DE69535047T2

DE69535047T2 - L-Nukleoside zur Behandlung von Hepatitis-B-Virus und Epstein-Barr Virus

Info

Publication number: DE69535047T2
Application number: DE69535047T
Authority: DE
Inventors: Chung K. Athens Chu; Yung-Chi Woodbridge Cheng; Balakrishna S. New Haven Pai; Gang-Qing Guilford Yao
Original assignee: University of Georgia; Yale University; University of Georgia Research Foundation Inc UGARF
Current assignee: University of Georgia; Yale University; University of Georgia Research Foundation Inc UGARF
Priority date: 1994-01-28
Filing date: 1995-01-30
Publication date: 2006-12-07
Anticipated expiration: 2015-01-31
Also published as: EP0748330A4; HU9601774D0; JPH09508394A; PT748330E; HK1014716A1; FI117475B; EP0748330B1; JP3899440B2; BG100792A; US5587362A; EP1283211B1; CA2182273C; DK0748330T3; AU710262B2; BR9506596B1; ES2194902T3; KR100321209B1; HUT75514A; NO306408B1; FI962986A

Description

Diese Erfindung liegt in dem Bereich von Verfahren zur Behandlung des Hepatitis-B-Virus (ebenso als „HBV" bezeichnet) und Epstein-Barr-Virus (als „EBV" bezeichnet), umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge von einer oder mehreren der hierin offenbarten aktiven Verbindungen, oder eines pharmazeutisch akzeptablen Derivats oder Prodrugs von einer dieser Verbindungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Der Hepatitis-B-Virus erreichte weltweit Epidemieniveaus. Nach einem Inkubationszeitraum von zwei bis sechs Monaten, in dem sich der Wirt der Infektion nicht bewußt ist, kann die HBV-Infektion zu akuter Hepatitis und Leberschäden führen, die Bauchschmerz, Gelbsucht und erhöhte Blutspiegel von bestimmten Enzymen verursachen. HBV kann fulminante Hepatitis verursachen, eine schnell fortschreitende, oftmals tödliche Form der Krankheit, bei der massive Abschnitte der Leber zerstört werden. Patienten erholen sich typischerweise wieder von der akuten Virushepatitis. Bei einigen Patienten bleiben jedoch hohe Niveaus an viralem Antigen in dem Blut für einen längeren oder undefinierten Zeitraum bestehen, was eine chronische Infektion verursacht. Chronische Infektionen können zu chronischer andauernder Hepatitis führen. Patienten, die mit chronischer andauernder HBV infiziert sind, kommen in Entwicklungsländern am häufigsten vor. Mitte 1991 gab es allein in Asien ungefähr 225 Millionen chronische Träger von HBV, und weltweit höchstens 300 Millionen Träger. Chronische andauernde Hepatitis kann Müdigkeit, Zirrhose der Leber und hepatozelluläres Karzinom, ein primärer Leberkrebs, verursachen.
In westlichen Industrieländern sind hohe Risikogruppen für HBV-Infektion die, die mit HBV-Trägern oder ihren Blutproben in Kontakt kommen. Die Epidemiologie von HBV ist tatsächlich sehr ähnlich zu der des erworbenen Immundefizienzsyndroms, welches der Grund dafür ist, warum die HBV-Infektion unter den Patienten mit AIDS oder HIV-verbundenen Infektionen üblich ist. Jedoch ist HBV ansteckender als HIV.
HBV ist nur gegenüber Tabak als Ursache für menschlichen Krebs zweitrangig. Der Mechanismus, durch den HBV Krebs auslöst, ist unbekannt, obwohl postuliert wird, daß es direkt die Tumorentwicklung auslöst, oder die Tumorentwicklung durch chronische Entzündung, Zirrhose und Zellregeneration, die mit der Infektion verbunden ist, indirekt auslöst.
Das Epstein-Barr-Virus (EBV) ist ein Mitglied der Gattung Lymphocryptovirus, welche zu der Unterfamilie Gammaherpesvirinae gehört. Es ist merklich lymphotrop. EBV hat die klassische Struktur von Herpesviren, sein doppelsträngiges DNA-Genom ist nämlich in einem icosapentaflächigen Nukleokapsid enthalten, das wiederum von einer Lipidhülle umgeben ist, die mit viralen Glykoproteinen besetzt ist. Ein amorphes Integumentprotein nimmt den Raum zwischen der Hülle und dem Nukleokapsid ein.
Alle menschlichen Herpesviren infizieren und replizieren innerhalb der Lymphozyten in einem gewissen Ausmaß, aber EBV tut es effizient. Hauptsächlich hängen die Pathogenese und Wirtsreaktionen auf die Infektion mit EBV offensichtlich mehr von der Lymphozyteninfektion ab, als bei den anderen menschlichen Herpesviren der Fall ist.
EBV ist nun als eine Ursache von B-Zellen-lymphoproliferativen Krankheiten anerkannt, und ist mit einer Vielzahl von anderen schweren und chronischen Krankheiten verbunden, einschließlich selten progressivem Mononukleose-artigem Syndrom und oraler haarförmiger Leukoplakie bei AIDS-Patienten. Die Schlußfolgerung, daß EBV eine Hauptursache von chronischer Müdigkeit ist, konnte einer genauen Prüfung nicht standhalten.
EBV wird in erste Linie durch den Speichel übertragen, obwohl einige Infektionen durch Bluttransfusion übertragen werden. Mehr als 85% der Patienten in den akuten Phasen der infektiösen Mononukleose sondern EBV ab.
EBV ist mit Krebs in Verbindung gebracht worden. Mindestens zwei Gruppen von Patienten sind hinsichtlich der Entwicklung von mit EBV in Verbindung stehenden Lymphomen gefährdet: die, die Nieren-, Herz-, Knochenmarks-, Leber- oder Thymustransplantate unter dem Schutz der immunosuppressiven Therapie erhielten, und Patienten mit AIDS. Mit EBV in Verbindung stehende Krebsarten umfassen Burkitt-Tumor und Nasopharynxkarzinom.
Im Lichte der Tatsache, daß Hepatitis-B-Virus und Epstein-Barr-Virus schwere und oftmals tragische Wirkungen auf den infizierten Patienten haben, besteht eine starke Notwendigkeit, neue wirksame pharmazeutische Mittel bereitzustellen, um Menschen zu behandeln, die mit den Viren, die für den Wirt geringe Toxizität aufweisen, infiziert sind.
Daher ist es ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, eine Verbindung, eine Zusammensetzung und ein Verfahren zur Behandlung von Hepatitis-B-Virus bereitzustellen.
Es ist ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, eine Verbindung, eine Zusammensetzung und ein Verfahren zur Behandlung von Epstein-Barr-Virus bereitzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Verfahren zur Behandlung eines Wirts und insbesondere eines Menschen, der mit HBV oder EBV infiziert ist, wird bereitgestellt, umfassend das Verabreichen einer HBV- oder EBV-Behandlungsmenge eines L-Nukleosids der Formel:
worin R eine Purin- oder Pyrimidinbase ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Nukleosid als das angegebene Enantiomer und im wesentlichen in Abwesenheit seines entsprechenden Enantiomers bereitgestellt (d. h. in enantiomer angereicherter, einschließlich enantiomerenreiner Form).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die aktive Verbindung 2'-Fluor-5-methyl-β-L-arabinofuranosyluridin (ebenso bezeichnet als L-FMAU). Diese Verbindung ist ein wirksames Virostatikum gegen HBV und EBV und zeigt niedrige Zytotoxizität. Andere spezifische Beispiele von aktiven Verbindungen umfassen N₁-(2'-Deoxy-2'-fluor-β-L-arabinofuranosyl)-5-ethyluracil, N₁-(2'-Deoxy-2'-fluor-β-L-arabinofuranosyl)-5-iodcytosin und N₁-(2'-Deoxy-2'-fluor-β-L-arabinofuranosyl)-5-ioduracil.
In einer alternativen Ausführungsform wird ein L-Nukleosid für die Verwendung bei der Behandlung von HBV oder EBV bereitgestellt, das eine 2'-Arabino-hydroxylgruppe, beispielsweise L-Arathymidin, L-Fludarabin, L-Araguanosin und L-Arainosin, umfaßt, wie in 1 dargestellt.
Die hierin offenbarten L-Nukleoside und ihre pharmazeutisch akzeptablen Derivate oder pharmazeutisch akzeptable Formulierungen, die diese Verbindungen enthalten, sind bei der Vorbeugung und Behandlung von HBV-Infektionen und anderen verwandten Zuständen, wie Anti-HBV-Antikörper-positive und HBV-positive Zustände, chronischer Leberentzündung, verursacht durch HBV, Zirrhose, akute Hepatitis, fulminante Hepatitis, chronische andauernde Hepatitis und Müdigkeit, nützlich. Die Verbindungen können ebenso bei der Behandlung von mit EBV in Verbindung stehenden Störungen verwendet werden. Diese Verbindungen oder Formulierungen können ebenso prophylaktisch verwendet werden, um der Progression der klinischen Krankheit bei Individuen, die Anti-HBV- oder Anti-EBV-Antikörper- oder HBV- oder EBV-Antigen-positiv sind oder die HBV oder EBV ausgesetzt gewesen sind, vorzubeugen oder diese zu verzögern.
In einer anderen Ausführungsform kann die aktive Verbindung oder ihr Derivat oder Salz in Kombination oder Wechsel mit einem anderen Anti-HBV-Mittel oder Anti-EBV-Mittel, einschließlich den oben aufgelisteten, oder einem Anti-HIV-Mittel verab reicht werden. Im allgemeinen wird während der Wechseltherapie eine wirksame Dosis von jedem Mittel fortlaufend verabreicht, während in der Kombinationstherapie eine wirksame Dosis von zwei oder mehreren Mitteln zusammen verabreicht wird. Die Dosierungen werden von der Absorptions-, Inaktivierungs- und Exkretionsgeschwindigkeit des Arzneimittels sowie von anderen Faktoren, die dem Fachmann bekannt sind, abhängen. Es wird angemerkt, daß die Dosierungswerte ebenso mit der Schwere des Zustandes, der gelindert werden soll, variieren. Es ist außerdem selbstverständlich, daß für jeden einzelnen Patienten spezielle Dosierungsregime und -pläne über die Zeit gemäß der einzelnen Bedürfnisse und professionellen Beurteilung der Person, die die Verabreichung der Zusammensetzung verabreicht oder überwacht, eingestellt werden sollten.
Nicht-einschränkende Beispiele von Virostatika, die in Kombination mit den hierin offenbarten Verbindungen verwendet werden können, umfassen das (-)-Enantiomer von 2-Hydroxymethyl-5-(5-fluorcytosin-1-yl)-1,3-oxathiolan (FTC); das (-)-Enantiomer von 2-Hydroxymethyl-5-(cytosin-1-yl)-1,3-oxathiolan (3TC); Carbovir, Acyclovir, Interferon, AZT, DDI (2',3'-Dideoxyinosin), DDC (2',3'-Dideoxycytidin), L-DDC, L-5-F-DDC und D4T.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist eine Darstellung der ausgewählten L-Nukleoside, die innerhalb der vorliegenden Erfindung liegen:
L-FMAU (2'-Fluor-5-methyl-β-L-arabinofuranosyluridin), L-FIAU (2'-Fluor-5-iod-β-L-arabinofuranosyluridin), L-FC (2'-Fluor-β-L-arabinofuranosylcytosin), L-FIAC (2'-Fluor-5-iod-β-L-arabinofuranosylcytosin), L-2-Cl-2'-F-2'-Deoxyadenin, L-FEAU (2'-Fluor-5-ethyl-β-L-arabinofuranosyluridin), L-Arathymidin, L-Fludarabin, L-Araguanosin und L-Arainosin.
2 ist eine graphische Darstellung des Prozentsatzes an lebensfähigen Zellen gegen die Arzneimittelkonzentration von L-FMAU in H1-Zellen.
3 ist eine schematische Darstellung zur Herstellung von 1-O-Acetyl-2,3,5-tri-O-benzoyl-β-L-ribofuranose (Verbindung 10).
4 ist eine schematische Darstellung einer alternativen Herstellung von 1-O-Acetyl-2,3,5-tri-O-benzoyl-β-L-ribofuranose (Verbindung 10).
5 ist eine schematische Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung von 1,3,5-Tri-O-benzoyl-2-deoxy-2-fluor-α-L-arabinofuranose (Verbindung 13).
6 ist eine schematische Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung von N₉-[3',5'-Di-O-benzoyl-2'-deoxy-2'-fluor-β-L-arabinofuranosyl]-2,6-di-chlorpurin (Verbindung 15) und N₉-[2'-Deoxy-2'-fluor-β-L-arabinofuranosyl]-2,6-di-chlorpurin (Verbindung 16).
7 ist eine Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung von mehreren [2'-Deoxy-2'-fluor-β-L-arabinofuranosyl]-pyrimidinen (Verbindungen 17–24).
8 ist eine Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung von N₁-(2'-Deoxy-2'-fluor-β-L-arabinofuranosyl)-5-iodcytosin (Verbindung 22).
9 ist eine Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung von 9-β-L-Arabinofuranosyladenin.
10 ist eine Darstellung eines alternativen Wegs zur Herstellung von 1-O-Acetyl-2,3,5-tri-O-benzoyl-β-L-ribofuranose (Verbindung 10) aus 1,2-Di-O-isopropyliden-α-L-xylofuranose (Verbindung 3).
11 ist eine graphische Darstellung der Plasmakonzentration von L-(-)-FMAU bei Mäusen nach der oralen Verabreichung über die Zeit (Kreuz, 10 mg/kg verabreicht b.i.d. (zweimal täglich) für 29 Tage vor der pharmakokinetischen Studie, und dann wird die Studie an Tag dreißig der Verabreichung derselben Konzentration durchgeführt; dunkler Kreis, 50 mg/kg verabreicht b.i.d. für 29 Tage vor der Studie, und dann wurde die Studie an Tag dreißig der Verabreichung derselben Konzentra tion durchgeführt; offener Kreis, 50 mg/kg verabreicht für die erste Zeit am ersten Tag der Studie).
12 ist eine graphische Darstellung der Konzentration von L-(-)-FMAU in der Mausleber nach der oralen Verabreichung über die Zeit (Kreuz, 10 mg/kg verabreicht b.i.d. (zweimal täglich) für 30 Tage vor der pharmakokinetischen Studie, und dann wurde die Studie an Tag dreißig der Verabreichung derselben Konzentration durchgeführt; dunkler Kreis, 50 mg/kg verabreicht b.i.d. für 30 Tage vor der Studie, und dann wurde die Studie an Tag dreißig der Verabreichung derselben Konzentration durchgeführt; offener Kreis, 50 mg/kg verabreicht für die erste Zeit am ersten Tag der Studie).
13a stellt die Veränderung im Körpergewicht über dreißig Tage von weiblichen Kontroll-BDF1-Mäusen dar. 13b und 13c stellen die Veränderung im Körpergewicht über dreißig Tage von weiblichen BDF1-Mäusen dar, die mit 10 mg/kg b.i.d. (13b) und 50 mg/kg (13c) L-(-)-FMAU Dosis versorgt wurden. Das dargestellte Körpergewicht stellt die mittlere und Standardabweichung von den fünf bis sieben Mäusen dar.
14 bis 20 stellen die klinische Chemie von Mäuseplasma nach der Verabreichung von L-(-)-FMAU bei 10 mg/kg (drei Mäuse) oder 50 mg/kg (drei Mäuse) b.i.d. für dreizehn Tage bereit. 14 ist ein Balkendiagramm der Konzentration des gesamten Bilirubins in dem Mäuseplasma in mg/dL. 15 ist ein Balkendiagramm der Konzentration von Alkaliphosphatase in dem Mäuseplasma in U/L. 16 ist ein Balkendiagramm der Konzentration von Kreatinin in dem Mäuseplasma in mg/dL. 17 ist ein Balkendiagramm der Konzentration von AST (SGOT, Serum-Glutamin-Oxal-Transaminase) in dem Mäuseplasma in U/L. 18 ist ein Balkendiagramm der Konzentration von ALT (SGPT, Serum-Glutamn-Pyruvin-Transaminase) in dem Mäuseplasma in U/L. 19 ist ein Balkendiagramm der Konzentration von Milchsäure in dem Mäuseplasma in mmol/L. 20 ist ein Balkendiagramm der Konzentration der Milchsäuredehydrogenase in dem Mäuseplasma in U/L.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „enantiomer angereichert" auf eine Nukleosidzusammensetzung, die mindestens ungefähr 95% und bevorzugt ungefähr 97%, 98%, 99% oder 100% eines einzelnen Enantiomers des Nukleosids umfaßt.
Wie hierin verwendet, umfaßt der Ausdruck Alkyl speziell C₁- bis C₁₀-Alkylgruppen, einschließlich Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Isopropyl, Isobutyl, sec-Butyl, t-Butyl, Isopentyl, Amyl, t-Pentyl, Cyclopentyl und Cyclohexyl, ist aber nicht darauf beschränkt.
Wie hierin verwendet, umfaßt der Ausdruck Acyl speziell Acetyl, Propionyl, Butyryl, Pentanoyl, 3-Methylbutyryl, Hydrogensuccinat, 3-Chlorbenzoat, Benzoyl, Acetyl, Pivaloyl, Mesylat, Propionyl, Valeryl, Capron-, Capryl-, Caprin-, Milch-, Myristin-, Palmitin-, Stearin- und Ölsäure, ist aber nicht darauf beschränkt.
Wie hierin verwendet, und wenn nicht anderweitig definiert, bezieht sich der Ausdruck Aryl auf Phenyl.
Der Ausdruck „geschützt", wie hierin verwendet, und wenn nicht anderweitig definiert, bezieht sich auf eine Gruppe, die zu einem Sauerstoff- oder Stickstoffatom zugegeben wird, um ihre weitere Reaktion während des Verlaufs der Derivatisierung von anderen Einheiten in dem Molekül, in dem der Sauerstoff oder der Stickstoff lokalisiert sind, zu verhindern. Eine breite Vielzahl an Sauerstoff- und Stickstoffschutzgruppen sind dem Fachmann für organische Synthese bekannt.
Der Ausdruck Purin- oder Pyrimidinbase umfaßt Adenin, N⁶-Alkylpurine, N⁶-Acylpurine (wobei Acyl C(O)-Alkyl, -Aryl, -Alkaryl oder -Aralkyl ist), N⁶-Benzylpurin, N⁶-Halogenpurin, N⁶-Vinylpurin, N⁶-Acetylenpurin, N⁶-Acylpurin, N⁶-Hydroxyalkylpurin, N⁶-Thioalkylpurin, Thymin, Cytosin, 6-Azapyrimidin, 2-Mercaptopyrimidin, Uracil, N⁵-Alkylpyrimidine, N⁵-Benzylpyrimidine, N⁵-Halogenpyrimidine, N⁵-Vinylpyrimidin, N⁵-Acetylenpyrimidin, N⁵-Acylpyrimidin, N⁵-Hydroxyalkylpurin, N⁶-Thioalkylpurin, 5-Azacytidinyl, 5-Azauracilyl, Triazolopyridinyl, Imidazolopyridinyl, Pyrro lopyrimidinyl, Pyrazolopyrimidinyl, ist aber nicht darauf beschränkt. Funktionelle Sauerstoff- und Stickstoffgruppen an der Base können, wenn notwendig oder gewünscht, geschützt werden. Geeignete Schutzgruppen sind dem Fachmann allgemein bekannt, und umfassen Trimethylsilyl, Dimethylhexylsilyl, t-Butyldimethylsilyl und t-Butyldiphenylsilyl, Tritylmethyl, Alkylgruppen, Acylgruppen, wie Acetyl, Propionyl, Butyl, Methylsulfonyl und p-Toluylsulfonyl. Sie umfassen speziell 5-Methyluracil (Thymin), 5-Ioduracil, Cytosin und 5-Ethyluracil.
Die Erfindung, wie hierin offenbart, ist ein Verfahren und eine Zusammensetzung für die Behandlung von HBV-Infektion, EBV-Infektion und anderen Viren, die sich in ähnlicher Weise replizieren, bei Menschen oder anderen Wirtstieren, wie HIV, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge von einem oder mehreren der oben identifizierten L-Nukleoside, oder ein physiologisch akzeptables Derivat, oder ein physiologisch akzeptables Salz davon, gegebenenfalls in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger. Die Verbindungen dieser Erfindung besitzen entweder Anti-HBV-Aktivität, Anti-EBV-Aktivität, oder werden zu einer Verbindung oder Verbindungen metabolisiert, die Anti-HBV- oder Anti-EBV-Aktivität zeigen. Die hierin offenbarten Verbindungen können ebenso verwendet werden, um mit HBV und EBV in Verbindung stehende Störungen zu behandeln.
Die aktive Verbindung kann als irgendein Derivat verabreicht werden, das bei der Verabreichung an den Empfänger direkt oder indirekt die Stammverbindung bereitstellen kann, oder die selbst Aktivität zeigt. Nicht-einschränkende Beispiele sind die pharmazeutisch akzeptablen Salze (alternativ bezeichnet als „physiologisch akzeptable Salze"), und die 5'- und Purin- oder Pyrimidin-acylierten oder -alkylierten Derivate der aktiven Verbindung (alternativ bezeichnet als „physiologisch aktive Derivate"). In einer Ausführungsform ist die Acylgruppe ein Carbonsäureester (d. h., -C(O)R'), worin die Nicht-Carbonyleinheit (R') der Estergruppe ausgewählt ist aus geradem, verzweigtem oder cyclischem C₁- bis C₁₀-Alkyl, Alkoxyalkyl, einschließlich Methoxymethyl, Aralkyl, einschließlich Benzyl, Aryloxyalkyl, wie Phenoxymethyl, Aryl, einschließlich Phenyl, gegebenenfalls substituiert mit Halogen, C₁- bis C₄-Alkyl oder C₁- bis C₄-Alkoxy, Sulfonatester, wie Alkyl oder Aralkylsulfonyl, einschließlich Methansulfonyl, der Mono-, Di- oder Triphosphatester, Trityl oder Monomethoxytrityl, subsituiertes Benzyl, Trialkylsilyl (z. B. Dimethyl-t-butylsilyl) oder Diphenylmethylsilyl. Arylgruppen in den Estern umfassen optimalerweise eine Phenyl- oder Benzylgruppe. Die Alkylgruppe kann gerade, verzweigt oder cyclisch sein, und ist optimalerweise eine C₁- bis C₁₀-Gruppe.
I. Synthese von L-Nukleosiden
Die hierin offenbarten L-Nukleoside können, wie nachstehend ausführlich beschrieben, oder durch andere Assays, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden.
In den nachstehend beschriebenen Syntheseschemen können andere Standardreagenzien, einschließlich äquivalenter Säuren, Basen und Lösungsmittel anstelle der genannten verwendet werden, wie für den Fachmann bekannt. Ein breiter Bereich an Schutzgruppen für Sauerstoff oder Stickstoff kann verwendet werden, und wird beispielsweise in Greene, et al., „Protective Groups in Organic Synthesis," John Wiley and Sons, 2. Auflage, 1991 offenbart. Geeignete Sauerstoff- und Stickstoffschutzgruppen umfassen beispielsweise eine trisubsitutierte Silylgruppe, wie Trimethylsilyl, Dimethylhexylsilyl, t-Butyldimethylsilyl, t-Butyldiphenylsilyl, Trityl, Alkylgruppe, Acylgruppen, wie Acetyl, Propionyl, Benzoyl, p-NO₂-Benzoyl, Benzyl oder Toluyl, Methylsulfonyl oder p-Toluylsulfonyl. Funktionelle Sauerstoff und Stickstoffgruppen an der heterocyclischen Base sollten vor der Kondensation mit dem Zucker geschützt werden.
Geeignete Reduktionsmittel umfassen NaBH₄, Diisobutylaluminiumhydrid (DIBAL-H), Lithiumtetrahydridoborat (LiBH₄) und Natrium-bis(2-methoxyethoxy)-aluminiumhydrid (Red-Al). Geeignete Oxidationsmittel umfassen wässerige saure Chromsäure (CrO₃), Natriumdichromat (Na₂CrO₇), Pyridiniumchlorchromat (PCC), Pyridiniumdichromat (PDC), Kaliumpermanganat (KMnO₄), Bleitetraacetat/Pyridin, Sauerstoff über einen Platin/Kohlenstoffkatalysator, RuO₄, RuO₄/NaIO₄, Dimethylsulfoxid/Dicyclohexylcarbodiimid (DMSO/DCC) und einen Protonendonator, Silbercarbonat, Triphenylbismuthcarbonat, Oppenauer-Oxidation (Aluminumalkoxide in Aceton) und Mangandioxid (zur selektiven Oxidation von Allyl- oder Benzylalkoholen in Gegenwart von anderen Alkoholen).
Friedel-Crafts-Katalysatoren (Lewis-Säuren), die bei der Kondensationsreaktion verwendet werden können, umfassen SnCl₄, ZnCl₄, TiCl₄, AlCl₃, FeCl₃, BF₃-Diethylether und BCl₃. Diese Katalysatoren erfordern wasserfreie Bedingungen, da die Gegenwart von Wasser ihre Aktivität verringert. Die Katalysatoren werden ebenso in Gegenwart von organischen Lösungsmitteln mit aktiven Wasserstoffen, wie Alkoholen und organischen Säuren, inaktiviert. Die Katalysatoren werden typischerweise in Lösungsmitteln verwendet, wie Kohlenstoffdisulfid, Methylenchlorid, Nitromethan, 1,2-Dichlorethan, Nitrobenzol, Tetrachlorethan, Chlorbenzol, Benzol, Toluol, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran, Dioxan oder Acetonitril. Wasserfreies Aluminiumchlorid ist in Kohlenstoffdisulfid nicht löslich. Niedballa, et al., J. Org. Chem. 39, 25 (1974). Der bevorzugte Katalysator ist SnCl₄. Das bevorzugte Lösungsmittel ist 1,2-Dichlorethan. Trimethylsilyltriflat kann unter denselben Bedingungen, die oben für die Friedel-Crafts-Katalysatoren beschrieben sind, verwendet werden. Die Reaktion verläuft bei einem Temperaturbereich von –10 °C bis 200 °C. Die Desilylierung kann mit einer Vielzahl von Reagenzien durchgeführt werden, einschließlich Essigsäure, Trifluoressigsäure, Fluorwasserstoff, n-Tetrabutylammoniumfluorid, Kaliumfluorid und Pyridinium-HCl.
In bezug auf 3, ausgehend von L-Xylose (1a), wurde das Schlüsselzwischenprodukt 1-O-Acetyl-2,3,5-tri-O-benzoyl-β-L-ribofuranose (10) in einer Gesamtausbeute von 20% synthetisiert (L. Vargha, Chem. Ber., 1954, 87, 1351; Holy, A., et al., Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry, Band 1, 163–67). Wie in 4 gezeigt, kann die Verbindung 10 ebenso aus dem teureren Ausgangsmaterial L-Ribose synthetisiert werden (Holy, A., et al., Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry, Band 1, 163–67). 3 stellt eine alternative Synthese der Verbindung 10 dar (Ausbeute 53%), die anschließend an C₂ fluoriert wurde (J. Org. Chem. 1985, 50, 3644–47), um 1,3,5-Tri-O-benzoyl-2-deoxy-2-fluor-L-arabinofuranose (13) zu erhalten, die mit unterschiedlichen Basen durch den Bromzucker kondensiert wurde, um die 2'-Deoxy-2'-fluor-arabinofuranosylnukleoside in verschiedenen Ausbeuten bereitzustellen.
Die folgenden Verbindungen, die fett und nachstehend mit einer Zahl in Klammern versehen sind, sind Zwischenprodukte für die Herstellung von Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung.
1,2-Di-O-isopropyliden-α-L-xylofuranose (3)
Zu 650 ml wasserfreiem Aceton wurden 4 ml konz. Schwefelsäure, 5 g Molekularsieb (4A), 80 g wasserfreies Kupfer(II)-sulfat und 50 g L-Xylose zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 36 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und gründlich mit Aceton gewaschen, das vereinigte Filtrat wurde mit Ammoniumhydroxid neutralisiert, dann zur Trockne eingedampft. Ethylacetat (200 ml) wurde zugegeben, dann filtriert und eingedampft, wodurch ein Öl erhalten wurde, das in 250 ml einer 0,2%igen HCl-Lösung gelöst und bei Raumtemperatur für 2,5 Stunden gerührt wurde. Der pH wurde auf 8 mit ges. NaHCO₃ eingestellt, dann zur Trockne eingedampft, der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die Entfernung des Lösungsmittels lieferte ein gelbes Öl der Verbindung 3 (41,7 g, 82,3%).
¹H-NMR (CDCl₃): δ 5,979 (d, J = 3,78 Hz, 1H, H-1); 4,519 (d, J = 3,6 Hz, 1H, H-2); 4,308 (bd, 1H, H-3); 4,080 (m, 3H, H-4 und H-5); 1,321 (s, 3H, CH₃); 1,253 (s, 3H, CH₃).
1,2-Di-O-isopropyliden-3,5-di-O-o-tolylsulfonyl-α-L-xylofuranose (4)
Verbindung 3 (40 g, 210 mmol) wurde in 500 ml wasserfreiem Pyridin bei 0 °C gerührt, während TsCl (75 g, 393 mmol), gelöst in 100 ml CHCl₃, tropfenweise zugegeben wurde. Nach 3 Stunden wurde ein anderer Teil von TsCl (50 g, 262 mmol) in 50 ml CHCl₃ zugegeben, dasselbe wie oben. Das Gemisch wurde bei RT für 24 h gerührt, dann auf 0 °C abgekühlt, Wasser (10 ml) wurde zugegeben, dann bei RT für 30 Minuten gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in 500 ml Eiswasser gegossen, mit CHCl₃ (150 ml × 4) extrahiert, mit 1,5M H₂SO₄ (150 ml × 4), ges. NaHCO₃ (200 ml × 2) gewaschen, getrocknet (MgSO₄). Das Entfernen des Lösungsmittels ergab einen braunen Sirup, der bei der Kristallisierung aus EtOH 4 als weißen Feststoff ergab (103,8 g, 99%).
¹H-NMR (CDCl₃): δ 7,282, 7,836 (m, 8H, OTs); 5,849 (d, J = 3,51 Hz, 1H, H-1); 4,661, 4,779 (m, 2H, H-3 und H-4); 4,193 (dd, 1H, H-2); 4,011 (d, 2H, H-5); 2,448, 2,478 (2s, 6H, -OTs); 1,261, 1,320 (2s, 6H, CH₃).
1,2-Di-O-acetyl-3,5-di-O-p-tolylsulfonyl-α,β-xylofuranose (5)
Die Verbindung 4 (70 g, 140,5 mmol) wurde in 700 ml Eis-AcOH und 100 ml Ac₂O gelöst, während 50 ml konz. Schwefelsäure tropfenweise bei 0 °C zugegeben wurden. Die resultierende Lösung wurde bei RT über Nacht gerührt und dann in 1 l Eiswasser gegossen, mit CHCl₃ (200 ml × 4) extrahiert, mit ges. NaHCO₃ gewaschen, getrocknet (MgSO₄). Nach der Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum wurde 5 als Sirup erhalten (84,2 g, Rohausbeute 110%).
Methyl-3,5-di-O-p-tolylsulfonyl-α,β-xylofuranose (6)
Das rohe 5 (80 g) wurde in 500 ml 1%igem HCl/CH₃OH bei RT für 30 h gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, der Rückstand in 300 ml CHCl₃ gelöst, mit ges. NaHCO₃ gewaschen, getrocknet (MgSO₄). Die Entfernung des Lösungsmittels ergab 6 als Sirup (60 g, 90% aus 4).
Methyl-2-O-benzoyl-3,5-di-O-p-tolylsulfonyl-α,β-xylofuranosid (7)
Der Sirup 6 (60 g, 127 mmol) wurde in 200 ml Pyridin gelöst und bei 0 °C gerührt, während Benzoylchlorid (40 ml, 345 mmol) tropfenweise zugegeben wurde, die resultierende Lösung wurde bei RT für 17 h gerührt. Sie wurde auf etwa 50 ml konzentriert, dann in 300 ml Eiswasser gegossen, mit CHCl₃ extrahiert, mit 3N H₂SO₄ und ges. NaHCO₃ gewaschen, getrocknet (MgSO₄). Nach der Eindampfung des Lösungsmittels wurde 7 als Sirup erhalten (71 g, 97%).
Methyl-2,3,5-tri-O-benzoyl-α-β-L-ribofuranosid (9)
Der Sirup 7 (70 g) und Natriumbenzoat (100 g, 694 mmol) wurden in 1200 ml DMF suspendiert und unter Rückfluß für 16 h mechanisch gerührt. Er wurde auf RT abgekühlt und dann in 1 l Eiswasser gegossen, mit Ether extrahiert, getrocknet (MgSO₄). Die Eindampfung des Lösungsmittels ergab einen Sirup (50 g, 8a und 8b), der in 180 ml Pyridin gelöst und für 17 h bei RT benzoyliert wurde (BzCl, 20 ml, 172 mmol). Nach der Aufarbeitung wurde 9 als brauner Sirup erhalten (48 g, 83% aus 7).
1-O-Acetyl-2,3,5-tri-O-benzoyl-β-L-ribofuranose (10)
Die Verbindung 9 (26 g, 54,6 mmol) wurde mit 275 ml Eisessig, 55 ml Essigsäureanhydrid und 16 ml konz. Schwefelsäure bei 0 °C bis RT für 17 h behandelt, dann in 1 l Eiswasser gegossen, mit Chloroform (200 ml × 4) extrahiert. Das vereinigte Extrakt wurde mit ges. NaHCO₃ gewaschen und getrocknet (MgSO₄). Das Entfernen des Lösungsmittels ergab einen braunen Sirup, der mit Ethanol behandelt wurde, wodurch 10 als ein weißer Feststoff erhalten wurde. (8,8 g, 32%). Smp. 124,7 °C, Lit. 129–130 °C; D-Form: 130–131 °C [α]_D = –45,613 (c 1,0, CHCl₃), D-Form: [α]_D = +44,2.
¹H-NMR (CDCl₃): δ 7,317, 8,134 (m, 15H, OBz); 6,437 (s, 1H, H-1); 5,835 (m, 2H, H-2 und H-3); 4,649 (m, 3H, H-4 und H-5); 2,003 (s, 3H, CH ₃COO-).
1-O-Acetyl-2,3,5-tri-O-benzoyl-β-L-ribofuranose (aus L-Ribose)
L-Ribose (5 g, 33,3 mmol) wurde in 120 ml 1%igem HCl/MeOH suspendiert und bei RT für 3 h gerührt, bis eine klare Lösung erhalten wurde. Die Reaktion wurde durch Zugeben von 30 ml wasserfreiem Pyridin gequencht, dann unter reduziertem Druck eingedampft. Der resultierende Sirup wurde mit Pyridin (30 ml × 2) coeingedampft, dann in 80 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und bei 0 °C gerührt, während Benzoylchlorid (20 ml, 172 mmol) tropfenweise zugegeben wurde. Nach dem Rühren bei RT für 17 h wurde die Reaktion beendet. Wasser (10 ml) wurde zugegeben und das Gemisch wurde bei RT für 0,5 h gerührt, dann auf etwa 50 ml konzentriert, in 150 ml Eiswasser gegossen, mit Chloroform (50 ml × 4) extrahiert, nacheinander mit 3N H₂SO₄ (30 ml × 2), ges. NaHCO₃ (30 ml × 3) gewaschen und getrocknet (MgSO₄). Die Entfernung des Lösungsmittels ergab 9 als Sirup mit 13 g.
Das rohe 9 wurde in 80 ml HBr/AcOH gelöst (45%, G/V) und bei RT für 1,5 h gerührt. Zu diesem Gemisch wurde Eisessig (50 ml) zugegeben, und die resultierende Lösung bei 0 °C gerührt, während 34 ml Wasser langsam zugegeben wurden, um die Temperatur unter 7 °C zu halten. Es wurde dann bei RT für 1 h gerührt, in 200 ml Eiswasser gegossen, mit Chloroform (50 ml × 5) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit ges. NaHCO₃ gewaschen, getrocknet (MgSO₄). Die Entfernung des Lösungsmittels ergab einen Sirup (13 g), der in 40 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und bei 0 °C gerührt wurde. Essigsäureanhydrid (14 ml, 148,4 mmol) wurde dann tropfenweise zugegeben. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde es in 150 ml Eiswasser gegossen, mit Chloroform (50 ml × 4) extrahiert, nacheinander mit 3N H₂SO₄ (30 ml × 2), ges. NaHCO₃ (50 ml × 2) gewaschen und getrocknet (MgSO₄). Die Ent fernung des Lösungsmittels und die Behandlung mit Methanol ergab 10 als weißen Feststoff (9,2 g, 53,7% aus L-Ribose).
1,3,5-Tri-O-benzoyl-α-L-ribofuranose (11)
Die Verbindung 10 (9 g, 17,84 mmol) wurde in 100 ml CH₂Cl₂ bei 0 °C gerührt, während 70 ml CH₂Cl₂, enthaltend HBr (3,2 g, 30,5 mmol), in einem Teil zugegeben wurde. Das Gemisch wurde bei 0 °C für 3,5 h gerührt, Wasser (55 ml) wurde zugegeben und das Gemisch bei RT für 18 h gerührt. Die organische Schicht wurde abgetrennt, mit ges. NaHCO₃ gewaschen und getrocknet (MgSO₄). Nach der Eindampfung des Lösungsmittels wurde ein Schaum erhalten, der bei der Umkristallisierung aus CH₂Cl₂ und n-Hexan 11 als weißen Feststoff ergab. (6,2 g, 75,5 %). Smp. 137–138 °C, Lit. 140–141 °C, [α]_D = –81,960 (c 0,55, CHCl₃; D-Form: [a]_D = +83,71.
¹H-NMR (CDCl₃): δ 7,312, 8,187 (m, 15H, OBz); 6,691 (d, J = 4,59 Hz, H-1); 5,593 (dd, J_4-3 = 6,66 Hz; J_2-3 = 1,8 Hz, 1H, H-30); 4,637, 4,796 ^ (m, 4H, H-2, H-4 und H-5); 2,3 (b, OH).
1,3,5-Tri-O-benzoyl-2-O-imidazosulfuryl-α-L-ribofuranose (126
Die Verbindung 11 (5,94 g, 12,84 mmol) wurde in 50 ml wasserfreiem CH₂Cl₂ bei –15 °C gerührt (Trockeneis-CCl₄). Wasserfreies DMF (15 ml) und Sulfurylchlorid (3,2 ml, 3,98 mmol) wurden nacheinander zugegeben. Die Lösung wurde bei –15 °C für 30 Minuten gerührt und dann bei RT für 4 h stehengelassen. Imidazol (8,7 g, 12,78 mmol) wurde in drei Teilen zugegeben, während das Reaktionsgemisch in einem Eisbad abgekühlt wurde. Es wurde dann bei RT für 17 h gerührt. Das Gemisch wurde in 150 ml Eiswasser gegossen und die Wasserphase mit CH₂Cl₂ (50 ml × 3) extrahiert. Die vereinigte organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen und getrocknet (MgSO₄). Die Reinigung durch eine Säule (Hexan : EtOAc/5 : 1–1 : 1) ergab 12 als weißen Feststoff (3,7 g, 49%). Smp. 124,5–125,5 °C, Lit.: 129 °C; [α]_D = –68,976; D-Form: +66,154.
¹H-NMR (CDCl₃): δ 6,9, 8,2 (m, 18H, Ar-H); 6,67 (d, J = 4,4 Hz, 1H, H-1); 5,59 (dd, 1H, H-3), 5,21 (dd, 1H, H-2); 4,5, 4,8 (m, 3H, H-4 und H-5).
1,3,5-Tri-O-benzoyl-2-deoxy-2-fluor-α-L-arabinofuranose (13)
Eine Suspension aus 12 (3,33 g, 5,62 mmol), KHF₂ (1,76 g, 22,56 mmol) in 30 ml 2,3-Butandiol wurde unter Argon gerührt. Sie wurde auf 150 °C erhitzt, während 1 ml HF/H₂O (48%, 27,6 mmol) zugegeben wurde, und das Gemisch wurde bei 160 °C für 1,5 h gerührt. Salzlösung-Eis wurde zugegeben, um die Reaktion zu quenchen, und dann wurde die Lösung mit Methylenchlorid (50 ml × 4) extrahiert. Das vereinigte Extrakt wurde mit Salzlösung, Wasser, ges. NaHCO₃ gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat und Aktivkohle (Darco-60) getrocknet. Es wurde auf ein Kieselgelpad (5 cm × 5 cm) gegossen, mit Methylenchlorid und dann EtOAc gewaschen, wodurch ein Sirup erhalten wurde, der aus 95% EtOH 13 (1,3 g, 49,8%) kristallisierte. Smp. 77–78 °C; Lit.: 82 °C.
¹H-NMR (CDCl₃): δ 7,314, 8,146 (m, 15H, OBz); 6,757 (d, J = 9,1 Hz, 1H, H-1); 5,38 (d, J = 48,5 Hz, 1H, H-2); 5,630 (dd, J = 22,5 Hz, 1H, H-3); 4,768 (m, 3H, H-4 und H-5).
N₉-[3',5'-Di-O-benzoyl-2'-deoxy-2'-fluor-β-L-arabinofuranosyl]-2,6-di-chlor-purin (15)
Die Verbindung 13 (464 mg, 1 mmol) wurde in 10 ml Methylenchlorid gelöst, während 1,4 ml HBr/AcOH (45% G/V) zugegeben wurden. Die Lösung wurde bei RT für 24 h gerührt, und dann zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 20 ml Methylenchlorid gelöst, und mit Wasser, ges. NaHCO₃ gewaschen, getrocknet (MgSO₄). Die Filtration und Eindampfung ergaben Bromzucker 14 (100%, basierend auf DC).
Zum selben Zeitpunkt wurde 2,6-Di-chlor-purin (378 mg, 2 mmol) in 15 ml HMDS und 2 mg Ammoniumsulfat suspendiert und dann für 2 h unter Rückfluß erhitzt. Das HMDS wurde unter hohem Vakuum unter N₂ eingedampft, wodurch die weiße silylierte Base erhalten wurde.
Der Bromzucker 14 wurde in 25 ml wasserfreiem 1,2-Dichlorethan gelöst. Die resultierende Lösung wurde zu der silylierten Base unter N₂ zugegeben. Das Gemisch wurde unter Rückfluß für 2 Tage gerührt. Chloroform (30 ml) wurde zugegeben, und dann nacheinander mit Wasser (20 ml × 2), ges. NaHCO₃ (20 ml × 2), ges. NaCl-Lösung (20 ml × 2) gewaschen und getrocknet (MgSO₄). Aus CHCl₃ kristallisierte die Verbindung 15 (105 mg, 19,7%). Smp. 158 °C; D-Form: 158 °C. UV (Methanol): λ_max: 238,50 nm, 273,0 nm.
¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 8,82 (d, J = 1,5 Hz, 1H, H-8); 7,49, 8,33 (m, 10H, OBz); 6,767 (dd, J_H-H = 4 Hz, K_F-H = 13,8 Hz, 1H, H-1'); 5,854 (dq, J = 67,4 Hz, 1H, H-2'); 5,910 (m, 1H, H-3'); 4,751 (m, 3H, H-4' und H-5').
N₉[2'-Deoxy-2'-fluor-β-L-arabinofuranosyl]-2,6-di-chlorpurin (16)
Die Verbindung 15 (70 mg, 0,13 mmol) wurde in 25 ml ges. NH₃/CH₃OH in einer verschlossenen Stahlbombe gelöst und bei 90 °C für 6 h erhitzt. Die Entfernung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck ergab einen gelben Halbfeststoff, der durch präparative DC gereinigt wurde (9 : 1/CHCl₃ : CH₃OH). Die Lyophilisierung von Wasser und 1,4-Dioxan ergab ein weißes Pulver 16 (30 mg, 75%). UV(H₂O) pH2, λ_max 212,00 nm, 263,50 nm (ε 6711); pH7, λ_max 213,50 nm, 263,00 nm (ε 7590); pH11, λ_max 213,5 nm, 263,00 nm (ε 5468).
¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 8,279 (d, J = 1,5 Hz, 1H, H-8); 7,908 (bs, 2H, NH₂); 6,321 (dd, J_H-H = 4,4 Hz, J_F-H = 13,8 Hz, 1H, H-1'); 5,986 (t, 1H, 5'-OH); 5,230 (dt, J_F-H = 52,6 Hz, 1H, H-2'); 5,115 (d, 1H, 3'-OH); 4,425 (dq, J_F-H = 19 Hz, 1H, H-3'); 3,841 (m, 1H, H-4'); 3,636 (d, 2H, H-5').
N₁-(2'-Deoxy-2'-fluor-3',5'-di-O-benzyl-β-L-arabinofuranosyl)-thymin (17)
Zu einer Lösung aus 13 (400 mg, 0,86 mmol) in wasserfreiem CH₂Cl₂ (10 ml) wurde Bromwasserstoff in Essigsäure (45% G/V, 1,5 ml) zugegeben, und die resultierende Lösung wurde bei RT für 17 h gerührt. Nach der Eindampfung des Lösungsmittels und Coeindampfung mit Toluol wurde die Verbindung 14 erhalten.
Zum selben Zeitpunkt wurde Thymin (215 mg, 1,72 mmol) unter Rückfluß in HMDS (25 ml) unter Stickstoff für 17 h erhitzt, wodurch eine homogene Lösung erhalten wurde. Die Eindampfung des Lösungsmittels ergab silyliertes Thymin.
Eine Lösung aus 14 in Dichlorethan (50 ml) wurde zu dem silylierten Thymin zugegeben, und die resultierende Lösung wurde unter Stickstoff für 3 Tage unter Rückfluß erhitzt. Wasser wurde zugegeben und dann mit CHCl₃ extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Wasser, Salzlösung gewaschen und getrocknet (MgSO₄). Die Eindampfung des Lösungsmittels ergab das Rohprodukt, das durch präparative DC unter Verwendung von 2% MeOH/CHCl₃ gereinigt wurde, wodurch 17 (235 mg, 58%) erhalten wurde. Smp. 99–101 °C. UV (Methanol): 230, 264 nm [α]_D = +22,397.
¹H-NMR (CDCl₃): δ 7,343–8,389 (m, 12H, Ar-H, NH); 6,34 (dd, J_H-H = 2,97 Hz, J_F-H = 28,32 Hz, 1H, H-1'); 5,383 (dd, J_H-H = 2,7 Hz, J_F-H = 63,27 Hz, 1H, H-2'); 5,565 (dd, 1H, H-3'); 4,812 (d, 2H, H-5'); 4,466 (m, 1H, H-4'); 1,775 (s, 3H, CH₃), Anal. (C₂₄H₂₁N₂O₇F), C: 61,01; H: 4,57; N: 5,73; F: 3,92.
N₁-(2'-Deoxy-2'-fluor-β-L-arabinofuranosyl)-thymin (18)
Die Verbindung 17 (145 mg, 0,309 mmol) wurde mit NH₃/CH₃OH bei RT für 18 h behandelt. Nach der Eindampfung des Lösungsmittels und der Reinigung durch präparative DC (15% MeOH/CHCl₃) wurde 18 (70 mg, 87,5%) erhalten. Smp. 174–175 °C. UV: 264 nm, [α]_D = –104,36.
¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 11,401 (s, 1H, NH); 7,575 (s, 1H, H-6); 6,093 (dd, J_H-H = 4,41 Hz, J_F-H = 15,6 Hz, H-1'); 5,844 (d, 1H, 3'-OH); 5,019 (dt, J_F-H = 53,3 Hz, 1H, H-2'); 5,087 (t, 1H, 5'-OH); 4,194 (dq, 1H, H-3'); 3,647 (m, 3H, H-4' und H-5'); 1,781 (s, 3H, CH³), Anal. (C₁₀H₁₃N₂FO₅), C: 44,80; H: 4,97; N: 10,04; F: 7,03.
N₁-(2'-Deoxy-2'-fluor-3',5'-di-O-benzoyl-β-L-arabinofuranosyl)-5-ethyluracil (19)
Zu einer Lösung aus 13 in wasserfreiem Dichlormethan (10 ml) wurde Bromwasserstoff in Essigsäure zugegeben (45% G/V), 0,97 ml, 5,385 mmol). Die Lösung wurde bei RT für 18 h gerührt, nach der Eindampfung des Lösungsmittels und Coeindampfung mit Toluol wurde 14 erhalten.
Zum selben Zeitpunkt wurde 5-Ethyluracil (0,75 g, 5,39 mmol) in HMDS (10 ml) mit Ammoniumsulfat (5 mg) suspendiert und unter Rückfluß für 5 h unter Stickstoff erhitzt, wodurch eine homogene Lösung erhalten wurde.
Die silylierte Basenlösung wurde zur Trockne eingedampft, wobei der Kontakt mit Feuchtigkeit vermieden wurde. Zu dem erhaltenen Sirup wurde eine Lösung aus 14 in wasserfreiem 1,2-Dichlorethan (10 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 95 °C unter Stickstoff für 20 h gerührt, dann unter Vakuum zur Trockne einge dampft, wodurch ein gelber Feststoff erhalten wurde, der mit 5 ml CH₃OH/CHCl₃ (1 : 1) gemischt und filtriert wurde. Das Filtrat wurde eingedampft, wodurch ein Rückstand erhalten wurde, der auf einer Kieselgelsäule chromatographiert wurde (CH₃OH/CHCl₃, 0–1%), wodurch ein weißer Feststoff 19 erhalten wurde (0,557 g, 100%).
¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 11,55 (s, 1H, NH); 7,51, 8,08 (m, 10H, Ar-H); 7,32 (s, 1H, H-6); 6,29, 6,37 (dd, J_H-H = 3,7 Hz, J_F-H = 20 Hz, 1H, H-1'); 5,68–5,75 (dd, J_F-H = 20 Hz, 1H, H-3'), 5,47–5,65 (dd, J_F-H = 54 Hz, 1H, H-2'); 4,62–4,83 (m, 3H, H-4' und H-5'); 2,01, 2,09 (q, 2H, CH ₂-CH₃); 0,85 (t, 3H, CH₃).
N₁-(2'-Deoxy-2'-fluor-β-L-arabinofuranosyl)-5-ethyluracil (20)
Die Verbindung 19 (500 mg) wurde in methanolischem Ammoniak (50 ml) gelöst und bei RT für 44 h gerührt. Die Lösung wurde zur Trockne eingedampft, wodurch ein weißer Feststoff (0,4 g) erhalten wurde, der auf einer Kieselgelsäule chromatographiert wurde (CH₃OH/CHCl₃, 0–5%), wodurch ein weißer Feststoff 20 erhalten wurde (240 mg, 84%). Smp. 158–161 °C. UV (MeOH): λ_max 260 nm.
¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 11,42 (s, 1H, NH); 7,57 (s, 1H, H-6'); 6,10, 6,17 (dd, J_H-H = 5,0 Hz, J_F-H = 14 Hz, 1H, H-1'); 5,88 (bs, 1H, 3'-OH); 5,14, 5,19 (m, 2H, H-2' und 5'-OH); 4,98 (t, 1H, H-3'); 4,22, 4,28 (m, 1H, H-4'); 3,55, 3,78 (m, 2H, H-5') Anal. (C₁₁H₁₅N₂O₅F): C: 47,93; H: 5,56; N: 10,06; F: 6,68.
N₁-(2'-Deoxy-2'-fluor-3',5'-di-O-benzoyl-β-L-arabinofuranosyl)-N⁴-benzoyl-5-iodcytosin (21)
Zu einer Lösung aus 13 (150 mg, 0,323 mmol) in wasserfreiem Methylenchlorid (5 ml) wurde Bromwasserstoff in Essigsäure (45% G/V, 0,29 ml, 1,615 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei RT für 9,5 h gerührt. Nach dem Eindampfen des Lösungsmittels und Coeindampfen mit Toluol wurde 15 als gelber Sirup erhalten.
Zum selben Zeitpunkt wurde N⁴-Benzoyl-5-iodcytosin (550 mg, 1,615 mmol) in HMDS (8 ml) mit Ammoniumsulfat (3 mg) suspendiert und unter Rückfluß für 5 h unter Stickstoff erhitzt, wodurch eine homogene Lösung erhalten wurde.
Die silylierte Basenlösung wurde zur Trockne eingedampft, wobei der Kontakt mit Feuchtigkeit vermieden wurde. Zu dem erhaltenen Sirup wurde eine Lösung aus 14 in wasserfreiem 1,2-Dichlorethan (10 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde unter Stickstoff für 23 h unter Rückfluß erhitzt, dann zur Trockne eingedampft, wodurch ein brauner Sirup erhalten wurde, der mit Chloroform (30 ml) verrieben wurde. Der resultierende Niederschlag wurde abfiltriert und mit Chloroform gewaschen. Das Filtrat und die Waschungen wurden vereinigt und eingedampft, wodurch ein brauner Sirup erhalten wurde. Das Produktgemisch wurde durch Chromatographie auf einer Kieselgelsäule abgetrennt (CH₃OH/CHCl₃, 0–1%), wodurch ein weißer Feststoff 21 erhalten wurde (100 mg, 45%).
¹H-NMR (CDCl₃): δ 11,40 (bs, 1H, NH): 7,26, 8,20 (m, 17H, Ar-H, H-6 und NH); 6,36, 6,44 (dd, J_H-H = 2,8 Hz, J_F-H = 21 Hz, 1H, H-1'); 5,62, 5,68 (dd, 1H, H-3'); 5,39, 5,56 (dd, 1H, H-2'); 4,58, 4,85 (m, 3H, H-4' und H-5').
N₁-(2'-Deoxy-2'-fluor-β-L-arabinofuranosyl)-5-iodcytosin (22)
Die Verbindung 21 (100 mg, 0,27 mmol) wurde mit ges. NH₃/MeOH (60 ml) bei RT für 24 h behandelt. Die Kieselgelsäulenchromatographie (0–10% CH₃OH/CHCl₃) ergab die Verbindung 22 (35 mg, 71%) als weißen Feststoff. [α]_D = –65,4 (c 0,34, CH₃OH); UV (MeOH): λ_max = 293 nm.
¹H-NMR (DMSO-d₆); δ 8,04 (s, 1H, H-6); 6,74, 7,94 (s, 1H, NH); 6,01, 6,08 (dd, J_H-H = 3,9 Hz, J_F-H = 16,6 Hz, 1H, H-1'); 5,85 (d, 1H, 3'-OH); 5,17 (t, 1H, 5'-OH); 5,08 (t, 1H, H-2'); 4,89 (t, 1H, H-3'); 4,15–4,23 (m, 1H, H-4'); 3,63–3,79 (m, 2H, H-5').
N₁-(2'-Deoxy-2'-fluor-3',5'-di-O-benzoyl-β-L-arabinofuranosyl)-5-ioduracil (23)
Zu einer Lösung aus 13 (260 mg, 0,56 mmol) in 10 ml wasserfreiem CH₂Cl₂ wurde HBr/AcOH (45%, G/V, 0,5 ml, 2,8 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei RT für 36 h gerührt, und dann zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 20 ml CH₂Cl₂ gelöst, mit Wasser (10 ml), ges. NaHCO₃ (10 ml) gewaschen und getrocknet (MgSO₄). Die Filtration und Eindampfung ergab den Bromzucker 14 als Sirup.
Zum selben Zeitpunkt wurde 5-Ioduracil (270 mg, 1,12 mmol) in 10 ml HMDS suspendiert und unter Rückfluß für 36 h erhitzt, wodurch eine homogene Lösung erhal ten wurde. Sie wurde unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Dazu wurde eine Lösung aus 14 in wasserfreiem 1,2-Dichlorethan zugegeben, und die resultierende Lösung wurde unter N₂ für 1,5 Tage unter Rückfluß erhitzt. CHCl₃ (20 ml) wurde zugegeben, und die Lösung wurde nacheinander mit Wasser (10 ml), Salzlösung (10 ml) und ges. NaHCO₃ (10 ml) gewaschen und dann getrocknet (MgSO₄). Die Entfernung des Lösungsmittels ergab einen Sirup, der in CH₂Cl₂ kristallisierte, wodurch 23 als gelber Feststoff erhalten wurde (237 mg, 73%). Ein Teil davon (70 mg) wurde aus 2-Isopropanol umkristallisiert, wodurch ein weißer Feststoff (67 mg) erhalten wurde. UV (Methanol): λ_max 230,0 nm, 276,0 nm.
¹H-NMR (CDCl₃): δ 8,4, 7,3 (m, 12H, Ar-H); 6,29 (dd, J_H-H = 2,43 Hz, J_F-H = 21,6 Hz, 1H, H-1'); 5,377 (dd, J_H-H = 2,8 Hz, J_F-H = 61,3 Hz, 1H, H-2'); 5,55 (dd, 1H, H-3'); 4,865, 4,793 (d, 2H, H-5'); 4,588, 4,502 (m, 1H, H-4').
N₁-(2'-Deoxy-2'-fluor-β-L-arabinofuranosyl)-5-ioduracil (241
Die Verbindung 23 (40 mg, 0,069 mmol) wurde in 25 ml ges. NH₃/MeOH gelöst und bei RT für 24 h gerührt, und dann zur Trockne eingedampft. Der resultierende Sirup wurde durch präparative DC gereinigt (5 : 1/CHCl₃ : MeOH), wodurch 24 als Feststoff erhalten wurde (19 mg, 74%). UV (MeOH): λ_max 280,5 nm.
¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 11,82 (bs, CONH); 8,24 (s, 1H, H-6); 6,082 (dd, J_H-H = 4,45 Hz, J_F-H = 13,7 Hz, 1H, H-1'); 5,947 (d, 1H, 3'-OH); 5,296 (t, 1H, 5'-OH); 5,07 (dt, J_F-H = 53 Hz, 1H, H-2'); 4,24 (bd, J_F-H = 21 Hz, 1H, H-3'); 3,81, 3,55 (m, 3H, H-4', H-5').
2,3,5-Tri-O-benzyl-L-arabinose
Wie in 9 dargestellt, wurden 30 g (0,2 mol) pulverisierte L-Arabinose (5) und dann 0,4 ml konzentrierte Schwefelsäure zu 600 ml (14,8 mol) wasserfreiem Methanol zugegeben. Die Suspension wurde gerührt und unter leichtem Rückfluß für 2 h erhitzt, wodurch eine klare Lösung erhalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde mit 1,5 g Natriumhydrogencarbonat neutralisiert, getrocknet (Na₂SO₄), und dann im Vakuum eingedampft, wodurch ein schwerer Sirup 6 erhalten wurde, der mit 50 ml frisch gereinigtem Tetrahydrofuran verdünnt und wieder konzentriert (35 bis 40 °C Bad) wurde, wodurch das restliche Methanol entfernt wurde. Frisch gereinigtes Tetrahydrofuran (400 ml) wurde zugegeben, und das Gemisch mit 30 g Drierite, 156 g (2,78 mol) Kaliumhydroxid und 200 ml (1,74 mol) Benzylchlorid behandelt. Das Gemisch wurde unter leichtem Rückfluß über Nacht erhitzt, abgekühlt, durch eine dünne Schicht aus Celite filtriert, und im Vakuum und dann bei hohem Vakuum und 100 °C (Bad) konzentriert. Das rohe, sirupartige Methyl-2,3,5-tri-O-benzyl-L-arabinosid (7) wurde in 400 ml Eisessig gelöst. Das Hydrolysegemisch wurde bei 65 bis 70 °C für 2 h erhitzt, im Vakuum auf ein Drittel seines Volumens konzentriert und in 2,5 l eines Gemisches aus Eiswasser gegossen. Nach dem Impfen (Impfkristalle wurden ursprünglich durch Chromatographie unter Elution mit Dichlormethan erhalten) wurde das Gemisch bei 5 °C über Nacht gehalten. Die wässerige Schicht wurde aus der teilweise kristallinen Masse dekantiert, und letzteres wurde in 200 ml Dichlormethan gelöst. Die Lösung wurde mit kaltem, wässerigem Natriumhydrogencarbonat gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), durch ein dünnes Bett aus Entfärbungskohle filtriert, und im Vakuum zu einem dünnen Sirup konzentriert, der in 200 ml Cyclohexan gelöst wurde. Nach dem Impfen⁵ wurde die Lösung bei Raumtemperatur für 1 h und bei 5 °C über Nacht gehalten, wodurch 27,7 g (33,2%) 2,3,5-Tri-O-benzyl-L-arabinose (8) erhalten wurden. Smp. 68–73 °C. [α]²⁵ _D = –1,69 [c 2,01, 9 : 1 (V/V p-Dioxan-Wasser)] UV (MeOH) λ_max 220; 300-MHz ¹H-NMR (CDCl₃) δ 3,48–3,62 (m, 2H, H-5), 3,94–4,18 (m, 3H, H-2, -3, -4), 5,33 (d, 1H, J = 4,07, H-1), 5,29 (s, H-1), 7,25–7,33 (m, 15, H-aromat.).
2,3,5-Tri-O-benzyl-1-O-(p-nitrobenzoyl)-L-arabinose (9)
Die Verbindung 8 (9) (2 g, 4,76 mmol) wurde in 7,5 ml Dichlormethan gelöst, und zu dieser Lösung wurde eine Lösung aus 0,95 g (5,1 mmol) p-Nitrobenzoylchlorid in einem Gemisch aus 5 ml Dichlormethan und 1,5 ml Pyridin zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gehalten, und wurde dann nacheinander mit 1N Salzsäure (2 × 10 ml), wässerigem Natriumhydrogencarbonat (2 × 10 ml) und Wasser (3 × 30 ml) gewaschen. Die Feuchtigkeit wurde mit Na₂SO₄ entfernt, und die Lösung wurde im Vakuum konzentriert, wodurch 2,67 g (98,4%) eines Gemisches aus den Anomeren der Verbindung 9 erhalten wurde. Smp. 68–82 °C. Die weitere Reinigung durch Kieselgelsäulenchromatographie (Hexane : Aceton, 8 : 1) erhöhte den Smp. auf 89–93 °C; [α]²⁴ _D = 13,04 (c 6,8, CH₂Cl₂), UV (MeOH) λ_max 215,5 und 258,5, 250 MHz ¹H-NMR (CDCl₃): δ 3,54–3,69 (m, 2H, H-5), 4,06 (m, 1H, H-4'), 4,22 (m, 1H, H-3'), 4,33 (m, 1H, H-2'), 4,38–4,78 (m, 6H, Benzyl-CH₂), 6,50 (d, 1H, J = 2,35, H-1), 7,23–7,36 (m, 15H, H-aromat. der Benzylgruppe), 8,01–8,25 (m, 4H, H-aromat. der Nitrobenzoylgruppe).
10-(2,3,5-Tri-O-benzyl-β-L-arabinosyl)thymin (12)
Thymin 0,444 g (3,52 mmol) und Ammoniumsulfat (2 mg) wurden in Hexamethyldisilazan 10 ml suspendiert, das über Nacht unter Argon unter Rückfluß (140 °C) erhitzt wurde, wodurch eine klare Lösung erhalten wurde. Überschüssiges Hexamethyldisilazan wurde im Vakuum entfernt, während der Kontakt mit Feuchtigkeit vermieden wurde, wodurch ein Sirup 11 erhalten wurde.
Die Verbindung 9 (1 g, 1,76 mmol) wurde zu 17 ml Dichlormethan, das mit wasserfreiem Hydrogenchlorid vorgesättigt wurde, bei 0 °C zugegeben. Nach 2 h bei 0 °C wurde die ausgefällte p-Nitrobenzoesäure (0,25 g) durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde im Vakuum zu einem dünnen Sirup konzentriert, und dann bei Hochvakuum mit einer Pumpe bei Raumtemperatur für 2 Stunden gehalten, wodurch 2,3,5-Tri-O-benzyl-α-L-arabinosylchlorid (10) erhalten wurde.
Die so hergestellte Verbindung 10 wurde in 15 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst, und die Lösung wurde zu einem Gemisch aus silyliertem Thymin (11) und 3 g von 4A-Molekularsieb zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur unter Argon für 18 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 50 ml Dichlormethan verdünnt, und in 2 ml gesättigtes wässeriges NaHCO₃ unter kräftigem Rühren gegossen. Es erschien ein weißer Niederschlag (Zinnhydroxid), der auf dem Bett aus Celite abfiltriert wurde. Die organische Schicht wurde von Wasser abgetrennt und mit Wasser (3 × 30 ml) gewaschen. Die wässerige Schicht wurde mit Dichlormethan extrahiert, und die vereinigte Dichlormethanschicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet und dann im Vakuum eingedampft, wodurch ein Sirup erhalten wurde, der durch Kieselgelsäulenchromatographie gereinigt wurde (Chloroform : Methanol, 100 : 1), wodurch 12 als Sirup erhalten wurde, 0,68 g (73%). [α]²⁵ _D = –56,71 (c 0,6, CH₂Cl₂). UV (MeOH) λ_max 218 und 265; 300 MHz ¹H-NMR (CDCl₃): δ 1,67 (d, 3H, J = 1,11, CH₃), 3,66–3,70 (m, 2H, H-5') 4,06 (m, 1H, H-4'), 4,13 (t, 1H, J = 4,7, H-3'), 4,24 (t, 1H, J = 4,7, H-2'), 4,41, 4,54, 4,56 (m, 6H, Benzyl-CH₂), 6,28 (d, 1H, J = 5,24, H-1'), 7,15–7,33 (m, 15H, H-aromat.), 7,43 (d, 1H, J = 1,31, H-6).
1-β-L-Arabinofuranosylthymin (13)
Palladiumchlorid (680 mg, 3,835 mmol) wurde in 100 ml Methanol suspendiert, und durch Schütteln mit Wasserstoff bei Raumtemperatur reduziert. Eine Lösung aus 450 mg von 12 in 25 ml Methanol wurde dann zu der sauren Suspension aus Palladiumschwarz zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasserstoff bei Raumtemperatur für 38 h geschüttelt. Nachdem der Katalysator entfernt worden ist, wurde die Lösung mit Dowex (HCO₃ ^–) auf pH 7 neutralisiert und im Vakuum zu einem weißen Feststoff konzentriert, der mit Ethanol umkristallisiert wurde, wodurch 13 erhalten wurde (105 mg, 47,7%). Smp. 244–249 °C; [α]²⁵ _D = –91,48 (0,25, H₂O); IR (KBr): 1750, 1600 cm^–1 (CO); UV (MeOH): λ_max 268; 300 MHz ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ: 1,76 (s, 3H, CH₃), 3,62 (t, 2H, J = 4,56, H-5') 3,69 (m, 1H, H-4'), 3,90 (t, 1H, J = 3,88, H-3'), 3,99 (t, 1H, J = 4,10, H-2'), 5,08 (br s, 1H, C'5-OH, austauschbar), 5,42 (d, 1H, J = 4,24, C'2-OH oder C'3-OH, austauschbar), 5,54 (d, 1H, J = 5,23, C'2-OH oder C'3-OH, austauschbar), 5,97 (d, 1H, J = 4,64, H-1'), 7,51 (d, 1H, J = 0,97, H-6), 11,26 (s, 1H, NH, austauschbar), Anal. berechnet für C₁₀H₁₄N₂O₆; C, 46,51; H, 5,46; N, 10,85; gefunden: C, 46,67; H, 5,63; N, 10,56.
1-(2,3,5-Tri-O-benzyl-β-L-arabinosyl)cytosin (15)
Cytosin 0,61 g (6 mmol) und Ammoniumsulfat (2 mg) wurden in Hexamethyldisilazan 15 ml suspendiert, das unter Stickstoff für 2 Stunden unter Rückfluß (140 °C) erhitzt wurde, wodurch eine klare Lösung erhalten wurde. Das silylierte Cytosingemisch wurde zur Trockne im Vakuum eingedampft, während der Kontakt mit Feuchtigkeit vermieden wurde, wodurch ein Sirup 14 erhalten wurde.
Die Verbindung 9 (2,82 g, 5 mmol) wurde zu 47 ml trockenem Dichlormethan, das mit wasserfreiem Hydrogenchlorid vorgesättigt wurde, bei 0 °C zugegeben. Nach 2 Stunden bei 0 °C wurde die ausgefällte p-Nitrobenzoesäure (0,807 g) durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert, wodurch sirupartiges 2,3,5-Tri-O-benzyl-α-L-arabinosylchlorid (10) erhalten wurde.
Die so hergestellte Verbindung 10 wurde in 28,5 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst, und die Lösung wurde zu einem Gemisch aus silyliertem Cytosin (14) und 8,3 g 4A-Molekularsieb zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur unter Stickstoff für 5 Tage gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 50 ml Dichlormethan und 20 ml Wasser verdünnt, und in 2 ml gesättigtes wässeriges NaHCO₃ unter kräftigem Rühren gegossen. Es erschien ein weißer Niederschlag (Zinnhydroxid), der auf dem Bett aus Celite abfiltriert wurde. Die organische Schicht wurde von Wasser abgetrennt und mit Wasser (3 × 30 ml) gewaschen. Die wässerige Schicht wurde mit Dichlormethan extrahiert, und die vereinigte Dichlormethanschicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet, und dann im Vakuum eingedampft, wodurch ein Sirup erhalten wurde, der durch Kieselgelsäulenchromatographie gereinigt wurde (Chloroform : Methanol, 96 : 4), wodurch 15 als weißer Feststoff erhalten wurde, der mit 2-Propanol umkristallisiert wurde, wodurch 1,53 g (60%) erhalten wurden. Smp. 146–148 °C, [α]²⁵ _D = –105,2 (Cl, CH₂Cl₂), UV (MeOH): λ_max 211,5, λmin 272,5, pH1, pH7; λmax 211,5, λ_min 284, pH9. 300 MHz ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 3,65 (d, 2H, J = 4,85, H-5'), 4,00 (t, 1H, J = 3,72, H-3'), 4,11 (m, 1H, H-4'), 4,28 (m, 1H, H-2'), 4,38–4,55 (m, 6H, Benzyl-CH₂), 5,56 (d, 1H, J = 7,5, H-5), 6,39 (d, 1H, J = 4,59, H-1'), 7,12–7,31 (m, 15H, H-aromat.), 7,63 (d, 1H, J = 7,5, H-6).
1-β-L-Arabinofuranosylcytosinhydrochloridsalz (16) durch katalytische Hydrierung von 15
Palladiumchlorid (315 mg, 1,78 mmol) wurde in 160 ml Methanol suspendiert, und durch Schütteln mit Wasserstoff bei Raumtemperatur reduziert. Zu der sauren Suspension aus Palladiumschwarz wurde dann eine Lösung aus 300 mg 15 in 54 ml Methanol zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasserstoff bei Raumtemperatur für 3 Stunden geschüttelt. Nachdem der Katalysator entfernt worden ist, wurde die Lösung mit Dowex (HCO₃ ^–) neutralisiert, im Vakuum konzentriert und dann durch präparative DC gereinigt (MeOH : CHCl₃, 3 : 5), wodurch ein Sirup erhalten wurde, der in 3 ml Methanol gelöst, 1% HCl-Lösung in MeOH auf pH 1 zugegeben, zur Trockne konzentriert und mit 2-Propanol verrieben wurde, wodurch 36 mg (22,1%) von 16 erhalten wurden. Smp. 190–194 °C, [α]²⁵ _D = –115,47 (C 0,07, H₂O); UV (H₂O) λ_max 275, pH7; λ_max 209,5, 273, pH11; λ_max 280, pH1; 300 MHz ¹H-NMR (DMSO-d₆); δ 3,61 (d, 2H, H-5'), 3,82 (m, 1H, H-4'), 3,93 (m, 1H, H-2' oder H-3'), 4,04 (br s, 1H, H-2' oder H-3'), 5,18 (br s, 1H, C5'-OH, austauschbar), 5,61 (br s, 1H, C2'-OH oder C3'-OH, austauschbar), 5,67 (br s, 1H, C2'-OH oder C3'-OH, aus tauschbar), 6,00 (d, 1H, J = 4,02, H-1'), 6,01 (d, 1H, J_5,6 = 7,8, H-5) 7,92 (d, 1H, J_5,6 = 7,8, H-6), 8,49 (br s, 1H, NH, austauschbar), 9,38 (br s, 1H, NH, austauschbar).
1-β-L-Arabinofuranosylcytosinhydrochloridsalz (16) durch Behandlung der Verbindung 15 mit Bortrichlorid
5 ml von 1M Bortrichlorid in Dichlormethan wurden auf –72 °C abgekühlt (Trockeneis-Aceton). Eine Lösung aus 15 (180 mg, 0,351 mmol) in 3 ml Dichlormethan wurde langsam zu der Bortrichloridlösung zugegeben. Nach einer Gesamtreaktionszeit von 2,75 Stunden wurde das Kühlbad entfernt, und das Lösungsmittel und das Gas wurden im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in kaltem Dichlormethan (10 ml) gelöst, und die Lösung wurde zur Trockne eingedampft (dreimal, bis ein weißer fester Rückstand erhalten wurde), kalte gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung wurde zugegeben, um den pH auf 6–7 einzustellen. Das Gemisch wurde mit Ethanol verdünnt, zum Sieden erhitzt, mit Aktivkohle behandelt und filtriert. Das Filtrat wurde zur Trockne zu einem Sirup eingedampft, der in 3 ml Methanol gelöst wurde, 1% HCl-Lösung in Methanol auf pH 1 zugegeben, zur Trockne konzentriert und mit 2-Propanol verrieben, wodurch 16 (66 mg, 78,4%) erhalten wurde.
9-(2,3,5-Tri-O-benzyl-β-L-arabinosyl)adenin (18)
Die gründlich getrocknete Verbindung 9 (5 g, 8,8 mmol) wurde zu 82 ml Dichlormethan, das mit wasserfreiem Hydrogenchlorid vorgesättigt wurde, bei 0 °C zugegeben. Nach 2 Stunden der Reaktion bei 0 °C wurde die ausgefällte p-Nitrobenzoesäure (1,53 g) durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde im Vakuum zu einem Sirup konzentriert, der dann in vollständigem Vakuum bei Raumtemperatur für 2 h gehalten wurde. Das so hergestellte 2,3,5-Tri-O-benzyl-α-L-arabinosylchlorid (10) wurde in 50 ml Dichlormethan gelöst, und die Lösung wurde zu eine Gemisch aus 4,5 g (18,8 mmol) getrocknetem N-Benzoyladenin⁵ (17) und 14,5 g 4A-Molekularsieb zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für Woche gerührt, durch ein Bett aus Celite filtriert, und im Vakuum zu einem Sirup konzentriert, der auf Kieselgel unter Verwendung von Hexanen – Aceton (3 : 1, Rf = 0,22) chromatographiert wurde. Das Produkt wurde abgetrennt und im Vakuum zu einem Sirup konzentriert, der gelöst und mit methanolischem Ammoniak (20 ml) in einer Edelstahlbombe gerührt und über Nacht bei 50–55 °C erhitzt wurde. Die Lösung wurde dann bei reduziertem Druck konzentriert, wodurch ein Halbfeststoff erhalten wurde, der aus warmem Isopropylalkoholumkristallisiert wurde, wodurch 18 2,4 g (50,7%) erhalten wurde. Smp. 128–129 °C, [α]²⁷ _D = –20,04 (1,04, CH₂Cl₂); UV (CH₂Cl₂): λ_max 213, 258,5; 250 MHz ¹H-NMR (CDCl₃): δ 1,95 (br s, 1H, NH, austauschbar), 3,69 (d, 2H, J = 4,82, H-5'), 4,18–4,30 (m, 6H, Benzyl-CH₂), 4,51–4,64 (m, 3H, H-2', -3', -4'), 5,73 (br s, 1H, NH, austauschbar), 6,52 (d, 1H, J = 4,00, H-1'), 6,89–6,93, 7,17–7,37 (m, 15H, H-aromat. der Benzylgruppe), 8,17 (s, 1H, H-2 oder H-8), 8,32 (s, 1H, H-2 oder H-8).
9-β-L-Arabinofuranosyladenin (19)
Bortrichlorid (5 ml 1M) in Dichlormethan wurde bei –72 °C (Trockeneis-Aceton) abgekühlt. Eine Lösung aus 18 (150 mg, 0,279 mmol) in 5 ml Dichlormethan wurde langsam zu der Bortrichloridlösung zugegeben. Nach einer Gesamtreaktionszeit von 3,5 h wurde das Kühlbad entfernt, und das Lösungsmittel und das Gas wurden im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in kaltem Dichlormethan (10 ml) gelöst, und die Lösung zur Trockne eingedampft (sechsmal, bis ein gelber fester Rückstand erhalten wurde). Kalte gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung wurde zugegeben, um den pH auf 7–8 einzustellen. Das Gemisch wurde mit Ethanol verdünnt, zum Sieden erhitzt, die Suspension durch Celite filtriert, das Filtrat wurde im Vakuum zu einem Sirup konzentriert, der mit Wasser kristallisierte. 55 mg (74%) von 19 wurde erhalten. Smp. 256–258 °C, UV (H₂O): λ_max 259; 300 MHz ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ: 3,62–3,66 (m, 2H, H-5'), 3,77 (br s, 1H, H-4'), 4,13 (br s, 2H, H-2', -3'), 5,12 (t, 1H, J = 5,4, C'5-OH, austauschbar), 5,54 (d, 1H, J = 3,78, C'2-OH oder C'3-OH, austauschbar), 5,63 (d, 1H, J = 4,32, C'2-OH oder C'3-OH, austauschbar), 6,25 (d, 1H, J = 4,02, H-1'), 7,25 (br s, 2H, NH2, austauschbar), 8,13 (s, 1H, H-2 oder H-8), 8,18 (s, 1H, H-2 oder H-8).
10 ist eine Darstellung eines alternativen Wegs zur Herstellung von 1-O-Acetyl-2,3,5-tri-O-benzoyl-β-L-ribofuranose (Verbindung 10) aus 1,2-Di-O-isopropyliden-α-L-xylofuranose (Verbindung 3).
1,2-Di-O-isopropyliden-α-L-xylofuranose (3)
Zu 650 ml wasserfreiem Aceton wurden 4 ml konz. Schwefelsäure, 5 g Molekularsieb (4A), 80 g wasserfreies Kupfer(II)-sulfat und 40 g L-Xylose zugegeben. Das Gemisch wurde bei RT für 36 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann filtriert und gründlich mit Aceton gewaschen, das vereinigte Filtrat wurde mit Ammoniumhydroxid neutralisiert, dann zur Trockne eingedampft. Ethylacetat (200 ml) wurde zugegeben, und dann filtriert und eingedampft, wodurch ein Öl erhalten wurde, das in 250 ml 0,2%iger HCl-Lösung gelöst und bei Raumtemperatur für 2,5 h gerührt wurde. Der pH wurde auf 8 mit ges. NaHCO₃ eingestellt, und dann zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die Entfernung des Lösungsmittels lieferte ein gelbes Öl von 3 (41,7 g, 82,3 %). ¹H-NMR (CDCl₃): δ 5,979 (d, J = 3,78 Hz, 1H, H-1); 4,519 (d, J = 3,6 Hz, 1H, H-2); 4,308 (bd, 1H, H-3); 4,080 (m, 3H, H-4 und H-5); 1,321 (s, 3H, CH₃); 1,253 (s, 3H, CH₃).
5-O-Benzoyl-1,2-di-O-isopropyliden-α-L-xylofuranose (25)
Die Verbindung 3 (41 g, 215,6 mmol) wurde in Pyridin (150 ml) und CH₂Cl₂ (150 ml) bei 0 °C gerührt. BzCl (27,5 ml, 237 mmol), gelöst in 30 ml Pyridin, wurde tropfenweise zugegeben. Nach 30 min wurde Wasser (5 ml) zugegeben und das Gemisch wurde zur Trockne eingedampft, in EtOAc gelöst, mit ges. NaHCO₃ gewaschen und dann getrocknet (Na₂SO₄). Die Eindampfung des Lösungsmittels ergab einen orangefarbenen Sirup, der in Et₂O kristallisierte, wodurch die Verbindung 20 (36 g) erhalten wurde. Die Mutterlauge wurde zur Trockne eingedampft, und der Rückstand durch Kieselgelsäulenchromatographie gereinigt (1% CH₃OH/CHCl₃), wodurch eine andere Charge von Verbindung 25 erhalten wurde (12 g, Gesamtausbeute 76%). Smp. 82–83 °C. Lit D-Form: 83,5–84,5 °C. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 7,43, 8,07 (m, 5H, Ar-H); 5,97 (d, 1H, J = 3,6 Hz, H-1); 4,80 (q, 1H, H-4); 4,60 (d, 1H, J = 3,6 Hz, H-2); 4,40, 4,20 (m, 3H, H-5, H-5', H-3); 3,50 (bs, 1H, D₂O-Austausch, 3OH); 1,51, 1,32 (2s, 6H, 2CH₃).
5-O-Benzoyl-1,2-di-O-isopropyliden-α-L-erythro-pentofuranos-3-ulose (26)
Die Verbindung 25 (40 g, 136 mmol) wurde in 450 ml CH₂Cl₂ gerührt. Dazu wurde Pyridiniumdichromat (PDC, 30,7 g, 81,6 mmol) und Ac₂O (42,3 ml, 448,8 mmol) zugegeben. Das Gemisch wurde unter Rückfluß für 2,5 h erhitzt. Die Lösung wurde auf 1/5 ihres ursprünglichen Volumens konzentriert, und dann wurde Ethylacetat (50 ml) zugegeben, und die Lösung filtriert. Das Filtrat wurde auf ein Kieselgelpad (10 cm × 5 cm) gegossen, mit EtOAc eluiert, das vereinigte Elutionsmittel wurde konzentriert und mit Toluol (50 ml × 2) konzentriert. Die Kristallisation aus Hexan und EtOAc ergab 21 als weißen Feststoff (38 g, 96%). Smp. 91–93 °C, [α]_D: –132 °C (c, 1,0, CHCl₃); Lit² D-Form: Smp. 93–94,5 °C, [α]_D: +135 °C (c, 1,0, CHCl₃); IR (KBr): 1773 cm^–1 (ArCO), 173 cm^–1 (CO), ¹H-NMR (CDCl₃): δ 7,97, 7,42 (m, 5H, Ar-H); 6,14 (d, 1H, J = 4,4 Hz, H-1); 4,74, 4,68 (m, 2H, H-4, H-2); 4,50, 4,44 (m, 2H, H-5, H-5'); 1,52, 1,44 (2s, 6H, 2CH₃), Anal. berechnet (C₁₅H₁₆O₆): C, 61,64; H, 5,52; gefunden: C, 61,42; H, 5,53.
5-O-Benzoyl-1,2-di-O-isopropyliden-α-L-erythro-pentofuranos-3-ulose (26)
Die Verbindung 25 (40 g, 136 mmol) wurde in 450 ml CH₂Cl₂ gerührt. Dazu wurde Pyridiniumdichromat (PDC, 30,7 g, 81,6 mmol) und Ac₂O (42,3 ml, 448,8 mmol) zugegeben. Das Gemisch wurde unter Rückfluß für 2,5 h erhitzt. Die Lösung wurde auf 1/5 ihres ursprünglichen Volumens konzentriert, und dann wurde EtOAc (50 ml) zugegeben. Die Lösung wurde filtriert, das Filtrat wurde auf ein Kieselgelpad (10 cm × 5 cm) gegossen, mit EtOAc eluiert, das vereinigte Elutionsmittel wurde konzentriert, und mit Toluol (50 ml × 2) coeingedampft. Die Kristallisation aus Hexan und EtOAc ergab 26 als weißen Feststoff (38 g, 96%). Smp. 91–93 °C, [α]_D: –132 °C (c, 1,0, CHCl₃); Lit² D-Form: Smp. 93–94,5 °C, [α]_D: +135 °C (c, 1,0, CHCl₃); IR (KBr): 1773 cm^–1 (ArCO), 173 cm^–1 (CO). ¹H-NMR (CDCl₃): δ 7,97, 7,42 (m, 5H, Ar-H); 6,14 (d, 1H, J = 4,4 Hz, H-1); 4,74, 4,68 (m, 2H, H-4, H-2); 4,50, 4,44 (m, 2H, H-5, H-5'); 1,52, 1,44 (2s, 6H, 2CH₃), Anal. berechnet (C₁₅H₁₆O₆): C, 61,64; H, 5,52; gefunden: C, 61,42; H, 5,53
1,2-Di-O-isopropyliden-α-L-ribofuranose (27)
Die Verbindung 26 (37 g, 127 mmol) wurde in EtOH/H₂O (400 ml/100 ml) bei 0 °C gelöst, während NaBH₄ (23,3 g, 612 mmol) portionsweise zugegeben wurde. Die Suspension wurde bei RT für 4 h gerührt. Sie wurde filtriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft und mit Methanol coeingedampft. Nach der Kieselgelsäulenchromatographie (0–15% CH₃OH/CH₂Cl₂) und Kristallisation aus EtOAc/Hexan wurde 27 als weiße Nadeln erhalten (19 g, 79%). Smp. 86–87 °C; [α]_D: –31,5 °C (c, 0,62, CHCl₃); Lit³, D-Form: Smp. 86–87 °C, [α]_D: +37 °C (c, 0,59, CHCl₃); IR (KBr): 3356 cm^–1 (OH). ¹H-NMR (CDCl₃) δ 5,83 (d, 1H, J = 3,98 Hz, H-1 ); 4,595 (t, 1H, H-2); 4,055, 3,72 (m, 4H, H-3, H-4, H-5, H-5'); 2,38 (d, 1H, D₂O-Austausch, 3-OH); 1,83 (t, 1H, D₂O-Austausch, 5-OH); 1,58, 1,38 (2s, 6H, 2CH₃), Anal. berechnet (C₈H₁₄O₅): C, 50,50; H, 7,42; gefunden: C, 50,62; H, 7,46.
3,5-Di-O-Benzoyl-1,2-di-O-Isopropyliden-α-L-ribofuranose (28)
Die Verbindung 27 (19 g, 100 mmol) wurde in 300 ml Pyridin bei 0 °C gerührt, während BzCl (40 ml, 348 mmol) tropfenweise zugegeben wurde, und dann wurde bei RT für 3 h gerührt. Das Lösungsmittel wurde zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit EtOAc extrahiert, mit ges. NaHCO₃ gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), die Eindampfung des Lösungsmittel und Kristallisation in Ether ergab 23 als weißen Feststoff mit 39 g (98%) Smp. 83–85 °C. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 8,07, 7,36 (m, 10H, Ar-H); 5,94 (d, 1H, J = 3,6 Hz, H-1); 5,05, 5,00 (m, 1H, H-2); 4,73, 4,63 (m, 3H, H-4, H-5, H-5'); 1,58, 1,35 (2s, 6H, 2CH₃), Anal. berechnet (C₂₂H₂₂O₇): C, 66,50; H, 5,64; gefunden: C, 66,32; H, 5,57.
1-O-Acetyl-2,3,5-tri-O-benzoyl-β-L-ribofuranose (31)
Die Verbindung 28 (38 g, 95 mmol) wurde in 300 ml 1% HCl/CH₃OH bei RT für 30 h gerührt. Pyridin (20 ml) wurde zugegeben und dann wurde die Lösung zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit Pyridin (30 ml × 2) coeingedampft und dann in 100 ml wasserfreiem Pyridin bei 0 °C gelöst, während BzCl (17 ml, 146 mmol) tropfenweise zugegeben wurde, und dann wurde bei RT für 3 h gerührt. Das Lösungsmittel wurde eingedampft, und der Rückstand wurde in EtOAc gelöst, mit 0,5N HCl und dann ges. NaHCO₃ gewaschen, und dann getrocknet (Na₂SO₄). Die Eindampfung des Lösungsmittels ergab das rohe 30 als Sirup.
Das rohe 30 wurde in Eisessig (400 ml) und dann Ac₂O (100 ml) bei 0 °C gerührt, während konz. H₂SO₄ (10 ml) tropfenweise zugegeben wurde. Diese Lösung wurde bei RT über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde in Eiswasser gegossen, mit CHCl₃ extrahiert, mit ges. NaHCO₃ neutralisiert, und dann getrocknet (Na₂SO₄). Nach der Eindampfung des Lösungsmittels wurde ein hellgelber Sirup erhalten, der in Methanol kristallisierte, wodurch 31 als ein weißer Feststoff mit 23,89 g (49,6%, von 28– 31) erhalten wurde. Smp. 124,7 °C, [α]_D = 45,613 (c 1,0, CHCl₃); Lit⁴, Smp.: 129–130 °C, [α]_D = –43,6 (c 1,0, CHCl₃).
¹H-NMR (CDCl₃): δ 7,317, 8,134 (m, 15H, OBz); 6,437 (s, 1H, H-1); 5,835 (m, 2H, H-2 und H-3); 4,649 (m, 3H, H-4 und H-5); 2,003 (s, 3H, CH ₃COO-)
II. Biologische Aktivität
Die hierin offenbarten Verbindungen können hinsichtlich der Aktivität gegen HBV und EBV bewertet werden, wie nachstehend ausführlich offenbart oder durch andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind.
Beispiel 1: Biologische Aktivität gegen HBV
Menschliche Hepatomzellen mit HBV (2.2.15 Zellen) wurden in dem Assay verwendet. Diese Zellen wuchsen unter Konfluenz in minimal wesentlichem Medium mit 10% fetalem Rinderserum. Die Medien wurden bei 3-Tages-Intervallen gewechselt. Bei Konfluenz wurde die Behandlung mit den Arzneimitteln initiiert und dann für drei Tage fortgesetzt. Eine andere Zugabe derselben Konzentration des Arzneimittels wurde zu diesem Zeitpunkt nach der Entfernung der Medien von den Kulturen gegeben, und die Kulturen für einen zusätzlichen Zeitraum von 3 Tagen gehalten. Das Medium nach der 6-Tages-Behandlung wurde geerntet und die viralen Teilchen durch das Polyethylenglykolverfahren ausgefällt. Die Teilchen wurden anschließend digeriert und dann für die Southern-Analyse verarbeitet. Die Blots wurden zu einer HBV-spezifischen Sonde hybridisiert und virale DNA-Mengen im Vergleich zu den DNA-Niveaus aus Kulturen, die nicht mit den Arzneimitteln behandelt wurden, bewertet. Die genomische DNA wurde mit Hind III digeriert und der Southern-Analyse unterzogen. Niveaus der episomalen DNA wurden in bezug auf die integrierte HBV-DNA bestimmt. Die Arzneimittelkonzentrationen, die 50%ige Inhibierung der DNA (ID₅₀) im Vergleich zu den Kontrollen verursachen, wurden berechnet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 zusammengefaßt.
Inhibierung des HBV durch L-Nukleoside
Beispiel 2: Biologische Aktivität gegen EBV
H1-Zellen wurden im Langphasenwachstum für zwei Tage vor der Initiierung der Behandlung gehalten. Die Zellen wurden bei 600 g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert, um sie von dem Medium abzutrennen, welches vorher existierende Virusteilchen enthält. Die H1-Zellen wurden in 24-Lochplatten bei einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen pro Loch in 2 ml frischem Medium mit oder ohne Arzneimittel gesät und bei 37 °C für 5 Tage inkubiert. Das Medium, das Viruspartikel enthält, wurde gesichert und zur Bewertung der inhibierenden Wirkung von Arzneimitteln auf die Virusproduktion und Infektiosität durch die Verwendung eines Bioassays verwendet. Die reifen Viruspartikel wurden aus dem zellfreien Medium durch Zentrifugation bei 45.000 U/min für 90 min in einem SW-50 Ti-Rotor (Beckman) pelletiert. Die reifen Viruspartikel wurden in 1 ml Wachstumsmedium resuspendiert und dann verwendet, um 1 × 10⁶ Raji-Zellen für 48 Stunden zu infizieren. Da das Niveau an EBV-DP-Aktivität in Raji-Zellen-Nachsuperinfektion proportional zu der Anzahl an zugegebenen reifen Viruspartikeln ist, konnte die induzierte EBV-spezifische DP-Aktivität gemessen werden. Die inhibierende Arzneimittelwirkung wurde durch Vergleichen der EBV-DP-Aktivität mit mehreren Verdünnungskontrollen berechnet. Es wurde keine Inhibierung des Mitochondrien-DNA-Gehalts in H1-Zellen beobachtet, wenn die Zellen durch 1 mM L-FMAU für 6 Tage behandelt wurden.
Slot-Blotting-Assay – Die Menge an Mitochondrien-DNA wurde durch das Slot-Blotting-Verfahren (2) gemessen. 2 × 10⁵ der behandelten und nicht-behandelten H1-Zellen wurden in 200 μl von 10 mM Tris·HCl-Lösung (pH 7,5) durch Gefrier/Tau-Verfahren lysiert. Das Zelllysat wurde mit 10 μg/ml RNase A bei 37 °C für 30 min und dann Proteinase K (100 μg/ml) bei 55 °C für 2 Stunden behandelt. Gleiche Mengen an 20X SSC-Puffer wurden zu jedem Zelllysat zugegeben. Nach dem Kochen für 10 min wurden die Proben auf Nylonmembranen getüpfelt (Hybond-N, Amersham Corp.). Ein radioaktiv markiertes menschliches Mitochondrien-DNA-Fragment wurde als eine Sonde für die DNA-Hybridisierung verwendet. Dieselbe Membran wurde wieder mit menschlicher Alu-DNA nach der Entfernung der Mitochondrien-DNA-Sonde sondiert. Die Menge an Mitochondrien-DNA in den behandelten und nicht-behandelten H1-Zellen wurde durch Densitometer (LKB Ultroscan XL) quantitativ bestimmt.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 bereitgestellt.

Inhibierende Wirkung von Verbindungen auf EBV: Der CD₅₀ wurde durch Aussetzen von H1-Zellen den unterschiedlichen Konzentrationen der Verbindungen in normalem Wachstumsmedium bei 37 °C für 72 Stunden durchgeführt; die Zellen wurden dann gezählt und mit den Kontrollen verglichen. H1-Zellen wurden für 5 Tage behandelt und der ID₉₀ wurde durch Bioassay bestimmt.

Beispiel 3: Clearance von L-(-)-FMAU aus Plasma und Leber
Die Clearance von L-(-)-FMAU aus dem Plasma und der Leber von Mäusen nach der oralen Verabreichung wurde bewertet. Mäuse wurden mit L-(-)-FMAU, das mit Tritium markiert wurde (Radiospezifität von 9,3 μmol/μCi), injiziert.
11 ist eine graphische Darstellung der Plasmakonzentration von L-(-)-FMAU bei Mäusen nach der oralen Verabreichung über die Zeit, und 12 ist eine graphische Darstellung der Konzentration von L-(-)-FMAU in Mäuseleber nach der oralen Verabreichung über die Zeit (Kreuz, 10 mg/kg verabreicht b.i.d. (zweimal täglich) für 30 Tage vor der pharmakokinetischen Studie, und dann wurde die Studie an Tag einunddreißig der Verabreichung derselben Konzentration durchgeführt; dunkler Kreis, 50 mg/kg verabreicht b.i.d. für 30 Tage vor der Studie, und dann wurde die Studie an Tag einunddreißig der Verabreichung derselben Konzentration durchgeführt; offener Kreis, 50 mg/kg verabreicht für die erste Zeit am ersten Tag der Studie).
Zu den angegebenen Zeiten (siehe 10 und 11) wurden die Mäuse aus ihrer retroorbitalen Nasennebenhöhle unter Verwendung von heparinisierten Kapillaren ausgeblutet. Das Plasma wurde mit Trichloressigsäure extrahiert und mit Freon/Trioctylamin neutralisiert. Die Überstände wurden direkt gezählt und die Konzentration berechnet.
Wie in den 10 und 11 angegeben, trat die Spitzenkonzentration von L-(-)-FMAU in dem Plasma und der Leber bei ungefähr einer Stunde auf. Die Verbindung wurde im wesentlichen aus sowohl dem Plasma als auch der Leber nach 4 Stunden geklärt.
Beispiel 4: Toxizität von L-(-)-FMAU in weiblichen BDF1-Mäusen
13a stellt die Veränderung des Körpergewichts über 30 Tage der weiblichen Kontroll-BDF1-Mäuse dar. 13b und 13c stellen die Veränderung des Körpergewichts über 30 Tage der weiblichen BDF1-Mäuse dar, denen 10 mg/kg (13b) und 50 mg/kg (13c) b.i.d. von L-(-)-FMAU verabreicht wurden. Das dargestellte Körpergewicht stellt die mittlere und Standardabweichung von dem der fünf bis sieben Mäuse dar. Wie in den 13b und 13c angegeben, trat kein L-(-)-FMAU auf, das das Gewicht der Mäuse über 30 Tage signifikant beeinflußt, was angibt, daß die Verbindung gut toleriert wurde.
Beispiel 5: Klinische Chemie von Mäuseplasma nach der L-(-)-FMAU-Behandlung
14 bis 20 stellen die klinische Chemie von Mäuseplasma nach der Verabreichung von L-(-)-FMAU bei 10 mg/kg (drei Mäuse) oder 50 mg/kg (drei Mäuse) b.i.d. für 30 Tage bereit.
14 ist ein Balkendiagramm der Konzentration des gesamten Bilirubins in dem Mäuseplasma in mg/dL. 15 ist ein Balkendiagramm der Konzentration von Alkaliphosphatase in dem Mäuseplasma in U/L. Das gesamte Bilirubin und Alkaliphosphatase sind Indikatoren der Leberfunktion. Die Mäusewerte für das Bilirubin fallen in den normalen menschlichen Bereich (weniger als 1,2 mg/dL), aber die für Alkaliphosphatase sind etwas höher als der normale menschliche Gehalt (30–114 U/L).
16 ist ein Balkendiagramm der Konzentration von Kreatinin in dem Mäuseplasma in mg/dL. Kreatinin ist ein Index der Nierenfunktion. Mit der Ausnahme von Maus 50-2 unterscheiden sich die Kreatinin-Niveaus der behandelten Mäuse nicht von denen der Kontrollmäuse.
17 ist ein Balkendiagramm der Konzentration von AST (SGOT, Serum-Glutamin-Oxal-Transaminase) in dem Mäuseplasma in U/L. 18 ist ein Balkendiagramm der Konzentration von ALT (SGPT, Serum-Glutamin-Pyruvin-Transaminase) in dem Mäuseplasma in U/L. SGOT und SGPT sind Indikatoren der Leberfunktion. Mit der Ausnahme von Maus 50-2 (für sowohl SGOT als auch SGPT) und Maus 10-2 (nur für SGOT) unterscheiden sich die Enzymniveaus der behandelten Mäuse nicht von denen der Kontrollmäuse.
19 ist ein Balkendiagramm der Konzentration von Milchsäure in dem Mäuseplasma in mmol/L. 20 ist ein Balkendiagramm der Konzentration von Milchsäuredehydrogenase in dem Mäuseplasma in U/L. Milchsäure wird in Muskeln während der Glykolyse gebildet. Milchsäuredehydrogenase (LDH) liegt als unterschiedliche Isoenzyme in unterschiedlichen Geweben vor. Die Freisetzung von LDH in das Plasma kann ein Anzeichen von Gewebeschäden sein. Die Milchsäure- und Milch säuredehydrogenaseniveaus der behandelten Mäuse unterscheiden sich nicht signifikant von denen der Kontrollmäuse.
III. Oligonukleotide
Oligonukleotide der gewünschten Sequenzen können durch Substitution von einem oder mehreren der hierin offenbarten L-Nukleoside für ein Nukleosid in dem Oligonukleotid modifiziert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das L-Nukleosid an einem der Enden des Oligonukleotids plaziert. Das modifizierte Oligonukleotid kann beispielsweise in der Antisense-Technologie verwendet werden.
Die Antisense-Technologie bezieht sich im allgemeinen auf die Modulation der Genexpression durch ein Verfahren, wo ein synthetisches Oligonukleotid zu einer komplementären Nukleinsäuresequenz hybridisiert wird, um die Transkription oder Replikation zu inhibieren (wenn die Zielsequenz DNA ist), die Translation zu inhibieren (wenn die Zielsequenz RNA ist) oder um das Fortschreiten zu inhibieren (wenn die Zielsequenz prä-RNA ist). Eine breite Vielzahl an Zellaktivitäten kann unter Verwendung dieser Technik moduliert werden. Ein einfaches Beispiel ist die Inhibierung der Proteinbiosynthese durch ein Antisense-Oligonukleotid, das an mRNA gebunden ist. In einer anderen Ausführungsform wird ein synthetisches Oligonukleotid zu einer spezifischen Gensequenz in doppelsträngiger DNA unter Bildung eines dreisträngigen Komplexes (dreifach) hybridisiert, der die Expression der Gensequenz inhibiert. Antisense-Oligonukleotide können ebenso verwendet werden, um die Genexpression indirekt durch Unterdrücken der Biosynthese eines natürlichen Repressors zu aktivieren. AOT kann verwendet werden, um die Expression der pathogenen Gene zu inhibieren, beispielsweise die, die die Replikation von Viren erleichtern, einschließlich HIV-Virus (HIV), Hepatitis-B-Virus (HBV) und Herpesviren, und Krebsarten, insbesondere feste Tumormassen, wie Gliome, Brustkrebs und Melanome.
Die Stabilität eines ausgewählten Oligonukleotids gegenüber Nukleasen ist ein wichtiger Faktor für in vivo Applikationen. Es ist bekannt, daß die 3'-Exonuklease-Aktivität am meisten für den nicht-modifizierten Antisense-Oligonukleotid-Abbau in Serum verantwortlich ist. Vlassov, V.V., Yakubov, L.A., in Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancers and AIDS, 1991, 243–266, Wiley-Liss, Inc., New York; Nu cleic Acids Res., 1993, 21, 145. In einer Ausführungsform können die hierin offenbarten L-Nukleoside verwendet werden, um den 3'-Exonuklease-Abbau der Antisense-Oligonukleotide zu minimieren.
Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide, die an Polyribonukleinsäure oder Polydesoxyribonukleinsäure binden können, sind als Antisensemittel in derselben Weise wie konventionelle Antisensemittel nützlich. Siehe im allgemeinen Antisense Molecular Biology and S-oligos, Synthesis 1 (Okt. 1988) (veröffentlicht von Synthecell Corp., Rockville, Md.); 2 Discoveries in Antisense Nucleic Acids (C. Brakel und R. Fraley Hrsg. 1989); Uhlmann, et al., „Antisense Oligonucleotides: A New Therapeutic Technique," Chem. Rev. 90 (4), 1990; und Milligan, J. F., Matteucci, M. D., Martin, J. C., J. Med. Chem, 1993, 36, 1923–1937. Antisensemittel der vorliegenden Erfindung können durch Konstruieren eines Antisensemittels verwendet werden, das an eine vorbestimmte Polydesoxyribonukleinsäuresequenz oder Polyribonukleinsäuresequenz an eine Zelle, enthaltend eine solche Sequenz (z. B., durch Addition des Antisensemittels zu einem Kulturmedium, enthaltend die Zelle), selektiv binden kann, so daß das Antisensemittel in die Zelle aufgenommen wird, an die vorbestimmte Sequenz bindet und die Transkription, Translation oder Replikation davon blockiert. Die Erfordernisse für die selektive Bindung des Antisensemittels sind bekannt (z. B., eine Länge von 17 Basen zur selektiven Bindung innerhalb des menschlichen Genoms).
IV. Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen
Die hierin offenbarten Verbindungen und ihre pharmazeutisch akzeptablen Salze, Prodrugs und Derivate sind bei der Vorbeugung und Behandlung von HBV- und EBV-Infektionen und anderen verwandten Zuständen, wie Anti-HBV- oder Anti-EBV-Antikörper-positiven und HBV- oder EBV-positiven Zuständen, chronischer Leberentzündung, verursacht durch HBV, Zirrhose, akute Hepatitis, fulminante Hepatitis, chronische andauernde Hepatitis und Müdigkeit, nützlich. Diese Verbindungen oder Formulierungen können ebenso prophylaktisch verwendet werden, um der Progression der klinischen Krankheit bei Individuen, die Anti-HBV- oder Anti-EBV-Antikörper- oder HBV- oder EBV-Antigen-positiv sind oder die HBV oder EBV ausgesetzt gewesen sind, vorzubeugen oder diese zu verzögern.
Menschen, die unter einem dieser Zustände leiden, können durch Verabreichen an den Patienten einer wirksamen HBV- oder EBV-Behandlungsmenge von einer oder einem Gemisch aus aktiven Verbindungen, die hierin beschrieben sind, oder einem pharmazeutisch akzeptablen Derivat oder Salz davon, gegebenenfalls in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel behandelt werden. Die Wirkstoffe können durch jeden geeigneten Weg verabreicht werden, beispielsweise oral, parenteral, intravenös, intradermal, subkutan oder topisch, in flüssiger oder fester Form.
Die aktive Verbindung ist in dem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel in einer Menge eingeschlossen, die ausreichend ist, um an einen Patienten eine therapeutisch wirksame Menge abzugeben, ohne dabei ernste toxische Wirkungen bei dem behandelten Patienten zu verursachen.
Eine bevorzugte Dosis der aktiven Verbindung für alle obengenannten Zustände wird in dem Bereich von etwa 1 bis 60 mg/kg, bevorzugt 1 bis 20 mg/kg, Körpergewicht/Tag, im allgemeineren 0,1 bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht des Patienten/Tag liegen. Der wirksame Dosierungsbereich der pharmazeutisch akzeptablen Derivate kann berechnet werden, basierend auf dem Gewicht der abzugebenden Stammnukleoside. Wenn das Derivat selbst Aktivität zeigt, kann die wirksame Dosierung wie oben unter Verwendung des Gewichts des Derivats oder durch andere Mittel, die dem Fachmann bekannt sind, bestimmt werden. In einer Ausführungsform wird die aktive Verbindung, wie in dem Beipackzettel oder dem Physician's Desk Reference für 3'-Azido-3'-deoxythymidin (AZT), 2',3'-Dideoxyinosin (DDI), 2',3'-Dideoxycytidin (DDC) oder 2',3'-Dideoxy-2',3'-didehydrothymidin (D4T) für HIV-Indikation beschrieben, verabreicht.
Die Verbindung wird günstigerweise einheitlich in irgendeiner geeigneten Dosierungsform verabreicht, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, eine, enthaltend 7 bis 3000 mg, bevorzugt 70 bis 1400 mg an Wirkstoff pro Einheitsdosierungsform. Eine orale Dosierung von 50 bis 1000 mg ist normalerweise günstig.
Idealerweise sollte der Wirkstoff verabreicht werden, um Spitzenplasmakonzentrationen der aktiven Verbindung von etwa 0,2 bis 70 μM, insbesondere etwa 1,0 bis 10 μM zu erreichen. Dies kann beispielsweise durch die intravenöse Injektion einer 0,1- bis 5%igen Lösung des Wirkstoffs, gegebenenfalls in Kochsalzlösung, oder verabreicht als eine große Pille des Wirkstoffes erreicht werden.
Die aktive Verbindung kann in Form von pharmazeutisch akzeptablen Salzen bereitgestellt werden. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck pharmazeutisch akzeptable Salze oder Komplexe auf Salze oder Komplexe der Nukleoside, die die gewünschte biologische Aktivität der Ausgangsverbindung behalten und minimale, unerwünschte toxikologische Wirkungen zeigen, wenn überhaupt. Nicht-einschränkende Beispiele von solchen Salzen sind (a) Säureadditionssalze, gebildet mit anorganischen Säuren (beispielsweise Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und dergleichen), und Salze, gebildet mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Oxasäure, Weinsäure, Bernsteinsäure, Äpfelsäure, Ascorbinsäure, Benzoesäure, Gallusgerbsäure, Pamoasäure, Alginsäure, Polyglutaminsäure, Naphthalinsulfonsäuren, Naphthalindisulfonsäuren und Polygalacturonsäure; (b) Basenadditionssalze, gebildet mit Kationen, wie Natrium, Kalium, Zink, Calcium, Bismuth, Barium, Magnesium, Aluminium, Kupfer, Kobalt, Nickel, Cadmium, Natrium, Kalium und dergleichen, oder mit einem organischen Kation, gebildet aus N,N-Dibenzylethylen-diamin, Ammonium oder Ethylendiamin; oder (c) Kombinationen aus (a) und (b); beispielsweise ein Zinktannatsalz oder dergleichen.
Modifikationen der aktiven Verbindung, speziell an den N⁶- oder N⁴- und 5'-O-Stellungen, können die Bioverfügbarkeit und Stoffwechselrat der aktiven Spezies beeinflussen, wodurch Kontrolle über die Abgabe der aktiven Spezies bereitgestellt wird.
Die Konzentration der aktiven Verbindung in der Arzneimittelzusammensetzung wird von den Absorptions-, Inaktivierungs- und Exkretionsgeschwindigkeiten des Arzneimittels sowie anderen Faktoren, die dem Fachmann bekannt sind, abhängen. Es sollte angemerkt werden, daß die Dosierungswerte ebenso mit der Schwere des Zustandes, der gelindert werden soll, variieren werden. Es ist außerdem selbstver ständlich, daß für jeden einzelnen Patienten spezielle Dosierungsregime über die Zeit gemäß der einzelnen Bedürfnisse und professionellen Beurteilung der Person, die die Verabreichung der Zusammensetzung verabreicht oder überwacht, eingestellt werden sollten, und daß die hierin eingestellten Konzentrationsbereiche nur exemplarisch sind, und den Umfang oder die Praxis der beanspruchten Zusammensetzung nicht einschränken sollen. Der Wirkstoff kann einmal verabreicht werden, oder kann in mehrere kleinere Dosen, die bei variierenden Zeitintervallen verabreicht werden sollen, geteilt werden.
Eine bevorzugte Verabreichungsweise der aktiven Verbindung ist oral. Orale Zusammensetzungen werden im allgemeinen ein inertes Verdünnungsmittel oder einen eßbaren Träger umfassen. Sie können in Gelatinekapseln eingeschlossen oder in Tabletten gepreßt werden. Für die Zwecke der oralen therapeutischen Verabreichung kann die aktive Verbindung mit Trägerstoffen eingeführt werden und in Form von Tabletten, Pastillen oder Kapseln verwendet werden. Pharmazeutisch verträgliche Bindemittel und/oder Hilfsmaterialien können als Teil der Zusammensetzung eingezogen werden.
Die Tabletten, Pillen, Kapseln, Pastillen und dergleichen können irgendeinen der folgenden Inhaltsstoffe oder Verbindungen einer ähnlichen Beschaffenheit enthalten: ein Bindemittel, wie mikrokristalline Cellulose, Tragantgummi oder Gelatine; einen Trägerstoff, wie Stärke oder Laktose; ein Auflösungsmittel, wie Alginsäure, Primogel oder Maisstärke; ein Schmiermittel, wie Magnesiumstearat oder Sterotes; ein Gleitmittel, wie kolloidales Siliciumdioxid; ein Süßungsmittel, wie Saccharose oder Saccharin; oder einen Geschmacksstoff, wie Pfefferminze, Methylsalicylat oder Orangenaroma. Wenn die Dosierungseinheitsform eine Kapsel ist, kann sie zusätzlich zu dem Material des obigen Typs einen flüssigen Träger, wie ein Fettöl, enthalten. Außerdem können Dosierungseinheitsformen verschiedene andere Materialien enthalten, die die physikalische Form der Dosierungseinheit modifizieren, beispielsweise Beschichtungen aus Zucker, Schellack oder anderen enterischen Mitteln.
Die aktive Verbindung oder das pharmazeutisch akzeptable Salz oder Derivat davon kann als eine Komponente eines Elixiers, einer Suspension, eines Sirups, einer Waf fel, eines Kaugummis oder dergleichen verabreicht werden. Ein Sirup kann zusätzlich zu den aktiven Verbindungen Saccharose als Süßungsmittel und bestimmte Konservierungsmittel, Farbstoffe und Farbmittel und Aromastoffe enthalten.
Die aktive Verbindung oder das pharmazeutisch akzeptable Derivat oder Salz davon kann ebenso mit anderen Wirkstoffen gemischt werden, die die gewünschte Wirkung nicht beeinträchtigen, oder mit Materialien, die die gewünscht Wirkung unterstützen, wie Antibiotika, Antimykotikum, Entzündungshemmer oder andere Virostatika, einschließlich Anti-HBV-, Anti-EBV-, Anti-Cytomegalovirus- oder Anti-HIV- oder Anti-EBV-Mittel.
Lösungen oder Suspensionen, die zur parenteralen, intradermalen, subkutanen oder topischen Verabreichung verwendet werden, können die folgenden Komponenten umfassen: ein steriles Verdünnungsmittel, wie Wasser zur Injektion, Kochsalzlösung, fette Öle, Polyethylenglykole, Glycerin, Propylenglykol oder andere synthetische Lösungsmittel; antibakterielle Mittel, wie Benzylalkohol oder Methylparabene; Antioxidationsmittel, wie Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit; Chelatbildner, wie Ethylendiamintetraessigsäure; Puffer, wie Acetate, Citrate oder Phosphate und Mittel für die Einstellung der Tonizität, wie Natriumchlorid oder Dextrose. Das parenterale Präparat kann in Ampullen, Wegwerfspritzen oder Mehrfachdosierungsphiolen aus Glas oder Kunststoff eingeschlossen werden.
Wenn intravenös verabreicht, sind bevorzugte Träger physiologische Kochsalzlösung oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS). In einer bevorzugten Ausführungsform werden die aktiven Verbindungen mit Trägern hergestellt, die die Verbindung gegen schnelle Eliminierung aus dem Körper schützen, wie Formulierungen mit kontrollierter Freisetzung, einschließlich Implantate und mikroeingekapselte Abgabesysteme. Bioabbaubare, biokompatible Polymere können verwendet werden, wie Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglykolsäure, Kollagen, Polyorthoester und Polymilchsäure. Verfahren zur Herstellung von solchen Formulierungen werden dem Fachmann offensichtlich sein. Die Materialien können ebenso kommerziell von Alza Corporation und Nova Pharmaceuticals, Inc. erhalten werden.
Liposomale Suspensionen (einschließlich Liposomen, die darauf abzielen, Zellen mit monoklonalen Antikörpern zu viralen Antigenen zu infizieren) werden ebenso als pharmazeutisch akzeptable Träger bevorzugt. Diese können gemäß den Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden, wie beispielsweise in US-Patent Nr. 4,522,811 beschrieben (das hierin durch Verweis in seiner Gesamtheit aufgenommen wird). Beispielsweise können Liposomenformulierungen durch Lösen der entsprechenden Lipide (wie Stearoylphosphatidylethanolamin, Stearoylphosphatidylcholin, Arachadoylphosphatidylcholin und Cholesterin) in einem anorganischen Lösungsmittel gelöst werden, das dann eingedampft wird, was einen dünnen Film aus getrocknetem Lipid auf der Oberfläche des Behälters hinterläßt. Eine wässerige Lösung aus der aktiven Verbindung oder ihrem Monophosphat-, Diphosphat- und/oder Triphosphatderivaten werden dann in den Behälter eingeführt. Der Behälter wird dann per Hand geschwenkt, um das Lipidmaterial von den Seiten des Behälters zu befreien und um Lipidaggregate zu dispergieren, wodurch die Liposomensuspension gebildet wird.

Claims

L-Nukleosid-Verbindung der Formel:
wobei R eine Purin- oder Pyrimidinbase ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Adenin, N⁶-Alkylpurinen, N⁶-Acylpurinen (wobei Acyl C(O)(Alkyl, Aryl, Alkaryl oder Aralkyl) ist), N⁶-Benzylpurinen, N⁶-Halogenpurinen, N⁶-Vinylpurinen, N⁶-acetylenischem Purin, N⁶-Acylpurin, N⁶-Hydroxyalkylpurin, N⁶-Thioalkylpurin, Thymin, Cytosin, 6-Azapyrimidin, 2-Mercaptopyrimidin, Uracil, N⁵-Alkylpyrimidinen, N⁵-Benzylpyrimidinen, N⁵-Halogenpyrimidinen, N⁵-Vinylpyrimidinen, N⁵-acetylenischem Pyrimidin, N⁵-Acylpyrimidin, N⁵-Hydroxyalkylpurin, N⁶-Thioalkylpurin, 5-Azacytidinyl, 5-Azauracilyl, Triazolopyridinyl, Imidazolopyridinyl, Pyrrolopyrimidinyl und Pyrazolopyrimidinyl, und R'' aus Wasserstoff; Acyl, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Acetyl, Propionyl, Butyryl, Pentanoyl, 3-Methylbutyryl, Wasserstoffsuccinat, 3-Chlorbenzoat, Benzoyl, Pivaloyl, Mesylat, Valeryl, Caproyl, Capryloyl, Decanoyl, Lauroyl, Myristoyl, Palmitoyl, Stearoyl und Oleoyl; C₁ bis C₁₀ Alkyl, Monophosphat, Diphosphat und Triphosphat, ausgewählt ist.
L-Nukleosid nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus N₁-(2'-Deoxy-2'-fluor-β-L-arabinofuranosyl)-5-ethyluracil, N₁-(2'-deoxy-2'-fluor-β-L-arabinofuranosyl)-5-iodcytosin und N₁-(2'-deoxy-2'-fluor-β-L-arabinofuranosyl)- 5-ioduracil.
L-Nukleosid nach Anspruch 1, wobei die Base aus der Gruppe, bestehend aus 5-Methyluracil (Thymin), 5-Ioduracil, Cytosin und 5-Ethyluracil, ausgewählt ist.
L-Nukleosid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und pharmazeutisch verträgliche Salze davon zur Verwendung in der Therapie.
Verwendung einer Verbindung nach einem vorhergehenden Anspruch und pharmazeutisch verträgliche Salze davon zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer EBV- oder HBV-Infektion.