H-5′), 2,17 ppm (2-H, m, H-2′).
UV: λmax 234 nm (ε, 9,370), 282 nm (ε, 10,500), λmin 259 nm (ε, 6,550) bei pH 6.

Die Verbindungen wurden an dem Virus Vaccinia und an dem Virus Herpes simplex-1 (Stamm KOS) getestet. Diese Viren wurden in primären Kaninchennierenzellkulturen (PRK) und in menschlichen Fibroblasten (HSF) gezüchtet.

Für die Auswertung der Virus-Entwicklung in den Zellkulturen wurde die von De Clercq et al in Biochem. Pharmacol., 24, 523-527 (1975), beschriebene Technik verwendet.

Test 1

In diesem Test wurde die Inhibierungsaktivität von E-5-(2-Halogenvinyl)-2′-desoxyuridinen und verwandten Verbindungen auf in PRK und HSF Zellkulturen vorhandene Vaccinia- und Herpes simplex-1-Viren untersucht. Man ließ die Zellen in entweder flaschenförmigen Kulturgefäßen (PRK) oder auf Mikroplatten aus Kunststoff (HSF) solange wachsen, bis sie sich gegenseitig berührten. Die konfluierten Zellen wurden mit 100 CCID₅₀ entweder des Virus Vaccinia oder des Virus Herpes simplex-1 beimpft. Ein CCID₅₀ entspricht der Zellkultur-Infektionsdosis-50, das ist diejenige Menge an Virus, die zur Infektion zu 50% der Zellen in der Zellkultur erforderlich ist. Eine Stunde nach der Infektion mit dem Virus wurden die Verbindungen in verschiedenen Konzentrationen (im Bereich von 0,001 µg/ml bis 100 µg/ml) zugesetzt. Für jedes Virus-Zellsystem wurde die ID₅₀ bestimmt. Die ID₅₀ entspricht der inhibierenden Dosis-50, das ist diejenige Konzentration an Verbindung, die erforderlich ist, um den durch das Virus verursachte zytopatogenen Effekt um 50% zu unterdrücken. Der zytopathogene Effekt (CPE) wurde gemessen, sobald er in den mit dem unbehandelten Virus infizierten Zellkulturen vollständig abgelaufen war (im allgemeinen 3 Tage, nachdem die Zellen mit dem Virus infiziert worden waren). Die Ergebnisse sind in Tabelle I veranschaulicht; die angegebenen Daten sind Durchschnittswerte aus drei getrennt durchgeführten Experimenten.

Tabelle 1

Antivirale Aktivität von E-5-(2-Halogenvinyl)-2′-desoxyuridinen und verwandten 2′-Desoxyuridin-Analogen in primären Kaninchennierenzellkulturen (PRK) und menschlichen Hautfibroblastkulturen (HSF)

Test 2

Es wurde der Inhibierungseffekt von E-5-(2-Bromvinyl)-2′- desoxyuridin und verwandten Verbindungen auf die Vermehrung des Virus Herpes simplex-1 in PRK-Zellkulturen untersucht. In Petrischalen aus Kunststoff (Durchmesser: 55 mm) konfluierte einschichtige PRK Zellrasen wurden mit dem Virus Herpes simplex-1 (4,5 log-₁₀ PFU/0,5 ml/Petrischale) 1 Stunde lang bei 37°C bebrütet und unmittelbar danach der Einwirkung von 0,1 µg/ml einer der zu untersuchenden Verbindungen unterworfen. Danach wurden die Zellkulturen über unterschiedliche Zeitspannen (1, 2 oder 3 Tage lang) bei 37°C bebrütet. Nachdem die Züchtung beendet war, wurden die Zellen bei -70° eingefroren, und die Zellen-Homogenisate wurden durch Pocken- (Plaque-) Bildung in VERO Zellkulturen (VERO = eine kontinuierliche Zellreihe von Affenzellen) auf Virusgehalt untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 veranschaulicht. Die Werte gegen die Differenzen der Virus-Ausbeute zwischen den behandelten-Virus infizierten Zellkulturen und den unbehandelten-Virus infizierten Zellkulturen an. PFU bedeutet Pocken-(Plaque-) Bindungs-Einheiten.

Tabelle 2

Inhibierungseffekt von E-5-(2-Bromvinyl)-2′-desoxyuridin und verwandten 2′-Desoxyuridin-Analogen auf die Vermehrung von Virus Herpes simplex-1 (Stamm KOS) in primären Kaninchennierenzellkulturen (PRK)

Test 3

Es wurde die antimetabolische Aktivität von E-5-(2-Bromvinyl)- 2′-desoxyuridin und verwandten Verbindungen in PRK Zellkulturen untersucht.

a) in einem ersten Experiment wurde der Einbau bestimmter radiomarkierter DNS-Precursoren in Zellen-DNS und der Effekt von 5-(2-Bromvinyl)-2′-desoxyuridin und verwandter Verbindungen darauf getestet. Es wurde dabei die von De Clercq et al. in Biochemical Pharmacology, 26, 794-797 (1977) und von De Clercq et al. in Molecular Pharmacology, 14, 422-430, (1978), beschriebene Methode angewendet.

Als DNS-Precursoren wurden (Methyl-³H) (2′-desoxythymidin) (TdR) und (2-¹⁴C) (2′-desoxyuridin) (UdR) benutzt.

In Anwesenheit verschiedener Konzentrationen der Verbindungen (im Bereich von 1 bis 100 µg/ml) wurden die Zellen 16 Stunden lang entweder 0,12 µCi : 0,01 nMol (Methyl-³H) TdR (je 10⁵ Zellen) oder 14 µCi/250 nMol (2-¹⁴C) UdR (je 10⁵ Zellen) ausgesetzt. Danach wurde wie beschrieben der Einbau des radiomarkierten Precursors gemessen, und es wurde die ID₅₀ bestimmt. Unter dem ID₅₀-Wert versteht man die Inhibierungsdosis- 50, das ist die Konzentration an Verbindung, die erforderlich ist, um den Einbau von entweder (Methyl- ³H) TdR oder (2-¹⁴C) UdR zu 50% zu inhibieren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben.

b) In einem zweiten Experiment wurde die Gesamt-Zellzahl nach der Behandlung mit E-5-(2-Bromvinyl)-2′-desoxyuridin und verwandten Verbindungen bestimmt. In Anwesenheit von unterschiedlichen Konzentrationen der Verbindungen (im Bereich von 0,01 bis 100 µg/ml) wurden die Zellen auf Kunststoff-Petrischalen (Durchmesser: 55 mm) in einer Menge von annähernd 800.000 Zellen/Petrischale ausgestrichen. Nach dreitägiger Inkubationszeit bei 37° (in Anwesenheitt von 5% CO₂) wurde das Zellkulturmedium entfernt, die Zellen wurden in eine Suspension mit Trypsin eingebracht und mittels einer Zähleinrichtung (coulter counter model ZB) ausgezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 veranschaulicht. Der ID₅₀-Wert gibt die Inhibierungsdosis- 50 an, das ist die Konzentration an Verbindung, die erforderlich ist, um die Gesamt-Zellzahl um 50% zu vermindern.

Tabelle 3

Antimetabolische Aktivität von E-5-(2-Bromvinyl)-2′-desoxyuridin, E-5-(2-Jodvinyl)-2′-desoxyuridin und verwandter 2′-Desoxyuridin-Verbindungen in primären Kaninchennierenzellkulturen (PRK)

Test 4

Bei der letzten Prüfung wurde der Antiviral-Index von 5-(2-Bromvinyl)-2′-desoxyuridin und dessen verwandten Verbindungen in PRK Zellkulturen als Ergebnis der in den vorstehend beschriebenen Tests durchgeführten Bestimmungen ermittelt.

Der Antiviral-Index wurde durch Division des "antimetabolischen" ID₅₀-Wertes durch den "antiviralen" ID₅₀-Wert berechnet. Der "antimetabolische" ID₅₀-Wert war die Dosis, die zur Verminderung der Zellzahl um 50% erforderlich war; der "antivirale" ID₅₀-Wert war die Dosis, die zur Inhibierung des zytopathogenen Effektes von Herpes simplex-1 um 50% erforderlich war. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengestellt.

Tabelle 4

Antiviral-Index von E-5-(2-Bromvinyl)-2′-desoxyuridin und verwandten 2′-Desoxyuridin-Verbindungen des Standes der Technik in primären Kaninchennierenzellkulturen (PRK)

Aus den vorstehenden Test-Ergebnissen ist ersichtlich, daß E-5-(2-Bromvinyl)-2′-desoxyuridin und E-5-(2-Jodvinyl)- 2′-desoxyuridin eine andere Wirkung haben als die damit verwandten Verbindungen; sie haben eine spezifische antivirale Aktivität und einen beachtlich hohen Antiviral-Index gegen das Virus Herpes simplex, der insbesondere für E-5-(2-Bromvinyl)-2′-desoxyuridin auffallend hoch ist. Sie lassen sich vorteilhaft für die Behandlung von durch dieses Virus bei Menschen und Tieren verursachte Infektionskrankheiten verwenden.

Arzneimittel-Zusammensetzungen, die E-5-(2-Bromvinyl)-2′- desoxyuridin oder E-5-(2-Jodvinyl)-2′-desoxyuridin als aktiven Wirkstoff enthalten, können in Form von Pulver, Puder, Suspensionen, Lösungen, Emulsionen oder auch als Salben und Pasten konfektioniert werden und parenteral (intravenös, intradermal, intramuskulär, intrathekal . . .) injiziert, oral, rektal, intravaginal und intranasal verabreicht oder örtlich appliziert (zum Beispiel auf Wunden in der Haut, der Schleimheit und an den Augen) werden. Diese Arzneimittel-Zusammensetzungen lassen sich, wie dies für solche Zwecke üblich ist, durch Kombination des oder der aktiven Wirkstoffe mit pharmazeutisch verträglichen Zusatzstoffen formulieren. Solche Zusatzstoffe können wäßrige oder nicht-wäßrige Lösungsmittel, Stabilisatoren, Suspensions-, Dispersions- und Benetzungsmittel und dergleichen dem Fachmann bekannte Exzipienten sein. Solche Arzneimittel können auch beliebig geeignete Additive, wie Polyethylenglykole und gewünschten- oder erforderlichenfalls Farbstoffe, Parfüms oder dergleichen Beigaben enthalten.

Arzneimittel-Zusammensetzungen haben gewöhnlich einen Gehalt von mindestens 0,1 Gew.-%/Volumen an aktivem Wirkstoff. Die tatsächliche Konzentration hängt ab von der zu behandelnden Krankheit und gewählten Verabreichungsart. Im allgemeinen liegt diese Konzentration zwischen 0,1% und 100%.

Claims

1. E-5-(2-Bromvinyl)-2′-desoxyuridin.

2. E-5-(2-Jodvinyl)-2′-desoxyuridin.

3. Arzneimittel enthaltend als Wirkstoff eine Verbindung der Ansprüche 1 oder 2 zusammen mit für die anwendungsfertige Darreichungsform üblichen Zusatzstoffen.

4. Arzneimittel gemäß Anspruch 3 zur Behandlung von durch Herpes simplex-Viren verursachte Infektionen.