CZ292574B6

CZ292574B6 - L-Nukleosidy pro léčení hepatitidy viru B a Epstein-Barr viru

Info

Publication number: CZ292574B6
Application number: CZ19962114A
Authority: CZ
Inventors: Chung K. Chu; Yung-Chi Cheng; Balakrishna S. Pai; Gang-Qing Yao
Original assignee: University Of Georgia Research Foundation Inc.; Yale University
Priority date: 1994-01-28
Filing date: 1995-01-30
Publication date: 2003-10-15
Also published as: EP1283211A3; BG62571B1; WO1995020595A1; FI121846B; DE69530192D1; FI118954B; FI119416B; US5567688A; DE69535047T2; DE69530192T2; US5587362A; NZ330137A; EP1283211B1; AU710262B2; EP0748330A4; HUT75514A; FI962986L; DE69535047D1; BR9506596B1; EP0748330B1

Abstract

L-Nukleosid obecného vzorce I, kde znamená R zbytek 5-methyluracilu, adeninu nebo cytosinu, R'' atom vodíku, skupinu acetylovou, propionylovou, butyrylovou, pentanoylovou, 3-methylbutyrylovou, benzoylovou nebo pivaloylovou nebo znamená C.sub.1-10.n.alkylovou skupinu nebo mono-, di nebo trifosforečnanovou C.sub.1-10.n.alkylesterovou nebo fenylC.sub.1-10.n.alkylesterouvu skupinu a jeho farmaceuticky přijatelné soli jsou účinnými látkami pro farmaceutický prostředek pro ošetřování hostitele infikovaného virem hepatitidy B a Epstein-Barr virem (EBV).ŕ

Description

Tento vynález spadá do oblasti způsobů léčení hepatitidy viru B (také označovaný jako „HBV“) a Epstein-Barr viru (označovaný jako „EBV“), které zahrnují podávání účinného množství jedné nebo více zde popsaných aktivních sloučenin nebo farmaceuticky přijatelného derivátu nebo proléčiva jedné z těchto sloučenin.

Dosavadní stav techniky

Hepatitida viru B dosáhla ve světě úrovní epidemie. Po období dvou až šestiměsíční inkubace, kdy hostitel neví o infekci, může vést HBV infekce k akutní hepatitidě a poškození jater, což vyvolává bolesti břicha, žloutenku a zvýšení hladiny některých enzymů v krvi. HBV způsobuje prudkou hepatitidu, prudce progresivní, často smrtelnou formu nemoci, při které jsou velké části jater zničeny. Obvykle se pacienti z akutní virové hepatitidy uzdraví. U některých pacientů však vysoké hladiny virového antigenu přetrvávají v krvi po delší nebo neomezenou dobu a vyvolávají chronickou infekci. Chronické infekce mohou vést ke chronické přetrvávající hepatitidě. Pacienti infikovaní chronickou trvalou HBV jsou nejvíce soustředěni v rozvojových zemích. Uprostřed roku 1991 bylo pouze v Asii přibližně 225 milionů chronických nosičů HBV, a ve světě kolem 300 milionů nosičů. Chronické trvalé hepatitidy mohou způsobovat únavu, cirhózu jater, hepatocelulámí karcinom a primárně rakovinu jater.

V západních průmyslových zemích vysoce rizikové skupiny pro HBV infekci zahrnují ty, kteří jsou v kontaktu s HBV nosiči nebo s jejich vzorky krve. Epidemiologie HBV je ve skutečnosti velmi podobná získání syndromu ztráty imunity, což vysvětluje, proč je HBV infekce běžná mezi pacienty s AIDS nebo HIV - spojenými infekcemi. HBV je však více nakažlivý než HIV.

HBV je po tabáku druhou příčinou rakoviny lidí.

Mechanismus, kterým HBV indukuje rakovinu, není známý, avšak předpokládá se, že je přímým podnětem rozvoje tumoru, nebo může rozvíjet tumor nepřímo přes chronický zánět, cirhózu a regeneraci buněk spojenou s infekcí.

Epstein-Barr virus (EBV) je členem rodu Lymphocryptovirus, který spadá do podčeledě gammaherpesvirinae. Je zvláště lymfotropní. EPV má klasickou strukturu herpesvirů, totiž jeho dvojitý DNA genom je obsažen v ikosapentaedrickém nukleocapsidu, který je, v řadě, obklopen lipidovým obalem hustě pokrytým vírovými glykoproteiny. Amorfní obalový protein zabírá prostor mezi obalem a nukleocapsidem.

Všechny lidské oparové viry infikují a replikují se do určité míry v lymfocytech, ale EBV je výkonnější. Významnější je, že patogeneze a hostitelské reakce na infekci EBV závisí více na lymfocytní infekci, než je to patrné u jiných lidských oparových virů.

EBV je nyní určen jako příčina B-buněčných lymfoproliferačních chorob a je řazen k varietě ostatních těžkých a chronických onemocnění, včetně vzácného progresivního mononukleóze podobného syndromu a brání vlasové leukoplakie u pacientů AIDS.

Předpoklad, že EBV je hlavní příčinou chronické únavy, není podrobně prozkoumán.

EBV se primárně přenáší slinami, avšak některé infekce jsou přenosné krevní transfuzí. Více než 85 % pacientů v akutní fázi infekční mononukleázy vylučuje EBV. EBV je spojována s rakovinou. Nejméně dvě skupiny pacientů jsou v nebezpečí rozvoje lymfomů spojených s EBV: jsou to

-1 CZ 292574 B6 pacienti, kteří přijali transplantáty ledvin, srdce, kostní dřeně, jater nebo brzlíku se současnou imunosupresivní léčbou a pacienti s AIDS. S ΕΒλ’ spojenými karcinomy jsou Burkittův lymfom a nosohltanový karcinom.

Se zřetelem na skutečnost, že hepatitida viru B a Epstein-Barr viru má těžký a často tragický vliv na infikovaného pacienta, je trvalá snaha vyvinout účinný farmaceutický prostředek pro léčení lidí infikovaných viry vysoce toxickými pro hostitele.

Úkolem vynálezu je proto vyvinout sloučeninu, prostředek a způsob léčení hepatitidy viru B a Epstein-Barr viru.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je L-nukleosid obecného vzoru I

OH

kde znamená

R zbytek 5-methyluracilu, adeninu nebo cytosinu,

R atom vodíku, skupinu acetylovou, propionylovou, butyrylovou, pentanoylovou, 3-methylbutyrylovou, benzoylovou nebo pivaloylovou nebo znamená alkylovou skupinu s 1 až 10 atomy uhlíku nebo monofosforečnanovou, difosforečnanovou nebo trifosfosforečnanovou alkylesterovou skupinu s 1 až 10 atomy uhlíku nebo fenylalkylesterovou skupinu s 1 až 10 atomy uhlíku v alkylovém podílu, a jeho farmaceuticky přijatelné soli.

Ve výhodném provedení je nukleosid stanoven jako indikovaný enantiomer a v podstatě za nepřítomnosti jeho korespondujícího enantiomerů (např. enantiomemě obohacený, včetně enantiomemě čisté formy).

V jednom výhodném provedení je účinnou sloučeninou 2'-fluor-5-methyl-p~L-arabinofuranosyluridin (také označovaný jako L-FMAU). Tato sloučenina je potencionálním antivirovým činidlem proti HBV a EBV a vykazuje nízkou cytotoxicitu.

Další specifické příklady aktivní sloučeniny zahrnují

N i-(2 '-deoxy-fluor-p-L-arabinofuranosyl)-5-ethyluracil,

N j-(2 '-deoxy-2 '-fluor-p-L-arabinofuranosyl)-5-iodocytosin),

N]-(2'-deoxy-2'-fluor-P-L-arabinofuranosyl)-5-iodouracil.

-2CZ 292574 B6

V alternativním provedení je L-nukleosid stanovený pro použití při léčení HBV nebo EBV tak. že obsahuje 2'-arabinohydroxylovou skupinu, např. L-arathymidin, L-fludarabin, L-araguanosin, a L-arainosin, jak je zobrazeno na obr. 1.

Zde popsané L-nukleosidy a jejich farmaceuticky přijatelné formulace obsahující tyto sloučeniny jsou vhodné při prevenci a léčení HBV infekcí a jiných podobných stavů jako anti-HBV protilátka pozitivní a HBV-pozitivní, chronické poškození jater vyvolané HBV, cirhóza. akutní hepatitida, prudká hepatitida, chronická trvalá hepatitida, a únava.

Sloučeniny mohou být podobně použity při léčení EBV-přidružených nemocí.

Tyto sloučeniny nebo formulace mohou také být použity profylakticky k prevenci nebo zpoždění progrese klinických onemocnění u jednotlivců, kteří jsou anti-HBV nebo anti-EBV protilátka nebo HBV- nebo EBV-antigen pozitivní, nebo byli vystaveni HBV nebo EBV.

V dalším provedení mohou být účinná sloučenina nebo její deriváty nebo soli podávány v kombinaci nebo alternaci s jinou anti-HBV látkou nebo anti-EBV látkou, včetně těch uvedených výše, nebo anti-HIV látkou.

Obecně během alternativní léčby je účinné dávkování každé látky podáváno v sérii, zatímco při kombinační terapii je účinné dávkování dvou nebo více látek podávaných společně. Dávkování bude záviset na absorpční, inaktivační rychlosti a rychlosti vylučování léků, stejně jako na dalších faktorech známých odborníkovi v oboru. Je potřeba poznamenat, že hodnoty dávkování se také budou měnit s těžkostí stavu, který se má zmírnit. Dále je zřejmé, že pro některé zvláštní subjekty by měla být uzpůsobena specifická dávkovači schémata a časové plány po dobu podle individuální potřeby a odborného posudku osoby podávající nebo dohlížející na podávání kompozice.

Neomezující příklady antivirových látek, které mohou být použity v kombinaci se zde popsanými sloučeninami zahrnují (-)-enantiomer 2-hydroxymethyl-5-(5-fluorcytosin-l-yl)-l,3-oxathiolanu (FTC);

(-j-enantiomer 2-hydroxymethyl-5-(cytosin-l-yl)-l ,3-oxathiolanu (3TC);

karbovir, acyklovir, interferon, AZT,

DDI (2',3'-dideoxyinosin), DDC (2',3'-dideoxycytidin), L-DDC, L-5-F-DDC a D4T.

Popis obrázků

Obr. 1 zobrazuje vybrané L-nukleosidy, které spadají do předloženého vynálezu:

L-FMAU (2 '-fluor-5-methyl-P~L-arabinofuranosyluridin),

L-FIAU (2 '-fluro-5-jod-p-L-arabinofuranosyluridin),

L-FC (2'-fluor-P~L-arabinofuranosylcytosin),

L-FIAC (2 -fluor-5-jod-p-L-arabinofuranosylcytosin),

L-2-C1-2 '-F-2 '-deoxyadenin,

L-FEAU (2 '-fluor-5-ethyl-|3-L-arabinofuranosyluridin),

L-arathymidin, L-fludarabin, L-araguanosin, a L-ara-inosin.

Obr. 2 je graf v procentech životaschopných buněk proti koncentraci léčiva L-FMAU v H1 buňkách.

-3CZ 292574 B6

Obr. 3 je schematickým zobrazením přípravy l-0-acetyl-2,3,5-tri-0-benzoyl-p_L-ribofuranózy (sloučenina 10).

Obr. 4 je schematickým zobrazením alternativní přípravy l-0-acetyl-2,3.5-tri-0-benzoyl-P-Lribofuranózy (sloučenina 10).

Obr. 5 je schematickým zobrazením způsobu přípravy l,3,5-tri-O-benzoyl-2-deoxy-2-fluor-aL-arabinoforanózy (sloučenina 13).

Obr. 6 je schematickým zobrazením způsobu přípravy N?-[3 '-,5'-di-O-benzoyl_2'-deoxy-2'fluor-p-L-arabinofuranosyl]-2,6-di-chlorpurinu (sloučenina 15) a

7Vj>—[2—deoxy—2'—fluor—β—L—arabinofuranosyl]—2,6—di—chlorpurinu (sloučenina 16).

Obr. 7 je zobrazením způsobu přípravy více 2'-deoxy-2'-fluor-^-L-arabinofuranosyl]-pyrimidinů (sloučeniny 17-24).

Obr. 8 je zobrazením způsobu přípravy 7V;-(2'-deoxy-2'-fluor-p-L-arabinoftiranosyl)-5-jodocytosinu (sloučenina 22).

Obr. 9 je zobrazením způsobu přípravy 9-p-L-arabinofuranosy laděn inu.

Obr. 10 je zobrazením alternativního způsobu přípravy l-0-acetyl-2,3,5-tri-0-benzoyl-P-Lribofuranózy (sloučenina 10) z 1,2-di-CMzopropyliden-a-L-xylofuranózy (sloučenina 3).

Obr. 11 je graf koncentrace plazmy L-(-)-FMAU myší po orálním podání v nastavený čas (křížek, lOmg/kg podaná dávka (dvakrát denně) po 29 dní před farmakokinetickou studií a potom se studie provede třicátý den při podání ve stejné koncentraci; tmavý kroužek, 50 mg/kg podávaná dávka po 29 dní před studií a potom se provede rozbor třicátý den v podání ve stejné koncentraci; prázdný kroužek, 50 mg/kg podáno poprvé první den studie).

Obr. 12 je graf koncentrace L-(-)-FMAU v játrech myší po orálním podání v nastavený čas (křížek, lOmg/kg podaná dávka (dvakrát denně) po 30 dní před farmakokinetickou studií a potom se studie provede třicátý první den při podání ve stejné koncentraci; tmavý’ kroužek, 50 mg/kg podávaná dávka po 30 dní před studií a potom se provede rozbor třicátý první den v podání ve stejné koncentraci; prázdný kroužek, 50 mg/kg podáno poprvé první den studie).

Obr. 13a zobrazuje změnu hmotnosti těla po třiceti dnech kontroly BDF1 samičky myší.

Obr. 13b a 13c zobrazují změnu hmotnosti těla po třiceti dnech BDF1 samičky myši dávkování 10 mg/kg dávky (13b) a 50 mg/kg (13c) L-(-)-FMAU. Uvedená hmotnost těla znamená průměrnou a standardní odchylku pěti až sedmi myší.

Obr. 14-20 předkládají klinickou chemii myší plazmy po podávání L-(-)-FMAU při 10 mg/kg (tři myši) nebo 50 mg/kg (tři myši) podáváno po třicet dní.

Obr. 14 je šrafovaný diagram koncentrace celkového bilirubinu v plazmě myší v mg/dl.

Obr. 15 je šrafovaný diagram koncentrace alkalické fosfatázy v plazmě myši v U/l.

Obr. 16 je šrafovaný diagram koncentrace kreatininu v plazmě myší v mg/dl.

Obr. 17 je šrafovaný diagram koncentrace AST (SGOT, sérum glutamové šťavelové transaminázy) v plazmě myší v U/l.

-4CZ 292574 B6

Obr. 18. je šrafovaný diagram koncentrace ALT (SPGT, sérum glutamové pyrovik transminázy) v myší plazmě v U/l.

Obr. 19 je šrafovaný graf koncentrace kyseliny mléčné v plazmě myší v mmol/1.

Obr. 20 je šrafovaný graf koncentrace mléčné dehydrogenázy v plazmě myší v U/l.

Podstata vynálezu

Jak bylo řečeno, termín „enantiomemě obohacený“ označuje nukleosidovou kompozici, která zahrnuje nejméně přibližně 95 %, a výhodně přibližně 97 %, 98 %, 99 % nebo 100 % jediného enantiomeru tohoto nukleosidu.

Zde používaný termín alky l zejména zahrnuje, ale neomezuje se na ně, C] až C_]0 alkylové skupiny, včetně methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, izopropyl, izobutyl, sek.-butyl, t-butyl, izopentyl, amyl, t-pentyl, cvklopentyl a cyklohexyl.

Zde používaný termín acyl zejména zahrnuje, ale neomezují se na ně, acetyl, propionyl, butyryl, pentanoyl, 3-methylbutyryl, hydrogen sukcinát, 3-chlorbenzoát, benzoyl, acetyl, pivaloyl, methansulfonát, propionyl, valeryl, kyseliny kapronové, kyseliny kaprylové, kyseliny kaprinové, kyseliny laurové, kyseliny myristové, kyseliny palmitové, kyseliny stearové a kyseliny olejové.

Zde používaný termín aryl, pokud není definován jinak, značí fenyl.

Termín „chráněný“, zde používaný, pokud není definovaný jinak, označuje skupinu, která se přidá k dusíkovému nebo kyslíkovému atomu k zabránění jeho další reakce v průběhu derivatizace dalších podílů molekuly, ve které je kyslík nebo dusík umístěn.

Pro odborníka v oboru organických syntéz je známá široká řada kyslík a dusík chránících skupin.

Termín purinová nebo pyrimidinová báze zahrnuje, ale neomezuje se na ně, adenin, N⁶alkylpuriny, V-acylpuriny (kde je C(O) (alkyl, aryl, alkaryl, nebo aralkyl), A^-benzylpurin, N⁶halopurin, Λ—vinylpurin, Ý-acetylenpurin, A^-acylpurin, A^-hydroxylalkylpurin, M-thioalkylpurin, thymin, cytosin, 6-azapyrimidin, 2-merkaptopyrimidin, uráčil, ů^-alkylpyrimidiny, N⁵benzylpyrimidiny, V-halopyrimidiny, Ý-vinylpyrimidin, A^-acetylenpyrimidin, A^-acylpyrimidin, jV^J-hydroxyalkylpurin, Ý-thioalkylpurin, 5-azacytidinyl, 5-azauracilyl, triazolopyridinyl, imidazolopyridinyl, pyrrolopyrimidinyl, pyrazolopyrimidinyl.

Funkční skupiny na bázi kyslíku a dusíku jsou chráněny jak je nezbytné nebo žádoucí. Vhodné chránící skupiny jsou odborníkovi v oblasti techniky dobře známé, a zahrnují trimethylsilyl, dimethylhexylsilyl, t-butyldimethylsilyl, a t-butyldifenylsilyl, tritylmethyl, alkylskupiny, acylskupinyjako je acetyl, propionyl, butyl, methylsulfonyl a p-toluylsulfonyl.

Specificky zahrnuje 5-methyluracil (thymin), 5-jodouracil, cytosin, a 5-ethyluracil.

Vynálezem, jak je zde popsán, je způsob a kompozice pro léčení HBV infekce, EBV infekce, a jiných virů replikujících podobným způsobem, u lidského nebo zvířecího hostitele, jako je HIV, který zahrnuje podání účinného množství jedné nebo více výše identifikovaných b-nukleosidů, nebo jejich fyziologicky přijatelných solí, výhodně na farmaceuticky přijatelném nosiči. Sloučeniny podle tohoto vynálezu mají buď anti-HBV aktivitu, anti-EBV aktivitu, nebojsou metabolizovány na sloučeninu nebo sloučeniny, které vykazují anti-HBV nebo anti-EBV aktivitu. Sloučeniny zde popsané mohou být také použity k léčení HBV a EBV sdružených nemocí.

-5CZ 292574 B6

Účinná sloučenina může být podána jako jakýkoliv derivát, kteiý je při podání příjemci schopný poskytnout přímo nebo nepřímo výchozí látku, nebo který vykazuje aktivitu sám o sobě.

Neomezujícími příklady jsou farmaceuticky přijatelné soli (alternativně označované jako „fyziologicky přijatelné soli“), a 5'- a acylované nebo alkylované purinové nebo pyrimidinové deriváty aktivní sloučeniny (alternativně označované jako „fyziologicky aktivní deriváty“).

V jednom provedení je acylovou skupinou ester karboxylové kyseliny (např. -C(O)R'), ve kterém je nekarbonylová část (R') esterskupiny vybraná z přímého, větveného nebo cyklického C] až Cio alkylu, alkoxyalkylu včetně methoxymethylu, aralkylu včetně benzylu, aryloxyalkylu jako je fenoxymethyl, arylu včetně fenylu výhodně substituovaného halogenem, Ci až C₄ alkylem nebo Ci až C₄ alkoxyskupinou, estersulfonátu jako je alkyl nebo aralkylsulfonyl včetně methansulfonlu, mono-, di- nebo trifosforečnan ester, trityl nebo monometoxytrityl, substituovaný benzyl, trialkylsilyl (např. dimethyl-t-butylsilyl) nebo difenylmethylsilyl. Arylskupiny v esterech výhodně obsahují fenyl nebo benzylskupinu. Alkylskupinou může být přímá, větvená nebo cyklická, výhodně Ci až C₁₀ skupina.

I. Syntéza L-nukleosidů

L-nukleosidy zde popsané mohou být připraveny dále podrobně popsanými způsoby, nebo způsoby známými z oblasti techniky.

Ve schématech syntéz popsaných dále lze použít namísto zde uvedených jiná standardní činidla, včetně ekvivalentních kyselin, bází a rozpouštědel, jak jsou známé odborníkovi v oblasti techniky. Lze použít širokou oblast chránících skupin kyslíku a dusíku, které jsou popsány, např., v Green a kol., „Protective Groups in Organic Synthesis,“ John Wiley and Sons, druhé vydání, 1991.

Vhodné chránící skupiny kyslíku a dusíku zahrnují, například, trisubstituovanou silylskupinu, jako je trimethylsilyl, dimethylhexylsilyl, t-butyldimethylsilyl, t—butyldifenylsilyl, trityl, alkylskupina, acylskupiny jako je acetyl, propionyl, benzoyl, p-NO₂, benzoyl, benzyl nebo toluyl, methylsulfonyl, nebo p-toluylsulfonyl.

Funkční skupiny kyslíku a dusíku na bázi heterocyklu mohou být chráněny před kondenzací s cukrem.

Vhodná redukční činidla zahrnují NaBHi, diizobutylaluminium hydrid (DIBA1-H), tetrahydroboritan lithný (LiBH₄), a bis(metoxyetoxy)aluminium hydrid sodný (Red-Al).

Vhodná oxidační činidla zahrnují vodnou kyselou kyselinu chromovou (HCrO₃), dichroman sodný (Na₂CrO₇), pyridinium chlorchroman (PCC), pyridinium dichroman (PDC), manganistan draselný (KMnO₄), tetraacetát olova/pyridin, kyslík na katalyzátoru platina/uhlík, RuO₄, RuO₄/NaIO₄, dimethylsulfoxid/dicyklohexylkarbodiimid (DMSO/DCC) a donor protonu, uhličitan stříbrný, karbonáttrifenylbizmut, Oppenaurova oxidace (alkoxid hliníku v acetonu) a oxid manganičitý (pro selektivní oxidaci allylových nebo benzylových alkoholů za přítomnosti jiných alkoholů).

Friedel-Craftsovy katalyzátory (Lewisovy kyseliny), které mohou být použity při kondenzačních reakcích, zahrnují SnCl₄, ZnCl₄, TiCl₄, A1C1₃, FeCl₃, BF₃-diethyleter a BC1₃. Tyto katalyzátory vyžadují bezvodé podmínky, neboť přítomnost vody snižuje jejich aktivitu. Katalyzátoiy jsou také inaktivovány za přítomnosti organických rozpouštědel s aktivním vodíkem, jako jsou alkoholy a organické kyseliny. Katalyzátory jsou typicky používány v rozpouštědlech, jako je sulfid uhličitý, methylenchlorid, nitromethan, 1,2-dichlorethan, nitrobenzen, tetrachlorethan, chlorbenzen, benzen, toluen, dimethylformamid, tetrahydrofuran, dioxan nebo acetonitril. Bezvodý chlorid hlinitý není rozpustný v sulfidu uhličitém. Niedballa a kol., J. Org. Chem. 39, 25 (1974).

-6CZ 292574 B6

Preferovaným katalyzátorem je SnCl₄. Výhodným rozpouštědlem je 1,2-dichlorethan. Trimethylsilyltriflát může být použit za stejných podmínek popsaných vý še pro Friedel-Craftsovy katalyzátory.

Reakce probíhá při teplotě v rozmezí od -10 °C do 200 °C. Desilylace se může provádět s různými reagenty, včetně kyseliny octové, kyseliny trifluoroctové, hydrogenfluoridu, n-tetrabutylamoniumfluoridu, fluoridu draselného a pyridinium HC1.

S odkazem na obr. 3, vycházejícím z L-xylózy (la), klíčový meziprodukt 1 -O-acety 1-2,3,5—tri— O-benzoyl-P-L-ribofuranóza (10) byl syntetizován v celkovém výtěžku 20% (L. Vargha, Chem. Ber., 1954, 87, 1351; Holý, A., a kol., Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry, VI, 163-67).

Jak je uvedeno na obr. 4, sloučenina 10 může být také syntetizována z dražšího výchozího materiálu L-ribózy (Holý, A., a kol., Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry, VI, 163-67).

Obr. 3 ilustruje alternativní syntézu sloučeniny 10 (výtěžek 53 %), který je následně fluorován na C₂ (J. Org. Chem., 1985, 50, 3644-47) a získá se l,3,5-tri-Ó-benzoyl-2-deoxy-2-fluor-Larabinofuranóza (13), která byla kondenzována s různými bázemi přes bromcukr k poskytnutí 2'-deoxy-2'-fluorarabinofuranosylnukleosidy v různých výtěžcích.

1.2- Di-O-izopropyliden-a-L-xylofuranóza (3)

Do 650 ml bezvodého acetonu byly přidány 4 ml koncentrované kyseliny sírové, 5 g molekulárního síta (4A), 80 g bezvodého síranu měďnatého a 50 g L-xylózy a směs byla míchána při teplotě místnosti 36 hodin. Reakční směs byla zfiltrována a důkladně promyta acetonem, spojené filtráty byly neutralizovány hydroxidem amonným a odpařeny do sucha. Byl přidán ethylacetát (200 ml), potom zfiltrován a odpařen. Vytěžený olej, který byl rozpuštěn ve 250 ml roztoku 2% HC1, byl míchán při teplotě místnosti 2,5 hod. pH bylo udržováno na 8 nasycených NaHCO₃, potom byl odpařen do sucha, zbytek byl extrahován ethylacetátem. Odstranění rozpouštědla poskytne žlutý olej sloučeniny 3 (41,7 g, 82,3 %).

*H-NMR (CDCIj): δ 5,979 (d, J = 3,78 Hz, 1H, H-l); 4,519 (d, J = 3,6 Hz, 1H, H-2); 4,308 (bd, 1H, H-3); 4,080 (m, 3H, H^l) a H-5); 1,321 (s, 3H, CH₃); 1,253 (s, 3H, CH₃).

1.2- Di-0-izopropyliden-3,5-di-0-o-tolylsulfonyl-a-L-xylofuranóza (4)

Sloučenina 3 (40 g, 210 mmol) byla míchána v 500 ml bezvodého pyridinu při 0 °C, zatímco TsCl (75 g, 393 mmol) byl rozpuštěn ve 100 ml CHC1₃ a byl přidán po kapkách. Po 3 hodinách byl přidán stejně jako předtím další podíl TsCl (50 g, 262 mmol) v 50 ml CHC1₃. Směs byla míchána při teplotě místnosti 24 hod, potom ochlazena na 0 °C, byla přidána voda (10 ml), a mícháno při teplotě místnosti 30 minut. Reakční směs byla vložena do 500 ml ledové vody, extrahována CHCI₃ (150 ml x 4), promyta 1,5M H₂SO₄ (150 ml x 4), nasyceným NaHCO₃(200 ml x 2), sušena (MgSO₄).

Odstraněním rozpouštědla vznikne hnědý sirup, který během krystalizace z EtOH dává (4) jako bílou pevnou látku (103,8 g, 99 %).

’Η-NMR (CDC1₃) δ 7,282; 7,836 (m, 8H, OTs); 5,849 (d, J = 3,51 Hz, 1H, H-l); 4,661; 4,779 (m, 2H, H-3 a H-4); 4,193 (dd, 1H, H-2); 4,011 (d, 2H, H-5); 2,448; 2,478 (2s, 6H, -OTs); 1,261; 1,320 (2s, 6H, CH₃).

l,2-Di-0-acetyl-3,5-di-0-p-tolylsulfonyl-a.[3-xylofuranóza (5)

Sloučenina 4 (70 g, 140,5 mmol) byla rozpuštěna v 700 ml ledové AcOH a 100 ml Ac₂O, zatímco 50 ml konc. kyseliny sírové bylo přidáno po kapkách při 0 °C. Výsledný roztok byl míchán přes noc při teplotě místnosti a potom nalit do 1 1 ledové vody, extrahován CHC1₃(200 ml χ 4), promyt nasyc. HaHCO₃, sušen (MgSO₄). Po odstranění rozpouštědla ve vakuu byl získán (5) jako sirup (82,4 g, výtěžek suroviny 110 %).

Methyl-3,5-di-O-p-tolylsu!fbnyl-a,p-xylofuranóza (6)

Surovina (5) (80 g) byla míchána v 500 ml 1% HCI/CH3OH při teplotě místnosti 30 hod. Rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku, zbytek rozpuštěn ve 300 ml CHC1₃, promyt nasyc. NaHCO₃, sušen (MgSO₄).

Odstranění rozpouštědla poskytlo (6) jako sirup (60 g, 90 % ze (4)).

Methyl-2-O-benzoy 1-3,5-di-O-p-toly Isulfony Ι-α,β-xy lofuranosid (7)

Sirup (6) (60 g, 127 mmol) byl rozpuštěn ve 200 ml pyridinu a míchán při 0 °C, zatímco benzoylchlorid (40 ml, 345 mmol) byl přidán po kapkách, výsledný roztok byl míchán při teplotě místnosti 17 hod. Byl zkoncentrován na asi 50 ml, potom vložen do 300 ml ledové vody, extrahován CHCI3, promyt 3N H₂SO₄ a nasyc. NaHCO₃, sušen (MgSO₄). Po odpaření rozpouštědla byl získán (7) jako sirup (71 g, 97 %).

Methyl-2,3,5-tri-0-benzoyl-a,p-L-ribofuranosid (9)

Sirup (7) (70 g) a benzoát sodný (100 %, 694 mmol) byl suspendován v 1200 ml DMF a mechanicky míchán pod refluxem po 26 hod. Byl ochlazen na teplotu místnosti a potom vložen do 1 1 ledové vody, extrahován etherem, sušen (MgSO₄).

Odpařením rozpouštědla byl získán sirup (50 g, 8a a 8b), který byl rozpuštěn ve 180 ml pyridinu a benzoylován (BzCl, 20 ml, 172 mmol) po 17 hod při teplotě místnosti. Po skončení byl získán (9) jako hnědý sirup (48 g, 83 % ze (7)).

l-0-acetyl-2,3,5-tri-0-benzoyl-a,|3-ribofuranóza (10)

Sloučenina (9) (26 g, 54,6 mmol) byla zpracována s 275 ml ledové kyseliny octové, 55 ml acetanhydridu a 16 ml konc. kyseliny sírové při 0 °C při teplotě místnosti po 17 hod. Potom byla nalita do 1 1 ledové vody, extrahována chloroformem (200 ml χ 4). Spojené extrakty byly promyty nasyc. NaHCO₃ a sušeny (MgSO₄). Po odstranění rozpouštědla byl získán hnědý sirup, který byl zpracován s ethanolem za vzniku (10) jako bílé pevné látky. (8,8 g, 32 %). t.t. 124,7 °C, lit. 129-130 °C;D forma: 130-131 °C [a]_D = ^15,613 (c 1,0; CHCI3), D forma: [a]_D = +44,2.

'H-NMR (CDClj): δ 7,317; 8,134 (m, 15H, OBz); 6,437 (S, 1H, H-l); 5,835 (m, 2H, H-2 a H3); 4,649 (m, 3H, H-4 a H-5); 2,003 (s, 3H, CH3COO-).

l-0-acetyl-2,3,5-tri-0-benzoyl-a,|3-ribofuranóza (z L-ribózy)

L-Ribóza (5 g, 33,3 mmol) byla suspendována ve 120 ml 1% HCl/MeOH a míchána při teplotě místnosti po 3 hod, až se získá jasný roztok. Reakce byla zchlazena přidáním 30 ml bezvodého pyridinu, potom byla látka odpařena za sníženého tlaku.

Výsledný sirup byl odpařen spolu s pyridinem (30 ml χ 2), potom rozpuštěn v 80 ml bezvodého pyridinu a míchán při 0 °C, zatímco benzoylchlorid (20 ml, 172 mmol) byl přidán po kapkách. Pomíchání při pokojové teplotě po 17 hod byla reakce ukončena. Voda (10 ml) byla přidána

-8CZ 292574 B6 a směs byla míchána při teplotě místnosti 0,5 hod, potom zkoncentrována na asi 50 ml. vlita do

150 ml ledové vody, extrahována chloroformem (50 ml χ 4), promyta postupně 3N H₂SCh (30 ml x 2), nasyc NaHCO₃ (30 ml x 3), a sušena (MgSO₄).

Odstraněním rozpouštědla byl získán (9) jako 13 g sirupu. Surový (9) byl rozpuštěn v 80 ml HBr/AcOH (45 %, hmotn./obj.) a míchán při teplotě místnosti 1,5 hod. Do této směsi byla přidána ledová kyselina octová (50 ml) a výsledný roztok byl míchán při 0 °C. přičemž 34 ml vody bylo pomalu přidáváno při udržování teploty pod 7 °C. Potom byl míchán při teplotě místnosti 1 hod, vnesen do 200 ml ledové vody, extrahován chloroformem (50 ml x 5). Spojené extrakty byly promyty nasyc. NaHCO₃, sušeny (MgSO₄).

Po odstranění rozpouštědla se získal sirup (13 g), který byl rozpuštěn ve 40 ml bezvodého pyridinu, míchán při 0 °C. Po kapkách byl přidán acetanhydrid (14 ml, 148,4 mmol). Po ukončení reakce byl produkt vnesen do 150 ml ledové vody, extrahován chloroformem (50 ml x 4). promvt postupně 3N H₂SO₄ (30 ml χ 2), nasyc. NaHCO₃ (50 ml χ 2), a usušen (MgSO₄).

Po odstranění rozpouštědla a zpracování s methanolem byl získán (10) jako bílá pevná látka (9,2 g, 53,7 % z L-ribózy).

1.3.5- Tri-C>-benzoyl-a,|3-ribofuranóza (11)

Sloučenina 10 (9 g, 17,84 mmol) byla míchána v 10 ml CH₂C1₂ při 0 °C, zatímco 70 ml CH₂C1₂obsahujícího HBr (3,2 g, 30,5 mmol) bylo přidáno v jedné dávce. Směs byla míchána při 0 °C po 3,5 hod, byla přidána voda (55 ml) a směs byla míchána při teplotě místnosti 18 hod. Organická vrstva byla odebrána, promyta nasyc. NaHCO₃, sušena (MgSO₄). Po odpaření rozpouštědla byla získána pěna, která po rekrystalizaci z CH₂C1₂ a n-hexanu poskytla (11) jako bílou pevnou látku. (6,2 g, 75,5%), t.t. 137-138 °C, lit. 140-141 °C, [a]_D = -81,960 (c 0,55, CHC1₃; D forma: [a]_D = +83,71.

‘H-NMR (CDC1₃): δ 7,312; 8,187 (m, 15H, OBz); 6,691 (d, J = 4,58 Hz, H-l); 5,593 (dd, J₄_₃= 6,66; J₂_₃ = 1,8 Hz, 1H, H-30; 4,637 (m, 4H, H-2, H-4 a H-5); 2,3 (b, OH).

1.3.5- Tri-O-benzoyl-2-CMmidazosulfuryl-a-L-ribofuranóza (12)

Sloučenina (11) (5,94 g, 12,84 mmol) byla míchána v 50 ml bezvodého CH₂C1₂ při -15 ^CC (suchý led -CCI₄). Bezvodý DMF (15 ml) a sulfurylchlorid (3,2 ml, 3,98 mmol) byly přidány postupné. Roztok byl míchán při -15 °C 30 min a potom ponechán při teplotě místnosti po 4 hod. Ve třech částech byl přidán imidazol (8,7 g, 12,78 mmol), přičemž reakční směs byla chlazena v ledové lázni. Potom byla míchána při teplotě místnosti po 17 hod. Směs byla vnesena do 150 ml ledové vody a vodní fáze byla extrahována CH₂C1₂ (50 ml χ 3). Spojené organické vrstvy byly promyty' vodou a sušeny (MgSO₄). Purifikace na koloně (hexan: EtOAc/5:l - 1:1) poskytla (12) jako pevnou bílou látku (3,7 g, 49 %). m.p. 124,5-125,5 °C, lit: 129 °C; [a] = -68,976; D forma: +66,154.

'N-NMR (CDC1₃): δ 6,9; 8,2 (m, 18H, Ar-H); 6,67 (d, J = 4,4 Hz, 1H, H-l); 5,59 (dd, 1H, H-3); 5,21 (dd, 1H, H-2); 4,5, 4,8 (m, 3H, H-4 a H-5).

1.3.5- Tri-O-benzoyl-2-deoxy-2-fluor-a-L-arabinofuranóza (13)

Suspenze (12) (3,33 g, 5,62 mmol), KHF₂ (1,76 g, 22,56 mmol) v 30 ml 2,3-butandiolu byla míchána pod argonem. Byla zahřívána na 150 °C zatímco byl přidáván 1 ml HF/H₂O (48%, 27,6 mmol) a směs byla míchána při 160 °C 1,5 hod. Byla přidána ledová solanka ke zmrazení reakce, a potom byl roztok extrahován methylenchloridem (50 ml x 4). Spojené extrakty byly promyty solankou, vodou, nasyc. NaHCO₃, sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým a aktivním uhlím (Darco-60). Potom byl nalit na podložku ze silikagelu (5 cm χ 5 cm), promyt

-9CZ 292574 B6 methylenchloridem a potom EtOAc za vzniku sirupu, přičemž z 95% EtOH byl krystalizován (13) (1.3 g, 49,8 %). t.t. 77-78 °C; lit.: 82 °C.

'N-NMR (CDC1₃): δ 7,314, 8,146 (m, 15H, OBz); 6,757 (d, J = 9,1 Hz, 1H, H-l); 5,38 (d, J = 48,5 Hz, 1H, H-2); 5,630 (dd, J = 22,5 Hz, 1H, H-3); 4,768 (m, 3H, H-4 a H-5).

A^rjr-[3 .5 -Di-O-benzoyl-2'-deoxy-2'-fluor-p-L-arabinofuranosyl]-2,6-di-chlorpurin (15)

Sloučenina 13 (464 mg, 1 mmol) byla rozpuštěna v 10 ml methylenchloridu, zatímco bylo přidáno 1,4 ml HBr/AcOH (45% hmotn./obj.). Roztok byl míchán při teplotě místnosti 24 hod, a potom odpařen do sucha. Zbytek byl rozpuštěn ve 20 ml methylenchloridu a promyt vodou, nasyc. NaHCOs, sušen (MgSO₄). Filtrací a odpařením vznikl bromcukr (14) (100 %, na základě TLC).

Ve stejnou dobu byl 2,6-dichlorpurin (378 mg, 2 mmol) suspendován v 15 ml HMDS a 2 mg síranu amonného, a potom vařen pod zpětným chladičem 2 ho. HMDS byl odpařen ve vysokém vakuu pod dusíkem N₂ za vzniku bílé silylované báze.

Bromcukr 14 byl rozpuštěn ve 25 ml bezvodého 1,2-dichlorethanu, Výsledný roztok byl přidán do silylované báze pod N₂. Směs byla míchána pod refluxem po 2 dny. Byl přidán chloroform, a potom postupně promýván vodou (20 ml x 2), nasyc. NaHCO₃ (20 ml x 2), nasyc. NaCl roztok (20 ml x 2), a sušen (MgSO₄). Z CHC1₃ krystalizovala sloučenina 15 (105 mg, 19,7%). t.t. 158 °C;D forma: 158 °C.

UV (methanol): λ^: 238,50 nm, 273,0 nm.

'H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 8,82 (d, J = 1,5 Hz, 1H, H-8); 7,49; 8,33 (m, 10H, OBz); 6,767 (dd, J_h_h = 4 Hz, K_F__H = 13,8 Hz, 1H, H-l'); 5,854 (dq, J = 67,4 Hz, 1H, H-2'); 5,910 (m, 1H, H-3'); 4,751 (m, 3H, H-4' a H-5').

N9-[2'-deoxy-2'-fluor-|3-L-arabinofuranosyl]-2,6-di-chlorpurin (16)

Sloučenina (15) (70 mg, 0,13 mmol) byla rozpuštěna ve 25 ml nasyc. NH₃/CH₃OH v utěsněné ocelové bombě a zahřívána na 90 °C 6 hod. Po odstranění rozpouštědla za sníženého tlaku byla získána žlutá polotuhá látka, která byla čištěna preparativní TLC (9:1/CHC1₃:CH₃OH).

Lyofílizaci z vody a 1,4-dioxanu byl získán bílý prášek (16) (30 mg, 75 %). UV (H₂O) pH 2, λ,^ 212,00 nm, (ε 6711); pH7, 213,50 nm, 263,00 nm (ε 7590); pH 11, 213,5 nm,

263,00 nm (ε 5468).

'H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 8,279 (d, J = 1,5 Hz, 1H, H-8); 7,908 (bs, 2H, NH₂); 6,321 (dd, J_H-h = 4,4 Hz, J_F__H = 13,8 Hz, 1H, Η-Γ); 5,986 (t, 1H, 5' -OH); 5,230 (dt, J_F__H = 52,6 Hz, 1H, H-2'); 5,115 (d, 1H, 3' -OH); 4,425 (dq, J_F__H = 19 Hz, 1H, H = 3’); 3,841 (m, 1H, H-4'); 3,636 (d, 2H, H-5').

N_t-(2 '-Deoxy-2 '-fluor-3 ',5 '-di-CM>enzoyl-|3-L-arabinofuranosyl)-thymin (17)

Do roztoku (13) (400 mg, 0,86 mmol) vbezvodém CH₂C1₂ (10 ml) byl přidán bromovodík v kyselině octové (45% hmotn./obj., 1,5 ml), a získaný roztok byl míchán při teplotě místnosti 17 hod. Po odpaření rozpouštědla a společném odpaření s toluenem byla získána sloučenina (14).

Ve stejnou dobu byl thymin (215 mg, 1,72 mmol) vařen pod zpětným chladičem v HMDS (25 ml) pod dusíkem 17 hod a byl získán homogenní roztok. Po odpaření rozpouštědla byl získán silylovaný thymin.

-10CZ 292574 B6

Roztok (14) v dichlormethanu (50 ml) byl přidán do silylovaného thyminu a výsledný roztok byl vařen pod zpětným chladičem pod dusíkem 3 dny. Byla přidána voda a potom byl produkt extrahován CHC1₃. Organická vrstva byla promyta vodou, solankou a sušena (MgSO₄). Po odpaření rozpouštědla se získal syrový produkt, který byl čištěn preparativní TLC při použití 2% MeOH/CHCl₃ za vzniku (17) (235 mg. 58 %). m.p. 99-101 °C. UV (Methanol): 230, 264 nm [a]_D = +22,397.

'H-NMR (CDC1₃): δ 7,343 - 8.389 (m, 12H. Ar-H. NH); 6,34 (dd, J_H__H = 2,97 Hz, J_F__H = 28,32 Hz, 1H, H-l'); 5,383 (dd, J_h_h = 2,7 Hz, J_F__H = 63,27 Hz, 1H, H-2'); 5,565 (dd, 1H, H-3'); 4,812 (d, 2H, H-5'); 4,466 (m, 1H. H-4'): 1,775 (s, 3H, CH₃). Anal. (C₂₄H₂1H₂O₇F), C: 61,01; H; 4,57; N: 5,73; F: 3,92.

A/-(2'-Deoxy-2'-fluor-[3-L-arabinofuranosyl)-thymin (18)

Sloučenina (17) (145 mg, 0,309 mmol) byla zpracována s HN₃/CH₃OH při teplotě místnosti po 18 hod. Po odpaření rozpouštědla a purifikaci preparativní TLC (15% MeOH/CHCl₃) byl získán (18) (70 mg, 87,5 %). t.t. 174-175 °C. UV: 264 nm, [a]_D = -104,36.

H-NMR (DMSO-dé): δ 11,401 (s. 1H, NH); 7,575 (s, 1H, H-6); 6,093 (dd, J_H-_H = 4,41 Hz, J_F__H= 15,6 Hz, Η-Γ); 5,844 (d, 1H, 3' -OH); 5,019 (dt, J_F__H = 53,3 Hz, 1H, H-2'); 5,087 (t, 1H, 5' -OH); 4,194 (dq, 1H, H-3'): 3,647 (m, 3H, H-4' a H-5'); 1,781 (s, 3H, CH₃). Anal. (Ci₀H₁₃N₂FO₅), C: 44,80; H: 4,97; N: 10,04; F: 7.03.

Ni~(2 '-Deoxy-2 '-fluor-3 ',5 '-di-O-benzoyΙ-β-L-arabinofuranosyl)-5-ethyluracil (19)

Do roztoku (13) vbezvodém dichlormethanu (10 ml) byl přidán bromovodík v kyselina octové (45% hmotn./obj., 0,97 mi, 5,385 mmol). Roztok byl míchán při teplotě místnosti po 18 hod, a po odpaření rozpouštědla a společném odpaření s toluenem byl získán (14).

Ve stejnou dobu byl 5-ethyluracil (0,75 g, 5,39 mmol) suspendován v HMDS (10 ml) síranem amonným (5 mg) a vařen pod zpětným chladičem 5 hod pod dusíkem za vzniku homogenního roztoku.

Roztok silylované báze byl odpařen do sucha se zabráněním přístupu vlhkosti. Do vzniklého sirupu byl přidán roztok (14) v bezvodém 1,2-dichlorethanu (10 ml). Reakční směs byla míchána při 95 °C pod dusíkem 20 hod, potom odpařena pod vakuem do sucha za vzniku žluté pevné látky, která byla smísena s 5 ml CH₃OH/CHC1₃ (1:1) a zfiltrována. Filtrát byl odpařen a zbytek byl chromatografován na koloně silikagelu (CH-OH/CHC1₃, 0-1%) za vzniku bílé pevné látky (19) (0,557 g, 100%).

'H-NMR (DMSO-d₆): δ 11,55 (s, 1H, NH); 7,51, 8,08 (m, 10H, Ar-H); 7,32 (s, 1H, H-6); 6,29, 6,37 (dd, H_H-h = 3,7 Hz, J_F__H = 20 Hz, 1H, H-l'): 5,68 - 5,75 (dd, J_F__H = 20 Hz, 1H, H-3'), 5,47 - 5,65 (dd, J_F__H = 54 Hz, 1H, H-2'); 4,62 - 4,83 (m, 3H, H-4' a H-5'); 2,01; 2,09 (q, 2H, CH₂CH₃); 0,85 (t, 3H, CH₃).

N_s-{2 '-Deoxy-2 '-fluor-(3-L-arabinofuranosyl)-5-ethyluráčil (20)

Sloučenina (19) (500 mg) byla rozpuštěna v methanolickém amoniu (50 mi) a míchána při teplotě místnosti 44 hod. Roztok byl odpařen do sucha za vzniku bílé pevné látky (0,4 g), která byla chromatografována na koloně silikagelu. (CH₃OH/CHC1₃, 0-5%) za vzniku bílé pevné látky (20) (240 mg, 84 %). t.t. 158-161 °C.

UV (MeOH): 260 nm.

-11 CZ 292574 B6 'H-NMR (DMSO-d₆): δ 11,42 (s, IH. NH); 7,57 (s, IH, H-6'); 6,10, 6'17 (dd, J_H__H = 5,0 Hz,

J_F__H = 14 Hz, IH, Η-Γ); 5,88 (bs, IH. 3'-OH); 5,14, 5,19 (m, 2H, H-2' a 5'-OH); 4,98 (t. IH,

H-3'); 4,22, 4,28 (m, IH, H-4); 3,55. 3,78 (m, 2H, H-5') Anal. (C_H H₁₅N,O₅F): C: 47,93; H:

5,56; N: 10,06; F: 6,68.

Ni~(2 '-Deoxy-2 '-fluor-3 ',5 '-di-C>-benzoyl-[3-L-arabinofuranosyl)-?/-benzoyl-5-jodcytosin (21)

Do roztoku (13) (150 mg, 0,323 mmol) v bezvodém methylenchloridu (5 ml) byl přidán bromovodík v kyselině octové (45% hmotn./obj., 0,29 ml, 1,615 mmol). Reakční směs byla míchána při teplotě místnosti 9,5 hod. Po odpaření rozpouštědla a odpaření spolu s toluenem byl získán (15) jako žlutý sirup.

Současně byl Ý-benzoyl-5-jodcytosin (550 mg, 1,615 mmol) suspendován vHMDS (8 ml) se síranem amonným (3 mg) a vařen pod zpětným chladičem 5 hod pod dusíkem za vzniku homogenního roztoku.

Roztok silylované báze byl odpařen do sucha při současném zabránění přístupu vlhkosti. Do získaného sirupu byl přidán roztok (14) v bezvodém 1,2-dichlorethanu (10 ml). Reakční směs byla vařena pod zpětným chladičem pod dusíkem 23 hod, potom byla odpařena do sucha za vzniku hnědého sirupu, který byl rozetřen s chloroformem (30 ml). Získaná sraženina byla odfiltrována a promyta chloroformem. Filtráty a výplachy byly spojeny a odpařeny za vzniku hnědého sirupu. Směs produktu byla oddělena chromatografií na koloně silikagelu (CH3OH/CHCI3, 01%) za vzniku bílé pevné látky (21) (100 mg, 45 %).

‘H-NMR (CDCI3): δ 11,40 (bs, IH, NH); 7,26, 8,20 (m, 17H, Ar-H, H-6 a NH); 6,36, 6,44 (dd, Jh_h = 2,8 Hz, J_F__H = 21 Hz, IH, Η-Γ); 5,62; 5,68 (dd, IH, H-3'); 5,39; 5,56 (dd, IH, H-2'); 4,58; 4,85 (m, 3H, H-4' a H-5’).

M~(2'-Deoxy-2'-fluor-p-L-arabinofuranosyl)-5-jodcytosin (22)

Sloučenina (21) (100 mg, 0,27 mmol) byla zpracována s nasyc. NH₃/MeOH (60 ml) při pokojové teplotě po 24 hod. Silikagelová kolonová chromatografie (0-10% CH3OH/CHCI3) poskytla sloučeninu (22) (35 mg, 71 %) jako bílou pevnou látku. [a]_D = -65,4 (c 0,34, CH₃OH); UV (MeOH): 'k_max, = 293 nm.

’Η-NMR (DMSO-d₆); δ 8,04 (s, IH, H-6); 6,74; 7,94 (s, IH, NH); 6,01; 6,08 (dd, J_H-h = 3,9 Hz, Jp_H = 16,6 Hz, IH, Η-Γ); 5,85 (d, IH, 3'-OH); 5,17 (t, 1-H, 5'-OH); 5,08 (Τ, IH, H-2'); 4,89 (t, IH, H-3'); 4,15 - 4,23 (m, IH, H-4'); 3,63 - 3,79 (m, 2H, H-5').

M-(2'-Deoxy-2'-fluor-3',5'-di-O-benzoyl-[J-L-arabinofuranosyl)-5-joduracil (23)

Do roztoku (13) (260 mg, 0,56 mmol) v 10 ml bezvodého CH₂C1₂ byl přidán HBr/AcOH (45%, hmotn./obj., 0,5 ml, 2,8 mmol). Reakční směs byla míchána při pokojové teplotě 36 hod a potom odpařena do sucha. Zbytek byl rozpuštěn ve 20 ml CH₂C1₂, promyt vodou (10 ml), nasyc. NaHCO₃ (10 ml) a sušen (MgSO₄). Filtrací a odpařením byl získán bromcukr (14) jako sirup.

Současně byl 5-joduracil (270 g, 1,12 mmol) suspendován v 10 ml HMDS a vařen pod zpětným chladičem 36 hod za vzniku homogenního roztoku. Ten byl odpařen ve vakuu do sucha. K němu byl přidán roztok (14) v bezvodém 1,2-dichlorethanu, a výsledný roztok byl vařen pod zpětným chladičem pod N₂ 1,5 dne. Byl přidán CHC1₂ (20 ml) a roztok byl promyt postupně vodou (10 ml), solankou (10 ml) a nasyc. NaHCO₃ (10 ml) a potom sušen (MgSO₄). Odstraněním rozpouštědla se získal sirup, který byl rekrystalován v CH₂C1₂ za vzniku (23) jako žluté pevné látky (237 mg, 73 %). Její část (70 mg) byla rekrystalována z 2-izopropanol za vzniku bílé pevné látky (67 mg). UV(Methanol): 230,0 nm, 276,0 nm.

- 12CZ 292574 B6 'H-NMR (CDCI3): δ 8,4; 7,3 (m, 12H, Ar-H); 6,29 (dd, J_H._H = 2,43 Hz, J_F__H = 21,6 Hz, 1H,

Η-Γ); 5,377 (dd, J_H__H = 2,8 Hz, J_F__H = 61,3 Hz, 1H, H-2'); 5,55 (dd, 1H, H-3'); 4,865; 4,793 (c. 2H, H-5'); 4,588; 4,502 (m, 1H, H-4').

Ni~(2 '-Deoxy-2 '-fl uor-(3-L-arabinofuranosy 1)—5—j odurac i 1 (24)

Sloučenina (23) (40 mg, 0,069 mmol) byla rozpuštěna ve 25 ml nasyc. HN₃/MeOH a míchána při teplotě místnosti po 24 hod a potom odpařena do sucha. Výsledný sirup byl purifikován na preparativní TLC (5:l/CHCl₃:MeOH) za vzniku (24) jako pevné látky (19 mg, 74 %).

UV(MeOH): 280,5 nm.

'N-NMR (DMSO-d₆): δ 11,82 (bs, CONH); 8,24 (s, 1H, H-6); 6,082 (dd, H_h__h = 4,45 Hz, J_f_h = 13,7 Hz, 1H, Η-Γ); 5,947 (d, 1H, 3'-OH); 5,296 (t, 1H, 5'-OH); 5,07 (dt, J_F__H = 53 Hz, 1H, H-2'); 4,24 (bd, J_F__H = 21 Hz, 1H, H-3'); 3,81; 3,55 (m, 3H, H-4', H-5').

2.3.5- Tri-O-benzyl-L-arabinóza

Jak je znázorněno na obr. 9, 30 g (0,2 mol) práškové L-arabinózy (5) a potom 0,4 ml koncentrované kyseliny sírové bylo přidáno do 600 ml (14,8 mol) bezvodého methanolu. Suspenze byla míchána a potom zahřívána opatrně pod zpětným chladičem za vzniku čistého roztoku 2 hod. Reakční směs byla neutralizována 1,5 g hydrogenuhličitanu sodného, sušena (Na₂SO₄), a potom byla odpařena ve vakuu za vzniku těžkého sirupu (6), který byl zředěn 50 ml právě vyčištěného tetrahydrofuranu a rekoncentrován (lázeň 35-40 °C) k odstranění zbytků methanolu. Byl přidán čerstvě vyčištěný tetrahydrofuran (400 ml) a směs byla zpracována s30g Drierite, 156 g (2,78 mol) hydroxidu draselného, a 200 ml (1,74 mol) benzylchloridu. Směs byla zahřívána pod mírným refluxem přes noc, ochlazena, zfiltrována přes tenkou vrstvu celitu, a koncentrována ve vakuu, a potom ve vysokém vakuu a 100 °C (lázeň). Syrový sirup methyl 2,3,5-tri-O-benzyl-Larabinosid (7) byl rozpuštěn ve 400 ml ledové kyseliny octové. Hydrolyzovaná směs byla zahřívána na 65-70 °C 2 hod, koncentrována ve vakuu na jednu třetinu svého objemu, a vnesena do 2,5 1 směsi ledové vody.

Po naočkování (zárodečné krystaly byly původně získány chromatografií a byly vymývány dichlormetanem) směs byla držena při 5 °C přes noc. Vodná vrstva byla dekantována z částečně krystalické hmoty a poslední byla rozpuštěna ve 200 ml dichlormethanu. Roztok byl promyt studeným, vodným hydrogenuhličitanem sodným, sušen (NaSO₄), zfiltrován přes tenké lože odbarvovacího uhlí, a koncentrován ve vakuu na řídký sirup, který byl rozpuštěn ve 200 ml cyklohexanu.

Po naočkování byl udržován roztok při teplotě místnosti 1 hodinu a při 5 °C přes noc za vzniku 27,7 g (33,2 %) 2,3,5-tri-O-benzyl-L-arabinózy (8). t.t. 68-73 °C.

[a]²⁵ _D = 1,69 [C 2,01, 9:1 (obj./obj. p-dioxan-voda)]

UV (MeOH) λ™* 220; 300 - MHz 1HNMR (CDC1₃) δ 3,48 - 3,62 (m, 2H, H-5); 3,94 - 4,18 (m, 3H, H-2,3,4), 5,33 (d, 1H, J = 4,07, H-l); 5,29 (s, H-l); 7,25 - 7,33 (m, 15, H-aromat).

2.3.5- T ri-O-benzy 1-1 -O-(p-nitrobenzoyl)-L-arabinóza (9)

Sloučenina 8 (obr. 9) (2 g, 4,76 mmol) byla rozpuštěna v 7,5 ml dichlormethanu, a do tohoto roztoku byl přidán roztok 0,95 g (5,1 mmol) p-nitrobenzoylchloridu ve směsi s 5 ml dichlormethanu a 1,5 ml pyridinu. Reakční směs byla udržována při teplotě místnosti přes noc, potom byla promývána postupně IN kyselinou chlorovodíkovou (2x 10 ml), vodným hydrogenuhliči

-13CZ 292574 B6 taném sodným (2x 10 ml), a vodou (3χ 30 ml). Vlhkost byla odstraněna pomocí Na₂SO₄, roztok byl koncentrován ve vakuu za vzniku 2,67 g (98,4 %) směsi anomerů sloučeniny 9, t.t. 68-82 °C.

Dalším čistěním silikagelovou kolonovou chromatografií (hexan:aceton, 8:1) se zvýšila t.t. na 89-93 °C; [a]^?4 _D = 13,04 (C 6,8, CH₂C1₂),

UV (MeOH) 7_max 215,5 a 258,5, 250 MHz 1NMR (CDC1₃): δ 3,54 - 3,69 (m, 2H, H-5), 4,06 (m, IH, H-4'), 4,22 (m, IH, H-3'), 4,33 (m, IH, H-2'), 4,38 - 4,78 (m, 6H, benzyl CH₂), 6,50 (d, IH, J = 2,35, H-l), 7, 23 - 7,36 (m, 15H, H-aromat. z benzylskupiny), 8,01 - 8,25 (m, 4H, H-aromat. z nitrobenzoylskupiny).

(2,3,5-Tri-<9-benzyl-p-L-arabinosyl) thymin (12)

Thymin 0,444 g (3,52 mmol) a síran amonný (2 mg) byly suspendovány v hexamethyldisilazanu 10 ml, který byl vařen pod zpětným chladičem (140 °C) přes noc pod argonem za vzniku jasného roztoku. Nadbytek hexamethyldisilazanu byl odstraněn ve vakuu při současném zabránění přístupu vlhkosti za vzniku sirupu (11).

Sloučenina (9) (1 g, 1,76 mmol) byla přidána do 17 ml dichlormethanu předsyceného bezvodým chlorovodíkem při 0 °C. Po 2 hod při 0 °C byla vysrážená p-nitrobenzoová kyselina (0,25 g) odstraněna filtrací a filtrát byl koncentrován ve vakuu na slabý sirup a potom udržován pumpou v hlubokém vakuu při teplotě místnosti po 2 hod za vzniku 2,3,5-tri-O-benzyl-a-L-arabinosylchloridu (10).

Sloučenina (10) takto připravená byla rozpuštěna v 15 ml bezvodého dichlormethanu, a roztok byl přidán do směsi silylovaného thyminu (11) a 3 g 4A molekulárního síta. Reakční směs pak byla míchána při teplotě místnosti pod argonem po 18 hod. Reakční směs byla zředěna 50 ml dichlormethanu a nalita do 2 ml nasyceného vodného NaHCO₃ za intenzivního míchání. Vznikla bílá sraženina (hydroxid cínu), která byla odfiltrována na loži zcelitu. Organická vrstva byla z vody oddělena a promyta vodou (3x 30 ml). Vodná vrstva byla extrahována dichlormethanem, a spojená dichlormethanová vrstva byla sušena nad Na₂SO₄, a potom odpařena ve vakuu za vzniku sirupu, který byl čištěn silikagelovou kolonovou chromatografií (chlorofornrmethanol, 100:1) za vzniku (12) jako sirupu 0,68 g (73%).

[ct]²⁵ _D = —56,71 (C 0,6, CH₂C1₂).

UV (MeOH) 218 a 265; 300 MHz 1HNMR (CDC1₃): δ 1,67 (d, 3H, J = 1,11, CH₃), 3,66 - 3,70 (m, 2H, H-5'), 4,06 (m, IH, H-4'), 4,13 (t, IH, J = 4,7, H-3'), 4,24 (t, IH, J = 4,7, H-2'), 4,41; 4,54; 4,56 (m, 6H, benzyl CH₂, 6,28 (d, IH, J = 5,24, Η-Γ), 7,15 - 7,33 (m, 15H, H-aromat), 7,43 (d, IH, J = 1,31, H-6).

Ι-β-L-arabinofuranosylthymin (13)

Chlorid palladnatý (680 mg, 3,835 mmol) byl suspendován ve 100 ml methanolu a redukován mícháním s vodíkem při teplotě místnosti. Roztok 450 mg látky (12) ve 25 ml methanolu byl potom přidán do kyselé suspenze palladiové černi. Reakční směs potom byla míchána s vodíkem při teplotě místnosti 38 hod. Po odstranění katalyzátoru byl roztok neutralizován Dowexem (HCO₃-) na pH 7 a koncentrován ve vakuu na bílou pevnou látku, která rekrystalovala s ethanolem za vzniku (13) (105 mg, 47,7%). t.t. 244 - 249 °C. [a]²⁵D = -91,48 (0,25, H2O); IR(KBr): 1750, 1600 cm’¹ (CO); UV(MeOH): λ™, 268; 300 MHz 1HNMR (DMSO-d6): δ 1,76 (s, 3H, CH₃), 3,62 (t, 2H, J = 4,56, H-5'), 3,69 (m, IH, H-4'), 3,90 (t, IH, J = 3,88, H-3'), 3,99 (t, IH, J = 4,10, h-2'), 5,08 (br s, IH, D'5-OH, vyměnitelný), 5,42 (d, IH, J = 4,24, C'2-OH nebo C'3OH, vyměnitelný), 5,54 (d, IH, J = 5,23, C'2-OH nebo C'3-OH, vyměnitelný), 5,97 (d, IH, J = 4,64, Η-Γ), 7,52 (d, IH, J = 0,97, H-6), 11,26 (s, IH, NH, vyměnitelný). Anal. kale, pro Ci₀H₁₄N₂O₆; C, 46,51; H, 5,46; N, 10,85; nalezeno: C, 46,67; H, 5,63; N, 10,56.

-14CZ 292574 B6 l-(2,3,5-Tri-0-benzyl-p-L-arabinosyl)cytosin (15)

Cytosin 0,61 g (6 mmol) a síran amonný (2 mg) byly suspendovány v hexamethyldisilazanu 15 ml, který byl vařen pod zpětným chladičem (140 °C) pod dusíkem 2 hod za vzniku jasného roztoku. Směs silylovaného cytosinu byla odpařena do sucha ve vakuu při současném zabránění přístupu vlhkosti za vzniku sirupu (14).

Sloučenina (9) (2,82 g, 5 mmol) byla přidána do 47 ml suchého dichlormethanu předsyceného bezvodým chlorovodíkem při 0 °C. Po 2 hod při 0 °C byla vysrážená p-nitrobenzoová kyselina (0,807 g) odstraněna filtrací, a filtrát byl koncentrován ve vakuu za vzniku sirupu 2,3,5-tri-Obenzyl-a-L-arabinosylchloridu (10).

Takto připravená sloučenina (10) byla rozpuštěna ve 28,5 ml bezvodého dichlormethanu, a roztok byl přidán do směsi silylovaného cytosinu (14) a 8,3 g 4A molekulového síta.

Reakční směs byla míchána při teplotě místnosti pod dusíkem 5 dní. Potom byla reakční směs zředěna 50 ml nasyceného vodného NaHCO₃ za intenzivního míchání. Vznikla bílá sraženina (hydroxid cínu), která byla odfiltrována na loži celitu. Organická vrstva byla oddělena od vodné a promyta vodou (3*30 ml). Vodná vrstva byla extrahována dichlormethanem a spojená dichlormethanová vrstva byla sušena nad Na₂SO₄, a potom odpařována ve vakuu za vzniku sirupu, který byl vyčištěn silikagelovou kolonovou chromatografií (chloroform/mathanol, 96:4) za vzniku (15) jako bílé pevné látky, která byla rekrystalizována se 2-propanolem za vzniku 1,53 g (60%), t.t. 146-148 °C, [a]²⁵ _D =-105,2 (Cl, CH₂C1₂), VU(MeOH): Zmax 211,5, Zrnin 272, 5, phl, ph7; Zmax 211,5, Zrnin 284, ph9, 300 MHz í HNMR (CDC1₃) δ: 3,65 (D, 2H, J=4,85, H-5'), 4,00 (t, 1H, J=3.72, H-3), 4,11 (m, 1H, H-4'), 4,28 (m, 1H, H-2'), 4,38-4,55 (m, 6H, benzyl CH₃), 5,56 (d, 1H, J-7.5, H-5), 6,39 (d, 1H, J=4,59, Η-Γ), 7,12-7,31 (m, 15H, H-aromat), 7,63 (d, 1H, J=7,5, H-6).

Ι-β-L-Arabinofuranosylcytosinhydrochloridová sůl (16) katalytickou hydrogenací (15)

Chlorid palladnatý (315 g, 1,78 mmol) byl suspendován ve 160 ml methanolu a redukován mícháním s vodíkem při teplotě místnosti. Do kyselé suspenze palladiové černi potom byl přidán roztok 300 mg (15) v 54 ml methanolu. Reakční směs byla míchána s vodíkem při teplotě místnosti po 3 hod.

Po odstranění katalyzátoru byl roztok neutralizován Dowexem (HCO₃), koncentrován ve vakuu a potom čištěn preparativní TLC (MeOH:CHCl₃, 3:5) za vzniku sirupu, který byl rozpuštěn ve 3 ml methanolu, přidán roztok 1% HCI v MeOH na pH 1, zkoncentrován do sucha a rozetřen s 2-propanolem za vzniku 36 mg (22,1 %) (16). T.t. 190-194 °C, [a]²⁵ _D = - 115,47 (C 0,07, H20); UV(H20), max 275, pH7; Zmax 209,5,273, pHll; Zmax 280, pHl; 300 MHz 1 HNMR (DMSO-d6); δ 3.61 (c, 2H, H-5'), 3,82 (m, 1H, H-4'), 3,93 (m, 1H, H-2' nebo H-3'), 4,04 (brs, 1H, H-2') nebo H-3'), 5,18 (br s, 1H, C5'-OH, vyměnitelný), 5,61 (br s, 1H, C2'-OH nebo C3'-OH, vyměnitelný), 5,67 (br s, 1H, C2'-OH nebo C3'-OH, vyměnitelný), 6,00 (d, 1H, >4,02, Η-Γ), 6,01 (d, 1H, J₅,₆=7,8; H-5) 7,92 (d, 1H, J₅,₆=7,8, H-6), 8,49 (br s, 1H, NH, vyměnitelný), 9,38 (br s, 1H, vyměnitelný).

Ι-β-L-ArabinofuranosyIcytosin hydrochloridová sůl (16) zpracováním sloučeniny (15) s chloridem boritým ml 1M chloridu boritého v dichlormethanu bylo ochlazeno na -72 °C (suchý led-aceton). Roztok (15) (180 mg, 0,351 mmol) ve 3 ml dichlormethanu byl pomalu přidáván do roztoku chloridu boritého. Po celkové reakční době 2,75 hodin byla chladicí lázeň odstraněna a rozpouštědlo a plyn byly odstraněny ve vakuu. Zbytek byl rozpuštěn v chladném dichlormethanu (10 ml) a roztok byl odpařen do sucha (3 krát, dokud nebyl získán bílý pevný zbytek), byl přidán chladný

-15CZ 292574 B6 nasycený roztok hydrogenuhličitanu sodného k dosažení pH 6-7. Směs byla zředěna ethanolem, zahřáta k varu, zpracována dřevěným uhlím a zfiltrována. Filtrát byl odpařen na sirup, který byl zředěn 3 ml methanolu, přidán roztok 1% HC1 v methanolu na pH 1, zkoncentrován do sucha a rozmělněn s 2-propanolem za vzniku (16) (66 mg, 78,4 %).

9-(2,3,5-Tri-O-benzyl-p-L-arabinosyl)adenin (18)

Důkladně vysušená sloučenina 9 (5 g, 8,8 mmol) byla přidána do 82 ml dichlormethanu předsyceného bezvodým chlorovodíkem při 0 °C. Po dvou hodinách reakce při 0 °C byla vysrážená pnitrobenzoová kyselina (1,53 g) odstraněna filtrací, a filtrát byl koncentrován ve vakuu na sirup, který byl potom držen v úplném vakuu při teplotě místnosti 2 hod. 2,3,5-tri-O-benzyl-a-Larabinosylchlorid (10) takto připravený byl rozpuštěn v 50 ml dichlormethanu a roztok byl přidán do směsi 4,5 g (18,8 mmol) sušeného V-benzoyladeninu⁵ (17) a 14,5 g 4A molekulového síta. Reakční směs byla míchána při teplotě místnosti 1 týden, zfiltrována přes lože celitu a koncentrována ve vakuu na sirup, který byl chromatografován na silikagelu při použití hexan/acetonu (3:1, Rf=0,22). Produkt byl oddělen a zkoncentrován ve vakuu na sirup, který byl rozpuštěn a míchán s methanolovým amoniem (20 ml) v bombě z nerez oceli, a zahříván přes noc na 5055 °C. Roztok byl potom koncentrován při sníženém tlaku za vzniku polopevné látky, která rekrystalizovala z horkého izopropylalkoholu za vzniku (18) 2,4 g (50,7%). T.t. 128-129 °C. [a]²⁷ _D= -20,04 (1.04, CH₂C1₂); UV (CH₂C1₂); Xmax213, 285,5; 250 mHz 1 HNMR (CDC1₃): δ 1,95 (br s 1H, NM, vyměnitelný), 3,69 (d, 2H, J=4.82, H-5'), 4,18-4,30 (m, 6H, benzyl CH₂), 4,51-4,64 (m, 3H, H-2', 3', 4'), 5,73 (br s, 1H, NH, vyměnitelný), 6,52 (d, 1H, J-4,00, Η-Γ), 6,89-6,93, 7,17-7,37 (m, 15H, H-aromat z benzylskupiny), 8,17 (s, 1H, H-2 nebo H-8), 8,32 (s, 1H, H-2 nebo H-8).

9-p-L-Arabinofuranosyladenin (19)

Chlorid boritý (5 ml 1M) v dichlormethanu byl chlazen na -72 °C (suchý led-aceton). Roztok (18) (150 mg, 0,279 mmol) v 5 ml dichlormethanu byl pomalu přidán do roztoku chloridu boritého. Po úplném proběhnutí reakce po 3,5 hod byla chladicí lázeň odstraněna a rozpouštědlo a plyn byly odstraněny ve vakuu. Zbytek byl rozpuštěn v chladném dichlormethanu (10 ml) a roztok byl odpařen do sucha (6krát, dokud nebyl získán žlutý pevný zbytek). Chladný nasycený roztok hydrogenuhličitanu sodného byl přidán k dosažení pH 7-8. Směs byla zředěna methanolem, zahřívána k varu, suspenze byla zfiltrována přes celit, filtrát byl zkoncentrován ve vakuu na sirup, který krystalizoval z vody. Bylo získáno 55 mg (74%) (19). T.t. 256-258 °C, UV (H₂O): Xmax 259; 300 MHz 1 HNMR (DMSO-d6): δ: 3,62-3,66 (m, 2H, H-5'), 3,77 (br s, 1H, H-4'), 4,13 (br s, 2H, H-2', 3'), 5,12 (t, 1H, >5,4, C'5-OH, vyměnitelný), 5,54 (d, 1H, >3,78, C'2-OH nebo C'3-OH, vyměnitelný), 5,63 (d, 1H, >4.32, C'2-OH nebo C'3-OH, vyměnitelný), 6,25 (d, 1H, >4,02, Η-Γ), 7,25 (br s, 2H, NH2, vyměnitelný), 8,13 (s, 1H-H-2 nebo H-8), 8,18 (s, 1H, H-2 nebo H-8).

Obrázek 10 ilustruje alternativní cestu přípravy l-Oacetyl-2,3,5-tri-0-benzoyl-3-L-ribofuranózy (sloučenina 10) z 1,2-di-O-izopropyliden-a-L-xylofuranózy (sloučenina 3).

1,2-Di-Oizopropy liden-a-L-xylofuranóza (3)

Do 650 ml bezvodého acetonu byly přidány 4 ml konc. kyseliny sírové, 5 g molekulárního síta (4A), 80 g bezvodého síranu měďnatého a 40 g L-xylózy. Směs byla míchána při teplotě místnosti 36 hod. Potom byla reakční směs zfiltrována a promyta důkladně acetonem, spojené filtráty byly neutralizovány hydroxidem amonným a potom odpařeny do sucha. Byl přidán ethylacetát (200 ml) a potom produkt filtrován a odpařen za vzniku oleje, který byl rozpuštěn ve 250 ml 0,2% HC1 a roztok byl míchán při teplotě místnosti 2,5 hod. pH 8 bylo dosaženo nasyceným NaHCO₃, potom byl produkt odpařen do sucha. Zbytek byl extrahován ethylacetátem. Odstranění rozpouštědla poskytlo žlutý olej (3) (41,7 g, 82,3%).

-16CZ 292574 B6 'H-NMR (CDCI3): δ 5,979 (d, J=3,78 Hz, 1H, H-l); 4,519 (d, J=3,6 Hz, 1H, H-2); 4,308 (bd, 1H, H-3); 4,080 (m, 3H, H-4 a H-5); 1,321 (s, 3H, CH₃); 1,253 (s, 3H, CH₃).

5-O-Benzoyl-l,2-di-O-izopropyliden-a-L-xylofuranóza (25)

Sloučenina 3 (41 g, 215,6 mmol) byla míchána v pyridinu (150 ml) a CH₂C1₂ (150 ml) při 0 °C. BzCl (27,5 ml, 237 mmol) rozpuštěný ve 30 ml pyridinu byl přidán po kapkách. Po 30 min byla přidána voda (5 ml) a směs byla odpařena do sucha, rozpuštěna v EtOAc, promyta nasyc. NaHCO₃, a potom sušena (Na₂SO₄). Po odpaření rozpouštědla zůstal oranžový sirup, který krystalizoval v Et₂O za vzniku sloučeniny (20) (36 g). Matečná tekutina byla odpařena do sucha a zbytek byl čištěn silikagelovou kolonovou chromatografii (1% CH₃OH/CHC1₃) za vzniku další dávky sloučeniny (25) (12 g, celkový výtěžek 76 %). T.t. 82-83 °C. lit¹ D forma: 83,5-84,5 °C. 'H-NMR (CDC1₃): δ 7,43, 8,07 (m, 5H, Ar-H); 5,97 (D, 1H, J=3,6 Hz, H-l); 4,80 (q, 1H, H-4); 4,60 (d, 1H, J=3,6 Hz, H-2); 4,40, 4,20 (m, 3H, H-5, H-5',H-3); 3,50 (bs, 1H, D₂O výměna, 30H); 1,51; 1,32 (2s, 6H, 2CH₃).

5-0-Benzoyl-l,2-di-0-izopropyliden-a-L-erythro-pentofuranos-3-ulóza (26)

Sloučenina 25 (40 g, 136 mmol) byla míchána ve 450 ml CH₂C1₂. Byl přidán dvojchroman pyridinia (PDC, 30,7 g, 81,6 mmol) a Ac₂O (42,3 ml, 448,8 mmol). Směs byla vařena pod zpětným chladičem 2,5 hod. Roztok byl zkoncentrován na 1/5 svého původního objemu, potom byl přidán etylacetát (50 ml) a roztok byl zfiltrován. Filtrát byl nalit na silikagelovou podložku (10 cm x 5 cm), eluován EtOAc, spojené eluanty byly koncentrovány a spolu odpařeny s toluenem (50 ml x 2). Krystalizace z hexanu a EtOAc poskytla (21) jako bílou pevnou látku (38 g, 96 %). T.t. 91-93 °C, [a]_D: - 132° (c, 1,0, CHC1₃); lit² D forma: b.t. 93-94,5 °C, [a]_D: + 135° (c, 1,0, CHCi₃); IR (KBr): 1773 cm- (ArCO), 173 °Cm- (CO).'H-NMR (CDC1₃): δ 7,97, 7,42 (m, 5H, Ar-H); 6,14 (d, 1H, J = 4,4 Hz, H-l); 4,74, 4,68 (m, 2H, H-4, H-2); 4,50 4,44 (m, 2H, H-5, H-5'); 1,52, 1,44 (2s, 6H, 2CH₃). Anal.Kalc. (C_I5H₁₆O₆): C, 61,64; H, 5,52; Nalezeno: C, 61,42;

H, 5,53.

I, 2-di-O-izopropyliden-a-L-ribofuranóza (27)

Sloučenina (26) (37 g, 127 mmol) byla rozpuštěna vEtOH/H₂O (400 ml/100 ml) při 0 °C, přičemž NaBHi (23.3 g, 612 mmol) byl přidán v dávkách. Suspenze byla míchána při teplotě místnosti 4 hod. Potom byla zfiltrována a filtrát byl odpařen do sucha a odpařen spolu s methanolem. Po chromatografii na silikagelové koloně (0-15 % CH₃OH/CH₂C1₂) a kiystalizaci z EtOAc/hexanu, byl získán (27) jako bílá jehla (19 g, 79 %). T.t. 86-87 °C; [a]_D-31,5° (c, 0,62, CHC1₃); lit³, D forma: T.t. 86-87 °C, [a]_D: + 37° (c, 0,59, CHCI₃); IR (KBr): 3356cm-(OH). 'H-NMR (CDC1₃) δ 5,83 (d, 1H, J = 3,98 Hz, H-l); 4,595 (t, 1H, H-2); 4,055,3,72 (m, 4H, H-3, H-4, H-5, H-5'); 2,38 (d, 1H, D₂O výměna, 3-OH); 1,83 (t, 1H, D₂O výměna, 5-OH); 1,58, 1,38 (2s, 6H, 2CH₃). Anal. Kale. (C₈Hi₄O₅): C 50,50; H, 7,42; nalezeno: C, 50,62; H, 7,46.

3,5-Di-O-Benzoyl-l ,2-di-O-Izopropyliden-a-L-ribofuranóza (28)

Sloučenina (27) (19 g, 100 mmol) byla míchána ve 300 ml pyridinu při 0°C, zatímco BzCl (40 ml, 348 mmol) byl přidán po kapkách a potom míchán při teplotě místnosti 3 hod. Rozpouštědlo bylo odpařeno do sucha. Zbytek byl extrahován EtOAc, promyt nasyc. NaHCO₃, sušen (Na₂SO₄). Odpaření rozpouštědla a krystalizace poskytly (23) jako bílou pevnou látkou 39 g (98 %). T.t. 83-85 °C. ‘H-NMR (CDC1₃): δ 8,07, 7,36 (m, 10H, Ar-H); 5.94 (d, 1H, J=3,6 Hz, H-l); 5,05; 5,00 (m, 1H, H-2); 4,73, 4,63 (m, 3H, H-4, H-5, H-5'); 1,58; 1,38 (2s, 6H, 2CH₃). Anal. Kale. (C₂₂H₂₂O₇): C, 66,50; H, 5,64; nalezeno: C, 66,32; H, 5,57.

-17CZ 292574 B6 l-O-Acetyl-2,3,5-tri-O-benzoyl-p-L-ribofuranóza (31)

Sloučenina (28) (38 g, 95 mmol) byla míchána v 300 ml 1% HCI/CH3OH při teplotě místnosti 30 hod. Byl přidán pyridin (20 ml) a potom byl roztok odpařen do sucha. Zbytek by l odpařen spolu s pyridinem (30 ml χ 2), a potom rozpuštěn ve 100 ml bezvodého pyridinu při 0 °C, načež BzCl (17 ml, 146 mmol) byl přidán po kapkách, potom míchán při teplotě místnosti 3 hod. Rozpouštědlo bylo odpařeno a zbytek byl rozpuštěn v EtOAc, promyt 0,5N NCI a potom nacyc. NaHCO₃ a potom sušen (Na₂SO₄). Odpaření rozpouštědla byl získán surový (30) jako sirup.

Surový (30) byl míchán v ledové kyselině octové (400 ml) a potom Ac₂O (100 ml) při 0 ^CC, zatímco konc. H2SO4 (10 ml) byla přidána po kapkách. Tento roztok byl míchán při teplotě místnosti přes noc. Směs byla nalita do ledové vody, extrahována CHC13, neutralizována nasyc. NaHCO3 a potom sušena (Na2SO4). Po odpaření rozpouštědla byl získán světle žlutý sirup, který krystalizoval v methanolu za vzniku (31) jako bílé pevné látky 23,89 g (49,6 %, z (28)—(31)). T.t. 124,7 °C, [a]D = 45,613 (c 1,0; CHC13); lit⁴, b.t.: 129-130 °C, [a]D = -43,6 (c 1,0: CHC1₃), 'H-NMR (CDC1₃): δ 7,317, 8,134 (m, 14H, OBz); 6,437 (s, 1H, H.l); 5,835 (m, 2H, H-2 a H-3); 4,649 (m, 3H, H-4 a H-5); 2,003 (s, 3H, CH₃COO-).

II. Biologická účinnost

Zde popsané sloučeniny mohou být zhodnoceny s ohledem na účinnost proti HBV nebo EBV, jak je dále podrobně popsáno, nebo jinými postupy známými odborníkovi v oblasti techniky.

Příklad 1

Biologická aktivita proti HBV

Buňky lidského hepatomu s HBV (2.2.15 buněk) byly použity při této zkoušce. Tyto buňky by ly kultivovány na shluk v minimálním základním médiu s 10% fetálním hovězím sérem. Médium bylo měněno v třídenních intervalech. Ve shluku byla lékem iniciována léčba, a potom se pokračovalo 3 dny.

Další přídavek stejné koncentrace léku byl podán v okamžiku po odstranění média z kultur, a kultury se uchovávaly po další období 3 dní. Bylo získáno médium po šestidenním ošetřování a virové částice se vysrážely polyethylenglykolovým postupem. Částice byly postupně tříděny a zpracovány pro Southemovu analýzu. Bloty byly hybridizovány na HBV-specifícké sondě a množství virové DNA bylo posuzováno srovnáním s hladinami DNA z kultur, které nebyly ošetřeny lékem. Genomová DNA byla tříděna Hind III a podrobena Southemově analýze. Hladiny episomální DNA byly stanoveny ve vztahu k integrované HBV DNA.

Byla vypočtena koncentrace léku, která způsobí 50% inhibici DNA (ID₅₀) ve srovnání s kontrolami.

Výsledky jsou shrnuty v tabulce I.

-18CZ 292574 B6

Tabulka I

Inhibice HBV L-Nukleosidy

Sloučenina	Anti-HBV Aktivita ID_ÍO(pM)	MT2 CD_S0(_gM)	CEM CD₅o	CD₅₀ (μΜ) (H1 buňky)
L-FMAU	0,1	100	>100	1000
D-FMAU	2,0	8-9	10	50
D-FEAU	5,0	100	90	2000
L-FEAU	>5.0	100	>100	900

Příklad 2

Biologická účinnost proti EBV

H1 buňky byly ponechány v dlouhé růstové fázi po dva dny před iniciováním léčby. Buňky byly odstředěny na centrifuze při 600 g po 10 min při teplotě místnosti, aby se oddělily z média obsahujícího virové částice existující předem.

H1 buňky byly naočkovány ve 24 studnicových plotnách o hustotě 1 * 10⁵ buněk na plotnu ve 2 ml čerstvého média s lékem nebo bez léku a byly inkubovány při 37 °C 5 dní.

Médium obsahující viriony bylo uloženo a použito pro zhodnocení inhibičního účinku léků na produkci viru a infekčnosti použitím biozkoušky.

Viriony byly peletovány z média bez buněk odstřeďováním při 45 000 otáčkách za minutu pod 90 min v SW-50 Ti rotoru (Beckman). Viriony byly resuspendovány v 1 ml růstového média a potom použity na infikování 1 χ 10⁶ Ráji buněk po 48 hod. Dokud je hladina EBV DP aktivity v Ráji buňkách po zevní infekci úměrná počtu přidaných virionů, je možno měřit indukovanou EBV specifickou DP aktivitu.

Inhibiční účinek léku byl vypočítán srovnáním EBV DP účinnosti k násobku ředění kontrolních skupin.

Žádná inhibice mitochondriálního obsahu DNA v H1 buňkách nebyla pozorována, když byly buňky ošetřovány 1 mM L-FMAU po 6 dní.

Zkouška ..Slot Blot“

Množství mitochondriální DNA bylo měřeno metodou „slot blot“ (2). 2 χ 10⁵ ošetřených a neošetřených H1 buněk bylo lyžováno ve 200 μΐ 10 mM Tric-HCl (pH 7,5) roztoku postupem mražení /tavení. Buňky lyzátu byly ošetřeny s 10 pg/ml RNasy A při 37 °C 30 min, a potom proteinázou K (100 pg/ml) při 55 °C 2 hod. Do každého buněčného lyzátu byla přidána stejná množství 20 X SSC pufru. Po vaření 10 min byly vzorky naneseny na nylonové membrány (Hybond-N, Amersham Corp.). Jako sonda pro DNA hybridizací byl použit lidský mitochondriální DNA fragment značený radioaktivním izotopem. Stejné membrány byly sondovány lidským Alu DNA po odstranění mitochondriální DNA sondy. Množství mitochondriální DNA v ošetřených a neošetřených H1 buňkách byla kvantifikována denzitometrem (LKB Ultroscan XL).

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.

-19CZ 292574 B6

Tabulka 2

Léčivo	CD,₀(pM)	Ιθ90 (pM)	Index léčení (CD₅o/ID₉o)
PFA	1200 ± 100	75 ±5	16
DHPG	75 ±6	5± 1	15
ACV	1000 ±75	50 ±8	20
PCV	500 ±55	20 ±2	25
L-FMAU	1000 ±80	5 ±0,8	200
D-FMAU	50 ± 10	0,1 ± 0,02	50
L-FEAU	900 ± 70	60 ± 11	15
D-FEAU	2000 ± 80	1 ± 0,05	2000
L-FIAC	400 ±35	<10	>40
D-FIAC	125 ± 15	5 ±0,5	25
L-FIAU	240 ± 20	20 ±4	12
D-FIAU	20 ±4	0,5 ± 0,05	40

Inhibiční účinek sloučenin na EBV:

CD50 by la prováděna podrobením H1 buněk různým koncentracím sloučenin v normálním růstovém médiu při 37 °C po 72 hod; buňky byly spočítány a porovnány s kontrolními H1 buňky byly ošetřovány 5 dní, a potom byla ID50 stanovena biozkouškou.

Příklad 3

Odstranění L-(-)-FMAU z plazmy a jater

Bylo hodnoceno vymizení L-(-)-FMAU z plazmy a jater myší po orálním podávání.

Myši byly injektovány L-(-)-FMAU označeným tritiem (radiospecifičnost 9,3 pmol/pCi).

2} Obrázek 11 je graf koncentrace plazmy L-(-)-FMAU myši po orálním podání v čase, a obrázek je graf koncentrace L-(-)-FMAU v játrech myši po orálním podání v čase (křížek, 10 mg/kg, podáváno (denně) po 30 dní před farmakokinetickou studií, a potom byla prováděna studie třicátý první den podání stejné koncentrace; tmavý kroužek, 50 mg/kg podáváno denně 30 dní před studií a potom byla prováděna studie třicátý první den při podání stejné koncentrace; otevřený 25 kroužek, 50 mg/kg podáno poprvé v první den studie).

V označeném čase (viz obrázek 10 a 11) byly myši vykrváceny z tetro-orbitálního sinu užitím heparinizovaných kapilár. Plazma byla extrahována kyselinou trichloroctovou a neutralizována freon/trioktylaminem. Supematanty byly přímo spočítány a vypočítána koncentrace.

Jak je patrné z obrázků 10 a 11, pík koncentrace L-(-)-FMAU plazmy a jater je přibližně v jedné hodině.

Sloučenina byla v podstatě odstraněna z plazmy a jater po 4 hodinách.

-20CZ 292574 B6

Příklad 4

Toxicita L-(-)-FMAU v BDF1 samice myši

Obrázek 13a ilustruje změnu hmotnosti po 30 dnech kontrolní BDF1 samice myši.

Obrázky 13b a 13c ilustrují změnu tělesné hmotnosti BDF1 samice myši po 30 dnech podávání 10 mg/kg (13b) denně L-(-)-FMAU. Uváděná tělesná hmotnost označuje průměrnou a standardní odchylku u 5 až 7 myší.

Jak vyplývá z obrázků 13b a 13c, L-(-)-FMAU nevykazuje výrazně ovlivnění hmotnosti myši po 30 dnech, dokazující, že sloučenina byla velmi dobře tolerována.

Příklad 5

Klinická chemie myší plazmy po ošetření L-(-)-FMAU

Obrázky 14-20 popisují klinickou chemii plazmy myší po podání L-(-)-FMAU při 10 mg/kg (tři myši) nebo 50 mg/kg (tři myši) denně po 30 dní.

Obrázek 14 je sloupcový graf koncentrace celkového bilirubinu v myší plazmě v mg/dl.

Obrázek 15 je sloupcový graf koncentrace alkalické fosfatázy v myší plazmě v U/l.

Celkový bilirubin a alkalická fosfatáza jsou indikátory funkce jater. Hodnoty bilirubinu u myší leží v normálním lidském rozmezí (méně než 1,2 mg/dl), ale hodnoty alkalické fosfatázy jsou poněkud vyšší než je běžná hladina u lidí (30-114 U/l).

Obrázek 16 je sloupcový graf koncentrace kreatininu v myší plazmě v mg/dl.

Kreatinin je indexem funkce ledvin. S výjimkou myši 50-2 nejsou hladiny kreatininu u ošetřené myši odlišné od těchto u kontrolní myši.

Obrázek 17 je sloupcový graf koncentrace AST (SGOT, sérum glutamové oxalové transminázy) v myší plazmě v U/l.

Obrázek 18 je sloupcový graf koncentrace ALT (SPGT, sérum glutamové pyrohroznové transminázy) v myší plazmě U/l.

SGOT a SPGT jsou indikátory funkce jater. S výjimkou myši 50-2 (pro SGOT i SGPT) a myši 10-2 (pouze pro SGOT), nejsou hladiny enzymů u ošetřené myši odlišné od hodnot pro kontrolní myš.

Obrázek 19 je sloupcový graf koncentrace kyseliny mléčné v myší plazmě v mmol/1.

Obrázek 20 je sloupcový graf koncentrace mléčné dehydrogenázy v myší plazmě v U/l. Kyselina mléčná vzniká ve svalech při glykolýze. Mléčná dehydrogenáza („lactic dehydrogenase LDH“) je přítomná v různých isoenzymech v různých tkáních. Vylučování LDH do plazmy může indikovat poškození tkáně. Hladiny kyseliny mléčné a mléčné dehydrogenázy u ošetřených myší nejsou výrazně odlišné od hodnot u kontrolních myší.

-21 CZ 292574 B6

III. Oligonukleotidy

Oligonukleotidy požadovaných sekvencí mohou být modifikovány substitucí jednoho nebo více zde popsaných L-nukleosidů nukleosidem v oligonukleotidů.

Ve výhodném provedení je L-nukleosid umístěn na jednom ze zakončení oligonukleotidů. Modifikovaný oligonukleotid může být například použit v antimediátorové technologii.

Antimediátorová technologie se obecně týká modulace exprese genu postupem, kdy je syntetický oligonukleotid hybridizován na komplementární sekvenci kyseliny nukleové k potlačení transkripce nebo replikace (pokud je cílovou sekvencí DNA), potlačení translace (pokud je cílovou sekvencí RNA) nebo potlačení úpravy (pokud je cílovou sekvencí pre-RNA).

Použitím této techniky může být modulována široká oblast celulámích aktivit.

Jednoduchým příkladem je inhibice proteinové biosyntézy antimediátorovou oligonukleotidovou vazbou na mRNA.

V jiném provedení je syntetický oligonukleotid hybridizován na specifickou genovou sekvenci ve dvouřetězové DNA, vytvářející trojitý řetězový komplex (triplex), který inhibuje expresi této genové sekvence.

Antimediátorové oligonukleotidy mohou také být použity k aktivaci genové exprese nepřímo supresí biosyntézy přirozeného represoru. AOT může být použit k inhibici exprese patogenních genů, například těch, které usnadňují replikaci virů včetně lidského imunodeficitního viru (HIV), hepatitidy viru B (HBV) a herpesvirů, a karcinomu, zejména pevných mas tumorů, jako gliomů, rakoviny prsu a melanomů.

Stabilita vybraného oligonukleotidů proti nukleázám je významným faktorem pro aplikace in vivo.

Je známo, že aktivita 3'-exonukleázy je odpovědná za většinu nemodifikovaných antimediátorových oligonukleotidových degradací v séru. Vlassov, V. V., Yakubov, L. A., v ..Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancers and AIDS“, 1991, 243-266, Wiley - Liss, lne., New York; Nucleic Acids Res., 1993,21,145.

V jednom provedení mohou být zde popsané L-nukleosidy použity k minimalizování degradace 3'- exonukleázy antimediátorových oligonukleotidů.

Oligonukleotidy podle předloženého vynálezu, které jsou vhodné pro vázání na polyribonukleovou kyselinu nebo polydeoxyribonukleovou kyselinu, jsou vhodné jako antimediátorová činidla ve stejných postupech, jako běžná antimediátorová činidla.

Viz obecně Antisense Molecular Biology and S-oligos, Synthesis 1 (Říjen 1988) (zveřejněno Synthecell Corp., Rockville, Md.); 2 Discoveries in Antisense Nucleic Acid (C. Brakel a R. Fraley vyd. 1989); Uhlmann, a kol., „Antisense Oligonucleotides: A New Therapeutic Technique, ,,Chem. Rev. 90 (4), 1990; a Milligan, J. F., Matteucci, M. D., Martin, J. C., J. Med. Chem., 1993,36, 1923-1937.

Antimediátorová činidla podle předloženého vynálezu mohou být použita vytvořením antimediátorového činidla, které je schopné selektivního vázání na předem stanovenou polydeoxyribonukleovou kyselinovou sekvenci nebo polyribonukleovou kyselinovou sekvenci na buňku obsahující takovou sekvenci (např. přidáním antimediátorového činidla do média kultury obsahující buňku) tak, že antimediátorové činidlo je vzato do buňky, váže se do předem stanovené sekvence, a blokuje transkripci, translaci nebo jejich replikaci.

-22CZ 292574 B6

Požadavky pro selektivní vázání antimediátorového činidla jsou známé (např. délka 17 bází pro selektivní vázání s lidským genomem).

IV. Příprava farmaceutické kompozice

Zde popsané sloučeniny ajejich farmaceuticky přijatelné soli, proléčiva a deriváty jsou vhodné pro prevenci a léčení HBV a EBV infekcí a dalších příbuzných stavů, jako je anti-HBV nebo anti-EBV protilátka pozitivní a HBV- nebo EBV- pozitivní stavy, chronické poškození jater vyvolané HBV, cirhóza, akutní hepatitida, prudká hepatitida, chronická perzistentní hepatitida a únava.

Tyto sloučeniny nebo formulace mohou být rovněž použity proíylakticky k prevenci nebo potlačení postupu klinických onemocnění u jednotlivců, kteří jsou anti-HBV anti-EBV protilátkou nebo HBV- nebo EBV- antigen pozitivní, nebo kteří byli vystaveni HBV nebo EBV.

Lidské utrpení způsobené některými z těchto stavů může být léčeno podáváním pacientovi účinného HBV- nebo EBV- léčivého množství jedné nebo směsi účinných látek zde popsaných nebo farmaceuticky přijatelného derivátu nebo její soli, volitelně na farmaceuticky přijatelném nosiči nebo ředidle.

Účinné materiály mohou být podávány jakoukoliv příslušnou cestou, například orálně, parenterálně, intravenózně, intradermálně, podkožně, nebo topicky, v kapalné nebo pevné formě.

Účinné látky jsou obsaženy ve farmaceuticky přijatelném nosiči nebo ředidle v množství vhodném pro podání pacientovi terapeuticky účinného množství bez vyvolání vážných toxických účinků u léčeného pacienta.

Preferovanou dávkou účinné látky pro všechny výše zmíněné stavy je rozmezí od asi 1 do asi 60 mg/kg, výhodně 1 až 20 mg/kg tělesné hmotnosti za den, obvykleji 0,1 až asi 100 mg na kg tělesné hmotnosti příjemce za den. Rozmezí účinného dávkování farmaceuticky přijatelných derivátů se vypočítá na základě hmotnosti základního nukleosidu, ze kterého se vychází. Pokud vykazují deriváty aktivitu samy o sobě, může být účinné dávkování odhadnuto jako výše při použití hmotnosti derivátu, nebo jinými způsoby známými odborníkům ze stavu techniky.

V jednom provedení je účinná látka podávána jak je popsáno ve vložce produktu nebo v „Physician's Desk Reference“ pro 3'-azido-3'-deoxythimidinu (AZT), 2’,3'-dideoxyinosinu (DDI), nebo 2',3'-dideoxy-2',3'-didehydrothymidinu (D4T) pro HIV indikaci.

Sloučenina se běžně v jednotce jakékoliv vhodné dávkové formy, zahrnující ale neomezující se na ně, na 7 až 3000 mg, výhodně 70 až 1400 mg účinné látky na jednotu dávkové formy. Orální dávkování 50-1000 mg je obvykle vhodné.

Ideálně by měla být účinná přísada podána k dosažení vrcholu plazmových koncentrací účinné sloučeniny od asi 0,2 do 70 μΜ. Toho lze dosáhnout například intravenózní injekcí 0,1 až 5% roztoku účinné přísady, volitelně ve fyziologickém roztoku, nebo podáním jako bolus účinné přísady.

Účinná sloučenina může být předkládána ve formě farmaceuticky přijatelných solí.

Zde používaný termín farmaceuticky přijatelné soli nebo komplexy značí soli nebo komplexy nukleosidů, které mají požadovanou biologickou aktivitu rodičovské sloučeniny a vykazují minimální, pokud vůbec nějaké, nežádoucí toxikologické účinky.

-23CZ 292574 B6

Neomezujícími příklady těchto solí jsou:

(a) kyselinový přídavek anorganických kyselin, se kterými jsou tvořeny soli (např. kyselina chlorovodíková, bromovodíková, kyselina sírová, kyselina fosforečná, kyselina dusičná apod.), 5 a soli vytvořené s organickými kyselinami jako je kyselina octová, kyselina šťavelová, kyselina vinná, kyselina jantarová, kyselina jablečná, kyselina askorbová, kyselina benzoová, tanin, kyselina pamoová, kyselina alginová, kyselina polyglutamová, kyseliny naftalensulfonové a kyselina polygalakturonová;

(b) přídavek zásady solí tvořených s kationty jako je sodík, draslík, zinek, vápník, bizmut, baryum, hořčík, hliník, měď, kobalt, nikl, kadmium, sodík, draslík a podobně, nebo s organickými kationty vytvořenými z Ν,Ν-dibenzylethylendiaminu, amonia nebo ethylendiaminu: nebo (c) kombinací (a) a (b); např. sůl tanát zinečnatý nebo podobné.

Modifikací účinné sloučeniny, specificky na N⁶ nebo N⁴ a 5'-0 pozicích, lze ovlivnit biologickou dostupnost a rychlost metabolismu účinných druhů, za předpokladu kontroly dodání účinných druhů.

Koncentrace aktivní sloučeniny v léčivé kompozici bude záviset na absorpční, inaktivační a vylučovací rychlosti léčiva, stejně jako jiných faktorech známých odborníkovi ze stavu techniky.

Je potřeba poznamenat, že hodnoty dávkování se také budou měnit s těžkostí stavu, který se má zmírnit. Dále je zřejmé, že pro některé zvláštní subjekty by měla být uzpůsobena specifická 25 dávkovači schémata a časové plány po dobu podle individuální potřeby a odborného posudku osoby podávající nebo dohlížející na podávání kompozice, a že koncentrační rozmezí zde jsou pouze příkladná a nejsou míněna jako omezující rozsah nebo praktické použití nárokované kompozice.

Aktivní přísada může být podána najednou, nebo může být rozdělena do více menších dávek, které se podávají v různých časových intervalech.

Preferovaným typem podávání účinné látky je podání orální. Orální kompozice obvykle zahrnují inertní ředidlo nebo jedlý nosič. Mohou být uzavřeny v želatinových kapslích nebo lisovány do 35 tablet. Pro účely orálního terapeutického podání může být účinná sloučenina spojena s excipientem a použita ve formě tablet, pastilek nebo kapslí.

Farmaceuticky přijatelná pojivá a/nebo pomocné materiály mohou být zahrnuty jako část složení.

Tablety, pilulky, kapsle, pastilky a podobné mohou obsahovat některé z následujících přísad, nebo sloučenin podobné povahy:

pojivo, jako je mikrokrystalická celulóza, tragantová guma nebo želatina;

excipient, jako je škrob nebo laktóza;

dezintegrační činidlo jako je kyselina alginová, Primogel, kukuřičný škrob;

lubrikant jako je stearát hořečnatý nebo Sterotes;

klouzadlo jako je koloidní oxid křemičitý;

sladidlo jako je sacharóza nebo sacharin;

ochucuj ící přísada jako je máta pepmá, methylsalicylát, nebo pomerančová příchuť.

Pokud je dávkovou jednotkou kapsle, pak může obsahovat, přídavně k výše uvedeným typům, kapalný nosič jako je mastný olej.

-24CZ 292574 B6

Dále mohou jednotkové dávkové formy obsahovat různé další materiály, které modifikují fyzikální formu dávkové jednotky, například povlaky z cukru, šelaku nebo jiná enterická činidla.

Aktivní sloučenina nebo farmaceuticky přijatelná sůl nebo její deriváty mohou být podávány jako složka elixíru, suspenze, sirupu, vody, žvýkačky nebo podobně. Sirup může obsahovat přídavně k účinným látkám sacharózu jako sladící činidlo a některé ochranné látky, barviva a barevné přísady a ochucovadla.

Účinná sloučenina nebo farmaceuticky přijatelný derivát nebo jejich sůl může také být smísena s jinými aktivními materiály, které nenarušuji požadovaný účinek, nebo s látkami, které nahrazují požadovaný účinek, jako jsou antibiotika, antifungální látky , protizánětové látky nebo jiné protivirové látky, včetně anti-HBV, anti-EBV, anticytomegalovirů, nebo anti-HIV nebo anti-EBV činidel.

Roztoky nebo suspenze použité pro parenterální, intradermáiní, subkutánní nebo topické aplikace mohou zahrnovat následující složky:

sterilní vodu pro injekce, fyziologický roztok, pevné oleje, polyethylenglykoly, glycerin, propylenglykol nebo jiná syntetická rozpouštědla;

antibakteriální činidla jako je benzylalkohol nebo methylparabens;

antioxidanty jako je kyselina askorbová nebo bisulfit sodný:

chelatační činidla jako je kyselina ethylendiamintetraoctová:

pufiy jako jsou acetáty, citráty nebo fosfáty a činidla pro nastavení tonicity jako je chlorid sodný nebo dextróza.

Parenterální přípravky mohou být uzavřeny vampulích, použitelné injekční stříkačky nebo lékovky pro větší počet dávek jsou ze skla nebo plastu.

Při podávání intravenózně jsou preferovanými nosiči fyziologický roztok nebo fyziologický roztok tlumený fosfátem (PBS).

V preferovaných podáních jsou aktivní sloučeniny připraveny s nosiči, které chrání sloučeninu proti rychlému vylučování z těla, jako je formulace s kontrolovaným uvolňováním, včetně implantátů a mikro-opouzdřených dávkových systémů. Mohou byt použity biodegradovatelné, biokompatibilní polymery, jako je ethylenvinylacetát, polyanhydridy, polyglykolová kyselina, kolagen, polyortoestery a polymléčná kyselina. Způsoby přípravy těchto formulací jsou známé odborníkovi ze stavu techniky. Materiály lze také běžně získat z Alza Corporation a Nova Pharmaceuticals, lne.

Líposomální suspenze (včetně liposomů cílených na infikované buňky s monoklonálními protilátkami na virové antigeny) jsou také preferovány jako farmaceuticky přijatelné nosiče. Tyto mohou být připraveny způsoby známými odborníkovi ze stavu techniky, jak je například popsán v patentu US 4 522 811 (který je zde začleněn jako reference jako celek).

Například liposomové formulace mohou být připraveny rozpuštěním vhodného lipidu (ů) (jako je stearoyl fosfatidyl ethanolamin, stearoyl fosfatidyl cholin, a cholesterol) v anorganickém rozpouštědle, které se potom odpaří a zanechá tenký film suchého lipidu na povrchu kontejneru. Do kontejneru se potom zavede vodný roztok účinné sloučeniny nebo jeho monofosfátového, difosfátového a/nebo trifosfátového derivátu. Kontejner se potom ručně otáčí, aby se odstranil lipidový materiál ze stěn kontejnerů, a aby se rozptýlily lipidové agregáty, čímž se vytvoří liposomální suspenze.

-25CZ 292574 B6

Tento vynález byl poslán s odkazy na jeho výhodná provedení.

Variace a modifikace vynálezu jsou pro odborníka v oboru zřejmé z předchozího podrobného popisu vynálezu.

Je zřejmé, že všechny z těchto variací a modifikací jsou zahrnuty do rozsahu vy nálezu podle přiložených patentových nároků.

Claims

1. L-Nukleosid obecného vzorce I kde znamená

R zbytek 5-methyluracilu, adeninu nebo cytosinu,

R” atom vodíku, skupinu acetylovou, propionylovou, butyrylovou, pentanoylovou, 3-methylbutyrylovou, benzoylovou nebo pivaloylovou nebo znamená alkylovou skupinu s 1 až 10 atomy uhlíku nebo monofosforečnanovou, difosforečnanovou nebo trifosforečnanovou alkylesterovou skupinu s 1 až 10 atomy uhlíku nebo fenylalkylesterovou skupinu s 1 až 10 atomy uhlíku v alkylovém podílu, a jeho farmaceuticky přijatelné soli.

2. L-Nukleosid podle nároku 1, kterým je 2'-fluor-5-methyl-|3-L-arabinofuranosy!uridin.

3. L-Nukleosid podle nároku 1, obecného vzorce I, kde znamená R zbytek adeninu nebo cytosinu a R má v nároku 1 uvedený význam.

4. L-Nukleosid podle nároku 1, obecného vzorce I, kde znamená R zbytek 5-methyluracilu a R má v nároku 1 uvedený význam.

5. L-Nukleosid podle nároku 1, obecného vzorce I, kde znamená R monofosforečnanovou, difosforečnanovou nebo trifosforečnanovou alkylesterovou skupinu s 1 až 10 atomy uhlíku nebo fenylalkylesterovou skupinu s 1 až 10 atomy uhlíku v alkylovém podílu a R má v nároku 1 uvedený význam.

6. L-Nukleosid podle nároku 1, obecného vzorce I, kde znamená R atom vodíku a R má v nároku 1 uvedený význam.

7. L-Nukleosid podle nároku 1, obecného vzorce I, kde znamená R skupinu acetylovou, propionylovou nebo butyrylovou a R má v nároku 1 uvedený význam.

-26CZ 292574 B6

8. L-Nukleosid podle nároku 1, obecného vzorce I, kde znamená R skupinu alkylovou s 1 až 10 atomy uhlíku a R má v nároku 1 uvedený význam.

9. L-Nukleosid podle nároku 1, obecného vzorce I, kde R a R mají v nároku 1 uvedený význam, alespoň z 95 % prostý odpovídajícího D-enantiomeru.

10. L-Nukleosid podle nároku 1, obecného vzorce I, kde R a R mají v nároku 1 uvedený význam. alespoň z 98 % prosty' odpovídajícího D-enantiomeru.

11. L-Nukleosid podle nároku 4, obecného vzorce I, kde znamená R skupinu acetylovou, propionv lovou nebo buty rylovou a R má v nároku 4 uvedený význam.

12. L-Nukleosid podle nároku 4, obecného vzorce I, kde znamená R skupinu alkylovou s 1 až

10 atomy uhlíku a R má v nároku 4 uvedený význam.

13. L-Nukleosid podle nároku 4, obecného vzorce I, kde znamená R monofosforečnanovou, difosforečnanovou nebo trifosforečnanovou alkylesterovou skupinu s 1 až 10 atomy uhlíku nebo fenylalky lesterovou skupinu s 1 až 10 atomy uhlíku v alkylovém podílu a R má v nároku 4 uvedený význam.

14. L-Nukleosid podle nároku 4, obecného vzorce I, kde R a R mají v nároku 4 uvedený význam, alespoň z 95 % prostý odpovídajícího D-enantiomeru.

15. L-Nukleosid podle nároku 4, obecného vzorce I, kde R a R mají v nároku 4 uvedený význam, alespoň z 98 % prostý odpovídajícího D-enantiomeru.

16. L-Nukleosid podle nároku 2, obecného vzorce I, kde R a R mají v nároku 2 uvedený význam, alespoň z 95 % prostý odpovídajícího D-enantiomeru.

17. L-Nukleosid podle nároku 2, obecného vzorce I, kde R a R mají v nároku 2 uvedený význam, alespoň z 98 % prostý odpovídajícího D-enantiomeru.

18. L-Nukleosid podle nároku 1, kterým je 2'-fluor-5-methyl-|3-L-arabinofuranosyluridin nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.

19. Farmaceutický prostředek pro ošetřování HBV, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky účinné množství L-nukleosidu obecného vzorce I, kde mají jednotlivé symboly v nároku 1 uvedený význam nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli a farmaceuticky přijatelný nosič.

20. Farmaceutický prostředek podle nároku 19, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky účinné množství L-nukleosidu obecného vzorce I, kde znamená R zbytek 5-methyluracilu a R má v nároku 1 uvedený význam nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli a farmaceuticky přijatelný nosič.

21. Farmaceutický prostředek podle nároku 19, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky účinné množství L-nukleosidu obecného vzorce I, kde znamená R zbytek adeninu a R má v nároku 1 uvedený význam nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli a farmaceuticky přijatelný nosič.

22. Farmaceutický prostředek podle nároku 19, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky účinné množství L-nukleosidu obecného vzorce I, kde znamená R zbytek cytosinu a R má v nároku 1 uvedený význam nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli a farmaceuticky přijatelný nosič.

-27CZ 292574 B6

23. Farmaceutický prostředek podle nároku 19, vyznačuj ící se tím, že obsahuje farmaceuticky účinné množství L-nukleosidu obecného vzorce I, kde znamená R monofosforečnanovou, difosforečnanovou nebo trifosforečnanovou alkylesterovou skupinu s 1 až 10 atomy uhlíku nebo fenylalkylesterovou skupinu s 1 až 10 atomy uhlíku valkylovém podílu a R má v nároku 1 uvedený význam nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli a farmaceuticky přijatelný nosič.

24. Farmaceutický prostředek podle nároku 19, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky účinné množství L-nukleosidu obecného vzorce I, kde znamená R skupinu acetylovou, propionylovou nebo butyrylovou a R má v nároku 1 uvedený význam nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli a farmaceuticky přijatelný nosič.

25. Farmaceutický prostředek podle nároku 19, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky účinné množství 2'-fluor-5-methyl-p-L-arabinofuranosyluridinu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli a farmaceuticky přijatelný nosič.

26. 2'-Fluor-5-methyl-p-L-arabinofuranosyluridin a jeho farmaceuticky přijatelné soli pro ošetřování hostitele infikovaného EBV nebo HBV.

27. L-Nukleosid obecného vzorce I podle nároku 1 nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli pro ošetřování hostitele infikovaného EBV nebo HBV.

28. Použití 2'-fluor-5-methyl-|3-L-arabinofuranosyluridinu podle nároku 2 a jeho farmaceuticky přijatelných solí pro výrobu farmaceutických prostředků pro ošetřování hostitele infikovaného EBV nebo HBV.

29. Použití L-nukleosidu obecného vzorce I podle nároku 1 nebo jeho farmaceuticky přijatelných solí pro výrobu farmaceutických prostředků pro ošetřování hostitele infikovaného EBV nebo HBV.

30. Použití podle nároku 28 a 29 pro hostitele, kterým je člověk.