FI121846B - L-nukleosidejä hepatiitti-B-viruksen ja Epstein-Barr-viruksen hoitamiseksi - Google Patents

Description

L-nukleosidejä hepatiitti-B-viruksen ja Epstein-Barr-viruksen hoitamiseksi Tämä keksintö koskee farmaseuttisia koostumuksia 5 hepatiitti-B-viruksen (jota kutsutaan myös "HBV":ksi) ja Epstein-Barr-viruksen (jota kutsutaan "EBV":ksi) aiheuttamien tartuntojen hoitamiseksi. Hoitomenetelmissä annetaan tehokas määrä yhtä tai useampaa tässä julkistettua aktiivista yhdistettä tai jonkin näistä yhdisteistä farmaseut-10 tisesti hyväksyttävää johdannaista tai esilääkettä.

Keksinnön tausta

Hepatiitti-B-virus on levinnyt epidemiologisille tasoille kautta maailman. 2-6 kuukauden inkubointiaika-jakson, jona isäntä on tietämätön tartunnasta, jälkeen 15 HBV-tartunta voi johtaa akuuttiin hepatiittiin ja maksavaurioon, joka aiheuttaa vatsakipuja, keltaisuutta sekä tiettyjen entsyymien kohonneita tasoja veressä. HBV voi aiheuttaa äkillisen hepatiitin, joka on sairauden nopeasti etenevä, usein kohtalokas muoto, jossa suuria osia maksas-20 ta tuhoutuu. Potilaat tyypillisesti toipuvat akuutista vi-rushepatiitista. Joissakin potilaissa kuitenkin virusan-tigeenin korkeat tasot veressä säilyvät pidentyneen, tai määrittelemättömän, ajan aiheuttaen kroonisen tartunnan. Krooniset tartunnat voivat johtaa krooniseen pysyvään he-25 patiittiin. Potilaat, joilla on krooninen pysyvä HBV-tar-tunta, ovat yleisimpiä kehitysmaissa. Vuoden 1991 puolivälissä pelkästään Aasiassa oli noin 225 miljoonaa kroonista HBV-kantajaa ja koko maailmassa lähes 300 miljoonaa kantajaa. Krooninen pysyvä hepatiitti voi aiheuttaa väsymystä, 30 maksakirroosia ja maksasolusyöpää, joka on primaarinen maksasyöpä.

Läntisissä teollistuneissa maissa korkean riskin ryhmiä HBV-tartunnalle ovat henkilöt, jotka joutuvat kosketuksiin HBV-kantajien tai näiden verinäytteiden kanssa. 35 HBV:n epidemiologia on itse asiassa hyvin samankaltainen 2 kuin immuunikadon, mikä selittää sen, miksi HBV-tartunta on yleinen aids-potilailla tai henkilöillä, joilla on HIV-liitteisiä tartuntoja. Kuitenkin HBV on tarttuvampi kuin HIV.

5 HBV jää toiseksi vain tupakalle ihmissyövän syynä.

Mekanismi, jolla HBV aiheuttaa syöpää, on tuntematon, joskin oletetaan, että se saattaa suoraan laukaista kasvaimen kehittymisen tai epäsuorasti laukaista kasvaimen kehittymisen tartuntaan liittyvien kroonisen tulehduksen, kirroo-10 sin ja soluregeneraation välityksellä.

Epstein-Barr-virus (EBV) kuuluu Lympho c ryp t o-virusten sukuun, joka kuuluu gammaherpesvirusten alaryhmään. Se on huomattavan lymfotrooppinen. EBV:llä on herpesviruksille tavanomainen rakenne, sen kaksisäikeinen 15 DNA-genomi nimittäin on ikosapentahedraalisen nukleokapsi- din sisällä, jota puolestaan ympäröi virusglykoproteiineja runsaasti sisältävä lipidikuori. Kuoren ja nukleokapsidin välisessä tilassa on amorfinen peittoproteiini.

Kaikki ihmisen herpesvirukset tartuttavat lym-20 fosyyttejä ja replikoituvat niissä jossain määrin, mutta EBV tekee tämän tehokkaasti. Merkittävintä on, että patogeneesi ja isännän vasteet EBV-tartunnalle ovat riippuvaisempia lymfosyyttitartunnasta kuin on ilmeistä muiden ihmisen herpesvirusten kohdalla.

25 EBV on nyt tunnistettu syyksi B-solulymfolisäänty- missairauksiin, ja se on kytketty erilaisiin muihin vakaviin ja kroonisiin sairauksiin, mukaan lukien harvinainen progressiivinen mononukleoosin kaltainen oireyhtymä ja nukkaisten valkotäplien esiintyminen suun limakalvoilla 30 aids-potilailla. Esitys, että EBV on kroonisen väsymyksen pääasiallinen syy, ei ole kestänyt lähempää tarkastelua.

EBV tarttuu pääasiassa syljen välityksellä, vaikkakin jotkut tartunnat välittyvät veren siirroissa. Yli 85 % potilaista tarttuvan mononukleoosin akuuteissa vai-35 heissä erittää EBV:tä.

3 EBV on yhdistetty syöpään. Ainakin kaksi potilasryhmää on vaarassa kehittää EBV-liitteisiä lymfoomia: ne, jotka ovat saaneet munuais-, sydän-, luuydin-, maksa- tai kateenkorvasiirrännäisiä immunosuppresiivisen terapian 5 suojassa, sekä aids-potilaat. EBV-liitteisiä syöpiä ovat

Burkittin lymfooma ja nenänielusyöpä.

Sen valossa, että hepatiitti-B-viruksella ja Ep-stein-Barr-viruksella on vakavia ja usein traagisia vaikutuksia tartunnan saaneelle potilaalle, on olemassa voima-10 kas tarve saada käyttöön näiden virusten tartuttamien ihmisten hoitamiseksi uusia tehokkaita farmaseuttisia aineita, joiden myrkyllisyys isännälle on matala.

Tämän vuoksi esillä olevan keksinnön päämääränä on antaa käyttöön yhdiste, koostumus ja menetelmä hepatiitti-15 B-viruksen hoitamiseksi.

Esillä olevan keksinnön toinen päämäärä on antaa käyttöön yhdiste, koostumus ja menetelmä Epstein-Barr-viruksen hoitamiseksi.

Yhteenveto keksinnöstä 20 HBV- tai EBV-tartunnan saaneen isännän ja erityi sesti ihmisen hoitamiseksi annetaan käyttöön menetelmä, jossa annetaan HBV- tai EBV-tartuntaa hoitava määrä L-nukleosidiä, jonka kaava on:

OH

/7 25 jossa R on emäs valittu ryhmästä tyrniini, adeniini ja sytosiini; R' ' on vety; Οχ-ιο alkyyli; monofosfaatti, di-fosfaatti tai trifosfaatti; -C(0)R', jossa R' on suoraket-juinen, haarautunut tai syklinen Ci_i0 alkyyli, Ci_i0 alkok-si-Ci-io alkyyli, bentsyyli, fenoksi-Ci_i0 alkyyli, fenyyli 30 mahdollisesti substituoitu halogeenilla, Ci_4 alkyyli11a tai Ci-4 alkoksilla tai sulfonaattiesteri. Edulisessa suoritusmuodossa nukleosidi annetaan käyttöön esitettynä enantiomeerinä ja oleellisesti sitä vastaavan enantiomee-rin puuttuessa (eli enantiomeerisesti rikastetussa, mukaan 35 lukien enantiomeerisesti puhtaassa, muodossa).

4

Yhdessä edullisessa suoritusmuodossa aktiivinen yhdiste on 2'-fluori-5-metyyli-S-L-arabinofuranosyyliuri-diini (jota kutsutaan myös L-FMAU:ksi). Tämä yhdiste on tehokas virusvastäinen aine HBV:tä ja EBV:tä vastaan ja 5 sen sytotoksisuus on alhainen. Muita spesifisiä esimerkkejä aktiivisista yhdisteistä ovat Ni-(2'-deoksi-2'-fluori-β-L-arabinofuranosyyli)-5-etyyliurasiili, Ni-(21-deoksi- 2’fluori-E-L-arabinofuranosyyli)-5-jodisytosiini ja Ni-(2'-deoksi-2'-fluori-S-L-arabinofuranosyyli)-5-jodiurasiili .

10 Vaihtoehtoisessa suoritusmuodossa käytettäväksi HBV- tai EBV-tartunnan hoitoon annetaan käyttöön L-nukleo-sidi, joka sisältää 2'-arabinohydroksyyliryhmän, esimerkiksi L-aratymidiini, L-fludarabiini, L-araguanosiini ja L-arainosiini kuten esitetään kuviossa 1.

15 Tässä julkistetut L-nukleosidit ja niiden far maseuttisesti hyväksyttävät johdannaiset tai näitä yhdisteitä sisältävät farmaseuttisesti hyväksyttävät koostumukset ovat käyttökelpoisia HBV-tartuntojen ja muiden liittyvien tilojen estämiseksi ja hoitamiseksi kuten anti-HBV-20 vasta-ainepositiiviset ja HBV-positiiviset tilat, HBV: n aiheuttama krooninen maksatulehdus, kirroosi, akuutti hepatiitti, äkillinen hepatiitti, krooninen pysyvä hepatiitti ja väsymys. Yhdisteitä voidaan samoin käyttää EBV-liitteisten häiriötilojen hoitamiseksi. Näitä yhdisteitä 25 tai koostumuksia voidaan myös käyttää ennalta ehkäisevästi kliinisten sairauksien etenemisen estämiseksi tai hidastamiseksi yksilöillä, jotka ovat anti-HBV- tai anti-EBV-vasta-aine- tai HBV- tai EBV-antigeenipositiivisia tai jotka ovat joutuneet alttiiksi HBV:lie tai EBV:lie.

30 Toisessa suoritusmuodossa aktiivinen yhdiste tai sen johdannainen tai suola voidaan antaa yhdistäen tai vaihdellen toisen anti-HBV-aineen tai anti-EBV-aineen kanssa, mukaan lukien edellä mainitut, tai anti-HIV-aineen kanssa. Yleensä ottaen vaihteluterapiassa tehokas annostus 35 kumpaakin ainetta annetaan sarjassa, kun taas yhdistelmä-terapiassa tehokas annostus kahta tai useampaa ainetta annetaan yhdessä. Annostukset riippuvat lääkkeen absorptio-, inaktivoitumis- ja eritysnopeuksista sekä muista alan am- 5 mattilaisille tutuista tekijöistä. Huomattakoon, että an-nostusarvot vaihtelevat myös lievitettävän tilan vakavuuden mukaan. Edelleen tulee huomata, että mille tahansa nimenomaiselle kohteelle spesifiset annostusohjelmat ja -ai-5 kataulut tulisi säätää ajan funktiona yksilöllisen tarpeen ja sen henkilön ammatillisen harkinnan mukaan, joka antaa koostumuksia tai valvoo niiden antoa.

Ei-rajaavia esimerkkejä virusvastaisista aineista, joita voidaan käyttää yhdistettyinä tässä julkistettuihin 10 yhdisteisiin, ovat 2-hydroksimetyyli-5-(5-fluorisytosin-1- yyli)-1,3-oksatiolaanin (-)-enantiomeeri (FTC); 2-hydro-ksimetyyli-5- (sytosin-l-yyli)-1,3-oksatiolaanin (-) -enantiomeeri (3TC); karbovir, asyklovir, interferoni, AZT, DDI (2',3'-dideoksi-inosiini), DDC (2',3'-dideoksisytidiini), 15 L-DDC, L-5-F-DDC ja D4T.

Suppea kuvaus kuvioista

Kuvio 1 on esitys valikoiduista L-nukleosideistä, jotka kuuluvat esillä olevaan keksintöön: L-FMAU (2'-fluori- 5-metyyli-S-L-arabinofuranosyyliuridiini), L-FIAU (2'-fluo-20 ri-5-jodi-S-L-arabinofuranosyyliuridiini), L-FC (2'-fluo- ri-E-L-arabinofuranosyylisytosiini), L-FIAC (2'-fluori-5-jodiS-L-arabinofuranosyylisytosiini), L-2-C1-2'-F-2'-deok- siadeniini, L-FEAU (2'-fluori-5-etyyli-E-L-arabinofurano-syyliuridiini), L-aratymidiini, L-fludarabiini, L-aragua-25 nosiini ja L-arainosiini.

Kuviossa 2 esitetään graafisesti elinkelpoisten solujen prosentuaalinen osuus L-FMAU-lääkepitoisuuden funktiona Hl-soluissa.

Kuviossa 3 esitetään kaaviollinen esitys 1-O-ase-30 tyyli-2,3,5-tri-0-bentsoyyli-fe-L-ribofuranoosin (yhdiste 10) valmistuksesta.

Kuviossa 4 esitetään kaaviollinen esitys 1-O-ase-tyyli-2,3,5-tri-0-bentsoyyli-S-L-ribofuranoosin (yhdiste 10) vaihtoehtoisesta valmistuksesta.

6

Kuvio 5 on kaaviollinen esitys menetelmästä 1,3,5-tri-0-bentsoyyli-2-deoksi-2-fluori-a-L-arabinofuranoosin (yhdiste 13) valmistamiseksi.

Kuvio 6 on kaaviollinen esitys menetelmästä 5 N9-[3',5'-di-O-bentsoyyli-2'-deoksi-2'-fluori-S-L-arabiofu- ranosyyli]-2,6-diklooripuriinin (yhdiste 15) ja Ng-[2'-deoksi-2 '-fluori-S-L-arabiofuranosyyli]-2,6-diklooripuriinin (yhdiste 16) valmistamiseksi.

Kuvio 7 on esitys menetelmästä lukuisten 2'- 10 deoksi-2'-fluori-6-L-arabinofuranosyyli]pyrimidiinien (yhdis teet 17 - 24) valmistamiseksi.

Kuvio 8 on esitys menetelmästä Ni-[2'-deoksi- 2'fluori-S-L-arabinofuranosyyli]-5-jodisytosiinin (yhdiste 22) valmistamiseksi.

15 Kuvio 9 on esitys menetelmästä 9-S-L-arabinofura- nosyyliadeniinin valmistamiseksi.

Kuvio 10 on esitys vaihtoehtoisesta tiestä 1-O-ase-tyyli-2,3,5-tri-0-bentsoyyli-S-L-ribofuranoosin (yhdiste 10) valmistamiseksi 1,2-di-O-isopropylideeni-a-L-ksylofuranoo-20 sista (yhdiste 3).

Kuvio 11 on graafinen esitys L-(-)-FMAU:n plasma-pitoisuudesta hiirissä oraalisen annon jälkeen ajan funktiona [risti, 10 mg/kg annettu bid (engl. bi-daily, kahdesti päivässä)] 29 päivän ajan ennen farmakokineettistä 25 tutkimusta, minkä jälkeen tutkimus suoritettiin päivänä 30 annettaessa sama pitoisuus; umpinainen ympyrä, 50 mg/kg annetaan bid 29 päivän ajan ennen tutkimusta, minkä jälkeen tutkimus suoritetaan päivänä 30 annettaessa sama pitoisuus; avoin ympyrä, 50 mg/kg annetaan ensimmäisen ker-30 ran tutkimuksen 1. päivänä.

Kuvio 12 on graafinen esitys L-(-)-FMAU:n pitoisuudesta hiiren maksassa oraalisen annon jälkeen ajan funktiona [risti, 10 mg/kg annettu bid (engl. bi-daily, kahdesti päivässä)] 30 päivän ajan ennen farmakokineettis-35 tä tutkimusta, minkä jälkeen tutkimus suoritettiin päivänä 7 31 annettaessa sama pitoisuus; umpinainen ympyrä, 50 mg/kg annetaan bid 30 päivän ajan ennen tutkimusta, minkä jälkeen tutkimus suoritetaan päivänä 31 annettaessa sama pitoisuus; avoin ympyrä, 50 mg/kg annetaan ensimmäisen ker-5 ran tutkimuksen 1. päivänä.

Kuvio 13a havainnollistaa muutosta ruumiin painossa ajan funktiona 30 päivän aikana naaraspuolisissa ver-rokki-BDFl-hiirissä. Kuvioissa 13b ja 13c esitetään muutos ruumiin painossa ajan funktiona 30 päivän ajan naaraspuo-10 lisille BDFl-hiirille, joille annetaan 10 mg/kg bid (13b) ja 50 mg/kg (13c) L-(-)-FMAU:ta. Esitetty ruumiin paino edustaa keskiarvoa ja standardipoikkeamaa arvoille 5-7 hiirestä.

Kuvioissa 14 - 20 esitetään kliininen kemia hiiri-15 plasmalle, kun on annettu L-(-)-FMAU:ta annos 10 mg/kg (3 hiirtä) tai 50 mg/kg (3 hiirtä) bid 30 päivän ajan. Kuviossa 14 esitetään pylväsdiagrammi kokonaisbilirubiinipi-toisuudesa hiiriplasmassa yksiköissä mg/dl. Kuviossa 15 esitetään pylväsdiagrammina alkalisen fosfataasin pitoi-20 suus hiiriplasmassa yksiköissä U/litra. Kuviossa 16 esitetään pylväsdiagrammina kreatiniinin pitoisuus hiiriplasmassa yksiköissä mg/dl. Kuviossa 17 esitetään pylväsdiagrammina AST-pitoisuus (SGOT, seerumin glutamiini-oksaa-litransaminaasi) hiiriplasmassa yksiköissä U/litra. Kuvi-25 ossa 18 esitetään pylväsdiagrammina ALT-pitoisuus (SGPT, seerumin glutamiini-pyruvaattitransaminaasi) hiiriplasmassa yksiköissä U/litra. Kuviossa 19 esitetään pylväsdiagrammina maitohapon pitoisuus hiiriplasmassa yksiköissä mmol/litra. Kuviossa 20 esitetään pylväsdiagrammina maito-30 happodehydrogenaasipitoisuus hiiriplasmassa yksiköissä U/litra .

Yksityiskohtainen kuvaus keksinnöstä Tässä käytettynä ilmaisulla "enantiomeerisesti rikastettu" tarkoitetaan nukleosidikoostumusta, joka sisäl 8 tää ainakin noin 95 %, ja edullisesti noin 97, 98, 99 tai 100 % tuon nukleosidin yksittäistä enantiomeeriä.

Tässä käytettynä ilmaisun "alkyyli" piiriin kuuluvat spesifisesti mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta 5 Ci-io-alkyyliryhmät, mukaan lukien metyyli, etyyli, propyy- li, butyyli, pentyyli, heksyyli, isopropyyli, isobutyyli, sek-butyyli, t-butyyli, isopentyyli, amyyli, t-pentyyli, syklopentyyli ja sykloheksyyli.

Tässä käytettynä ilmaisun "asyyli" piiriin kuulu-10 vat spesifisesti mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta asetyyli, propionyyli, butyryyli, pentanoyyli, 3-metyyli-butyryyli, vetysukkinaatti, 3-klooribentsoaatti, bentsoyy-li, asetyyli, pivaloyyli, mesylaatti, propionyyli, vale-ryyli, kaproni-, kapryyli-, kapriini-, lauriini-, myris-15 tiini-, palmitiini-, steariini- ja öljyhapporadikaalit.

Tässä käytettynä ja ellei toisin ole määritelty ilmaisu "asyyli" viittaa fenyyliin.

Tässä käytettynä ilmaisulla "suojattu" viitataan ellei toisin ole määritelty ryhmään, joka lisätään happi-20 tai typpiatomiin sen edelleen reagoimisen estämiseksi mo lekyylin, jossa happi tai typpi sijaitsee, muiden ryhmien derivatisoinnin aikana. Orgaanisen synteesin alan ammattilaiset tuntevat laajan valikoiman hapen ja typen suojaryh-miä.

25 Ilmaisun "puriini- tai pyrimidiiniemäs" piiriin kuuluvat mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta adeniini, N6-alkyylipuriinit, N6-asyylipuriinit [joissa asyyli on C(O) (alkyyli, aryyli, alkaryyli tai aralkyyli)], N6-bent-soyylipyriini, N6-halogeenipuriini, N6-vinyylipuriini, N6-ase-30 tyleenipuriini, N6-asyylipuriini, N6-hydroksialkyylipu- riini, N6-tioalkyylipuriini, tyrniini, sytosiini, 6-atsapy-rimidiini, 2-merkaptopyrimidiini, N5-alkyylipyrimidiinit, N5-bentsyylipyrimidiinit, N5-halogeenipyrimidiinit, N5-vi-nyylipyrimidiini, N5-asetyleenipyrimidiini, N5-asyylipyri-35 midiini, N5-hydroksialkyylipuriini, N6-tioalkyylipuriini, 9 5-atsasytidinyyli, 5-atsaurasilyyli, triatsolopyridinyyli, imidatsolopyridinyyli, pyrrolopyrimidinyyli, pyratsolopy-rimidinyyli. Emäksen funktionaaliset happi- ja typpiryhmät voidaan suojata tarpeen mukaan tai haluttaessa. Alan am-5 mattilaisille sopivat suojaryhmät ovat tuttuja, ja niitä ovat trimetyylisilyyli, dimetyyliheksyylisilyyli, t-butyy-lidimetyylisilyyli ja t-butyylidifenyylisilyyli, trityyli-metyyli, alkyyliryhmät, asyyliryhmät kuten asetyyli, propio-nyyli, butyyli, metyylisulfonyyli ja p-toluyylisulfonyyli. 10 Spesifisesti mukaan kuuluvat 5-metyyliurasiili (tyrniini), 5-jodiurasiili, sytosiini ja 5-etyyliurasiili.

Keksintö tässä julkistettuna on koostumus HBV-tartunnan ja EBV-tartunnan hoitamiseksi ihmisissä tai muissa isäntäeläimissä, johon menetelmään sisältyy tehok-15 kaan määrän yhtä tai useampaa edellä identifioitua L-nukleosidia tai fysiologisesti hyväksyttävää suolaa antaminen, mahdollisesti farmaseuttisesti hyväksyttävässä kantajassa. Tämän keksinnön mukaisilla yhdisteillä joko on anti-HBV-aktiivisuutta, anti-EBV-aktiivisuutta, tai ne me-20 taboloituvat yhdisteeksi tai yhdisteiksi, joilla on anti-HBV- tai anti-EBV-aktiivisuutta. Tässä julkistettuja yhdisteitä voidaan myös käyttää HBV- ja EBV-liitteisten häiriötilojen hoitamiseksi.

Aktiivinen yhdiste voidaan antaa minä tahansa joh-25 dannaisena, joka vastaanottajalle annettuna kykenee tuottamaan suoraan tai epäsuorasti kantayhdisteen, tai joka itse osoittaa aktiivisuutta. Ei-rajaavia esimerkkejä ovat farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat (joihin vaihtoehtoisesti viitataan "fysiologisesti hyväksyttävinä suoloina"), 30 ja aktiivisen yhdisteen 5' ja puriini- tai pyrimidiini-asyloidut tai alkyloidut johdannaiset (joihin vaihtoehtoisesti viitataan "fysiologisesti aktiivisina johdannaisina"). Yhdessä suoritusmuodossa asyyliryhmä on karboksyyli- 10 happoesteri [eli -C(O)R')], jossa esteriryhmän ei-karbo-nyyliryhmä (R') valitaan suorista, haarautuneista tai syklisistä Ci-io-alkyyleistä, -alkoksialkyyleistä, mukaan lukien metoksimetyyli, aralkyyli mukaan lukien bentsyyli, aryyli-5 oksialkyyli kuten fenoksimetyyli, aryyli mukaan lukien mahdollisesti halogeenilla substituoitu fenyyli, Ci-4-al-kyyli tai Ci-4-alkoksi, sulfonaattiesterit kuten alkyyli-tai aralkyylisulfonyyli mukaan lukien metaanisulfonyyli, mono-, di- tai trifosfaattiesteri, trityyli tai monometok-10 sitrityyli, substituoitu bentsyyli, trialkyylisilyyli (esim. dimetyyli-t-butyylisilyyli) tai difenyylimetyylisilyyli. Aryy-liryhmät estereissä optimaalisesti käsittävät fenyyli- tai bentsyyliryhmän. Alkyyliryhmä voi olla suora, haarautunut tai syklinen, ja on optimaalisesti Ci-i0-ryhmä.

15 1. L-nukleosidien synteesi Tässä julkistetut L-nukleosidit voidaan valmistaa kuten kuvataan alla yksityiskohtaisesti tai muilla, alan ammattilaisille tutuilla menetelmillä.

Alla kuvatuissa synteesikaavioissa muita tavan-20 omaisia reagensseja, mukaan lukien ekvivalenttisia happoja, emäksiä ja liuottimia, voidaan käyttää mainittujen tilalla kuten alan keskimääräisillekin taitajille tuttua. Voidaan käyttää laajaa valikoimaa hapen tai typen suoja-ryhmiä, kuten esitetään esimerkiksi kirjassa Greene et 25 ai., "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, 2. painos, 1991. Sopivia hapen ja typen suojaryh-miä ovat esimerkiksi trisubstituoitu silyyliryhmä kuten trimetyylisilyyli, dimetyyliheksyylisilyyli, t-butyylidime tyylisi lyyli, t-butyylidifenyylisilyyli, trityyli, alkyyli-30 ryhmä, asyyliryhmät kuten asetyyli, propionyyli, bentsoyy-li, p-N02-bentsoyyli, bentsyyli tai toluyyli, metyylisul-fonyyli tai p-toluyylisulfonyyli. Funktionaaliset happi-ja typpiryhmät heterosyklisessä emäksessä tulisi suojata ennen kondensointia sokeriin.

11

Sopivia pelkistimiä ovat NaBH4, di-isobutyylialu-miniumhydridi (DIBAL-H), litiumboorihydridi (LiBH4) ja natri-umbis(2-metoksietoksi)aluminiumhydridi (Red-Al). Sopivia hapettimia ovat kromihapon (Cr03) hapan vesiliuos, natrium-5 dikromaatti (Na2Cr07), pyridiniumkloorikromaatti (PCC) , pyri-diniumdikromaatti (PDC), kaliumpermanganaatti (KMn04) , lyijy-tetra-asetaatti/pyridiini, happi platina/hiili-katalysaat-torilla, Ru04, Ru04/Nal04, dimetyylisulfoksidi/disyklohek- syylikarbodi-imidi (DMSO/DCC) ja protoniluovuttaja, hopea-10 karbonaatti, trifenyylivismuttikarbonaatti, Oppenauer-ha-petin (aluminiumalkoksidit asetonissa) ja mangaanidioksidi (allyyli- tai bentsyylialkoholien selektiiviseen hapetukseen muiden alkoholien läsnä ollessa).

Friedel-Crafts-katalysaattoreita (Lewis-happoja), 15 joita voidaan käyttää kondensaatioreaktiossa, ovat SnCl4, ZnCl4, TiCl4, AICI3, FeCl3, BF3-dietyylieetteri ja BC13. Nämä katalysaattorit edellyttävät vedettömiä olosuhteita, koska veden läsnäolo laskee niiden aktiivisuutta. Nämä katalysaattorit inaktivoituvat myös orgaanisten liuottimien 20 läsnä ollessa, joissa on aktiivisia vetyjä, kuten alkoholit ja orgaaniset hapot. Näitä katalysaattoreita käytetään tyypillisesti liuottimissa kuten hiilidisulfidi, mety-leenikloridi, nitrometaani, 1,2-dikloorietaani, nitrobent-seeni, tetrakloorietaani, klooribentseeni, bentseeni, to-25 lueeni, dimetyyliformamidi, tetrahydrofuraani, dioksaani tai asetonitriili. Vedetön aluminiumkloridi ei liukene hiilidisulf idiin [Niedballa et ai., J. Org. Chem. 39 (1974) 25]. Edullinen katalysaattori on SnCl4. Edullinen liuotin on 1,2-dikloorietaani. Trimetyylisilyylitriflaat-30 tia voidaan käyttää samoissa olosuhteissa kuin kuvataan edellä Friedel-Crafts-katalysaattoreille. Reaktio tapahtuu lämpötila-alueella -10 - +200 °C. Desilylointi voidaan suorittaa erilaisilla reagensseilla, mukaan lukien etikkahap-po, trifluorietikkahappo, fluorivety, n-tetrabutyyliammo-35 niumfluoridi, kaliumfluoridi ja pyridinium-HCl.

12

Viitaten kuvioon 3 L-ksyloosista (la) lähtien keskeinen välituote l-0-asetyyli-2,3,5-tri-0-bentsoyyli-S-L-ribofuraanoosi (10) syntetisoitiin kokonaissaannon ollessa 20 % [L. Vargha, Chem. Ber. 87 (1954) 87; Holy, A., et ai. , 5 Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry VI 163 -167], Kuten esitetään kuviossa 4, yhdiste 10 voidaan myös syntetisoida kalliimmasta lähtömateriaalista L-riboosi [Holy et ai., Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry VI 163 - 167]. Kuviossa 3 esitetään vaihtoehtoinen synteesi 10 yhdisteelle 10 (saanto 53 %) , joka sitten fluorattiin C2:ssa [J. Org. Chem. 50 (1985) 3644 - 3647] 1,3,5-tri-O- bentsoyyli-2-deoksi-2-fluori-L-arabinofuraanoosin (13) saamiseksi, joka kondensoitiin eri emäksiin bromisokerin välityksellä 2'-deoksi-2'-fluoriarabinofuranosyylinukleosidien 15 saamiseksi vaihtelevin saannoin.

1,2-di-O-isopropylideani-<x-L-ksylofuranoosi (3) 650 ml:aan vedetöntä asetonia lisättiin 4 ml kons. rikkihappoa, 5 g molekyyliseula-ainetta (4 Ä) , 80 g vedetöntä kupari(2)sulfaattia ja 50 g L-ksyloosia, ja seosta 20 sekoitettiin huoneenlämpötilassa 36 tunnin ajan. Reak- tioseos sudoatettiin ja pestiin perusteellisesti asetonilla, yhdistetty suodos neutraloitiin ammoniumhydroksidillä ja haihdutettiin sitten kuiviin. Jäännökseen lisättiin etyyliasetaattia (200 ml) , minkä jälkeen suodattamlla ja 25 kuiviin haihduttamalla saatiin öljy, joka liuotettiin 250 ml:aan 0,2-%:ista HCl-liuosta ja sekoitettiin huoneenlämpötilassa 2,5 tunnin ajan. pH säädettiin 8:ksi lisäämällä kyllästettyä NaHC03-liuosta, minkä jälkeen haihdutettiin kuiviin ja uutettiin jäännöstä etyyliasetaatilla. Poista-30 maila liuotin saatiin keltaisena öljynä yhdistettä 3 (41,7 g, 82,3 %) .

^-NMR (CDCls) : δ 5,979 (d, J=3,78Hz, 1H, H-l) ; 4,519 (d, J=3,6Hz, 1H, H-2); 4,308 (leveä d, 1H, H-3); 4,080 (m, 3H, H-4 ja H-5); 1,321 (s, 3H, CH3) ; 1,253 (s, 35 3H, CH3) .

13 1.2- di-0-isopropylideeni-3,5-di-O-o-tolyylisulfon-yyli-a-L-ksylofuraanoosi (4)

Yhdistettä 3 (40 g, 210 mmol) sekoitettiin 500 ml:ssa vedetöntä pyridiiniä 0 °C:ssa samalla, kun lisättiin tipoit-5 tain liuos, jossa oli TsCl:ää (75 g, 393 mmol) liuotettuna 100 ml:aan CHC13. 3 tunnin kuluttua toinen annos TsClrää (50 g, 262 mmol) 50 ml:ssa CHC13 lisättiin samoin kuin edellä. Seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 24 tunnin ajan, minkä jälkeen se jäähdytettiin 0 °C:seen, vettä (10 ml) lisättiin 10 ja sekoitettiin sitten huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan. Reaktioseos kaadettiin 500 ml:aan jäävettä, uutettiin CHCl3:lla (150 ml x 4) , pestiin 1,5 M H2S04:llä (150 ml x 4) , kyllästetyllä NaHC03-liuoksella (200 ml x 2) ja kuivattiin (MgS04) . Poistamalla liuotin saatiin ruskea siirappi, josta EtOH:sta 15 kiteyttämällä saatiin yhdistettä 4 valkoisena kiinteänä aineena (103,8 g, 99 %).

1H-NMR (CDC13) : δ 7,282, 7,836 (m, 8H, OTs); 5,849 (d, J=3,51Hz, 1H, H-l); 4,661, 4,779 (m, 2H, H-3 ja H-4); 4,193 (kaksois-d, 1H, H-2); 4,011 (d, 2H, H-5); 2,448, 20 2,478 (2s, 6H, -OTs); 1,261, 1,320 (2s, 6H, CH3) .

1.2- di-0-asetyyli-3,5-di-O-p-tolyylisulfonyyli-a#S-ksylofuranoosi (5)

Yhdistettä 4 (70 g, 140,5 mmol) liuotettiin 700 ml:aan jääkylmää AcOH:ta ja 100 ml:aan Ac20:ta samalla, 25 kun 50 ml kons. rikkihappoa lisättiin tipoittain 0 °C:ssa. Saatua liuosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa yön yli, minkä jälkeen se kaadettiin 1 litraan jäävettä, uutettiin CHC13:11a (200 ml x 4), pestiin kyllästetyllä NaHC03-liuok- sella ja kuivattiin (MgS04) . Poistamalla liuotin tyhjössä 30 saatiin yhdistettä 5 siirappina (84,2 g, raakasaanto 110 %).

14

Metyyli-3,5-di-0-p-tolyylisulfonyyli-<x,i5-ksylo£u-ranoosi (6)

Epäpuhdasta yhdistettä 5 (80 g) sekoitettiin 500 ml:ssa 1 % HCl/CH30H:ta huoneenlämpötilassa 30 tunnin ajan.

5 Liuotin poistettiin alipaineessa, jäännös liuotettiin 300 ml:aan CHCI3, pestiin kyllästetyllä NaHCC^-liuoksella ja kuivattiin (MgSOJ . Poistamalla liuotin saatiin yhdistettä 6 siirappina (60 g, 90 % 4:stä).

Metyy 1 i - 2 -O-bent soyyl i-3,5-di-O-p-tolyyl i sul f onyy-10 li-a#fc-ksylofuranosidi (7)

Siirappia 6 (60 g, 127 mmol) liuotettiin 200 ml:aan pyridiiniä ja sekoitettiin 0 °C:ssa samalla, kun bentsoyyli-kloridia (40 ml, 345 mmol) lisättiin tipoittain, minkä jälkeen saatua liuosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 17 tun-15 nin ajan. Se konsentroitiin noin 50 ml:ksi, minkä jälkeen se kaadettiin 300 ml:aan jäävettä, uutettiin CHCl3:lla, pestiin 3 N H2SC>4:llä ja kyllästetyllä NaHC03-liuoksella ja kuivattiin (MgSC>4) . Liuotin eroon haihduttamalla saatiin yhdistettä 7 siirappina (71 g, 97 %).

2 0 Metyyli-2# 3,S-tri-O-bentsoyyli-a-fe-L-ribofurano- sidi (9)

Siirappia 7 (70 g) ja natriumbentsoaattia (100 g, 694 mmol) suspendoitiin 1 200 ml:aan DMF:ää ja sekoitettiin mekaanisesti palautusjäähdyttäen 16 tunnin ajan. Seos jääh-25 dytettiin huoneenlämpötilaan, minkä jälkeen se kaadettiin 1 litraan jäävettä, uutettin eetterillä ja kuivattiin (MgS04) . Haihduttamalla liuotin saatiin siirappi (50 g, 8a ja 8b) , joka liuotettiin 180 ml:aan pyridiiniä ja bentsoyloitiin (BzCl, 20 ml, 172 mmol) 17 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. 30 Jatkotyöstön jälkeen saatiin yhdistettä 9 siirappina (48 g, 83 %:n saanto 7:stä).

l-O-asetyyli-2,3,5-tri-0-bentsoyyli-S-L-ribo£ura-noosi (10)

Yhdistettä 9 (26 g, 54,6 mmol) käsiteltiin seoksel-35 la, jossa oli 275 ml jääetikkaa, 55 ml asetanhydridiä ja 16 15 ml kons. rikkihappoa, lämpötilassa 0 °C:sta huoneenlämpötilaan 17 tunnin ajan. Tämän jälkeen seos kaadettiin 1 litraan jäävettä ja uutettiin kloroformilla (200 ml x 4) . Yhdistetyt uutteet pestiin kyllästetyllä NaHC03-liuoksella ja kui-5 vattiin (MgS04) . Poistamalla liuotin saatiin ruskea siirappi, jota etanolilla käsittelemällä saatiin yhdistettä 10 valkoisena kiinteänä aineena (8,8 g, 32 %) . Sp. 124,7 °C, kirj . 129 - 130 °C; D-muoto: 130 - 131 °C [a]D = -45,613 (c=l,0, CHC13) , D-muoto: [ot]D - +44,2.

10 1H-NMR (CDCI3) : δ 7,317, 8,134 (m, 15H, OBz); 6,437 (s, 1H, H-l); 5,835 (m, 2H, H-2 ja H-3); 4,649 (m, 3H, H-4 ja H-5); 2,003 (s, 3H, CH3COO-).

l-O-asetyyli-2,3# S-tri-O-bentsoyyli-S-L-ribofura-noosi (L-riboosista) 15 L-riboosia (5 g, 33,3 mmol) suspendoitiin 120 mlraan 1 % HCl/MeOH:ta ja sekoitettiin huoneenlämpötilassa 3 tunnin ajan, jolloin saatiin kirkas liuos. Reaktio keskeytettiin lisäämällä 30 ml vedetöntä pyridiiniä, minkä jälkeen seos haihdutettiin alipaineessa kuiviin. Saatu siirappi haihdu-20 tettiin yhdessä pyridiinin kanssa (30 ml x 2), minkä jälkeen jäännös liuotettiin 80 ml:aan vedetöntä pyridiiniä ja sekoitettiin 0 °C:ssa samalla, kun bentsoyylikloridia (20 ml, 172 mmol) lisättiin tipoittain. 17 tunnin sekoituksen huoneenlämpötilassa jälkeen reaktio oli mennyt loppuun. Vettä (10 25 ml) lisättiin ja seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 0,5 tunnin ajan, minkä jälkeen se haihdutettiin noin 50 ml:ksi, joka kaadettiin 150 ml:aan jäävettä, uutettiin kloroformilla (50 ml x 4), pestiin toisiaan seuraten 3 N H2S04:llä (30 ml x 2) , kyllästetyllä NaHCCh-liuoksella (30 ml x 3) ja kuivat-30 tiin (MgSC>4) . Poistamalla liuotin saatiin yhdistettä 9 siirappina 13 g.

Yhdiste 9 -raakatuote liuotettiin 80 ml:aan HBr/ AcOH:ta (45 %, paino/tilavuus) , ja sekoitettiin 1,5 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Tähän seokseen lisättiin jääetik-35 kaa (50 ml) ja saatua liuosta sekoitettiin 0 °C:ssa samalla, 16 kun 34 ml vettä lisättiin hitaasti lämpötilan pysyttämiseksi alle 7 °C:ssa. Sitten seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan, minkä jälkeen se kaadettiin 200 ml:aan jäävettä ja uutettiin kloroformilla (50 ml x 5) . Yhdistetyt 5 uutteet pestiin kyllästetyllä NaHCCh-liuoksella ja kuivattiin (MgS04) . Liuotin poistamalla saatiin siirappi (13 g) , joka liuotettiin 40 ml:aan vedetöntä pyridiiniä ja sekoitettiin 0 °C:ssa, minkä jälkeen lisättiin tipoittain asetanhyd-ridiä (14 ml, 148,4 mmol). Kun reaktio oli valmis, seos kaa-10 dettiin 150 ml:aan jäävettä, uutettin kloroformilla (50 ml x 4), pestiin toisiaan seuraten 3 N H2S04:llä (30 ml x 2), kyllästetyllä NaHC03-liuoksella (50 ml x 2), ja kuivattiin (MgS04) . Liuotin poistamalla ja metanolilla käsittelemällä saatiin yhdistettä 10 valkoisena kiinteänä aineena (9,2 g, 15 53,7 % L-riboosista).

1,3,5-tri-O-bentsoyyli-ci-L-ribofuranoosi (11)

Yhdistettä 10 (9 g, 17,84 mmol) sekoitettiin 100 ml:ssa CH2Cl2:ta 0 °C:ssa samalla, kun 70 ml CH2Cl2:ta, joka sisälsi HBr:ää (3,2 g, 30,5 mmol), lisättiin yhtenä eränä. 20 Seosta sekoitettiin 0 °C:ssa 3,5 tunnin ajan, vettä (55 ml) lisättiin ja seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 18 tunnin ajan. Orgaaninen faasi erotettiin, se pestiin kyllästetyllä NaHC03-liuoksella ja kuivattiin (MgS04) . Liuotin haihduttamalla saatiin vaahto, josta CH2Cl2:sta ja n-heksaanista 25 uudelleenkiteyttämällä saatiin yhdistettä 11 valkoisena kiinteänä aineena (6,2 g, 75,5 %) . Sp. 137 - 138 °C, kirj. 140 - 141 °C, [ot]d = -81,960 (c=0,55, CHC13) ; D-muoto: [a]D = +83,71.

1H-NMR (CDC13) : δ 7,312, 8,187 (m, 15H, OBz); 6,691 30 (d, J=4,59Hz, H-l) ; 5,593 (kaksois-d, J4_3 = 6,66Hz; J2-3= 1,8Hz, 1H, H-3 0) ; 4,637, 4,796 (m, 4H, H-2, H-4 ja H-5) ; 2,3 (b, OH).

17 1,3# 5-tri-0-bentsoyyli-2“0-imidatsosulfyryyli-a-L-ribofuranoosi (12)

Yhdistettä 11 (5,94 g, 12,84 mmol) sekoitettiin 50 ml:ssa vedetöntä CH2Cl2:ta -15 °C:ssa (kuivajää-CCl4) . Vede-5 töntä DMF:ää (15 ml) ja sulfyryylikloridia (3,2 ml, 3,98 mmol) lisättiin peräkkäin. Liuosta sekoitettiin -15 °C:ssa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen se jätettiin huoneenlämpötilaan 4 tunniksi. Imidatsolia (8,7 g, 12,78 mmol) lisättiin 3 erässä samalla, kun reaktioseosta jäähdytettiin jäähautees-10 sa. Sitten sitä sekoitettiin 17 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Seos kaadettiin 150 ml:aan jäävettä ja vesifaasia uutettiin CH2Cl2:lla (50 ml x 3) . Yhdistetyt orgaaniset faasit pestiin vedellä ja kuivattiin (MgS04) . Puhdistamalla kolonnissa (heksaani/EtOAc 5:1 —> 1:1) saatiin yhdistettä 12 val-15 koisena kiinteänä aineena (3,7 g, 49 %). Sp. 124,5 - 125,5 °C, kirj. 129 °C; [a]D = -68,976; D-muoto: +66,154.

1H-NMR (CDC13) : δ 6,9, 8,2 (m, 18H, Ar-H); 6,67 (d, J=4,4Hz, 1H, H-l) ; 5,59 (kaksois-d, 1H, H-3); 5,21 (kak- sois-d, 1H, H-2); 4,5, 4,8 (m, 3H, H-4 ja H-5).

20 1,3,5-tri-0-bentsoyyli-2-d.eoksi-2-fluori-a-Ii-ara- binofuranoosi (13)

Suspensiota, jossa oli yhdistettä 12 (3,33 g, 5,62 mmol), KHF2:ta (1,76 g, 22,56 mmol) 30 ml:ssa 2,3-butaani-diolia, sekoitettiin argonsuojakaasussa. Seos kuumennettiin 25 150 °C:seen samalla, kun 1 ml HF/H20:ta (48-%:inen %-liuos, 27,6 mmol) lisättiin ja seosta sekoitettiin 160 °C:ssa 1,5 tunnin ajan. Suolavesi-jäätä lisättiin reaktion pysäyttämiseksi, minkä jälkeen liuosta uutettiin metyleenikloridilla (50 ml x 4). Yhdistetyt uutteet pestiin suolavedellä, vedel-30 lä, kyllästetyllä NaHCC>3:lla, kuivattiin kidevedettömällä magnesiumsulfaatilla ja aktiivihiilellä (Darco-60). Se kaadettiin silikageelityynylle (5 cm x 5 cm), pestiin ensin metyleenikloridilla ja sitten EtOAc:llä, jolloin saatiin siirappi, josta 95-%:isesta EtOH:sta kiteytettämällä saatiin 35 yhdiste 13 (1,3 g, 49,8 %). Sp. 77 - 78 °C; kirj. 82 °C.

18 1H-NMR (CDC13) : δ 7,314, 8,146 (m, 15H, OBz); 6,757 (d, J=9,1Hz, 1H, H-1) ; 5,38 (d, J=48,5Hz, 1H, H-2); 5,630 (kaksois-d, J=22,5Hz, 1H, H-3); 4,768 (m, 3H, H-4 ja H-5).

N9-[3 ', 5 1-di-O-bentsoyyli-2'-deoksi-2'-fluori-iS-L-5 arabinofuranosyyli]-2,6-diklooripuriini (15)

Yhdistettä 13 (464 mg, 1 mmol) liuotettiin 10 ml:aan metyleenikloridia ja lisättiin 1,4 ml HBr/AcOH:ta (45 % paino/ tilavuus) . Liuosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 24 tunnin ajan, minkä jälkeen se haihdutettiin kuiviin. Jäännös 10 liuotettiin 20 ml:aan metyleenikloridia, ja liuos pestiin vedellä, kyllästetyllä NaHC03-liuoksella sekä kuivattiin (MgS04) . Suodattamalla ja kuiviin haihduttamalla saatiin bromisokeria 14 (100 % TLC:n perusteella).

Samanaikaisesti 2,6-diklooripuriinia (378 mg, 2 mmol) 15 suspendoitiin 15 ml:aan HMDS:ää, jossa oli 2 mg ammoniumsul-faattia, minkä jälkeen keitettiin palautusjäähdyttäen 2 tunnin ajan. HMDS haihdutettiin tehokkaassa tyhjössä ^-suoja-kaasussa, jolloin saatiin valkoista silyloitua emästä.

Bromisokeria 14 liuotettiin 25 ml:aan vedetöntä 1,2-20 dikloorietaania. Saatu liuos lisättiin silyloituun emäkseen N2-suojakaasussa. Seosta keitettiin sekoittaen ja palautus-jäähdyttäen 2 päivän ajan. Lisättiin kloroformia (30 ml), minkä jälkeen pestiin toisiaan seuraten vedellä (20 ml x 2), kyllästetylä NaHCC^-liuoksella (20 ml x 2) , kyllästetyllä 25 NaCl-liuoksella (20 ml x 2), ja kuivattiin(MgS04) . Yhdiste 15 (105 mg, 19,7 %) kiteytettiin CHCl3:sta. Sp. 158 °C, D-muoto 158 °C.

UV (metanoli) : larnbdamaks.: 238,50 nm, 273,0 nm.

1H-MMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 8,82 (d, J=l,5Hz, 1H, 30 H-8); 7,49, 8,33 (m, 10H, OBz); 6,767 (kaksois-d, Jh-h=4Hz,

Kf-h=13,8Hz, 1H, H-l'); 5,854 (kaksois-q, J=67,4Hz, 1H, H-2'); 5,910 (m, 1H, H-3'); 4,751 (m, 3H, H-4' ja H-5').

19

Ng-[2'-deoksi-2'-fluori-K-L-arabinofuranosyyli]-2,6-diklooripuriini (16)

Yhdistettä 15 (70 mg, 0,13 mmol) liuotettiin 25 ml:aan kyllästettyä Mth/CIhOHita tiiviiisti suljetussa te-5 räspommissa, ja kuumennettiin 90 °C:ssa 6 tunnin ajan. Poistamalla liuotin alipaineessa saatiin keltainen puolikiinteä aine, jota puhdistettiin preparatiivisella TLCrllä (9:1, CHCI3/CH3OH) . Lyofilisoimalla vedestä ja 1,4-dioksaanista saatiin valkoisena jauheena yhdistettä 16 (30 mg, 75 %).

10 UV (H2O) pH 2, larribdamaks. 212,00 nm, 263,50 nm (eeta 6711); pH 7, lambdamaks. 213,50 nm, 263,00 nm (eeta 7590); pH 11, larnbdamaks. 213,5 nm, 263,00 nm (eeta 5468).

1H-NMR (300 MHz, DMS0-d6) : δ 8,279 (d, J=l,5Hz, 1H, H-8) ; 7,908 (leveä s, 2H, NH2) ; 6,321 (kasois-d, Jh-h=4,4Hz, 15 Jf-h=13,8Hz, 1H, H-l1 ) ; 5,986 (t, 1H, 5 ' -OH) ; 5,230 (kaksois- t, Jf_h=52,6Hz, 1H, H-2 ' ) : 5,115 (d, 1H, 3 '-OH) ; 4,425 (kak-sois-q, Jf_h=19Hz, 1H, H=3' ) ; 3,841 (m, 1H, H-4' ) ; 3,636 (d, 2H, H-5').

Ni-(2'-deoksi-2'-fluori-3', 5'-di-O-bentsyyli-S-L-20 arabinofuranosyyli)tyrniini (17)

Liuokseen, jossa oli yhdistettä 13 (400 mg, 0,86 mmol) vedettömässä CH2Cl2:ssa (10 ml), lisättiin bromivetyä etik-kahapossa (45 % paino/tilavuus, 1,5 ml), ja saatua seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 17 tunnin ajan. Haihdutta-25 maila liuotin eroon ja sitten haihduttamalla yhdessä toluee-nin kanssa saatiin yhdistettä 14.

Samanaikaisesti tymiiniä (215 mg, 1,72 mmol) keitettiin palautusjäähdyttäen HMDS:ssä (25 ml) typpisuoja-kaasussa 17 tunnin ajan homogeenisen liuoksen saamiseksi. 30 Liuotin haihduttamalla saatiin silyloitua tymiiniä.

Liuos, jossa oli yhdistettä 14 dikloorietaanissa (50 ml) lisättiin silyloituun tymiiniin, ja saatua liuosta keitettiin palautusjäähdyttäen typpisuojakaasussa 3 päivän ajan. Lisättiin vettä, minkä jälkeen uutettiin CHCl3:lla. 35 Orgaaninen faasi pestiin vedellä, suolaliuoksella ja kui- 20 vattiin (MgS04) . Haihduttamalla liuotin eroon saatiin raa-katuotetta, jota puhdistettiin preparatiivisella TLC:llä käyttäen 2 % MeOH/CHCl3, jolloin saatiin yhdistettä 17 (235 mg, 58 %) . Sp. 99 - 101 °C.

5 UV (metanoli): 230, 264 nm; [a]D = +22,397.

1H-NMR (CDC13) : δ 7,343 - 8,389 (m, 12H, Ar-H, NH); 6,34 (kaksois-d, JH-H= 2,97Hz, Jf_h= 28,32Hz, 1H, H-l' ) ; 5,383 (kaksois-d, Jh-h=2,7Hz, Jf-H=63,27Hz, 1H, H-2 ’ ) ; 5,565 (kaksois-d, 1H, H-3'); 4,812 (d, 2H, H-5'); 4,466 (m, 1H, 10 H-4'); 1,775 (s, 3H, CH3) .

Koostumusanalyysi (C24H21N2O7F) : C 61,01; H 4,57; N 5,73; F 3,92.

Ni-(2'-deoksi-2'-fluori-ft-L-arabinofuranosyyli)-tyrniini (18) 15 Yhdistettä 17 (145 mg, 0,309 mmol) käsiteltiin NH3/CH3OH:11a huoneenlämpötilassa 18 tunnin ajan. Liuotin eroon haihduttamalla ja sitten jäännöstä preparatiivisella TLC:llä puhdistamalla (15 % MeOH/CHCl3) saatiin yhdistettä 18 (70 mg, 87,5 %). Sp. 174 - 175 °C.

20 UV: 264 nm; [a]D= -104,36.

1H-NMR (DMSO-d6) : δ 11,401 (S, 1H, NH) ; 7,575 (s, 1H, H-6) ; 6,093 (kaksois-d, Jh-h=4,41Hz, Jf_h=15,6Hz, H-l'); 5,844 (d, 1H, 3'-OH); 5,019 (kaksois-t, Jf_h=53,3Hz, 1H, H-2'); 5,087 (t, 1H, 5’-OH); 4,194 (kaksois-q, 1H, H-3'); 25 3,647 (m, 3H, H-4' ja H-5’); 1,781 (s, 3H, CH3) .

Koostumusanalyysi (C10H13N2FO5) : C 44,80; H 4,97; N 10,04; F 7,03 .

Ni- (2 ’ -deoksi-2 1 -fluori-3 ', 5 1 -di-O-bentsoyyli-β-Ιι-arabinofuranosyyli)-5-etyyliurasiili (19) 30 Liuokseen, jossa on yhdistettä 13 vedettömässä di- kloorimetaanissa (10 ml), lisättiin bromivetyä etikkahapossa (45 % paino/tilavuus, 0,97 ml, 5,385 mmol). Liuosta sekoi tettiin huoneenlämpötilassa 18 tunnin ajan, minkä jälkeen haihduttamalla liuotin eroon ja haihduttamalla kuiviin yh-35 dessä tolueenin kanssa saatiin yhdistettä 14.

21

Samanaikaisesti 5-etyyliurasiilia (0,75 g, 5,39 nunol) suspendoitiin HMDS:ään (10 ml) ammoniumsulfaatin (5 mg) kanssa, ja keitettiin palautusjäähdyttäen 5 tunnin ajan typpisuojakaasussa homogeenisen liuoksen saamiseksi.

5 Silyloitu emäs -liuos haihdutettiin kuiviin välttäen kosketusta kosteuteen. Saatuun siirappiin lisättiin liuos, jossa oli yhdistettä 14 vedettömässä 1,2-dikloorietaanissa (10 ml). Reaktioseosta sekoitettiin 95 °C:ssa typpisuojakaasussa 20 tunnin ajan, minkä jälkeen se haihdutettiin tyhjös-10 sä kuiviin, jolloin saatiin keltaista kiinteää ainetta, joka sekoitettiin 5 ml:aan CH3OH/CHCI3 (1:1) ja suodatettiin. Suodos kuiviin haihduttamalla saatiin jäännös, jolla suoritettiin kromatografia-ajo silikageelikolonnissa (CH3OH/CHCI3, 0 - 1 %) , jolloin saatiin valkoisena kiinteänä aineena yh-15 distettä 19 (0,557 g, 100 %).

1H-NMR (DMSO-de) : δ 11,55 (s, 1H, NH) ; 7,51, 8,08 (m, 10H, Ar-H) ; 7,32 (s, 1H, H-6); 6,29, 6,37 (kaksois-d, Jh-h=3,7Hz, Jf-h=20Hz, 1H, H-l'); 5,68 - 5,75 (kaksois-d, Jf_h=20Hz , 1H, H-3 ' ) ; 5,47 - 5,65 (kaksois-d, Jf-h=54Hz, 1H, 20 H-2 ' ) ; 4,62 - 4,83 (m, 3H, H-4' ja H-5') ; 2,01, 2,09 (g, 2H, CH2-CH3) ; 0,85 (t, 3H, CH3) .

Ni-(2 *-deoksi-2'-fluori-fi-L-arabinofuranosyyli)-5-etyyliurasiili (20)

Yhdistettä 19 (500 mg) liuotettiin ammoniakin me- 25 tanoliliuokseen (50 ml), ja sekoitettiin huoneenlämpötilassa 44 tunnin ajan. Liuos kuiviin haihduttamalla saatiin valkoista kiinteää ainetta (0,4 g), jolla suoritettiin kromatografia-ajo silikageelikolonnissa (CH3OH/CHCl3, 0 - 5 %) , jolloin saatiin valkoisena kiinteänä aineena yhdistettä 20 30 (240 mg, 84 %). Sp. 158 - 161 °C.

UV (MeOH) : lambdamaks. 260 nm.

1H-NMR (DMSO-d6) : δ 11,42 (s, 1H, NH) ; 7,57 (s, 1H, H-6'); 6,10, 6,17 (kaksois-d, Jh-H=5,0Hz, Jf-h=14Hz, 1H, H-l'); 5,88 (leveä s, 1H, 3'-OH); 5,14, 5,19 (m, 2H, H-2' 22 ja 5'-OH); 4,98 (t, 1H, H-3') ; 4,22, 4,28 (m, 1H, H-4'); 3,55, 3,78 (m, 2H, H-5').

Koostumusanalyysi (CiiHi5N205F) : C 47,93; H 5,56; N 10,06; F 6,68.

5 Ni- (2 ' -deoksi-2 ' -f luori-3 ', 5 ' -di-O-bentsoyyli-iS-L- arabinofuranosyyli) -t^-bentsoyyli-S-jodisytosiini (21)

Liuokseen, jossa oli yhdistettä 13 (150 mg, 0,323 mmol) vedettömässä metyleenikloridissa (5 ml) , lisättiin bromivetyä etikkahapossa (45 % paino/tilavuus, 0,29 ml, 1,615 mmol). 10 Reaktioseosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 9,5 tunnin ajan. Haihduttamalla liuotin eroon ja sitten haihduttamalla kuiviin yhdessä tolueenin kanssa saatiin yhdistettä 15 keltaisena siirappina.

Samanaikaisesti FT^-bentsoyyli-S-jodisytosiinia (550 mg, 15 1,615 mmol) suspendoitiin HMDS:ään (8 ml) ammoniumsulfaatin (3 mg) kanssa, ja keitettiin palautusjäähdyttäen 5 tunnin ajan typpisuojakaasussa homogeenisen liuoksen saamiseksi.

Silyloitu emäs -liuos haihdutettiin kuiviin välttäen kosketusta kosteuteen. Saatuun siirappiin lisättiin liuos, 20 jossa oli yhdistettä 14 vedettömässä 1,2-dikloorietaanissa (10 ml) . Reaktioseosta keitettiin palautusjäähdyttäen typpisuojakaasussa 23 tunnin ajan, minkä jälkeen se haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin ruskea siirappi, jota tritu-roitiin kloroformissa (30 ml) . Saatu sakka suodatettiin 25 eroon ja pestiin kloroformilla. Suodos ja pesuerät yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin ruskeaa siirappia. Tuoteseos erotettiin kromatografisesti silikageeli-kolonnissa (CH3OH/CHCI3, 0 - 1 %), jolloin saatiin valkoista kiinteää ainetta 21 (100 mg, 45 %) .

30 1H-NMR (CDCI3) : δ 11,40 (leveä s, 1H, NH) ; 7,26, 8,20 (m, 17H, Ar-H, H-6 ja NH) ; 6,36, 6,44 (kaksois-d, Jh-h=2,8Hz, Jf_h=21Hz, 1H, H-l' ) ; 5,62, 5,68 (kaksois-d, 1H, H-3'); 5,39, 5,56 (kaksois-d, 1H, H-21); 4,58, 4,85 (m, 3H, H-41 ja H-51).

23

Ni-(21-deoksi-2'-fluori-S-L-arabinofuranosyyli)-5-jodisytosiini (22)

Yhdistettä 21 (100 mg, 0,27 mmol) käsiteltiin ammoniakilla kyllästetyllä metanolilla (60 ml) huoneenlämpöti-5 lassa 24 tunnin ajan. Suorittamalla kromatografia-ajo sili-kageelikolonnissa (0 - 10 % CH30H/CHC13) saatiin yhdistettä 22 (35 mg, 71 %) valkoisena kiinteänä aineena. [a]D = -65,4 (c=0,34, CH3OH).

UV (MeOH) : larnbdamaks. = 293 nm.

10 1H-NMR (DMSO-de) : δ 8,04 (s, 1H, H-6); 6,74, 7,94 (s, 1H, NH) ; 6,01, 6,08 (kaksois-d, Jh-h=3,9Hz, Jf_h=16,6Hz, 1H, H-1'); 5,85 (d, 1H, 3'-OH); 5,17 (t, 1-H, 5'-OH); 5,08 (t, 1H, H-2 ' ) ; 4,89 (t, 1H, H-3 ' ) ; 4,15 - 4,23 (m, 1H, H-4'); 3,63 - 3,79 (m, 2H, H-5').

15 Ni-(2'-deoksi-2'-fluori-3',5'-di-O-bentsoyyli-β-ΐι- arabinofuranosyyli)-5-jodiurasiili (23)

Liuokseen, jossa oli yhdistettä 13 (260 mg, 0,56 mmol) 10 ml:ssa vedetöntä CH2Cl2:ta, lisättiin HBr/AcOH:ta (45 %, paino/tilavuus, 0,5 ml, 2,8 mmol). Reaktioseosta sekoitet-20 tiin huoneenlämpötilassa 36 tunnin ajan, minkä jälkeen se haihdutettiin kuiviin. Jäännös liuotettiin 20 ml:aan CH2Cl2:ta, pestiin vedellä (10 ml), kyllästetyllä NaHC03-liuoksella (10 ml) ja kuivattiin (MgS04) . Suodattamalla ja suodos kuiviin haihduttamalla saatiin bromisokeria 14 sii-2 5 rappina.

Samanaikaisesti 5-jodiurasiilia (270 mg, 1,12 mmol) suspendoitiin 10 ml:aan HMDSrää ja keitettiin palautus-jäähdyttäen 36 tunnin ajan homogeenisen liuoksen saamiseksi, joka haihdutettiin tyhjössä kuiviin. Jäännökseen li-30 sättiin liuos, jossa oli yhdistettä 14 vedettömässä 1,2-dikloorietaanissa, ja saatua liuosta keitettiin palautus-jäähdyttäen N2-suojakaasussa 1,5 päivän ajan. Lisättiin CHC13 (20 ml) ja liuos pestiin toisiaan seuraten vedellä (10 ml), suolaliuoksella (10 ml) ja kyllästetyllä NaHC03-35 liuoksella (10 ml) ja kuivattiin sitten (MgS04) . Poista- 24 maila liuotin saatiin siirappia, joka CH2Cl2:sta kiteyttämällä saatiin yhdistettä 23 keltaisena kiinteänä aineena (237 mg, 73 %). Osa tästä (70 mg) uudelleenkiteytettiin 2-isopropanolista, jolloin saatiin valkoista kiinteää ainet-5 ta (67 mg).

UV (metanoli) : lambdamaks. 230,0 nm, 276,0 nm.

1H-NMR (CDC13) : δ 8,4, 7,3 (m, 12H, Ar-H) ; 6,29 (kaksois-d, Jh-h=2,43Hz, Jf_h=21,6Hz, 1H, H-l'); 5,377 (kak-sois-d, Jh-h=2,8Hz, Jf-h=61,3Hz, 1H, H-2' ) ; 5,55 (kaksois-d, 10 1H, H-3'); 4,865, 4,793 (d, 2H, H-5'); 4,588, 4,502 (m, 1H, H-41).

Ni-(2'-deoksi-2'-fluori-fi-L-arabinofuranosyyli)-5-jodiurasiili (24)

Yhdistettä 23 (40 mg, 0,069 mmol) liuotettiin 25 ml:aan 15 ammoniakilla kyllästettyä metanolia ja sekoitettiin huoneenlämpötilassa 24 tunnin ajan, minkä jälkeen liuos haihdutettiin kuiviin. Saatua siirappia preparatiivisella TLC:llä puhdistamalla (5:1 CHCl3/MeOH) saatiin yhdistettä 24 kiinteänä aineena (19 mg, 74 %).

2 0 UV (MeOH) : lambdamaks. 2 80,5 nm.

'’H-NMR (DMSO-d6) : δ 11,82 (leveä s, CONH) ; 8,24 (s, 1H, H-6) ; 6,082 (kaksois-d, Jh-h=4,45Hz, Jf_h=13,7, 1H, H-l'); 5,947 (d, 1H, 3'-OH); 5,296 (t, 1H, 5'-OH) ; 5,07 (kaksois-t, Jf-h=53Hz, 1H, H-2'); 4,24 (leveä d, Jf_h=21Hz, 25 1H, H-3'); 3,81, 3,55 (m, 3H, H-4', H-5').

2,3,5-tri-O-bentsyyli-L-arabinoosi

Kuten esitetään kuviossa 9, 30 g (0,2 mol) jauhemaista L-arabinoosia (5) ja sitten 0,4 ml kons. rikkihappoa lisättiin 600 ml:aan (14,8 mol) vedetöntä metanolia. 30 Suspensiota sekoitettiin ja keitettiin kevyesti palautus-jäähdyttäen 2 tunnin ajan kirkkaan liuoksen saamiseksi. Reaktioseos neutraloitiin lisäämällä 1,5 g natriumvetykar-bonaattia, kuivattiin (Na2S04) ja haihdutettiin sitten tyhjössä kuiviin, jolloin saatiin raskasta siirappia 6, jota 35 laimennettiin lisäämällä 50 ml vastapuhdistettua tetrahyd- 25 rofuraania ja haihdutettiin toistamiseen kuiviin (haude 35 - 40 °C) metanoiijäämien poistamiseksi. Vastapuhdistettua tetrahydrofuraania (400 ml) lisättiin ja seokseen lisättiin 30 g Drierite-valmistetta, 156 g (2,78 mol) kalium-5 hydroksidia ja 200 ml (1,74 mol) bentsyylikloridia. Seosta kuumennettiin kevyesti palautusjäähdyttäen yön yli, se jäähdytettiin, suodatettiin ohuen Celite-kerroksen läpi ja haihdutettiin suodosta tyhjössä ja sitten tehokkaassa tyhjössä 100 °C:ssa (haude). Epäpuhdas siirappimainen metyyli-2,3,5-10 tri-O-bentsyyli-L-arabinosidi (7) liuotettiin 400 ml:aan jää-etikkaa. Hydrolyysiseosta kuumennettiin 65 - 70 °C:ssa 2 tunnin ajan, se haihdutettiin tyhjössä 1/3 tilavuuteen ja kaadettiin 2,5 litraan jäävesiseosta. Alkukiteiden (alku-kiteitä saatiin alunperin kromatografisesti dikloorime-15 taanilla eluoiden) lisäyksen jälkeen seosta pidettiin 5 °C:ssa yön yli. Vesifaasi dekantoitiin eroon osittain kiteisestä massasta, joka liuotettiin 200 ml:aan dikloori-metaania. Liuos pestiin natriumvetykarbonaatin kylmällä vesiliuoksella, kuivattiin (Na2SC>4), suodatettiin ohuen pedin 20 läpi väriä poistavaa hiiltä ja haihdutettiin tyhjössä ohueksi siirapiksi, joka liuotettiin 200 ml:aan syklohek-saania. Alkukiteiden lisäyksen jälkeen liuosta pidettiin huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan ja 5 °C:ssa yön yli, jolloin saatiin 27,7 g (33,2 %) 2,3,5-tri-O-bentsyyli-L- 25 arabinoosia (8). Sp. 68 - 73 °C; [a]25D = -1,69 (c=2,01, 9:1 v/v p-dioksaani/vesi).

UV (MeOH) larnbdamaks. 220.

1H-NMR (300 MHz, CDCl3) : δ 3,48 - 3,62 (m, 2H, H- 5); 3,94 - 4,18 (m, 3H, H-2,3,4); 5,33 (d, 1H, J=4,07, H-30 1); 5,29 (s, H-l); 7,25 - 7,33 (m, 15H, aromaatteja).

26 2,3, 5-tri-O-bentsyyli-l-O-(p-nitrobentsoyyli)-L-arabinoosi (9)

Yhdistettä 8 (kuvio 9) (2 g, 4,76 mmol) liuotet tiin 7,5 ml:aan dikloorimetaania, ja tähän liuokseen li-5 sättiin liuos, jossa oli 0,95 g (5,1 mmol) p-nitrobents-oyylikloridia 5 ml: n dikloorimetaania ja 1,5 ml: n pyri-diiniä seoksessa. Reaktioseosta pidettiin huoneenlämpötilassa yön yli, minkä jälkeen se pestiin toisiaan seuraten 1 N kloorivetyhapolla (2 x 10 ml) , natriumvetykarbonaatin 10 vesiliuoksella (2 x 10 ml) ja vedellä (3 x 30 ml). Kosteus poistettiin Na2S04:llä ja liuos haihdutettiin tyhjössä kuiviin, jolloin saatiin 2,67 g (98,4 %) yhdisteen 9 ano-meerien seosta, sp. 68 - 82 °C. Lisäpuhdistus kolonnikro-matografisesti silikageelissä (heksaaniseos/asetoni 8:1) 15 nosti sulamispisteen 89 - 93 °C:seen; [a]D = 13,04 (c=6,8, CH2C12) .

UV (MeOH) larnbdamaks. 215,5 ja 258,5.

1H-NMR (250 MHz, CDC13) : δ 3,54 - 3,69 (m, 2H, H- 5); 4,06 (m, 1H, H-4' ) ; 4,22 (m, 1H, H-3 ’ ) ; 4,33 (m, 1H, 20 H-2' ) ; 4,38 - 4,78 (m, 6H, bentsyyli-CH2) ; 6,50 (d, 1H, J=2,35, H-l); 7,23 - 7,36 (m, 15H, aromaattisia vetyjä bentsyyliryhmästä) ; 8,01 - 8,25 (m, 4H, aromaattisia ve tyjä nitrobentsoyyliryhmästä) .

10- (2,3,4-tri-0-bentSYyli-lS-L-arabinosyyli) tyrniini 25 (12)

Tymiiniä (0,444 g, 3,52 mmol) ja ammoniumsulfaat-tia (2 mg) suspendoitiin heksametyylidisilatsaaniin (10 ml) ja keitettiin palautusjäähdyttäen (140 °C) yön yli argon-suo jakaasussa kirkkaan liuoksen saamiseksi. Heksametyyli-30 disilatsaaniylimäärä poistettiin tyhjössä välttäen koske tusta kosteuteen, jolloin saatiin siirappia 11.

Yhdistettä 9 (1 g, 1,76 mmol) lisättiin 17 ml:aan dikloorimetaania, joka oli esikyllästetty vedettömällä kloorivedyllä, 0 °C:ssa. 2 tunnin 0 °C:ssa kuluttua saostunut 35 p-nitrobentsoehappo (0,25 g) poistettiin suodattamalla ja 27 suodos haihdutettiin tyhjössä ohueksi siirapiksi, jota käsiteltiin sitten tehokkaalla tyhjöpumpulla huoneenlämpötilassa 2 tunnin ajan, jolloin saatiin 2,3,5-tri-0-bents-yyli-a-L-arabinosyylikloridia (10).

5 Näin valmistettua yhdistettä 10 liuotettiin 15 ml:aan vedetöntä dikloorimetaania, ja liuos lisättiin seokseen, jossa oli silyloitua tymiiniä (11) ja 3 g 4 Ä:n molekyy-liseula-ainetta. Reaktioseosta sekoitettiin huoneenlämpö-tilassa argonsuojakaasussa 18 tunnin ajan. Reaktioseosta 10 laimennettiin lisäämällä 50 ml dikloorimetaania ja se kaadettiin 2 ml:aan NaHC03:n kyllästettyä vesiliuosta samalla kiivaasti sekoittaen. Muodostui valkoinen sakka (tinahyd-roksidia), joka suodatettiin eroon Celite-pedillä. Orgaaninen faasi erotettiin vedestä ja pestiin vedellä (3 x 30 15 ml). Vesifaasia uutettiin dikloorimetaanilla, ja yhdistetty dikloorimetaanifaasi kuivattiin Na2S04:llä ja haihdutettiin sitten tyhjössä siirapiksi, jota kolonnikromato-grafisesti silikageelissä puhdistamalla (kloroformi/me-tanoli, 100:1) saatiin yhdistettä 12 siirappina (0,68 g, 20 73 %) . [a]D = -56,71 (c=0,6, CH2C12) .

UV (MeOH) larnbdamaks. 218 ja 265.

1H-NMR (300 MHz, CDC13) : δ 1,67 (d, 3H, J=l,ll, CH3); 3,66 - 3,70 (m, 2H, H-5' ) ; 4,06 (m, 1H, H-4') ; 4,13 (t, 1H, J=4,7, H-3 ' ) ; 4,24 (t, 1H, J=4,7, H-2 ' ) ; 4,41, 25 4,54, 4,56 (m, 6H, bentsyyli-CH2) ; 6,28 (d, 1H, J=5,24, H-l'); 7,15 - 7,33 (m, 15H, aromaattisia vetyjä); 7,43 (d, 1H, J=l,31, H-6).

Ι-β-L-arabinofuranosyylityrniini (13)

Palladiumkloridia (680 mg, 3,835 mmol) suspendoi-30 tiin 100 ml:aan metanolia, ja suoritettiin pelkistys ravistamalla vedyn kanssa huoneenlämpötilassa. Palladium-mustan happamaan suspensioon lisättiin sitten liuos, jossa oli 450 mg yhdistettä 12 25 ml:ssa metanolia. Reaktioseosta ravistettiin vedyn kanssa huoneenlämpötilassa 38 tunnin 35 ajan. Katalysaattorin poistamisen jälkeen liuos neutraloi- 28 tiin lisäämällä Dowex-valmistetta (HCO3-) pH:hon 7, minkä jälkeen se haihdutettiin tyhjössä valkoiseksi kiinteäksi aineeksi, joka etanolista uudelleenkiteyttämällä saatiin yhdistettä 13 (105 mg, 47,7 %) . Sp. 244 - 249 °C; [a]D = 5 -91,48 (c=0,25, H20).

IR (KBr) : 1750, 1600 cm'1 (CO); UV (MeOH) : lamb- dämaks. 2 68.

1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 1,76 (s, 3H, CH3) ; 3,62 (t, 2H, J=4,56, H-5’); 3,69 (m, 1H, H-4' ) ; 3,90 t, 10 1H, J=3,88, H-3'); 3,99 (t, 1H, J=4,10, H-2'); 5,08 (leveä s, 1H, C'5-OH, vaihtokelpoinen); 5,42 (d, 1H, J=4,24, C'2-OH tai C'3-OH, vaihtokelpoinen); 5,54 (d, 1H, J=5,23, C'2-OH tai C'3-OH, vaihtokelpoinen); 5,97 (d, 1H, J=4,64, H- 1'); 7,51 (d, 1H, J=0,97, H-6); 11,26 (s, 1H, NH, 15 vaihtokelpoinen).

Koostumusanalyysi CioHi4N206: lie: laskettu C 46,51; H 5,46; N 10,85; todettu C 46,67; H 5,63; N 10,56.

1-(2,3,5-tri-0-bentsyyli-S-L-arabinosyyli)syto-siini (15) 20 Sytosiinia (0,61 g, 6 mmol) ja ammoniumsulfaattia (2 mg) suspendoitiin heksametyylidisilatsaaniin (15 ml), ja keitettiin palautusjäähdyttäen (140 °C) typpisuojakaasussa 2 tunnin ajan kirkkaan liuoksen saamiseksi. Silyloitu sy-tosiiniseos haihdutettiin tyhjössä kuiviin välttäen koske-25 tusta kosteuteen, jolloin saatiin siirappia 14.

Yhdistettä 9 (2,82 g, 5 mmol) lisättiin 47 ml:aan kuivaa dikloorimetaania, joka oli esikyllästetty vedettömällä kloorivedyllä, 0 °C:ssa. 2 tunnin 0 °C:ssa kuluttua saostunut p-nitrobentsoehappo (0,807 g) poistettiin suo-30 dattamalla ja suodos haihdutettiin tyhjössä kuiviin, jolloin saatiin siirappimaista 2,3,5-tri-O-bentsyyli-a-L-ara-binosyylikloridia (10).

Näin valmistettua yhdistettä 10 liuotettiin 28,5 ml:aan vedetöntä dikloorimetaania, ja liuos lisättiin seokseen, 35 jossa oli silyloitua sytosiinia (14) ja 8,3 g 4 Ä:n mole- 29 kyyliseula-ainetta. Reaktioseosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa typpisuojakaasussa 5 päivän ajan. Sitten reaktioseosta laimennettiin lisäämällä 50 ml dikloorimetaania ja 2 0 ml vettä, ja se kaadettiin 2 ml:aan NaHC03:n kylläs-5 tettyä vesiliuosta samalla kiivaasti sekoittaen. Muodostui valkoinen sakka (tinahydroksidia), joka suodatettiin eroon Celite-pedillä. Orgaaninen faasi erotettiin vedestä ja pestiin vedellä (3 x 30 ml) . Vesifaasia uutettiin dikloo-rimetaanilla, ja yhdistetty dikloorimetaanifaasi kuivat-10 tiin Na2S04:llä ja haihdutettiin sitten tyhjössä siirapiksi, jota kolonnikromatografisesti silikageelissä puhdistamalla (kloroformi/metanoli 96:4) saatiin yhdistettä 15 valkoisena kiinteänä aineena, joka 2-propanolista uudel-leenkiteyttämällä saatiin 1,53 g (60 %) yhdistettä. Sp. 15 146 - 148 °C; [a]25D = -105,2 (Cl, CH2C12) .

UV (MeOH) : larnbdamaks. 211,5, larnbdamin. 272,5, pH 1, pH 7; larnbdamaks. 211,5, lambda^in. 284, pH 9.

^-NMR (300 MHz, CDC13) : δ 3,65 (d, 2H, J=4,85, H-5 ' ) ; 4,00 (t, 1H, J=3,72, H-3 ' ) ; 4,11 (m, 1H, H-4 ' ) ; 20 4,28 (m, 1H, H-2 1 ) ; 4,38 - 4,55 (m, 6H, bentsyyli-CH2) ; 5,56 (d, 1H, J=7,5, H-5); 6,39 (d, 1H, J=4,59, H-l'); 7,12 - 7,31 (m, 15H, aromaattisia vetyjä); 7,63 (d, 1H, J=7,5, H-6).

Ι-β-L-arabinofuranosyylisytosiinin hydrokloridi-25 suola (16) hydraamalla katalyyttisestä, yhdistettä 15

Palladiumkloridia (315 mg, 1,78 mmol) suspendoi-tiin 160 ml-.aan metanolia, ja suoritettiin pelkistäminen ravistamalla vedyn kanssa huoneenlämpötilassa. Palladium-mustan happamaan suspensioon lisättiin sitten liuos, jossa 30 oli 300 mg yhdistettä 15 54 ml:ssa metanolia. Reaktioseosta ravistettiin vedyn kanssa huoneenlämpötilassa 3 tunnin ajan. Kun katalysaattori oli poistettu, liuos neutraloitiin lisäämällä Dowex-valmistetta (HCO3-) ja se haihdutettiin tyhjössä kuiviin, minkä jälkeen jäännöstä puhdistet-35 tiin preparatiivisella TLC:llä (MeOH/CHCl3 3:5), jolloin 30 saatiin siirappia, joka liuotettiin 3 mlraan metanolia, lisättiin HCl:n l-%:ista liuosta MeOH:ssa pH:hon 1, haihdutettiin kuiviin ja trituroitiin jäännöstä 2-propano-lissa, jolloin saatiin 36 mg (22,1 %) yhdistettä 16. Sp.

5 190 - 194 °C; [a]25D = -115,47 (c=0,07, H20) .

UV (H20) lambdamaks. 275, pH 7; lambdamaks. 2 09,5, 273, pH 11; lambdamaks. 280, pH 1.

1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 3,61 (d, 2H, H-5' ) ; 3,82 (m, 1H, H-4' ) ; 3,93 (m, 1H, H-2' tai H-31 ) ; 4,04 10 (leveä s, 1H, H-2' tai H-3'); 5,18 (leveä s, 1H, C5'-OH, vaihtokelpoinen); 5,61 (leveä s, 1H, C2'-OH tai C3'-OH, vaihtokelpoinen); 5,67 (leveä s, 1H, C2'-OH tai C3'-OH, vaihtokelpoinen); 6,00 (d, 1H, J=4,02, H-l'); 6,01 (d, 1H, J5,6=7,8, H-5); 7,92 (d, 1H, J5,6=7,8, H-6); 8,49 (leveä s, 15 1H, NH, vaihtokelpoinen); 9,38 (leveä s, 1H, NH, vaihtokelpoinen).

Ι-β-L-arabinofuranosyylisytosiinin hydrokloridi-suola (16) käsittelemällä yhdistettä 15 booritrikloridilla 5 ml booritrikloridin 1 M liuosta dikloorimetaa-20 nissa jäähdytettiin -72 °C:seen (kuivajää/asetoni). Boori-trikloridiliuokseen lisättiin hitaasti liuos, jossa oli yhdistettä 15 (180 mg, 0,351 mmol) 3 ml:ssa dikloorimetaa-nia. 2,75 tunnin kokonaisreaktioajan jälkeen jäähdytys-haude poistettiin ja liuotin ja kaasu poistettiin tyhjös-25 sä. Jäännös liuotettiin kylmään dikloorimetaaniin (10 ml) ja liuos haihdutettiin kuiviin (3 kertaan kunnes saatiin valkoinen kiinteä jäännös), ja jäänökseen lisättiin kylmää kyllästettyä natriumvetykarbonaattiliuosta pH: n säätämiseksi arvoon 6-7. Seosta laimennettiin lisäämällä etano-30 lia, se kuumennettiin kiehuvaksi, lisättiin hiiltä ja suodatettiin. Suodos haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin siirappia, joka liuotettiin 3 ml:aan metanolia, lisättiin HCl:n l-%:ista liuosta metanolissa pH:hon 1, haihdutettiin kuiviin ja trituroitiin 2-propanolissa, jolloin saatiin 35 yhdistettä 16 (66 mg, 78,4 %).

(18) 31 9-(2,3,5-tri-0-bentsyyli-fc-L-arabinosyyli) adeniini

Perusteellisesti kuivattua yhdistettä 9 (5 g, 8,8 mmol) lisättiin 82 ml:aan dikloorimetaania, joka oli esi-5 kyllätetty vedettömällä kloorivedyllä, 0 °C:ssa. 2 tunnin reaktioajan jälkeen 0 °C:ssa saostunut p-nitrobentsoehappo (1,53 g) poistettiin suodattamalla, ja suodos haihdutettiin tyhjössä siirapiksi, jota pidettiin sitten täydellisessä tyhjössä huoneenlämpötilassa 2 tunnin ajan. Näin 10 valmistettu 2,3,5-tri-O-bentsyyli-a-L-arabinosyylikloridi (10) liuotettiin 50 ml:aan dikloorimetaania, ja liuos lisättiin seokseen, jossa oli 4,5 g (18,8 mmol) kuivattua N-bentsoyyliadeniinia5 (17) ja 14,5 g 4 Ä:n molekyyliseula-ainetta. Reaktioseosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 1 15 viikon ajan, se suodatettiin Celite-pedin läpi, ja haihdutettiin tyhjössä siirapiksi, jolla suoritettiin kromato-grafia-ajo silikageelissä käyttäen eluoinnissa heksaa-niseos/asetonia (3:1, Rf = 0,22). Tuote erotettiin ja haihdutettiin tyhjössä siirapiksi, joka liuotettiin ammoniakin 20 metanolilluokseen (20 ml), jossa sitä sekoitettiin ruostu mattomasta teräksestä valmistetussa pommissa, ja kuumennettiin yön yli 50 - 55 °C:ssa. Sitten liuos haihdutettiin alipaineessa puolikiinteäksi aineeksi, joka uudelleenki-teytettiin lämpimästä isopropyylialkoholista, jolloin saa-25 tiin yhdistettä 18 2,4 g (50,7 %) . Sp. 128 - 129 °C; [a]27D = -20,4 (c=l, 04 , CH2C12) .

UV (CH2C12) : larnbdamaks. 213, 258,5.

1H-NMR (250 MHz, CDC13) : δ 1,95 (leveä S, 1H, NH, vaihtokelpoinen); 3,69 (d, 2H, J=4,82, H-5'); 4,18 - 4,30 30 (m, 6H, bentsyyli-CH2) ; 4,51 - 4,64 (m, 3H, H-2', 3', 4'); 5,73 (leveä s, 1H, NH, vaihtokelpoinen); 6,52 (d, 1H, J=4,00, H-l' ) ; 6,89 - 6,93, 7,17 - 7,37 (m, 15H, aromaattisia vetyjä bentsyyliryhmästä) ; 8,17 (s, 1H, H-2 tai H-8); 8,32 (s, 1H, H-2 tai H-8).

32 9-β-L-arabinofuranosyyliadeniini (19) 5 ml liuosta, jossa oli booritrikloridin 1 M liuosta dikloorimetaanissa, jäähdytettiin -72 °C:seen (kuiva-jää/asetoni). Liuos, jossa oli yhdistettä 18 (150 mg, 5 0,279 mmol) 5 ml:ssa dikloorimetaania, lisättiin hitaasti booritrikloridiliuokseen. Kaikkiaan 3,5 tunnin reaktioajan jälkeen jäähdytyshaude poistettiin ja liuotin ja kaasu poistettiin tyhjössä. Jäännös liuotettiin kylmään dikloo-rimetaaniin (10 ml) ja liuos haihdutettiin kuiviin (6 ker-10 taan kunnes saatiin keltainen kiinteä jäännös). Kylmää kyllästettyä natriumvetykarbonaattiliuosta lisättiin pH:n säätämiseksi arvoon 7-8. Seosta laimennettiin etanolilla, se kuumennettiin kiehuvaksi, suspensio suodatettiin Celite-valmisteen läpi ja suodos haihdutettiin tyhjössä 15 siirapiksi, joka kiteytettiin vedestä, jolloin saatiin 55 mg (74 %) yhdistettä 19. Sp. 256 - 258 °C.

UV (H20) : larnbdamaks. 259.

1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 3,62 - 3,66 (m, 2H, H-5' ) ; 3,77 (leveä s, 1H, H-4' ) ; 4,13 (leveä s, 2H, H-2 ' , 20 3'); 5,12 (t, 1H, J=5,4, C'5-OH, vaihtokelpoinen); 5,54 (d, 1H, J=3,78, C'2-OH tai C'3-OH, vaihtokelpoinen); 5,63 (d, 1H, J=4,32, C'2-OH tai C'3-OH, vaihtokelpoinen); 6,25 (d, 1H, J=4,02, H-l'); 7,25 (leveä s, 2H, NH2, vaihtokelpoinen); 8,13 (s, lH-H-2 tai H-8); 8,18 (s, 1H, H-2 tai 25 H8).

Kuviossa 10 esitetään vaihtoehtoinen tie 1-O-ase- tyyli-2,3,5-tri-0-bentsoyyli-6-L-ribofuranoosin (yhdiste 10) valmistamiseksi 1,2-di-O-isopropylideeni-a-L-ksylofuranoo-sista (yhdiste 3).

30 1,2-di-O-isopropylideeni-a-L-ksylofuranoosi (3) 650 ml:aan vedetöntä asetonia lisättiin 4 ml kons. rikkihappoa, 5 g molekyyliseula-ainetta (4 Ä) , 80 g vedetöntä kupari(2)sulfaattia ja 40 g L-ksyloosia. Seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 36 tunnin ajan, minkä jäl-35 keen reaktioseos suodatettiin ja pestiin perusteellisesti 33 asetonilla, yhdistetty suodos neutraloitiin lisäämällä am-moniumhydroksidia ja haihdutettiin sitten kuiviin. Etyyliasetaattia (200 ml) lisättiin, minkä jälkeen suodatettiin ja haihdutettiin suodos kuiviin, jolloin saatiin öljy, jo-5 ka liuotettiin 250 ml:aan 0,2-%:ista HCl:ää ja liuosta sekoitettiin 2,5 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. pH säädettiin 8:ksi lisäämällä kyllästettyä NaHC03-liuos ta, minkä jälkeen liuos haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä uutettiin etyyliasetaatilla, minkä jälkeen liuotin poistamalla saa-10 tiin keltaisena öljynä yhdistettä 3 (41,7 g, 82,3 %).

1H-NMR (CDC13) : δ 5,979 (d, J=3,78Hz, 1H, H-l); 4,519 (d, J=3,6Hz, 1H, H-2); 4,308 (leveä d, 1H, H-3); 4,080 (m, 3H, H-4 ja H-5); 1,321 (s, 3H, CH3) ; 1,253 (s, 3H, CH3) .

15 5-O-bentsoyyli-1# 2-di-O-i sopropylideeni -<x-L-ksylo- furanoosi (25)

Yhdistettä 3 (41 g, 215,6 mmol) sekoitettiin pyri-diinissä (150 ml) ja CH2Cl2:ssa (150 ml) 0 °C:ssa. Seokseen lisättiin tipoittain liuos, jossa oli BzClrää (27,5 ml, 20 237 mmol) 30 ml:ssa pyridiiniä. 30 minuutin kuluttua li sättiin vettä (5 ml) ja seos haihdutettiin kuiviin, jäännös liuotettiin EtOAc:hen, liuos pestiin kyllästetyllä NaHC03-liuoksella ja kuivattiin sitten (Na2SC>4) . Haihduttamalla liuotin pois saatiin oranssin värinen siirappi, jos-25 ta Et20:sta kiteyttämällä saatiin yhdistettä 20 (36 g).

Emäneste haihdutettiin kuiviin, ja jäännöstä puhdistettiin kolonnikromatografisesti silikageelissä (1 % CH3OH/CHCl3) , jolloin saatiin toinen erä yhdistettä 25 (12 g, kokonaissaanto 76 %) . Sp. 82 - 83 °C; kirj.1 D-muoto: 83,5 - 84,5 °C.

30 1H-NMR (CDCI3) : δ 7,43, 8,07 (m, 5H, Ar-H) ; 5,97 (d, 1H, J=3,6Hz, H-l); 4,80 (q, 1H, H-4); 4,60 (d, 1H, J=3,6Hz, H-2); 4,40, 4,20 (m, 3H, H-5, H-5', H-3); 3,50 (leveä s, 1H, D20-vaihto, 30H); 1,51, 1,32 (2s, 6H, 2CH3) .

34 5-O-bentsoyyli-1,2-di-O-isopropylideeni-a-L-eryt-ropentofuranos-3-uloosi (26)

Yhdistettä 25 (40 g, 136 mmol) sekoitettiin 450 ml:ssa CH2Cl2:ta. Tähän lisättiin pyridiniumdikromaattia (PDC, 30,7 g, 5 81,6 mmol) ja Ac20:ta (42,3 ml, 448,8 mmol). Seosta kei tettiin palautusjäähdyttäen 2,5 tunnin ajan, minkä jälkeen liuos haihdutettiin 1/5:aan alkuperäisestä tilavuudestaan, minkä jälkeen etyyliasetaattia (50 ml) lisättiin ja liuos suodatettiin. Suodos kaadettiin silikageelityynylle (10 cm 10 x 5 cm), eluoitiin EtOAc:llä, haihdutettiin yhdistetty eluaatti kuiviin ja haihdutettiin jäännös kuiviin yhdessä tolueenin kanssa (50 ml x 2). Kiteyttämällä heksaanista ja EtOAc:stä saatiin yhdistettä 21 valkoisena kiinteänä aineena (38 g, 96 %) . Sp. 91 - 93 °C; [a]D = -132° (c=l,0, 15 CHCls); kirj.2 D-muoto: sp. 93-94,5 °C; [a]D: +135° (c=l,0, CHCI3) .

IR (KBr) : 1773 cm'1 (ArCO) , 1730 cm'1 (CO).

1H-NMR (CDCI3) : δ 7,97, 7,42 (m, 5H, Ar-H) ; 6,14 (d, 1H, J=4,4Hz, H-l); 4,74, 4,68 (m, 2H, H-4, H-2); 4,50, 20 4,44 (m, 2H, H-5, H-5'); 1,52, 1,44 (2s, 6H, 2CH3).

Koostumusanalyysi (Ci5Hi606) : laskettu C 61,64; H 5,52; todettu C 61,42; H 5,53.

5-O-bentsoyy1i-1#2-di-O-isopropylideeni-a-L-eryt-ropentofuranos-3-uloosi (26) 25 Yhdistettä 25 (40 g, 136 mmol) sekoitettiin 450 ml:ssa CH2Cl2:ta. Tähän lisättiin pyridiniumdikromaattia (PDC, 30,7 g, 81,6 mmol) ja Ac20:ta (42,3 ml, 448,8 mmol). Seosta keitettiin palautusjäähdyttäen 2,5 tunnin ajan, minkä jälkeen liuos konsentroitiin 1/5:aan alkuperäisestä tilavuudes-30 taan, minkä jälkeen lisättiin EtOAc:tä (50 ml). Liuos suodatettiin, suodos kaadettiin silikageelityynylle (10 cm x 5 cm), eluoitiin EtOAc:llä, haihdutettiin yhdistetty eluaatti kuiviin, ja haihdutettiin jäännös kuiviin yhdessä tolueenin kanssa (50 ml x 2). Heksaanista ja EtOAc:stä ki-35 teyttämällä saatiin yhdistettä 26 valkoisena kiinteänä ai- 35 neena (38 g, 96 %) . Sp. 91 - 93 °C; [a]D: -132° (c=l,Of CHC13) ; kirj.2 D-muoto: sp. 93 - 94,5 °C; [a]D = +135° (c=l,0, CHCI3) .

IR (KBr) : 1773 cm'1 (ArCO) , 1730 cm'1 (CO).

5 1H-NMR (CDCI3) : δ 7,97, 7,42 (m, 5H, Ar-H) ; 6,14 (d, 1H, J=4,4Hz, H-l); 4,74, 4,68 (m, 2H, H-4, H-2); 4,50, 4,44 (m, 2H, H-5, H-5'); 1,52, 1,44 (2s, 6H, 2CH3) .

Koostumusanalyysi (Ci5Hi606) : laskettu C 61,64; H 5,52; todettu: C 61,42; H 5,53.

10 l,2-di-0-isopropylideeni-a-L-ribo£uranoosi (27)

Yhdistettä 26 (37 g, 127 mmol) liuotettiin EtOH/ H20:hon (400 ml/100 ml) 0 °C:ssa samalla, kun lisättiin pieninä erinä NaBH4: ää (23,3 g, 612 mmol). Suspensiota sekoitettiin huoneenlämpötilassa 4 tunnin ajan. Se suodatet-15 tiin ja suodos haihdutettiin kuiviin sekä haihdutettiin kuiviin metanolin kanssa. Suorittamalla jäännöksen kroma-tografia-ajo silikageelikolonnissa (0 - 15 % CH3OH/CH2CI2) sekä EtOAc/heksaanista kiteyttämällä saatiin yhdistettä 27 valkoisina neulasina (19 g, 79 %) . Sp. 86 - 87 °C; [a]D = 2 0 -31,5° (c=0,62, CHC13) ; kirj.3 D-muoto: sp. 86 - 87 °C; [a]D (c=0,59 , CHCI3) IR (KBr) : 3356 cm'1 (OH) .

1H-NMR (CDCI3) : δ 5,83 (d, 1H, J=3,98Hz, H-l) ; 4,595 (t, 1H, H-2); 4,055, 3,72 (m, 4H, H-3, H-4, H-5, H-25 5'); 2,38 (d, 1H, D20-vaihto, 3-OH) ; 1,83 (t, 1H, D20- vaihto, 5-OH); 1,58, 1,38 (2s, 6H, 2CH3) .

Koostumusanalyysi (C8H14O5) : laskettu C 50,50; H 7,42; todettu C 50,62; H 7,46.

3,5-di-O-bent soyyli -1,2-di-O-isopropylideeni-<x-L- 3 0 ribofuranoosi (28)

Yhdistettä 27 (19 g, 100 mmol) sekoitettiin 300 ml:ssa pyridiiniä 0 °C:ssa samalla, kun BzCl:ää (40 ml, 348 mmol) lisättiin tipoittain, minkä jälkeen sekoitettiin huoneenlämpötilassa 3 tunnin ajan, ja haihdutettiin liuotin 35 eroon. Jäännöstä uutettiin EtOAc:llä, pestiin kyllästetyl- 36 lä NaHC03-liuoksella, kuivattiin (Na2S04) , haihdutettiin liuotin kuiviin ja kiteytettiin kummasta tahansa, jolloin saatiin ydhistettä 23 valkoisena kiinteänä aineena (39 g, 98 %). Sp. 83 - 85 °C.

5 1H-NMR (CDC13) : δ 8,07, 7,36 (m, 10H, Ar-H) ; 5,94 (d, 1H, J=3,6Hz, H-l); 5,05, 5,00 (m, 1H, H-2); 4,73, 4,63 (m, 3H, H-4, H-5, H-5'); 1,58, 1,35 (2s, 6H, 2CH3).

Koostumusanalyysi (C22H22O7) : laskettu C 66,50; H 5,64; todettu C 66,32; H 5,57.

10 1-O-asetyyli-2,3,5-tri-O-bentsoyyli-β-L-ribofura- noosi (31)

Yhdistettä 28 (38 g, 95 mmol) sekoitettiin 300 ml:ssa 1 % HCl/CH30H:ta huoneenlämpötilassa 3 0 tunnin ajan. Lisättiin pyridiiniä (20 ml), minkä jälkeen liuos haihdutet-15 tiin kuiviin. Jäännös haihdutettiin kuiviin yhdessä pyri-diinin kanssa (30 ml x 2), minkä jälkeen jäännös liuotettiin 100 ml:aan vedetöntä pyridiiniä 0 °C:ssa samalla, kun BzCl:ää (17 ml, 146 mmol) lisättiin tipoittain, minkä jälkeen sekoitettiin huoneenlämpötilassa 3 tunnin ajan. Liuo-20 tin haihdutettiin eroon ja jäännös liuotettiin EtOAc:hen, pestiin 0,5 N Helillä ja sitten kyllästetyllä NaHC03-liuok-sella ja kuivattiin sitten (Na2S04) · Haihduttamlla liuotin eroon saatiin yhdistettä 30 siirappina.

Epäpuhdasta yhdistettä 30 sekoitettiin jääetikassa 25 (400 ml) ja sitten Ac20:ssa (100 ml) 0 °C:ssa samalla, kun lisättiin tipoittain kons. H2S04:ää (10 ml). Tätä liuosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa yön yli. Seos kaadettiin jääveteen, uutettiin CHCl3:lla, neutraloitiin kyllästetyllä NaHC03-liuoksella ja kuivattiin sitten (Na2S04) . Liuot-30 timen eroon haihdutuksen jälkeen saatiin vaaleankeltainen siirappi, joka metanolista kiteyttämällä saatiin yhdistettä 31 valkoisena kiinteänä aineena (23,89 g, 49,6 % yhdisteistä 28 - 31). Sp. 124,7 °C; [a]D = 45,613 (c=l,0, CHC13) ; kirj.4 sp. = 129 - 130 °C; [a]D=-43,6 (c=l,0, CHC13) .

37 1H-NMR (CDC13) : δ 7,317, 8,134 (m, 15H, OBz); 6,437 (s, 1H, H-l); 5,835 (m, 2H, H-2 ja H-3); 4,649 (m, 3H, H-4 ja H-5); 2,003 (s, 3H, CH3COO") .

II. Biologinen aktiivisuus 5 Tässä julkistettujen yhdisteiden aktiivisuutta HBV:tä ja EBV:tä vastaan voidaan arvioida kuten alla yksityiskohtaisesti selostetaan, tai muilla, alan ammattilaisille tutuilla menetelmillä.

Esimerkki 1 10 Biologinen aktiivisuus HBV:tä vastaan Tässä määrityksessä käytettiin ihmisen HBV-tar-tutettuja maksasoluja (2.2.15-soluja). Näitä soluja kasva-tetiin yhteenkasvuun oleellisessa minimivaaatimuskasvu-alustassa, jossa oli 10 % nautasikiöseerumia. Kasvualusta 15 vaihdettiin 3 päivän välein. Kun yhteenkasvu oli saavutettu, käynnistettiin käsittely lääkkeillä, minkä jälkeen sitä jatkettiin 3 päivän ajan. Toinen lisäys lääkettä samana pitoisuutena annettiin tämän jälkeen kasvualustan poistamisen jälkeen viljelmistä ja viljelmiä ylläpidettiin vielä 20 3 päivän ajan. Kasvualusta 6 päivän käsittelyn jälkeen otettiin talteen, ja viruspartikkelit saostettiin polyety-leeniglykolimenetelmällä. Hiukkaset hajotettiin sitten, minkä jälkeen ne prosesoitiin Southern-analyysiä varten. Blot-siirrot hybridisoitiin HBV-spesifiseen koettimeen ja 25 viraalisen DNA:n määrät määritettiin verrattuna DNA-tasoi-hin viljelmistä, joita ei ollut käsitelty lääkkeillä. Ge-nomi-DNA pilkottiin HindIII:lla ja sillä suoritettiin Southern-analyysi. Episomaalisen DNA:n tasot määritettiin suhteessa integroituun HBV-DNA:hän. Laskettiin lääkepitoi-30 suudet, jotka aiheuttavat DNA:n 50 %:n inhibition (ID50) verrattuna verrokkeihin. Tuloksista esitetään yhteenveto taulukossa I.

38 <<*-v +) I o co

o ' in rH

Q ffi O O

U w o o o o o o o 1—I LO 0\3 CTi U o Q ° ° U ° °

^ rH O O i-H

Λ rH Ch Λ

CM S

U Q

a u σ» o I o o o o o

rH 00 rH rH

co

P

P

:(d CO

ιΗ -H

H t>

rl -rH

<D -rl Ό +)

rl AS

CO Π)

0 I

Φ > cr H W § A!

P I

fi -H o O

1 -Pm i—I O O < hi ö Q » - - m rij H o cm m Λ H -P Ö •r) 0 Λ

rH H

A3 O Ö A! -H 0)

A! -P D P D D

P (3 W C pH < til

H ·· -H S S W W

P > Ό h h fa ti

cd PQ Ai I I I I

Eh IB in ι-q Q Q ^ 39

Esimerkki 2

Biologinen aktiivisuus EBV:tä vastaan

Hl-soluja pidettiin pitkän faasin kasvussa 2 päivän ajan ennen käsittelyn aloittamista. Soluja sentrifu-5 goitiin 600 x g:ssä 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa niiden erottamiseksi kasvualustasta, joka sisälsi ennalta esiintyviä viruspartikkeleita. Hl-solut siirrostettiin 24-kuoppalevyille tiheydeksi 1 x 105 solua/kuoppa 2 ml:ssa tuoretta kasvualustaa lääkkeellä tai ilman ja inkuboitiin 10 37 °C:ssa 5 päivän ajan. Virionin sisältävä kasvualusta säästettiin ja sitä käytettiin lääkkeiden inhibitovaiku-tuuksen arvioimiseksi virustuotantoon ja viruksen tartu-tuskykyyn biomääritystä käyttämällä. Virionit pelletoitiin soluvapaasta kasvualustasta sentrifugoimalla kierrosnopeu-15 della 45 000 rpm 90 minuutin ajan käyttäen SW-50 Ti -roottoria (Beckman). Virionit uudelleensuspendoitiin 1 ml:aan kasvualustaa, minkä jälkeen niitä käytettiin 1 x 106 Raji-solun tartuttamiseksi 48 tunnin aikana. Koska EBV-DP-aktiivisuuden taso Raji-soluissa superinfektoinnin jälkeen 20 on verrannollinen lisättyjen virionien määrään, kyettiin mittaamaan indusoitu EBV-spesifinen DP-aktiivisuus. Inhiboiva lääkevaikutus laskettiin vertaamalla EBV-DP-aktii-visuutta monilaimennosverrokkeihin. Mitään mitokondria-DNA-sisällön inhibitiota Hl-soluissa ei havaittu käsitel-25 täessä soluja pitoisuudella 1 mM L-FMAU 6 päivän ajan.

Slot blot -määritys

Mitokondriaalisen DNA:n määrä mitattiin slot blot -menetelmällä (2). 2 x 105 käsitellyssä ja ei-käsitellyssä Hl-solussa aiheutettiin lyysi 200 pl:ssa 10 mM Tris-HCl-30 liuosta (pH 7,5) jäädytys/sulatus-menetelmällä. Soluly-saattia käsiteltiin 10 pg:lla/ml RN-aasi-A:ta 37 °C:ssa 30 minuutin ajan, ja sitten proteinaasi-K:11a (100 pg/ml) 55 °C:ssa 2 tunnin ajan. Samat määrät 2 X SSC-puskuria lisättiin kuhunkin solulysaattiin. 10 minuutin keittämisen 35 jälkeen näytteet sijoitettiin täplinä nylonmembraaneille (HyBond-N, Amersham Corp.). Radioleimattua ihmisen mito- 40 kondrian DNA-fragmenttia käytettiin DNA-hybridisaatiossa koettimena. Samat membraanit uudelleenseulottiin ihmisen Alu-DNA:lla mitokondriaalisen DNA-koettimen poistamisen jälkeen. Mitokondriaalisen DNA:n määrä käsitellyissä ja 5 ei-käsitellyissä Hl-soluissa kvantitoitiin densitometrillä (LKB Ultroscan XL).

Tulokset esitetään taulukossa 2.

41

,-N

O

Ch

P

H

O

tn p o

♦H

Ui

M

0) Ό £ I C i g -H U 0) H :<ö

*H *H O -P 0) H

e vomo^ooinoouino

S ΗΗΝίΝΟ.ΛΗΟ^ίΝΗ^ tä :ffl ί £ S

ΰ n S λ P ·Ρ a) ΐ ϋ ^ Λ -H -H .. X >1 3 V) © e „ +> dl '10 -P (0 ^ ·γ1 (X ’(0 £0 -n J J Pi « E -H ffl 3 SÖ

S Ό MJ

p o λ f o g H s ti -S « o

CvJ H r* I »H

ϋ Φ b H ,Q

S H k K

3 .. H £ c

3 C Ή ^ J "H

h a) ro N 5 -h 3 h u ΕΝ Ή n « M ^ 2 n E"' P ΰ H Oio o P 2 -h m — covoio v. > S m o fj Σ ·> o H ·> ·νΟ S ,j ti) ϋ .j a. UIHCDiNO HOOO^t Wn«iJu

— -h h ϋ H .. o -H

H Ή Ή -H -H +<+i +t Ή » 3 u 1( 5 S rl V IA 3 ° H f O IOIAOOLO~>OH lOO^. 4J^ fl)c H C- IACS ΟΌ no 3 J h > o ϋ ί m , Q" •Hm

« ® ro <§ H

o .® S ro ®

o -Η d ro H

o lOlAOOOOlAlOO +-> p jj h .-. HOr-lACDtHr'COmHO)'?’ 'rl n M <!> r·"

£ Λ m H > B

j4 Ή-Η-ΗΉ-ΗΉ-Η-Η-Η-Η-ΗΉ -H f 2 q oinooooooomoo c d 2 p ®

s ot-ooomooon^iN

a n oioo OiO^nn rocoo-ro <> HHH n c * S a >

0) H X X -H

Ό ro [fi :(ö H E ffl (0 Qi a ro m h P 4-> M LT) to m -H 4-> □ pppuupp d 'f! d 3 c

®j fO (MMM *G H (D O *H

•cd ϊ* (ö s tn -μ ;rt O- ffl U U 1 » J l t I I i p p ρ· ^ppppppppp 42

Esimerkki 3 L-(-)-FMAU:n poistuminen plasmasta ja maksasta L- (-) -FMA.U:n poistuminen hiirten plasmasta ja maksasta arvioitiin oraalisen annon jälkeen. Hiiriin ruisku-5 tettiin tritiumleimattua L-(-)-FMAU:ta (radiospesifisyys 9,3 μιηοΙ/μΟϊ) .

Kuvio 11 on graafinen esitys L-(-)-FMAU:n plasma-pitoisuudetsa hiirissä oraalisen annon jälkeen ajan funktiona, ja kuvio 12 on graafinen esitys L-(-)-FMAU:n pitoi-10 suudesta hiiren maksassa oraalisen annon jälkeen ajan funktiona [risti, 10 mg/kg annettuna bid (kahdesti päivässä) 30 päivän ajan ennen farmakokineettistä tutkimusta, minkä jälkeen tutkimus suoritettiin päivänä 31 sama pitoisuus annettaessa; tumma ympyrä, 50 mg/kg annettuna bid 30 15 päivän ajan ennen tutkimusta, minkä jälkeen tutkimus suoritettiin päivänä 31 annettaessa sama pitoisuus; avoin ympyrä, 50 mg/kg annettuna ensimmäisen kerran tutkimuksen 1. päivänä].

Ilmoitettuina ajankohtina (katso kuviot 10 ja 11) 20 hiiristä otettiin verta niiden silmäkuopan takaisesta ontelosta käyttäen hepariinilla käsiteltyjä kapillaareja. Plasmaa uutettiin trikloorietikkahapolla, minkä jälkeen se neutraloitiin freon/trioktyyliamiinilla. Supernatantit laskettiin suoraan ja pitoisuus laskettiin.

25 Kuten esitetään kuvioissa 10 ja 11, L-(-)-FMAU:n huippupitoisuus plasmassa ja maksassa esiintyi ajankohtana noin 1 tunti. Yhdiste oli oleellisesti poistunut sekä plasmasta että maksasta 4 tunnin kuluttua.

Esimerkki 4 30 L-(-)-FMAUsn myrkyllisyys naaraspuolisissa BDF1- hiirissä

Kuviossa 13a esitetään muutos ruumiin painossa 30 päivän ajalta naaraspuolisissa verrokki-BDF-l-hiirissä. Kuvioissa 13b ja 13c esitetään muutos ruumiin painossa 35 30 päivän aikana naaraspuolisissa BDFl-hiirissä, joille annettiin 10 mg/kg (13b) ja 50 mg/kg (13c) bid L-(-)- 43 FMAU: ta. Esitetty ruumiin paino edustaa keskiarvoa ja standardipoikkeamaa 5-7 hiiren arvoista. Kuten esitetään kuvioissa 13b ja 13c, L-(-)-FMAU ei vaikuttanut merkittävästi vaikuttavan hiirten painoon 30 päivässä, mikä osoit-5 taa yhdisteen hyvän siedon.

Esimerkki 5

Hiiren plasman kliininen kemia L-(-)-FMAU-käsit-telyn jälkeen

Kuvioissa 14-20 esitetään hiiriplasman kliininen 10 kemia L-(-)-FMAU:n annon jälkeen annoksena 10 mg/kg (3 hiirtä) tai 50 mg/kg (3 hiirtä) bid 30 päivän ajan.

Kuivo 14 on pylväsdiagrammi kokonaisbilirubiinipi-toisuudesta hiiren plasmassa yksiköissä mg/dl. Kuviossa 15 esitetääään pylväsdiagrammi alkalisen fosfataasin pitoi-15 suudesta hiiren plasmassa yksiköissä U/litra. Kokonaisbi-lirubiini ja alkalinen fosfataasi ovat maksafunktion indikaattoreita. Hiiriarvot bilirubiinille ovat normaalilla ihmisalueella (alle 1,2 mg/dl), mutta alkalisen fosfataasin arvot ovat jonkin verran korkeampia kuin normaali ih-20 mistaso (30 - 114 U/litra).

Kuvio 16 on pylväsdiagrammi kreatiniinin pitoisuudesta hiiriplasmassa yksiköissä mg/dl. Kreatiniini on munuaisten toiminnan indeksi. Lukuun ottamatta hiirtä 50-2 käsiteltyjen hiirten kreatiniinitasot eivät poikkea ver- 25 rokkihiirten vastaavista.

Kuvio 17 on pylväsdiagrammi AST:n (SGOT, seerumin glutamiinioksaalitransaminaasi) pitoisuudesta hiiriplasmassa yksiköissä U/litra. Kuviossa 18 esitetään pylväsdiagrammina ALT:n (SGPT, seerumin glutamiini-pyruvaattitrans-30 aminaasi-) pitoisuus hiiriplasmassa yksiköissä U/litra.

SGOT ja SGPT ovat maksafunktion indikaattoreita. Lukuun ottamatta hiirtä 50-2 (sekä SGOT että SGPT) ja hiirtä 10-2 (vain SGOT) entsyymitasot käsitellyissä hiirissä eivät poikkea verrokkihiirten vastaavista.

35 Kuvio 19 on pylväsdiagrammi maitohapon pitoisuu desta hiiriplasmassa yksiköissä mmol/litra. Kuvio 20 on 44 pylväsdiagrammi maitohappodehydrogenaasin pitoisuudesta hiiriplasmassa yksiköissä U/litra. Maitohappoa muodstuu lihaksissa glykolyysin aikana. Maitohappodehydrogenaasia (LDH) esiintyy eri isoentsyymeinä eri kudoksissa. LDH:n 5 vapautuminen plasmaan voi olla osoitus kudosvauriosta. Käsiteltyjen hiirten maitohappo- ja maitohappodehydrogenaa-sitasot eivät merkittävästi poikkea verrokkihiirten vastaavista arvoista.

III. Oligonukleotidit 10 Halutun sekvenssin mukaisia oligonukleotideja voi daan modifioida substituoimalla yksi tai useampi tässä julkistettu L-nukleosidi jollain nukleosidilla oligonukle-otidissä. Edullisessa suoritusmuodossa L-nukleosidi sijoitetaan oligonukleotidin jompaankumpaan päähän. Modifioitua 15 oligonukleotidiä voidaan käyttää esimerkiksi antisense- teknologiassa.

Antisense-teknologia viittaa yleensä ottaen geeni ilmentymisen modulaatioon prosessilla, jossa synteettinen oligonukleotidi hybridisoidaan siihen nähden komple-20 mentaariseen nukleiinihapposekvenssiin transkription tai replikaation inhiboimiseksi (jos kohdesekvenssinä on DNA), translaation inhiboimiseksi (jos kohdesekvenssinä on RNA) tai prosessoinnin inhiboimiseksi (jos kohdesekvenssinä on pre-RNA). Laajaa valikoimaa soluaktiivisuuksia voidaan mo-25 duloida tätä tekniikkaa käyttäen. Yksinkertainen esimerkki on proteiinien biosynteesin inhibointi mRNArhan sitoutuneella antisense-oligonukleotidilla. Toisessa suoritusmuodossa synteettinen oligonukleotidi hybridisoidaan spesifiseen geenisekvenssiin kaksisäikeisessä DNA:ssa, jolloin 30 muodostuu koImisäikeinen kompleksi (tripleksi), joka inhi boi tuon geenisekvenssin ilmentymisen. Antisense-oligo-nukleotidejä voidaan myös käyttää geeni-ilmentymisen aktivoimiseksi epäsuorasti suppressoimalla luonnollisen rep-ressorin biosynteesi. AOT:tä voidaan käyttää patogeenisten 35 geenien ilmentymisen inhiboimiseksi, esimerkiksi geenien, jotka helpottavat virusten replikaatiota, mukaan lukien 45 ihmisen immuunikatovirus (HIV), hepatiitti-B-virus (HBV) ja herpesvirukset, ja syöpien, erityisesti kiinteiden kas-vainmassojen kuten glioomat (hermon tukisolukasvain), rintasyöpä ja melanoomat.

5 Valitun oligonukleotidin stabiilisuus nukleaaseja vastaan on tärkeä tekijä in vivo -käytöissä. Tiedetään, että 31-eksonukleaasiaktiivisuus on vastuussa valtaosasta ei-modifioidun antisense-oligonukleotidin hajoamisesta seerumissa [Vlassov, V.V., Yakubov, L.A., "Prospects for An-10 tisense Nucleic Acid Therapy of Cancers and AIDS", Wiley-Liss, Inc., New York, 1991, 243 - 266; Nucl. Acids Res. 21 (1993) 145]. Yhdessä suoritusmuodossa tässä julkistettuja L-nukleosideja voidaan käyttää antisense-oligonukleotidien 3'-eksonukleaasihajoamisen minimoiseksi.

15 Esillä olevan keksinnön mukaiset oligonukleotidit, jotka kykenevät sitoutumaan polyribonukleiinihappoon tai polydeoksiribonukleiinihappoon, ovat käyttökelpoisia anti-sense-aineina samaan tapaan kuin tavanomaiset antisenseai-neet [katso yleisesti "Antisense Molecular Biology and S-20 oligos" (suom. "Antisense-molekyylibiologia ja S-oligot"),

Synthesis 1 (lokakuu 1988), julkaisija Synthecell Corp., Rockville, Md) ; "Discoveries in Antisense Nucleic Acids", C. Brakel ja R. Fraley, toim., 1989; Uhlmann et al. , "Antisense Oligonucleotides: A New Therapeutic Technique" 25 (suom. "Antisense-oligonukleotidit: Uusi terapeuttinen tekniikka"), Chem. Rev. 90:4 (1990); ja Milligan, J.F.,

Matteucci, M.D., Martin, J.C., J. Med. Chem. 36 (1993) 1923 - 1937]. Esillä olevan keksinnön mukaisia antisense-aineita voidaan käyttää antisense-aineen rakentamiseksi, 30 joka kykenee sitoutumaan selektiivisesti ennalta määrättyyn polydeoksiribonukleiinihapposekvenssiin tai polyribo-nukleiinihapposekvenssiin tai tällaisen sekvenssin sisältävään soluun (esim. lisäämällä antisense-ainetta solun sisältävään kasvualustaan) siten, että antisense-aine 35 siirtyy soluun, sitoutuu ennalta määrättyyn sekvenssiin ja salpaa sen transkription, translaation tai replikaation.

46

Edellytykset antisense-aineen selektiiviselle sitoutumiselle tunnetaan (esim. 17 emäksen pituus selektiivistä sitoutumista varten ihmisgenomiin).

IV. Farmaseuttisten koostumusten valmistus 5 Tässä julkistetut yhdisteet ja niiden farmaseutti sesti hyväksyttävät suolat, esilääkkeet ja johdannaiset ovat käyttökelpoisia HBV- ja EBV-tartuntojen ja muiden sukulais tilojen estämiseksi ja hoitamiseksi, kuten anti-HBV-tai anti-EBV-vasta-ainepositiiviset ja HBV- tai EBV-posi-10 tiiviset tilat, HBV:n aiheuttama krooninen maksatulehdus, kirroosi, akuutti hepatiitti, äkillinen hepatiitti, krooninen pysyvä hepatiitti ja väsymys. Näitä yhdisteitä tai koostumuksia voidaan käyttää myös ennalta ehkäisemään tai estämään tai hidastamaan kliinisen sairauden etenemistä 15 yksilöissä, jotka ovat anti-HBV-, anti-EBV-vasta-aine- tai HBV- tai EBV-antigeenipositiivisia tai jotka ovat altistuneet HBV:lie tai EBV:lie.

Mistä tahansa näistä tiloista kärsiviä ihmisiä voidaan hoitaa antamalla potilaalle tehokas HBV- tai 20 EBV-hoitomäärä yhtä tässä kuvattua aktiivista yhdistettä tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää johdannaista tai suolaa tai mainittujen seosta mahdollisesti farmaseuttisesti hyväksyttävässä kantajassa tai laimentimessa. Aktiivisia materiaaleja voidaan antaa mitä tahansa sopivaa tie-25 tä, esimerkiksi oraalisesti, ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta laskimonsisäisesti, ihonsisäisesti, ihonalaisesti tai paikallisesti nestemäisessä tai kiinteässä muodossa.

Aktiivinen yhdiste sisällytetään farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan tai laimentimeen määränä, joka on 30 riittävä kuljettamaan potilaaseen terapeuttisesti tehokkaan määrän aiheuttamatta vakavia toksisia vaikutuksia hoidetussa potilaassa.

Aktiivisen yhdisteen edullinen annos kaikkiin edellä mainittuihin tiloihin on noin 1-60 g/kg, edulli-35 sesti 1 - 20 mg/kg, ruumiin painoa päivässä, yleisemmin 0,1 - noin 100 mg/kg vastaanottajan ruumiin painoa päiväs- 47 sä. Farmaseuttisesti hyväksyttävien johdannaisten tehokas annostusalue voidaan laskea perille toimitettavan kanta-nukleosidin painosta. Jos johdannainen sinänsä osoittaa aktiivisuutta, tehokas annostus voidaan arvioida kuten 5 edellä käyttäen johdannaisen painoa, tai muilla, alan taitajille tutuin keinoin. Yhdessä suoritusmuodossa aktiivinen yhdiste annetaan kuten kuvataan käsikirjan "Physician's Desk Reference" tuoteliitteessä 3'-atsido-3'-deoksi-tymidiinille (AZT), 2',3'-dideoksi-inosiinille (DDI), 2’,3'-10 dideoksisytidiinille (DDC) tai 2',3'-dideoksi-2' , 3'-dide-hydrotymidiinille (D4T) HIV-indikaatiossa.

Yhdiste annetaan kätevästi minä tahansa sopivana annostusmuotoyksikkönä, mukaan lukien mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta yksikkö, joka sisältää 7-3 000 mg, 15 edullisesti 70-1 400 mg, aktiivista aineosaa kohden yk-sikköannostusmuoto. Tavallisesti kätevä on oraalinen annostus 50 - 1 000 mg.

Ihanteellisesti aktiivista ainesosaa tulisi antaa aktiivisen yhdisteen huippuplasmapitoisuuksien saavuttami-20 seksi, jotka ovat noin 0,2 - 70 μΜ, edullisesti noin 1,0 -10 μΜ. Tähän voidaan päästä esimerkiksi ruiskuttamalla laskimonsisäisesti aktiivisen aineosan 0,1 - 5-%:ista liuosta mahdollisesti suolaliuoksessa, tai antamalla kerta-annos aktiivista aineosaa.

25 Aktiivinen yhdiste voidaan antaa käyttöön far maseuttisesti hyväksyttävien suolojen muodossa. Tässä käytettynä ilmaisulla "farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat tai kompleksit" tarkoitetaan nukleosidien suoloja tai komplekseja, joilla on tallella kantayhdisteen haluttu 30 biologinen aktiivisuus ja jotka osoittavat minimaalisia tai ei ollenkaan epätoivottavia toksikologisia vaikutuksia. Ei-rajaavia esimerkkejä tällaisista suoloista ovat (a) epäorgaanisten happojen kanssa muodostetut happoaddi-tiosuolat (esimerkiksi kloorivetyhappo, bromivetyhappo, 35 rikkihappo, fosforihappo, typpihappo ja muut vastaavat), ja orgaanisten happojen kanssa muodostetut suolat, kuten 48 seuraavien happojen kanssa muodostetut suolat: etikkahap- po, oksaalihappo, viinihappo, meripihkahappo, omenahappo, askorbiinihappo, bentsoehappo, parkkihappo, palmitiinihap-po, algiinihappo, polyglutamiinihappo, naftaleenisulfoni-5 hapot, naftaleenidisulfonihapot ja polygalakturonihappo; (b) emäsadditiosuolat, jotka on muodostettu kationien kanssa kuten natrium, kalium, sinkki, kalsium, vismutti, barium, magnesium, aluminium, kupari, koboltti, nikkeli, kadmium, natrium, kalium ja muut vastaavat, tai orgaanisen 10 kationin kanssa muodostetut suolat, jotka on muodostettu N,N-dibentsyylietyleenidiamiinista, ammoniumista tai ety-leenidiamiinista; tai (c) (a):n ja (b):n yhdistelmät, esim. sinkkitannaattisuolat ja muut vastaavat.

Aktiivisen yhdisteen modifikaatiot, spesifisesti 15 N6- tai N4- ja 51-O-asemissa, voivat vaikuttaa aktiivisen lajin biosaatavuuteen ja aineenvaihduntanopeuteen, jolloin saadaan kontrolli aktiivisen lajin perille toimittamiseen.

Aktiivisen yhdisteen pitoisuus lääkekoostumuksessa riippuu lääkkeen absorptio-, inaktivaatio- ja eritysnope-20 uksista sekä muista, alan taitajille tutuista tekijöistä. Huomattakoon, että annostusarvot vaihtelevat myös lievitettävän tilan vakavuuden mukaan. Edelleen tulee ymmärtää, että mille tahansa tietylle kohteelle spesifiset annostus-ohjelmat tulisi säätää ajan funktiona yksilöllisen tarpeen 25 mukaan ja koostumuksia antavan tai antoa valvovan henkilön ammatillisen harkinnan mukaan, ja että tässä esitetyt pi-toisuusalueet ovat vain esimerkkiluonteisia, jolloin niiden ei tarkoiteta rajoittavan patentoitavaksi vaaditun koostumuksen käytännön suojapiiriä. Aktiivinen aineosa 30 voidaan antaa kerralla, tai se voidaan jakaa lukuisiksi pienemmiksi annoksiksi, jotka annetaan vaihtelevina ajankohtina .

Aktiivisen yhdisteen edullinen antotapa on oraalinen. Oraaliset koostumukset sisältävät yleensä inerttiä 35 laimenninta tai syötävää kantajaa. Ne on voitu sulkea ge-latiinikapseleihin tai puristaa tableteiksi. Oraalista te- 49 rapeuttista antoa silmällä pitäen aktiivinen yhdiste voidaan sisällyttää täyteaineisiin ja sitä voidaan käyttää tablettien, suussa liukenevien tablettien tai kapselien muodossa. Farmaseuttisesti yhteensopivia sideaineita ja/ 5 tai apumateriaaleja voidaan sisällyttää osaksi koostumusta .

Tabletit, pillerit, kapselit, suussa sulavat tabletit ja muut vastaavat voivat sisältää mitä tahansa seu-raavia aineosia tai luonteeltaan samankaltaisia yhdistei-10 tä: sideainetta, kuten mikrokiteinen selluloosa, tragant- tikumi tai gelatiini; täyteainetta kuten tärkkelys tai laktoosi, hajottavaa ainetta kuten algiinihappo, Primogel-valmiste tai maissitärkkelys; voiteluainetta kuten magne-siumstearaatti tai Sterotes-valmiste; liukuainetta kuten 15 kolloidinen piidioksidi; makeutusainetta kuten sakkaroosi tai sakkariini; tai flavorlainetta kuten piparminttu, me-tyylisalisylaatti, tai appelsiinin maku. Kun annostusyk-sikkömuoto on kapseli, se voi sisältää edeltävän tyyppisen materiaalin lisäksi nestemäistä kantaa kuten rasvaöljy. 20 Lisäksi annostusyksikkömuodot voivat sisältää erilaisia muita materiaaleja, jotka modifioivat annostusyksikön fysikaalista muotoa, esimerkiksi sokeri-, sellakkapäällys-teet tai muut suolessa sulavat aineet.

Aktiivinen yhdiste tai sen farmaseuttisesti hyväk-25 syttävä suola tai johdannainen voidaan antaa eliksiirin, suspension, siirapin, vohvelin, purukumin tai muun vastaavan aineosana. Siirappi voi sisältää aktiivisten yhdisteiden lisäksi sakkaroosia makeutusaineena ja tiettyjä säily-tysaineita, värejä ja väriaineita ja flavoriaineita.

30 Aktiivinen yhdiste tai sen farmaseuttisesti hyväk syttävä johdannainen tai suola voidaan myös sekoittaa muihin aktiivisiin materiaaleihin, jotka eivät haittaa haluttua vaikutusta, tai materiaaleihin, jotka täydentävät haluttua vaikutusta, kuten antibiootit, sienivastaiset ai-35 neet, tulehdusvastaiset aineet tai muut virusvastaiset ai- 50 neet, mukaan lukien anti-HBV-, anti-EBV-, anti-sytomegalo-virus- tai anti-HIV- tai anti-EBV-aineet.

Liuokset tai suspensiot, joita käytetään ruoansulatuskanavan ulkopuoliseen, ihonsisäiseen, ihonalaiseen tai 5 paikalliseen antoon, voivat sisältää seuraavia aineosia: steriili laimennin kuten injisointivesi, suolaliuos, kovetetut öljyt, polyetyleeniglykolit, glyseriini, propyleeni-glykoli tai muut synteettiset liuottimet; bakteerivastai-set aineet kuten bentsyylialkoholi tai metyyliparabeenit; 10 hapetuksenestoaineet kuten askorbiinihappo tai natriumbi-sulfiitti; kelatoivat aineet kuten etyleenidiamiinitetra-etikkahappo; puskurit kuten asetaatit, sitraatit tai fosfaatit, ja aineet toonisuuden säätämiseksi kuten natrium-kloridi tai dekstroosi. Kantavalmiste voidaan sisällyttää 15 ampulleihin, kertakäyttöruiskuihin tai lasista tai muovista valmistettuihin moniannosampulleihin.

Laskimonsisäisessä annossa edullisia kantajia ovat fysiologinen suolaliuos tai fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS). Edullisessa suoritusmuodossa aktiiviset yhdisteet 20 koostetaan kantajien kanssa, jotka suojaavat yhdistettä vastaan nopeaa poistumista elimistöstä, kuten kontrolloidun vapautumisen koostumus, mukaan lukien istutteet ja mikrokapseloidut kuljetussysteemit. Voidaan käyttää bioha-joavia, bioyhteensopivia polymeerejä, kuten etyleenivinyy-25 liasetaatti, polyanhydridit, polyglykolihappo, kollageeni, polyortoesterit ja polymaitohappo. Menetelmät tällaisten koostumusten valmistamiseksi ovat ilmeisiä alan ammattilaisille. Materiaalit voidaan myös saada kaupallisesti tahoilta Alza Corporation ja Nova Pharmaceuticals, Inc.

30 Liposomisuspensiot (mukaan lukien liposomit, jotka on kohdennettu tartutettuihin soluihin virusantigeenien vastaisilla monoklonaalisilla vasta-aineilla) ovat myös edullisia farmaseuttisesti hyväksyttävinä kantajina. Nämä voidaan valmistaa alan taitajille tutuilla menetelmillä 35 kuten kuvataan esimerkiksi US-patenttijulkaisussa nro 4 552 811 (joka sisällytetään tähän kokonaisuudessaan viit- 51 teeksi). Esimerkiksi liposomikoostumuksia voidaan valmistaa liuottamalla yhtä tai useampaa sopivaa lipidiä (kuten stearoyylifosfatidyylietanoliamiini, stearoyylifosfatidyy-likoliini, arakadoyylifosfatidyylikoliini ja kolesteroli) 5 epäorgaaniseen liuottimeen, joka sitten haihdutetaan pois, jolloin jäljelle jää ohut kalvo kuivattua lipidiä astian pinnalle. Sitten astiaan lisätään aktiivisen yhdisteen tai sen monofosfaatti-, difosfaatti- ja/tai trifosfaattijohdannaisten vesiliuosta. Sitten astiaa pyöritetään käsin 10 lipidimateriaalin vapauttamiseksi astian seiniltä ja lipi-diaggregaattien dispergoimiseksi, jolloin muodostuu li-posomisuspensio.

Tätä keksintöä on kuvattu viitaten sen edullisiin suoritusmuotoihin. Keksinnön variaatiot ja modifikaatiot 15 ovat ilmeisiä alan ammattilaisille keksinnön edeltävästä yksityiskohtaisesta kuvauksesta. Tarkoitus on, että kaikki nämä variaatiot ja modifikaatiot sisältyvät oheisten patenttivaatimusten suojapiiriin.

Claims (30)

52

1. Farmaseuttinen koostumus, joka käsittää HBV:n ja EBV:n hoitoon tarvittavan määrän L-nukleosidiyhdisteen, 5 jolla on kaava: OH N_ R"cr lR tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan käytettäväksi HBV:n tai EBV:n hoitoon, jossa kaavassa 10. on emäs valittu ryhmästä tyrniini, adeniini ja sytosiini; R' 1 on vety; Ci_i0-alkyyli; monof osf aatti, difos-faatti tai trifosfaatti; -C(0)R', jossa R' on suoraketjui-nen, haarautunut tai syklinen Ci-io-alkyyli, Ci_i0-alkoksi-

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että L-nukleosidi on ainakin 20 95-prosenttisesti puhdas vastaavasta D-nukleosidista.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että L-nukleosidi on ainakin 98-prosenttisesti puhdas vastaavasta D-nukleosidista.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen farmaseuttinen 25 koostumus, tunnettu siitä, että R on tyrniini.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että R on adeniini.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että R on sytosiini.

7. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen far maseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että R’ 1 on mo-nofosfaatti. 53

8. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että R' ' on di-fosfaatti.

9. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen far-5 maseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että R' ' on tri- fosfaatti.

10. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen far maseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että R' ' on -C(0)R'.

11. Patenttivaatimuksen 4 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että R1 1 on monof osf aatti.

12. Patenttivaatimuksen 4 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että R’ 1 on difosfaatti.

13. Patenttivaatimuksen 4 mukainen farmaseuttinen 15 koostumus, tunnettu siitä, että R11 on trif osfaatti.

14. Patenttivaatimuksen 4 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että R’1 on -C(0)R'.

15. Patenttivaatimuksen 5 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että R’ ’ on monof osf aatti.

15 Ci-io-alkyyli, bentsyyli, f enoksi-Ci_io-alkyyli, fenyyli mahdollisesti substituoitu halogeenilla, Ci-4-alkyylilla tai Ci-4-alkoksilla tai sulfonaattiesteri.

16. Patenttivaatimuksen 5 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että R1 1 on difosfaatti.

17. Patenttivaatimuksen 5 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että R’ ’ on trif osfaatti.

18. Patenttivaatimuksen 5 mukainen farmaseuttinen 25 koostumus, tunnettu siitä, että R’ ' on -C(0)R'.

19. Patenttivaatimuksen 6 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että R’ ' on monof osf aatti.

20. Patenttivaatimuksen 6 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että R'' on difosfaatti.

21. Patenttivaatimuksen 6 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että R1' on trif osf aatti.

22. Patenttivaatimuksen 6 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että R' 1 on -C(0)R'.

23. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen far-35 maseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että koostumus on formuloitu oraaliseen antomuotoon. 54

24. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että koostumus on formuloitu liposomaaliseksi suspensioksi.

25. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen far-5 maseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että koostumus on formuloitu kontrolloidun vapautumisen formulaatioksi.

26. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että koostumus on formuloitu parenteraaliseen antomuotoon.

27. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen far maseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että koostumus on formuloitu suonensisäiseen antomuotoon.

28. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että koostumus 15 on formuloitu paikalliseen antomuotoon.

29. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että koostumus on formuloitu ihonsisäiseen antomuotoon.

30. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen far-2 0 maseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että koostumus on sopiva subkutaaniseen antomuotoon. 55