DE2915254A1

DE2915254A1 - Neue chemische verbindungen, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung als arzneimittel mit antiviraler wirkung

Info

Publication number: DE2915254A1
Application number: DE19792915254
Authority: DE
Inventors: @@ Barr Philip Jeffrey; @@ De Clerco Erik Prof; Albert Stanley Prof Jones; Richard Thomas Walker
Original assignee: Stichting Rega VZW; University of Birmingham
Current assignee: Berlin Chemie AG
Priority date: 1978-04-24
Filing date: 1979-04-14
Publication date: 1979-11-15
Also published as: SE7903541L; CH643273A5; NL7903029A; IT1165954B; BE875773A; GB1601020A; FR2432526A1; NL192793C; FR2432526B1; JPS642599B2; DE2915254C2; JPS554364A; NL192793B; SE445832B; US4424211A; CA1117108A; IT7909403A0

Description

Neue chemische Verbindungen, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittel mit antiviraler Wirkung

Die Erfindung bezieht sich auf neue chemische Verbindungen
und deren Herstellung, die sich als Wirkstoffe in Arzneimitteln, insbesondere für die Behandlung von Virus-Infektionen verwenden lassen, und umfaßt auch Verbindungen, die
als Zwischenprodukte bei der chemischen Synthese dieser
neuen Wirkstoffe brauchbar sind.

Gegenstand der Erfindung sind 2 '-Desoxy-5- (2-halogenvinyl) uridine, speziell E-5-(2-Halogenvinyl)-l-(2'-desoxy-ß-D-ery thro-pentof uranosy 1) -1,2,3,4-tetrahydropyrind din-2,4-di one, insbesondere das E-5- (2-Bromvinyl) -2 '-desoxyuridin und das
E-5- (2-Jodvinyl) -2 · -desoxyuridin. Diese neuen chemischen
Verbindungen lassen sich durch folgende Strukturformel,
worin Hai vorzugsweise Brom oder Jod bedeutet, veranschau-Ii chen:

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er ^n

(I)

Ein vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung dieser neuen Verbindungen ist dadurch gekennzeichnet, daß man ein 2-Desoxy-D-erythro-pentofuranosyl-Derivat, dessen Hydroxylgruppen geschützt sind, mit einem Di s-(tri alkyl)-si lyl-Deri vat des entsprechenden E-5-(2-Halogenvinyl)-uraciIs , wie des E-5-(2-Bromvinyl)-uraciIs oder des E-5-(2-Jodvinyl) uracils kondensiert und dann die Tri alkylsi lylgruppen und die Schutzgruppen an den HydroxylgruDpen entfernt.

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Untersuchungen haben ergeben, daß diese neuen Verbindungen, insbesondere das E-5- (2-Bromvinyl) -2 ' -desoxyuridin und das E-5-(2-Jodvinyl)-2'-desoxYuridin antivirale Aktivität besitzen, die stark selektiv gegen das Virus Herpes simplex wirkt. Diese Verbindungen haben darüber hinaus eine bemerkenswert geringe Toxizität, so daß sich ein hoher Anti vi ral-Index gegen diese Virusart ergibt. Die neuen Verbindungen sind infolge dessen hervorragend brauchbar für die Behandlung von durch das Herpes simplex - Virus verursachte Infektionskrankheiten bei Menschen und Tieren.

Es sind schon andere Desoxyuridin-Derivate mit antlviraler Aktivität bekannt. So konnte beispielsweise für 2'-Desoxy-5-joduridin (Prusoff und Goz, Handbook of Experimental Pharmacology, Teil II of Antineoplastic and Inununosuppressi ve Agents, Editors: A.C. Sartorelli und D.G. Johns, Springer-Verlag, New York, 1975, Seiten 272-347) und für 2'-Desoxy-5-vtnyluridin (Cheng et al, Antimicrobial Agents und Chemotherapy, Vol. 10, 1, 119-122 (1976)) antivirale »aktivität ermittelt werden. Allerdings sind die antiviralen Aktivitäten dieser bekannten Verbindungen nicht sehr spezifisch; die Verbindungen wirken gleich gut gegen verschiedene DNS-Viren, wie Vaccinia und Herpes simplex.

Auch ist die Toxizität dieser Verbindungen, speziell die Toxizität von 2'-DeSOXy-S-JOdUrIdIn, unerwünscht hoch. Im Hinblick auf diesen Stand der Technik überraschend wurde nun gefunden, daß die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen E-5-(2-Bromvinyl)-2'-desoxyuridin und E-5-(2-Jodvinyl)-2'-desoxyuridin eine ausgeprägt selektive antivirale Wirkung gegen eine einzige Virus-Art (Herpes simplex) besitzen und daß ihre Toxizität (in Zellkultur) außerordentlich niedrig ist. '

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Ein Verfahren zur Herstellunq der neuen E-5-(2-Halogenvinyl)-2 '-desoxyuridlne ist erfindungsgem-iß dadurch gekennzeichnet, daß man ein geschätzte Hydroxygruppen aufweisendes reaktives 2-Desoxy-D-erythro-pentofuranosyl-Derivat mit einem BIs-(tri alkyl) -si lyl-Deri vat von E-5- (2-Halogenvinyl) -urad 1 umsetzt und danach die Tri alkylsi Iy lgruppen und die Schutzgruppen an den Hydroxylgruppen entfernt.

Die Erfindung umfaßt weiterhin Arzneimittel für die Behandlung von durch das Virus Herpes simplex verursachte Infektionskrankheiten, die ein erfindungsgemäßes E-5-(2-Halogenvinyl) -2' -desoxy uri din, insbesondere E-5-(2-Bromvinyl)-2'-desoxyuridin oder E-5-(2-Jodvinyl)-2 '-desoxyuridin, als Wirkstoff enthalten. Zur Fertigung dieses erfindungsgemäßen Arzneimittels wird ein E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-desoxyuridin, insbesondere das E-5-(2-Bromvinyl)-2'-desoxyuridin oder das E-5-(2-Jodvinyl)-2'-desoxyuridin mit für die anwendungsfertige Darreichungsform üblichen Zusatzstoffen konfektioniert. Die Erfindung umfaßt auch die als Zwischenprodukte erfindungsgemäß benötigten Bis- (trialkyl) -silyl-Deri vate der E-5-(2-Halogenvi ny1)-uraciIe.

Es wird nachstehend die chemische Darstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen näher beschrieben.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden eine geschützte Hydroxylgruppen aufweisende reaktive 2-Desoxy-D-erythro-pentofuranosyl-Verbindung der Formel (II) und eine Bis- (tri alkyl) -si IyI-Verbindung eines E-5-(2-Halogenvinyl)-uraci Is der Formel (III) miteinander kondensiert, und von der resultierenden Molekül verbindung werden die Tri alkylsi Iylgruppen und die Schutzgruppen an den Hydroxylgruppen entfernt.

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■?-

Si(R)

HnI

(II)

(III)

In diesen Formeln bedeuten R einen Mkylrest, vorzugsweise Methyl-; R einen leicht austauschbaren Rest, vorzugsweise entweder Methoxy- (wenn es sich bei der Verbindung (II) um ein Gemisch von e(- und ß-Anomeren handelt) oder Chlor- (wenn es sich bei der Verbindung (II) um das c( -Anomer handelt);

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R und R die Hydroxylgruppe schützende Reste, vorzugsweise p-Toluoyl-; und Hai ein Brom- oder Jodatom.

Wenn die Verbindung (II) mit Chlor als R -Rest verwendet wird, kann man als Katalysator eine Lewis-Siiure verwenden, notwendig ist dies jedoch nicht. Falls eine Verbindung (II) mit dem Methoky-Rest R eingesetzt wird, ist ein Lewis-SHure-Katalysator erforderlich. Geeignete Lewis-Säure-Katalysatoren sind beispielsweise Molekularsiebe, Zlnn(IV)- und Queck si lber( II)-Halogenide , zum Beispiel die Chloride und Bromide, sowie TrImethyls!Iylperfluoralkylsulfonate.

Die Menge an eingesetztem Katalysator hangt von dem speziell gewHhlten Katalysator ab. Wenn man Quecksilberhalogenide

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benutzt, erhält man häufig beste Ergebnisse mit geringen Mengen, beispielsweise weniger als ein Zehntel molare Verhältnismenge, vorzugsweise mit einer Hundertstel molaren Verhältni smenge.

Für guten Verlauf der Reaktion ist die Auswahl des Lösungsmittels nicht wesentlich; es ist allerdings erforderlich, daß das eingesetzte Lösungsmittel inert ist gegenüber den Ausgangssubstanzen und den Produkten, und bevorzugt sollte ein solches Lösungsmittel verwendet werfen, das sowohl die beiden Ausgangs ve rbi ndunqen (II) und (III) als auch, sofern vorhanden, den Katalysator in einer ausreichenden Menge löst. Um sicher -*u gehen, daß die Lösungsmittel gegenüber der Verbindung (III) inert sind, sollten sie möglichst stark get ro -''net werden. Beispiele für geeignete Lösungsmittel sind Acetonitril, flüssige aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol und Toluol, und halogenlerte Alkane, wie beispielsweise Dl chlormethan, 1,2-Di chlnrethan und Tetrachlorkohlenstoff.

Die Temperatur, bei der die Reaktion durchgeführt wird, ist unkritisch; da sich jedoch die Zuckerderivate (II) bei höheren Temperaturen leicht zersetzen, ist es vorteilhafter, die Reaktion bei Zimmertemperatur oder darunter liegenden Temperaturen vorzunehmen.

Die Reaktion sollte in trockener Atmosphäre stattfinden, um der Hydrolyse der Trialkylsilyl-Verbindung durch atmosphärische Feuchtigkeit vorzubeugen.

Die Zeitdauer für die Reaktion hängt von dem speziell eingesetzten Katalysator und dem verwendeten Lösungsmittel ab. Man kann den Ablauf der Reaktion durch Dünnschi chtchromatographie verfolgen, und man lässt die Reaktion solange von-

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statten gehen, bis das Maximum an Produktausbeute erreicht ist. Danach wird das Re ak ti ons gemisch zu einem Rohprodukt aufgearbeitet, das anschließend durch Kristallisation oder Ch romatographt e qe rei ni gt wi rd,

Die Schutzgruppen können nach bekannten Standard-Methoden entfernt werden; man spaltet beispielsweise die Trialkylsilylgruppen und die die Hydroxylgruppen schützenden Reste durch Hydrolyse oder Alkoholyse ab. Bei der beschriebenen Arbeitsweise entsteht gewöhnlich ein Gemisch aus o(.- und ß-Anomeren in einem anteiligen Verhältnis, das auch von dem Katalysator abhängt.

Es ist gewöhnlich zweckmäßig, das ß-Anomer, d.i. die gewünschte Form der E-5- (2-Halogenvinyl) -2^f~desoxyuridin, aus dem Gemisch der Anomeren abzutrennen. Man kann die ß-Anomeren aus dem gereinigten Anomeren-Gemisch abscheiden und führt im allgemeinen zweckmäßig diese Abtrennung aus, bevor die an den Hydroxylgruppen ansitzenden Schutzgruppen entfernt werden.

Diese Abtrennung aus dem Anomeren-Gemisch kann durch fraktionierte Kristallisation und/oder Chromatographie an SiIicagel vorgenommen werden. Das spezielle Lösungsmittel oder Lösungsmi ttelgeitl sch, das für diese Trennvorgänge eingesetzt wird, hängt davon ab, welche spezielle Schutzgruppe an den Hydroxylgruppen vorhanden ist (sofern die Hydroxy1-Schutzgruppen noch ansitzen) . Im Einzelfall kann man beispielsweise durch Vorversuche auf Dünnschichtdaromatographie-Platten die geeignete Abtrennfl^:lssigkelt ermitteln. Die abgetrennten Anomeren kann man bei diesen Versuchen mittels NMR-Spektroskopie charakterisieren.

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-ν-

2 ' 3

Wenn als R- und R - Schutzgruppen die bevorzugten p-Toluoyl-Reste vorhanden sind, so arbeitet man, wenn man das reine geschützte ß-Anomer zu erhalten wünscht, vorzugsweise so, daß man zunächst das rohe Reaktionsprodukt unter Verwendung von BenzolrEthylacetat als Eluierungsmittel an Si Ii cagex Chromatographiert und so ein gereinigtes Anomeren-Gemisch gewinnt, und dann anschließend aus Methanol kristallisiert. Das reine geschützte ß-Anomer kristallisiert aus dieser Lösung bevorzugt aus. Es kann dann anschließend zu dem E-5- (2-Halogenvinyl) -2 '-desoxyuridin hydrolysiert werden.

Die Ausgangsmaterialien für die Verbindung der Formel (II) sind früher bereits beschrieben worden. Man kann ausgehen von 2-Desoxy-D-erythro-pentofuranose, diese an der !-Hydroxylgruppe methylieren, die Schutzgruppen für die Hydroxylgruppen in 3- und 5- Stellung einbauen und, falls erforderlich, die 1-Methoxygruppe durch Chlor ersetzen (vergleiche zum Beispiel CC. Bath, in Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry, von Tipson R.S., und Zorbach W.W. eds, Interscience, Vol. 521-522 (1968).

Bei der Ausgangsverbindung der Formel (III) handelt es sich um eine neue chemische Verbindung, die auch Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist. Verbindungen der Formel (III) können durch Umsetzung eines E-5- (2-Halogenvinyl) -urad. Is mit einem Silylierungsmittel, wie beispielsweise Hexamethyldlsilazan oder Tri methyl chlor si lan oder Gemischen dieser Si IyHerungsmittel hergestellt werden. Ein E-5- (2-Halogenvinyl) -uracil kann man in einfacher Weise z.B. durch Bromieren oder Jodieren von 5-Vinyluraci 1 und anschließender Eliminierung von HBr bzw. HJ durch Hitzeeinwirkung gewinnen (vergl. Bleackley et al, Tetrahedron, Vol. 32, 2795-2797 (1976) ).

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In den nachstehenden Beispielen sind die chemische Synthese und physikalische Konstanten des Endprodukts sowie die Herstellung von Ausgangsverbindungen der Formel (III) näher erläutert.

Beispiel 1

Herstellung von E-5-(2-Bromvinyl)-uraci1

5-Vinyluraci 1 (2,75 g, 20 mMole) wurde in trockenem Dimethylformamid (250 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurde eine Lösung von Brom (3,2 g, 20 mMole) in trockenem Dimethylformamid (30 ml) hinzu gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde geschüttelt, bis es farblos war, und dann 1 Stunde lang bei 100 erhitzt. Danach wurde die Lösung unter vermindertem Drude zu einem braunen ttl eingedampft. Dem öl wurde Wasser ( 30 ml ) zugesetzt. Die resultierende rosa gefärbte Suspension wurde filtriert, und der schwach rosa gefärbte feste Rückstand ergab, aus Methanol umkristallisiert, E-5-(2-Bromvinyl)-uraci1 (3,62 g, Ausbeute 84%). NMR: £ (d6DMS0): 11,2 (2-H,bd, N-H's), 7,7 (1-H, d, H-6, J=6Hz) 7,3 (1-H, E-(trans)vinylisches H-2', J=13Hz), 6,8 ppm (1-H, E-(trans)vinylisches H-I¹, J=13Hz). UV:Amax 290 nm (£ , 9,930), 251 nm (£ , 17,500), Λ min 275 nm ( £ , 8,2 80) bei pH-l,Amax 305 {£ , 11,400), 267 nm (£ , 15,400), \ min 290 nm (£ , 10,500) bei pH-13.

Herstellung von E-5-(2-Bromvinyl)-3·,5'-di-O-p-toluoyl-2'-desoxyuridin und dessen Ά. -Anomer

E-5-(2-Bromvinyl)-uraci1 (3,62 g, 16,7 mMole) wurde in Hexamethyldisilazan (15 ml) suspendiert, und es wurde TrimethylsiIylchlorid ( 0,1 ml ) zugegeben. Die Suspension wurde 1.Stunde lang unter Rückfluß am Sieden gehalten. Dabei bildete sich eine klare Lösung, überschüssiges Lösungsmittel wurde bei 120-130° unter Hochvakuum in einem

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-yf-

Kuqelrohrofen destilliert. Dabei wurde die bi stri methylsi Iy lierte Verbindung als farbloses öl erhalten (5,04 g, Ausbeute 84%).

NMRrS(CCl₄): 8,05 (1-11,3,11-6), 6,83 (2-11,s ,vinyl'- ehe H's), 0,38, O,30 npm (18H,2s,Me₃Si - an -2-O- und 4-O-) (Me.Si externer Standard).

Dan bistrimethylsi Iy lierte E-5- (2-Bromvinyl) -uraci 1 (5,04 g, 14 mMole) wurde in trockenem Dlchlorethan (50 ml) gelöst, und es wurde eine Lösung von l-Chlor-2-desoxy-3,5-di. -O-D-toluoyl-f>C-D-erythro-pentofuranose (4,0 g, 12,6 mMole) in trockenem Dichlorethan (50 ml) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 8 Stunden lang bei 22 mit einem Magnetrührer gerührt und dann unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Das resultierende öl wurde auf eine Silicagel-Säule aufgegeben, und unter Verwendung von Benzoi-Ethylacetat (7:3) als Laufmittel wurde das Nucleosid-Produkt in einer Gesamtausbeute von 5,3 g (88%) gewonnen» Die NMR-spektroskopische Untersuchung ergab, daß das Verhältnis der Anomeren 1,3:1, oC : ß,. betrug. Anschließende Säulenchromatographie-Behandlunq mit Chloroform-Propan-2-ol (99:1) ergab eine stärkere Auftreinung der Anomeren. Das weiter laufende Nucleosid wurde aus Methanol umkristalll™ siert, und man erhielt das ß-Anomer in Form von farblosen Kristallen.

NMR:S (CDCl₃): 8,28 (1-H,s, N-H), 7,94 (4-H,d, aromatische H's) , 7,41 (1-H,s, H-6), 7,26 (5-H, m, aromatische H's und E-vinylisches H-2¹¹), 6,40 (1-H, t, H-I¹), 6,08 (1-H, d, E-vinylisches H-I¹¹, J=13IIz) , 5,62 (1-H, d, H-3¹), 4,72 (2-h, dd, H-5·), 4,54 (1-H, m, H-4'), 2,7 (2-H, bm, H-2'), 2,42 ppm (6-H, s, CH₃ ¹S).
ä

UVs A mäx 244 nm (£ , 37,4OO), 286 nm (sh) (£ , 8,550} in Ethanol.

Schmp. 186-188° (Zers.).

Das oC -Anomer fiel beim Umkristallisieren aus Methanol in Form von weißen Nadeln an.

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HeΓ53teilung von Γ1-5- (2-Bromvinyl) -2 '-desoxyuridin

Tn einer Lösung von Natriummethoxid in Methanol (15 ml, 0,1 M) wurde E-5-(2-Bromvinyl)-2'-desoxy-3',5'-di-O-p-toluoyluridin (0,924 g, 1,6 mMole) gelöst-, und man ließ das Gemisch 24 Stunden lang bei 22 stehen. Durch vorsichtige Zugabe von Ionenaustauscherharz (H + Form) (Produkt mit der Handelsbezeichnung "Dowex 5O) wurde die Lösung auf pH 6 neutralisiert und anschließend zu einem weißen Feststoff eingedampft. Die feste Masse, wurde mit zither ( 3 χ 10 ml) verrieben, und nach Trocknen im Vakuum wurde rohes E-5- (2-Bromvinyl) -2 •-desoxyuridin (508 mg, Ausbeute 94%) erhalten. Das Rohprodukt wurde aus Methanol-Wasser umk ri stallt si ert, und es wurden weiße "adeln mit einem Schmelzpunkt von 123-125° (Z.) erhalten. NMR: S (d6DMS0) : 11,24 (I=H,s,N-H), 8,O8 (l-H,s,H-6), 7,24 (1-H, d, E_rvinylisches H-2"), 6,81 (1-U,d, E-vinylisches H-I'¹, J=13Hz), 6,10 (1-H,t,H-I), 5,18 (1-H,d,OH-3'), 5,02 (1-H,t, OH-5¹), 4,22 (l-H,m,H-3'), 3,78 (l-H,m,H~4'), 3,58 (2-H,m,H-5), 2,12 ppm (2-H,m,H-2').

ÜV:λ max 253 nm ( _t , 13,100), 295 nm (£ , 10,300),Λ min 274nm (7,500) in Ethanol.

Das c<,-Anomer ließ sich in analoger Weise freisetzen.

Beispiel 2

Herstellung von E-5-(2-Jodv±nyl)-uracl1

In trockenem Dimethylformamid (4O ml) wurde 5-Viny.luraci 1 (1,1 g, 8 mMole) gelöst. Dieser Lösung wurde eine Lösung von Jodmonochlorid (1,28 g, 8 mMole) in trockenem Dimethylformamid (20 ml) zugesetzt. Man ließ das Reak ti ons gemisch unter gelegentlichem Schütteln 30 Minuten lang stehen und erhitzte, dann 3O Minuten lang auf 100 . Anschließend wurde die Lösung unter vermindertem Druck eingedampft. Es wurde

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ein braunes öl erhalten, dem Wasser (20 ml) zugesetzt wurde.

Die resultierende dunkelbraune Suspension wurde filtriert.

Der braune Feststoff wurde gesammelt und getrocknet, und

man erhielt rohes E-5-(2-Jodvinyl)-uraci1 (1,6 g, Ausbeute 76%). Dieses Produkt wurde ohne weitere Reinigung in der

folgenden Verfahrensstufe eingesetzt.

MMR: <S (d6DMSO) : 11,1 (2-II,bd, N-II's), 7,7 Q-H ,d,H-6, J=GHz) ,

7,2 ppm (2-H's, vinylische H's)

UV:A max 294 nm (£ , 9,900), 250 nm (£ , 15,200),^ min 278 nm (S , 9,250) bei pH-1, Λ max 310 nm (£ , 12,2OO) ,Λ max 262 nm

(£ , 15,850),λ min 290 nm (£ , 1Ο,Ο50) bei pH-13.

Herstellung von E-5-(2-Jodvi nyl)-3 ' ,5 ' -di -O-p-toluoyl-2 ' desoxyuridin und dessen ¹^ -Anomer

E-5-(2-Jodvinyl)-uraci1 (1 g, 3,8 mMole) wurde in Hexamethyldisilazan ( 8 ml ) suspendiert, und es wurde Trimethy lsi IyI-chlorid (0,1 ml) zugesetzt. Man ließ die Suspension 1 Stunde lang unter Rückfluß sieden; dabei bildete sich eine klare Lösung, überschüssiges Lösungsmittel wurde im Hochvakuum entfernt, und der ölige Rückstand wurde bei 130-160° im Hochvakuum in einem Kugel roh ro fen destilliert. Dabei wurde das bistrimethylsi lyüerte Derivat in Form eines gelben Öls gewonnen (554 mg, Ausbeute 36%).

NMR: 6 (CCl₄): 8,0 (l-H,s,H-6), 7,2 (1-H,d,E-(trans) vinylisches H-2¹, J=15Hz), 6,8 (1-H,d,E-(trans)vinylisches H-I¹, J=15Hz), 0,4, O,3 ppm (18-H, 2s, Me₃Si- an 2-O- und 4-O- ).

Die vinylischen Kopplungskonstanten von 15Hz zeigten, daß die Konfiguration um die Doppelbindung die Ε-Konfiguration war.

Die Kondensation der bistrimethylsi lylierten Verbindung mit l-Chlor-2-desoxy-3, 5-di-o-p-toluoyl-oC -D-erythro-pentofuranose wurde in gleicher Weise wie zuvor im Zusammenhang mit der 5-(2-Bromvinyl)-Verbindung beschrieben, vorgenommen. Durch

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Säulenchromatographie mit Benzol-Ethylacetat (8:2) als Lauf mittel wurden die ot- und ß-Anomeren voneinander getrennt. Das tiefer fließende Nucleosid wurde aus Methanol umkristallisiert, und man erhielt das ß-Anomer in Form von farblosen Kristallen.

NMRrS(CDCl₃): 8,5 (1-H,bs ,N-H) , 6,45 ppm (2-H,m,II-l' und E-(trans)vinylisches H-I¹').

UV:λ max 242 nm (_fc , 33,950),λ max 295 nm (£ , 9,650), λ min 272 nm (£ , 7,850) in Ethanol.

Das (L -Anomer wurde aus Methanol umkristallisiert und fiel in Form von weißen Nadeln an.

Herstellung von E-5- (2-JodvinYl) -2 '-desoxyuridin

In einer Lösung von Natriummethoxi d in trockenem Methanol ( 3 ml, 0,1 M) wurde E-5-(2-Jodvinyl)-2'-desoxy-3,',5',-di-O-p-toluoyl-uridin (84 mg, 0,14 mMole) gelöst, und man ließ das Gemisch 5 Stunden lang bei 22 stehen. Die Lösung wurde durch vorsichtige Zugabe von lonenaustauscherharz (H + Form) (Handelsbezeichnung "Dowex 50") auf pH 6 neutralisiert und dann eingedampft, und es wurde ein gelbes öl erhalten. Dieses wurde mit Methanol versetzt und erneut eingedampft, und man erhielt in Form/fahl gelbem Feststoff roh^es E-5-(2-Jodvinyl) 2'-desoxyuridin (22 mg, Ausbeute 42%).

NMR: £ (d6DMS0) : 11,6 (1-H ,bs ,N-H) , 8,08 (1-H, s,H-6), 7,17 (2-H,s,vinylische H's), 6,14 ppm (1-H, H-I¹, J=6Hz). UV: X max 250 nm (_fc- , 14 ,100) ,A- max 295 nm ( £ , 11,450), λ min 275 nm ( £ , 8,450) in Ethanol.

In gleicher Weise ließ sich das c(, -Anomer freisetzen.

Nachfolgend wird über ei β Reihe von biologischen Tests berichtet, "die die spezielle antivirale Wirkung und den hohen Anti vi ral-Index erflndungsgemfißer Verbindungen veranschaulichen.

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In diesen Tests wurde der Effekt von E-5-(2-Halogenvlnyl)-2'-desoxyuridinen und verwandten Verbindungen auf Wachstum und Ausbeute von Viren in Zellkulturen untersucht.

Die folgenden Verbindungen wurden geprüft: 2'-Des°xy-5-vi nyluridin (hergestellt nach der Vorschrift von Bobek et al: J. Org.Chem. 40,2377-237«? (1975); 5- (1-Chlorvinyl) -2 '-desoxyuridin (wie üblich hergestellt} ; E-5- (2-Bromvinyl) -2 ·- desoxyurldin (hergestellt gem'iß vorstehendem Beispiel 1); E-5-(2-Jodvinyl)-2 '-desoxyuridin (hergestellt gemäß vorstehendem Beispiel 2); 2-Desoxy-5-ethynyluridin (hergestellt nach der Vorschrift von Bobek et al: Tetrahedron Letters, 28, 2427-243O, (1976); und 2-Desoxy-5-joduridin (von Ludeco, Brüssel, erhalten). Sofern nichts anderes gesagt ist, hanes stell bei allen Verbindugnen um die ß-Anomeren.

5-(1-Chlorvl nyl)-2'-desoxyuri dt η wurde durch Einwirkung von HCl auf 2 '-desoxy-5-ethynyluri dt η gewonnen. Die physikalischen Konstanten dieser Verbindungen waren die folgenden:

Schmp. 108-110 (Z.).

NMR: £ (döDMSO): 11,2 (1-H ,bs ,N-H) , 8,37 (1-H ,s ,11-6) , 6,43 (1-H,s ,vinylisches H, trans zum heterocyclischen Ring), 6,18 (1-H,t,H-I¹) , 5,54 (1-H,s , vinyli sches H, eis zum heterocyclischen Ring), 5,1 (2-H,bs,0-H), 4,25 (l-H,m,H-3·), 3,86 (l-II,m,H-4') , 3,70 (2-II ,m,II-5 ') , 2,17 ppm (2-H,m,H-2 ') . UV: λ max 234 nm (^ , 9,37O), 282 nm ( t ι 10,500),Amin 259 nm ( £ , 6,550) bei pH G.

Die Verbindungen wurden an dem Virus Vaccinia und an dem Virus Herpes simplex-1 (Stamm KOS) getestet. Diese Viren wurden in primären Kaninchennierenzellkulturen (PRK) und in menschliphen Flbroblasten (HSF) gezüchtet.

Für die Auswertung der Vi rus-Enti'wck lung in den Zellkulturen wurde die von De Clercq et al in Biochem.Pharmacol. , 24, 523-527 (1975) , beschriebene Technik verwendet.

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Test I

In diesem Test wurde die Inhi bi erunqs ak ti vit.1t von E-5-(2-Halogenvi nyl)-2 '-desoxyurldinen und verwandten Verbindunqen auf in PRK und HRF Zellkulturen vorhandene Vaccinia- und He-rpeμ 5>lmr>lex-l - Viren untersucht. Man ließ die Zellen in entweder f laschen förmiqen KulturgefHßen (PRK) oder auf Mikroplatten aus Kunststoff (HSF) solange, wachsen, bis sie sich gegenseitig berührten. Die konfluierten Zellen wurden mit 100 CCID entweder des Virus Vaccinia oder des Virus Herpes simplex-1 beimpft. Ein CCIDc₀ entspricht der Zellkultur-Infektionsdosis-50, das ist diejenige Menge an Virus, die zur Infektion zur 50% der Zellen in der Zellkultur erforderlich ist. Eine Stunde nach der Infektion mit dem Virus wurden die Verbindungen in verschiedenen Konzentrationen (im Bereich von 0,001 ,ug/ml bis 100 ,ug/ml) zugesetzt. Für jedes Virus-Zellsystem wurde die IDc₀ bestimmt. Die ID₁. entspricht der inhibierenden Dosis-50, das ist diejenige Konzentration an Verbindung, die erforderlich ist, um den durch das Virus verursachte zytopattogenen Effekt um 50% zu unterdrücken. Der zytopathogene Effekt (CPE) wurde gemessen, sobald er in den mit dem unbehandelten Virus infizierten Zellkulturen vollständig abgelaufen war (im allgemeinen 3 Tage, nachdem die Zellen mit dem Virus infiziert w^r-rien waren). Die Ergebnisse sind in Tabelle I veranschaulicht; die angegebenen Daten sind Durchschnittswerte aus drei qetrennt durchgeführten Experimenten.

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Tabelle 1

Antivirale Aktivität von E-5- (2-Halogenvinyl) -2 '-desoxyuridi nen und verwandten 2'-Desoxyuridiη-Analogen in primären Kaninchennierenzellkulturen (PRK) und menschlichen Hautfibroblastkulturen (HSF)

Verbindung

2 ' -Descxy-5-vinyluri din 5- (1-Chlorvinyl) -2 ' -desoxyuridiη E-5- (2-Eromvinyl) -2 ·-desoxyuridiη E-5- (2-Jodvinyl) -2 '-desoxyuridiη 2 '-Desoxy-5-ethynyluridin

2 '-Desoxy-5-joduri din

	^ID50	(_/ug/nl)	Herpes simplex-1 Stamm KOS (HSP)
Vaccini a (PRK)	Vaccinia (HSF)	Herpes simplex-1 Starten KOS (PRK)	0,07
0,4	0,1	0,04	2
0,4	0,7	0,4	0,007
7	0,7	0,007	-
10	-	0,01	0,4
0,2	0,1	0,07

0,2

0,7

Test 2

Es wurde der Inhibierungseffekt von E-5-(2-Bromvinyl)-2'-desoxyuridin und verwandten Verbindungen auf die Vermehrung des Virus Herpes simnlex-1 in PRK-Zellkulturen untersucht. In Petrischalen aus Kunststoff , urehmesser: 55 nun) konfluierte einschichtige PRK Zellrasen wurden mit dem Virus Herpes simplex-1 (4,5 log-.. PFU/0,5 ml/Petrischale) 1 Stunde lang bei 37 C bebrütet '^d unmittelbar danach der Einwirkung von 0,1 ,ug/ml einer der zu untersuchenden Verbindungen unterworfen. Danach wurden die Zellkulturen über unterschiedliche Zeitspannen (1, 2 oder 3 Tage lang) bei 37 C bebrütet. Nachdem die Züchtung beendet war wurden die Zellen bei -70 eingefroren, und die Zellen-Homogenisate wurden durch Pocken-(Pla^ue-) Bildung in VERO Zellkulturen (VERO = eine kontinuierliche Zellreihe von Affenzellen) auf Virusgehalt untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 veranschaulicht. Die Werte geben die Differenzen der Vi rus-Ausbeute zwischen den behandelten-Vlrus infizierten Zellkulturen und den unbehandelten-Virus infizierten Zellkulturen an. PFU bedeutet Pocken-(Plaque-) Bildungs-Einheiten.

§09846/058§

-go-

Tabelle

Inhibierungsef fekt von F-¹J- (2-Bromvinyl) -2 '-desoxyuridin und verwandten 2'-Desoxyurldin-Analogen auf die Vermehrung von Virus Herpes siniplex-1 (Stamm KOS) in primären Kaninchennierenzellkulturen (PRK)

Verbindung

Dosi Cug/ml)

Verminderung der Virusausbeute , vergli chen mit Kontroll-Zellkulturen (infiziert mit unbehandeltem Virus)

Tage nach der Infektion 3

2'-DPsoxy-5-Vinyluri din O,l

5-(l-Chlorvinyl)-2'-desoxyuridin

E-5- (2-Bromvinyl) -2 '-desoxyuri di η

0,1

2,4

0,2

3,8

1,1

0,4

2,6

1,0

0,2

0,8

2'-Desoxy-5-ethyny1-uridt η

,2

0,2

0,1

2'-Desoxy-5-joduridin

0,1

1,2

0,9

0,7

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Test 3

Es wurde die anti.inetaboli sehe Aktivität von E-5- (2-Bromvinyl)-2 '-desoxyurt din und verwandten Verbindunaen in PRK Zell'culturen untornucht.

a) in einem ersten Experiment wurde der Einhau bestimmter radiomarkier' ^r DM.I-Precursoren in Zellen-DNS und der Effekt von 5-2 (Bromvinyl) -2 '-desoxyurt din und verwandter Verbindungen darauf getestet. Es wurde dabei die von De Clerci et al in Biochemical Pharmacology, 26, 794-797 (1977) und von De Clerc'i et al. in Molecular Pharmacology, im Drude, 1978, beschriebene Methode angewendet.

Als DNS-Precursoren wurden (Methyl-'H) (2'-desoxythymidln ) (TdR) und (2-¹⁴C) (2'-desoxyuridin) (QdR) benutzt.

In Anwesenheit verschiedener Konzentrationen der Verbindungen (im Bereich von 1 bis IQO .ug/ml) wurden die Zellen 16 Stun-

' 3

den lang entweder O,12 ,uCi:0,01 nMol (Methyl- H) TdR

(je 10⁵ Zellen) oder 14 ,uCi/250 nMol (2-¹⁴C) UdH (je 10⁵ Zellen) ausgesetzt. Danach wurde wie beschrieben der Einbau des radiomarkierten Precursors gemessen, und es wurde die IDcq bestimmt. Unter dem ID_ -Wert versteht man die Inhibierungsdosis-50, das ist die Konzentration an Verbindung, die erforderlich ist, um den Einbau von entweder (Methylol) TdR oder (2-¹⁴C) UdR zu 50% zu 1
gebnisse sind in Tabelle 3 angegeben.

b) In einem zweiten E^neriment wurde die Gesamt-Zellzahl
nach der Behandlung mit E-5-(2-Bromvtnyl)-2 '-desoxyurldin und verwandten Verbindungen bestimmt. In Anwesenheit von unterschiedlichen Konzentrationen der Verbindungen ( im
Bereich von 0,01 bis 100 .ug/ml ) wurden die Zellen auf
Kunststoff-Petrischalen ( Durchmesser: 55 mm ) in einer

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Menge von nnnähernd 800.000 Zellen / Petrischale ausgestrichen. Nach dreitägiger Inkubationszeit bei 37° ( in Anwesenheit von 5% CO-) wurde das Zellkulturmedium entfernt, die Zellen wurden in eine Suspension mit Trypsin eingebracht und mittels einer Zähleinrichtung ( coulter counter model ZB) ausgezählt. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 3 veranschaulicht. Der TD -Wert gibt die Inhibierungsdosis-50 an, das ist die Konzentration an Verbindung, die erforderlich ist, um die Gesamt-Zellzahl um
50% zu vermindern.

Tabelle 3

Antimetabolische Aktivität von E-5- (2-Bromvinyl) -2 '-desoxyuridin und verwandter 2 '-Desoxy uri din-Verbi ndungen in primären Kaninchennierenzellkulturen (PRK)

Verbi ndung

ID₅₀ (^ug/ml )

(Methyl- H)TdR (2- C)UdR Gesamt-Einbau Einbau Zellin DNS in DNS zahl

2 '-Desoxy-5-vinyluri ¹In

5- (1-Chlorvi nyl)-2'-desoxyuridin

E-5- (2-Bromvinyl) -2 '-desoxyuri di η

2'-Desoxy-5-ethynyluridin

2O	8	8
27	<6	2
70	35	>33
100	«6	0,3

2 '-Desoxy-5-joduridin

2,5

1,2

— 0 Ί —

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Bei der letzten Prüfung wurde der Anti viral-Index von 5- (2-Bromvinyl) -2 '-desoxyuridin und dessen verwandten Verbindungen in PRK Zellkulturen als Ergebnis der in den vorstehend beschriebenen Test-", durchgeführten Bestimmungen ermittelt.

Der Antiviral-Index wurde durch Division des "antimetaboIisehen" ID₅ -Wertes durch den "antiviralen" ID₅ -Wert berechnet. Der " anti nie tabo Ii sehe" ID₅-WeTt war die Dosis, die zur Verminderung der Zellzahl um 50% erforderlich war; der "antivirale" ID,-_O-Wert war die Dosis, die zur Inhibierung des zytopathogenen Effe-ctes von Herpes sirriwlex-1 um 50% erforderlich war. Die Ergebnisse sind in Tabelle ζ us ammenges te11t.

Tabelle 4

Anti viral-Index von E-5-(2-Rromvinyl)-2 '-desoxyuridin und verwandten 2 ' -Desoxyuridin-Verbindungen in orimären Kaninchennierenzellkulturen (PRK)

Verbi ndung Anti vi ral-Index

2'-Desoxy-5—vinyluridin 200

5- (1-Chlorvinyl) -2 '-desoxyuridin 5

E-5- (2-Bromvinyl) -2 ·-desoxyuridin >5000

2 '-Desoxy-5-ethynyluridin 5

2'-Desoxy-5-joduridin 30

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Aus den vorstehenden Test-Eraebnissen ist ersichtlich, daß E-5-(2-Bromvinyl)-2 '-desoxy-uridin und E-5-(2-Jodvinyl)-2'-desoxv uridtn eine andere Wirkung haben als die damit verwandten Verbindungen; sie haben eine spezifische antivirale Aktivität und einen beachtlich hohen Anti viral-Index gegen das Virus Herpes simplex, der insbesondere für E-5- (2-Bromvinyl) -2 ' -desoxyuridin auffallend hoch ist. Sie lassen sich vorteilhaft für die Behandlung von durch dieses Virus bei Menschen und Tieren verursachte Infektionskrankheiten verwenden.

Arzneimittel-Zusammensetzungen, die E-5-(2-Bromvinyl)-2'-desoxyuridin oder E-5- (2-Jodvinyl) -2 '-desoxyuridin als aktiven Wirkstoff enthalten, können in Form von Pulver, Puder, Suspensionen, Lösungen, Emulsionen oder auch als Salben und Pasten konfektioniert werden und parenteral (intravenös, intradermal, intramuskulär, intrathekal,. .) injiziert, oral, rektal, intravaginal und intranasal verabreicht oder örtlich appliziert (zum Beispiel auf Wunden in der Haut, der Schleimhaut und an den Augen) werden. Diese Arzneimittel-Zusammensetzungen lassen sich, wie dies für solche Zwecke üblich ist, durch Kombination des oder der aktiven Wirkstoffe mit pharmazeutisch verträglichen Zusatzstoffen formulieren. Solche Zusatzstoffe können wässrige oder nicht-wässrige Lösungsmittel, Stabilisatoren, Suspensions-, Dispersions- und Benetzungsmittel und dergleichen dem Fachmann bekannte Exzipientien sein. Solche Arzneimittel können auch beliebige geeignete Additive, wie Polyethylenglyköle und gewünschten- oder erforderlichenfalls Farbstoffe, Perfüms oder dergleichen Beigaben enthalten.

-23-

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Arzneimittel-Zusammensetzungen haben gewöhnlich einen Gehalt von mindestens 0,1 Gew.-%/Volumen an aktivem Wirkstoff. Die tatsächliche Konzentration hängt ab yr>n der zu behandelnden Krankheit und gewählten Verabreichungsart. Im allgemeinen liegt diese Konzen-. .ration zwischen O,l% und

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Claims

DIPL. PHYS.K. SCHAEFER _DATUM 2915254

UNSER ZEICHEN: PATENTANWÄLTE SCHAEFER. POSTFACH 70 1542, D-2 HAMBURG 7ff lHRZEICHEN: ΑΤ)Τ1 1 19 79

Stichting Rega V.Z.W., No. 3, Krakenstraat, B-3000 Leuven, Belgien

Patentansprüche

Neue chemische Verbindungen, bestehend aus einem E-5-(2-Halogenviny1)-2'-desoxyurldl η.
2. Verbindung nach Anspruch 1, bestehend aus E-5- (2 -Bromvi ny 1) -2 ' -desoxy uri di η.
3. Verbindung nach Anspruch 1, bestehend aus E-5-(2-Jodvinyl)-2'-desoxy uri din.
4. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein geschützte Hydroxylgruppen aufweisendes reaktives Derivat von 2-Desoxy-D-erythro-pentofuranose mit einem Bis-(trialkyU-silyl-Deri vat von E-5-(2-Halogenvinyl)-uracil umsetzt und von dem Umsetzungsprodukt die Trialkylsilylgruppen und die Schutzgruppen an den Hydroxylgruppen entfernt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Umsetzungsprodukt, bevor man von den Hydroxylgruppen die Schutzgruppen entfernt, in seine Anomeren zerlegt und das ß-Anomer gewinnt.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß raan das Umsetzungsprodukt, nachdem man von den Hydroxylgruppen die Schutzgruppen entfernt hat, in seine Anomeren zerlegt und das ß-Anomer gewinnt.
7. Arzneimittel mit antiviraler Wirkung, insbesondere geeignet für die Behandlung von durch das Virus Herpes simplex verursachte Infektionen, dadurch gekennzeichnet, daß darin

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als Wirkstoff eine Verbindung der Ansprüche 1 bis 3 zusammen mit für die anwendungs fertige Darreichungsform üblichen Zusatzstoffen enthalten ist.
8. Neue chemische Verbindung, bestehend aus einem Bis-(trialkyl)-silyl-Derivat eines E-5-(2-Halogenvinyl) uraci Is.

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