FI117475B - L-nukleosidejä hepatiitti-B-viruksen ja Epstein-Barr-viruksen hoitamiseksi - Google Patents

Description

J ' 117475 L-nukleosidejä hepatiitti-B-viruksen ja Epstein-Barr-vi- ί' ruksen hoitamiseksi Tämä keksintö koskee yhdisteitä hepatiitti-B-viruk-5 sen (jota kutsutaan myös "HBV":ksi) ja Epstein-Barr-viruk-sen (jota kutsutaan "EBV":ksi) aiheuttamien tartuntojen hoitamiseksi. Hoitomenetelmissä annetaan tehokas määrä yhtä tai useampaa tässä julkistettua aktiivista yhdistettä | tai jonkin näistä yhdisteistä farmaseuttisesti hyväksyttä- ^ 10 vää johdannaista tai esilääkettä.

Keksinnön tausta

Hepatiitti-B-virus on levinnyt epidemiologisille tasoille kautta maailman. 2-6 kuukauden inkubointiaika-jakson, jona isäntä on tietämätön tartunnasta, jälkeen 15 HBV-tartunta voi johtaa akuuttiin hepatiittiin ja maksavaurioon, joka aiheuttaa vatsakipuja, keltaisuutta sekä tiettyjen entsyymien kohonneita tasoja veressä. HBV voi aiheuttaa äkillisen hepatiitin, joka on sairauden nopeasti etenevä, usein kohtalokas muoto, jossa suuria osia maksas-20 ta tuhoutuu. Potilaat tyypillisesti toipuvat akuutista vi- rushepatiitista. Joissakin potilaissa kuitenkin virusan- - tigeenin korkeat tasot veressä säilyvät pidentyneen, tai määrittelemättömän, ajan aiheuttaen kroonisen tartunnan.

:T: Krooniset tartunnat voivat johtaa krooniseen pysyvään he-

:*·.· 25 patiittiin. Potilaat, joilla on krooninen pysyvä HBV-tar- I

• · . .·. tunta, ovat yleisimpiä kehitysmaissa. Vuoden 1991 puolivä- ···

Iissä pelkästään Aasiassa oli noin 225 miljoonaa kroonista 4 HBV-kantajaa ja koko maailmassa lähes 300 miljoonaa kanta-. . jaa. Krooninen pysyvä hepatiitti voi aiheuttaa väsymystä, 30 maksakirroosia ja maksasolusyöpää, joka on primaarinen • » *···* maksasyöpä.

: Läntisissä teollistuneissa maissa korkean riskin ·*···.'· ·;··· ryhmiä HBV-tartunnalle ovat henkilöt, jotka joutuvat kos- *. ketuksiin HBV-kantajien tai näiden verinäytteiden kanssa.

»«· 35 HBV:n epidemiologia on itse asiassa hyvin samankaltainen f • · ♦ ♦ · 'ä • · • ' ‘ 4 :.2 117475 kuin immuunikadon, mikä selittää sen, miksi HBV-tartunta on yleinen aids-potilailla tai henkilöillä, joilla on HIV-liitteisiä tartuntoja. Kuitenkin HBV on tarttuvampi kuin HIV.

5 HBV jää toiseksi vain tupakalle ihmissyövän syynä. ,,

Mekanismi, jolla HBV aiheuttaa syöpää, on tuntematon, .« joskin oletetaan, että se saattaa suoraan laukaista kasvaimen kehittymisen tai epäsuorasti laukaista kasvaimen .

kehittymisen tartuntaan liittyvien kroonisen tulehduksen, 10 kirroosin ja soluregeneraation välityksellä.

Epstein-Barr-virus (EBV) kuuluu Lymphocrypto-virus-ten sukuun, joka kuuluu gammaherpesvirusten alaryhmään. Se on huomattavan lymfotrooppinen. EBVillä on herpesviruksil-le tavanomainen rakenne, sen kaksisäikeinen DNA-genomi ni-15 mittäin on ikosapentahedraalisen nukleokapsidin sisällä, :.i jota puolestaan ympäröi virusglykoproteiineja runsaasti sisältävä lipidikuori. Kuoren ja nukleokapsidin välisessä tilassa on amorfinen peittoproteiini.

Kaikki ihmisen herpesvirukset tartuttavat lymfo- 4 20 syyttejä ja replikoituvat niissä jossain määrin, mutta EBV ,5 . f, tekee tämän tehokkaasti. Merkittävintä on, että patogenee- s • si ja isännän vasteet EBV-tartunnalle ovat riippuvaisempia • » · t lymfosyyttitartunnasta kuin on ilmeistä muiden ihmisen • · · • · ,·;·φ herpesvirusten kohdalla.

• · · '·>! 1' . 25 EBV on nyt tunnistettu syyksi B-solulymfolisäänty- • · 1 .1 missairauksiin, ja se on kytketty erilaisiin muihin vaka- * · · *"1 viin ja kroonisiin sairauksiin, mukaan lukien harvinainen • · · *·1 1 progressiivinen mononukleoosin kaltainen oireyhtymä ja nukkaisten valkotäplien esiintyminen suun limakalvoilla • · ·,· · 30 aids-potilailla. Esitys, että EBV on kroonisen väsymyksen • 1 ϊ ί pääasiallinen syy, ei ole kestänyt lähempää tarkastelua.

.···, EBV tarttuu pääasiassa syljen välityksellä, vaikka- • ·

***. kin jotkut tartunnat välittyvät veren siirroissa. Yli 85 % J

• · · · 9 * · . potilaista tarttuvan mononukleoosin akuuteissa vaiheissa ...1!1 35 erittää EBV:tä.

• --Φ 1 · « 9 · ' 3 .- .·), 117475 j EBV on yhdistetty syöpään. Ainakin kaksi potilasryhmää on vaarassa kehittää EBV-liitteisiä lymfoomia: ne, |j jotka ovat saaneet munuais-, sydän-, luuydin-, maksa- tai f! kateenkorvasiirrännäisiä immunosuppresiivisen terapian 5 suojassa, sekä aids-potilaat. EBV-liitteisiä syöpiä ovat Burkittin lymfooma ja nenänielusyöpä.

Sen valossa, että hepatiitti-B-viruksella ja Epstein-Barr-viruksella on vakavia ja usein traagisia vai- k kutuksia tartunnan saaneelle potilaalle, on olemassa voi-10 makas tarve saada käyttöön näiden virusten tartuttamien { ihmisten hoitamiseksi uusia tehokkaita farmaseuttisia aineita, joiden myrkyllisyys isännälle on matala. i.

Tämän vuoksi esillä olevan keksinnön päämääränä on f antaa käyttöön yhdiste, koostumus ja menetelmä hepatiitti- | 15 B-viruksen hoitamiseksi.

Esillä olevan keksinnön toinen päämäärä on antaa käyttöön yhdiste, koostumus ja menetelmä Epstein-Barr-vi-ruksen hoitamiseksi.

Yhteenveto keksinnöstä 20 HBV- tai EBV-tartunnan saaneen isännän ja erityi sesti ihmisen hoitamiseksi annetaan käyttöön menetelmä, . jossa annetaan HBV- tai EBV-tartuntaa hoitava määrä L-nuk- f » » · * · · *·· leosidiä, jonka kaava on: • · · * · «

.♦V. OH

*·“ 25 _ :¾ HO—1 p \

R

• « * * jossa R on puriini- tai pyrimidiiniemäs. Edulisessa suori- • ;*· 30 tusmuodossa nukleosidi annetaan käyttöön esitettynä enan- *»· * .···, tiomeerinä ja oleellisesti sitä vastaavan enantiomeerin " · * : #* puuttuessa (eli enantiomeerisesti rikastetussa, mukaan lu- • · *···* kien enantiomeerisesti puhtaassa, muodossa). f * * Yhdessä edullisessa suoritusmuodossa aktiivinen yh- 35 diste on 2' -fluori-5-metyyli-B-L-arabinofuranosyyliuridii- | • · · «

• · T

117475 4 ni (jota kutsutaan myös L-FMAU:ksi). Tämä yhdiste on tehokas virusvastainen aine HBV:tä ja EBV:tä vastaan ja sen sytotoksisuus on alhainen. Muita spesifisiä esimerkkejä aktiivisista yhdisteistä ovat N:-(2'-deoksi-2'-fluori-B-5 L-arabinofuranosyyli )-5-etyyliurasiili, Nj-(2'-deoksi-2'- fluori-B-L-arabinofuranosyyli)-5-jodisytosiini ja ΝΑ — (2* — if deoksi-2'-fluori-B-L-arabinofuranosyyli)-5-jodiurasiili.

Vaihtoehtoisessa suoritusmuodossa käytettäväksi HBV- tai EBV-tartunnan hoitoon annetaan käyttöön L-nukleo-10 sidi, joka sisältää 2'-arabinohydroksyyliryhmän, esimerkiksi L-aratymidiini, L-fludarabiini, L-araguanosiini ja L-arainosiini kuten esitetään kuviossa 1.

Tässä julkistetut L-nukleosidit ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät johdannaiset tai näitä yhdis-15 teitä sisältävät farmaseuttisesti hyväksyttävät koostu- ; mukset ovat käyttökelpoisia HBV-tartuntojen ja muiden liittyvien tilojen estämiseksi ja hoitamiseksi kuten an-ti-HBV-vasta-ainepositiiviset ja HBV-positiiviset tilat, HBV:n aiheuttama krooninen maksatulehdus, kirroosi, akuut-20 ti hepatiitti, äkillinen hepatiitti, krooninen pysyvä hepatiitti ja väsymys. Yhdisteitä voidaan samoin käyttää : ;*: EBV-liitteisten häiriötilojen hoitamiseksi. Näitä yhdis- • · · . :.:f

.·.*. teitä tai koostumuksia voidaan myös käyttää ennalta ehkäi- I

* · .···. sevästi kliinisten sairauksien etenemisen estämiseksi tai • « · . 25 hidastamiseksi yksilöillä, jotka ovat anti-HBV- tai anti- • I» EBV-vasta-aine- tai HBV- tai EBV-antigeenipositiivisia tai • · · ‘‘I jotka ovat joutuneet alttiiksi HBV:lie tai EBV:lle.

* · · *·* Toisessa suoritusmuodossa aktiivinen yhdiste tai sen johdannainen tai suola voidaan antaa yhdistäen tai • · : 30 vaihdellen toisen anti-HBV-aineen tai anti-EBV-aineen ·· * ·...* kanssa, mukaan lukien edellä mainitut, tai anti-HIV-aineen « .···. kanssa. Yleensä ottaen vaihteluterapiassa tehokas annostus i kumpaakin ainetta annetaan sarjassa, kun taas yhdistelmä- r • · . terapiassa tehokas annostus kahta tai useampaa ainetta an- 35 netaan yhdessä. Annostukset riippuvat lääkkeen absorptio-, f • >' 117475 5 inaktivoitumis- ja eritysnopeuksista sekä muista alan ammattilaisille tutuista tekijöistä. Huomattakoon, että an-nostusarvot vaihtelevat myös lievitettävän tilan vakavuuden mukaan. Edelleen tulee huomata, että mille tahansa ni-5 menomaiselle kohteelle spesifiset annostusohjelmat ja -aikataulut tulisi säätää ajan funktiona yksilöllisen tarpeen f ja sen henkilön ammatillisen harkinnan mukaan, joka antaa koostumuksia tai valvoo niiden antoa,

Ei-rajaavia esimerkkejä virusvastaisista aineista, 10 joita voidaan käyttää yhdistettyinä tässä julkistettuihin f yhdisteisiin, ovat 2-hydroksimetyyli-5-(5-fluorisytosin-l-yyli)-1,3-oksatiolaanin (-)-enantiomeeri (FTC); 2-hydrok- f simetyyli-5-(sytosin-l-yyli)-l,3-oksatiolaanin (-)-enan-tiomeeri (3TC); karbovir, asyklovir, interferoni, AZT, DDI 15 (2',3'-dideoksi-inosiini), DDC (2',3'-dideoksisytidiini), L-DDC, L-5-F-DDC ja D4T.

Suppea kuvaus kuvioista

Kuvio 1 on esitys valikoiduista L-nukleosideistä, jotka kuuluvat esillä olevaan keksintöön: L-FMAU (2'-fluo-20 ri-5-metyyli-B-L-arabinofuranosyyliuridiini), L-FIAU (2'- =* fluori-5-jodi-B-L-arabinofuranosyyliuridiini), L-FC (2'- : fluori-B-L-arabinofuranosyylisytosiini), L-FIAC (2'-fluo- ri-5-jodiB-L-arabinofuranosyylisytosiini ), L-2-C1-2 ' -F-2 ' - i| deoksiadeniini, L-FEAU ( 2 '-f luori-5-etyyli-B-L-arabinofu- 11 • f · "* ** ; 25 ranosyyliuridiini), L-aratymidiini, L-fludarabiini, L-ara-

• · · ··· ..;C

guanosiini ja L-arainosiini.

• · ·

Kuviossa 2 esitetään graafisesti elinkelpoisten so- • * · * lujen prosentuaalinen osuus L-FMAU-lääkepitoisuuden funktiona Hl-soluissa.

• · • · · · Λ ·**: ί 30 Kuviossa 3 esitetään kaaviollinen esitys 1-0-ase- * * · *...* tyyli-2,3,5-tri-0-bentsoyyli-B-L-ribofuranoosin (yhdiste 4, • - "V-' .*··. 10) valmistuksesta. , * * *

Kuviossa 4 esitetään kaaviollinen esitys 1-O-ase- # * ♦ . tyyli-2,3,5-tri-0-bentsoyyli-B-L-ribofuranoosin (yhdiste ...i 35 10) vaihtoehtoisesta valmistuksesta.

* · · * · • · 6 1 1 7475

Kuvio 5 on kaaviollinen esitys menetelmästä 1,3,5-tri-0-bentsoyyli-2-deoksi-2-fluori-a- L-arabinofuranoosin (yhdiste 13) valmistamiseksi.

Kuvio 6 on kaaviollinen esitys menetelmästä N9-[3',-5 5'-di-0-bentsoyyli-2'-deoksi-2 '-f luori-B-L-arabiofurano- - f

syyli]-2,6-diklooripuriinin (yhdiste 15) ja N9-[2’-deoksi- M

2'-fluori-B-L-arabiofuranosyyli]-2,6-diklooripuriinin (yhdiste 16) valmistamiseksi.

Kuvio 7 on esitys menetelmästä lukuisten 2'-deoksi- '/·ψ 10 2’-fluori-B-L-arabinofuranosyyli]pyrimidiinien (yhdisteet | 17-24) valmistamiseksi.

Kuvio 8 on esitys menetelmästä N1-[2’-deoksi-2'- | fluori-B-L-arabinofuranosyyli]-5-jodisytosiinin (yhdiste i 22 ) valmistamiseksi. "7 15 Kuvio 9 on esitys menetelmästä 9-B-L-arabinofurano- • syyliadeniinin valmistamiseksi.

Kuvio 10 on esitys vaihtoehtoisesta tiestä 1-0-ase-tyyli-2,3,5-tri-0-bentsoyyli-B-L-ribofuranoosin (yhdiste * 10) valmistamiseksi 1,2-di-O-isopropylideeni-a-L-ksylofu-20 ranoosista (yhdiste 3).

Kuvio 11 on graafinen esitys L-(-)-FMAU:n plasmapi- f : toisuudesta hiirissä oraalisen annon jälkeen ajan funktio- 1*1 • V. na [risti, 10 mg/kg annettu bid (engl. bi-daily, kahdesti .·;·, päivässä)] 29 päivän ajan ennen farmakokineettistä tutki- ,·. · 25 musta, minkä jälkeen tutkimus suoritettiin päivänä 30 an- # · · fmy nettaessa sama pitoisuus; umpinainen ympyrä, 50 mg/kg an- • · « ^ “I netaan bid 29 päivän ajan ennen tutkimusta, minkä jälkeen • · · '** tutkimus suoritetaan päivänä 30 annettaessa sama pitoi suus; avoin ympyrä, 50 mg/kg annetaan ensimmäisen kerran ; 30 tutkimuksen 1. päivänä.

• · «

Kuvio 12 on graafinen esitys L-(-)-FMAU:n pitoisuu- ^

,**·. desta hiiren maksassa oraalisen annon jälkeen ajan funk- I

*··*·, .·£ tiona [risti, 10 mg/kg annettu bid (engl. bi-daily, kah- ·ζ * · . desti päivässä)] 30 päivän ajan ennen farmakokineettistä 35 tutkimusta, minkä jälkeen tutkimus suoritettiin päivänä 31 • *···*. .-:..--7 • * 117475 7 annettaessa sama pitoisuus; umpinainen ympyrä, 50 mg/kg annetaan bid 30 päivän ajan ennen tutkimusta, minkä jäi- - keen tutkimus suoritetaan päivänä 31 annettaessa sama pitoisuus; avoin ympyrä, 50 mg/kg annetaan ensimmäisen ker-5 ran tutkimuksen 1. päivänä.

Kuvio 13a havainnollistaa muutosta ruumiin painossa | ajan funktiona 30 päivän aikana naaraspuolisissa verrokki- j BDF1-hiirissä. Kuvioissa 13b ja 13c esitetään muutos ruumiin painossa ajan funktiona 30 päivän ajan naaraspuoli-10 sille BDFl-hiirille, joille annetaan 10 mg/kg bid (13b) ja 50 mg/kg (13c) L-(-)-FMAU:ta. Esitetty ruumiin paino edustaa keskiarvoa ja standardipoikkeamaa arvoille 5-7 hii- f restä. >

Kuvioissa 14 - 20 esitetään kliininen kemia hiiri-15 plasmalle, kun on annettu L-(-)-FMAU:ta annos 10 mg/kg (3 hiirtä) tai 50 mg/kg (3 hiirtä) bid 30 päivän ajan. Kuviossa 14 esitetään pylväsdiagrammi kokonaisbilirubiini-pitoisuudesa hiiriplasmassa yksiköissä mg/dl. Kuviossa 15 esitetään pylväsdiagrammina alkalisen fosfataasin pitoi- j,, 20 suus hiiriplasmassa yksiköissä U/litra. Kuviossa 16 esi- f tetään pylväsdiagrammina kreatiniinin pitoisuus hiiriplas- § • ·*· massa yksiköissä mg/dl. Kuviossa 17 esitetään pylväsdiag- rammina AST-pitoisuus (SGOT, seerumin glutamiini-oksaali- \ • ♦ ’j, transaminaasi) hiiriplasmassa yksiköissä U/litra. Kuviossa • · · . 25 18 esitetään pylväsdiagrammina ALT-pitoisuus (SGPT, seeru- .

• · · ; * .* min glutamiini-pyruvaattitransaminaasi) hiiriplasmassa yk- • · · siköissä U/litra. Kuviossa 19 esitetään pylväsdiagrammina • · · *·* maitohapon pitoisuus hiiriplasmassa yksiköissä mmol/litra.

Kuviossa 20 esitetään pylväsdiagrammina maitohappodehydro- • · ·.; ; 30 genaasipitoisuus hiiriplasmassa yksiköissä U/litra.

• · ·

Yksityiskohtainen kuvaus keksinnöstä .···, Tässä käytettynä ilmaisulla "enantiomeerisesti ri- ·

kastettu" tarkoitetaan nukleosidikoostumusta, joka sisäl- J

* ♦ . tää ainakin noin 95 %, ja edullisesti noin 97, 98, 99 tai 35 100 % tuon nukleosidin yksittäistä enantiomeeriä.

• >· • ·Φ«· • · ' ’ ' 8 117475 Tässä käytettynä ilmaisun "alkyyli" piiriin kuuluvat spesifisesti mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta Ci_10-alkyyliryhmät, mukaan lukien metyyli, etyyli, propyy-li, butyyli, pentyyli, heksyyli, isopropyyli, isobutyyli, 5 sek-butyyli, t-butyyli, isopentyyli, amyyli, t-pentyyli, < syklopentyyli ja sykloheksyyli. | Tässä käytettynä ilmaisun "asyyli" piiriin kuuluvat

VM

spesifisesti mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta asetyy-li, propionyyli, butyryyli, pentanoyyli, 3-metyylibutyryy-10 li, vetysukkinaatti, 3-klooribentsoaatti, bentsoyyli, ase- f tyyli, pivaloyyli, mesylaatti, propionyyli, valeryyli, kaproni-, kapryyli-, kapriini-, lauriini-, myristiini-, palmitiini-, steariini- ja öljyhapporadikaalit.

Tässä käytettynä ja ellei toisin ole määritelty il-15 maisu "asyyli" viittaa fenyyliin.

Tässä käytettynä ilmaisulla "suojattu" viitataan ellei toisin ole määritelty ryhmään, joka lisätään happl-tai typpiatomiin sen edelleen reagoimisen estämiseksi molekyylin, jossa happi tai typpi sijaitsee, muiden ryhmien 20 derivatisoinnin aikana. Orgaanisen synteesin alan ammatti- 3 laiset tuntevat laajan valikoiman hapen ja typen suojaryh- | : :*.* miä.

··· ''f- •V. Ilmaisun "puriini- tai pyrimidiiniemäs" piiriin kuuluvat mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta adeniini, i |4 .

,·, ; 25 N -alkyylipuriinit, N -asyylipuriinit [joissa asyyli on * »· // C(0) (alkyyli, aryyli, alkaryyli tai aralkyyli)], N6-bent- * * · , , soyylipyriini, N -halogeenipuriini, N -vinyylipuriini, • · · ·* * N6-asetyleenipuriini, N6-asyylipuriini, N6-hydroksialkyy- lipuriini, N6-tioalkyylipuriini, tyrniini, sytosiini, 6-at- • t : 30 sapyrimidiini, 2-merkaptopyrimidiini, N5-alkyylipyrimidii- • •t nit, N5-bentsyylipyrimidiinit, N5-halogeenipyrimidiinit, ^ * e e c ,···, N -vinyylipyrimidiini, N-asetyleenipyrimidiini, N -asyyli- £ pyrimidiini, N5-hydroksialkyylipuriini, N6-tioalkyylipurii- £ • » . ni, 5-atsasytidinyyli, 5-atsaurasilyyli, triatsolopyridi- 35 nyyli, imidatsolopyridinyyli, pyrrolopyrimidinyyli, pyrat- • «••I · 9 117475 solopyrimidinyyli. Emäksen funktionaaliset happi- ja typ-piryhmät voidaan suojata tarpeen mukaan tai haluttaessa.

Alan ammattilaisille sopivat suojaryhmät ovat tuttuja, ja niitä ovat trimetyylisilyyli, dimetyyliheksyylisilyyli, 5 t-butyylidimetyylisilyyli ja t-butyylidifenyylisilyyli, trityylimetyyli, alkyyliryhmät, asyyliryhmät kuten asetyy-li, propionyyli, butyyli, metyylisulfonyyli ja p-toluyyli-sulfonyyli. Spesifisesti mukaan kuuluvat 5-metyyliurasiili •Ί· (tyrniini), 5-jodiurasiili, sytosiini ja 5-etyyliurasiili.

10 Keksintö tässä julkistettuna on menetelmä ja koos- ‘ tumus HBV-tartunnan, EBV-tartunnan ja muiden, samankaltaisella tavalla replikoituvien virusten kuten HIV aiheuttamien tartuntojen hoitamiseksi ihmisissä tai muissa isäntä-eläimissä, johon menetelmään sisältyy tehokkaan määrän yh-15 tä tai useampaa edellä identifioitua L-nukleosidia tai sen fysiologisesti hyväksyttävää johdannaista tai fysiologisesti hyväksyttävää suolaa antaminen, mahdollisesti farmaseuttisesti hyväksyttävässä kantajassa. Tämän keksinnön mukaisilla yhdisteillä joko on anti-HBV-aktiivisuutta, an-20 ti-EBV-aktiivisuutta, tai ne metaboloituvat yhdisteeksi tai yhdisteiksi, joilla on anti-HBV- tai anti-EBV-aktiivi- ? ί suutta. Tässä julkistettuja yhdisteitä voidaan myös käyt- ; • ♦ ♦ . _'v tää HBV- ja EBV-liitteisten häiriötilojen hoitamiseksi. ] • ♦ ..--.¾

Aktiivinen yhdiste voidaan antaa minä tahansa joh- ί • 4 « ^ .·, · 25 dannaisena, joka vastaanottajalle annettuna kykenee tuot- s • ·· tamaan suoraan tai epäsuorasti kantayhdisteen, tai joka | • ♦ · 'i

Hl itse osoittaa aktiivisuutta. Ei-rajaavia esimerkkejä ovat f • · 4 * * farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat (joihin vaihtoehtoi sesti viitataan "fysiologisesti hyväksyttävinä suoloina"), • · • 4 t ί.ί : 30 ja aktiivisen yhdisteen 5' ja puriini- tai pyrimidiiniasy- ··» loidut tai alkyloidut johdannaiset (joihin vaihtoehtoises-,···, ti viitataan "fysiologisesti aktiivisina johdannaisina").

Yhdessä suoritusmuodossa asyyliryhmä on karboksyylihappo- • ·

. esteri [eli -C(0)R')J, jossa esteriryhmän ei-karbonyyli- N

35 ryhmä (R' ) valitaan suorista, haarautuneista tai syklisis- •4«4| .-.¾.

* · ί 10 117475 tä C^Q-alkyyleistä, -alkoksialkyyleistä, mukaan lukien | metoksimetyyli, aralkyyli mukaan lukien bentsyyli, aryyli-oksialkyyli kuten fenoksimetyyli, aryyli mukaan lukien mahdollisesti halogeenilla substituoitu fenyyli, C^-alkyy-5 li tai C1.4-alkoksi, sulfonaattiesterit kuten alkyyli- tai .·.$, aralkyylisulfonyyli mukaan lukien metaanisulfonyyli, mo- lino-, di- tai trifosfaattiesteri, trityyli tai monometoksi- ; trityyli, substituoitu bentsyyli, trialkyylisilyyli (esim. dimetyyli-t-butyylisilyyli) tai difenyylimetyylisilyyli. ^ 10 Aryyliryhmät estereissä optimaalisesti käsittävät fenyyli- '5 tai bentsyyliryhmän. Alkyyliryhmä voi olla suora, haarautunut tai syklinen, ja on optimaalisesti C^o-ryhmä. | 1. L-nukleosidien synteesi Tässä julkistetut L-nukleosidit voidaan valmistaa 15 kuten kuvataan alla yksityiskohtaisesti tai muilla, alan s ammattilaisille tutuilla menetelmillä.

Alla kuvatuissa synteesikaavioissa muita tavanomai- ..

siä reagensseja, mukaan lukien ekvivalenttisia happoja, emäksiä ja liuottimia, voidaan käyttää mainittujen tilalla 4 20 kuten alan keskimääräisillekin taitajille tuttua. Voidaan i käyttää laajaa valikoimaa hapen tai typen suojaryhmiä, ku- t : ·*; ten esitetään esimerkiksi kirjassa Greene et ai., "Protec- • ♦ · tive Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, 2. >' painos, 1991. Sopivia hapen ja typen suojaryhmiä ovat esi- ; • * ♦ ' . 25 merkiksi trisubstituoitu silyyliryhmä kuten trimetyylisi- ·« lyyli, dimetyyliheksyylisilyyli, t-butyylidimetyylisilyy- | *** li, t-butyylidifenyylisilyyli, trityyli, alkyyliryhmä, f ♦ · · *·* * asyyliryhmät kuten asetyyli, propionyyli, bentsoyyli, ρ-ΝΟ,-bentsoyyli, bentsyyli tai toluyyli, metyylisulfonyyli • · * : 30 tai p-toluyylisulfonyyli. Funktionaaliset happi- ja typpi- ··· ryhmät heterosyklisessä emäksessä tulisi suojata ennen ,j .·♦·. kondensointia sokeriin. ΐ • · ·> MM« Sopivia pelkistimiä ovat NaBH4, di-isobutyylialumi- | • » · * . niumhydridi (DIBAL-H), litiumboorihydridi (LiBH4) ja nat- 35 riumbis( 2-metoksietoksi )aluminiumhydridi (Red-Al). Sopivia ·««·· • · 117475 11 -f*

' . -'C

hapettimia ovat kromihapon (Cr03) hapan vesiliuos, natrium- ·

dikromaatti (Na2Cr07), pyridiniumkloorikromaatti (PCC), py- T

ridiniumdikromaatti (PDC), kaliumpermanganaatti (KMn04), lyijytetra-asetaatti/pyridiini, happi platina/hiili-kata-5 lysaattorilla, Ru04, Ru04/NaI04, dimetyylisulfoksidi/disyk- 4 loheksyylikarbodi-imidi (DMSO/DCC) ja protoniluovuttaja, | hopeakarbonaatti, trifenyylivismuttikarbonaatti, Oppen-auer-hapetin (aluminiumalkoksidit asetonissa) ja mangaanidioksidi (allyyli- tai bentsyylialkoholien selektiiviseen i" :f\ 10 hapetukseen muiden alkoholien läsnä ollessa).

Friedel-Crafts-katalysaattoreita (Lewis-happoja), joita voidaan käyttää kondensaatioreaktiossa, ovat SnCl4,

ZnCl4, TiCl4, A1C13/ FeCl3, BF3-dietyylieetteri ja BC13. Nämä katalysaattorit edellyttävät vedettömiä olosuhteita, koska 15 veden läsnäolo laskee niiden aktiivisuutta. Nämä katalysaattorit inaktivoituvat myös orgaanisten liuottimien läsnä ollessa, joissa on aktiivisia vetyjä, kuten alkoholit ja orgaaniset hapot. Näitä katalysaattoreita käytetään tyypillisesti liuottimissa kuten hiilidisulfidi, metylee- f 20 nikloridi, nitrometaani, 1,2-dikloorietaani, nitrobentsee- κ ni, tetrakloorietaani, klooribentseeni, bentseeni, toluee- % : ni, dimetyyliformamidi, tetrahydrofuraani, dioksaani tai • · · ;*·*· asetonitriili. Vedetön aluminiumkloridi ei liukene hiili- ; * · \ disulfidiin [Niedballa et ai., J. Org, Chem. 39 (1974) s ; 25 25]. Edullinen katalysaattori on SnCl4. Edullinen liuotin • · · *t,* on 1,2-dikloorietaani. Trimetyylisilyylitriflaattia voi- i • ♦ · daan käyttää samoissa olosuhteissa kuin kuvataan edellä • ♦ # ** Friedel-Crafts-katalysaattoreille. Reaktio tapahtuu lämpö tila-alueella -10 - +200 °C. Desilylointi voidaan suorit- ϊ·ί : 30 taa erilaisilla reagensseilla, mukaan lukien etikkahappo, ··· trifluorietikkahappo, fluorivety, n-tetrabutyyliammonium- $ .***. fluoridi, kaliumfluoridi ja pyridinium-HCl.

Viitaten kuvioon 3 L-ksyloosista (la) lähtien kes- -i • · « kelnen välituote l-0-asetyyli-2,3,5-tri-0-bentsoyyli-6-L- ..ΓΓ 35 ribofuraanoosi (10) syntetisoitiin kokonaissaannon olles- • · · « « • « ... ‘λ 117475 12 sa 20 % [L. Vargha, Chem. Ber. 87 (1954) 87; Holy, A., et al., Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry VI >

163 - 167]. Kuten esitetään kuviossa 4, yhdiste 10 voidaan myös syntetisoida kalliimmasta lähtömateriaalista L-riboo-5 si [Holy et ai., Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry VI 163 - 167]. Kuviossa 3 esitetään vaihtoehtoinen synteesi yhdisteelle 10 (saanto 53 %), joka sitten fluo-rattiin C2:ssa [J. Org. Chem. 50 (1985) 3644 - 3647] 1,3,5-tri-0-bentsoyyli-2-deoksi-2-fluori-L-arabinofuraanoosin I

10 (13) saamiseksi, joka kondensoitiin eri emäksiin bromiso- kerin välityksellä 2’-deoksi-21-fluoriarabinofuranosyyli- nukleosidien saamiseksi vaihtelevin saannoin. %

X

1,2-di-O-isopropylideeni-a-L-ksylofuranoosi (3) 650 ml:aan vedetöntä asetonia lisättiin 4 ml kons.

15 rikkihappoa, 5 g molekyyliseula-ainetta (4 A), 80 g vede- v töntä kupari(2Jsulfaattia ja 50 g L-ksyloosia, ja seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 36 tunnin ajan. Reaktio- seos sudoatettiin ja pestiin perusteellisesti asetonilla, * yhdistetty suodos neutraloitiin ammoniumhydroksidilla ja 20 haihdutettiin sitten kuiviin. Jäännökseen lisättiin etyy- ··? liasetaattia (200 ml), minkä jälkeen suodattamlla ja kui- . viin haihduttamalla saatiin öljy, joka liuotettiin 250 • · · ml:aan 0,2-%:ista HCl-liuosta ja sekoitettiin huoneenläm- t • · · :

Potilassa 2,5 tunnin ajan. pH säädettiin 8:ksi lisäämällä | * · · ' ': , 25 kyllästettyä NaHCO.-liuosta, minkä jälkeen haihdutettiin < • · * * ^ • ,* kuiviin ja uutettiin jäännöstä etyyliasetaatilla. Pois- • · · *··’ tamalla liuotin saatiin keltaisena öljynä yhdistettä 3 V : (41,7 g, 82,3 %).

^-NMR (CDC13): 6 5,979 (d, J=3,78Hz, 1H, H-l); I.:*· 30 4,519 (d, J=3,6Hz, 1H, H-2); 4,308 (leveä d, 1H, H-3); 4,080 (m, 3H, H-4 ja H-5); 1,321 (s, 3H, CH3); 1,253 (s, § .*··. 3H, CH3).

• * 4 *· ·/ * · · * · • · ·*« • · · « • ·; * · * * « • ♦ 117475 13 1,2-di-0-isopropylideeni-3,5-di-O-o-tolyylisulfo-nyyli-a-L-ksylofuraanoosi (4) ?

Yhdistettä 3 (40 g, 210 mmol) sekoitettiin 500 mlrssa vedetöntä pyridiiniä 0 °C:ssa samalla, kun lisät-5 tiin tipoittain liuos, jossa oli TsCliää (75 g, 393 mmol) liuotettuna 100 ml:aan CHC13. 3 tunnin kuluttua toinen an- y, nos TsCl:ää (50 g, 262 mmol) 50 ml:ssa CHC13 lisättiin samoin kuin edellä. Seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 24 tunnin ajan, minkä jälkeen se jäähdytettiin 0 °C:seen, | 10 vettä (10 ml) lisättiin ja sekoitettiin sitten huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan. Reaktioseos kaadettiin 500 ml:aan jäävettä, uutettiin CHCl3:lla (150 ml x r 4), pestiin 1,5 M H2S04:llä (150 ml x 4), kyllästetyllä *

NaHC03-liuoksella (200 ml x 2) ja kuivattiin (MgS04).

15 Poistamalla liuotin saatiin ruskea siirappi, josta

EtOH:sta kiteyttämällä saatiin yhdistettä 4 valkoisena kiinteänä aineena (103,8 g, 99 %).

1H-NMR (CDC13): 6 7,282, 7,836 (m, 8H, OTs); 5,849 (d, J=3,51Hz, 1H, H-l); 4,661, 4,779 (m, 2H, H-3 ja H-4); 20 4,193 (kaksois-d, 1H, H-2); 4,011 (d, 2H, H-5); 2,448, f 2,478 (2s, 6H, -OTs); 1,261, 1,320 (2s, 6H, CH3). | : l,2-di-0-asetyyli-3,5-di-0-p-tolyylisulfonyyli-a,B- •»· i ksylofuranoosi (5) 1 • · · .."Sr

Yhdistettä 4 (70 g, 140,5 mmol) liuotettiin 700 \

• · * . V

m»t . 25 ml:aan jääkylmää AcOH:ta ja 100 ml:aan Ac20:ta samalla, ‘ • · · ,* kun 50 ml kons. rikkihappoa lisättiin tipoittain 0 °C:ssa.

“ ♦ · · • · · s ’** Saatua liuosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa yön yli, Λ • · · • minkä jälkeen se kaadettiin 1 litraan jäävettä, uutettiin CHCl3:lla (200 ml x 4), pestiin kyllästetyllä NaHC03-liuok- h: : 30 sella ja kuivattiin (MgS04). Poistamalla liuotin tyhjös- »·· :...· sä saatiin yhdistettä 5 siirappina (84,2 g, raakasaanto ; 110 %). - • · - • · · • · ;; • ·* • '/ ··· ·♦··; <·

* -V

••M, f :1 ’f : 14 117475

Metyyli-3,5-di-0-p-tolyylisul£onyyli-a,B-ksylofura- noosi (6)

Epäpuhdasta yhdistettä 5 (80 g) sekoitettiin 500 mlrssa 1 % HCl/CH30H:ta huoneenlämpötilassa 30 tunnin ajan.

5 Liuotin poistettiin alipaineessa, jäännös liuotettiin 300 ml:aan CHC13, pestiin kyllästetyllä NaHC03-liuoksella ja kuivattiin (MgS04). Poistamalla liuotin saatiin yhdistettä 6 siirappina (60 g, 90 % 4:stä).

Metyyli-2-0-bentsoyyli-3,5-di-0-p-tolyylisulfonyy-10 li-a,β-ksylofuranosidi (7)

Siirappia 6 (60 g, 127 mmol) liuotettiin 200 ml:aan pyridiiniä ja sekoitettiin 0 °C:ssa samalla, kun bentsoyy- ΐ likloridia (40 ml, 345 mmol) lisättiin tipoittain, minkä jälkeen saatua liuosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 15 17 tunnin ajan. Se konsentroitiin noin 50 mltksi, min kä jälkeen se kaadettiin 300 ml:aan jäävettä, uutettiin --¾ CHCl3:lla, pestiin 3 N H2S04:llä ja kyllästetyllä NaHC03-liuoksella ja kuivattiin (MgS04). Liuotin eroon haihduttamalla saatiin yhdistettä 7 siirappina (71 g, 97 %).

20 Metyyli-2,3,5-tri-0-bentsoyyli-a-B-L-ribofuranosidi j (9) f • ·? • ;’· Siirappia 7 (70 g) ja natriumbentsoaattia (100 g, :| • · · .*.·. 694 mmol) suspendoitiin 1 200 ml:aan DMFrää ja sekoitet- ' $ • * · . '· .·$· • * tiin mekaanisesti palautusjäähdyttäen 16 tunnin ajan. Seos i • · « -f f>t . 25 jäähdytettiin huoneenlämpötilaan, minkä jälkeen se kaadet- r * ♦ · tiin 1 litraan jäävettä, uutettin eetterillä ja kuivattiin v • · · ** l” (MgS04). Haihduttamalla liuotin saatiin siirappi (50 g, • · · *·* ' 8a ja 8b), joka liuotettiin 180 ml:aan pyridiiniä ja bent- soyloitiin (BzCl, 20 ml, 172 mmol) 17 tunnin ajan huoneen- • * · 30 lämpötilassa. Jatkotyöstön jälkeen saatiin yhdistettä 9 ··* siirappina (48 g, 83 %:n saanto 7:stä).

.···. l-0-asetyyli-2,3,5-tri-0-bentsoyyli-B-L-ribofura- ! • · ’'i£· ***. noosi (10) * ·*··· 7 * · . Yhdistettä 9 (26 g, 54,6 mmol) käsiteltiin seoksel- -f • · ,,i:* 35 la, jossa oli 275 ml jääetikkaa, 55 ml asetanhydridiä ja \ • · · · « * ♦ 117475 15 16 ml kons. rikkihappoa, lämpötilassa 0 eC:sta huoneenläm- ^ potilaan 17 tunnin ajan. Tämän jälkeen seos kaadettiin f : -ip 1 litraan jaavetta ja uutettiin kloroformilla (200 ml x . * 4). Yhdistetyt uutteet pestiin kyllästetyllä NaHC03-liuok-5 sella ja kuivattiin (MgS04). Poistamalla liuotin saatiin ruskea siirappi, jota etanolilla käsittelemällä saatiin | yhdistettä 10 valkoisena kiinteänä aineena (8,8 g, 32 %).

Sp. 124,7 °C, kirj. 129 - 130 °C; D-muoto: 130 - 131 eC [a]D = -45,613 (c=l,0, CHC13), D-muoto: [a]D = +44,2. :-.-¾ 10 1H-NMR (CDC13): 6 7,317, 8,134 (m, 15H, OBz); 6,437 (s, 1H, H-l); 5,835 (m, 2H, H-2 ja H-3); 4,649 (m, 3H, H-4 ja H-5); 2,003 (s, 3H, CH3C00-).

l-0-asetyyli-2,3,5-tri-0-bentsoyyli-B-L-ribofura-noosi (L-riboosista) 15 L-riboosia (5 g, 33,3 mmol) suspendoitiin 120 ml:aan 1 % HCl/MeOH:ta ja sekoitettiin huoneenlämpötilassa f 3 tunnin ajan, jolloin saatiin kirkas liuos. Reaktio keskeytettiin lisäämällä 30 ml vedetöntä pyridiiniä, minkä jälkeen seos haihdutettiin alipaineessa kuiviin. Saatu « 20 siirappi haihdutettiin yhdessä pyridiinin kanssa (30 ml x £' 2), minkä jälkeen jäännös liuotettiin 80 ml:aan vedetöntä j, • ;*; pyridiiniä ja sekoitettiin 0 °C:ssa samalla, kun bentsoyy- * · · ,*.·. likloridia (20 ml, 172 mmol) lisättiin tipoittain. 17 tun- • · · • · nin sekoituksen huoneenlämpötilassa jälkeen reaktio oli f • · · : .f . 25 mennyt loppuun. Vettä (10 ml) lisättiin ja seosta sekoi- • · φ ''·£?

* .* tettiin huoneenlämpötilassa 0,5 tunnin ajan, minkä jäi- I

• · keen se haihdutettiin noin 50 ml:ksi, joka kaadettiin 150 *·* ml:aan jäävettä, uutettiin kloroformilla (50 ml x 4), pes tiin toisiaan seuraten 3 N H2S04:llä (30 ml x 2), kylläste- • · I 30 tyllä NaHC03-liuoksella (30 ml x 3) ja kuivattiin (MgS04).

• · ·

Poistamalla liuotin saatiin yhdistettä 9 siirappina 13 g. I

,···. Yhdiste 9 -raakatuote liuotettiin 80 ml:aan HBr/ • ·

AcOH:ta (45 %, paino/tilavuus), ja sekoitettiin 1,5 tunnin f . ajan huoneenlämpötilassa. Tähän seokseen lisättiin jää- r 35 etikkaa (50 ml) ja saatua liuosta sekoitettiin 0 °C:ssa 117475 16 samalla, kun 34 ml vettä lisättiin hitaasti lämpötilan | . y pysyttämiseksi alle 7 °C:ssa. Sitten seosta sekoitettiin f huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan, minkä jälkeen se : kaadettiin 200 ml:aan jäävettä ja uutettiin kloroformil-5 la (50 ml x 5). Yhdistetyt uutteet pestiin kyllästetyllä ;

NaHC03-liuoksella ja kuivattiin (MgS04). Liuotin poistamalla saatiin siirappi (13 g), joka liuotettiin 40 ml:aan vedetöntä pyridiiniä ja sekoitettiin 0 °C:ssa, minkä jälkeen lisättiin tipoittain asetanhydridiä (14 ml, 148,4 mmol).

10 Kun reaktio oli valmis, seos kaadettiin 150 ml:aan jäävettä, uutettin kloroformilla (50 ml x 4), pestiin toisiaan seuraten 3 N H2S04:llä (30 ml x 2), kyllästetyllä NaHC03- f "jfl liuoksella (50 ml x 2), ja kuivattiin (MgS04). Liuotin i poistamalla ja metanolilla käsittelemällä saatiin yhdis-15 tettä 10 valkoisena kiinteänä aineena (9,2 g, 53,7 % L-riboosista).

1,3,5-tri-0-bentsoyyli-a-L-ribofuranoosi (11)

Yhdistettä 10 (9 g, 17,84 mmol) sekoitettiin 100 ml:ssa CH2Cl2:ta 0 °C:ssa samalla, kun 70 ml CH2Cl2:ta, jo- 20 ka sisälsi HBr:ää (3,2 g, 30,5 mmol), lisättiin yhtenä Ϊ eränä. Seosta sekoitettiin 0 eC:ssa 3,5 tunnin ajan, vettä : (55 ml) lisättiin ja seosta sekoitettiin huoneenlämpöti- • « « lassa 18 tunnin ajan. Orgaaninen faasi erotettiin, se pes- • · tiin kyllästetyllä NaHC03-liuoksella ja kuivattiin (MgS04). v • · 1 · · ° · · -’v #·. ; 25 Liuotin haihduttamalla saatiin vaahto, josta CH2Cl2:sta ja • ·· .1 n-heksaanista uudelleenkiteyttämällä saatiin yhdistettä 11 **; valkoisena kiinteänä aineena (6,2 g, 75,5 %). Sp. 137 - 138 ÖC, kirj. 140 - 141 °C, [a]D = -81,960 (c=0,55, CHC13); D-muoto: [a]D = +83,71.

Φ m : 30 ^-NMR (CDC13): δ 7,312, 8,187 (m, 15H, OBz); 6,691 C,: (d, J=4,59Hz, H-l); 5,593 (kaksois-d, J4_3=6,66Hz; J2.3= 1,8Hz, 1H, H-30); 4,637, 4,796 (m, 4H, H-2, H-4 ja H-5); 4 • · ;·,$! .!!!: 2,3 (b, OH). f • · ··· • ·« · · , 1‘ 117475 17 "s* 1,3,5-tri-0-bentsoyyli-2-0-imidatsosulfyryyli-a-L- ^ ribofuranoosi (12) ΐ

Yhdistettä 11 (5,94 g, 12,84 mmol) sekoitettiin 50 ml:ssa vedetöntä CH2Cl2:ta -15 °C:ssa (kuivajää-CCl4). Ve-5 detöntä DMF:ää (15 ml) ja sulfyryylikloridia (3,2 ml, 3,98 mmol) lisättiin peräkkäin. Liuosta sekoitettiin -15 °C:ssa | 30 minuutin ajan, minkä jälkeen se jätettiin huoneenlämpö-tilaan 4 tunniksi. Imidatsolia (8,7 g, 12,78 mmol) lisättiin 3 erässä samalla, kun reaktioseosta jäähdytettiin 10 jäähauteessa. Sitten sitä sekoitettiin 17 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Seos kaadettiin 150 ml:aan jäävettä ja vesifaasia uutettiin CH2Cl2:lla (50 ml x 3). Yhdistetyt orgaaniset faasit pestiin vedellä ja kuivattiin (MgS04). i

Puhdistamalla kolonnissa (heksaani/EtOAc 5:1 -> 1:1) saa-15 tiin yhdistettä 12 valkoisena kiinteänä aineena (3,7 g, 49 %). Sp. 124,5 - 125,5 eC, kirj. 129 °C; [a]D = -68,976; D-muoto: +66,154. -% 1H-NMR (CDC13): 6 6,9, 8,2 (m, 18H, Ar-H); 6,67 (d, J=4,4Hz, 1H, H-l); 5,59 (kaksois-d, 1H, H-3); 5,21 (kak-20 sois-d, 1H, H-2); 4,5, 4,8 (m, 3H, H-4 ja H-5).

1,3,5-tri-0-bentsoyyli-2-deoksi-2-fluori-a-L-ara- * • ·’· binofuranoosi (13) • §

Suspensiota, jossa oli yhdistettä 12 (3,33 g, 5,62 ^

• * . . X

.·;·. mmol), KHF2:ta (1,76 g, 22,56 mmol) 30 ml:ssa 2,3-butaani- ϊ • · · V' .·, . 25 diolia, sekoitettiin argonsuojakaasussa. Seos kuumennet- fl • · · tiin 150 °C:seen samalla, kun 1 ml HF/H20:ta (48-%:inen • · * ' %-liuos, 27,6 mmol) lisättiin ja seosta sekoitettiin ' • · · *** * 160 °C:ssa 1,5 tunnin ajan. Suolavesi-jäätä lisättiin reaktion pysäyttämiseksi, minkä jälkeen liuosta uutettiin • * hi: 30 metyleenikloridilla (50 ml x 4). Yhdistetyt uutteet pes- • · · tiin suolavedellä, vedellä, kyllästetyllä NaHC03:lla, kui- | • '·$

.♦··. vattiin kidevedettömällä magnesiumsulfaatilla ja aktiivi- I

• · *-v hiilellä (Darco-60). Se kaadettiin silikageelityynylle | • · . (5 cm x 5 cm), pestiin ensin metyleenikloridilla ja sitten • .:4 ..*♦* 35 EtOAc:llä, jolloin saatiin siirappi, josta 95-%:isesta *·**« • ♦ 18 1 1 7475

EtOH:sta kiteytettämällä saatiin yhdiste 13 (1,3 g, 49,8 %). Sp. 77 - 78 °C; kirj. 82 eC. Ä ^-NMR (CDC13): ö 7,314, 8,146 (m, 15H, OBz); 6,757 ? (d, J=9,1Hz, 1H, H-l); 5,38 (d, J=48,5Hz, 1H, H-2); 5,630 5 (kaksois-d, J=22,5Hz, 1H, H-3); 4,768 (m, 3H, H-4 ja H-5).

N9- [3', 5 ' -di-O-bentsoyyli-2' -deoksi-2'-fluori-fi-L-arabinofuranosyyli]-2,6-diklooripuriini (15)

Yhdistettä 13 (464 mg, 1 mmol) liuotettiin 10 ml:aan metyleenikloridia ja lisättiin 1,4 ml HBr/AcOH:ta 10 (45 % paino/tilavuus). Liuosta sekoitettiin huoneenlämpö- tilassa 24 tunnin ajan, minkä jälkeen se haihdutettiin kuiviin. Jäännös liuotettiin 20 ml:aan metyleenikloridia, j ja liuos pestiin vedellä, kyllästetyllä NaHC03-liuoksella sekä kuivattiin (MgS04). Suodattamalla ja kuiviin haihdut-15 tamalla saatiin bromisokeria 14 (100 % TLC:n perusteella).

Samanaikaisesti 2,6-diklooripuriinia (378 mg, 2 - mmol) suspendoitiin 15 ml:aan HMDS:ää, jossa oli 2 mg am-moniumsulfaattia, minkä jälkeen keitettiin palautusjääh-dyttäen 2 tunnin ajan. HMDS haihdutettiin tehokkaassa tyh-20 jössä N2-suojakaasussa, jolloin saatiin valkoista silyloi- | tua emästä.

• .·. Bromisokeria 14 liuotettiin 25 ml: aan vedetöntä • * ·

Hl 1,2-dikloorietaania. Saatu liuos lisättiin silyloituun |

• · I

emäkseen N2-suojakaasussa. Seosta keitettiin sekoittaen ja ^ • · ♦ ·.'·"> I . 25 palautusjäähdyttäen 2 päivän ajan. Lisättiin kloroformia I ·· *.* (30 ml), minkä jälkeen pestiin toisiaan seuraten vedellä ' • · · v *·|·* (20 ml x 2), kyllästetylä NaHC03-liuoksella (20 ml x 2), 5 *♦* * kyllästetyllä NaCl-liuoksella (20 ml x 2), ja kuivattiin (MgS04). Yhdiste 15 (105 mg, 19,7 %) kiteytettiin ·.:*· 30 CHC13: sta. Sp. 158 eC, D-muoto 158 °C.

UV (metanoli): lambdamakB : 238,50 nm, 273,0 nm. | 1H-NMR (300 MHz, DMS0-d6): Ö 8,82 (d, J=l,5Hz, 1H, f

H-8); 7,49, 8,33 (m, 10H, OBz); 6,767 (kaksois-d, J =4Hz, I

KF.H=13,8Hz, 1H, H-l' ); 5,854 (kaksois-q, J=67,4Hz, 1H, I

' *£

35 H-2'); 5,910 (m, 1H, H-3'); 4,751 (m, 3H, H-4' ja H-5'). I

« • · 117475 ' 19 .

N9-[21-deoksi-2’-fluori-B-L-arabinofuranosyyll]-2,6-diklooripuriini (16) ';?j

Yhdistettä 15 (70 mg, 0,13 mmol) liuotettiin 25 ml:aan kyllästettyä NH3/CH3OH:ta tiiviiisti suljetussa te-5 räspommissa, ja kuumennettiin 90 °C:ssa 6 tunnin ajan. Poistamalla liuotin alipaineessa saatiin keltainen puoli-kiinteä aine, jota puhdistettiin preparatiivisella TLCrllä (9:1, CHCI3/CH3OH). Lyofilisoimalla vedestä ja 1,4-dioksaa-nista saatiin valkoisena jauheena yhdistettä 16 (30 mg, ·...

10 75 %).

UV (H20) pH 2, lambdanake> 212,00 nm, 263,50 nm (eeta 6711); pH 7, larnbdamake 213,50 nm, 263,00 nm (eeta 7590); . .· pH 11, lambdamaks 213,5 nm, 263,00 nm (eeta 5468). ·/ 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 8,279 (d, J=l,5Hz, 1H, 15 H-8); 7,908 (leveä s, 2H, NH2); 6,321 (kasois-d, Jh_h=4,4Hz,

Jf_h=13,8Hz, 1H, H-l' ); 5,986 (t, 1H, 5'-0H); 5,230 (kak-sois-t, JF_H=52,6Hz, 1H, H-2 · ): 5,115 (d, 1H, 3’-0H); 4,425 (kaksois-q, JF_H=19Hz, 1H, H=3'); 3,841 (m, 1H, H-4'); 3,636 (d, 2H, H-5').

20 Nj- (2'-deoksi-2'-fluori-3',5'-di-O-bentsyyli-B-L- arabinofuranosyyli)tyrniini (17) 5 * :1· Liuokseen, jossa oli yhdistettä 13 (400 mg, 0,86 ··· } mmol) vedettömässä CH2Cl2:ssa (10 ml), lisättiin bromivetyä ·? • · etikkahapossa (45 % paino/tilavuus, 1,5 ml), ja saatua * · · ; 25 seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 17 tunnin ajan.

• ··

Haihduttamalla liuotin eroon ja sitten haihduttamalla · I v :··ί * 1 1 *** yhdessä tolueenin kanssa saatiin yhdistettä 14. | m 1 · -f1 *·1 Samanaikaisesti tymiiniä (215 mg, 1,72 mmol) kei tettiin palautusjäähdyttäen HMDSrssä (25 ml) typpisuoja- • ♦ : 30 kaasussa 17 tunnin ajan homogeenisen liuoksen saamiseksi.

• · »

Liuotin haihduttamalla saatiin silyloitua tymiiniä. | • r-i .·»·. Liuos, jossa oli yhdistettä 14 dikloorietaanissa ·: (50 ml) lisättiin silyloituun tymiiniin, ja saatua liuosta • · . keitettiin palautusjäähdyttäen typpisuojakaasussa 3 päivän ‘ 'Ky ..1·1 35 ajan. Lisättiin vettä, minkä jälkeen uutettiin CHCl3:lla. ^ · i ,-ii 20 117475

Orgaaninen faasi pestiin vedellä, suolaliuoksella ja kui- | vattiin (MgSO,). Haihduttamalla liuotin eroon saatiin raa- fi ;-i|l katuotetta, jota puhdistettiin preparatiivisella TLC:llä ^ käyttäen 2 % MeOH/CHCl3, jolloin saatiin yhdistettä 17 (235 5 mg, 58 %). Sp. 99 - 101 eC.

UV (metanoli): 230, 264 nm; [a]D - +22,397. 1¾ 1H-NMR (CDC13): & 7,343 - 8,389 (m, 12H, Ar-H, NH); 6,34 (kaksois-d, JH_H« 2,97Hz, JF.H= 28,32Hz, 1H, H-l'); 5,383 (kaksois-d, Jh_h=2,7Hz, Jf.h=63,27Hz, 1H, H-2'); 5,565 10 (kaksois-d, 1H, H-3'); 4,812 (d, 2H, H-5'); 4,466 (m, 1H, H-4' ); 1,775 (s, 3H, CH3).

Koostumusanalyysi (C24H21N207F): C 61,01; H 4,57; .

N 5,73; F 3,92. *

Nx-(2'-deoksi-2'-f luori-fl-L-arabinofuranosyyli) ty-15 miini (18)

Yhdistettä 17 (145 mg, 0,309 mmol) käsiteltiin NH3/ CH30H:lla huoneenlämpötilassa 18 tunnin ajan. Liuotin eroon haihduttamalla ja sitten jäännöstä preparatiivisella TLCrllä puhdistamalla (15 % MeOH/CHCl3) saatiin yhdis-20 tettä 18 (70 mg, 87,5 %). Sp. 174 - 175 °C. | UV: 264 nm; [a]D = -104,36. § Ϊ.Λ 1H-NMR (DMS0-d6): 6 11,401 (s, 1H, NH); 7,575 (s, :*·*; 1H, H-6); 6,093 (kaksois-d, Jh.h=4,41Hz, Jf.h=15,6Hz, H-l'); |

5,844 (d, 1H, 3' -OH); 5,019 (kaksois-t, Jf_h=53,3Hz, 1H, I

; 25 H-2'); 5,087 (t, 1H, 5'-0H); 4,194 (kaksois-q, 1H, H-3');

* M

3,647 (m, 3H, H-4' ja H-5'); 1,781 (s, 3H, CH3).

• · · «

Koostumusanalyysi (C10H13N2FOS): C 44,80; H 4,97; 1 N 10,04; F 7,03.

Nx-(2’-deoksi-2'-fluori-3’,5 *-di-O-bentsoyyli-B-L- * * t *·! ί 30 arabinofuranosyyli)-5-etyyliurasiili (19) ··«

Liuokseen, jossa on yhdistettä 13 vedettömässä di- ·***; kloorimetaanissa (10 ml), lisättiin bromivetyä etikkaha- i ··· possa (45 % paino/tilavuus, 0,97 ml, 5,385 mmol). Liuosta * · sekoitettiin huoneenlämpötilassa 18 tunnin ajan, minkä ··· · « • . ·' c ···* ·'·.·; ·**«· • · ·.; > 117475 21 jälkeen haihduttamalla liuotin eroon ja haihduttamalla f kuiviin yhdessä tolueenin kanssa saatiin yhdistettä 14. |

Samanaikaisesti 5-etyyliurasiilia (0,75 g, 5,39 mmol) suspendoitiin HMDS:ään (10 ml) ammoniumsulfaatin 5 (5 mg) kanssa, ja keitettiin palautusjäähdyttäen 5 tunnin ajan typpisuojakaasussa homogeenisen liuoksen saamiseksi.

Silyloitu emäs -liuos haihdutettiin kuiviin välttäen kosketusta kosteuteen. Saatuun siirappiin lisättiin liuos, jossa oli yhdistettä 14 vedettömässä 1,2-dikloori- ' , 10 etaanissa (10 ml). Reaktioseosta sekoitettiin 95 °C:ssa typpisuojakaasussa 20 tunnin ajan, minkä jälkeen se haihdutettiin tyhjössä kuiviin, jolloin saatiin keltaista kiinteää ainetta, joka sekoitettiin 5 ml:aan CH30H/CHC13 (1:1) ja suodatettiin. Suodos kuiviin haihduttamalla saa-15 tiin jäännös, jolla suoritettiin kromatografia-ajo silika- geelikolonnissa (CH30H/CHC13, 0 - 1 %), jolloin saatiin f valkoisena kiinteänä aineena yhdistettä 19 (0,557 g, 100 %).

1H-NMR (DMS0-d6): 6 11,55 (s, 1H, NH); 7,51, 8,08 20 (m, 10H, Ar-H); 7,32 (s, 1H, H-6); 6,29, 6,37 (kaksois-d, f

Jh_h=3,7Hz, Jf_h=20Hz, 1H, H-l'); 5,68 - 5,75 (kaksois-d, ']

Jf.h=20Hz, 1H, H-3'); 5,47 - 5,65 (kaksois-d, Jf_h=54Hz, 1H, :*:*· H-2'); 4,62 - 4,83 (m, 3H, H-4' ja H-5'); 2,01, 2,09 (q, 1 * · :*·*; 2h, ch2-ch3); 0,85 (t, 3h, ch3). .% * .·. : 25 N.-(2' -deoksi-2f-fluori-B-L-arabinofuranosyyli)-5- • ·· A • · , etyyliurasiili (20) • · ·

Hl Yhdistettä 19 (500 mg) liuotettiin ammoniakin meta- Λ • * · * noliliuokseen (50 ml), ja sekoitettiin huoneenlämpötilassa 44 tunnin ajan. Liuos kuiviin haihduttamalla saatiin vai- • * # ϊ·ί ϊ 30 koista kiinteää ainetta (0,4 g), jolla suoritettiin kroma- • · · :£· tografia-ajo silikageelikolonnissa (CH30H/CHC13, 0 - 5 %), f • . f

,···. jolloin saatiin valkoisena kiinteänä aineena yhdistettä 20 H

(240 mg, 84 %). Sp. 158 - 161 °C. I

. UV (MeOH): larnbdamaks. 260 nm. | ··# , ··«·« 1 ' ‘ t • · 117475 22

^-NMR (DMSO-d6): 6 11,42 (s, 1H, NH); 7,57 (s, 1H, U

H-6'); 6,10, 6,17 (kaksois-d, Jh.h=5,0Hz, Jf_h=14Hz, 1H, | H-l’); 5,88 (leveä s, 1H, 3'-0H); 5,14, 5,19 (m, 2H, H-2' - ja 5'-OH); 4,98 (t, 1H, H-3’); 4,22, 4,28 (m, 1H, H-4'); 5 3,55, 3,78 (m, 2H, H-5').

Koostumusanalyysl (CnH15N205F): C 47,93; H 5,56; I

N 10,06; F 6,68.

Nj-(2'-deoksi-2'-fluori-3',5'-di-O-bentsoyyli-B-L-arabinofuranosyyli) -N4-bentsoyyli-5-jodisytosiini (21) I

1 · '“i* 10 Liuokseen, jossa oli yhdistettä 13 (150 mg, 0,323 mmol) vedettömässä metyleenikloridissa (5 ml), lisättiin bromivetyä etikkahapossa (45 % paino/tilavuus, 0,29 ml, 1,615 mmol). Reaktioseosta sekoitettiin huoneenlämpötilas- ? sa 9,5 tunnin ajan. Haihduttamalla liuotin eroon ja sitten 15 haihduttamalla kuiviin yhdessä tolueenin kanssa saatiin yhdistettä 15 keltaisena siirappina.

Samanaikaisesti N4-bentsoyyli-5-jodisytosiinia (550 ; mg, 1,615 mmol) suspendoitiin HMDS tään (8 ml) ammoniumsul-faatin (3 mg) kanssa, ja keitettiin palautusjäähdyttäen 5 20 tunnin ajan typpisuojakaasussa homogeenisen liuoksen saa- f ’ £ miseksi. r j ·’· Silyloitu emäs -liuos haihdutettiin kuiviin vält- ·*;*; täen kosketusta kosteuteen. Saatuun siirappiin lisättiin t • · * ·.< liuos, jossa oli yhdistettä 14 vedettömässä 1,2-dikloori- f .*. · 25 etaanissa (10 ml). Reaktioseosta keitettiin palautusjääh- * · .* dyttäen typpisuojakaasussa 23 tunnin ajan, minkä jälkeen i • » · ^

II’ se haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin ruskea siirappi, I

• · ♦ • Φ · · l * jota trituroitiin kloroformissa (30 ml). Saatu sakka suodatettiin eroon ja pestiin kloroformilla. Suodos ja pesu- • · · : 30 erät yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saa- • ·« tiin ruskeaa siirappia. Tuoteseos erotettiin kromatografi- | .·*·. sesti silikageelikolonnissa (CH30H/CHC13, 0 - 1 %), jolloin ? ··· saatiin valkoista kiinteää ainetta 21 (100 mg, 45 %).

* · • 1H-NMR (CDC13): 6 11,40 (leveä s, 1H, NH); 7,26, 35 8,20 (m, 17H, Ar-H, H-6 ja NH); 6,36, 6,44 (kaksois-d, • · « t · * · 117475 23 J„_„=2,8Hz, Jf_h=21Hz, lH, H-l*); 5,62, 5,68 (kaksois-d, 1H, H-3' ); 5,39, 5,56 (kaksois-d, 1H, H-2'); 4,58, 4,85 (m, 3h, h-4 ' ja H-5 ’ ). ''% N3-(2'-deoksi-21-fluori-8-L-arabinofuranosyyli)-5-® jodisytosiini (22)

Yhdistettä 21 (100 mg, 0,27 mmol) käsiteltiin ammo- § niakilla kyllästetyllä metanolilla (60 ml) huoneenlämpötilassa 24 tunnin ajan. Suorittamalla kromatografia-ajo si-likageelikolonnissa (0 - 10 % CH30H/CHC13) saatiin yhdis-•*0 tettä 22 (35 mg, 71 %) valkoisena kiinteänä aineena. [a]D * 1, -65,4 (c=0,34, CH30H).

UV (MeOH): lambdaraak8 - 293 nm.

; '•fcri lH-NMR (DMS0-d6): δ 8,04 (s, 1H, H-6); 6,74, 7,94 | (s, 1H, NH); 6,01, 6,08 (kaksois-d, Jh_h=3,9Hz, Jf.h=16,6Hz, 15 1H, H-l')? 5,85 (d, 1H, 3'-0H); 5,17 (t, 1-H, 5'-0H); 5,08 (t, 1H, H-2'); 4,89 (t, 1H, H-3'); 4,15 - 4,23 (m, 1H, H-4'); 3,63 - 3,79 (m, 2H, H-5').

N1-(2'-deoksi-2'-fluori-3',5,-di-0-bentsoyyli-fi-L-arabinofuranosyyli)-5-jodiurasiili (23) 20 Liuokseen, jossa oli yhdistettä 13 (260 mg, 0,56 s h mmol) 10 ml:ssa vedetöntä CH2Cl2:ta, lisättiin HBr/AcOH:ta f • · < (45 %, paino/tilavuus, 0,5 ml, 2,8 mmol). Reaktioseosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 36 tunnin ajan, minkä } j*i*. jälkeen se haihdutettiin kuiviin. Jäännös liuotettiin 20 1 • j· .·. j 25 mitään CH2Cl2:ta, pestiin vedellä (10 ml), kyllästetyllä ·?

NaHC03-liuoksella (10 ml) ja kuivattiin (MgS04). Suodatta- | • · · 7.

**’ maila ja suodos kuiviin haihduttamalla saatiin bromisoke- • · · ♦ · · • ria 14 siirappina.

Samanaikaisesti 5-jodiurasiilia (270 mg, 1,12 mmol) • · : 30 suspendoitiin 10 mitään HMDStää ja keitettiin palautus- *·· ί#4#ί jäähdyttäen 36 tunnin ajan homogeenisen liuoksen saamisek- ,·«, . si, joka haihdutettiin tyhjössä kuiviin. Jäännökseen li- **’. sättiin liuos, jossa oli yhdistettä 14 vedettömässä 1,2- > ····« " • « , dikloorietaanissa, ja saatua liuosta keitettiin palautus- ...T 35 jäähdyttäen N2-suojakaasussa 1,5 päivän ajan. Lisättiin Ϊ * 4 • « : 24 1 1 7 47 5 j ^ CHC13 (20 ml) ja liuos pestiin toisiaan seuraten vedellä ' s (10 ml), suolaliuoksella (10 ml) ja kyllästetyllä NaHCO,-liuoksella (10 ml) ja kuivattiin sitten (MgS04). Poistamal- 5 la liuotin saatiin siirappia, joka CH2Cl2:sta kiteyttämäl-5 lä saatiin yhdistettä 23 keltaisena kiinteänä aineena (237 mg, 73 %). Osa tästä (70 mg) uudelleenkiteytettiin 2-iso-propanolista, jolloin saatiin valkoista kiinteää ainetta (67 mg).

UV (metanoli): lambda,,.,,, 230,0 nm, 276,0 nm.

10 "H-NMR (CDCI3): δ 8,4, 7,3 (m, 12H, Ar-H); 6,29 (kaksois-d, Jh_h=2,43Hz, Jf_h=21,6Hz, 1H, H-l'); 5,377 (kak-sois-d, Jh.h=2,8Hz, Jf.m=61,3Hz, 1H, H-2'); 5,55 (kaksois-d, 1H, H-3'); 4,865, 4,793 (d, 2H, H-5'); 4,588, 4,502 (m, >| 1H, H-4').

15 N2-(2'-deoksi-2'-fluori-B-L-arabinofuranosyyli)-5- jodiurasiili (24)

Yhdistettä 23 (40 mg, 0,069 mmol) liuotettiin 25 ml:aan ammoniakilla kyllästettyä metanolia ja sekoitettiin huoneenlämpötilassa 24 tunnin ajan, minkä jälkeen liuos 20 haihdutettiin kuiviin. Saatua siirappia preparatiivisella f TLCillä puhdistamalla (5:1 CHCl3/MeOH) saatiin yhdistettä ϊβj1J 24 kiinteänä aineena (19 mg, 74 %).

uv (MeOH): lambdamaks. 280,5 nm. }, • · ^-NMR (DMS0-d6): 6 11,82 (leveä s, CONH); 8,24 (s, > .1. ί 25 1H, H-6); 6,082 (kaksois-d, Jh.m=4,45Hz, Jf_h=13,7, 1H, ,V H-l'); 5,947 (d, 1H, 3'-0H); 5,296 (t, 1H, 5'-0H); 5,07 : (kaksois-t, Jf_h=53Hz, 1H, H-2'); 4,24 (leveä d, Jf_h-21Hz, *** ‘ 1H, H-3'); 3,81, 3,55 (m, 3H, H-4', H-5').

2,3,5-tri-O-bentsyyli-L-arabinoosi •‘· ί 30 Kuten esitetään kuviossa 9, 30 g (0,2 mol) jauhe- * 1 · maista L-arabinoosia (5) ja sitten 0,4 ml kons. rikkihap-.1"· poa lisättiin 600 ml:aan (14,8 mol) vedetöntä metanolia. - • · · -.'il

Suspensiota sekoitettiin ja keitettiin kevyesti palautus- • · • jäähdyttäen 2 tunnin ajan kirkkaan liuoksen saamiseksi.

*·· ...i 35 Reaktioseos neutraloitiin lisäämällä 1,5 g natriumvety- 117475 25 : % karbonaattia, kuivattiin (Na2S04) ja haihdutettiin sitten .-¾ -¾ tyhjössä kuiviin, jolloin saatiin raskasta siirappia 6, | jota laimennettiin lisäämällä 50 ml vastapuhdistettua tet- i rahydrofuraania ja haihdutettiin toistamiseen kuiviin 5 (haude 35 - 40 °C) metanolijäämien poistamiseksi. Vasta-puhdistettua tetrahydrofuraania (400 ml) lisättiin ja seokseen lisättiin 30 g Drierite-valmistetta, 156 g (2,78 mol) kaliumhydroksidia ja 200 ml (1,74 mol) bentsyyliklo-ridia. Seosta kuumennettiin kevyesti palautusjäähdyttäen 10 yön yli, se jäähdytettiin, suodatettiin ohuen Celite-ker- | roksen läpi ja haihdutettiin suodosta tyhjössä ja sitten tehokkaassa tyhjössä 100 °C:ssa (haude). Epäpuhdas siirappimainen metyyli-2,3,5-tri-0-bentsyyli-L-arabinosidi (7) | liuotettiin 400 ml:aan jääetikkaa. Hydrolyysiseosta kuu-15 mennettiin 65 - 70 °C:ssa 2 tunnin ajan, se haihdutettiin '

tyhjössä 1/3 tilavuuteen ja kaadettiin 2,5 litraan jääve-siseosta. Alkukiteiden (alkukiteitä saatiin alunperin kromatografisesta dikloorimetaanilla eluoiden) lisäyksen jälkeen seosta pidettiin 5 °C:ssa yön yli. Vesifaasi dekan-20 toitiin eroon osittain kiteisestä massasta, joka liuotet- I

'f tiin 200 ml:aan dikloorimetaania. Liuos pestiin natriumve- 2 . tykarbonaatin kylmällä vesiliuoksella, kuivattiin (Na,S0.), • · * suodatettiin ohuen pedin läpi väriä poistavaa hiiltä ja Φ * · ' 1.1^ haihdutettiin tyhjössä ohueksi siirapiksi, joka liuotet- 4 * t ‘ . 25 tiin 200 ml:aan sykloheksaania. Alkukiteiden lisäyksen • · Φ * 4* jälkeen liuosta pidettiin huoneenlämpötilassa 1 tunnin 3 φ φ # . /£ *”·* ajan ja 5 °C:ssa yön yli, jolloin saatiin 27,7 g (33,2 %) # · φ ·.' * 2,3,5-tri-O-bentsyyli-L-arabinoosia (8). Sp. 68 - 73 °C; [a]25„ = -1,69 (c=2,01, 9:1 v/v p-dioksaani/vesi). j.:': 30 UV (MeOH) lambdamaks- 220.

1H-NMR (300 MHz, CDCl,): δ 3,48 - 3,62 (m, 2H, H-5); • · · ** , ;/

3,94 - 4,18 (m, 3H, H-2,3,4); 5,33 (d, 1H, J=4,07, H-l); J

5,29 (s, H-l); 7,25 - 7,33 (m, 15H, aromaatteja).

φ # # . . ^ •

Ml Φ • M* Φ Φ · · Φ Φ Φ Φ 26 117475

2,3,5-tri-O-bentsyyli-l-O-(p-nitrobentsoyyli)-L- I

arabinoosi (9)

Yhdistettä 8 (kuvio 9) (2 g, 4,76 mmol) liuotettiin 7.5 ml:aan dikloorimetaania, ja tähän liuokseen lisättiin 5 liuos, jossa oli 0,95 g (5,1 mmol) p-nitrobentsoyyliklori- dia 5 ml:n dikloorimetaania ja 1,5 ml:n pyridiiniä seok- + sessa. Reaktioseosta pidettiin huoneenlämpötilassa yön yli, minkä jälkeen se pestiin toisiaan seuraten 1 N kloo-rivetyhapolla (2 x 10 ml), natriumvetykarbonaatin vesi-10 liuoksella (2 x 10 ml) ja vedellä (3 x 30 ml). Kosteus f poistettiin Na2S04:llä ja liuos haihdutettiin tyhjössä kuiviin, jolloin saatiin 2,67 g (98,4 %) yhdisteen 9 anomee- ΐ

rien seosta, sp. 68 - 82 °C. Lisäpuhdistus kolonnikromato- I

grafisesti silikageelissä (heksaaniseos/asetoni 8:1) nos-15 ti sulamispisteen 89 - 93 °C:seen; [a]D = 13,04 (c=6,8, CH2C12). i UV (MeOH) larnbdamak, 215,5 ja 258,5.

1H-NMR (250 MHz, CDC13): 6 3,54 - 3,69 (m, 2H, H-5); 4.06 (m, 1H, H-4' ); 4,22 (m, 1H, H-3'); 4,33 (m, 1H, 20 H-2' ) ,* 4,38 - 4,78 (m, 6H, bentsyyli-CH2); 6,50 (d, 1H, J=2,35, H-l); 7,23 - 7,36 (m, 15H, aromaattisia vetyjä | . .·. bentsyyliryhmästä); 8,01 - 8,25 (m, 4H, aromaattisia ve- f * * · . * • · · .·.·. tyjä nitrobentsoyyliryhmästä). ΐ * · · ...

7;·, 10-(2,3,4-tri-0-bentsyyli-U-L-arabinosyyli) tyrniini V! 25 (12) • · **/ Tymiiniä (0,444 g, 3,52 mmol) ja ammoniumsulfaattia • · · ·' £ *··* (2 mg) suspendoitiin heksametyylidisilatsaaniin (10 ml) ja * · · *.* * keitettiin palautus jäähdyttäen (140 °C) yön yli argonsuo- jakaasussa kirkkaan liuoksen saamiseksi. Heksametyylidisi- • · • #j J 30 latsaaniylimäärä poistettiin tyhjössä välttäen kosketusta kosteuteen, jolloin saatiin siirappia 11.

• · · "

Yhdistettä 9 (1 g, 1,76 mmol) lisättiin 17 ml:aan • · ; dikloorimetaania, joka oli esikyllästetty vedettömällä i \ kloorivedyllä, 0 °C:ssa. 2 tunnin 0 eC:ssa kuluttua saos- f • '.'i

35 tunut p-nitrobentsoehappo (0,25 g) poistettiin suodatta- ' A

* «*···.

• * : .· · ' 27 1 1 7475 maila ja suodos haihdutettiin tyhjössä ohueksi siirapiksi, ^ jota käsiteltiin sitten tehokkaalla tyhjöpumpulla huoneen- | .•-f1 lämpötilassa 2 tunnin ajan, jolloin saatiin 2,3,5-tri-O-bentsyyli-a-L-arabinosyylikloridia (10).

5 Näin valmistettua yhdistettä 10 liuotettiin 15 ml:aan vedetöntä dikloorimetaania, ja liuos lisättiin ; seokseen, jossa oli silyloitua tymiiniä (11) ja 3 g 4 A:n molekyyliseula-ainetta. Reaktioseosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa argonsuojakaasussa 18 tunnin ajan. Reak-10 tioseosta laimennettiin lisäämällä 50 ml dikloorimetaania | ja se kaadettiin 2 ml:aan NaHC03:n kyllästettyä vesiliuos- ' ta samalla kiivaasti sekoittaen. Muodostui valkoinen sak- . i ka (tinahydroksidia), joka suodatettiin eroon Celite-pe-dillä. Orgaaninen faasi erotettiin vedestä ja pestiin 15 vedellä (3 x 30 ml). Vesifaasia uutettiin dikloorime-taanilla, ja yhdistetty dikloorimetaanifaasi kuivattiin Na2S04:llä ja haihdutettiin sitten tyhjössä siirapiksi, jota kolonnikromatografisesti silikageelissä puhdistamalla (kloroformi/metanoli, 100:1) saatiin yhdistettä 12 siirap-20 pina (0,68 g, 73 %). [a]D = -56,71 (c=0,6, CH2C12). | UV (MeOH) larnbdamake> 218 ja 265. { . .·. 1H-NMR (300 MHz, CDC1,): 6 1,67 (d, 3H, J-1,11, | ;v'. CH3); 3,66 - 3,70 (m, 2H, H-5’); 4,06 (m, 1H, H-4’); 4,13 f (t, 1H, J=4,7, H-3' ); 4,24 (t, 1H, J=4,7, H-2'); 4,41, 1 . 25 4,54, 4,56 (m, 6H, bentsyyli-CH,); 6,28 (d, 1H, J=5,24, Ϊ * / H-l'); 7,15 - 7,33 (m, 15H, aromaattisia vetyjä); 7,43 (d, | :·^·: 1H, J=l, 31, H-6). | • · 1 * l-B-L-arabinofuranosyylitymiini (13)

Palladiumkloridia (680 mg, 3,835 mmol) suspendoi-·.· · 30 tiin 100 ml:aan metanolia, ja suoritettiin pelkistys ra- vistamalla vedyn kanssa huoneenlämpötilassa. Palladium- • · · > ,'/ ,···# mustan happamaan suspensioon lisättiin sitten liuos, jossa f • · oli 450 mg yhdistettä 12 25 ml:ssa metanolia. Reaktioseos- • · . ta ravistettiin vedyn kanssa huoneenlämpötilassa 38 tunnin | • £ ..1·1 35 ajan. Katalysaattorin poistamisen jälkeen liuos neutraloi- · · » · * 1 117475 28 tiin lisäämällä Dowex-valmistetta (HC03 ) pH:hon 7, minkä i . i jälkeen se haihdutettiin tyhjössä valkoiseksi kiinteäksi «: aineeksi, joka etanolista uudelleenkoteyttämällä saatiin ^ yhdistettä 13 (105 mg, 47,7 %). Sp. 244 - 249 °C; [a]D = 5 -91,48 (c=0,25, H20).

IR (KBr): 1750, 1600 cm'1 (CO); UV (MeOH): lamb- f damaks. 268.

1H-NMR (300 MHz, DMS0-d6): 6 1,76 (s, 3H, CH3); 3,62 (t, 2H, J=4,56, H-5'); 3,69 (m, 1H, H-4'); 3,90 t, 1H, 10 J=3,88, H-3'); 3,99 (t, 1H, J=4,10, H-2' ); 5,08 (leveä s, * 1H, C'5-OH, vaihtokelpoinen); 5,42 (d, 1H, J=4,24, C'2-OH tai C'3-OH, vaihtokelpoinen); 5,54 (d, 1H, J=5,23, C2-0H tai C'3-OH, vaihtokelpoinen); 5,97 (d, 1H, J=4,64, H-l'); ? 7,51 (d, 1H, J=0,97, H-6); 11,26 (s, 1H, NH, vaihtokelpoi- | 15 nen).

Koostumusanalyysi C10H14N206:lie; laskettu C 46,51; H 5,46; N 10,85; todettu C 46,67; H 5,63; N 10,56.

1-(2,3,5-tri-0-bentsyyli-B-L-arabinosyyli)sytosii- ni (15) 20 Sytosiinia (0,61 g, 6 mmol) ja ammoniumsulfaattia f

(2 mg) suspendoitiin heksametyylidisilatsaaniin (15 ml), I

; ja keitettiin palautus jäähdyttäen (140 °C) typpi suo jakaa- • · · sussa 2 tunnin ajan kirkkaan liuoksen saamiseksi. Silyloi- • « · --if tu sytosiiniseos haihdutettiin tyhjössä kuiviin välttäen ‘1 l' . 25 kosketusta kosteuteen, jolloin saatiin siirappia 14. if *.*·. Yhdistettä 9 (2,82 g, 5 mmol) lisättiin 47 ml:aan • · · £ *“·’ kuivaa dikloorimetaania, joka oli esikyllästetty vedettö- t • · » *·* mällä kloorivedyllä, 0 °C;ssa. 2 tunnin 0 °C:ssa kuluttua saostunut p-nitrobentsoehappo (0,807 g) poistettiin suo- • · ·.· ; 30 dattamalla ja suodos haihdutettiin tyhjössä kuiviin, joi- • · · loin saatiin siirappimaista 2,3,5-tri-O-bentsyyli-a-L-ara- .···. binosyylikloridia (10).

* ♦ Näin valmistettua yhdistettä 10 liuotettiin 28,5 ; • · . ml:aan vedetöntä dikloorimetaania, ja liuos lisättiin s • ... ‘k 35 seokseen, jossa oli silyloitua sytosiinia (14) ja 8,3 g f • * « * · i · ·4* 29 117475 4 Α:η molekyyliseula-ainetta. Reaktioseosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa typpisuojakaasussa 5 päivän ajan. Sitten reaktioseosta laimennettiin lisäämällä 50 ml dikloori-metaania ja 20 ml vettä, ja se kaadettiin 2 ml:aan NaHC03:n 5 kyllästettyä vesiliuosta samalla kiivaasti sekoittaen.

Muodostui valkoinen sakka (tinahydroksidia), joka suodatettiin eroon Celite-pedillä. Orgaaninen faasi erotettiin vedestä ja pestiin vedellä (3 x 30 ml). Vesifaasia uutettiin dikloorimetaanilla, ja yhdistetty dikloorimetaanifaa-10 si kuivattiin Na2S04:llä ja haihdutettiin sitten tyhjössä siirapiksi, jota kolonnikromatografisesti silikageelissä puhdistamalla (kloroformi/metanoli 96:4) saatiin yhdistet- \ tä 15 valkoisena kiinteänä aineena, joka 2-propanolista f uudelleenkiteyttämällä saatiin 1,53 g (60 %) yhdistettä.

15 Sp. 146 - 148 °C; [a]25D = -105,2 (Cl, CH2C12).

UV (MeOH): lambdamakB 211,5, lambdanin. 272,5, pH 1, pH 7; lambdamakBi 211,5, lambdamln, 284, pH 9.

1H-NMR (300 MHz, CDClj): δ 3,65 (d, 2H, J=4,85, H-5' ); 4,00 (t, 1H, J=3,72, H-3' ); 4,11 (m, 1H, H-4’); 20 4,28 (m, 1H, H-2'); 4,38 - 4,55 (m, 6H, bentsyyli-CH2); ä 5,56 (d, 1H, J=7,5, H-5); 6,39 (d, 1H, J=4,59, H-l’);

: 7,12 - 7,31 (m, 15H, aromaattisia vetyjä); 7,63 (d, 1H, I

• · · J=7, 5, H-6).

• m l-B-L-arabinofuranosyylisytosiininhydrokloridisuo- • · · ';ϊ .·, · 25 la (16) hydraamalla katalyyttisesti yhdistettä 15 • · *

Palladiumkloridia (315 mg, 1,78 mmol) suspendoitiin * · * - % "I 160 ml:aan metanolia, ja suoritettiin pelkistäminen ravis- 1 • * · • * tamalla vedyn kanssa huoneenlämpötilassa. Palladium-mustan happamaan suspensioon lisättiin sitten liuos, jossa oli : 30 300 mg yhdistettä 15 54 ml:ssa metanolia. Reaktioseosta »·· :...ϊ ravistettiin vedyn kanssa huoneenlämpötilassa 3 tunnin

.···, ajan. Kun katalysaattori oli poistettu, liuos neutraloi- S

• · tiin lisäämällä Dowex-valmistetta (HC0, ) ja se haihdutet- ft»«* ' J* ' w • · . tiin tyhjössä kuiviin, minkä jälkeen jäännöstä puhdistet- 35 tiin preparatiivisella TLC:llä (MeOH/CHCl3 3:5), jolloin 117475 30 ' . ' · ‘ ^ saatiin siirappia, joka liuotettiin 3 mlraan metano- lia, lisättiin HCl:n l-%:ista liuosta MeOHrssa pH:hon 1, g r .· .:¾ haihdutettiin kuiviin ja trituroitiin jäännöstä 2-propa- f nolissa, jolloin saatiin 36 mg (22,1 %) yhdistettä 16.

5 Sp. 190 - 194 °C; [a]25D = -115,47 (c=0,07, H20).

UV (H20) lambdamaks 275, pH 7; lambda.*.. 209,5, 273, f pH 11; lambdaraaks 280, pH 1.

^-NMR (300 MHz, DMS0-d6): 6 3,61 (d, 2H, H-5'); 3,82 (m, 1H, H-4' ); 3,93 (m, 1H, H-2' tai H-3'); 4,04 10 (leveä s, 1H, H-2' tai H-3'); 5,18 (leveä s, 1H, C5'-0H, ΐ vaihtokelpoinen); 5,61 (leveä s, 1H, C2'-OH tai C3'-0H, vaihtokelpoinen); 5,67 (leveä s, 1H, C2'-0H tai C3'-0H, vaihtokelpoinen); 6,00 (d, 1H, J=4,02, H-l'); 6,01 (d, 1H, | J5.6=7,8, H-5); 7,92 (d, 1H, J56=7,8, H-6); 8,49 (leveä s, j 15 1H, NH, vaihtokelpoinen); 9,38 (leveä s, 1H, NH, vaihto kelpoinen).

1-β-L-arabinofuranosyy1isytosiininhydrokloridisuola (16) käsittelemällä yhdistettä 15 booritrikloridilla

5 ml booritrikloridin 1 M liuosta dikloorimetaanis-20 sa jäähdytettiin -72 eC:seen (kuivajää/asetoni). Booritri- I

kloridiliuokseen lisättiin hitaasti liuos, jossa oli yh- f : distettä 15 (180 mg, 0,351 mmol) 3 ml:ssa dikloorimetaa- ’

• · · V

.*.·. nia. 2,75 tunnin kokonaisreaktioajan jälkeen jäähdytyshau- • « -3

de poistettiin ja liuotin ja kaasu poistettiin tyhjössä. I

*e* * "X

. 25 Jäännös liuotettiin kylmään dikloorimetaaniin (10 ml) ja • · · liuos haihdutettiin kuiviin (3 kertaan kunnes saatiin vai- ΐ • ♦ · ' '3* • · · --.,7 koinen kiinteä jäännös), ja jäänökseen lisättiin kylmää *** kyllästettyä natriumvetykarbonaattiliuosta pH:n säätämi seksi arvoon 6-7. Seosta laimennettiin lisäämällä etano-; 30 lia, se kuumennettiin kiehuvaksi, lisättiin hiiltä ja suo- • · · datettiin. Suodos haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin ,···. siirappia, joka liuotettiin 3 ml: aan metanolia, lisättiin f *##* > . HCl:n l-%:ista liuosta metanolissa pH:hon 1, haihdutettiin i • * · · · r . ( . kuiviin ja trituroitiin 2-propanolissa, jolloin saatiin | „*·* 35 yhdistettä 16 (66 mg, 78,4 %).

• .'V

* · · * · ·. £ 117475 31 9-(2,3,5-tri-0-bentsyyli-B-L-arabinosyyli)adeniini

(18) I

Perusteellisesti kuivattua yhdistettä 9 (5 g, 8,8 mmol) lisättiin 82 ml:aan dikloorimetaania, joka oli esi-5 kyllätetty vedettömällä kloorivedyllä, 0 °C:ssa. 2 tunnin reaktioajan jälkeen 0 °C:ssa saostunut p-nitrobentsoehappo | (1,53 g) poistettiin suodattamalla, ja suodos haihdutettiin tyhjössä siirapiksi, jota pidettiin sitten täydellisessä tyhjössä huoneenlämpötilassa 2 tunnin ajan. Näin 10 valmistettu 2,3,5-tri-0-bentsyyli-a-L-arabinosyylikloridi (10) liuotettiin 50 ml:aan dikloorimetaania, ja liuos lisättiin seokseen, jossa oli 4,5 g (18,8 mmol) kuivattua N- | bentsoyyliadeniinia5 (17) ja 14,5 g 4 Ä:n molekyyliseula- f ainetta. Reaktioseosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 1 15 viikon ajan, se suodatettiin Celite-pedin läpi, ja haihdutettiin tyhjössä siirapiksi, jolla suoritettiin kroma-tografia-ajo silikageelissä käyttäen eluoinnissa heksaa-niseos/asetonia (3:1, Rf = 0,22). Tuote erotettiin ja haihdutettiin tyhjössä siirapiksi, joka liuotettiin ammoniakin 20 metanoliliuokseen (20 ml), jossa sitä sekoitettiin ruostu- mattomasta teräksestä valmistetussa pommissa, ja kuumen- ? • ;*j nettiin yön yli 50 - 55 °C:ssa. Sitten liuos haihdutettiin | • ® · · ’i i .·.·. alipaineessa puolikiinteäksi aineeksi, joka uudelleenko- 5 • · · ^ • * .···, teytettiin lämpimästä isopropyylialkoholista, jolloin ···'·' lm . 25 saatiin yhdistettä 18 2,4 g (50,7 %). Sp. 128 - 129 °C; |i *· !: [a]27p = -20,4 (c=l,04, CH2C12).

*"f UV (CH2C12): lambdaMks 213, 258,5. I

·*·: : ^-NMR (250 MHz, CDC13): 6 1,95 (leveä s, 1H, NH, vaihtokelpoinen); 3,69 (d, 2H, J=4,82, H-5'); 4,18 - 4,30 :.:Ί 30 (m, 6H, bentsyyli-CH2); 4,51 - 4,64 (m, 3H, H-2', 3', 4'); 5,73 (leveä s, 1H, NH, vaihtokelpoinen); 6,52 (d, 1H, #·Σ·. J=4,00, H-l'); 6,89 - 6,93, 7,17 - 7,37 (m, 15H, aromaat- ?: tisia vetyjä bentsyyliryhmästä); 8,17 (s, 1H, H-2 tai H-8); 8,32 (s, 1H, H-2 tai H-8).

··· -41 • · ·;, ·*··· • * >, 117475 " 32 -'y:: 9-6-L-arabinofuranosyyliadeniini (19) jii 5 ml liuosta, jossa oli boori tr iklor idin IM ;:? liuosta dikloorimetaanissa, jäähdytettiin -72 °C:seen (kuivajää/asetoni). Liuos, jossa oli yhdistettä 18 (150 5 mg, 0,279 mmol) 5 ml:ssa dikloorimetaania, lisättiin hitaasti booritrikloridiliuokseen. Kaikkiaan 3,5 tunnin ^ reaktioajan jälkeen jäähdytyshaude poistettiin ja liuotin ja kaasu poistettiin tyhjössä. Jäännös liuotettiin kylmään dikloorimetaaniin (10 ml) ja liuos haihdutettiin kuiviin • .'<ΊΙ 10 (6 kertaan kunnes saatiin keltainen kiinteä jäännös). Kyl mää kyllästettyä natriumvetykarbonaattiliuosta lisättiin pH:n säätämiseksi arvoon 7-8. Seosta laimennettiin eta- i nolilla, se kuumennettiin kiehuvaksi, suspensio suodatet- f tiin Celite-valmisteen läpi ja suodos haihdutettiin tyh-15 jössä siirapiksi, joka kiteytettiin vedestä, jolloin saatiin 55 mg (74 %) yhdistettä 19. Sp. 256 - 258 °C.

UV (H20): larnbdamaks 259.

1H-NMR (300 MHz, DMS0-d6): 6 3,62 - 3,66 (m, 2H, H-5'); 3,77 (leveä s, 1H, H-4'); 4,13 (leveä s, 2H, H-2', 20 3'); 5,12 (t, 1H, J=5,4, C'5-OH, vaihtokelpoinen); 5,54 |

(d, 1H, J=3,78, C2-0H tai C'3-OH, vaihtokelpoinen); 5,63 J

• (d, 1H, J=4,32, C'2-0H tai C3-0H, vaihtokelpoinen); 6,25 (d, 1H, J=4,02, H-l'); 7,25 (leveä s, 2H, NH2, vaihtokel-

*.*.* I

poinen); 8,13 (s, 1H-H-2 tai H-8); 8,18 (s, 1H, H-2 tai f

Y.* 25 H8). I

• · · ♦ · · *.* Kuviossa 10 esitetään vaihtoehtoinen tie 1-0-ase- | • · · · ' ‘ **|·’ tyyli-2,3,5-tri-0-bentsoyyli-8-L-ribofuranoosin (yhdiste i • · ♦ *·* * 10) valmistamiseksi 1,2-di-O-isopropylideeni-a-L-ksylofu- ranoosista (yhdiste 3).

• * *.· · 30 1,2-di-O-isopropylideeni-a-L-ksylofuranoosi (3) • · · : : 650 ml:aan vedetöntä asetonia lisättiin 4 ml kons.

•I. rikkihappoa, 5 g molekyyliseula-ainetta (4 A), 80 g vede- f ***. töntä kupari(2)sulfaattia ja 40 g L-ksyloosia. Seosta se- .* koitettiin huoneenlämpötilassa 36 tunnin ajan, minkä jäi- • V.ji .♦ΙΓ 33 keen reaktioseos suodatettiin ja pestiin perusteellisesti 4 ··«·· • · 33 1 1 7475 : - asetonilla, yhdistetty suodos neutraloitiin lisäämällä

' ' I

ammoniumhydroksidia ja haihdutettiin sitten kuiviin. 1 ' -jjf'

Etyyliasetaattia (200 ml) lisättiin, minkä jälkeen suodatettiin ja haihdutettiin suodos kuiviin, jolloin saatiin 5 Öljy, joka liuotettiin 250 ml:aan 0,2-%:ista HCl:ää ja liuosta sekoitettiin 2,5 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. ;,& pH säädettiin 8:ksi lisäämällä kyllästettyä NaHC03-liuos-ta, minkä jälkeen liuos haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä uutettiin etyyliasetaatilla, minkä jälkeen liuotin pois- •/S- 10 tamalla saatiin keltaisena öljynä yhdistettä 3 (41,7 g, 82,3 %).

1H-NMR (CDC13): 6 5,979 (d, J=3,78Hz, 1H, H-l); 4,519 (d, J=3,6Hz, 1H, H-2); 4,308 (leveä d, 1H, H-3); | 4,080 (m, 3H, H-4 ja H-5); 1,321 (s, 3H, CH3); 1,253 (s, 15 3H, CH3). f1 5-0-bentsoyyli-l,2-di-0-isopropylideeni-a-L-ksylo-furanoosi (25)

Yhdistettä 3 (41 g, 215,6 mmol) sekoitettiin pyri-diinissä (150 ml) ja CH2Cl2:ssa (150 ml) 0 °C:ssa. Seokseen 20 lisättiin tipoittain liuos, jossa oli BzCl:ää (27,5 ml, 237 mmol) 30 ml:ssa pyridiiniä. 30 minuutin kuluttua li- ^ • ·*· sättiin vettä (5 ml) ja seos haihdutettiin kuiviin, jään- • · · · ·$ nös liuotettiin EtOAczhen, liuos pestiin kyllästetyllä - • · .···. NaHC03-liuoksella ja kuivattiin sitten (Na2S04). Haihdut- ί • · · . 25 tamalla liuotin pois saatiin oranssin värinen siirappi, * • · · josta Et20:sta kiteyttämällä saatiin yhdistettä 20 (36 g).

lii Emäneste haihdutettiin kuiviin, ja jäännöstä puhdistettiin % • · · *♦* ’ kolonnikromatograf isesti silikageelissä (1 % CH30H/CHC13), jolloin saatiin toinen erä yhdistettä 25 (12 g, kokonais- • « · 30 saanto 76 %). Sp. 82 - 83 °C; kirj.1 D-muoto: 83,5 - 84,5 eC.

• · · r ..j.

.···. 1H-NMR (CDC13): δ 7,43, 8,07 (m, 5H, Ar-H); 5,97 (d, '4 1H, J=3,6Hz, H-l); 4,80 (g, 1H, H-4); 4,60 (d, 1H, J=3,6Hz, H-2); 4,40, 4,20 (m, 3H, H-5, H-5’, H-3); 3,50 35 (leveä s, 1H, D20-vaihto, 30H); 1,51, 1,32 (2s, 6H, 2CH3). '4 * ····· 1 • « ·; -f 117475 34 . ..i ,b 5-0-bentsoyyli-l, 2-di-O-isopropylideeni-a-L-erytro-pentofuranos-3-uloosi (26)

Yhdistettä 25 (40 g, 136 mmol) sekoitettiin 450 * ml:ssa CH2Cl2:ta. Tähän lisättiin pyridiniumdikromaattia 5 (PDC, 30,7 g, 81,6 mmol) ja Ac20:ta (42,3 ml, 448,8 mmol).

Seosta keitettiin palautus jäähdyttäen 2,5 tunnin ajan, :¾ minkä jälkeen liuos haihdutettiin 1/5:aan alkuperäisestä tilavuudestaan, minkä jälkeen etyyliasetaattia (50 ml) lisättiin ja liuos suodatettiin. Suodos kaadettiin silika- ; 10 geelityynylle (10 cm x 5 cm), eluoitiin EtOActllä, haihdu- j tettiin yhdistetty eluaatti kuiviin ja haihdutettiin jään- * nös kuiviin yhdessä tolueenin kanssa (50 ml x 2). Kiteyttämällä heksaanista ja EtOAcistä saatiin yhdistettä 21 ? valkoisena kiinteänä aineena (38 g, 96 %). Sp. 91 - 93 °C; 15 [a]D = -132° (c=l,0, CHC13); kirj.2 D-muoto: sp. 93 - 94,5 eC; [a]D: +135° (c=l,0, CHC13).

IR (KBr): 1773 cm'1 (ArCO), 1730 cm'1 (CO). * ^-NMR (CDClj): δ 7,97, 7,42 (m, 5H, Ar-H); 6,14 (d, 1H, J=4,4Hz, H-l); 4,74, 4,68 (m, 2H, H-4, H-2); 4,50, 20 4,44 (m, 2H, H-5, H-5’); 1,52, 1,44 (2s, 6H, 2CH3).

Koostumusanalyysi (C15H1606): laskettu C 61,64; | : H 5,52; todettu C 61,42; H 5,53.

* · Φ ' \f 5-0-bentsoyyli-l, 2-di-O-isopropylideeni-a-L-erytro- | • * pentofuranos-3-uloosi (26) i * · · · f

• . 25 Yhdistettä 25 (40 g, 136 mmol) sekoitettiin 450 I

• · · .* ml:ssa CH2Cl2:ta. Tähän lisättiin pyridiniumdikromaattia

Hl (PDC, 30,7 g, 81,6 mmol) ja Ac20:ta (42,3 ml, 448,8 mmol). ί • · * ·* * Seosta keitettiin palautusjäähdyttäen 2,5 tunnin ajan, minkä jälkeen liuos konsentroitiin 1/5:aan alkuperäisestä ί.ί ; 30 tilavuudestaan, minkä jälkeen lisättiin Et0Ac:tä (50 ml).

• · · ί.,,ί Liuos suodatettiin, suodos kaadettiin silikageelityynylle i • ,···, (10 cm x 5 cm), eluoitiin Et0Ac:llä, haihdutettiin yhdis- f: *···*'' ‘i tetty eluaatti kuiviin, ja haihdutettiin jäännös kuiviin • · . yhdessä tolueenin kanssa (50 ml x 2). Heksaanista ja ί 35 Et0Ac:stä kiteyttämällä saatiin yhdistettä 26 valkoisena 117475 35 ;'ί kiinteänä aineena (38 g, 96 %). Sp. 91 - 93 “C; [a]D: -132® (c=l,O, CHC13); kirj.2 D-muoto: sp. 93 - 94,5 °C; [a]D = |! +135° (c-1,0, CHCI3). f IR (KBr): 1773 cm'1 (ArCO), 1730 cm'1 (CO).

5 1H-NMR (CDCI3): 6 7,97, 7,42 (m, 5H, Ar-H); 6,14 (d, 1H, J=4,4Hz, H-l); 4,74, 4,68 (m, 2«, H-4, H-2); 4,50, ΐ 4,44 (m, 2H, H-5, H-5'); 1,52, 1,44 (2s, 6H, 2CH3).

Koostumusanalyysi (C15H1606): laskettu C 61,64; H 5,52; todettu: C 61,42; H 5,53.

10 1,2-di-O-isopropylideeni-a-L-ribofuranoosi (27) "I

Yhdistettä 26 (37 g, 127 mmol) liuotettiin EtOH/ I

HjOihon (400 ml/100 ml) 0 °C:ssa samalla, kun lisättiin pieninä erinä NaBH4:ää (23,3 g, 612 mmol). Suspensiota 1 sekoitettiin huoneenlämpötilassa 4 tunnin ajan. Se suoda- 15 tettiin ja suodos haihdutettiin kuiviin sekä haihdutettiin kuiviin metanolin kanssa. Suorittamalla jäännöksen kroma- tografia-ajo silikageelikolonnissa (0 - 15 % CH30H/CH2C12) sekä EtOAc/heksaanista kiteyttämällä saatiin yhdistettä 27 valkoisina neulasina (19 g, 79 %). Sp. 86 - 87 °C; [a]D = 20 -31,5° (c=0,62, CHCI3); kirj .3 D-muoto: sp. 86 - 87 °C; [a]D j (c=0, 59, CHCI3) /f : IR (KBr); 3356 cm-1 (OH).

• · * 1H-NMR (CDClj): 6 5,83 (d, 1H, J=3,98Hz, H-l); 4,595 (t, 1H, H-2); 4,055, 3,72 (m, 4H, H-3, H-4, H-5, H-5'); * « · , : 25 2,38 (d, 1H, D20-vaihto, 3-OH); 1,83 (t, 1H, D20-vaihto, | * .j 5-OH); 1,58, 1,38 (2s, 6H, 2CH3) .

• · · Γ** Koostumusanalyysi (CeH1405): laskettu C 50,50; Ϊ • · · ·; **’ H 7,42; todettu C 50,62; H 7,46.

3,5-di-O-bentsoyyli-l, 2-di-O-isopropylideeni-a-L-; 30 ribofuranoosi (28) • · *

Yhdistettä 27 (19 g, 100 mmol) sekoitettiin 300 ,···, ml: ssa pyridiiniä 0 °C:ssa samalla, kun BzCl:ää (40 ml, 348 mmol) lisättiin tipoittain, minkä jälkeen sekoitettiin • * . huoneenlämpötilassa 3 tunnin ajan, ja haihdutettiin liuo- ! 35 tin eroon. Jäännöstä uutettiin EtOAc:llä, pestiin kylläs- * · 1 117475 36 ' $

; . · .yST

tetyllä NaHC03-liuoksella, kuivattiin (Na2S04), haihdutet-tiin liuotin kuiviin ja kiteytettiin kummasta tahansa, i jolloin saatiin ydhistettä 23 valkoisena kiinteänä aineena ί (39 g, 98 %). Sp. 83 - 85 eC.

5 1H-NMR (CDClj): 6 8,07, 7,36 (m, 10H, Ar-H); 5,94 (d, 1H, J=3,6Hz, H-l); 5,05, 5,00 (m, 1H, H-2); 4,73, 4,63 (m, 3H, H-4, H-5, H-5'); 1,58, 1,35 (2s, 6H, 2CH3).

Koostumusanalyysi (C22H2207): laskettu C 66,50; H 5,64; todettu C 66,32; H 5,57.

10 l-O-asetyyli-2,3,5-tri-0-bentsoyyli-8-L-ribofura- f noosi (31) .

Yhdistettä 28 (38 g, 95 mmol) sekoitettiin 300 mlrssa 1 % HC1/CH30H:ta huoneenlämpötilassa 30 tunnin ajan. f

Lisättiin pyridiiniä (20 ml), minkä jälkeen liuos haihdu-15 tettiin kuiviin. Jäännös haihdutettiin kuiviin yhdessä py-ridiinin kanssa (30 ml x 2), minkä jälkeen jäännös liuotettiin 100 ml:aan vedetöntä pyridiiniä 0 eC:ssa samalla, kun BzCliää (17 ml, 146 mmol) lisättiin tipoittain, min- * kä jälkeen sekoitettiin huoneenlämpötilassa 3 tunnin 20 ajan. Liuotin haihdutettiin eroon ja jäännös liuotettiin

Et0Ac:hen, pestiin 0,5 N HCl:llä ja sitten kyllästetyllä f ; NaHC03-liuoksella ja kuivattiin sitten (Na2S04). Haihdutta- mlla liuotin eroon saatiin yhdistettä 30 siirappina. |

Epäpuhdasta yhdistettä 30 sekoitettiin jääetikassa I

*.* · .

.·, ; 25 (400 ml) ja sitten Ac20:ssa (100 ml) 0 eC:ssa samalla, kun • · · ·..·£ .* lisättiin tipoittain kons. H,S04:ää (10 ml). Tätä liuosta ;> · · Λ, h fi * · * sekoitettiin huoneenlämpötilassa yön yli. Seos kaadettiin • * * *·* jääveteen, uutettiin CHC13:11a, neutraloitiin kyllästetyllä

NaHC03-liuoksella ja kuivattiin sitten (Na2S04). Liuottimen * « 4 4 : 30 eroon haihdutuksen jälkeen saatiin vaaleankeltainen sii- • * * rappi, joka metanolista kiteyttämällä saatiin yhdistettä ,··*. 31 valkoisena kiinteänä aineena (23,89 g, 49,6 % yhdis- * teistä 28 - 31). Sp. 124,7 "C; [a]D = 45,613 (c-1,0, i CHC13); kirj.4 sp. = 129 - 130 °C; [a]D=-43,6 (c-1,0, ? ...*;* 35 CIICI3). ί 37 117475 1H-NMR (CDCI3): fi 7,317, 8,134 (m, 15H, OBz); 6,437 (s, 1H, H-l); 5,835 (m, 2H, H-2 ja H-3); 4,649 (m, 3H, H-4 i '»5 ja H-5) ,* 2,003 (s, 3H, CH3COO').

II. Biologinen aktiivisuus 5 Tässä julkistettujen yhdisteiden aktiivisuutta HBV:tä ja EBV:tä vastaan voidaan arvioida kuten alla yksi- ί

tyiskohtaisesti selostetaan, tai muilla, alan ammattilai- I

sille tutuilla menetelmillä.

Esimerkki 1 10 Biologinen aktiivisuus HBV:tä vastaan | Tässä määrityksessä käytettiin ihmisen HBV-tartu- *

tettuja maksasoluja (2.2.15-soluja). Näitä soluja kasva- I

tetiin yhteenkasvuun oleellisessa minimivaaatimuskasvu-alustassa, jossa oli 10 % nautasikiöseerumia. Kasvualusta ' 15 vaihdettiin 3 päivän välein. Kun yhteenkasvu oli saavutet- ? tu, käynnistettiin käsittely lääkkeillä, minkä jälkeen sitä jatkettiin 3 päivän ajan. Toinen lisäys lääkettä samana f pitoisuutena annettiin tämän jälkeen kasvualustan poistamisen jälkeen viljelmistä ja viljelmiä ylläpidettiin vielä 20 3 päivän ajan. Kasvualusta 6 päivän käsittelyn jälkeen otettiin talteen, ja viruspartikkelit seostettiin polyety- * • **j leeniglykolimenetelmällä. Hiukkaset hajotettiin sitten, • · · · minkä jälkeen ne prosesoitiin Southern-analyysiä varten. ϊ • · .·♦·. Blot-siirrot hybridisoitiin HBV-spesifiseen koettimeen ja

• · · ;V

I . 25 viraalisen DNA:n määrät määritettiin verrattuna DNA-tasoi- • · · .* hin viljelmistä, joita ei ollut käsitelty lääkkeillä. Ge- • · · . : i nomi-DNA pilkottiin HindIII:lla ja sillä suoritettiin | * « · *·* Southern-analyysi. Episomaalisen DNA:n tasot määritettiin suhteessa integroituun HBV-DNA:hän. Laskettiin lääkepitoi- • * : 30 suudet, jotka aiheuttavat DNA:n 50 %:n inhibition (ID50) * · · verrattuna verrokkeihin. Tuloksista esitetään yhteenveto • .**·, taulukossa I. |

# * ‘ V

1 . . /1 · · · • · i«« ·«·· '? «···· • · 38 1 1 7475

C

μ

^ S

5 r* a o 0 o o ? ° ° o i o O O Jl * h in <N σι :¾

H S

u w O O' _ P o o

S S I—I O O rH

M Q A H (JN A

u u rs 2 o I o o

E-· Q O O O

as u i—I oo i—I ·—· w ' 'il 3 ' ·ΐ «ϋ οι . ιΗ ·Η ::: h > *:· ·Η -rt ,.-9

• φ ·Η I

: : : ό μ

•H X

«ο nj ; ... 01 <υ > C- ··· H CQ ξ *. *: ^ κ ^ : :*: c ·η _ ο ΐ I μ ° Η ο ο » · β Q ·· m ::: «: h o <ν tn λ • -rl μ ö : .·. o * * ♦ n • · · ^ Ή o §

• X -H <U

.*·*. x μ o o o o ·...· 3 C M < < < < — h ·· -H E £ ω ω ..... 3 > *0 h h 1i< h • * n> m j5 i i i i . E-ι K >< J Q Q <4 • .6 ·:* # • · * · .

* • · 39 117475

Esimerkki 2

Biologinen aktiivisuus EBV:tä vastaan >

Hl-soluja pidettiin pitkän faasin kasvussa 2 päi- 1· vän ajan ennen käsittelyn aloittamista. Soluja sentrifu-5 goitiin 600 x g:ssä 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa niiden erottamiseksi kasvualustasta, joka sisälsi ennalta esiintyviä viruspartikkeleita. Hl-solut siirrostettiin 24-kuoppalevyille tiheydeksi 1 x 105 solua/kuoppa 2 ml:ssa tuoretta kasvualustaa lääkkeellä tai ilman ja inkuboitiin 10 37 °C:ssa 5 päivän ajan. Virionin sisältävä kasvualusta säästettiin ja sitä käytettiin lääkkeiden inhibitovaiku-tuuksen arvioimiseksi virustuotantoon ja viruksen tartu-tuskykyyn biomääritystä käyttämällä. Virionit pelletoitiin l soluvapaasta kasvualustasta sentrifugoimalla kierrosnopeu- ’ 15 della 45 000 rpm 90 minuutin ajan käyttäen SW-50 Ti -roottoria (Beckman). Virionit uudelleensuspendoitiin 1 ml:aan kasvualustaa, minkä jälkeen niitä käytettiin 1 x 106 Raji-solun tartuttamiseksi 48 tunnin aikana. Koska EBV-DP-ak-tiivisuuden taso Raji-soluissa superinfektoinnin jälkeen 20 on verrannollinen lisättyjen virionien määrään, kyettiin mittaamaan indusoitu EBV-spesifinen DP-aktiivisuus. Inhi- . .·. boiva lääkevaikutus laskettiin vertaamalla EBV-DP-aktiivi- * · · • · · suutta monilaimennosverrokkeihin. Mitään mitokondria-DNA- ; • · · sisällön inhibitiota Hl-soluissa ei havaittu käsiteltäessä • ♦ · • · · · · ^ I , 25 soluja pitoisuudella 1 mM L-FMAU 6 päivän ajan.

• · · J

'1 / Slot blot -määritys * 2 · % *···1 Mitokondriaalisen DNA:n määrä mitattiin slot blot ' • · · '·2 1 -menetelmällä (2). 2 x 105 käsitellyssä ja ei-käsitellyssä

Hl-solussa aiheutettiin lyysi 200 pl:ssa 10 mM Tris-HCl- • · ·.· j 30 liuosta (pH 7,5) jäädytys/sulatus-menetelmällä. Soluly- :***: saattia käsiteltiin 10 pg:lla/ml RN-aasi-A:ta 37 °C:ssa * 1 1 30 minuutin ajan, ja sitten proteinaasi-K: 11a (100 pg/ml) | • · ·,.·έ "1. 55 °C:ssa 2 tunnin ajan, Samat määrät 2 X SSC-puskuria li- | • · · · · , Sättiin kuhunkin solulysaattiin. 10 minuutin keittämisen • tv· 35 jälkeen näytteet sijoitettiin täplinä nylonmembraaneille · · · · 2 • · 40 117475 (HyBond-N, Amersham Corp.). Radioleimattua ihmisen mito- |

kondrian DNA-fragmenttia käytettiin DNA-hybridisaatiossa I

Λ koettimena. Samat membraanit uudelleenseulottiin ihmisen Alu-DNA:lla mitokondriaalisen DNA-koettimen poistamisen 5 jälkeen. Mitokondriaalisen DNA:n määrä käsitellyissä ja ei-käsitellyissä Hl-soluissa kvantitoitiin densitometrillä (LKB Ultroscan XL).

Tulokset esitetään taulukossa 2.

• · · * « · • · 1 • · ' • · 1 ‘ '5 ♦··: • · *·» 'i • · · . .

• · · ' £ * ^ • · • · 1 • · • · · * · · ' ' " ' .'Λ ·1·.

* 2 3 4 • · • 1 1 * · · *··· ♦ 1 • ♦ ·2 * ! ·.'/_ ··· ? • · • 1 • · « 2 • ' ; 3 *«« 4 '1 • ' ^ • ♦ · · # 41 1 1 7475 o σ\

O

M

O

m n o

*H

ω

M

Ό C I ti I · a H h 0 H 40

’H ‘rl O 4-> Q) H

ö voinotnooinoomno t> C .ti £ ^

π ΗΗΠΠΟΛΗΟ^ΙΝΗ* qIuOMwS

•h n S Λ -p -μ «o x ä ^ Λ -H -H * >i 3 ^ a) a „ p dj ‘(d -P (0 Ή

ft :(0 tfl -n O

JO S -( (0 00 ω Ό Λ «0 H o Λ C O g >i -j ω o

w fl d 1 H

O ° 0) 5 H Λ S H H Ä ·· H jj fi

P c * A -H

3 S iJ tN -rl ±J b m <n m ^ ·± o x: Tj % h o m o ^2 -Hm ί

— ® n o ui *» > 2 <o a) S

. .*. 3E *> O H ·% *> O ® *3 (/) X

·.:.* 5 m h ω m o h o o o « W o w * ä ί τι Π Tl n ** O 4η .-t

. -H-H-H-H-H Ή-H -HU 0) TL O p S

*.·.· * h v m 3 ?! · n ·§ ... a ininoom^oH in o ·. +j ^ 0 ··· t-ι t" Λ Cl Qiö (NO P . r*. > o X u oo „ q”

• * Ή n) C R

: *.: S co Ä H

• ·* o 10 S « rt : o “ ? g H n ·" o m tn o o o o m m o p ·: ΰ 0

Λ Htor-infiOiHr-ranHCNN· >-* n ω iP

·*· X ,q u ^ J> »h 4, -Η-Η-Η-Η-Η-ΗΉ-Η-Η-ΗΉ-Η ^ ? H (j ·η ' οιηοοοοοοοιηοο c d § 'Ί 10 .. s or-oooinoootN^cs ·η ^ ί -n - ::: q «n o m o <λ o ^ h cn to tn ti ^ u ηηπ n o h s ϊ >

• ; 0) h ji ^ -H

• · . Ό (0 (Q XO : • "H g (0 (0 Oi .·*·. 03 <0 (0 h . . P P CO in

·*· (0 (0 -rl -P

....: PPPPUUPP P -H H p C

JS o 2233μμηη £ h g o -h

• -M t* (0 E CO P

. :cd [L· EC U U · t i i i I t l

*·**. ^ AP ^ftPPPPPPPP

• · i . ^ 42 117475

Esimerkki 3 L-(-)-FMAU:n poistuminen plasmasta ja maksasta L-(-)-FMAU:n poistuminen hiirten plasmasta ja maksasta arvioitiin oraalisen annon jälkeen. Hiiriin ruisku-5 tettiin tritiumleimattua L-(-)-FMAU:ta (radiospesifisyys 9,3 pmol/pCi). |

Kuvio 11 on graafinen esitys L-(-)-FMAU:n plasmapi- f toisuudetsa hiirissä oraalisen annon jälkeen ajan funktiona, ja kuvio 12 on graafinen esitys L-(-)-FMAU:n pitoisuu-10 desta hiiren maksassa oraalisen annon jälkeen ajan funktiona [risti, 10 mg/kg annettuna bid (kahdesti päivässä) 30 päivän ajan ennen farmakokineettistä tutkimusta, minkä jälkeen tutkimus suoritettiin päivänä 31 sama pitoisuus annettaessa; tumma ympyrä, 50 mg/kg annettuna bid 30 päi-15 vän ajan ennen tutkimusta, minkä jälkeen tutkimus suoritettiin päivänä 31 annettaessa sama pitoisuus; avoin ympyrä, 50 mg/kg annettuna ensimmäisen kerran tutkimuksen 1. päivänä].

Ilmoitettuina ajankohtina (katso kuviot 10 ja 11) 20 hiiristä otettiin verta niiden silmäkuopan takaisesta on- | telosta käyttäen hepariinilla käsiteltyjä kapillaareja. | . .·. Plasmaa uutettiin trikloorietikkahapolla, minkä jälkeen se 1 neutraloitiin freon/trioktyyliamiinilla. Supernatantit

• ♦ · '-.J

I.! laskettiin suoraan ja pitoisuus laskettiin. | • ♦ · ' ' I , 25 Kuten esitetään kuvioissa 10 ja 11, L-(-)-FMAU:n • · · • ” huippupitoisuus plasmassa ja maksassa esiintyi ajankohta- • · · ' *···* na noin 1 tunti. Yhdiste oli oleellisesti poistunut sekä V * plasmasta että maksasta 4 tunnin kuluttua.

Esimerkki 4 ·.· · 30 L- (-) -FMAUrn myrkyllisyys naaraspuolisissa BDFl- hiirissä • « · ,.:v .1. Kuviossa 13a esitetään muutos ruumiin painossa 30 t • · päivän ajalta naaraspuolisissa verrokki-BDF-l-hiirissä.

*.’ Kuvioissa 13b ja 13c esitetään muutos ruumiin painossa

*i* 35 30 päivän aikana naaraspuolisissa BDFl-hiirissä, joille I

* · 43 1 1 7475 annettiin 10 mg/kg (13b) ja 50 mg/kg (13c) bid L-(-)-FMAU:ta. Esitetty ruumiin paino edustaa keskiarvoa ja standardipoikkeamaa 5-7 hiiren arvoista. Kuten esitetään kuvioissa 13b ja 13c, L-(-)-FMAU ei vaikuttanut merkittä-5 västi vaikuttavan hiirten painoon 30 päivässä, mikä osoittaa yhdisteen hyvän siedon.

Esimerkki 5

Hiiren plasman kliininen kemia L-(-)-FMAU-käsitte-lyn jälkeen 10 Kuvioissa 14 - 20 esitetään hiiriplasman kliini- f nen kemia L-(-)-FMAU:n annon jälkeen annoksena 10 mg/kg (3 hiirtä) tai 50 mg/kg (3 hiirtä) bid 30 päivän ajan.

Kuivo 14 on pylväsdiagrammi kokonaisbilirubiinipi- > toisuudesta hiiren plasmassa yksiköissä mg/dl. Kuviossa 15 15 esitetääään pylväsdiagrammi alkalisen fosfataasin pitoi- ? suudesta hiiren plasmassa yksiköissä U/litra. Kokonaisbi- lirubiini ja alkalinen fosfataasi ovat maksafunktion indi- ^ kaattoreita. Hiiriarvot bilirubiinille ovat normaalilla ihmisalueella (alle 1,2 mg/dl), mutta alkalisen fosfataa- 20 sin arvot ovat jonkin verran korkeampia kuin normaali ih- .=.¾ mistaso (30 - 114 U/litra). ΐ

, .·. Kuvio 16 on pylväsdiagrammi kreatiniinln pitoisuu- J

» · · desta hiiriplasmassa yksiköissä mg/dl. Kreatiniini on mu- ί nuaisten toiminnan indeksi. Lukuun ottamatta hiirtä 50-2 ; • · · • · · ! . 25 käsiteltyjen hiirten kreatiniinitasot eivät poikkea ver- * * · * * rokkihiirten vastaavista.

• » I · !*' *·*·’ Kuvio 17 on pylväsdiagrammi AST:n (SGOT, seerumin ϊ • · · s • « · *.* * glutamiinioksaalitransaminaasi) pitoisuudesta hiiriplas massa yksiköissä U/litra. Kuviossa 18 esitetään pylväsdia- • · ·.· · 30 grammina ALT:n (SGPT, seerumin glutamiini-pyruvaattitrans- aminaasi-) pitoisuus hiiriplasmassa yksiköissä U/litra.

··· SGOT ja SGPT ovat maksafunktion indikaattoreita. Lukuun i • · . i ottamatta hiirtä 50-2 (sekä SGOT että SGPT) ja hiirtä 10-2 il , (vain SGOT) entsyymitasot käsitellyissä hiirissä eivät ..*·* 35 poikkea verrokkihiirten vastaavista.

• ft ft « « '.··; · 44 117475

Kuvio 19 on pylväsdiagrammi maitohapon pitoisuudesta hiiriplasmassa yksiköissä mmol/litra. Kuvio 20 on pylväsdiagrammi maitohappodehydrogenaasin pitoisuudesta hii- ;?< riplasmassa yksiköissä U/litra. Maitohappoa muodstuu li-5 haksissa glykolyysin aikana. Maitohappodehydrogenaasia (LDH) esiintyy eri isoentsyymeinä eri kudoksissa. LDH:n vapautuminen plasmaan voi olla osoitus kudosvauriosta. Kä- '£.

siteltyjen hiirten maitohappo- ja maitohappodehydrogenaa-sitasot eivät merkittävästi poikkea verrokkihiirten vas-10 taavista arvoista. f III. Oligonukleotidit

Halutun sekvenssin mukaisia oligonukleotidejä voidaan modifioida substituoimalla yksi tai useampi tässä julkistettu L-nukleosidi jollain nukleosidilla oligonuk-15 leotidissä. Edullisessa suoritusmuodossa L-nukleosidi sijoitetaan oligonukleotidin jompaankumpaan päähän. Modi- f fioitua oligonukleotidiä voidaan käyttää esimerkiksi antisense- teknologiassa.

Antisense-teknologia viittaa yleensä ottaen geeni- 20 ilmentymisen modulaatioon prosessilla, jossa synteettinen .¾ oligonukleotidi hybridisoidaan siihen nähden komplementaa- i . .·. riseen nukleiinihapposekvenssiin transkription tai rep- /-f • · · * . 'k- likaation inhiboimiseksi (jos kohdesekvenssinä on DNA), t • · · ' . 'k l.l translaation inhiboimiseksi (jos kohdesekvenssinä on RNA) i* • « · .*£.

I . 25 tai prosessoinnin inhiboimiseksi (jos kohdesekvenssinä on • · • · · • pre-RNA). Laajaa valikoimaa soluaktiivisuuksia voidaan mo- ; • · · ‘•J·* duloida tätä tekniikkaa käyttäen. Yksinkertainen esimerkki ··♦ • · Φ *.* * on proteiinien biosynteesin inhibointi mRNArhan sitoutu neella antisense-oligonukleotidilla. Toisessa suoritusmuo- • · • J · 30 dossa synteettinen oligonukleotidi hybridisoidaan spesifi- :***: seen geenisekvenssiin kaksisäikeisessä DNA:ssa, jolloin « muodostuu kolmisäikeinen kompleksi (tripleksi), joka inhi- • · ***, boi tuon geenisekvenssin ilmentymisen. Antisense-oligonuk- , leotidejä voidaan myös käyttää geeni-ilmentymisen aktivoi- 35 miseksi epäsuorasti suppressoimalla luonnollisen represso- f • · · · · • * 45 117475 rin biosynteesi. AOTrtä voidaan käyttää patogeenisten gee- nien ilmentymisen inhiboimiseksi, esimerkiksi geenien, 1 jotka helpottavat virusten replikaatiota, mukaan lukien ihmisen immuunikatovirus (HIV), hepatiitti-B-virus (HBV) ί 5 ja herpesvirukset, ja syöpien, erityisesti kiinteiden kas-vainmassojen kuten glioomat (hermon tukisolukasvain), rintasyöpä ja melanoomat. £

Valitun oligonukleotidin stabiilisuus nukleaaseja vastaan on tärkeä tekijä in vivo -käytöissä. Tiedetään, 10 että 3'-eksonukleaasiaktiivisuus on vastuussa valtaosasta f ei-modifioidun antisense-oligonukleotidin hajoamisesta seerumissa [Vlassov, V.V., Yakubov, L.A., "Prospects for j

Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancers and AIDS", |

Wiley-Liss, Inc., New York, 1991, 243 - 266; Nucl. Acids 15 Res. 21 (1993) 145], Yhdessä suoritusmuodossa tässä julkistettuja L-nukleosideja voidaan käyttää antisense-oligo-nukleotidien 3'-eksonukleaasihajoamisen minimoiseksi.

Esillä olevan keksinnön mukaiset oligonukleotidit, jotka kykenevät sitoutumaan polyribonukleiinihappoon tai 20 polydeoksiribonukleiinihappoon, ovat käyttökelpoisia anti- J? sense-aineina samaan tapaan kuin tavanomaiset antisense- f ; ·*; aineet [katso yleisesti "Antisense Molecular Biology and * ·*· · S-oligos" (suom. "Antisense-molekyylibiologia ja S-oli- | • · ' ; ,τϊ

got"), Synthesis 1 (lokakuu 1988), julkaisija Synthecell I

,·, . 25 Corp., Rockville, Md); "Discoveries in Antisense Nucleic | • »9 7¾ .’ Acids", C. Brakel ja R. Fraley, toim., 1989; Uhlmann et s • ♦ · - • · · “· al., "Antisense Oligonucleotides: A New Therapeutic Tech- • · · *·* nique" (suom. "Antisense-oligonukleotidit: Uusi terapeut tinen tekniikka"), Chem. Rev. 90:4 (1990); ja Milligan, • · ' ; 30 J.F., Matteucci, M.D., Martin, J.C., J. Med♦ Chem. 36 • · · :,..ϊ (1993) 1923 - 1937]. Esillä olevan keksinnön mukaisia an- • Λ .···, tisense-aineita voidaan käyttää antisense-aineen rakenta- v • * . miseksi, joka kykenee sitoutumaan selektiivisesti ennalta * · . määrättyyn polydeoksiribonukleiinihapposekvenssiin tai po- ·: ,,*·* 35 lyribonukleiinihapposekvenssiin tai tällaisen sekvenssin « • · · · · 46 : 117475 sisältävään soluun (esim. lisäämällä antisense-ainetta so- f 'i\\ lun sisältävään kasvualustaan) siten, että antisense-aine -? siirtyy soluun, sitoutuu ennalta määrättyyn sekvenssiin ja salpaa sen transkription, translaation tai replikaation.

5 Edellytykset antisense-aineen selektiiviselle sitoutumiselle tunnetaan (esim. 17 emäksen pituus selektiivistä si- toutumista varten ihmisgenomiin). f IV. Farmaseuttisten koostumusten valmistus Tässä julkistetut yhdisteet ja niiden farmaseutti-10 sesti hyväksyttävät suolat, esilääkkeet ja johdannaiset f ovat käyttökelpoisia HBV- ja EBV-tartuntojen ja muiden su-kulaistilojen estämiseksi ja hoitamiseksi, kuten anti-HBV- ί tai anti-EBV-vasta-ainepositiiviset ja HBV- tai EBV-posi-tiiviset tilat, HBV:n aiheuttama krooninen maksatulehdus, 15 kirroosi, akuutti hepatiitti, äkillinen hepatiitti, krooninen pysyvä hepatiiti ja väsymys. Näitä yhdisteitä tai koostumuksia voidaan käyttää myös ennalta ehkäisemään tai estämään tai hidastamaan kliinisen sairauden etenemistä yksilöissä, jotka ovat anti-HBV-, anti-EBV-vasta-aine- tai 20 HBV- tai EBV-antigeenipositiivisia tai jotka ovat altistu- neet HBV:lie tai EBV:lie. ? • Mistä tahansa näistä tiloista kärsiviä ihmisiä voi-

IM

daan hoitaa antamalla potilaalle tehokas HBV- tai EBV-hoi- f * · ' >

,···. tomäärä yhtä tässä kuvattua aktiivista yhdistettä tai sen I

• · · ι·ι . 25 farmaseuttisesti hyväksyttävää johdannaista tai suolaa tai f

• M

mainittujen seosta mahdollisesti farmaseuttisesti hyväk- *

• · · -V

• · · · V

syttävässä kantajassa tai laimentimessa. Aktiivisia mate- 4 *·* * riaaleja voidaan antaa mitä tahansa sopivaa tietä, esimer kiksi oraalisesti, ruoansulatuskanavan ulkopuolisesti, • * : 30 laskimonsisäisesti, ihonsisäisesti, ihonalaisesti tai pai- • · · :...ϊ kallisesti nestemäisessä tai kiinteässä muodossa.

,···. Aktiivinen yhdiste sisällytetään farmaseuttisesti • · hyväksyttävään kantajaan tai laimentimeen määränä, joka on • · . riittävä kuljettamaan potilaaseen terapeuttisesti tehok- f

• :X

·♦· -¾ • ( • » · · 47 117475 kaan määrän aiheuttamatta vakavia toksisia vaikutuksia hoidetussa potilaassa.

Aktiivisen yhdisteen edullinen annos kaikkiin edel- · lä mainittuihin tiloihin on noin 1-60 g/kg, edullisesti 5 1-20 mg/kg, ruumiin painoa päivässä, yleisemmin 0,1 - noin 100 mg/kg vastaanottajan ruumiin painoa päivässä. Farmaseuttisesti hyväksyttävien johdannaisten tehokas an- i nostusalue voidaan laskea perille toimitettavan kantanuk-leosidin painosta. Jos johdannainen sinänsä osoittaa ak-10 tiivisuutta, tehokas annostus voidaan arvioida kuten edel- ... ί lä käyttäen johdannaisen painoa, tai muilla, alan taitajille tutuin keinoin. Yhdessä suoritusmuodossa aktiivinen f yhdiste annetaan kuten kuvataan käsikirjan "Physician's Desk Reference" tuoteliitteessä 3'-atsido-3'-deoksitymi-15 diinille (AZT), 2',3'-dideoksi-inosiinille (DDI), 2',3'- dideoksisytidiinille (DDC) tai 2',3'-dideoksi-2',3'-dide- | hydrotymidiinille (D4T) HlV-indikaatiossa.

Yhdiste annetaan kätevästi minä tahansa sopivana annostusmuotoyksikkönä, mukaan lukien mainittuihin kuiten-20 kaan rajoittumatta yksikkö, joka sisältää 7 - 3 000 mg, edullisesti 70-1 400 mg, aktiivista aineosaa kohden yk- $ I, . sikköannostusmuoto. Tavallisesti kätevä on oraalinen an- s * · · • · · -·<, .·.·. nostus 50 - 1 000 mg. | * * * ' il

Ihanteellisesti aktiivista ainesosaa tulisi antaa • * * . 25 aktiivisen yhdisteen huippuplasmapitoisuuksien saavutta- | • ·· * ,* miseksi, jotka ovat noin 0,2 - 70 μΜ, edullisesti noin • · · !*

’”·* 1,0 - 10 μΜ. Tähän voidaan päästä esimerkiksi ruiskut- J

* # · '·' tamalla laskimonsisäisesti aktiivisen aineosan 0,1 - 5-%:ista liuosta mahdollisesti suolaliuoksessa, tai anta- • a ·.; · 30 maila kerta-annos aktiivista aineosaa.

• · ·

Aktiivinen yhdiste voidaan antaa käyttöön farma-,···, seuttisesti hyväksyttävien suolojen muodossa. Tässä käy- ji • · . ·ϊ·:: ’**, tettynä ilmaisulla "farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat , tai kompleksit" tarkoitetaan nukleosidien suoloja tai 35 komplekseja, joilla on tallella kantayhdisteen haluttu · ♦ • « 117475 ; 48 /. J; . -|· biologinen aktiivisuus ja jotka osoittavat minimaalisia tai ei ollenkaan epätoivottavia toksikologisia vaikutuksia. Ei-rajaavia esimerkkejä tällaisista suoloista ovat * (a) epäorgaanisten happojen kanssa muodostetut happoaddi-5 tiosuolat (esimerkiksi kloorivetyhappo, bromivetyhappo, rikkihappo, fosforihappo, typpihappo ja muut vastaavat), . 1, ja orgaanisten happojen kanssa muodostetut suolat, kuten i seuraavien happojen kanssa muodostetut suolat: etikkahap-po, oksaalihappo, viinihappo, meripihkahappo, omenahappo, 10 askorbiinihappo, bentsoehappo, parkkihappo, palmitiinihap- po, algiinihappo, polyglutamiinihappo, naftaleenisulfoni-hapot, naftaleenidisulfonihapot ja polygalakturonihappo; (b) emäsadditiosuolat, jotka on muodostettu kationien ; kanssa kuten natrium, kalium, sinkki, kalsium, vismutti, 15 barium, magnesium, aluminium, kupari, koboltti, nikkeli, kadmium, natrium, kalium ja muut vastaavat, tai orgaanisen kationin kanssa muodostetut suolat, jotka on muodostettu ? N,N-dibentsyylietyleenidiamiinista, ammoniumista tai ety-leenidiamiinista; tai (c) (a):n ja (b):n yhdistelmät, 20 esim. sinkkitannaattisuolat ja muut vastaavat.

Aktiivisen yhdisteen modifikaatiot, spesifisesti ; . -s * ,*. N6- tai N4- ja 5'-0-asemissa, voivat vaikuttaa aktiivisen | • · · ·.'·!*' lajin biosaatavuuteen ja aineenvaihduntanopeuteen, jolloin j * * * . ·£, saadaan kontrolli aktiivisen lajin perille toimittamiseen. f • · · *;·’ . 25 Aktiivisen yhdisteen pitoisuus lääkekoostumuksessa | • ·· * / riippuu lääkkeen absorptio-, inaktivaatio- ja eritysno- • · v *···* peuksista sekä muista, alan taitajille tutuista tekijöis- • · · ?' V * tä. Huomattakoon, että annostusarvot vaihtelevat myös lie vitettävän tilan vakavuuden mukaan. Edelleen tulee ymmär- • · ·.· · 30 tää, että mille tahansa tietylle kohteelle spesifiset an- • · · tnostusohjelmat tulisi säätää ajan funktiona yksilöllisen ,···. tarpeen mukaan ja koostumuksia antavan tai antoa valvovan | • · ’t·,' henkilön ammatillisen harkinnan mukaan, ja että tässä esi- * · . tetyt pitoisuusalueet ovat vain esimerkkiluonteisia, joi- 35 loin niiden ei tarkoiteta rajoittavan patentoitavaksi vaa- i, ♦ • t 49 117475 ditun koostumuksen käytännön suojapiiriä. Aktiivinen aineosa voidaan antaa kerralla, tai se voidaan jakaa lukuisiksi pienemmiksi annoksiksi, jotka annetaan vaihtelevina ajankohtina.

5 Aktiivisen yhdisteen edullinen antotapa on oraali nen. Oraaliset koostumukset sisältävät yleensä inerttiä laimenninta tai syötävää kantajaa. Ne on voitu sulkea ge-latiinikapseleihin tai puristaa tableteiksi. Oraalista terapeuttista antoa silmällä pitäen aktiivinen yhdiste voi-10 daan sisällyttää täyteaineisiin ja sitä voidaan käyttää |' tablettien, suussa liukenevien tablettien tai kapselien muodossa. Farmaseuttisesti yhteensopivia sideaineita ja/ tai apumateriaaleja voidaan sisällyttää osaksi koostumus- ’ ta.

15 Tabletit, pillerit, kapselit, suussa sulavat table- f t' tit ja muut vastaavat voivat sisältää mitä tahansa seuraa-via aineosia tai luonteeltaan samankaltaisia yhdisteitä: sideainetta, kuten mikrokiteinen selluloosa, traganttikumi tai gelatiini; täyteainetta kuten tärkkelys tai laktoosi, 20 hajottavaa ainetta kuten algiinihappo, Primogel-valmiste tai maissitärkkelys; voiteluainetta kuten magnesiumstea- !;| • ·*· raatti tai Sterotes-valmiste; liukuainetta kuten kolloidi- ···’ nen piidioksidi; makeutusainetta kuten sakkaroosi tai sak- • · · 'M-s; • * ·:'·ξ kariini; tai flavoriainetta kuten piparminttu, metyylisa- % • · · £ . 25 lisylaatti, tai appelsiinin maku. Kun annostusyksikkömuoto f • · · .* on kapseli, se voi sisältää edeltävän tyyppisen materiaa- j • · · . 'i

Iin lisäksi nestemäistä kantaa kuten rasvaöljy. Lisäksi • * · *·’ annostusyksikkömuodot voivat sisältää erilaisia muita ma teriaaleja, jotka modifioivat annostusyksikön fysikaalista • · :.! · 30 muotoa, esimerkiksi sokeri-, sellakkapäällysteet tai muut • φ * ϊ ϊ suolessa sulavat aineet.

• · · .···, Aktiivinen yhdiste tai sen farmaseuttisesti hyväk- • · syttävä suola tai johdannainen voidaan antaa eliksiirin, * . suspension, siirapin, vohvelin, purukumin tai muun vastaa- • -¾ ..!** 35 van aineosana. Siirappi voi sisältää aktiivisten yhdistei- ' • · 5° 117475 ,¥ den lisäksi sakkaroosia makeutusaineena ja tiettyjä säily-tysaineita, värejä ja väriaineita ja flavoriaineita.

Aktiivinen yhdiste tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä johdannainen tai suola voidaan myös sekoittaa mui-5 hin aktiivisiin materiaaleihin, jotka eivät haittaa haluttua vaikutusta, tai materiaaleihin, jotka täydentävät ha- j luttua vaikutusta, kuten antibiootit, sienivastaiset ai- .·"> neet, tulehdusvastaiset aineet tai muut virusvastaiset aineet, mukaan lukien anti-HBV-, anti-EBV-, anti-sytomegalo- ':k 10 virus- tai anti-HIV- tai anti-EBV-aineet. >

Liuokset tai suspensiot, joita käytetään ruoansulatuskanavan ulkopuoliseen, ihonsisäiseen, ihonalaiseen tai }.

paikalliseen antoon, voivat sisältää seuraavia aineosia: steriili laimennin kuten injisointivesi, suolaliuos, kove-15 tetut öljyt, polyetyleeniglykolit, glyseriini, propyleeni- glykoli tai muut synteettiset liuottimet; bakteerivastai- ' set aineet kuten bentsyylialkoholi tai metyyliparabeenit; hapetuksenestoaineet kuten askorbiinihappo tai natriumbi-sulfiitti; kelatoivat aineet kuten etyleenidiamiinitetra-20 etikkahappo; puskurit kuten asetaatit, sitraatit tai fos- faatit, ja aineet toonisuuden säätämiseksi kuten natrium- f ; kloridi tai dekstroosi. Kantavalmiste voidaan sisällyttää f ampulleihin, kertakäyttöruiskuihin tai lasista tai muovis- f • · · £ • · ' V.

.···, ta valmistettuihin moniannosampulleihin. 1 * · » ’•t .25 Laskimonsisäisessä annossa edullisia kantajia ovat • · * .* fysiologinen suolaliuos tai fosfaattipuskuroitu suolaliuos Ä • ♦ · *r ’"f (PBS). Edullisessa suoritusmuodossa aktiiviset yhdisteet | • « « »v *·* koostetaan kantajien kanssa, jotka suo jaavat yhdistettä vastaan nopeaa poistumista elimistöstä, kuten kontrolloi-* 30 dun vapautumisen koostumus, mukaan lukien istutteet ja ♦ · · mikrokapseloidut kuljetussysteemit. Voidaan käyttää bioha- .···. joavia, bioyhteensopivia polymeerejä, kuten etyleenivinyy- • · liasetaatti, polyanhydridit, polyglykolihappo, kollageeni, * · . polyortoesterit ja polymaitohappo. Menetelmät tällaisten s ..*♦* 35 koostumusten valmistamiseksi ovat ilmeisiä alan ammatti- f * · 51 : 117475 laisille. Materiaalit voidaan myös saada kaupallisesti tahoilta Alza Corporation ja Nova Pharmaceuticals, Inc.

Liposomisuspensiot (mukaan lukien liposomit, jotka on kohdennettu tartutettuihin soluihin virusantigeenien 5 vastaisilla monoklonaalisilla vasta-aineilla) ovat myös edullisia farmaseuttisesti hyväksyttävinä kantajina. Nämä ^ voidaan valmistaa alan taitajille tutuilla menetelmillä f kuten kuvataan esimerkiksi US-patenttijulkaisussa nro t 4 552 811 (joka sisällytetään tähän kokonaisuudessaan --¾ 10 viitteeksi). Esimerkiksi liposomikoostumuksia voidaan vai- f mistaa liuottamalla yhtä tai useampaa sopivaa lipidiä (kuten stearoyylifosfatidyylietanoliamiini, stearoyylifosfa-tidyylikoliini, arakadoyylifosfatidyylikoliini ja koleste- -i roli) epäorgaaniseen liuottimeen, joka sitten haihdutetaan 15 pois, jolloin jäljelle jää ohut kalvo kuivattua lipidiä astian pinnalle. Sitten astiaan lisätään aktiivisen yhdis- i teen tai sen monofosfaatti-, difosfaatti- ja/tai trifos- ' faattijohdannaisten vesiliuosta. Sitten astiaa pyöritetään käsin lipidimateriaalin vapauttamiseksi astian seiniltä ja 20 lipidiaggregaattien dispergoimiseksi, jolloin muodostuu liposomisuspensio.

• ·*. Tätä keksintöä on kuvattu viitaten sen edullisiin • * * ;* • · suoritusmuotoihin. Keksinnön variaatiot ja modifikaatiot * · « V; • · e*;-f ovat ilmeisiä alan ammattilaisille keksinnön edeltävästä I . 25 yksityiskohtaisesta kuvauksesta. Tarkoitus on, että kaikki , * · · ' ‘:'v * * * *.· nämä variaatiot ja modifikaatiot sisältyvät oheisten pa- * • * · y tenttivaatimusten suojapiiriin. f • · · .

• · · • · ··· ' * · · ··· · * · · • · • · * • * * • * * · • · · ·····' • · • '-‘v

• A

• • · · · *·**·' * ·

Claims (25)

117475 52 "S ' ' »

1. L-nukleosidiyhdiste, jolla on kaava: OH 5 ft^7\ 1 r«0J F H 10 jossa R on emäs, joka on valittu tymiinistä, ade- niinista ja sytosiinista; ja R" on vety; -C(0)R', jossa R' on suoraketjuinen, haa- ijj • . '' .'f rautunut tai syklinen Ci~Ci0-alkyyli, Ci-Cio-alkoksi-Ci-Cm- 1 i alkyyli, bentsyyli, fenoksi-Ci-Cio-alkyyli, mahdollisesti 15 halogeenilla, Ci-C4-alkyylillä tai Ci-C4_alkoksilla substi- tuoitu fenyyli, sulfonaattiesteri, mono-, di- tai trifos-faattiesteri, trityyli tai monometoksitrityyli, substi-tuoitu bentsyyli, trialkyylisilyyli tai difenyylimetyy-lisilyyli; lauryyli; myristyyli; palmityyli; stearyyli; 20 oleyyli; monofosfaatti; difosfaatti tai trifosfaatti; tai > sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola. •

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen L-nukleosidi-yhdiste, jossa R on tyrniini.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen L-nukleosidi- ;\ϊ 25 yhdiste, jossa R on adeniini tai sytosiini.

• · . 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen L-nukleosidi- * · 1 yhdiste, jossa R' on sulfonaattiesteri, joka on Ci-Cio-• · · 2 alkyylisulfonyyli tai fenyyli-Ci-Ci0-alkyylisulf onyyli tai ’ . . bentsyyli-Ci-CiQ-alkyylisulfonyyli. • · · : 30

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen L-nukleosidi- • 1 · *·..2 yhdiste, jossa R' on metaanisulfonyyli. ;3;

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen L-nukleosidi- • · · yhdiste, jossa R' on dimetyyli-t-butyylisilyyli.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen L-nukleosidi- : 2 ··1 -..- •••i 35 yhdiste, jossa R' on Ci-Cio-alkyyli. 1 • 1 · · · 3 • · 53 - 117475

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen L-nukleosidi- : yhdiste, jossa R" on mono-, di- tai trifosfaattiesteri.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen L-nukleosidi-yhdiste, jossa R" on vety.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen L-nukleosidi- yhdiste, jossa R" on asetyyli, propionyyli tai butyryyli.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen L-nukleosidi-yhdiste, joka on 2'-fluori-5-metyyli-p-L-arabinofuranosyy-liuridiini tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola. 1

12. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen L-nukleosidiyhdiste, joka on ainakin 95-%risesti puhdas D-enantiomeerista. .

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen L-nukleosidiyhdiste, joka on ainakin 98-%risesti puhdas D-enantio- 15 meerista.

14. Modifioitu oligonukleotidi, jossa yksi tai useampi modifioimattoman oligonukleotidin nukleosideista on korvattu yhdellä tai useammalla, jonkin patenttivaatimuksen 1-13 mukaisella L-nukleosidiyhdisteellä. :j' : H

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen modifioitu ’ oligonukleotidi, jossa L-nukleosidi on sijoitettu oligo- • m*· ' 4 nukleotidin jompaankumpaan päähän. k * · $

16. Eksonukleaasiresistentti antisense-oligonuk- ’ leotidi, joka sisältää ainakin yhden, jonkin patenttivaa- ;*·,· 25 timuksen 1-13 mukaisen L-nukleosidiyhdisteen. ,1.

· . 17. Farmaseuttinen koostumus, joka sisältää jon- * • · · .···. kin patenttivaatimuksen 1-13 mukaista L-nukleosidi- t *·* · yhdistettä farmaseuttisesti hyväksyttävässä kantajassa.

. . 18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen farmaseutti- *!!.* 30 nen koostumus, jossa farmaseuttisesti hyväksyttävä kantaja • # *♦··* on sopiva oraaliseen antoon.

; :***: 19. Patenttivaatimuksen 17 mukainen farmaseutti- *♦* ·;··| nen koostumus, jossa farmaseuttisesti hyväksyttävä kantaja ·, on liposomisuspensio. ·· *··· ·**··' • · i? • 54 ' 117475

20. Patenttivaatimuksen 17 mukainen farmaseuttinen koostumus, jossa farmaseuttisesti hyväksyttävä kantaja on kontrolloidusti vapautuva koostumus.

21. Farmaseuttinen koostumus, joka sisältää HBV:n 5 tai EBV:n hoitoon tehokkaan määrän 2'-fluori-5-metyyli~p- L-arabinofuranosyyliuridiinia farmaseuttisesti hyväksyttävässä kantajassa.

22. Jonkin patenttivaatimuksen 1-13 mukaisen yhdisteen tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan 10 käyttö lääkkeen valmistukseen, joka on tarkoitettu HBV- ίn fiktion hoitoon. ]

23. Jonkin patenttivaatimuksen 1-13 mukaisen yhdisteen tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan f käyttö lääkkeen valmistukseen, joka on tarkoitettu EBV- 13' - J infektion hoitoon.

24. 2'-fluori-S-metyyli-p-L-arabinofuranosyyli- uridiinin tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan käyttö lääkkeen valmistukseen, joka on tarkoitettu HBV- infektion hoitoon.

25. 2'-fluori-5-metyyli-p-L~arabinofuranosyyli- 'y • .*. uridiinin tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan ,*,·\ käyttö lääkkeen valmistukseen, joka on tarkoitettu EBV- • * * * I .·.! infektion hoitoon. * • : : * • * **· T V : , t j I/: *·· » C‘: ·* m .*·* . *·· ···.; * · * 1 •*\ , ' . . ϊί *:··: ^ k; 117475 55. o •