FI118954B - L-nukleosidejä hepatiitti-B-viruksen ja Epstein-Barr-viruksen hoitamiseksi - Google Patents

Description

! 118954 L-nukleosidejä hepatiitti-B-viruksen ja Epstein-Barr-vi-ruksen hoitamiseksi Tämä keksintö koskee yhdisteitä hepatiitti-B-viruk-5 sen (jota kutsutaan myös "HBV":ksi) ja Epstein-Barr-viruk-sen (jota kutsutaan "EBV":ksi) aiheuttamien tartuntojen hoitamiseksi. Hoitomenetelmissä annetaan tehokas määrä yhtä tai useampaa tässä julkistettua aktiivista yhdistettä tai jonkin näistä yhdisteistä farmaseuttisesti hyväksyttä-10 vää johdannaista tai esilääkettä.

Keksinnön tausta

Hepatiitti-B-virus on levinnyt epidemiologisille tasoille kautta maailman. 2-6 kuukauden inkubointiaika-jakson, jona isäntä on tietämätön tartunnasta, jälkeen 15 HBV-tartunta voi johtaa akuuttiin hepatiittiin ja maksavaurioon, joka aiheuttaa vatsakipuja, keltaisuutta sekä tiettyjen entsyymien kohonneita tasoja veressä. HBV voi aiheuttaa äkillisen hepatiitin, joka on sairauden nopeasti etenevä, usein kohtalokas muoto, jossa suuria osia maksas-20 ta tuhoutuu. Potilaat tyypillisesti toipuvat akuutista vi-rushepatiitista. Joissakin potilaissa kuitenkin virusan- ; tigeenin korkeat tasot veressä säilyvät pidentyneen, tai • · · määrittelemättömän, ajan aiheuttaen kroonisen tartunnan. Krooniset tartunnat voivat johtaa krooniseen pysyvään he~ • · **"* 25 patiittiin. Potilaat, joilla on krooninen pysyvä HBV-tar- • · *···* tunta, ovat yleisimpiä kehitysmaissa. Vuoden 1991 puolivä- : ** Iissä pelkästään Aasiassa oli noin 225 miljoonaa kroonista .

• · · HBV-kantajaa ja koko maailmassa lähes 300 miljoonaa kantajaa. Krooninen pysyvä hepatiitti voi aiheuttaa väsymystä, 30 maksakirroosia ja maksasolusyöpää, joka on primaarinen • · ·***; maksasyöpä.

··* Läntisissä teollistuneissa maissa korkean riskin • * · ryhmiä HBV-tartunnalle ovat henkilöt, jotka joutuvat kos- * · *···* ketuksiin HBV-kantajien tai näiden verinäytteiden kanssa.

:***; 35 HBV:n epidemiologia on itse asiassa hyvin samankaltainen • · · ·«♦·« • « 2 118954 kuin immuunikadon, mikä selittää sen, miksi HBV-tartunta on yleinen aids-potilailla tai henkilöillä, joilla on HIV-liitteisiä tartuntoja. Kuitenkin HBV on tarttuvampi kuin HIV.

5 HBV jää toiseksi vain tupakalle ihmissyövän syynä.

Mekanismi, jolla HBV aiheuttaa syöpää, on tuntematon, joskin oletetaan, että se saattaa suoraan laukaista kasvaimen kehittymisen tai epäsuorasti laukaista kasvaimen kehittymisen tartuntaan liittyvien kroonisen tulehduksen, kirroo-10 sin ja soluregeneraation välityksellä.

Epstein-Barr-virus (EBV) kuuluu Lymphocrypto-virusten sukuun, joka kuuluu gammaherpesvirusten alaryhmään. Se on huomattavan lymfotrooppinen. EBVrllä on herpesviruksille tavanomainen rakenne, sen kaksisäikeinen 15 DNA-genomi nimittäin on ikosapentahedraalisen nukleokapsi-din sisällä, jota puolestaan ympäröi virusglykoproteiineja runsaasti sisältävä lipidikuori. Kuoren ja nukleokapsidin välisessä tilassa on amorfinen peittoproteiini.

Kaikki ihmisen herpesvirukset tartuttavat lym-20 fosyyttejä ja replikoituvat niissä jossain määrin, mutta EBV tekee tämän tehokkaasti. Merkittävintä on, että pato-: .·, geneesi ja isännän vasteet EBV-tartunnalle ovat riippuvai- i · · *“/ sempia lymfosyyttitartunnasta kuin on ilmeistä muiden ih- • · "t misen herpesvirusten kohdalla.

• · *"·’ 25 EBV on nyt tunnistettu syyksi B-solulymfolisäänty- « * ’···* missairauksiin, ja se on kytketty erilaisiin muihin vaka- ·· : ** viin ja kroonisiin sairauksiin, mukaan lukien harvinainen • · · !...· progressiivinen mononukleoosin kaltainen oireyhtymä ja nukkaisten valkotäplien esiintyminen suun limakalvoilla 30 aids-potilailla. Esitys, että EBV on kroonisen väsymyksen • · pääasiallinen syy, ei ole kestänyt lähempää tarkastelua.

«·« EBV tarttuu pääasiassa syljen välityksellä, vaik- • · · • ·* kakin jotkut tartunnat välittyvät veren siirroissa. Yli • *···* 85 % potilaista tarttuvan mononukleoosin akuuteissa vai- ·*": 35 heissä erittää EBVrtä.

··· • · 3 118954 EBV on yhdistetty syöpään. Ainakin kaksi potilasryhmää on vaarassa kehittää EBV-liitteisiä lymfoomia: ne, jotka ovat saaneet munuais-, sydän-, luuydin-, maksa- tai kateenkorvasiirrännäisiä immunosuppresiivisen terapian 5 suojassa, sekä aids-potilaat. EBV-liitteisiä syöpiä ovat Burkittin lymfooma ja nenänielusyöpä.

Sen valossa, että hepatiitti-B-viruksella ja Ep-stein-Barr-viruksella on vakavia ja usein traagisia vaikutuksia tartunnan saaneelle potilaalle, on olemassa voima-10 kas tarve saada käyttöön näiden virusten tartuttamien ihmisten hoitamiseksi uusia tehokkaita farmaseuttisia aineita, joiden myrkyllisyys isännälle on matala.

Tämän vuoksi esillä olevan keksinnön päämääränä on antaa käyttöön yhdiste, koostumus ja menetelmä hepatiitti-15 B-viruksen hoitamiseksi.

Esillä olevan keksinnön toinen päämäärä on antaa käyttöön yhdiste, koostumus ja menetelmä Epstein-Barr-viruksen hoitamiseksi.

Yhteenveto keksinnöstä 20 HBV- tai EBV-tartunnan saaneen isännän ja erityi sesti ihmisen hoitamiseksi annetaan käyttöön menetelmä, : jossa annetaan HBV- tai EBV-tartuntaa hoitava määrä ··« · ·'**. L-nukleosidiä, jonka kaava on:

OH

fi jt^\

... F R

: : ··· 25 jossa R on puriini- tai pyrimidiiniemäs. Edulises- sa suoritusmuodossa nukleosidi annetaan käyttöön esitetty- • · « * · %·«« nä enantiomeerinä ja oleellisesti sitä vastaavan enan- • * T tiomeerin puuttuessa (eli enantiomeerisesti rikastetussa, ·· · { */ mukaan lukien enantiomeerisesti puhtaassa, muodossa).

:***: 30 Yhdessä edullisessa suoritusmuodossa aktiivinen ··« y,.' yhdiste on 2'-fluori-5-metyyli-B-L-arabinofuranosyyliuri- *·*. diini (jota kutsutaan myös L-FMAU: ksi) . Tämä yhdiste on • * 4 118954 tehokas virusvastainen aine HBV:tä ja EBV:tä vastaan ja sen sytotoksisuus on alhainen. Muita spesifisiä esimerkkejä aktiivisista yhdisteistä ovat Ni-(2'-deoksi-2'-fluo-ri-B-L-arabinofuranosyyli)-5-etyyliurasiili/ Ni-(2'-deoksi-5 2'fluori-B-L-arabinofuranosyyli)-5-jodisytosiini ja Ni-(2' - deoksi-2'-fluori-fi-L-arabinofuranosyyli)-5-jodiurasiili.

Vaihtoehtoisessa suoritusmuodossa käytettäväksi HBV- tai EBV-tartunnan hoitoon annetaan käyttöön L-nukleo-sidi, joka sisältää 2'-arabinohydroksyyliryhmän, esimer-10 kiksi L-aratymidiini, L-fludarabiini, L-araguanosiini ja L-arainosiini kuten esitetään kuviossa 1.

Tässä julkistetut L-nukleosidit ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät johdannaiset tai näitä yhdisteitä sisältävät farmaseuttisesti hyväksyttävät koostumuk-15 set ovat käyttökelpoisia HBV-tartuntojen ja muiden liittyvien tilojen estämiseksi ja hoitamiseksi kuten anti-HBV-vasta-ainepositiiviset ja HBV-positiiviset tilat, HBV:n aiheuttama krooninen maksatulehdus, kirroosi, akuutti hepatiitti, äkillinen hepatiitti, krooninen pysyvä hepatiit-20 ti ja väsymys. Yhdisteitä voidaan samoin käyttää EBV-liitteisten häiriötilojen hoitamiseksi. Näitä yhdisteitä : tai koostumuksia voidaan myös käyttää ennalta ehkäisevästi .···, kliinisten sairauksien etenemisen estämiseksi tai hidasta- • · miseksi yksilöillä, jotka ovat anti-HBV- tai anti-EBV- • * 25 vasta-aine- tai HBV- tai EBV-antigeenipositiivisia tai • · !*··* jotka ovat joutuneet alttiiksi HBV:lie tai EBV:lle.

• · • ** Toisessa suoritusmuodossa aktiivinen yhdiste tai ··· *...* sen johdannainen tai suola voidaan antaa yhdistäen tai vaihdellen toisen anti-HBV-aineen tai anti-EBV-aineen • · ϊ^ϊ 30 kanssa, mukaan lukien edellä mainitut, tai anti-HIV-aineen :***: kanssa. Yleensä ottaen vaihteluterapiassa tehokas annostus • * · ,.’,f kumpaakin ainetta annetaan sarjassa, kun taas yhdistelmä- • * * terapiassa tehokas annostus kahta tai useampaa ainetta an- « · *·;·* netaan yhdessä. Annostukset riippuvat lääkkeen absorptio-, ϊ>#>ί 35 inaktivoitumis- ja eritysnopeuksista sekä muista alan am- • · 118954 mattilaisille tutuista tekijöistä. Huomattakoon, että an-nostusarvot vaihtelevat myös lievitettävän tilan vakavuuden mukaan. Edelleen tulee huomata, että mille tahansa nimenomaiselle kohteelle spesifiset annostusohjelmat ja 5 -aikataulut tulisi säätää ajan funktiona yksilöllisen tarpeen ja sen henkilön ammatillisen harkinnan mukaan, joka antaa koostumuksia tai valvoo niiden antoa.

Ei-rajaavia esimerkkejä virusvastaisista aineista, joita voidaan käyttää yhdistettyinä tässä julkistettuihin 10 yhdisteisiin, ovat 2-hydroksimetyyli-5-(5-fluorisytosin-l-yyli)-1,3-oksatiolaanin (-)-enantiomeeri (FTC); 2-hydro-ksimetyyli-5-(sytosin-l-yyli)-1,3-oksatiolaanin (-) -enantiomeeri (3TC); karbovir, asyklovir, interferoni, AZT, DDI (2 ', 3 '-dideoksi-inosiini), DDC (2 ', 3'-dideoksisytidiini), 15 L-DDC, L-5-F-DDC ja D4T.

Suppea kuvaus kuvioista

Kuvio 1 on esitys valikoiduista L-nukleosideistä, jotka kuuluvat esillä olevaan keksintöön: L-FMAU (2'-fluori-5-metyyli-ft-L-arabinofuranosyyliuridiini), L-FIAU (2'-fluo-20 ri-5-jodi-fi-L-arabinofuranosyyliuridiini), L-FC (2'-fluo-ri-B-L-arabinofuranosyylisytosiini), L-FIAC (2'-fluori-5-{ .1. j odiJi-L-arabinofuranosyylisytosiini), L-2-C1-2 '-F-2 ' -deok- IM · ,*··. siadeniini, L-FEAU (2'-fluori-5-etyyli-fi-L-arabinofurano- • · syyliuridiini) , L-aratymidiini, L-fludarabiini, L-aragua- • · 25 nosiini ja L-arainosiini.

• φ * · ,"1 Kuviossa 2 esitetään graafisesti elinkelpoisten • Λ • " solujen prosentuaalinen osuus L-FMAU-lääkepitoisuuden • · *···* funktiona Hl-soluissa.

Kuviossa 3 esitetään kaaviollinen esitys 1-0- • f ϊ.ί,! 30 asetyyli-2,3,5-tri-0-bentsoyyli-fi-L-ribofuranoosin (yhdiste !***: 10) valmistuksesta.

··· .»]·, Kuviossa 4 esitetään kaaviollinen esitys 1-0- • · *..! asetyyli-2,3, 5-tri-0-bentsoyyli-fö-L-ribofuranoosin (yhdiste • · *“ 10) vaihtoehtoisesta valmistuksesta.

··· 1 • · ··· · 6 118954

Kuvio 5 on kaaviollinen esitys menetelmästä 1,3,5-tri-0-bentsoyyli-2-deoksi-2-fluori-a-L-arabinofuranoosin (yhdiste 13) valmistamiseksi.

Kuvio 6 on kaaviollinen esitys menetelmästä 5 N9-[3',5'-di-0-bentsoyyli-2'-deoksi-2'-fluori-B-L-arabiofu- ranosyyli]-2,6-diklooripuriinin (yhdiste 15) ja N9_[2'-deok-si-2'-fluori-ft-L-arabiofuranosyyli]-2,6-diklooripuriinin (yhdiste 16) valmistamiseksi.

Kuvio 7 on esitys menetelmästä lukuisten 2'- 10 deoksi-2'-fluori-fö-L-arabinofuranosyyli]pyrimidiinien (yh disteet 17 - 24) valmistamiseksi.

Kuvio 8 on esitys menetelmästä Ni-[2'-deoksi- 2'fluori-B-L-arabinofuranosyyli]-5-jodisytosiinin (yhdiste 22) valmistamiseksi.

15 Kuvio 9 on esitys menetelmästä 9-6-L-arabino- furanosyyliadeniinin valmistamiseksi.

Kuvio 10 on esitys vaihtoehtoisesta tiestä 1- 0-asetyyli-2,3,5-tri-0-bentsoyyli-B-L-ribofuranoosin (yhdiste 10) valmistamiseksi 1,2-di-O-isopropylideeni-a-L-ksylo-20 furanoosista (yhdiste 3).

Kuvio 11 on graafinen esitys L-(-)-FMAU:n plasma-: pitoisuudesta hiirissä oraalisen annon jälkeen ajan funk- M« f ,···, tiona. [risti, 10 mg/kg annettu bid (engl. bi-daily, kah- • * desti päivässä)] 29 päivän ajan ennen farmakokineettistä • · UI 25 tutkimusta, minkä jälkeen tutkimus suoritettiin päivänä 30 • · t**· annettaessa sama pitoisuus; umpinainen ympyrä, 50 mg/kg ♦ · annetaan bid 29 päivän ajan ennen tutkimusta, minkä jäl-*...: keen tutkimus suoritetaan päivänä 30 annettaessa sama pi toisuus; avoin ympyrä, 50 mg/kg annetaan ensimmäisen ker- • * ϊ/φί 30 ran tutkimuksen 1. päivänä.

i***: Kuvio 12 on graafinen esitys L-(-)-FMAU:n pitoi- suudesta hiiren maksassa oraalisen annon jälkeen ajan • *..! funktiona [risti, 10 mg/kg annettu bid (engl. bi-daily, • * **** kahdesti päivässä) ] 30 päivän ajan ennen farmakokineettis- • ·· ϊβ##ί 35 tä tutkimusta, minkä jälkeen tutkimus suoritettiin päivänä « · 7 118954 31 annettaessa sama pitoisuus; umpinainen ympyrä, 50 mg/kg annetaan bid 30 päivän ajan ennen tutkimusta, minkä jälkeen tutkimus suoritetaan päivänä 31 annettaessa sama pitoisuus; avoin ympyrä, 50 mg/kg annetaan ensimmäisen 5 kerran tutkimuksen 1. päivänä.

Kuvio 13a havainnollistaa muutosta ruumiin painossa ajan funktiona 30 päivän aikana naaraspuolisissa ver-rokki-BDFl-hiirissä. Kuvioissa 13b ja 13c esitetään muutos ruumiin painossa ajan funktiona 30 päivän ajan naaraspuo-10 lisille BDFl-hiirille, joille annetaan 10 mg/kg bid (13b) ja 50 mg/kg (13c) L-(-)-FMAU:ta. Esitetty ruumiin paino edustaa keskiarvoa ja standardipoikkeamaa arvoille 5-7 hiirestä.

Kuvioissa 14 - 20 esitetään kliininen kemia hiiri-15 plasmalle, kun on annettu L-(-)-FMAU:ta annos 10 mg/kg (3 hiirtä) tai 50 mg/kg (3 hiirtä) bid 30 päivän ajan. Kuviossa 14 esitetään pylväsdiagrammi kokonaisbilirubiinipi-toisuudesa hiiriplasmassa yksiköissä mg/dl. Kuviossa 15 esitetään pylväsdiagrammina alkalisen fosfataasin pitoi-20 suus hiiriplasmassa yksiköissä U/litra. Kuviossa 16 esitetään pylväsdiagrammina kreatiniinin pitoisuus hiiriplas- • ·’· massa yksiköissä mg/dl. Kuviossa 17 esitetään pylväsdia- ··* · .**·. grammina AST-pitoisuus (SGOT, seerumin glutamiini-oksaa- ··* ,···, litransaminaasi) hiiriplasmassa yksiköissä U/litra. Kuvi- • · 25 ossa 18 esitetään pylväsdiagrammina ALT-pitoisuus (SGPT, t · .**’ seerumin glutamiini-pyruvaattitransaminaasi) hiiriplasmas- sa yksiköissä U/litra. Kuviossa 19 esitetään pylväsdia- • * *··* grammina maitohapon pitoisuus hiiriplasmassa yksiköissä mmol/litra. Kuviossa 20 esitetään pylväsdiagrammina maito- • · \V 30 happodehydrogenaasipitoisuus hiiriplasmassa yksiköissä ϊ ϊ U/litra.

Yksityiskohtainen kuvaus keksinnöstä • · Tässä käytettynä ilmaisulla "enantiomeerisesti ri- s m T kastettu" tarkoitetaan nukleosidikoostumusta, joka sisäl- ··· • · S · ··· s s · 8 118954 tää ainakin noin 95 %, ja edullisesti noin 97, 98, 99 tai 100 % tuon nukleosidin yksittäistä enantiomeeriä.

Tässä käytettynä ilmaisun "alkyyli" piiriin kuuluvat spesifisesti mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta 5 Ci-io-alkyyliryhmät, mukaan lukien metyyli, etyyli, propyy-li, butyyli, pentyyli, heksyyli, isopropyyli, isobutyyli, sek-butyyli, t-butyyli, isopentyyli, amyyli, t-pentyyli, syklopentyyli ja sykloheksyyli.

Tässä käytettynä ilmaisun "asyyli" piiriin kuulu-10 vat spesifisesti mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta asetyyli, propionyyli, butyryyli, pentanoyyli, 3-metyyli-butyryyli, vetysukkinaatti, 3-klooribentsoaatti, bentsoyy-li, asetyyli, pivaloyyli, mesylaatti, propionyyli, vale-ryyli, kaproni-, kapryyli-, kapriini-, lauriini-, myris-15 tiini-, palmitiini-, steariini- ja öljyhapporadikaalit.

Tässä käytettynä ja ellei toisin ole määritelty ilmaisu "asyyli" viittaa fenyyliin.

Tässä käytettynä ilmaisulla "suojattu" viitataan ellei toisin ole määritelty ryhmään, joka lisätään happi-20 tai typpiatomiin sen edelleen reagoimisen estämiseksi molekyylin, jossa happi tai typpi sijaitsee, muiden ryhmien • .·# derivatisoinnin aikana. Orgaanisen synteesin alan ammatti- .···. laiset tuntevat laajan valikoiman hapen ja typen suojaryh- ··· ··· miä.

• · • ·

Hl 25 Ilmaisun "puriini- tai pyrimidiiniemäs" piiriin • · .··* kuuluvat mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta adeniini, •#i** N6-alkyylipuriinit, N6-asyylipuriinit [joissa asyyli on *···* C (O) (alkyyli, aryyli, alkaryyli tai aralkyyli) ] , N -bent- soyylipyriini, N6-halogeenipuriini, N6-vinyylipuriini, ♦ · c c e V.* 30 N -asetyleenipuriini, N -asyylipuriini, N -hydroksialkyy- ϊ] * lipuriini, N6-tioalkyylipuriini, tyrniini, sytosiini, ·]*. 6-atsapyrimidiini, 2-merkaptopyrimidiini, N5-alkyylipyri- Ϊ *·* E c *..I midiinit, N -bentsyylipyrimidiinit, N -halogeenipyrimidii- "* nit, N -vinyylipyrimidiini, N -asetyleenipyrimidiini, N - 35 asyylipyrimidiini, N -hydroksialkyylipuriini, N -tioalkyy- • • · 9 118954 lipuriini, 5-atsasytidinyyli, 5-atsaurasilyyli, triatsolo-pyridinyyli, imidatsolopyridinyyli, pyrrolopyrimidinyyli, pyratsolopyrimidinyyli. Emäksen funktionaaliset happi- ja typpiryhmät voidaan suojata tarpeen mukaan tai haluttaes-5 sa. Alan ammattilaisille sopivat suojaryhmät ovat tuttuja, ja niitä ovat trimetyylisilyyli, dimetyyliheksyylisilyyli, t-butyylidimetyylisilyyli ja t-butyylidifenyylisilyyli, trityylimetyyli, aikyyliryhmät, asyyliryhmät kuten asetyyli, propionyyli, butyyli, metyylisulfonyyli ja p-toluyy-10 lisulfonyyli. Spesifisesti mukaan kuuluvat 5-metyyli- urasiili (tyrniini), 5-jodiurasiili, sytosiini ja 5-etyyliurasiili.

Keksintö tässä julkistettuna on menetelmä ja koostumus HBV-tartunnan, EBV-tartunnan ja muiden, samankaltai-15 sella tavalla replikoituvien virusten kuten HIV aiheuttamien tartuntojen hoitamiseksi ihmisissä tai muissa isäntä-eläimissä, johon menetelmään sisältyy tehokkaan määrän yhtä tai useampaa edellä identifioitua L-nukleosidia tai sen fysiologisesti hyväksyttävää johdannaista tai fy-20 siologisesti hyväksyttävää suolaa antaminen, mahdollisesti farmaseuttisesti hyväksyttävässä kantajassa. Tämän keksin- • ·*· nön mukaisilla yhdisteillä joko on anti-HBV-aktii- M« « .*··. visuutta, anti-EBV-aktiivisuutta, tai ne metaboloituvat • * ·«· ,···. yhdisteeksi tai yhdisteiksi, joilla on anti-HBV- tai anti- * * 25 EBV-aktiivisuutta. Tässä julkistettuja yhdisteitä voidaan t * myös käyttää HBV- ja EBV-liitteisten häiriötilojen hoita- *..! miseksi.

• · *···* Aktiivinen yhdiste voidaan antaa minä tahansa joh dannaisena, joka vastaanottajalle annettuna kykenee tuot- • · \V 30 tamaan suoraan tai epäsuorasti kantayhdisteen, tai joka ϊ,,.ί itse osoittaa aktiivisuutta. Ei-rajaavia esimerkkejä ovat ··,·. farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat (joihin vaihtoehtoi- • · sesti viitataan "fysiologisesti hyväksyttävinä suoloina"), • · *Γ ja aktiivisen yhdisteen 5' ja puriini- tai pyrimi- ··♦ 35 diiniasyloidut tai alkyloidut johdannaiset (joihin vaihto- • * 10 118954 ehtoisesti viitataan "fysiologisesti aktiivisina johdannaisina") . Yhdessä suoritusmuodossa asyyliryhmä on karbok-syylihappoesteri [eli -C(0)R')]/ jossa esteriryhmän ei-karbonyyliryhmä (R') valitaan suorista, haarautuneista tai 5 syklisistä Ci-io-alkyyleistä, -alkoksialkyyleistä, mukaan lukien metoksimetyyli, aralkyyli mukaan lukien bentsyyli, aryylioksialkyyli kuten fenoksimetyyli, aryyli mukaan lukien mahdollisesti halogeenilla substituoitu fenyyli, C1-4-alkyyli tai Ci-4-alkoksi, sulfonaattiesterit kuten alkyyli-10 tai aralkyylisulfonyyli mukaan lukien metaanisulfonyyli, mono-, di- tai trifosfaattiesteri, trityyli tai monometok-sitrityyli, substituoitu bentsyyli, trialkyylisilyyli (esim. dimetyyli-t-butyylisilyyli) tai difenyylimetyy-lisilyyli. Aryyliryhmät estereissä optimaalisesti käsittä-15 vät fenyyli-tai bentsyyliryhmän. Alkyyliryhmä voi olla suora, haarautunut tai syklinen, ja on optimaalisesti Ci-10-ryhmä.

I. L-nukleosidien synteesi Tässä julkistetut L-nukleosidit voidaan valmistaa 20 kuten kuvataan alla yksityiskohtaisesti tai muilla, alan ammattilaisille tutuilla menetelmillä.

• :*: Alla kuvatuissa synteesikaavioissa muita tavan- • M · omaisia reagensseja, mukaan lukien ekvivalenttisia happo-

• M

,···. ja, emäksiä ja liuottimia, voidaan käyttää mainittujen ti- f · lllt 25 lalla kuten alan keskimääräisillekin taitajille tuttua.

• *

Voidaan käyttää laajaa valikoimaa hapen tai typen suoja- ! Il ryhmiä, kuten esitetään esimerkiksi kirjassa Greene et # · ’···* ai,, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, 2. painos, 1991. Sopivia hapen ja typen suojaryh- • · *.V 30 miä ovat esimerkiksi trisubstituoitu silyyliryhmä kuten ··· trimetyylisilyyli, dimetyyliheksyylisilyyli, t-butyylidi- JV. metyylisilyyli, t-butyylidifenyylisilyyli, trityyli, ai- • · \·1 kyyliryhmä, asyyliryhmät kuten asetyyli, propionyyli, • 1 *♦* bentsoyyli, p-N02-bentsoyyli, bentsyyli tai toluyyli, me- ··· !,„· 35 tyylisulfonyyli tai p-toluyylisulfonyyli. Funktionaaliset • * 11 118954 happi- ja typpiryhmät heterosyklisessä emäksessä tulisi suojata ennen kondensointia sokeriin.

Sopivia pelkistimiä ovat NaBH4, di-isobutyyli-aluminiumhydridi (DIBAL-H), litiumboorihydridi (LiBH4) 5 ja natriumbis(2-metoksietoksi)aluminiumhydridi (Red-Al).

Sopivia hapettimia ovat kromihapon (Cr03) hapan vesiliuos, natriumdikromaatti (Na2CrOv) , pyridiniumkloorikromaatti (PCC), pyridiniumdikromaatti (PDC), kaliumpermanganaatti (KMn04), lyijytetra-asetaatti/pyridiini, happi platina/- 10 hiili-katalysaattorilla, Ru04, Ru04/NaI04, dimetyylisulfok- sidi/disykloheksyylikarbodi-imidi (DMSO/DCC) ja protoni-luovuttaja, hopeakarbonaatti, trifenyylivismuttikarbo-naatti, Oppenauer-hapetin (aluminiumalkoksidit asetonissa) ja mangaanidioksidi (allyyli- tai bentsyylialkoholien se-15 lektiiviseen hapetukseen muiden alkoholien läsnä ollessa).

Friedel-Crafts-katalysaattoreita (Lewis-happoja), joita voidaan käyttää kondensaatioreaktiossa, ovat SnCl4, ZnCl4f TiCl4f A1C13, FeCl3, BF3-dietyylieetteri ja BCI3. Nämä katalysaattorit edellyttävät vedettömiä olosuhteita, 20 koska veden läsnäolo laskee niiden aktiivisuutta. Nämä katalysaattorit inaktivoituvat myös orgaanisten liuottimien • läsnä ollessa, joissa on aktiivisia vetyjä, kuten alkoho- 1*« 1 .***. lit ja orgaaniset hapot. Näitä katalysaattoreita käytetään .···, tyypillisesti liuottimissa kuten hiilidisulf idi, mety- ,···, 25 leenikloridi, nitrometaani, 1,2-dikloorietaani, nitrobent- • · «j* seeni, tetrakloorietaani, klooribentseeni, bentseeni, to- • ·· , lueem, dimetyyliformamidi, tetrahydrofuraani, dioksaani • · *···* tai asetonitriili. Vedetön aluminiumkloridi ei liukene hiilidisulfidiin [Niedballa et ai., J. Ora. Chem. 39 • · --—---- - 30 (1974) 25]. Edullinen katalysaattori on SnCl4. Edullinen ··· liuotin on 1,2-dikloorietaani. Trimetyylisilyylitriflaat- :V. t;i-a voidaan käyttää samoissa olosuhteissa kuin kuvataan • · .···. edellä Friedel-Crafts-katalysaattoreille. Reaktio tapahtuu *»* lämpötila-alueella -10 - +200 °C. Desilylointi voidaan 35 suorittaa erilaisilla reagensseilla, mukaan lukien etikka- • « 12 118964 happo, trifluorietikkahappo, fluorivety, n-tetrabutyyli-ammoniumfluoridi, kaliumfluoridi ja pyridinium-HCl.

Viitaten kuvioon 3 L-ksyloosista (la) lähtien keskeinen välituote l-0-asetyyli-2,3,5-tri-0-bentsoyyli-fi-L-5 ribofuraanoosi (10) syntetisoitiin kokonaissaannon ollessa 20 % [L. Vargha, Chem. Ber. 87 (1954) 87; Holy, A., et al., Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry VI 163 - 167]. Kuten esitetään kuviossa 4, yhdiste 10 voidaan myös syntetisoida kalliimmasta lähtömateriaalista L-riboo-10 si [Holy et ai., Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry VI 163 - 167]. Kuviossa 3 esitetään vaihtoehtoinen synteesi yhdisteelle 10 (saanto 53 %), joka sitten fluo-rattiin C2:ssa [J. Qrq. Chem. 50 (1985) 3644 - 3647] 1,3,5-tri-0-bentsoyyli-2-deoksi-2-fluori-L-arabinofuraa-15 noosin (13) saamiseksi, joka kondensoitiin eri emäksiin bromisokerin välityksellä 2'-deoksi-2'-fluoriarabinofura-nosyylinukleosidien saamiseksi vaihtelevin saannoin.

1,2-di-O-isopropylideeni-a-L-ksylofuranoosi (3) 650 mitään vedetöntä asetonia lisättiin 4 ml kons. 20 rikkihappoa, 5 g molekyyliseula-ainetta (4 Ä), 80 g vedetöntä kupari(2)sulfaattia ja 50 g L-ksyloosia, ja seosta I sekoitettiin huoneenlämpötilassa 36 tunnin ajan. Reak- »M · ,···. tioseos sudoatettiin ja pestiin perusteellisesti asetonil- • · ,···, la, yhdistetty suodos neutraloitiin ammoniurnhydroksidilla • · ^ 25 ja haihdutettiin sitten kuiviin. Jäännökseen lisättiin • · ."· etyyliasetaattia (200 ml), minkä jälkeen suodattamlla ja • · kuiviin haihduttamalla saatiin öljy, joka liuotettiin 250 • « '···* ml:aan 0,2-%:ista HCl-liuosta ja sekoitettiin huoneenläm pötilassa 2,5 tunnin ajan. pH säädettiin 8:ksi lisäämällä • · V.* 30 kyllästettyä NaHCC^-liuosta, minkä jälkeen haihdutettiin ··· kuiviin ja uutettiin jäännöstä etyyliasetaatilla. Poista-j·*·, maila liuotin saatiin keltaisena öljynä yhdistettä 3 (41,7 g, 82,3 %) .

• ♦ *·;·* 1H-NMR (CDC13) : δ 5, 979 (d, J=3,78Hz, 1H, H-l) ; O 35 4,519 (d, J=3,6Hz, 1H, H-2); 4,308 (leveä d, 1H, H-3) ; • · 13 118954 4,080 (m, 3H, H-4 ja H-5) ; 1,321 (s, 3H, CH3) ; 1,253 (s, 3H, CH3) .

1,2-di-0-isopropylideeni-3,5-di-O-o-tolyylisulfon-yyli-a-L-ksylofuraanoosi (4) 5 Yhdistettä 3 (40 g, 210 nunol) sekoitettiin 500 ml:ssa vedetöntä pyridiiniä 0 °C:ssa samalla, kun lisättiin tipoittain liuos, jossa oli TsClrää (75 g, 393 nunol) liuotettuna 100 ml:aan CHCI3. 3 tunnin kuluttua toinen annos TsClrää (50 g, 262 mmol) 50 ml:ssa CHCI3 lisät-10 tiin samoin kuin edellä. Seosta sekoitettiin huoneenlämpö-tilassa 24 tunnin ajan, minkä jälkeen se jäähdytettiin 0 °C:seen, vettä (10 ml) lisättiin ja sekoitettiin sitten huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan. Reaktioseos kaadettiin 500 ml:aan jäävettä, uutettiin CHCl3:lla (150 ml x 15 4), pestiin 1,5 M H2S04:llä (150 ml x 4), kyllästetyllä

NaHC03-liuoksella (200 ml x 2) ja kuivattiin (MgS04) . Poistamalla liuotin saatiin ruskea siirappi, josta EtOH:sta kiteyttämällä saatiin yhdistettä 4 valkoisena kiinteänä aineena (103,8 g, 99 %) .

20 1H-NMR (CDCI3) : δ 7,282, 7,836 (m, 8H, OTs); 5,849 (d, J=3,51Hz, 1H, H-l); 4,661, 4,779 (m, 2H, H-3 ja H-4); S 4,193 (kaksois-d, 1H, H-2); 4,011 (d, 2H, H-5); 2,448, /•\ 2,478 (2s, 6H, -OTs); 1,261, 1,320 (2s, 6H, CH3) .

• a .···, 1,2-di-0-asetyyli-3,5-di-O-p—tolyylisulf onyyli- • a

Iti 25 α,β-ksylofuranoosi (5) ,;** Yhdistettä 4 (70 g, 140,5 mmol) liuotettiin 700 • * ml: aan jääkylmää AcOHrta ja 100 ml: aan ÄC20:ta samalla, a 4 *...* kun 50 ml kons. rikkihappoa lisättiin tipoittain 0 °C:ssa.

Saatua liuosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa yön yli, • 4 ν,ϊ 30 minkä jälkeen se kaadettiin 1 litraan jäävettä, uutettiin i"]s CHCl3:lla (200 ml x 4), pestiin kyllästetyllä NaHC03- ··]·. liuoksella ja kuivattiin (MgS04) . Poistamalla liuotin tyh- • a jössä saatiin yhdistettä 5 siirappina (84,2 g, raakasaanto **:·' no %).

a·* • a a a aa# a a a 14 118954

Metyyli-3,5-di-O-p-tolyylisulfonyyli-α,β-ksylofu-ranoosi (6)

Epäpuhdasta yhdistettä 5 (80 g) sekoitettiin 500 mlrssa 1 % HCl/CH30H:ta huoneenlämpötilassa 30 tunnin 5 ajan. Liuotin poistettiin alipaineessa, jäännös liuotettiin 300 ml: aan CHCI3, pestiin kyllästetyllä NaHCCb-liuoksella ja kuivattiin (MgSO-a) . Poistamalla liuotin saatiin yhdistettä 6 siirappina (60 g, 90 % 4:stä).

Metyyli-2-O-bentsoyyli-3,5-di-O-p-tolyylisulfonyy-10 li-a,β-ksylofuranosidi (7)

Siirappia 6 (60 g, 127 mmol) liuotettiin 200 ml:aan pyridiiniä ja sekoitettiin 0 °C:ssa samalla, kun bentsoyylikloridia (40 ml, 345 mmol) lisättiin tipoittain, minkä jälkeen saatua liuosta sekoitettiin huoneenlämpöti-15 lassa 17 tunnin ajan. Se konsentroitiin noin 50 ml:ksi, minkä jälkeen se kaadettiin 300 ml:aan jäävettä, uutettiin CHCl3:lla, pestiin 3 N H2S04:llä ja kyllästetyllä NaHC03-liuoksella ja kuivattiin (MgS04) . Liuotin eroon haihduttamalla saatiin yhdistettä 7 siirappina (71 g, 97 %).

2 0 Metyyli-2,3,S-tri-O-bentsoyyli-a-fi-L-ribofurano- sidi (9) : Siirappia 7 (70 g) ja natriumbentsoaattia (100 g, .···. 694 mmol) suspendoitiin 1 200 ml:aan DMF:ää ja sekoitet- 9 · tiin mekaanisesti palautusjäähdyttäen 16 tunnin ajan. Seos • « I” 25 jäähdytettiin huoneenlämpötilaan, minkä jälkeen se kaadet-* · !*··* tiin 1 litraan jäävettä, uutettin eetterillä ja kuivattiin • · ^ ** (MgS04) . Haihduttamalla liuotin saatiin siirappi (50 g, 8a ja 8b), joka liuotettiin 180 ml:aan pyridiiniä ja bent-soyloitiin (BzCl, 20 ml, 172 mmol) 17 tunnin ajan huoneen- • · ::: 30 lämpötilassa. Jatkotyöstön jälkeen saatiin yhdistettä 9 siirappina (48 g, 83 %:n saanto lista).

9 m* l-O-asetyyli-2,3,5-tri-0-bentsoyyli-B-L-ribo£ura- *..; noosi (10) • · *;** Yhdistettä 9 (26 g, 54,6 mmol) käsiteltiin seok- 35 sella, jossa oli 275 ml jääetikkaa, 55 ml asetanhydridiä 9 9 15 118954 ja 16 ml kons, rikkihappoa, lämpötilassa 0 °C:sta huoneenlämpötilaan 17 tunnin ajan. Tämän jälkeen seos kaadettiin 1 litraan jäävettä ja uutettiin kloroformilla (200 ml x 4) . Yhdistetyt uutteet pestiin kyllästetyllä NaHCCb-5 liuoksella ja kuivattiin (MgSCU) . Poistamalla liuotin saatiin ruskea siirappi, jota etanolilla käsittelemällä saatiin yhdistettä 10 valkoisena kiinteänä aineena (8,8 g, 32 %) . Sp. 124,7 °C, kirj. 129 - 130 °C; D-muoto: 130 -131 °C [a]o = -45,613 (c=l,0, CHCI3), D-muoto: [α]β = 10 +44,2.

1H-NMR (CDCI3) : δ 7,317, 8,134 (m, 15H, OBz); 6,437 (s, 1H, H-l); 5,835 (m, 2H, H-2 ja H-3); 4,649 (m, 3H, H-4 ja H-5).; 2,003 (s, 3H, CH3COO-) .

l-O-asetyyli-2,3,5-tri-0-bentsoyyli-B-L-ribofura-15 noosi (L-riboosista) L-riboosia (5 g, 33,3 mmol) suspendoitiin 120 ml:aan 1 % HCl/MeOH:ta ja sekoitettiin huoneenlämpötilassa 3 tunnin ajan, jolloin saatiin kirkas liuos. Reaktio keskeytettiin lisäämällä 30 ml vedetöntä pyridiiniä, minkä 20 jälkeen seos haihdutettiin alipaineessa kuiviin. Saatu siirappi haihdutettiin yhdessä pyridiinin kanssa (30 ml x : 2), minkä jälkeen jäännös liuotettiin 80 ml:aan vedetöntä • · · .··. pyridiiniä ja sekoitettiin 0 °C:ssa samalla, kun bentsoyy- • · lii likloridia (20 ml, 172 mmol) lisättiin tipoittain. 17 tun- • · *" 25 nin sekoituksen huoneenlämpötilassa jälkeen reaktio oli • · !*··* mennyt loppuun. Vettä (10 ml) lisättiin ja seosta sekoi- • · ϊ ** tettiin huoneenlämpötilassa 0,5 tunnin ajan, minkä jäi- • · · ·...* keen se haihdutettiin noin 50 ml:ksi, joka kaadettiin 150 ml:aan jäävettä, uutettiin kloroformilla (50 ml x 4), pesisi 30 tiin toisiaan seuraten 3 N H2S04:llä (30 ml x 2), kylläs- :*’*· tetyllä NaHCCb-liuoksella (30 ml x 3) ja kuivattiin *·· (MgSOi) . Poistamalla liuotin saatiin yhdistettä 9 siirap- • ft · V.* pina 13 g.

• · *··** Yhdiste 9 -raakatuote liuotettiin 80 ml:aan HBr/ 35 AcOHrta (45 %, paino/tilavuus), ja sekoitettiin 1,5 tunnin • · ,, 1 1 8954 16 ajan huoneenlämpötilassa. Tähän seokseen lisättiin jääetik-kaa (50 ml) ja saatua liuosta sekoitettiin 0 °C:ssa samalla, kun 34 ml vettä lisättiin hitaasti lämpötilan pysyttämiseksi alle 7 °C:ssa. Sitten seosta sekoitettiin huoneen-5 lämpötilassa 1 tunnin ajan, minkä jälkeen se kaadettiin 200 ml:aan jäävettä ja uutettiin kloroformilla (50 ml x 5) . Yhdistetyt uutteet pestiin kyllästetyllä NaHCC>3-liuoksella ja kuivattiin (MgSCU) . Liuotin poistamalla saatiin siirappi (13 g), joka liuotettiin 40 ml:aan vedetöntä 10 pyridiiniä ja sekoitettiin 0 °C:ssa, minkä jälkeen lisättiin tipoittain asetanhydridiä (14 ml, 148,4 mmol). Kun reaktio oli valmis, seos kaadettiin 150 ml:aan jäävettä, uutettin kloroformilla (50 ml x 4), pestiin toisiaan seuraten 3 N H2S04:llä (30 ml x 2), kyllästetyllä NaHCC^-15 liuoksella (50 ml x 2), ja kuivattiin (MgS04) . Liuotin poistamalla ja metanolilla käsittelemällä saatiin yhdistettä 10 valkoisena kiinteänä aineena (9,2 g, 53,7 % L-riboosista).

1,3,5-tri-O-bentsoyyli-a-L-ribofuranoosi (11) 20 Yhdistettä 10 (9 g, 17,84 mmol) sekoitettiin 100 ml:ssa CH2Cl2:ta 0 °C:ssa samalla, kun 70 ml CH2Cl2:ta, jo- : ka sisälsi HBr:ää (3,2 g, 30,5 mmol), lisättiin yhtenä • · · t···. eränä. Seosta sekoitettiin 0 °C:ssa 3,5 tunnin ajan, vettä •

Hl (55 ml) lisättiin ja seosta sekoitettiin huoneenlämpöti- • * ·” 25 lassa 18 tunnin ajan. Orgaaninen faasi erotettiin, se pes- • · ]···’ tiin kyllästetyllä NaHC03-liuoksella ja kuivattiin • · ί ** (MgS04) . Liuotin haihduttamalla saatiin vaahto, josta ··· CH2Cl2:sta ja n-heksaanista uudelleenkiteyttämällä saatiin yhdistettä 11 valkoisena kiinteänä aineena (6,2 g, 75,5 iV: 30 %). Sp. 137 - 138 °C, kirj. 140 - 141 °C, [a]D = -81,960 :***: (c=0,55, CHCI3) ; D-muoto: [o]d = +83,71.

·· 1H-NMR (CDCI3) : δ 7,312, 8,187 (m, 15H, OBz); 6,691 • · * (d, J=4,59Hz, H-l); 5,593 (kaksois-d, J4-3=6,66Hz; J2-3= *··/ 1,8Hz, 1H, H-30) ; 4,637, 4,796 (m, 4H, H-2, H-4 ja H-5) ; Ϊ***: 35 2,3 (b, OH).

·· « • · 17 tf S£$4 1,3,5-tri-0-bentsoyyli-2-0-imidatsosulfyryyli-a-L-ribofuranoosi (12)

Yhdistettä 11 (5,94 g, 12,84 mmol) sekoitettiin 50 ml:ssa vedetöntä CH2Cl2:ta -15 °C:ssa (kuivajää-CCli) . Ve~ 5 detöntä DMF:ää (15 ml) ja sulfyryylikloridia (3,2 ml, 3,98 mmol) lisättiin peräkkäin. Liuosta sekoitettiin -15 °C:ssa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen se jätettiin huoneenlämpö-tilaan 4 tunniksi. Imidatsolia (8,7 g, 12,78 mmol) lisättiin 3 erässä samalla, kun reaktioseosta jäähdytettiin 10 jäähauteessa. Sitten sitä sekoitettiin 17 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Seos kaadettiin 150 ml:aan jäävettä ja vesifaasia uutettiin CH2Cl2:lla (50 ml x 3). Yhdistetyt orgaaniset faasit pestiin vedellä ja kuivattiin (MgS04) . Puhdistamalla kolonnissa (heksaani/EtOAc 5:1 —> 1:1) saa-15 tiin yhdistettä 12 valkoisena kiinteänä aineena (3,7 g, 49 %). Sp. 124,5 - 125,5 °C, kirj. 129 °C; [a]D = -68,976; D-muoto: +66,154.

1H-NMR (CDC13) : δ 6,9, 8,2 (m, 18H, Ar-H) ; 6,67 (d, J=4,4Hz, 1H, H-l); 5,59 (kaksois-d, 1H, H-3) ; 5,21 (kak- 20 sois-d, 1H, H-2); 4,5, 4,8 (m, 3H, H-4 ja H-5).

1,3,5-tri-0-bentsoyyli-2-deoksi-2-fluori-a-L-ara-: .*. binofuranoosi (13) • M · .···. Suspensiota, jossa oli yhdistettä 12 (3,33 g, 5,62 • · mmol), KHF2:ta (1,76 g, 22,56 mmol) 30 ml: ssa 2,3- • · VV. 25 butaanidiolia, sekoitettiin argonsuojakaasussa. Seos kuu-• · ]···* mennettiin 150 °C:seen samalla, kun 1 ml HF/H2O:ta (48~ • · • '* %:inen %-liuos, 27,6 mmol) lisättiin ja seosta sekoitet- ··· • tiin 160 °C:ssa 1,5 tunnin ajan. Suolavesi-jäätä lisättiin reaktion pysäyttämiseksi, minkä jälkeen liuosta uutettiin · ϊ.ϊ.ϊ 30 metyleenikloridilla (50 ml x 4) . Yhdistetyt uutteet pes- tiin suolavedellä, vedellä, kyllästetyllä NaHCChilla, kui- ..[.t vattiin kidevedettömällä magnesiumsulfaatilla ja aktiivi- • · hiilellä (Darco-60) . Se kaadettiin silikageelityynylle **;·* (5 cm x 5 cm), pestiin ensin metyleenikloridilla ja sitten ··· 35 EtOAc:llä, jolloin saatiin siirappi, josta 95-%:isesta • · 18 1 18954

EtOH:sta kiteytettämällä saatiin yhdiste 13 (1,3 g, 49,8 %). Sp. 77 - 78 °C; kirj. 82 °C.

1H-NMR (CDC13) : δ 7,314, 8,146 (m, 15H, OBz) ; 6,757 (d, J=9,1Hz, 1H, H-l) ; 5,38 (d, J=48,5Hz, 1H, H-2); 5,630 5 (kaksois-d, J=22,5Hz, 1H, H-3); 4,768 (m, 3H, H-4 ja H-5).

Ng-[3',5'-di-O-böntsoyyli-2'-deoksi-2'-fluori-B-L-arabinofuranosyyli]-2,6-diklooripuriini (15)

Yhdistettä 13 (464 mg, 1 mmol) liuotettiin 10 ml:aan metyleenikloridia ja lisättiin 1,4 ml HBr/AcOH:ta 10 (45 % paino/tilavuus). Liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 24 tunnin ajan, minkä jälkeen se haihdutettiin kuiviin. Jäännös liuotettiin 20 ml:aan metyleenikloridia, ja liuos pestiin vedellä, kyllästetyllä NaHCC>3-liuoksella sekä kuivattiin (MgS04) . Suodattamalla ja kui-15 viin haihduttamalla saatiin bromisokeria 14 (100 % TLC:n perusteella).

Samanaikaisesti 2,6-diklooripuriinia (378 mg, 2 mmol) suspendoitiin 15 ml:aan HMDS:ää, jossa oli 2 mg am-moniumsulfaattia, minkä jälkeen keitettiin palautusjääh-20 dyttäen 2 tunnin ajan. HMDS haihdutettiin tehokkaassa tyhjössä N2-suojakaasussa, jolloin saatiin valkoista silyloi- : .·. tua emästä.

• · ·

IM I

,···, Bromisokeria 14 liuotettiin 25 ml: aan vedetöntä • * 1,2-dikloorietaania. Saatu liuos lisättiin silyloituun • * "I 25 emäkseen N2-suojakaasussa. Seosta keitettiin sekoittaen ja • · ,"** palautus jäähdyttäen 2 päivän ajan. Lisättiin kloroformia • · i ** (30 ml), minkä jälkeen pestiin toisiaan seuraten vedellä ··* (20 ml x 2), kyllästetylä NaHCC^-liuoksella (20 ml x 2), kyllästetyllä NaCl-liuoksella (20 ml x 2) , ja kuivat- ·#·#· 30 tiin (MgSOi) . Yhdiste 15 (105 mg, 19,7 %) kiteytettiin :***; CHCl3:sta. Sp. 158 °C, D-muoto 158 °C.

··· UV (metanoli) : larnbdamaks.: 238,50 nm, 273, 0 nm.

*„;* 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 8,82 (d, J=l,5Hz, 1H, • · **;*’ H-8); 7,49, 8,33 (m, 10H, OBz); 6, 767 (kaksois-d, Jh-h=4Hz, * · • · ·*· • · 118954 19

Kf-h=13,8Hz, lH, H-l'); 5,854 (kaksois-q, J=67,4Hz, 1H, H-2'); 5,910 (m, 1H, H-3'); 4,751 (m, 3H, H-4' jaH-5')· Ng-[2'-deoksi-2'-fluori-B-L-arabinofuranosyyli]- 2,6-diklooripuriini (16) 5 Yhdistettä 15 (70 mg, 0,13 mmol) liuotettiin 25 ml:aan kyllästettyä NH3/CH30H:ta tiiviiisti suljetussa te-räspommissa, ja kuumennettiin 90 °C:ssa 6 tunnin ajan. Poistamalla liuotin alipaineessa saatiin keltainen puoli-kiinteä aine, jota puhdistettiin preparatiivisella TLC:llä 10 (9:1, CHCI3/CH3OH) . Lyofilisoimalla vedestä ja 1,4-diok- saanista saatiin valkoisena jauheena yhdistettä 16 (30 mg, 75 %) .

UV (H2O) pH 2, lambdamaks. 212,00 nm, 263, 50 nm (eeta 6711); pH 7, lambdamaks. 213,50 nm, 263, 00 nm (eeta 15 7590); pH 11, lambdamaks. 213,5 nm, 263, 00 nm (eeta 5468).

1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 8,279 (d, J=l,5Hz, 1H, H-8); 7,908 (leveä s, 2H, NH2) ; 6,321 (kasois-d, JH-h=4,4Hz, Jf-h=13, 8Hz, 1H, H-l'); 5,986 (t, 1H, 5'-OH); 5,230 (kaksois-t, Jf-h=52,6Hz, 1H, H-2') : 5,115 (d, 1H, 3'-20 OH); 4,425 (kaksois-q, JF-h=19Hz, 1Η, H=3') ; 3,841 (m, 1H, H-4'); 3,636 (d, 2H, Η-5').

• ·*· Ni- (2 ' -deoksi-2 ' -f luori-3' , 5' -di-O-bentsyyli-B-L-··· · .·*·. arabinofuranosyyli) tyrniini (17) ,···. Liuokseen, jossa oli yhdistettä 13 (400 mg, 0,86 • · ΪΑ 25 mmol) vedettömässä CH2Cl2:ssa (10 ml), lisättiin bromive-• · tyä etikkahapossa (45 % paino/tilavuus, 1,5 ml), ja saatua seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 17 tunnin ajan.

• · *···* Haihduttamalla liuotin eroon ja sitten haihduttamalla yh dessä tolueenin kanssa saatiin yhdistettä 14.

· V.: 30 Samanaikaisesti tymiiniä (215 mg, 1,72 mmol) kei- if#t: tettiin palautusjäähdyttäen HMDS:ssä (25 ml) typpisuoja- ··]·, kaasussa 17 tunnin ajan homogeenisen liuoksen saamiseksi.

• ·

Liuotin haihduttamalla saatiin silyloitua tymiiniä.

*" Liuos, jossa oli yhdistettä 14 dikloorietaanissa 35 (50 . ml) lisättiin silyloituun tymiiniin, ja saatua liuosta « · 118954 20 keitettiin palautusjäähdyttäen typpisuojakaasussa 3 päivän ajan. Lisättiin vettä, minkä jälkeen uutettiin CHCl3:lla. Orgaaninen faasi pestiin vedellä, suolaliuoksella ja kuivattiin (MgS04) . Haihduttamalla liuotin eroon saatiin raa-5 katuotetta, jota puhdistettiin preparatiivisella TLCtllä käyttäen 2 % MeOH/CHCl3, jolloin saatiin yhdistettä 17 (235 mg, 58 %) . Sp. 99 - 101 «*C.

UV (metanoli): 230, 264 nm; [a]D = +22,397.

1H-NMR (CDC13) : δ 7,343 - 8,389 (m, 12H, Ar-H, NH) ; 10 6,34 (kaksois-d, Jh-h= 2,97Hz, JF-H= 28,32Hz, 1H, H-l'); 5,383 (kaksois-d, Jh-h=2,7Hz, Jf-h-63,27Hz, 1H, H-2' ) ; 5,565 (kaksois-d, 1H, H-3'); 4,812 (d, 2H, H-5'); 4,466 (m, 1H, H-4' ) ; 1,775 (s, 3H, CH3) .

Koostumusanalyysi (C24H21N2O7F) : C 61,01; H 4,57; 15 N 5,73; F 3,92.

Ni~(2'-deoksi-2'-fluori-β-L-arabinofuranosyyli)-tyrniini (18)

Yhdistettä 17 (145 mg, 0,309 mmol) käsitel tiin NH3/ CH3OH:lla huoneenlämpötilassa 18 tunnin ajan. 20 Liuotin eroon haihduttamalla ja sitten jäännöstä preparatiivisella TLC:llä puhdistamalla (15 % MeOH/CHCl3) saa-J .·. tiin yhdistettä 18 (70 mg, 87,5 %) . Sp. 174 - 175 °C.

,*··. UV: 264 nm; [a]D = -104,36.

• » 1H-NMR (DMSO-de): δ 11,401 (s, 1H, NH) ; 7,575 (s, 25 IK, Η-e); 6, 093 (kaksois-d, Jh-h=4,41Hz, Jf_h=15, 6Hz, H-l'); • · ]“·* 5,844 (d, 1H, 3' -OH); 5,019 (kaksois-t, Jf-h=53,3Hz, 1H, • H-2'); 5,087 (t, 1H, 5'-OH); 4,194 (kaksois-q, 1H, H-3'); 3, 647 (m, 3H, H-4' ja H-5'); 1,781 (s, 3H, CH3) .

Koostumusanalyysi (C10H13N2FO5) : C 44,80; H 4,97; iV: 30 N 10,04; F 7,03.

Ni-(2'-deoksi-2'-fluori-3',5'-di-O-bentsoyyli-B-L-arabinofuranosyyli) -5-etyyliurasiili (19) • m

Liuokseen, jossa on yhdistettä 13 vedettömässä di- • · *·"’ kloorimetaanissa (10 ml), lisättiin bromivetyä etikkaha- ϊ>#<: 35 possa (45 % paino/tilavuus, 0,97 ml, 5, 385 mmol). Liuosta « e · 118954 21 sekoitettiin huoneenlämpötilassa 18 tunnin ajan, minkä jälkeen haihduttamalla liuotin eroon ja haihduttamalla kuiviin yhdessä tolueenin kanssa saatiin yhdistettä 14.

Samanaikaisesti 5-etyyliurasiilia (0,75 g, 5,39 5 mmol) suspendoitiin HMDS:ään (10 ml) ammoniumsulfaatin (5 mg) kanssa, ja keitettiin palautusjäähdyttäen 5 tunnin ajan typpisuojakaasussa homogeenisen liuoksen saamiseksi.

Silyloitu emäs -liuos haihdutettiin kuiviin välttäen kosketusta kosteuteen. Saatuun siirappiin lisättiin 10 liuos, jossa oli yhdistettä 14 vedettömässä 1,2-dikloo-rietaanissa (10 ml). Reaktioseosta sekoitettiin 95 °C:ssa typpisuojakaasussa 20 tunnin ajan, minkä jälkeen se haihdutettiin tyhjössä kuiviin, jolloin saatiin keltaista kiinteää ainetta, joka sekoitettiin 5 ml:aan CH3OH/CHCI3 15 (1:1) ja suodatettiin. Suodos kuiviin haihduttamalla saa tiin jäännös, jolla suoritettiin kromatografia-ajo silika-geelikolonnissa (CH3OH/CHCI3, 0 - 1 %), jolloin saatiin valkoisena kiinteänä aineena yhdistettä 19 (0,557 g, 100 %) .

20 1H-NMR (DMSO-de): δ 11,55 (s, 1H, NH) ; 7,51, 8,08 (m, 10H, Ar-H); 7,32 (s, 1H, H-6); 6,29, 6,37 (kaksois-d, : Jh-h=3,7Hz, Jf-h=20Hz, 1H, H-l'); 5, 68 - 5,75 (kaksois-d, .···. Jf-h=20Hz, 1H, H-3') ; 5,47 - 5, 65 (kaksois-d, Jf-h=54Hz, 1H, ϊ.'·' H-2'); 4,62 - 4,83 (m, 3H, H-4' ja H-5'); 2,01, 2,09 (g, 25 2H, CH2-CH3); o, 85 (t, 3H, CH3) .

• ·

Ni-(2'-deoksi-2'-fluori-B-L-arabinofuranosyyli)-5- • · • " etyyliurasiili (20)

Yhdistettä 19 (500 mg) liuotettiin ammoniakin me- tanoliliuokseen (50 ml) , ja sekoitettiin huoneenlämpöti- ϊ ϊ ί 30 lassa 44 tunnin ajan. Liuos kuiviin haihduttamalla saatiin :***! valkoista kiinteää ainetta (0,4 g), jolla suoritettiin ··· kromatografia-ajo silikageelikolonnissa (CH30H/CHC13, 0 - • · 5 %), jolloin saatiin valkoisena kiinteänä aineena yhdis- • *·;·* tettä 20 (240 mg, 84 %) . Sp. 158 - 161 <>C.

35 UV (MeOH) : lambdamakS. 260 nm.

• · 118954 22 1H-NMR (DMSO-de): δ 11,42 (s, 1H, NH); 7,57 (s, 1H, H-6') ; 6,10, 6,17 (kaksois-d, Jh-h=5,0Hz, Jf-h=14Hz, 1H, H-l'); 5,88 (leveä s, 1H, 3'-OH); 5,14, 5,19 (m, 2H, H-2' ja 5'-OH); 4,98 (t, 1H, H-3'); 4,22, 4,28 (m, 1H, H-4') ; 5 3,55, 3,78 (m, 2H, H-5').

Koostumusanalyysi (C11H15N2O5F) : C 47,93; H 5,56; N 10,06; F 6,68.

Ni-(2'-deoksi-2'-fluori-3',5'-di-O-bentsoyyli-B-L-arabinofuranosyyli) -N4-bentsoyyli-5-jodisytosiini (21) 10 Liuokseen, jossa oli yhdistettä 13 (150 mg, 0,323 mmol) vedettömässä metyleenikloridissa (5 ml), lisättiin bromivetyä etikkahapossa (45 % paino/tilavuus, 0,29 ml, 1,615 mmol). Reaktioseosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 9,5 tunnin ajan. Haihduttamalla liuotin eroon ja sitten 15 haihduttamalla kuiviin yhdessä tolueenin kanssa saatiin yhdistettä 15 keltaisena siirappina.

Samanaikaisesti N4-bentsoyyli-5-j odisytosiinia (550 mg, 1,615 mmol) suspendoitiin HMDS:ään (8 ml) ammoni-umsulfaatin (3 mg) kanssa, ja keitettiin palautusjäähdyt-20 täen 5 tunnin ajan typpisuojakaasussa homogeenisen liuoksen saamiseksi.

J .*. Silyloitu emäs -liuos haihdutettiin kuiviin vält- • ti · .··*. täen kosketusta kosteuteen. Saatuun siirappiin lisättiin liuos, jossa oli yhdistettä 14 vedettömässä 1,2-dikloo- • * "! 25 rietaanissa (10 ml) . Reaktioseosta keitettiin palautus- • » • · .1" jäähdyttäen typpisuojakaasussa 23 tunnin ajan, minkä jäi- * · keen se haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin ruskea sii- • « *···* rappi, jota trituroitiin kloroformissa (30 ml) . Saatu sak ka suodatettiin eroon ja pestiin kloroformilla. Suodos ja :.V 30 pesuerät yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin ruskeaa siirappia. Tuoteseos erotettiin kromato- ··]·, grafisesti silikageelikolonnissa (CH3OH/CHCI3, 0 - 1 %), • · *.« jolloin saatiin valkoista kiinteää ainetta 21 (100 mg, 45 %) .

··· t · • · ··· • · 118954 23 1H-NMR (CDC13) : δ 11,40 (leveä s, 1H, NH) ; 7,26, 8,20 (m, 17H, Ar-H, H-6 ja NH) ; 6, 36, 6, 44 (kaksois-d, Jh-h=2,8Hz, JF-h^21Hz, 1H, H-l'); 5, 62, 5, 68 (kaksois-d, 1H, H-3'); 5,39, 5,56 (kaksois-d, 1H, H-2'); 4,58, 4,85 (m, 5 3H, H-4' ja H-5').

Ni-(2'-deoksi-2'-fluori-fi-L-arabinofuranosyyli)-5-jodisytosiini (22)

Yhdistettä 21 (100 mg, 0,27 mmol) käsiteltiin am moniakilla kyllästetyllä metanolilla (60 ml) huoneenlämpö-10 tilassa 24 tunnin ajan. Suorittamalla kromatografia-ajo silikageelikolonnissa (0 - 10 % CH3OH/CHCI3) saatiin yhdistettä 22 (35 mg, 71 %) valkoisena kiinteänä aineena.

[Oi] d = -65,4 (c=0,34, CH3OH) .

UV (MeOH) : lambda^. = 293 nm.

15 1H-NMR (DMSO-de) : δ 8,04 (s, 1H, H-6); 6,74, 7,94 (s, 1H, NH) ; 6,01, 6,08 (kaksois-d, Jh-h=3,9Hz, Jf-h=16, 6Hz, 1H, H-l'); 5,85 (d, 1H, 3'-OH); 5,17 (t, 1-H, 5'-OH); 5,08 (t, 1H, H-2'); 4,89 (t, 1H, H-3’); 4,15 - 4,23 (m, 1H, H-4’); 3,63 - 3,79 (m, 2H, H-5')· 2 0 Ni-(2'-deoksi-2'-fluori-3',5'-di-O-bentsoyyli-B-L- arabinofuranosyyli)-5-jodiurasiili (23) { ·1; Liuokseen, jossa oli yhdistettä 13 (260 mg, 0,56 M· 1 ;**·. mmol) 10 mlrssa vedetöntä CH2Cl2:ta, lisättiin HBr/AcOH:ta «·· ,1··, (45 %, paino/tilavuus, 0,5 ml, 2,8 mmol). Reaktioseosta ·. · 25 sekoitettiin huoneenlämpötilassa 36 tunnin ajan, minkä • · ,*** jälkeen se haihdutettiin kuiviin. Jäännös liuotettiin 20 • · ml:aan CH2Cl2:ta, pestiin vedellä (10 ml), kyllästetyllä • 1 *···1 NaHC03-liuoksella (10 ml) ja kuivattiin (MgSCL) . Suodatta malla ja suodos kuiviin haihduttamalla saatiin bromisoke- • e \V 30 ria 14 siirappina.

··· ’,..1 Samanaikaisesti 5-jodiurasiilia (270 mg, 1,12 *V. mmol) suspendoitiin 10 ml:aan HMDStää ja keitettiin palau- * ♦ tus jäähdyttäen 36 tunnin ajan homogeenisen liuoksen saarni- • · V seksi, joka haihdutettiin tyhjössä kuiviin. Jäännökseen ··· 35 lisättiin liuos, jossa oli yhdistettä 14 vedettömässä 1,2- · 24 118954 dikloorietaanissa, ja saatua liuosta keitettiin palautus-jäähdyttäen N2-suojakaasussa 1,5 päivän ajan. Lisättiin CHCI3 (20 ml) ja liuos pestiin toisiaan seuraten vedellä (10 ml), suolaliuoksella (10 ml) ja kyllästetyllä NaHCC^-5 liuoksella (10 ml) ja kuivattiin sitten (MgSCU) - Poistamalla liuotin saatiin siirappia, joka CH2Cl2:sta kiteyttämällä saatiin yhdistettä 23 keltaisena kiinteänä aineena (237 mg, 73 %). Osa tästä (70 mg) uudelleenkiteytettiin 2-isopropanolista, jolloin saatiin valkoista kiinteää ainet-10 ta (67 mg).

UV (metanoli) : lambdamaks. 230, 0 nm, 276, 0 nm.

1H-NMR (CDCI3) : δ 8,4, 7,3 (m, 12H, Ar-H) ; 6,29 (kaksois-d, Jh-h^, 43Hz, Jf-h=21,6Hz, 1H, H-l'); 5, 377 (kak-sois-d, Jh-h=2,8Hz, Jf-h=61,3Hz, 1H, H-2'); 5,55 (kaksois-d, 15 1H, H-3' ) ; 4,865, 4,793 (d, 2H, H-5'); 4,588, 4,502 (m, 1H, H-4').

Ni-(2'-deoksi-2'-fluori-β-L-arabinofuranosyyli)-5-jodiurasiili (24)

Yhdistettä 23 (40 mg, 0,069 mmol) liuotettiin 25 20 ml:aan ammoniakilla kyllästettyä metanolia ja sekoitettiin huoneenlämpötilassa 24 tunnin ajan, minkä jälkeen liuos • ·*· haihdutettiin kuiviin. Saatua siirappia preparatiivisella .*··. TLC:llä puhdistamalla (5:1 CHCl3/MeOH) saatiin yhdistettä .*··, 24 kiinteänä aineena (19 mg, 74 %) .

• · 25 UV (MeOH) : lambdamak3. 280,5 nm.

!:"* 1H-NMR (DMSO-de): δ 11,82 (leveä s, CONH) ; 8,24 (s, • m *tmt 1H, H-6) ; 6,082 (kaksois—d, Jh-h=4,45Hz, Jf-h=13,7, 1H, H-l'); 5,947 (d, 1H, 3'-OH); 5,296 (t, 1H, 5'-OH); 5,07 (kaksois-t, JF-h=53Hz, 1H, H-2') ; 4,24 (leveä d, Jf-h=21Hz, •\V: 30 IH, H-3'); 3,81, 3,55 (m, 3H, H-4', H-5').

2,3,5-tri-O-bentsyyli-L-arabinoosi

Kuten esitetään kuviossa 9, 30 g (0,2 mol) jauhe- • ♦ maista L-arabinoosia (5) ja sitten 0,4 ml kons. rikkihap- • · *ί* poa lisättiin 600 ml:aan (14,8 mol) vedetöntä metanolia.

999 35 Suspensiota sekoitettiin ja keitettiin kevyesti palautus- 9 9 9 118954 25 jäähdyttäen 2 tunnin ajan kirkkaan liuoksen saamiseksi. Reaktioseos neutraloitiin lisäämällä 1,5 g natriumvetykar-bonaattia, kuivattiin (Na2S04) ja haihdutettiin sitten tyhjössä kuiviin, jolloin saatiin raskasta siirappia 6, 5 jota laimennettiin lisäämällä 50 ml vastapuhdistettua tet-rahydrofuraania ja haihdutettiin toistamiseen kuiviin (haude 35 - 40 °C) metanolijäämien poistamiseksi. Vasta-puhdistettua tetrahydrofuraania (400 ml) lisättiin ja seokseen lisättiin 30 g Drierite-valmistetta, 156 g (2,78 10 mol) kaliumhydroksidia ja 200 ml (1,74 mol) bentsyyliklo-ridia. Seosta kuumennettiin kevyesti palautusjäähdyttäen yön yli, se jäähdytettiin, suodatettiin ohuen Celite-kerroksen läpi ja haihdutettiin suodosta tyhjössä ja sitten tehokkaassa tyhjössä 100 °C:ssa (haude). Epäpuhdas 15 siirappimainen metyyli-2,3,5-tri-O-bentsyyli-L-arabinosi-di (7) liuotettiin 400 ml:aan jääetikkaa. Hydrolyysiseosta kuumennettiin 65 - 70 °C:ssa 2 tunnin ajan, se haihdutettiin tyhjössä 1/3 tilavuuteen ja kaadettiin 2,5 litraan jäävesiseosta. Alkukiteiden (alkukiteitä saatiin alunperin 20 kromatografisesti dikloorimetaanilla eluoiden) lisäyksen jälkeen seosta pidettiin 5 °C:ssa yön yli. Vesifaasi de- { ·*· kantoitiin eroon osittain kiteisestä massasta, joka liuo- ♦ *· · .**·. tettiin 200 mitään dikloorimetaania. Liuos pestiin natri- ··· .*··. umvetykarbonaatin kylmällä vesiliuoksella, kuivattiin • · ,···. 25 (Na2S04) , suodatettiin ohuen pedin läpi väriä poistavaa • · .Γ* hiiltä ja haihdutettiin tyhjössä ohueksi siirapiksi, joka liuotettiin 200 mitään sykloheksaania. Alkukiteiden lisäyk- • * *···* sen jälkeen liuosta pidettiin huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan ja 5 °Ctssa yön yli, jolloin saatiin 27,7 g (33,2 %) * · ·,·.· 30 2,3,5-tri-O-bentsyyli-L-arabinoosia (8). Sp. 68 - 73 °C; [a]25D = -1,69 (c=2,01, 911 v/v p-dioksaani/vesi) .

:\\ UV (MeOH) larnbdamalts. 220.

• » 1H-NMR (300 MHz, CDC13) : δ 3, 48 - 3,62 (m, 2H, H- '"** 5); 3,94 - 4,18 (m, 3H, H-2,3,4); 5,33 (d, 1H, J=4,07, H- ·*· 35 1); 5,29 (s, H-l); 7,25 - 7,33 (m, 15H, aromaatteja) .

• * 118954 26 2,3,5-tri-O-bentsyyli-l-O-(p-nitrobentsoyyli)-L-arabinoosi (9)

Yhdistettä 8 (kuvio 9) (2 g, 4,76 mmol) liuotet tiin 7,5 ml:aan dikloorimetaania, ja tähän liuokseen li-5 sättiin liuos, jossa oli 0,95 g (5,1 mmol) p-nitro-bentsoyylikloridia 5 ml:n dikloorimetaania ja 1,5 ml:n py-ridiiniä seoksessa. Reaktioseosta pidettiin huoneenlämpö-tilassa yön yli, minkä jälkeen se pestiin toisiaan seuraten 1 N kloorivetyhapolla (2 x 10 ml), natriumvetykar-10 bonaatin vesiliuoksella (2 x 10 ml) ja vedellä (3 x 30 ml). Kosteus poistettiin Na2SC>4:llä ja liuos haihdutettiin tyhjössä kuiviin, jolloin saatiin 2,67 g (98,4 %) yhdisteen 9 anomeerien seosta, sp. 68 - 82 °C. Lisäpuhdistus kolonnikromatografisesti silikageelissä (heksaaniseos/- 15 asetoni 8:1) nosti sulamispisteen 89 - 93 °C:seen; [a]D = 13,04 (c=6, 8, CH2C12) .

UV (MeOH) lambdamaks. 215,5 ja 258,5.

1H-NMR (250 MHz, CDCI3) : δ 3,54 - 3,69 (m, 2H, H-5); 4,06 (m, 1H, H-4' ) ; 4,22 (m, 1H, H-3' ) ; 4,33 (m, 1H, 20 H-2') ; 4,38 - 4,78 (m, 6H, bentsyyli-CH2) ; 6,50 (d, 1H, J=2,35, H-l) ; 7,23 - 7,36 (m, 15H, aromaattisia vetyjä • ·*· bentsyyliryhmästä) ; 8,01 - 8,25 (m, 4H, aromaattisia ve- ··« Φ .***. tyjä nitrobentsoyyliryhmästä) .

*·· .···. 10- (2,3,4-tri-0-bentsyyli-B-L-arabinosyyli) tyrniini X 25 (12) • · .!*" Tymiiniä (0,444 g, 3,52 mmol) ja ammoniumsulfaat- • *·* *,,, tia (2 mg) suspendoitiin heksametyylidisilatsaaniin (10 • · *···* ml) ja keitettiin palautusjäähdyttäen (140 °C) yön yli ar- gonsuojakaasussa kirkkaan liuoksen saamiseksi. Heksametyy- • · \V 30 lidisilatsaaniylimäärä poistettiin tyhjössä välttäen kos- ··· ketusta kosteuteen, jolloin saatiin siirappia 11.

j·.·. Yhdistettä 9 (1 g, 1,76 mmol) lisättiin 17 ml:aan • · \··\ dikloorimetaania, joka oli esikyllästetty vedettömällä • # V kloorivedyllä, 0 °C:ssa. 2 tunnin 0 °C:ssa kuluttua saos- ·«· 35 tunut p-nitrobentsoehappo (0,25 g) poistettiin suodatta- • · 118954 27 maila ja suodos haihdutettiin tyhjössä ohueksi siirapiksi, jota käsiteltiin sitten tehokkaalla tyhjöpumpulla huoneenlämpötilassa 2 tunnin ajan, jolloin saatiin 2,3,5-tri-O-bentsyyli-a-L-arabinosyylikloridia (10).

5 Näin valmistettua yhdistettä 10 liuotettiin 15 ml:aan vedetöntä dikloorimetaania, ja liuos lisättiin seokseen, jossa oli silyloitua tymiiniä (11) ja 3 g 4 Ä:n molekyyliseula-ainetta. Reaktioseosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa argonsuojakaasussa 18 tunnin ajan. Reak-10 tioseosta laimennettiin lisäämällä 50 ml dikloorimetaania ja se kaadettiin 2 ml:aan NaHCCbtn kyllästettyä vesiliuosta samalla kiivaasti sekoittaen. Muodostui valkoinen sakka (tinahydroksidia), joka suodatettiin eroon Celite- pedillä. Orgaaninen faasi erotettiin vedestä ja pestiin 15 vedellä (3 x 30 ml). Vesifaasia uutettiin dikloorime-taanilla, ja yhdistetty dikloorimetaanifaasi kuivattiin Na2S04:llä ja haihdutettiin sitten tyhjössä siirapiksi, jota kolonnikromatografisesti silikageelissä puhdistamalla (kloroformi/metanoli, 100:1) saatiin yhdistettä 20 12 siirappina (0,68 g, 73 %). [a]D = -56,71 (c=0,6, CH2CI2) .

; UV (MeOH) lambdamajcs. 218 ja 265.

!·"! 1H-NMR (300 MHz, CDCI3) : δ 1,67 (d, 3H, J=l,ll, • · CH3) ; 3,66 - 3,70 (m, 2H, H-5’); 4,06 (m, 1H, H-4 ·) ; 4,13 25 (t, IB, J=4,7, H-3’); 4,24 (t, IK, J=4,7, H-2' ) ; 4,41, • * I"·' 4,54, 4,56 (m, 6H, bentsyyli-CH2) ; 6,28 (d, 1H, J=5,24, • · H-l' ) ; 7,15 - 7,33 (m, 15H, aromaattisia vetyjä); 7,43 (d, 1H, J=l, 31, H-6) .

l-fi-L-arabinofuranosyylitymiini (13) • · :.V 30 Palladiumkloridia (680 mg, 3,835 mmol) suspendoi- tiin 100 ml:aan metanolia, ja suoritettiin pelkistys ra- ··]·' vistamalla vedyn kanssa huoneenlämpötilassa. Palladium- • · *..I mustan happamaan suspensioon lisättiin sitten liuos, jossa **" oli 450 mg yhdistettä 12 25 ml:ssa metanolia. Reaktioseos- • ·· 35 ta ravistettiin vedyn kanssa huoneenlämpötilassa 38 tunnin ♦ · 118954 28 ajan. Katalysaattorin poistamisen jälkeen liuos neutraloitiin lisäämällä Dowex-valmistetta (HCO3-) pHthon 7, minkä jälkeen se haihdutettiin tyhjössä valkoiseksi kiinteäksi aineeksi, joka etanolista uudelleenkiteyttämällä saatiin 5 yhdistettä 13 (105 mg, 47,7 %) . Sp. 244 - 249 °C; [cx]d = -91,48 (c=0,25, H20) .

IR (KBr) : 1750, 1600 cm-1 (CO); UV (MeOH) : lamb- dajnaks. 2 68.

1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 1,76 (s, 3H, CH3) ; 10 3,62 (t, 2H, J=4,56, H-5'); 3,69 (m, 1H, H-4'); 3,90 t, 1H, J=3,88, H-3'); 3,99 (t, 1H, J=4,10, H-2'); 5,08 (leveä s, 1H, C5-OH, vaihtokelpoinen); 5,42 (d, 1H, J=4,24, C'2-OH tai C3-OH, vaihtokelpoinen); 5,54 (d, 1H, J=5,23, C'2-OH tai C'3-OH, vaihtokelpoinen); 5,97 (d, 1H, J=4,64, H- 15 1'); 7,51 (d, 1H, J-0,97, H-6); 11,26 (s, 1H, NH, vaihtokelpoinen).

Koostumusanalyysi C10H14N2O6: lie: laskettu C 46,51; H 5,46; N 10,85; todettu C 46,67; H 5,63; N 10,56.

1-(2,3,5—tri-O-bentsyyli-B-L-arabinosyyli)syto-20 siini (15)

Sytosiinia (0,61 g, 6 mmol) ja ammoniumsulfaattia ; (2 mg) suspendoitiin heksametyylidisilatsaaniin (15 ml), • · f · .···. ja keitettiin palautus jäähdyttäen (140 °C) typpisuojakaa- · ^1« sussa 2 tunnin ajan kirkkaan liuoksen saamiseksi. Silyloi- • · "I 25 tu sytosiiniseos haihdutettiin tyhjössä kuiviin välttäen • 1 kosketusta kosteuteen, jolloin saatiin siirappia 14.

• 2 Yhdistettä 9 (2,82 g, 5 mmol) lisättiin 47 ml:aan ·1· *...1 kuivaa dikloorimetaania, joka oli esikyllästetty vedettö mällä kloorivedyllä, 0 °C:ssa. 2 tunnin 0 °C:ssa kuluttua • · ί#ί#ί 30 saostunut p-nitrobentsoehappo (0,807 g) poistettiin suo- dattamalla ja suodos haihdutettiin tyhjössä kuiviin, jol-loin saatiin siirappimaista 2,3,5-tri-O-bentsyyli-a-L- • · arabinosyylikloridia (10) .

• · ’·;2 Näin valmistettua yhdistettä 10 liuotettiin 28,5 ··« 35 ml: aan vedetöntä dikloorimetaania, ja liuos lisättiin · t1 · 2 · 29 1159-54 seokseen, jossa oli silyloitua sytosiinia (14) ja 8,3 g 4 Ä:n molekyyliseula-ainetta. Reaktioseosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa typpisuojakaasussa 5 päivän ajan. Sitten reaktioseosta laimennettiin lisäämällä 50 ml dikloori-5 metaania ja 20 ml vettä, ja se kaadettiin 2 ml:aan NaH-CC>3:n kyllästettyä vesiliuosta samalla kiivaasti sekoittaen. Muodostui valkoinen sakka (tinahydroksidia), joka suodatettiin eroon Celite-pedillä. Orgaaninen faasi erotettiin vedestä ja pestiin vedellä (3 x 30 ml) . Vesifaasia 10 uutettiin dikloorimetaanilla, ja yhdistetty dikloorime-taanifaasi kuivattiin Na2S04:llä ja haihdutettiin sitten tyhjössä siirapiksi, jota kolonnikromatografisesti silika-geelissä puhdistamalla (kloroformi/metanoli 96:4) saatiin yhdistettä 15 valkoisena kiinteänä aineena, joka 2-15 propanolista uudelleenkiteyttämällä saatiin 1,53 g (60 %) yhdistettä. Sp. 146 - 148 °C; [a]25D = -105,2 (Cl, CH2C12) .

UV (MeOH) : lambdamaks. 211,5, lambdamin. 272,5, pH 1, pH 7; lambdaraaks. 211,5, lambdamin. 284, pH 9.

1H-NMR (300 MHz, CDCI3) : δ 3,65 (d, 2H, J=4,85, 20 H-5') ; 4,00 (t, 1H, J=3,72, H-3'); 4,11 (m, 1H, H-4'); 4,28 (m, 1H, H-2' ) ; 4,38 - 4,55 (m, 6H, bentsyyli-CH2) ; : 5,56 (d, 1H, J=7,5, H-5); 6,39 (d, 1H, J=4,59, H-l'); .···. 7,12 - 7,31 (m, 15H, aromaattisia vetyjä); 7,63 (d, 1H, .*». J=7,5, H-6) .

• · V.’.' 25 Ι-β-L-arahinofuranosyylisytosiinin hydrokloridi- • · ,*'* suola (16) hydraamalla katalyyttisesti yhdistettä 15 • · • ]* Palladiumkloridia (315 mg, 1,78 mmol) suspendoi- t · *·*·* tiin 160 ml: aan metanolia, ja suoritettiin pelkistäminen ravistamalla vedyn kanssa huoneenlämpötilassa. Palladium- • · •,V 30 mustan tappamaan suspensioon lisättiin sitten liuos, jossa oli 300 mg yhdistettä 15 54 ml:ssa metanolia. Reaktioseos- ;·)·, ta ravistettiin vedyn kanssa huoneenlämpötilassa 3 tunnin • · *,.* ajan. Kun katalysaattori oli poistettu, liuos neutraloi- • · *" tiin lisäämällä Dowex-valmistetta (HCO3-) ja se haihdutet- ··· ϊ,,,ί 35 tiin tyhjössä kuiviin, minkä jälkeen jäännöstä puhdistet- • Φ · · · * » 118954 30 tiin preparatiivisella TLCillä (MeOH/CHCl3 3:5), jolloin saatiin siirappia, joka liuotettiin 3 ml:aan me-tanolia, lisättiin HCl:n l-%:ista liuosta MeOH:ssa pH:hon 1, haihdutettiin kuiviin ja trituroitiin jäännöstä 2-5 propanolissa, jolloin saatiin 36 mg (22,1 %) yhdistettä 16. Sp. 190 - 194 °C; [a]25D = -115,47 (c=0,07, H20) .

UV (H2O) lambdamaks. 275, pH 7; lambda^s. 209,5, 273, pH 11; lambdamaks. 280, pH 1.

^-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 3,61 (d, 2H, H-5'); 10 3, 82 (m, 1H, H-4 *) ; 3,93 (m, 1H, H-2' tai H-3'); 4,04 (leveä s, 1H, H-2' tai H-3'); 5,18 (leveä s, 1H, C5'-OH, vaihtokelpoinen); 5,61 (leveä s, 1H, C2'-OH tai C3'-OH, vaihtokelpoinen); 5,67 (leveä s, 1H, C2'-OH tai C3'-OH, vaihtokelpoinen); 6,00 (d, 1H, J=4,02, H-l'); 6,01 (d, 1H, 15 J5,6=7,8, H-5); 7,92 (d, 1H, J5,6=7,8, H-6); 8,49 (leveä s, 1H, NH, vaihtokelpoinen); 9,38 (leveä s, 1H, NH, vaihtokelpoinen).

1-B-L-arabinofuranosyylisytosiinin hydrokloridi- suola (16) käsittelemällä yhdistettä 15 booritrikloridilla 20 5 ml booritrikloridin 1 M liuosta dikloorime- taanissa jäähdytettiin -72 °C:seen (kuivajää/asetoni).

: Booritrikloridiliuokseen lisättiin hitaasti liuos, jossa ··* · .···. oli yhdistettä 15 (180 mg, 0,351 mmol) 3 ml:ssa dikloori- • · metaania. 2,75 tunnin kokonaisreaktioajan jälkeen jäähdy- * · 25 tyshaude poistettiin ja liuotin ja kaasu poistettiin tyh- ,"** jössä. Jäännös liuotettiin kylmään dikloorimetaaniin (10 • · 1 ** ml) ja liuos haihdutettiin kuiviin (3 kertaan kunnes saa- ··· ^ • · *...* tiin valkoinen kiinteä jäännös), ja jäänökseen lisättiin kylmää kyllästettyä natriumvetykarbonaattiliuosta pH: n • · 30 säätämiseksi arvoon 6-7. Seosta laimennettiin lisäämällä etanolia, se kuumennettiin kiehuvaksi, lisättiin hiiltä ja suodatettiin. Suodos haihdutettiin kuiviin, jolloin saa- • · *..I tiin siirappia, joka liuotettiin 3 ml:aan metanolia, li- · *·" sattiin HCl:n l-%:ista liuosta metanolissa pH:hon 1, haih- • · • · *·· • · 118954 31 dutettiin kuiviin ja trituroitiin 2-propanolissa, jolloin saatiin yhdistettä 16 (66 mg, 78,4 %) .

9-(2,3,5-tri-O-bentsyyli-β-L-arabinosyyli)adeniini (18) 5 Perusteellisesti kuivattua yhdistettä 9 (5 g, 8,8 mmol) lisättiin 82 ml:aan dikloorimetaania, joka oli esi-kyllätetty vedettömällä kloorivedyllä, 0 °C:ssa. 2 tunnin reaktioajan jälkeen 0 °C:ssa saostunut p-nitrobentsoehappo (1,53 g) poistettiin suodattamalla, ja suodos haihdutet-10 tiin tyhjössä siirapiksi, jota pidettiin sitten täydellisessä tyhjössä huoneenlämpötilassa 2 tunnin ajan. Näin valmistettu 2,3,5-tri-O-bentsyyli-oi-L-arabinosyylikloridi (10) liuotettiin 50 ml:aan dikloorimetaania, ja liuos lisättiin seokseen, jossa oli 4,5 g (18,8 mmol) kuivattua N-15 bentsoyyliadeniinia5 (17) ja 14,5 g 4 Ä:n molekyyliseula-ainetta. Reaktioseosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 1 viikon ajan, se suodatettiin Celite-pedin läpi, ja haihdutettiin tyhjössä siirapiksi, jolla suoritettiin kromato-grafia-ajo silikageelissä käyttäen eluoinnissa heksaa-20 niseos/asetonia (3:1, Rf = 0,22). Tuote erotettiin ja haihdutettiin tyhjössä siirapiksi, joka liuotettiin ammo- j ·'· niakin metanoliliuokseen (20 ml), jossa sitä sekoitettiin ··· · .·*·. ruostumattomasta teräksestä valmistetussa pommissa, ja * · .···. kuumennettiin yön yli 50 - 55 °C:ssa. Sitten liuos haihdu- * · 25 tettiin alipaineessa puolikiinteäksi aineeksi, joka uudel-leenkiteytettiin lämpimästä isopropyylialkoholista, joi- • · *i#]* loin saatiin yhdistettä 18 2,4 g (50,7 %) . Sp. 128 - 129 °C; [a]27D = -20,4 (c=l,04, CH2C12) .

UV (CH2C12) : lambdamaks. 213, 258,5.

0.: 30 1H-NMR (250 MHz, CDC13) : δ 1,95 (leveä s, 1H, NH, vaihtokelpoinen); 3,69 (d, 2H, J=4,82, H-5'); 4,18 - 4,30 ··]·. (m, 6H, bentsyyli-CH2) ; 4,51 - 4,64 (m, 3H, H-2' , 3', 4'); • · 5,73 (leveä s, 1H, NH, vaihtokelpoinen); 6,52 (d, 1H, J=4,00, H-l*); 6,89 - 6,93, 7,17 - 7,37 (m, 15H, aromaat- ··· • · • · ··· ····· • « 118954 32 tisia vetyjä bentsyyliryhmästä); 8,17 (s, 1H, H-2 tai H-8) ; 8,32 (s, 1H, H-2 tai H-8).

9-B-L-arabinofuranosyyliadeniini (19) 5 ml liuosta, jossa oli booritrikloridin 1 M liu-5 osta dikloorimetaanissa, jäähdytettiin -72 °C:seen (kuiva-jää/asetoni). Liuos, jossa oli yhdistettä 18 (150 mg, 0,279 mmol) 5 ml:ssa dikloorimetaania, lisättiin hitaasti booritrikloridiliuokseen. Kaikkiaan 3,5 tunnin reaktioajan jälkeen jäähdytyshaude poistettiin ja liuotin ja kaasu 10 poistettiin tyhjössä. Jäännös liuotettiin kylmään dikloo-rimetaaniin (10 ml) ja liuos haihdutettiin kuiviin (6 kertaan kunnes saatiin keltainen kiinteä jäännös). Kylmää kyllästettyä natriumvetykarbonaattiliuosta lisättiin pH:n säätämiseksi arvoon 7-8. Seosta laimennettiin etanolil-15 la, se kuumennettiin kiehuvaksi, suspensio suodatettiin

Celite-valmisteen läpi ja suodos haihdutettiin tyhjössä siirapiksi, joka kiteytettiin vedestä, jolloin saatiin 55 mg (74 %) yhdistettä 19. Sp. 256 - 258 °C.

UV (H2O) : lambdamaks. 259.

20 1H-NMR (300 MHz, DMS0-d6) : δ 3, 62 - 3, 66 (m, 2H, H-5'); 3,77 (leveä s, 1H, H-4'); 4,13 (leveä s, 2H, H-2', ; 3'); 5,12 (t, 1H, J=5,4, C'5-OH, vaihtokelpoinen); 5,54 .···. (d, 1H, J=3,78, C'2-OH tai C3-OH, vaihtokelpoinen); 5,63 • * .«·, (d, 1H, J=4,32, C'2-OH tai C3-OH, vaihtokelpoinen); 6,25 25 (d, 1H, J=4,02, H-l'); 7,25 (leveä s, 2H, NH2, vaihtokel- ."** poinen) ; 8,13 (s, 1H-H-2 tai H-8); 8,18 (s, 1H, H-2 tai i *** H8) .

··· • · *···* Kuviossa 10 esitetään vaihtoehtoinen tie 1-0- asetyyli-2,3,5-tri-0-bentsoyyli-ft-L-ribofuranoosin (yhdis- • · V,i 30 te 10) valmistamiseksi 1,2-di-O-isopropylideeni-a-L-ksylo-furanoosista (yhdiste 3) .

··]·, l,2-di-0-isopropylideeni-a-L-ksylofuranoosi (3) • · *..I 650 ml:aan vedetöntä asetonia lisättiin 4 ml kons.

"* rikkihappoa, 5 g molekyyliseula-ainetta (4 k), 80 g vede- ··* 35 töntä kupari (2) sulfaattia ja 40 g L-ksyloosia. Seosta se- ····· • · 118954 33 koitettiin huoneenlämpötilassa 36 tunnin ajan, minkä jälkeen reaktioseos suodatettiin ja pestiin perusteellisesti asetonilla, yhdistetty suodos neutraloitiin lisäämällä am-moniumhydroksidia ja haihdutettiin sitten kuiviin. Etyyli-5 asetaattia (200 ml) lisättiin, minkä jälkeen suodatettiin ja haihdutettiin suodos kuiviin, jolloin saatiin öljy, joka liuotettiin 250 ml:aan 0,2-%:ista HCl:ää ja liuosta sekoitettiin 2,5 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. pH säädettiin 8:ksi lisäämällä kyllästettyä NaHCC>3-liuosta, minkä 10 jälkeen liuos haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä uutettiin etyyliasetaatilla, minkä jälkeen liuotin poistamalla saatiin keltaisena öljynä yhdistettä 3 (41,7 g, 82,3 %).

1H-NMR (CDC13) : δ 5,979 (d, J=3,78Hz, 1H, H-l) ; 4,519 (d, J=3, 6Hz, 1H, H-2) ; 4,308 (leveä d, 1H, H-3) ; 15 4,080 (m, 3H, H-4 ja H-5) ; 1,321 (s, 3H, CH3) ; 1,253 (s, 3H, CH3) .

5-O-bentsoyyli-l,2-di-O-isopropylideeni-a-L-ksylo-furanoosi (25)

Yhdistettä 3 (41 g, 215,6 mmol) sekoitettiin pyri- 20 diinissä (150 ml) ja CH2Cl2:ssa (150 ml) 0 °C:ssa. Seokseen lisättiin tipoittain liuos, jossa oli BzCl:ää (27,5 ml, ; ·1; 237 mmol) 30 ml:ssa pyridiiniä. 30 minuutin kuluttua li- *·· · .·**. sättiin vettä (5 ml) ja seos haihdutettiin kuiviin, jään- ··· ,···, nös liuotettiin EtOAc:hen, liuos pestiin kyllästetyllä Φ · 25 NaHCC>3-liuoksella ja kuivattiin sitten (Na2S04) . Haihdutta- • · .Γ1 maila liuotin pois saatiin oranssin värinen siirappi, jos- ta Et20:sta kiteyttämällä saatiin yhdistettä 20 (36 g).

• · *·1·1 Emäneste haihdutettiin kuiviin, ja jäännöstä puhdistettiin kolonnikromatografisesti silikageelissä (1 % CH3OH/CHCI3), *.V 30 jolloin saatiin toinen erä yhdistettä 25 (12 g, kokonais- ·ββ#ϊ saanto 76 %) . Sp. 82 - 83 °C; kirj.1 D-muoto: 83,5 - SV. 84,5 °C.

^-NMR (CDCI3) : δ 7,43, 8, 07 (m, 5H, Ar-H) ; 5,97 *”·1 (d, 1H, J=3,6Hz, H-l); 4,80 (q, 1H, H-4); 4,60 (d, 1H, ··· • · • ♦ ··· ♦ 118954 34 J=3,6Hz, H-2); 4,40, 4,20 (m, 3H, H-5, H-5', H-3) ; 3,50 (leveä s, 1H, D20-vaihto, 30H); 1,51, 1,32 (2s, 6H, 2CH3) .

5-O-bentsoyyli-l,2-di-0-isopropylideeni-a-L-eryt~ ropentofuranos-3-uloosi (26) 5 Yhdistettä 25 (40 g, 136 mmol) sekoitettiin 450 ml:ssa CH2Cl2:ta. Tähän lisättiin pyridiniumdikromaattia (PDC, 30,7 g, 81,6 mmol) ja Ac20:ta (42,3 ml, 448,8 mmol). Seosta keitettiin palautusjäähdyttäen 2,5 tunnin ajan, minkä jälkeen liuos haihdutettiin 1/5:aan alkuperäisestä 10 tilavuudestaan, minkä jälkeen etyyliasetaattia (50 ml) lisättiin ja liuos suodatettiin. Suodos kaadettiin silika-geelityynylle (10 cm x 5 cm), eluoitiin EtOAc:llä, haihdutettiin yhdistetty eluaatti kuiviin ja haihdutettiin jäännös kuiviin yhdessä tolueenin kanssa (50 ml x 2) . Kiteyt-15 tämällä heksaanista ja EtOAcistä saatiin yhdistettä 21 valkoisena kiinteänä aineena (38 g, 96 %). Sp. 91-93 °C; [a]D = -132° (c=l,0, CHCI3) ; kirj.2 D-muoto: sp. 93 - 94,5 °C; [a]D: +135° (c=l,0, CHC13) .

IR (KBr) : 1773 cm'1 (ArCO) , 1730 cm'1 (CO).

20 1H-NMR (CDCI3) : δ 7,97, 7,42 (m, 5H, Ar-H) ; 6,14 (d, 1H, J=4,4Hz, H-l); 4,74, 4,68 (m, 2H, H-4, H-2); 4,50, i ·1: 4,44 (m, 2H, H-5, H-5'); 1,52, 1,44 (2s, 6H, 2CH3) .

··· a .·1·, Koostumusanalyysi (C15H16O6) : laskettu C 61,64; ,···, H 5,52; todettu C 61,42; H 5,53.

• · 25 5-0-bentsoyyli-l,2-di-0-isopropylideeni-a-L-eryt- • · .Γ1 ropentofuranos-3-uloosi (26) • a

Yhdistettä 25 (40 g, 136 mmol) sekoitettiin 450 • a *··** ml:ssa CH2Cl2:ta. Tähän lisättiin pyridiniumdikromaattia (PDC, 30,7 g, 81,6 mmol) ja Ac20:ta (42,3 ml, 448,8 mmol).

a a *.V 30 Seosta keitettiin palautusjäähdyttäen 2,5 tunnin ajan, • •a minkä jälkeen liuos konsentroitiin 1/5:aan alkuperäisestä ;V. tilavuudestaan, minkä jälkeen lisättiin EtOAc:tä (50 ml).

• ♦

Liuos suodatettiin, suodos kaadettiin silikageelityynylle • · "1 (10 cm x 5 cm), eluoitiin EtOAcrllä, haihdutettiin yhdis- ··· 35 tetty eluaatti kuiviin, ja haihdutettiin jäännös kuiviin a 118954 35 yhdessä tolueenin kanssa (50 ml x 2) . Heksaanista ja EtO-Ac:stä kiteyttämällä saatiin yhdistettä 26 valkoisena kiinteänä aineena (38 g, 96 %). Sp. 91 - 93 °C; [a]D: -132° (c=l,0, CHC13) ; kirj.2 D-muoto: sp. 93 - 94,5 °C; [oOd = 5 +135° (c=l, 0, CHCI3) .

IR (KBr) : 1773 cm'1 (ArCO) , 1730 cm’1 (CO) .

1H-NMR (CDCI3) : δ 7,97, 7,42 (m, 5H, Ar-H) ; 6,14 (d, 1H, J=4,4Hz, H-l); 4,74, 4,68 (m, 2H, H-4, H-2); 4,50, 4,44 (m, 2H, H-5, H-5'); 1.52, 1, 44 (2s, 6H, 2CH3) .

10 Koostumusanalyysi (CisHieOe) : laskettu C 61,64; H 5,52; todettu: C 61,42; H 5,53.

1,2-di-0-isopropylideeni-o-L-ribofuranoosi (27) Yhdistettä 26 (37 g, 127 mmol) liuotettiin EtOH/ H20:hon (400 ml/100 ml) 0 °C:ssa samalla, kun lisättiin 15 pieninä erinä NaBH4:ää (23,3 g, 612 mmol). Suspensiota sekoitettiin huoneenlämpötilassa 4 tunnin ajan. Se suodatettiin ja suodos haihdutettiin kuiviin sekä haihdutettiin kuiviin metanolin kanssa. Suorittamalla jäännöksen kroma-tografia-ajo silikageelikolonnissa (0 - 15 % CH3OH/CH2Cl2) 20 sekä EtOAc/heksaanista kiteyttämällä saatiin yhdistettä 27 valkoisina neulasina (19 g, 79 %). Sp. 86 - 87 °C; [a]D = -31,5° (c=0,62, CHCI3) ; kirj.3 D-muoto: sp. 86 - 87 °C; [a] d (c=0, 59, CHCI3) .··*. IR (KBr) : 3356 cm"1 (OH) .

25 1H-NMR (CDCI3) : δ 5,83 (d, 1H, J=3,98Hz, H-l); * · ·’]* 4,595 (t, 1H, H-2); 4,055, 3,72 (m, 4H, H-3, H-4, H-5, H- **..!* 5'); 2,38 (d, 1H, D20-vaihto, 3-OH) ; 1,83 (t, 1H, D20- • · '···* vaihto, 5-OH) ; 1, 58, 1,38 (2s, 6H, 2CH3) .

Koostumusanalyysi (0δΗι4Ο5) : laskettu C 50,50; V.J 30 H 7,42; todettu C 50, 62; H 7,46.

··· ·...* 3,5-di-O-bentsoyyli-l, 2-di-O-isopropylideeni-a-L- ribofuranoosi (28) ,···. Yhdistettä 27 (19 g, 100 mmol) sekoitettiin 300 • ml:ssa pyridiiniä 0 °C:ssa samalla, kun BzCl:ää (40 ml, *,„· 35 348 mmol) lisättiin tipoittain, minkä jälkeen sekoitettiin • · 118954 36 huoneenlämpötilassa 3 tunnin ajan, ja haihdutettiin liuotin eroon. Jäännöstä uutettiin EtOAc:llä, pestiin kyllästetyllä NaHC03~liuoksella, kuivattiin (Na2S04) , haihdutettiin liuotin kuiviin ja kiteytettiin kummasta tahansa, 5 jolloin saatiin ydhistettä 23 valkoisena kiinteänä aineena (39 g, 98 %). Sp. 83 - 85 °C.

XH-NMR (CDC13) : δ 8,07, 7, 36 (m, 10H, Ar-H) / 5,94 (d, 1H, J=3,6Hz, H-l); 5,05, 5,00 (m, 1H, H-2); 4,73, 4,63 (m, 3H, H-4, H-5, H-5'); 1,58, 1,35 (2s, 6H, 2CH3) .

10 Koostumusanalyysi (C22H22O7) : laskettu C 66,50; H 5,64; todettu C 66,32; H 5,57.

l-O-asetyyli-2,3,5-tri-0-bentsoyyli-B-L-ribofura-noosi (31)

Yhdistettä 28 (38 g, 95 mmol) sekoitettiin 300 15 ml:ssa 1 % HCl/CH30H:ta huoneenlämpötilassa 30 tunnin ajan. Lisättiin pyridiiniä (20 ml), minkä jälkeen liuos haihdutettiin kuiviin. Jäännös haihdutettiin kuiviin yhdessä pyridiinin kanssa (30 ml x 2), minkä jälkeen jäännös liuotettiin 100 ml:aan vedetöntä pyridiiniä 0 °C:ssa 20 samalla, kun BzCl:ää (17 ml, 146 mmol) lisättiin tipoit-tain, minkä jälkeen sekoitettiin huoneenlämpötilassa 3 • ·’; tunnin ajan. Liuotin haihdutettiin eroon ja jäännös liuo- 9·* · .***. tettiin EtOAcrhen, pestiin 0,5 N HClrllä ja sitten kylläs- ··· .*··, tetyllä NaHCC^-liuoksella ja kuivattiin sitten (Na2S04) .

* · ,··· 25 Haihduttamlla liuotin eroon saatiin yhdistettä 30 siirap- k * ··· · *» pina.

• · • ··

Epäpuhdasta yhdistettä 30 sekoitettiin jääetikassa 9 · ***** (400 ml) ja sitten ÄC20:ssa (100 ml) 0 °C:ssa samalla, kun lisättiin tipoittain kons. H2S04:ää (10 ml). Tätä liuosta • · *,*.· 30 sekoitettiin huoneenlämpötilassa yön yli. Seos kaadettiin ··· !.„* jääveteen, uutettiin CHCl3.*lla, neutraloitiin kyllästetyt- :*.·. la NäHC03~liuoksella ja kuivattiin sitten (Na2S04) . Liuot- • · * · ,···, timen eroon haihdutuksen jälkeen saatiin vaaleankeltainen • "* siirappi, joka metanolista kiteyttämällä saatiin yhdistet- 35 ta 31 valkoisena kiinteänä aineena (23,89 g, 49,6 % yhdis- • · 118954 37 teistä 28 - 31). Sp. 124,7 °C; [a]D = 45,613 (c=l,0, CHCI3) ; kirj.4 sp. = 129 - 130 °C; [aJD=-43,6 (c=l,0, CHCI3) .

^-NMR (CDCI3) : δ 7,317, 8,134 (m, 15H, OBz) ; 6,437 5 (s, 1H, H-l); 5,835 (m, 2H, h-2 ja H-3); 4,649 (m, 3H, H-4 ja H-5) ; 2,003 (s, 3H, CH3COO") .

II. Biologinen aktiivisuus Tässä julkistettujen yhdisteiden aktiivisuutta HBV:tä ja EBV:tä vastaan voidaan arvioida kuten alla yksilö tyiskohtaisesti selostetaan, tai muilla, alan ammattilaisille tutuilla menetelmillä.

Esimerkki 1

Biologinen aktiivisuus HBV:tä vastaan Tässä määrityksessä käytettiin ihmisen HBV-15 tartutettuja maksasoluja (2.2.15-soluja). Näitä soluja kasvatetiin yhteenkasvuun oleellisessa minimivaaatimuskas-vualustassa, jossa oli 10 % nautasikiöseerumia. Kasvualusta vaihdettiin 3 päivän välein. Kun yhteenkasvu oli saavutettu, käynnistettiin käsittely lääkkeillä, minkä jäl-20 keen sitä jatkettiin 3 päivän ajan. Toinen lisäys lääkettä samana pitoisuutena annettiin tämän jälkeen kasvualustan • ·’· poistamisen jälkeen viljelmistä ja viljelmiä ylläpidettiin M» · .·**. vielä 3 päivän ajan. Kasvualusta 6 päivän käsittelyn jäi- ··· keen otettiin talteen, ja viruspartikkelit saostettiin po-25 lyetyleeniglykolimenetelmällä. Hiukkaset hajotettiin sit- 1 « ten, minkä jälkeen ne prosesoitiin Southern-analyysiä var-ten. Blot-siirrot hybridisoitiin HBV-spesifiseen koetti- • · *···* meen ja viraalisen DNA: n määrät määritettiin verrattuna DNA-tasoihin viljelmistä, joita ei ollut käsitelty lääk- • » V.· 30 keillä. Genomi-DNA pilkottiin HindIII:lla ja sillä suori- ··· ϊ.„· tettiin Southern-analyysi. Episomaalisen DNA:n tasot mää- ·*/. ritettiin suhteessa integroituun HBV-DNA:han. Laskettiin • · lääkepitoisuudet, jotka aiheuttavat DNA:n 50 %:n inhibiti- • · "* on (ID50) verrattuna verrokkeihin. Tuloksista esitetään ··· 35 yhteenveto taulukossa I.

• · 38 ί1®954 •Ρ I H s 8

o * m rH

8W o o o o o o o o o I—I LT) 0\1 CTl g U o

Q ° O

Ho o

^ iH O O rH

A \—I A

s •w*

CM S

§ 8 (Tl O I o o o o o

(H 00 i—I i—I

n „ g :(tf «1

H -H

.* H > : S -j 4 3

·...· -rt .K

··· M Ifl : : o i

· · φ p Q

... h m 3 : : Ai * w

Ml £ | ^

:*. G -H o O

··· I -P in i—IOO·.

... Ω G Q - ' - lo • rt H O Csl LO Λ

*...* H

•P

G

H

· 0 ... Λ

. . H -H

... rl . * _ 1¾

·...· o G

: Ai h φ

... M -P D P O O

: · : g g w < < < < * · h ·· -h s s ω ω ... 3 J> *3 ti h ti h : : m λ fi i i i i

*;· E-ι SG >ϊ P Q Q |P

··· • · « ·

IM

• · 39 116954

Esimerkki 2

Biologinen aktiivisuus EBV:tä vastaan

Hl-soluja pidettiin pitkän faasin kasvussa 2 päivän ajan ennen käsittelyn aloittamista. Soluja sentrifu-5 goitiin 600 x g:ssä 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa niiden erottamiseksi kasvualustasta, joka sisälsi ennalta esiintyviä viruspartikkeleita. Hl-solut siirrostettiin 24-kuoppalevyille tiheydeksi 1 x 105 solua/kuoppa 2 mlrssa tuoretta kasvualustaa lääkkeellä tai ilman ja inkuboitiin 10 37 °C:ssa 5 päivän ajan. Virionin sisältävä kasvualusta säästettiin ja sitä käytettiin lääkkeiden inhibitovaiku-tuuksen arvioimiseksi virustuotantoon ja viruksen tartu-tuskykyyn biomääritystä käyttämällä. Virionit pelletoitiin soluvapaasta kasvualustasta sentrifugoimalla kierrosnopeu-15 della 45 000 rpm 90 minuutin ajan käyttäen SW-50 Ti - roottoria (Beckman). Virionit uudelleensuspendoitiin 1 ml:aan kasvualustaa, minkä jälkeen niitä käytettiin 1 x 106 Raji-solun tartuttamiseksi 48 tunnin aikana. Koska EBV-DP-aktiivisuuden taso Raji-soluissa superinfektoinnin 20 jälkeen on verrannollinen lisättyjen virionien määrään, kyettiin mittaamaan indusoitu EBV-spesifinen DP- • ·*· aktiivisuus. Inhiboiva lääkevaikutus laskettiin vertaamal- • t» · .·*·. la EBV-DP-aktiivisuutta monilaimennosverrokkeihin. Mitään « · .···. mitokondria-DNA-sisällön inhibitiota Hl-soluissa ei ha- • · 25 vaittu käsiteltäessä soluja pitoisuudella 1 mM L-FMAU 6 • , · päivän ajan.

• · * *♦

Slot blot -määritys • · *···* Mitokondriaalisen DNA:n määrä mitattiin slot blot -menetelmällä (2). 2 x 105 käsitellyssä ja ei-käsitellyssä • · ·,·.· 30 Hl-solussa aiheutettiin lyysi 200 pl:ssa 10 mM Tris-HCl- • •s ϊ.,,ϊ liuosta (pH 7,5) j äädytys/sulatus-menetelmällä. Solu- ;·]·. lysaattia käsiteltiin 10 pg:lla/ml RN-aasi-A:ta 37 °C:ssa • · 30 minuutin ajan, ja sitten proteinaasi-K: 11a (100 pg/ml) s · "* 55 °C:ssa 2 tunnin ajan. Samat määrät 2 X SSC-puskuria li- 35 sättiin kuhunkin solulysaattiin. 10 minuutin keittämisen *!**J jälkeen näytteet sijoitettiin täplinä nylonmembraaneille 118954 40 (HyBond-N, Amersham Corp.). Radioleimattua ihmisen mito-kondrian DNA-fragmenttia käytettiin DNA-hybridisaatiossa koettimena. Samat membraanit uudelleenseulottiin ihmisen Alu-DNA:11a mitokondriaalisen DNA-koettimen poistamisen 5 jälkeen. Mitokondriaalisen DNA:n määrä käsitellyissä ja ei-käsitellyissä Hl-soluissa kvantitoitiin densitometrillä (LKB Ultroscan XL).

Tulokset esitetään taulukossa 2.

* · • · · • · ·

Ml I

• · · • · • · • · · • · Φ • 1 • · • · · ··· • · • · * 1 1 *· • · • · 1 • · · • · • · ·· · • · • 1 f • · · • · * · · • · • · • · • · · • · • 1 • 1 ··· · • · • · · · f • 1 Φ · * · · « • 1 118954 41

O

d

M

O

ΙΛ o u

-H

3 c I q I · p A U <5 H ·& h a ο -μ ei h (3 νΟΙΛΟΙΛΟΟΙΛΟΟΙΛΜΟ g rtHMiNOinHO^ tNH'C fflsOTOtflffl a ™ 2 λ μ μ ® J! W ™ Λ -rl vl .* X >1 Ί μ φ g „ -μ £ ao μ S <o -ri

S. S “ >-> ‘5? H

a E ^ n) 3 rt h Ό h «) “ e jC r· O g w Q * -S ? 5 ^ ° e c ΰ & I - H £ e 5 S » N 5 3 \2 Ä m CS Ή χ> « w ·£> „ s ^ ^ μ H OM» 0^3·ηΦ ~ ββκΟΜ» -

% innono h o o o * W0«^M

·-· Ή rt Tl ij »t O äj H -H -H -H -H Ή-H Ή -H » rt U ^ $ 8 H v m 3 q. . μ g q Lr»M>oou»->ort ino·* 4-* 0) K c- in<N ove fS ° 3 > o

Jf L· m . n

• * . | M

•:': 0 § § S 5 " '**.* O U)M»OOOOM1M»0 μ H ® }jj .

·· —» Pivef'Uiertr'OrortC'iy ·η q it ® j % -H-M-H-H-H-H-H-H-H-H-H-H £ ? rt C £ ϊί “ 0U»O00O000lf>00 ^ K 3 2 *°

··· e ΟΓ-ΟΟΟΙΛΟΟΟΜ^ΙΝ "Ί > jj C

.··*. β IN o m o moyrtfN (OM+J® ·· D H H rt CN G H <0 d) > ··· 0) H X .£ -rl **. Ό id ίο rt • · · -h E λ ro a

• G) Id tl H

·.· μ μ n in ; : 01 10 -rl μ

3 9 § 9 ^ y 3 g rt ί ί 3 S

o» 59535535 λ η «a o -h lw Äft&sfcEfcli.fcliifcdi Ι^ιΟΞΟίμ ♦ · :« [uncuUiii11*** ΐ · · >-ϊ O* Q* • · « · · • · * · • · · « · ♦ · · • · * * • · · • · • · * · · ··· • Φ • · • · · »···· • · 118954 42

Esimerkki 3 L-(-)-FMAU:n poistuminen plasmasta ja maksasta L-(-)-FMAU:n poistuminen hiirten plasmasta ja maksasta arvioitiin oraalisen annon jälkeen. Hiiriin ruisku-5 tettiin tritiumleimattua L-(-)-FMAU:ta (radiospesifisyys 9, 3 μπιοΙ/μΟΐ) .

Kuvio 11 on graafinen esitys L-(-)-FMAU:n plasma-pitoisuudetsa hiirissä oraalisen annon jälkeen ajan funktiona, ja kuvio 12 on graafinen esitys L-(-)~FMAU:n pitoi-10 suudesta hiiren maksassa oraalisen annon jälkeen ajan funktiona [risti, 10 mg/kg annettuna bid (kahdesti päivässä) 30 päivän ajan ennen farmakokineettistä tutkimusta, minkä jälkeen tutkimus suoritettiin päivänä 31 sama pitoisuus annettaessa; tumma ympyrä, 50 mg/kg annettuna bid 30 15 päivän ajan ennen tutkimusta, minkä jälkeen tutkimus suoritettiin päivänä 31 annettaessa sama pitoisuus; avoin ympyrä, 50 mg/kg annettuna ensimmäisen kerran tutkimuksen 1. päivänä].

Ilmoitettuina ajankohtina (katso kuviot 10 ja 11) 20 hiiristä otettiin verta niiden silmäkuopan takaisesta ontelosta käyttäen hepariinilla käsiteltyjä kapillaareja.

: .·. Plasmaa uutettiin trikloorietikkahapolla, minkä jälkeen se ,···, neutraloitiin f reon/trioktyyliamiinilla. Supernatantit • · laskettiin suoraan ja pitoisuus laskettiin.

• · 25 Kuten esitetään kuvioissa 10 ja 11, L-(-)-FMAU:n • t huippupitoisuus plasmassa ja maksassa esiintyi ajankohta- • · • *’ na noin 1 tunti. Yhdiste oli oleellisesti poistunut sekä • · '...* plasmasta että maksasta 4 tunnin kuluttua.

Esimerkki 4 • · 1,1.1 30 L- (-) -FMAU:n myrkyllisyys naaraspuolisissa BDF1- ··· : : hiirissä ·»·

Kuviossa 13a esitetään muutos ruumiin painossa 30 • · *..! päivän ajalta naaraspuolisissa verrokki-BDF-l-hiirissä.

**"* Kuvioissa 13b ja 13c esitetään muutos ruumiin painossa ·...* 35 30 päivän aikana naaraspuolisissa BDFl-hiirissä, joille *:**: annettiin 10 mg/kg (13b) ja 50 mg/kg (13c) bid L-(-)- 118954 43 FMAU: ta. Esitetty ruumiin paino edustaa keskiarvoa ja standardipoikkeamaa 5-7 hiiren arvoista. Kuten esitetään kuvioissa 13b ja 13c, L-(-)-FMAU ei vaikuttanut merkittävästi vaikuttavan hiirten painoon 30 päivässä, mikä osoit-5 taa yhdisteen hyvän siedon.

Esimerkki 5

Hiiren plasman kliininen kemia L-(-)-BMAU-käsit-telyn jälkeen

Kuvioissa 14 - 20 esitetään hiiriplasman kliini-10 nen kemia L-(-)-FMAU:n annon jälkeen annoksena 10 mg/kg (3 hiirtä) tai 50 mg/kg (3 hiirtä) bid 30 päivän ajan.

Kuivo 14 on pylväsdiagrammi kokonaisbilirubiinipi-toisuudesta hiiren plasmassa yksiköissä mg/dl. Kuviossa 15 esitetääään pylväsdiagrammi alkalisen fosfataasin pitoi-15 suudesta hiiren plasmassa yksiköissä U/litra. Kokonaisbi-lirubiini ja alkalinen fosfataasi ovat maksafunktion indikaattoreita. Hiiriarvot bilirubiinille ovat normaalilla ihmisalueella (alle 1,2 mg/dl), mutta alkalisen fosfataasin arvot ovat jonkin verran korkeampia kuin normaali ih-20 mistaso (30 - 114 U/litra).

Kuvio 16 on pylväsdiagrammi kreatiniinin pitoisuu- | ·*· desta hiiriplasmassa yksiköissä mg/dl. Kreatiniini on mu- ··· · .**·, nuaisten toiminnan indeksi. Lukuun ottamatta hiirtä 50-2 • · ·*« ,···, käsiteltyjen hiirten kreatiniinitasot eivät poikkea ver- • · I" 25 rokkihiirten vastaavista.

• · • · .!** Kuvio 17 on pylväsdiagrammi AST:n (SGOT, seerumin • · glutamiinioksaalitransaminaasi) pitoisuudesta hiiriplas- · *···* massa yksiköissä U/litra. Kuviossa 18 esitetään pylväsdia grammina ALT: n (SGPT, seerumin glutamiini-pyruvaatti- • · *.V 30 transaminaasi-) pitoisuus hiiriplasmassa yksiköissä ϊ.,.ϊ U/litra. SGOT ja SGPT ovat maksafunktion indikaattoreita.

Lukuun ottamatta hiirtä 50-2 (sekä SGOT että SGPT) ja · S··' hiirtä 10-2 (vain SGOT) entsyymitasot käsitellyissä hii- • · *1' rissa eivät poikkea verrokkihiirten vastaavista.

• ·· 35 Kuvio 19 on pylväsdiagrammi maitohapon pitoisuu- *!**J desta hiiriplasmassa yksiköissä mmol/litra. Kuvio 20 on 118954 44 pylväsdiagrammi maitohappodehydrogenaasin pitoisuudesta hiiriplasmassa yksiköissä U/litra. Maitohappoa muodstuu lihaksissa glykolyysin aikana. Maitohappodehydrogenaasia (LDH) esiintyy eri isoentsyymeinä eri kudoksissa. LDH:n 5 vapautuminen plasmaan voi olla osoitus kudosvauriosta. Kä siteltyjen hiirten maitohappo- ja maitohappodehydro-genaasitasot eivät merkittävästi poikkea verrokkihiirten vastaavista arvoista.

III. Oligonukleotidit 10 Halutun sekvenssin mukaisia oligonukleotidejä voi daan modifioida substituoimalla yksi tai useampi tässä julkistettu L-nukleosidi jollain nukleosidilla oligonukle-otidissä. Edullisessa suoritusmuodossa L-nukleosidi sijoitetaan oligonukleotidin jompaankumpaan päähän. Modifioitua 15 oligonukleotidiä voidaan käyttää esimerkiksi antisense- teknologiassa.

Antisense-teknologia viittaa yleensä ottaen gee-niilmentymisen modulaatioon prosessilla, jossa synteettinen oligonukleotidi hybridisoidaan siihen nähden komple- 20 mentaariseen nukleiinihapposekvenssiin transkription tai replikaation inhiboimiseksi (jos kohdesekvenssinä on DNA), • ·*; translaation inhiboimiseksi (jos kohdesekvenssinä on RNA) ·«« · ,·*·, tai prosessoinnin inhiboimiseksi (jos kohdesekvenssinä on #«· ,···, pre-RNA) . Laajaa valikoimaa soluaktiivisuuksia voidaan mo- • · 25 duloida tätä tekniikkaa käyttäen. Yksinkertainen esimerkki • · on proteiinien biosynteesin inhibointi mRNA:han sitoutu-neella antisense-oligonukleotidilla. Toisessa suoritusmuo- • · *···* dossa synteettinen oligonukleotidi hybridisoidaan spesifi seen geenisekvenssiin kaksisäikeisessä DNA:ssa, jolloin • · V.· 30 muodostuu kolraisäikeinen kompleksi (tripleksi), joka inhi- ··· ·,„· boi tuon geenisekvenssin ilmentymisen. Antisense-oligo- ;·|·, nukleotidejä voidaan myös käyttää geeni-ilmentymisen akti- • · *..It voimiseksi epäsuorasti suppressoimalla luonnollisen rep- • · "* ressorin biosynteesi. A0T:tä voidaan käyttää patogeenisten M· 35 geenien ilmentymisen inhiboimiseksi, esimerkiksi geenien, *!**i jotka helpottavat virusten replikaatiota, mukaan lukien 118954 45 ihmisen immuunikatovirus (HIV), hepatiitti-B-virus (HBV) ja herpesvirukset, ja syöpien, erityisesti kiinteiden kas-vainmassojen kuten glioomat (hermon tukisolukasvain), rintasyöpä ja melanoomat.

5 Valitun oligonukleotidin stabiilisuus nukleaaseja vastaan on tärkeä tekijä in vivo -käytöissä. Tiedetään, että 3'-eksonukleaasiaktiivisuus on vastuussa valtaosasta ei-modifioidun antisense-oligonukleotidin hajoamisesta seerumissa [Vlassov, V.V., Yakubov, L.A., "Prospects for 10 Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancers and AIDS", Wi-ley-Liss, Inc., New York, 1991, 243 - 266; Nucl. Acids

Res. 21 (1993) 145]. Yhdessä suoritusmuodossa tässä jul kistettuja L-nukleosideja voidaan käyttää antisense-oligonukleotidien 31-eksonukleaasihajoamisen minimoiseksi.

15 Esillä olevan keksinnön mukaiset oligonukleotidit, jotka kykenevät sitoutumaan polyribonukleiinihappoon tai polydeoksiribonukleiinihappoon, ovat käyttökelpoisia an-tisense-aineina samaan tapaan kuin tavanomaiset antisense-aineet [katso yleisesti "Antisense Molecular Biology and 20 S-oligos" (suom. "Antisense-molekyylibiologia ja S-oligot"), Synthesis 1_ (lokakuu 1988), julkaisija Synthe- I;*· cell Corp., Rockville, Md) ; "Discoveries in Antisense Nu- ·«· · cleic Acids", C. Brakel ja R. Fraley, toim., 1989; Uhlmann ··· .*··, et al., "Antisense Oligonucleotides: A New Therapeutic I * 25 Technique" (suom. "Antisense-oligonukleotidit: Uusi terä- ,Γ* peuttinen tekniikka"), Chem. Rev. 90:4 (1990); ja

Milligan, J.F., Matteucci, M.D., Martin, J.C., J. Med.

• · *···* Chem. 36 (1993) 1923 - 1937] . Esillä olevan keksinnön mu kaisia antisense-aineita voidaan käyttää antisense-aineen * · 30 rakentamiseksi, joka kykenee sitoutumaan selektiivisesti :...ί ennalta määrättyyn polydeoksiribonukleiinihapposekvenssiin tai polyribonukleiinihapposekvenssiin tai tällaisen sek- φ · ]··*. venssin sisältävään soluun (esim. lisäämällä antisense- • · "* ainetta solun sisältävään kasvualustaan) siten, että an-

• M

35 tisense-aine siirtyy soluun, sitoutuu ennalta määrättyyn *·**! sekvenssiin ja salpaa sen transkription, translaation tai 118954 46 replikaation. Edellytykset antisense-aineen selektiiviselle sitoutumiselle tunnetaan (esim. 17 emäksen pituus selektiivistä sitoutumista varten ihmisgenomiin).

IV. Farmaseuttisten koostumusten valmistus 5 Tässä julkistetut yhdisteet ja niiden farmaseutti sesti hyväksyttävät suolat, esilääkkeet ja johdannaiset ovat käyttökelpoisia HBV- ja EBV-tartuntojen ja muiden su-kulaistilojen estämiseksi ja hoitamiseksi, kuten anti-HBV-tai anti-EBV-vasta-ainepositiiviset ja HBV- tai EBV-posi-10 tiiviset tilat, HBV:n aiheuttama krooninen maksatulehdus, kirroosi, akuutti hepatiitti, äkillinen hepatiitti, krooninen pysyvä hepatiitti ja väsymys. Näitä yhdisteitä tai koostumuksia voidaan käyttää myös ennalta ehkäisemään tai estämään tai hidastamaan kliinisen sairauden etenemistä 15 yksilöissä, jotka ovat anti-HBV-, anti-EBV-vasta-aine- tai HBV- tai EBV-antigeenipositiivisia tai jotka ovat altistuneet HBV:lie tai EBV:lle.

Mistä tahansa näistä tiloista kärsiviä ihmisiä voidaan hoitaa antamalla potilaalle tehokas HBV- tai 20 EBV-hoitomäärä yhtä tässä kuvattua aktiivista yhdistettä tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää johdannaista tai ; ·’: suolaa tai mainittujen seosta mahdollisesti farmaseutti- • M · .**·. sesti hyväksyttävässä kantajassa tai laimentimessa. Aktii- ··· ,···. visia materiaaleja voidaan antaa mitä tahansa sopivaa tie- ,···, 25 tä, esimerkiksi oraalisesti, ruoansulatuskanavan ulkopuo- • * lisesti, laskimonsisäisesti, ihonsisäisesti, ihonalaisesti • « • ·· tai paikallisesti nestemäisessä tai kiinteässä muodossa.

• · *···* Aktiivinen yhdiste sisällytetään farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan tai laimentimeen määränä, joka on V,: 30 riittävä kuljettamaan potilaaseen terapeuttisesti tehok- ··· ·„.ϊ kaan määrän aiheuttamatta vakavia toksisia vaikutuksia :v. hoidetussa potilaassa.

* · #..!t Aktiivisen yhdisteen edullinen annos kaikkiin • · *" edellä mainittuihin tiloihin on noin 1-60 g/kg, edulli- • Il 35 sesti 1-20 mg/kg, ruumiin painoa päivässä, yleisemmin *"*! 0,1 - noin 100 mg/kg vastaanottajan ruumiin painoa päiväs- 118954 47 sä. Farmaseuttisesti hyväksyttävien johdannaisten tehokas annostusalue voidaan laskea perille toimitettavan kanta-nukleosidin painosta. Jos johdannainen sinänsä osoittaa aktiivisuutta, tehokas annostus voidaan arvioida kuten 5 edellä käyttäen johdannaisen painoa, tai muilla, alan taitajille tutuin keinoin. Yhdessä suoritusmuodossa aktiivinen yhdiste annetaan kuten kuvataan käsikirjan "Physician's Desk Reference" tuoteliitteessä 31-atsido-31-deoksitymidiinille (AZT), 2',3'-dideoksi-inosiinille (DDI), 10 2',3'-dideoksisytidiinille (DDC) tai 2',3'-dideoksi-2', 3 ' - didehydrotymidiinille (D4T) HIV-indikaatiossa.

Yhdiste annetaan kätevästi minä tahansa sopivana annostusmuotoyksikkönä, mukaan lukien mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta yksikkö, joka sisältää 7-3 000 mg, 15 edullisesti 70-1 400 mg, aktiivista aineosaa kohden yk-sikköannostusmuoto. Tavallisesti kätevä on oraalinen annostus 50-1 000 mg.

Ihanteellisesti aktiivista ainesosaa tulisi antaa aktiivisen yhdisteen huippuplasmapitoisuuksien saavuttami-20 seksi, jotka ovat noin 0,2 - 70 μΜ, edullisesti noin 1,0 -10 μΜ. Tähän voidaan päästä esimerkiksi ruiskuttamalla • ;*· laskimonsisäisesti aktiivisen aineosan 0,1 - 5-%:ista liu- ··· · .***. osta mahdollisesti suolaliuoksessa, tai antamalla kerta- • · r ··· ,···. annos aktiivista aineosaa.

• · .···, 25 Aktiivinen yhdiste voidaan antaa käyttöön far- • · ,Γ* maseuttisesti hyväksyttävien suolojen muodossa. Tässä käy- • ·· tettynä ilmaisulla "farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat • ♦ *···* tai kompleksit" tarkoitetaan nukleosidien suoloja tai komplekseja, joilla on tallella kantayhdisteen haluttu • *.V 30 biologinen aktiivisuus ja jotka osoittavat minimaalisia • · * tai ei ollenkaan epätoivottavia toksikologisia vaikutuk-siä. Ei-rajaavia esimerkkejä tällaisista suoloista ovat • a ,···. (a) epäorgaanisten happojen kanssa muodostetut happoaddi- * i **' tiosuolat (esimerkiksi kloorivetyhappo, bromivetyhappo,

Ml 35 rikkihappo, fosforihappo, typpihappo ja muut vastaavat) , * ja orgaanisten happojen kanssa muodostetut suolat, kuten 118954 48 seuraavien happojen kanssa muodostetut suolat: etikkahap-po, oksaalihappo, viinihappo, meripihkahappo, omenahappo, askorbiinihappo, bentsoehappo, parkkihappo, palmitiinihap-po, algiinihappo, polyglutamiinihappo, naftaleenisulfoni-5 hapot, naftaleenidisulfonihapot ja polygalakturonihappo; (b) emäsadditiosuolat, jotka on muodostettu kationien kanssa kuten natrium, kalium, sinkki, kalsium, vismutti, barium, magnesium, aluminium, kupari, koboltti, nikkeli, kadmium, natrium, kalium ja muut vastaavat, tai orgaanisen 10 kationin kanssa muodostetut suolat, jotka on muodostettu N,N-dibentsyylietyleenidiamiinista, ammoniumista tai ety-leenidiamiinista; tai (c) (a):n ja (b):n yhdistelmät, esim. sinkkitannaattisuolat ja muut vastaavat.

Aktiivisen yhdisteen modifikaatiot, spesifisesti 15 N6- tai N4- ja 5'-O-asemissa, voivat vaikuttaa aktiivisen lajin biosaatavuuteen ja aineenvaihduntanopeuteen, jolloin saadaan kontrolli aktiivisen lajin perille toimittamiseen.

Aktiivisen yhdisteen pitoisuus lääkekoostumuksessa riippuu lääkkeen absorptio-, inaktivaatio- ja eritysnope-20 uksista sekä muista, alan taitajille tutuista tekijöistä. Huomattakoon, että annostusarvot vaihtelevat myös lievi-j tettävän tilan vakavuuden mukaan. Edelleen tulee ymmärtää, ··· i ,···. että mille tahansa tietylle kohteelle spesifiset annostus- • · l**t ohjelmat tulisi säätää ajan funktiona yksilöllisen tarpeen • ·

Hl 25 mukaan ja koostumuksia antavan tai antoa valvovan henkilön m » • · ammatillisen harkinnan mukaan, ja että tässä esitetyt pi- • · ^ ** toisuusalueet ovat vain esimerkkiluonteisia, jolloin nii- *··.* den ei tarkoiteta rajoittavan patentoitavaksi vaaditun koostumuksen käytännön suojapiiriä. Aktiivinen aineosa • :.V 30 voidaan antaa kerralla, tai se voidaan jakaa lukuisiksi S*"*; pienemmiksi annoksiksi, jotka annetaan vaihtelevina ajan- ··*. kohtina.

• * * • · *..* Aktiivisen yhdisteen edullinen antotapa on oraali- * · "* nen. Oraaliset koostumukset sisältävät yleensä inerttiä *·· 35 laimenninta tai syötävää kantajaa. Ne on voitu sulkea ge-*!**: latiinikapseleihin tai puristaa tableteiksi. Oraalista te- 118954 49 rapeuttista antoa silmällä pitäen aktiivinen yhdiste voidaan sisällyttää täyteaineisiin ja sitä voidaan käyttää tablettien, suussa liukenevien tablettien tai kapselien muodossa. Farmaseuttisesti yhteensopivia sideaineita ja/ 5 tai apumateriaaleja voidaan sisällyttää osaksi koostumusta.

Tabletit, pillerit, kapselit, suussa sulavat tabletit ja muut vastaavat voivat sisältää mitä tahansa seu-raavia aineosia tai luonteeltaan samankaltaisia yhdistei-10 tä: sideainetta, kuten mikrokiteinen selluloosa, tragant- tikumi tai gelatiini; täyteainetta kuten tärkkelys tai laktoosi, hajottavaa ainetta kuten algiinihappo, Primogel-valmiste tai maissitärkkelys; voiteluainetta kuten magne-siumstearaatti tai Sterotes-valmiste; liukuainetta kuten 15 kolloidinen piidioksidi; makeutusainetta kuten sakkaroosi tai sakkariini; tai flavoriainetta kuten piparminttu, me-tyylisalisylaatti, tai appelsiinin maku. Kun annostusyk-sikkömuoto on kapseli, se voi sisältää edeltävän tyyppisen materiaalin lisäksi nestemäistä kantaa kuten rasvaöljy.

20 Lisäksi annostusyksikkömuodot voivat sisältää erilaisia muita materiaaleja, jotka modifioivat annostusyksikön fy- • ·*· sikaalista muotoa, esimerkiksi sokeri-, sellakkapäällys- ··· « .***. teet tai muut suolessa sulavat aineet.

• · ··· ,···, Aktiivinen yhdiste tai sen farmaseuttisesti hyväk- • · φ’!Ιφ 25 syttävä suola tai johdannainen voidaan antaa eliksiirin, • · ,“* suspension, siirapin, vohvelin, purukumin tai muun vastaa- van aineosana. Siirappi voi sisältää aktiivisten yhdistei- • · *···* den lisäksi sakkaroosia makeutusaineena ja tiettyjä säily- tysaineita, värejä ja väriaineita ja flavoriaineita.

• * V,* 30 Aktiivinen yhdiste tai sen farmaseuttisesti hyväk- syttävä johdannainen tai suola voidaan myös sekoittaa mui- ··]·, hin aktiivisiin materiaaleihin, jotka eivät haittaa halut- • * tua vaikutusta, tai materiaaleihin, jotka täydentävät ha- "· luttua vaikutusta, kuten antibiootit, sienivastaiset ai- *·· 35 neet, tulehdusvastaiset aineet tai muut virusvastai- • · 118954 50 set aineet, mukaan lukien anti-HBV-, anti-EBV-, anti-sytomegalovirus- tai anti-HIV- tai anti-EBV-aineet.

Liuokset tai suspensiot, joita käytetään ruoansulatuskanavan ulkopuoliseen, ihonsisäiseen, ihonalaiseen 5 tai paikalliseen antoon, voivat sisältää seuraavia aineosia: steriili laimennin kuten injisointivesi, suolaliuos, kovetetut öljyt, polyetyleeniglykolit, glyseriini, propy-leeniglykoli tai muut synteettiset liuottimet; bakteeri-vastaiset aineet kuten bentsyylialkoholi tai metyylipara-10 beenit; hapetuksenestoaineet kuten askorbiinihappo tai natriumbisulfiitti; kelatoivat aineet kuten etyleenidi-amiinitetraetikkahappo; puskurit kuten asetaatit, sitraa-tit tai fosfaatit, ja aineet toonisuuden säätämiseksi kuten natriumkloridi tai dekstroosi. Kantavalmiste voidaan 15 sisällyttää ampulleihin, kertakäyttöruiskuihin tai lasista tai muovista valmistettuihin moniannosampulleihin.

Laskimonsisäisessä annossa edullisia kantajia ovat fysiologinen suolaliuos tai fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS). Edullisessa suoritusmuodossa aktiiviset yhdisteet 20 koostetaan kantajien kanssa, jotka suojaavat yhdistettä vastaan nopeaa poistumista elimistöstä, kuten kontrol- : .*. loidun vapautumisen koostumus, mukaan lukien istutteet ja * · · · .···. mikrokapseloidut kuljetussysteemit. Voidaan käyttää bioha- • · ,···, joavia, bioyhteensopivia polymeerejä, kuten etyleenivinyy- • · III 25 liasetaatti, polyanhydridit, polyglykolihappo, kollageeni, polyortoesterit ja polymaitohappo. Menetelmät tällaisten • · • ** koostumusten valmistamiseksi ovat ilmeisiä alan ammatti- Ψ·· • · *··.* laisille. Materiaalit voidaan myös saada kaupallisesti ta hoilta Alza Corporation ja Nova Pharmaceuticals, Inc.

• * V,i 30 Liposomisuspensiot (mukaan lukien liposomit, jotka ϊφ”ί on kohdennettu tartutettuihin soluihin virusantigeenien vastaisilla monoklonaalisilla vasta-aineilla) ovat myös • · *..I edullisia farmaseuttisesti hyväksyttävinä kantajina. Nämä voidaan valmistaa alan taitajille tutuilla menetelmillä • · · ϊφ##ϊ 35 kuten kuvataan esimerkiksi US-patentti julkaisussa nro *;**: 4 552 811 (joka sisällytetään tähän kokonaisuudessaan 118954 51 viitteeksi). Esimerkiksi liposomikoostumuksia voidaan valmistaa liuottamalla yhtä tai useampaa sopivaa lipidiä (kuten stearoyylifosfatidyylietanoliamiini, stearoyylifosfa-tidyylikoliini, arakadoyylifosfatidyylikoliini ja koleste-5 roli) epäorgaaniseen liuottimeen, joka sitten haihdutetaan pois, jolloin jäljelle jää ohut kalvo kuivattua lipidiä astian pinnalle. Sitten astiaan lisätään aktiivisen yhdisteen tai sen monofosfaatti-, difosfaatti- ja/tai trifos-faattijohdannaisten vesiliuosta. Sitten astiaa pyöritetään 10 käsin lipidimateriaalin vapauttamiseksi astian seiniltä ja lipidiaggregaattien dispergoimiseksi, jolloin muodostuu liposomisuspensio.

Tätä keksintöä on kuvattu viitaten sen edullisiin suoritusmuotoihin. Keksinnön variaatiot ja modifikaatiot 15 ovat ilmeisiä alan ammattilaisille keksinnön edeltävästä yksityiskohtaisesta kuvauksesta. Tarkoitus on, että kaikki nämä variaatiot ja modifikaatiot sisältyvät oheisten patenttivaatimusten suojapiiriin.

• · φ · • t I ··· t • · · • 1 • · • · · • · · • 1 • · »·« ΦΦΦ • · • · ··· • · • · • ·· «·· • 1 • · ·«· • · • · · * · · • 1 * · · • Φ Φ · * 1 · • Φ · · Φ t · Φ · φ Φ * · · • φ Φ f Φ φ φ • tl· Φ · • · ΦΙΙ φ φ φ φ Φ • Φ

Claims (29)

52 1 1 8 9 5 4

1. Farmaseuttinen koostumus, joka käsittää L-nuk-leosidiyhdisteen, jolla on kaava: 5 OH jossa R on emäs valittu ryhmästä tyrniini, adeniini ja sytosiini;

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että L-nukleosidi on ainakin 15 95-prosenttisesti puhdas vastaavasta D-nukleosidista.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että L-nukleosidi on ainakin 98-prosenttisesti puhdas vastaavasta D-nukleosidista.

• . 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen farmaseuttinen . · · • . · 20 koostumus, tunnettu siitä, että R on tyrniini.

• · ;;;* 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen farmaseuttinen • · *···* koostumus, tunnettu siitä, että R on adeniini.

... *...* 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen farmaseuttinen .· ϊ *·· koostumus, tunnettu siitä, että R on sytosiini. ϊ : 25

7. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen far- ··· ' maseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että R'' on mo- ;V: nofosfaatti.

* · .**·. 8. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen far- • . maseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että R'' on di- : ·* 30 fosfaatti. ...

9. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen far- . ·***. maseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että R' ' on tri- ... fosfaatti. . · 118954

10. Patenttivaatimuksen 4 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, R'' on monofosfaatti.

10 R' 1 on vety, monofosfaatti, difosfaatti tai tri- fosfaatti; tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan, yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan kanssa.

11. Patenttivaatimuksen 4 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että R' ' on difosfaatti.

12. Patenttivaatimuksen 4 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että R'' on trifosfaatti.

13. Patenttivaatimuksen 5 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä,, että R'' on monofosfaatti.

14. Patenttivaatimuksen 5 mukainen farmaseuttinen 10 koostumus, tunnettu siitä, että R'' on difosfaatti.

15. Patenttivaatimuksen 5 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että R'' on trifosfaatti.

16. Patenttivaatimuksen 6 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että R'' on monofosfaatti.

17. Patenttivaatimuksen 6 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että R'' on difosfaatti.

18. Patenttivaatimuksen 6 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että R' ' on trifosfaatti.

19. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen far-20 maseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että kantaja on sopiva oraaliseen antomuotoon.

» : 20. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen far- ·#· ϊ,.,ϊ maseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että kantaja on : liposomaalinen suspensio. ;***: 25

21. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen far- φ · · maseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että kantaja on .···. kontrolloidun vapautumisen formulaatio. • ♦

22. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen far- .. maseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että kantaja on • · · 1,1 30 sopiva parenteraaliseen antomuotoon. • · **··1

23. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen far- maseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että kantaja on • · ·***· sopiva suonensisäiseen antomuotoon. ··1

24. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen far- * · *·1·] 35 maseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että kantaja on 1 sopiva paikalliseen antomuotoon. 118954

25. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että kantaja on sopiva ihonsisäiseen antomuotoon.

26. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen far-5 maseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että kantaja on sopiva subkutaaniseen antomuotoon.

27. Patenttivaatimuksen 1 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että koostumus on annoste-luyksikkömuodossa.

28. Patenttivaatimuksen 27 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että annos teluyksikkö on tabletti tai kapseli.

29. Patenttivaatimuksen 27 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että annosteluyksikkö sisäl-15 tää 7 - 3000 mg L-nukleosidiyhdistettä. * · • · · t » i ·· · ·· • · • · *·· ··· * • · ·#· ··· • « • · ··* • · • ·· *·· • · • · • · • · · • · · • · ··· • · • · ··· ·* · • · « • * • * ··· # « * ·♦· ··· • · • · ··* m · 118954