JP2004532900A - オリゴヌクレオチドのｉｎｖｉｖｏでの効率を増加するおよび哺乳動物において炎症を阻害するための方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、核酸分子のin vivoでの効率を増加させるため、およびまた哺乳動物において炎症を阻害するためのヌクレオチド代替物の使用に関する。さらに特に、本発明は抗炎症組成物の中で、およびまた従来のオリゴと比べてin vivoでの生理学的効率の増加および毒性の減少を有する核酸分子の調製のために2'6'ジアミノプリン（DAP）およびその類似体自体を使用することに関する。本発明は嚢胞性線維症、喘息、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、好酸球性気管支炎、アレルギー、アレルギー性鼻炎、肺線維症、成人呼吸窮迫症候群、副鼻腔炎、呼吸器合胞体ウイルスあるいはその他のウイルス性呼吸気道感染および癌などの肺／呼吸器疾患を治療するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの調製のために特に有用である。
Description
【０００１】
関連する出願
本出願は、2001年7月6日に出願された合衆国仮出願60/303,071の優先権を主張し、これによりその開示は完全にここで参考文献により受け入れられる。
【０００２】
発明の背景
（ a ） 発明の分野
本発明は核酸分子のin vivo効率を増加するための、およびまた哺乳動物において炎症を阻害するためのヌクレオチド代替物の使用に関する。
【０００３】
さらに具体的には、本発明は抗炎症組成物における、およびまたin vivoでの生理学的効率の増加および毒性の減少を有する核酸分子の調製のための、2'6'ジアミノプリン（DAP）およびその類似体のそれ自体の使用に関する。
【０００４】
（ a ） 先行する技術の簡単な説明
核酸分子の使用に基づく治療的アプローチは、ますます一般的になってきている。遺伝子をベースとする治療およびアンチセンスをベースとする治療は、おそらく近い将来に医学を根本的に変化させるであろう。
【０００５】
現在までの治療としての核酸分子、さらに具体的にはアンチセンスオリゴヌクレオチドの問題は、毒性（全身性および局所性の両方）、安定性、および細胞表面タンパク質への非特異的結合である。アンチセンスオリゴヌクレオチドの毒性は種間で様々であるようであり、ラットは最も感受性が高いが、毒性は治療的に効果のある用量以上の用量で現れる（総説として、ST Crooke, Hematologic Pathology, 1995,9:5972参照）。肺／呼吸器疾患では、治療的なアンチセンス／遺伝子の投与に関連する核酸分子毒性は次のものを含む：免疫刺激の増加、肺への単核球性-炎症性浸潤、およびおそらく気道の過敏性および気管支収縮。
【０００６】
毒性の問題を回避するための最適とまではいかない解決法が、今日までにいくつか提案された。最も一般的なものの中には、様々な修飾DNA塩基、RNA塩基、および／または修飾バックボーン構造を含有する核酸分子の調製がある。例えば、WO 99/67378は修飾糖に基づくアンチセンスオリゴヌクレオチド構築物を記載する。また、NyceはWO 00/09525およびWO 00/62736にて、明らかにはされていないが、呼吸器疾患を治療するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドに含まれるアデノシン塩基が肺での毒性の主要な原因であることを主張した。その結果、Nyceは低アデノシンオリゴヌクレオチド、およびアデノシン塩基をアデノシンの類似体で置換したオリゴヌクレオチドを提案する。しかし、Nyceが提案した低アデノシンオリゴヌクレオチドおよびアデノシン類似体は、それらの生物学的活性についてあるいは毒性を減少するとされることについて、これまで何ら試験されていない。
【０００７】
2',6'-ジアミノプリンヌクレオシド（2-アミノ-2'-デオキシアデノシン；DAP）は、シアノファージS-2Lによりアデノシンの代わりにDNAに存在することが見出された（Cheng, X., Annu Rev Biophys Biomol Struct 24: 293-318, 1995; Khudyakov, I. Y., et al., Virology 88 : 8-18,1978）。それ以来、2',6'-ジアミノプリンヌクレオチド（DAP）は、とりわけヒト免疫不全ウイルス（HIV）複製をin vitroで選択的に阻害する能力のある2-アミノ-2',3'-ジデオキシアデノシン（DAPではない）などの抗ウイルス化合物の合成のための化学的な開始点として、広く使用および研究された（Balzarini, J. et al., Biochem. & Biophys. Res. Communications 145: 269-76,1987）。しかし、アンチセンスオリゴヌクレオチドあるいは遺伝子治療法におけるDAPの使用は、今まで示唆されたことはない。
【０００８】
また、US特許番号 5,925,624および番号 5,889,178は、2,6-ジアミノプリン-ベータ-D-リボフラヌロンアミドの誘導体を記載する。これらの誘導体は抗炎症効果（大半は好中球のスーパーオキシド放出に対する）を有し、呼吸器疾患の治療に使用されうるが、それらはDAPおよびその類似体の化学式とは異なる化学式を有している。
【０００９】
要約すれば、今日までDAP自体を抗炎症組成物にて使用しうるという示唆あるいは証拠はなく、またDAPおよびその類似体を、核酸分子（遺伝子構築物およびアンチセンス）中に、これらのオリゴのin vivo効率を増加させるために組み込みうるという示唆あるいは例示はなかった。
【００１０】
従って、2'6-ジアミノプリンおよび／またはその類似体を含むより効果的な抗炎症組成物が必要とされる。
また、高い効果および低い毒性を示す一方で、体内で安定を維持する核酸分子が長い間必要と思われている。
【００１１】
さらに具体的に、2'6'-ジアミノプリン（DAP）およびその類似体などのヌクレオチド代替物を組み込む核酸分子の必要性、同じものを含む組成物の必要性、および特に遺伝子およびアンチセンス治療法においてこれらの核酸分子を使用する方法の必要性が存在する。ヌクレオチド代替物による塩基の置換がアンチセンスオリゴヌクレオチドの安定性、結合性、分解効率および毒性に影響を与えうるかどうかのテスト、および細胞、培養あるいは動物における生物学的活性に関するそのような修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのテストは、今まで誰も行っていない。
【００１２】
本発明はこれらの必要性、および以下の明細書を読むことで当業者に明らかとなるであろうその他の必要性を満たす。
【００１３】
発明の概要
本発明の目的は、高い効果および低い毒性を示す一方で、体内で安定を維持する遺伝子構築物およびアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸分子を提供することである。
【００１４】
本発明の観点によれば、少なくとも1つのヌクレオチド代替物を核酸分子に組み込むことを含む、哺乳動物に投与する核酸分子のin vivoでの効率を増加させるための方法が提供される。そのような組み込みは、哺乳動物に投与するとき、ヌクレオチド代替物を組み込まない核酸分子と比較して、核酸分子のin vivoでの生理学的効率を増加させ、またその毒性を減少させる。好ましい態様によると、ヌクレオチド代替物は核酸分子にその中でアデノシン塩基を置換するために組み込まれる。さらに好ましくは、ヌクレオチド代替物は2'6'-ジアミノプリンおよびその類似体から成る群から選択される。好ましい2'6'-ジアミノプリン類似体には、2,6-ジアミノプリンへミスルフェート（2,6-diaminopurine hemisulfate）、2-アミノ-9-(B-D-2'-デオキシリボフラノシル)プリン、7-デアザ-2'-デオキシアデノシン、N6-メチル-2'-デオキシアデノシン、2-アミノアデノシン／2,6-ジアミノプリンリボシド、それらの塩およびそれらの機能的誘導体を含む。
【００１５】
本発明はまた、哺乳動物被検体に少なくとも1つの核酸分子をin vivoで投与するための改善された方法に関する。改善は、核酸分子の中に少なくとも1つの2'6'-ジアミノプリンおよび／またはその類似体を組み込むことから成る。好ましくは、2'6'-ジアミノプリンあるいはその類似体を、核酸分子内にその中でアデノシン塩基を置換するために組み込む。
【００１６】
本発明のもう1つの観点によると、アンチセンスオリゴヌクレオチドから選択された単離あるいは精製された核酸分子、および治療的遺伝子産物をコードする配列を含む核酸分子、本発明に従って2'6'-ジアミノプリンおよびその類似体から成る群から選択されるヌクレオチド代替物を含む核酸分子が提供される。
【００１７】
本発明のもう1つの観点によると、先に定義された少なくとも1つの核酸分子と、医薬的に許容可能なキャリアとを含む医薬的な組成物が提供される。本発明の組成物は、呼吸器系疾患、神経疾患、心血管疾患、リウマチ性疾患、消化器疾患、皮膚疾患、眼疾患、泌尿器系疾患、癌、病原体感染、および遺伝性疾患、好酸球増加症、全身炎症、および癌から選択される疾患を治療および／または予防するために有用でありうる。
【００１８】
本発明のさらなる観点によると、先に定義されたように治療的有効量あるいは予防的有効量の少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、それを必要とする哺乳動物の呼吸器系に直接投与するステップを含む、アンチセンス治療の方法が提供される。この方法は、呼吸器系疾患、癌、病原体感染、および遺伝性疾患、およびさらに具体的には、肺線維症、成人呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、好酸球性気管支炎、喘息、アレルギー、副鼻腔炎、呼吸器合胞体ウイルスあるいはその他の気道感染ウイルスおよび好酸球増加症などの肺、気道および／または鼻の炎症に関係する呼吸器系疾患を予防および／または治療するのに有用である。
【００１９】
本発明のもう1つの観点によると、2'6'-ジアミノプリンおよびその類似体から成る群から選択されるヌクレオチド代替物の使用を含む、哺乳動物における炎症を阻害するための方法が提供される。典型的に、2'6'-ジアミノプリンあるいはその類似体を哺乳動物に投与する。好ましくは、2'6'-ジアミノプリンおよびその類似体それ自体を抗炎症組成物において使用するが、しかしそれらはまた核酸分子中に組み込まれうる。関連する観点では、本発明は：2'6'-ジアミノプリンおよびその類似体から成る群から選択されるアデノシンアンタゴニスト化合物；および医薬的に許容可能なキャリア；を含む抗炎症組成物に関係する。もう1つの関連する観点は、抗炎症組成物の調製のための2'6'-ジアミノプリンおよび／またはその類似体の使用に関係する。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、高い効果および低い毒性を示す一方で、体内で安定を維持する遺伝子構築物およびアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸分子に関する。それはまた、炎症を阻害するために2'6'-ジアミノプリンおよびその類似体を使用することに関する。
【００２１】
本発明の観点によれば、哺乳動物に投与する核酸分子のin vivoでの効率を増加させるための方法が提供される。この方法は、少なくとも1つのヌクレオチド代替物を核酸分子に組み込むステップを含む。後述の実施例にて示すように、そのような組み込みは、ヌクレオチド代替物を組み込まない核酸分子と比較して、哺乳動物に投与するとき、核酸分子のin vivoでの生理学的効率を増加させ、また核酸分子の毒性を減少させる。
【００２２】
核酸分子の“毒性の減少”は、当該技術分野で知られる原理を使用して評価しうる。本発明の好ましい態様によると、ヌクレオチド代替物を組み込む核酸分子がin vivoでのより低い炎症特性を示し、およびそれによって毒性を減少させるように、ヌクレオチド代替物が選択される。さらに好ましくは、この修飾を組み込む核酸分子がリンパ球、好酸球、マクロファージおよび／または好中球がこれらの核酸分子を投与する部位および／または疾患の部位へ補充されることを阻害できるように、ヌクレオチド代替物が選択される。
【００２３】
本発明の好ましい態様によると、ヌクレオチド代替物は核酸分子中にそこでアデノシン塩基を置換するために組み込まれる。好ましくは、ヌクレオチド代替物は2'6'-ジアミノプリン（図1参照）またはその類似体である。本明細書中で使用される場合、“2'6'-ジアミノプリンの類似体”には2'6'-ジアミノプリンと同様な構造、および実質的に同一な生物学的な活性／効率を有するすべての化合物が含まれる。好ましい2'6'-ジアミノプリン類似体はまた図1に示され、および：2,6-ジアミノプリンへミスルフェート（1H-プリン-2,6-ジアミン、スルフェート(2:1); CAS 69369-16-0）、2-アミノ-9-(B-D-2'-デオキシリボフラノシル)プリン（CAS 3616-24-8）、7-デアザ-2'-デオキシアデノシン（CAS 60129-59-1）、N6-メチル-2'-デオキシアデノシン（CAS 2002-35-9）、2-アミノアデノシン／2,6-ジアミノプリリボシド（CAS 209610-08）、およびそれらの塩を含む。
【００２４】
2'6'-ジアミノプリン類似体には、2'6'-ジアミノプリンの全ての機能的誘導体、すなわち2'6'-ジアミノプリンおよび／または図1に示すその類似体の生物学的な活性／効率と実質的に同様な生物学的な活性／効率を保持する全ての化合物、もまた含まれる。
【００２５】
本発明のもう1つの観点によると、先に定義されるように2'6'-ジアミノプリンおよびその類似体から成る群から選択されるヌクレオチド代替物を含む単離あるいは精製された核酸分子が提供される。本発明の核酸分子は、治療的遺伝子産物をコードする配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド、2本鎖RNA（RNAiとして）あるいは核酸分子からなっていてもよい。好ましくは、ヌクレオチド代替物は核酸分子中にその中でアデノシン塩基を置換するために組み込まれる。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、“核酸分子”という表現は、完全な遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む、1つあるいはそれ以上のヌクレオチドを有するいずれかのDNA、kRNA配列あるいは分子を意味する。その用語は、天然あるいは非天然であろうとも特定の細胞、組織あるいは器官で起こる全ての核酸を包含することを意図する。これにはDNAおよびその断片、RNAおよびその断片、cDNAおよびその断片、発現配列タグ、ランダム化人工配列を含む人工配列が含まれる。
【００２７】
本発明の核酸分子は、当該技術分野でよく知られる方法を使用して合成される。それらはDNA、あるいはRNAの形態であってもよく、それらはメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホジエステル、ホスホロジチオエート、ボラノホスフェート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、チオエーテル、カーボネート、カルバメート、スルフェート、スルホネート、スルファメート、スルホンアミド、スルホン、スルファイト、スルホキシド、スルフィド、ヒドロキシルアミン、メチレン（メチルイミノ）、メチレンオキシ（メチルイミノ）、およびホスホールアミデート残基などの1つあるいは複数のモノヌクレオチド連結残基を含みうる。
【００２８】
DAP塩基およびその類似体は、従来のホスホールアミダイト化学を使用して、DNAおよびRNA配列に化学的に導入しうる。あるいは、DAPは当該技術分野でよく知られるように、DAPトリホスフェートおよびポリメラーゼの使用を通して、酵素的方法によってDNAおよびRNA中に組み込むことができる。興味深いことに、DAP-トリホスフェートはDNA合成酵素のためにATPの真の類似体として作用する（Rackwitz, H.R., et al. Eur J Biochem 72: 191-200, 1977）
【００２９】
本発明の核酸分子はまた、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣体（peptidomimetics）、低分子化学物質、リガンド、脂質、核酸、あるいは炭水化物部分などの“キャリア”分子に連結しうる。
【００３０】
本発明の核酸分子のサイズは所望する使用により変わるであろうし、オリゴは典型的には2から約10000ヌクレオチドを有する。さらに好ましくは、アンチセンス核酸分子のサイズは約10から約100ヌクレオチドまで変わるであろうが、治療的遺伝子産物をコードする配列を含む核酸分子のサイズは典型的には約100から約10000ヌクレオチドまで変わるであろう。
【００３１】
本発明の核酸分子は、様々な疾患の治療および／または予防に有用でありうる。本核酸分子から恩恵を受けうる疾患の典型的な例には、呼吸器系疾患、神経疾患、心血管疾患、リウマチ性疾患、消化器疾患、皮膚疾患、眼疾患、泌尿器系疾患、癌、病原体感染、遺伝性疾患、好酸球増加症、全身炎症、および癌が含まれる。最も好ましい核酸分子には、以下の表1に記載したオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００３２】
【表１】
【００３３】
本発明のDAP-置換核酸分子は効率の改善および／または毒性の減少を有しているため、それらは遺伝子治療およびDNAワクチン方法に使用しうる。例えば、DAP-置換核酸分子は、呼吸器系の病原体の増殖を阻害するための治療薬；肺／気道／鼻における新生物細胞増殖を治療あるいは予防するための治療薬あるいはワクチン；嚢胞性線維症などの、肺／気道／鼻の遺伝性疾患を治療するための治療薬あるいはワクチン；および喘息、アレルギー、慢性閉塞性肺疾患、肺線維症、慢性咳嗽および粘液産生、成人呼吸窮迫症候群、全身炎症、炎症性疾患、癌、病原体感染（例えば、副鼻腔炎、呼吸器合胞体ウイルスあるいはその他のウイルス性呼吸気道感染）、遺伝性疾患、あるいはいずれかの呼吸器系の疾患の治療および／または予防のための治療薬あるいはワクチン、として使用されうる。加えて、DAPおよびその類似体は、遺伝子治療中に起こる免疫反応を減少させるために、および／または遺伝子治療方法の効率を改善するために、アデニンあるいはいずれかの他の塩基の代わりに遺伝子内に挿入しうるか、あるいは遺伝子と共同して（例えば、コード領域あるいは非コード領域に組み込まれる）投与しうる。
【００３４】
より具体的には、DAP-置換核酸分子は、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、リノウイルス、インフルエンザウイルス、細菌および疾患を起こすその他の病因などの呼吸器病原体の複製を阻害することにより、病原体感染を治療するため、および／またはそれらが起こることを予防するために使用されうる。同様に、抗腫瘍活性を有するDAP-置換核酸分子は、肺癌あるいはその他の癌の治療および予防のために使用されうる。DAP-置換DNAあるいは遺伝子はまた、呼吸気道の遺伝性疾患（例えば、嚢胞性線維症）の治療などの遺伝子に対する炎症反応が望まれないところでの治療的適応のために特に有用である。
【００３５】
所望する使用によって、DAP-核酸分子がプラスミドあるいはウイルスなどのベクターに組み込まれること、およびそれが治療的遺伝子産物をコードする配列を含むことが必要となりうる。
【００３６】
本発明の好ましい態様によると、核酸分子はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。以下の実施例に示すように、DAP-置換アンチセンスオリゴヌクレオチドは効率の改善および／または毒性の減少を有する。従って、これらのアンチセンスは、少なくとも1つの肺／気道／鼻のメディエーターあるいは受容体に対して示される治療薬あるいはワクチンとして、喘息あるいはアレルギー性鼻炎に存在する炎症反応を阻害するための治療薬として、およびアレルギーあるいは喘息の発症を予防するための、あるいはこれらの疾患を有する患者を脱感作するための治療薬として使用されうる。
【００３７】
例えば、DAP-置換アンチセンスオリゴヌクレオチドは、メディエーターおよび受容体をコードする核酸配列、あるいは炎症プロセスのその他の成分に対して示されうるものであり、そしてこれらのタンパク質の発現を阻害することにより、肺／気道（喘息、慢性閉塞性肺疾患の治療薬）あるいは鼻（アレルギー性鼻炎）、あるいは副鼻腔（慢性副鼻腔炎）において炎症プロセスを消しうるであろう。
【００３８】
従って、本発明のさらなる観点は、アンチセンス療法の方法、つまり先に定義したように治療的有効量あるいは予防的有効量の少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、それを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む方法に関する。この方法は、呼吸器系疾患、神経疾患、心血管疾患、リウマチ性疾患、消化器疾患、皮膚疾患、眼疾患、泌尿器系疾患、癌、病原体感染、遺伝性疾患、全身炎症および癌を予防および／または治療するために特に有用である。
【００３９】
好ましい態様によると、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、肺線維症、成人呼吸促進症候群、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、好酸球性気管支炎、喘息、アレルギー、アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎および好酸球増加症などの肺、気道および／または鼻の炎症に関係する呼吸器系疾患を予防および／または治療するために、呼吸器系に直接的に投与される。
【００４０】
好ましくは、本発明の核酸分子は、先に定義された少なくとも1つの核酸分子、および医薬的に許容可能なキャリアを含む医薬的組成物に組み込まれうる。
【００４１】
本発明の組成物中に存在する核酸分子の量は、治療的有効量である。核酸分子の治療的有効量は、組成物が投与される宿主の中で、過度に負の効果を起こさずにその生物学的機能を行うために必要な量である。使用される核酸分子および投与される組成物の正確な量は、オリゴ生物学的活性、治療される条件の型、投与の様式、ならびに組成物中のその他の有効成分などの因子によって変わりうる。典型的には、組成物は約1％から約90％の核酸分子から成り、および約20μgから約20 mgの核酸分子が投与されるであろう。
【００４２】
組成物の医薬的に許容可能なキャリアは、固体キャリア、液体キャリアおよび気相キャリアから成る群から選択されうる。有利なことに、キャリアは脂質粒子、脂質小胞、微結晶およびサーファクタントから成る群から選択される。
【００４３】
さらなる薬剤を本発明の組成物に加えることができる。例えば、本発明の組成物はまた、薬物、抗酸化剤、サーファクタント、香料添加剤、揮発性油分、緩衝化剤、分散剤、推進剤、および防腐剤などの薬剤を含みうる。医薬的組成物の調製のため、当該技術分野でよく知られた方法を使用しうる。
【００４４】
本発明の核酸分子および組成物は、様々な投与経路を通して与えられうる。例えば、組成物は、例えば、滅菌注射用水性あるいは油性懸濁液として、滅菌注射用調製物の形で投与されうる。これらの懸濁液は、適した分散剤あるいは湿潤剤および懸濁化剤を使用して、当該技術分野で知られた技術によって製剤化されうる。滅菌注射用調製物はまた、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤あるいは溶剤中の滅菌注射用液体あるいは懸濁液でありうる。それらは非経口的に、例えば、静脈内、筋肉内あるは皮下に注射あるいは輸液によって与えられうる。本発明の核酸分子および組成物はまた、局所投与のためにクリームあるいは軟膏として製剤化されうる。それらはまた、加圧型噴霧器、鼻腔用スプレー、ネブライザー、定量吸入器、ドライパウダー吸入器、あるいはカプセルにより被験体の気道に投与されうる。適した用量は、組成物中の各々の成分の量、所望する効果（即効あるいは長期）、治療される疾患あるいは障害、投与経路および治療される個人の年齢および体重などの因子により変わるであろう。いずれにしても、本発明の核酸分子および組成物を投与するために、当該技術分野でよく知られた方法が使用されうる。
【００４５】
前述のように、本発明は哺乳動物において炎症を阻害するための2'6'-ジアミノプリンおよびその類似体の使用に関する。従って、本発明はまた：2'6'-ジアミノプリンおよび／またはその類似体；および医薬的に許容可能なキャリア；を含む抗炎症組成物を提供する。本発明はまた、医薬的組成物における2'6'-ジアミノプリンおよびその類似体自体の使用および／またはこの（これらの）化合物の使用を含む、哺乳動物において炎症を阻害するための方法を提供する。2'6'-ジアミノプリンおよびその類似体は、それ自体投与されうるし、あるいはアミノ酸、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物、低分子化学物質、リガンド、脂質、核酸、あるいは炭水化物部分などの“キャリア”分子に連結して組み込まれうる。好ましい態様において、2'6'-ジアミノプリンおよび／またはその類似体は核酸分子中に組み込まれ、体による核酸分子の分解の結果、2'6'-ジアミノプリンおよび／またはその類似体は放出される。
【００４６】
関連する観点において、本発明は2'6'-ジアミノプリンおよびその類似体からなる群から選択されるアデノシンアンタゴニスト化合物；および医薬的に許容可能なキャリア；を含む抗炎症組成物に関係する。もう1つの関連する観点は、抗炎症組成物の調製のための2'6'-ジアミノプリンおよび／またはその類似体の使用に関係する。
【００４７】
本発明の抗炎症組成物は、アデノシン受容体の活性化が実質亭に毒性であり、さらにより具体的には、全身性、器官特異的あるいは組織特異的炎症であるいずれかの疾患（局所あるいは全身）の予防および／または治療のために特に有用でありうる。さらに具体的には、本発明の抗炎症組成物は、癌、呼吸器系疾患、神経疾患、心血管疾患、リウマチ性疾患、消化器疾患、皮膚疾患、眼疾患および泌尿器系疾患が関連するおよび／または原因となるいずれかの炎症の予防および／または治療のために特に有用でありうる。本発明の抗炎症組成物から恩恵を受けうる呼吸器系疾患のさらに具体的な例には、肺線維症、成人呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、好酸球性気管支炎、喘息、アレルギー、および好酸球増加症が含まれる。
【００４８】
上述したように、本発明の組成物中にて使用する2'6'-ジアミノプリンおよびその類似体の量、投与する組成物の量およびその投与の経路は、当該技術分野でよく知られる様々な因子により変わりうる。
【００４９】
後述の実施例によってすぐに説明するように：（1）本発明は2,6-ジアミノプリンの類似体に基づき、アデノシンを置換する、新規アンチセンス技術を提供する；（2）アデノシンの代替物は全てが同程度に効果的というわけではなく、DAPおよびその類似体は他のものより驚くほど効果的である；（3）本発明の核酸分子は、標準的なアンチセンスオリゴヌクレオチドと比べて、標的タンパク質の合成を阻害する点で、同等に驚くほど一層効果的である；（4）DAPをベースとするアンチセンスが従来のアンチセンスオリゴヌクレオチドより著しい抗炎症効果を有しているため、本発明によるDAPをベースとするアンチセンス技術は既存の技術より強力であり、および重大な進歩を構成する；（5）DAP-核酸分子は、アデノシン受容体の阻害に関係しないような機序によりそれらの抗炎症効果を発揮するようである；（6）本核酸分子はいずれかの炎症疾患および／または肺／気道にとって毒性を著しく減少した；（7）本発明のDAP-核酸分子、組成物および方法の使用は、（DAPを含まない）通常のアンチセンスを使用するよりも、より効果的でありうる；および（8）最後に、2'6'-ジアミノプリンそれ自体およびその類似体は抗炎症活性を有する。
【００５０】
実施例
以下の実施例は、本発明の広範囲の適用の実例であり、その範囲を限定する意図はない。修飾および変化は、その中で本発明の意図および範囲を逸脱せずに行われうる。本明細書中に記載されるものと同様あるいは同等ないずれかの方法および材料は、本発明のテストを実行する際に使用されうるが、好ましい方法および材料が記載される。
【００５１】
A）イントロダクション
アンチセンスオリゴヌクレオチド（AS）は、科学文献および特許文献にて広く記載された新規分野の薬剤である。この治療的ストラテジーは、1つあるいはいくつかの遺伝子の過剰発現が疾患の存在あるいは持続を引き起こすと信じられているいずれかの疾患に潜在的に適用されうる。効率の向上および抗炎症効率の向上によりASは、喘息、細気管支炎、ウイルスあるいはその他の形式の感染、鼻炎、嚢胞性線維症、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、好酸球性およびその他の形式の咳、肺線維症、成人呼吸窮迫症候群、結膜炎およびその他の形式の眼あるいは皮膚炎症疾患を含む全ての呼吸器疾患のための重要な治療的ストラテジーとなりうる。
【００５２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの全身性効果および毒性のレビューは、ST Crooke（Hematologic Pathology, 9: 5972; 1995）によりまとめられた。PSオリゴヌクレオチドの毒性を回避する1つの方法は、PSオリゴヌクレオチドを治療するために設定した疾患の部位に投与し、全身への分配およびその結果それに関連する毒性を最小限にすることである。PS ASオリゴヌクレオチドはマウスあるいはウサギの肺に噴霧された（Templin MV et al. Antisense and nucleic acid drug development, 10: 359-368; 2000; Ali S et al. Am J Respir Critic Care Med 163: 989-993; 2001）。治療的に効果がある考えられる用量では、全身への分配は非常に少ないという結果が示された。しかし、高用量では少しのマクロファージおよび単核球を伴って、主にリンパ球および好中球を含む多発性の細胞性浸潤がマウスの肺で起こる。オリゴヌクレオチドに含まれるアデノシン塩基は前炎症性効果あるいは抗炎症効果を有するであろうが、我々は先に特許WO 99/66037にて、CCR3受容体に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、18 merあたりに5アデノシンを含有するもの（27.7％アデノシン）が、ラットにてin vivoで喘息性反応を効果的に阻害したことを報告した。
【００５３】
類似体による塩基の置換がアンチセンスオリゴヌクレオチドの安定性、結合、分解効率および毒性に影響を与えうるかどうかのテストを系統的には誰も行っておらず、またそれらを培養中あるいは動物中の細胞における生物学的活性についてテストすることも行われていない。2,6-ジアミノプリン（DAP）は、シアノファージS-2Lによりアデノシンの代わりにDNA中に存在することが見出された（Cheng, X., Annu Rev Biophys Biomol Struct 24: 293-318,1995; Khudyakov, I. Y., et al., Virology 88: 8-18, 1978）。DAPは二本鎖DNAの構造を変化させ、A:T二本鎖と比較するとき、（シトシンおよびグアノシンにより形成される三重水素結合と同様に）D:T二本鎖にて三重水素結合を導入する（Chollett, A. and Kawashima, E. of Biogen SA (Geneva), Nucleic Acids Research 16: 305-17, 1988）。この余分な水素結合により、DNA-DNAハイブリダイゼーションの間における選択性およびハイブリダイゼーション強度が増加し、ならびにいくつかの制限酵素の開裂の阻害が引き起こされる（Bailly, C. and Waring, M.J., Nucleic Acids Research 23: 885-92,1995 ; Bailly, C. et al. PNAS 93: 13623-8, 1996）。
【００５４】
DAPにおけるC2炭素のさらなるN2アミノ基は塩基対合のために使用される。さらなる結合はDNA二本鎖の安定性を増加させ、B-およびZ-DNA両方の副溝をより親水性にする。アデノシンをDAPに置換することは、DNA含有DAPのTm、つまり2つの二本鎖相補DNA鎖が溶解する温度、をDAP残基毎に1.5℃上昇させる（Hoheisel, J.D., Lehrach, H., FEBS Letters 274: 103-6, 1990）。従って、DAPおよびその類似体は、複数の塩基の置換だけでなく、一つの塩基の置換としてオリゴヌクレオチド内に含まれるとき、遺伝子治療に組み込まれるとき、あるいは以下に見られるように、単独で投与されるとき、ASオリゴヌクレオチドの効率および抗炎症活性を増加する可能性を有する。
【００５５】
B）材料と方法
細胞株を用いた実験
実験は、（本明細書中に援用される）国際出願WO 99/66037に記載されるIL-3、IL-5およびGM-CSF受容体の共通ベータサブユニットに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、アデノシンを2-アミノ-2'-デオキシアデノシンあるいはイノシンのどちらかで置換することによって修飾したとき、この受容体の発現および機能を阻害しうるかどうかを評価するために行われた。TF-1およびU937細胞は、高レベルのGM-CSF受容体を発現する。加えて、TF-1細胞は生存に関して、GM-CSFに依存している。これらの細胞は、10％熱不活化ウシ胎仔血清、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびl-グルタミンを補充したRPMI 1640中で5％CO2中37℃にて培養した（TF-1細胞にはGM-CSFを補充した）。それらを12時間、培地のみ、あるいはIL-3、IL-5およびGM-CSF受容体の共通ベータサブユニットに対するセンス（107S: 5'-ACCATCCCGCTGCAGACCC-3'; SEQID番号:19）あるいはアンチセンス（107A:5'-GGGTCTGCAGCGGGATGGT-3'; SEQ ID NO: 20）オリゴヌクレオチドを用いた培地のどちらかで培養した。107A-DAPの配列は5'-GGGTCTGCDapGCGGGDapTGGT-3'（SEQ ID NO: 21）；107A-イノシン（107A-I）の配列は：5'-GGGTCTGCIGCGGGITGGT-3'（SEQ ID NO: 22）であった。細胞を回収して3回洗浄した。そして、RNAを回収し、受容体のベータ鎖の存在を半定量RT-PCRによって評価した。
【００５６】
動物
6-8週齢および220-275 gのブラウンノルウェーラットを、Harlan-Sprague-Dawley（Walkerville, MD）から得た。ラットは従来の動物施設で維持した。
【００５７】
オボアルブミンへの感作
ラットの能動感作は、1 mgの鶏卵オボアルブミン（OA）（Sigma, St.Louis, MO）および3.5 mgの水酸化アルミニウムゲル（BDH Chemicals, Poole, UK）を含有する1 mlの生理食塩水を皮下注射することにより行った。
【００５８】
オボアルブミンチャレンジ
オボアルブミンでの感作後14日目に、65 mg/kgでのペントタールを用いて全身麻酔しおよび気管内挿管した後、オボアルブミンチャレンジを60μl中200マイクログラムのオボアルブミンを気管内に注入することで行う。8時間あるいは15時間の後、ラットを全身麻酔後に再び挿管して、そして5回の0.9％生理食塩水5 mlの喉頭注入することからなる肺洗浄を行う。細胞を洗浄して、計数してそしてCytospin IIITMにてスライド上で遠心分離する。差異細胞計数を行う。
【００５９】
気道反応の測定
肺抵抗性を測定する道具および方法論は先に記載されているとおりである（Renzi, P. M., et al. Am. Rev. Respir. Dis 146:163-169, 1992）。全身麻酔は腹腔内へのペントタール（50 mg/kg）あるいはウレタン（1.1 g/kg）のどちらかを用いて導入した。そして、気管内挿管は6 cm長のPE-240TMポリエチレンカテーテルを使用して行った。熱パッドを使用して、一定体温を維持し、そして電子温度計を用いて継続的に直腸温をモニターした（TelethermometerTM, Yellow Springs Instrument Co., Yellowsprings, OH）。肺抵抗性（RL）は動物を側臥位にして自然換気呼吸の間測定した。流量は小さなPlexiglassTMボックス（容積265 ml）の内側に気管チューブの先端を置くことにより測定した。差圧トランスデューサー（MP-45+ 2 cm. H20; Validyne Corp, Northridge, CA）と連結したFleishTM No. 0呼吸気流計をボックスの他の端に取り付けて気流を測定し、そして量はフローシグナルの数値積分法により得た。食道圧の変化は、生理食塩水で満たしたカテーテルおよび差圧トランスデューサー（Sanborn 267 BCTM; Hewlett Packard, Waltham, MA）を使用することによって測定した。トランスデューサーのその他の端子はボックスに接続した。食道カテーテルは、より短い長さ（6 cm）のチュービング（PE-100TM）を取り付けた20 cm長のポリエチレンチュービング（PE-200TM）から構成された。肺圧差は食道およびボックス圧の間の差として算出した。気道反応は、市販ソフトウェア（RHT-Infodat Inc., Montreal, Quebec, Canada）を使用して多重線形回帰によって肺の運動方程式に適合させて決定させたRLから評価した。
【００６０】
通常あるいは修飾したPSアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与直後の、肺抵抗性の測定
オボアルブミンでの感作後14日目に、65 mg/kgのペントタールを用いて全身麻酔しおよび気管内挿管した後、GM-CSF、IL-3およびIL-5受容体のラット共通ベータ鎖に対するPS ASオリゴヌクレオチド（AS141A:5'-TGGCACTTTAGGTGGCTG-3'; SEQ ID NO: 23）の60μgを気管内に注入した。肺抵抗性は基準にて、30分間の間5分毎に、そして15分間隔で、測定した。アデノシンをDAPに置換した修飾AS141、つまりAS141-DAP（5'-TGGCDapCTTTDapGGTGGCTG-3'; SEQ ID NO: 24）、あるいはイノシンで置換したAS141-I（5'-TGGCICTTTIGGTGGCTG-3'; SEQ ID NO: 25）を用いて同様な実験を繰り返した。
【００６１】
アデノシンおよびDAPヌクレオシドおよびその他の特異的なDAP類似体に対する気道反応を評価する実験
感作後14日に、ラットはペントタール（65 mg/kg）を用いて全身麻酔して、挿管して、そして基準RLを測定した。ラットには、50μlの生理食塩水あるいは酢酸を加えた生理食塩水中で0.125μgから100μgの用量幅にわって、アデノシン（CAS 58-61-7）、2,6ジアミノプリンヘミスルフェート塩（CAS 69369−16−0）、DAP（2-アミノ-2'-デオキシアデノシン; CAS 4546-70-7）、2-アミノ-9-（B-D-2'-デオキシリボフラノシル）プリン（CAS 3616-24-8）、7-デアザ-2'デオキシアデノシン（CAS 60129-59-1）、N6-メチル-2'-デオキシアデノシン（CAS 2002-35-9）、2-アミノアデノシン／2,6ジアミノプリンリボシド（CAS 2096-10-08）の増分用量を気管内に投与した。各々の投与の直後に、RLを測定した。DAPは次のように溶解した：3 mgのDAPを100μlの酢酸と組み合わせて、追加の生理食塩水によって1.5から3 mlに調節して、そして70℃に加熱した。これにより最終濃度は1から2μg/μlとなった。希釈は同じ緩衝液によって行った。対照動物は示したように同じ最終濃度で酢酸を用いた生理食塩水を投与した。
【００６２】
抗原チャレンジ後のロイコトリエンD4反応を評価する実験
我々は、ラットCCR3受容体に対するアンチセンスASA4（5'-ACTCATATTCATAGGGTG-3'; SEQ ID NO: 26）が抗原チャレンジ後に肺内への好酸球の流入を効果的に阻害することを先に示した（WO 99/66037参照）。我々は、これらの実験のために同じオリゴヌクレオチド配列を使用した。14日目に、ラットをペントタール（65 mg/kg）を用いて全身麻酔した後に挿管して、50μlの0.9％NaCl中200μgのASA4、ASA4-DAP（5'-DapCTCDapTDapTTCDapTDapGGGTG-3'; SEQ ID NO: 27）、ミスマッチASA4-DAP（5'-CDapTCDapT TDapTCATGDapGGTG-3'; SEQ ID NO: 28）、AS141-DAP（5'-TGGCDapCTTTDapGGTGGCTG-3'; SEQ ID NO: 29）、ミスマッチAS141-DAP（5'-GTGCCDapTTTGDapGTGGCTG-3'; SEQ ID NO: 30）、ASA4-DAPおよびASA141-DAPの組み合わせ（全100μg）あるいは生理食塩水を気管内に投与した。10分後、オボアルブミンチャレンジを50μlの0.9％生理食塩水中200マイクログラムのオボアルブミンを気管内に注射することにより行った。15時間後、ラットを全身麻酔した後に再び挿管して、基準肺抵抗性を測定して、基準肺抵抗性が2倍になるまで（EC200）2倍濃度のロイコトリエンD4（50 ngから1600 ng）を気管内に接種した。
【００６３】
抗原チャレンジ後の肺内への細胞流入を評価する実験
14日目に、ラットをペントタール（65 mg/kg）を用いて全身麻酔した後に挿管して、50μlの0.9％NaCl中200μgのASA4、ASA4-DAP（5'-DapCTCDapTDapTTCDapTDapGGGTG-3'; SEQ ID NO: 27）、AS141-DAP（5'-TGGCDapCTTTDapGGTGGCTG-3'; SEQ ID NO: 29）、ミスマッチAS141-DAP（5'-GTGCCDapTTTGDapGTGGCTG-3'; SEQ ID NO: 30）、ASA4-DAPおよびASA141-DAPの組み合わせ（全100μg）あるいは生理食塩水を気管内に投与した。20分後、オボアルブミンチャレンジを50μlの0.9％生理食塩水中200μgのオボアルブミンを気管内に注射することにより行った。15時間後、ラットを全身麻酔した後に再び挿管して、そして5回の5 mlの喉頭注入を含有する肺洗浄を行った。細胞を洗浄して、計数してそしてCytospin IIITMにてスライド上で遠心分離した。最後に差異細胞計数を行った。
【００６４】
アデノシンあるいはDAP投与後の肺内への細胞流入を評価する実験
感作の14日後に、ラットをペントタール65 mg/kgを用いて麻酔した後に挿管して、そして50μl中100μgのアデノシンあるいは2-アミノ-2'-デオキシアデノシン、あるいは2-アミノ-2'-デオキシアデノシンに続いて10分後にアデノシン、あるいは生理食塩水にて気管内に注入した。15時間後、ラットをペントタールを用いて全身麻酔した後に挿管して、そして肺洗浄を行い、そして上記のように細胞を計数した。
【００６５】
C）結果
実施例 1：DAPによるアデノシンの置換は、in vitroにて通常のホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドと少なくとも同等の効果がある
実験の最初のセットは、DAPによるアデノシンの置換がASオリゴヌクレオチドのin vitroでの効率に影響するかどうかを決定するために設計された。図2Aにて注目すべきは、ヒトGM-CSF、IL-3およびIL-5受容体の共通ベータ鎖に対するアンチセンスの生物学的効果は、この受容体を発現するU937細胞において、アデノシンを2-アミノ-2'デオキシアデノシンにより置換することによっては影響されないということである。AS107は2アデノシン塩基を含有する19 merのオリゴヌクレオチドである。アデノシン塩基はDAPにより置換された（AS107-DAP）。この修飾オリゴヌクレオチドは、半定量PCR（ハウスキーピング遺伝子としてG3PDHを有する）によって評価するとき、共通ベータ鎖のmRNAの阻害においてはアデノシン含有AS107（AS107）と少なくとも同等の効果がある。
その他の細胞株での効率を確認するため、生存についてGM-CSFに依存するTF1細胞にて繰り返し実験を行った。図2Bにて注目すべきは、ヒトGM-CSF、IL-3およびIL-5受容体の共通ベータ鎖に対するAS107-DAPは、mRNA発現の阻害においてはアデノシン含有AS107（AS107）と少なくとも同等の効果があったということである。アンチセンスオリゴヌクレオチドにおけるDAPによるアデノシンの置換はin vitroでは効果的である。
【００６６】
実施例 2：ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれるとき全てのアデノシンの代替物が遺伝子の阻害に効果的というわけではない
アデノシンの置換がアンチセンスオリゴヌクレオチドの効率に影響を与えうるかどうかを決定するために実験を行った。図3にて注目すべきは、上述したように同じアンチセンスオリゴヌクレオチド（AS107）の効果は両方のアデノシンをイノシンに置換するときには消失するということである。イノシン含有アンチセンス（AS107-I）は、半定量PCRによって評価して、そしてアデノシン含有AS107と比較するとき、mRNA発現の阻害に関して効果はなかった。培地のみ、10μmol濃度のAS107あるいはAS107-Iと共にU937細胞をRNA単離前の6時間インキュベーションすること、および半定量PCRを行うことにより実験を行った。
【００６７】
実施例 3：アデノシンと関連しないホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドの気管内注入後に肺抵抗性の増加が起こる
50μlの生理食塩水に含有されるホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドの急速気管内注入後の肺抵抗性の効果を評価するために実験を行った。
図4Aは、感作したブラウンノルウェー（BN）ラットの肺抵抗性に対する、各々60μg用量での、ラットGM-CSF、IL-3およびIL-5受容体の共通ベータ鎖に対するアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（AS141、2アデノシンを含有する19 merオリゴヌクレオチド）の気管内投与の効果、および同じ配列のDAP-置換ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を説明する。これらの実験および続くものに関して、感作したブラウンノルウェーラットは先に記載したように利用した（Renzi PM, Am Rev Respir Dis 146:163-9; 1992）。リン酸緩衝生理食塩水の注射は、最大25％増の肺抵抗性の穏やかな増加を引き起こした。通常のアンチセンスは、15％以下のアデノシンを含み、中等度の肺抵抗性の増加（87％）を引き起こした。DAP修飾オリゴヌクレオチドは肺抵抗性の穏やかから中等度の増加（33％）を引き起こした。NyceはWO 00/62736およびWO 00/09525において、肺抵抗性の増加はオリゴヌクレオチドに含まれるアデノシンにより引き起こされることを示唆した。しかし、オリゴヌクレオチドにはアデノシンを分解および放出する時間（2-3分間）を見出せないであろうし、そして利用したアンチセンスオリゴヌクレオチドは10％しかアデノシンを含有していなかった（それは、WO 00/62736およびWO 00/09525によると、肺抵抗性に対する効果を有さない）。
イノシンはアデノシンに比べて肺／気道の気管支収縮は引き起こさないことが知られているので、AS141において2イノシンで置換した2アデノシンにより気管支攣縮が起きたのかどうかを評価するためにアッセイを行った（Mann, J.C. et al., J Appl Physiol 61: 1667-76, 1986）。図4Bに示すように、ラットGM-CSF、IL-3およびIL-5受容体の共通ベータ鎖に対する同じアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（AS141）においてイノシンでアデノシンを置換したもの（AS141-イノシン）の気管内投与もまた、肺抵抗性の一時的な増加（108％まで）を引き起こした。これらの結果は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの気管内注入はアデノシンとは関連しないように思われている機序により、一時的に肺抵抗性を増加させることを示す。
【００６８】
実施例 4：肺抵抗性に対する様々なDAP類似体の効果
我々はブラウンノルウェーラットにおいて肺抵抗性に対するDAP類似体の気管内投与およびアデノシンの気管内投与の効果を評価した。図5に示すように、アデノシン、DAP、および5つの異なるDAPの類似体を研究した。各々の化合物に関して、最少6尾のラットを研究し、そして平均％基準肺抵抗性を、DAPあるいはその類似体の気管内用量の関数として示す。この図で示されるように、肺抵抗性は5μgのアデノシンの濃度では次第にピークまで増加するのに対し、これは研究中には2-アミノ-2'デオキシアデノシン（DAP）あるいはその類似体では起こらない。これらの結果は、アデノシンとは対照的に、DAPおよびその類似体は肺抵抗性を著しくは増加させないことを示す。オリゴヌクレオチドは肺内では徐々に分解されるため、アデノシンの代わりにこれらの化合物を使用することは予期せず好都合になりうる。
【００６９】
実施例 5：DAP修飾ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、in vivoでの抗原チャレンジ後に起こる気道過敏性を阻害するのに効果的である。
ラットCCR3および喘息のラットモデルにおけるIL-3／IL-5／GM-CSF受容体の共通β鎖に対するDAP修飾アンチセンスのin vivoでの生物学的活性を図6Aに示す。ASA4は、CCR3受容体の阻害および抗原チャレンジ後に起こる好酸球流入の阻害を示した18 merのホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドである（WO 99/66037参照）。ASA141もまた、IL-3／IL-5／GM-CSF受容体の共通β鎖の阻害および抗原チャレンジ後に起こる好酸球流入の阻害を示した18 merのホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドである（WO 99/66037参照）。ASA4は5アデノシン塩基を含有する（28％アデノシン）。AS143は2アデノシン塩基を含有する。ASA4-DAPは、ASを与えていないラット（チャレンジした対象; p＜0.01）あるいはDAPミスマッチ処理ラットと比較するとき、オボアルブミンチャレンジ後15時間でロイコトリエンD4に対する気道過敏性を著しく減少させたということに注目すべきである。また、ASA4-DAPは非修飾ASA4よりも効果的な傾向があり、そして非チャレンジラットから得た結果と違いがなかったことにも注目すべきである。AS141もまた、対照チャレンジおよび141-DAPミスマッチ処理ラットと比較するとき、LTD4に対する過敏性を著しき減少させた（P＜0.05）。さらに、CCR3および共通β鎖オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて処理したラットにおいて、各々のアンチセンスオリゴヌクレオチドのものと比較すると、LTD4に対する気道過敏性が著しく減少し、そしてこの組み合わせはDAPオリゴヌクレオチドの組み合わせ（全50μg；図6B）と同等の効果であった。
【００７０】
実施例 6：DAP修飾ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、従来のアンチセンスオリゴヌクレオチドより、in vivoでの抗原チャレンジ後に起こる気道炎症を阻害するのに効果的である
これらの実験は、ラットCCR3受容体あるいはIL-3、5およびGM-CSFの共通ベータ鎖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて行った。オボアルブミン感作およびチャレンジされたラットは、オボアルブミンチャレンジの10分前に、生理食塩水、200μgの通常ASA4あるいは200μgのASA4-DAPの気管内注入により処理した。15時間後、ラットを麻酔して挿管して、そして気管支肺胞洗浄を総細胞計測および差異のために行った。結果は、両方の通常ASA4（図7A）およびAS141（図7B）および両方のASA4-DAPおよびAS141-DAPが好酸球の補充を効果的に阻害したことを示す（各々84％および83％まで；図7A）。しかし、AS4DAPは好中球およびマクロファージを減少させる傾向があり、そしてリンパ球の補充を著しく減少させた（74％まで）。141-DAPは同じくマクロファージの補充を著しく減少させた（p＜0.05）。2つのA4-DAPおよび141-DAPオリゴヌクレオチドの組み合わせ（全200μg）もまた、リンパ球およびマクロファージの補充を著しく減少させた（図7C）。これらの結果は、DAP修飾オリゴヌクレオチドが通常のオリゴヌクレオチドより効果的であるだけでなく、より広範な抗炎症効果を有していることを示す。
【００７１】
実施例 7：アデノシンは好酸球の補充に特異的である肺における前炎症性（pro-inflammatory）効果を有しており、DAPはアデノシンの前炎症性効果のアンタゴニストである
他の実験において、6尾の感作はしたがチャレンジしていないブラウンノルウェーラットの群をペントタールで麻酔し、そして気管内に挿管した。そして、ラットに（1）生理食塩水（対照）、（2）100μgのアデノシン、（3）100μgの2-アミノ-2'-デオキシアデノシン（DAP）あるいは（4）100μgのDAPのいずれかを、続いて10分後に100μgのアデノシンを気管内注入した。肺洗浄のために15時間後にラットを覚醒させ、再び麻酔および挿管をした。洗浄液から回収した媒質に存在した細胞を計数して、そして差異をCytospinTMスライド上で得た。
図8に示すように、アデノシンは肺において前炎症性であり、他の細胞型に著しい影響は及ぼさずに好酸球の選択的補充（10倍以上の増加）をもたらした。対して、DAPは肺洗浄の細胞性を増加させず、そしてアデノシンにより誘導される好酸球の補充を完全に阻害した。
【００７２】
D) 結論
上記のことを考慮すると、DAP置換アンチセンスオリゴヌクレオチドは、非修飾アンチセンスあるいはイノシン修飾アンチセンスと比較するとき次の利点を有する：
a）図1から8に示されるようにそして本特許出願に記載されるように、DAPおよびDAP類似体の化学的構造および特性はアデノシンとは異なる。これらの異なる化学的性質は、DAPおよび／またはDAP類似体を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、非修飾アンチセンスと比べて異なる化学的性質、ハイブリダイゼーション特性および安定性を有するようにする。
b）実施例1は、DAPホスホロチオエートアンチセンスがin vitroにて異なる細胞株でどのくらい効果的なのかを示す。
c）実施例2は、（イノシンで示されるように）ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれるとき、アデノシンの代替物のすべてが遺伝子を阻害することに効果的であるわけではないことを示す。
d）実施例3は、肺抵抗性の増加はホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドの気管内注入後に起こること、およびこの増加はアデノシンとは関連しないことを示す。実際、イノシンはアデノシン受容体を刺激しないのにもかかわらず、イノシンオリゴで肺抵抗性の増加が認められた。しかし、この増加はDAP修飾オリゴのものよりも重要度は低かった。
e）実施例4は、アデノシン、DAPおよびDAPの類似体の様々な代替物はin vivoにて気管内注入をするとき肺抵抗性に対して異なる効果を有するが、これらの化合物は全てアデノシンよりも毒性が低かった。例えば、図5で示すように、ピークアデノシン毒性（5μg）では、テストした化合物の相対的順位は、アデノシン＞N6-メチル-2'デオキシアデノシン＞DAPを含む残りであった。しかし、5倍低い濃度（1μg）では、毒性順位は異なり、アデノシン＞2-アミノ-2デオキシアデノシン／DAP＞残りであった。遊離DAP塩基は構造対照として、毒性に糖が要求されるかどうかを決定するために使用した。
f）実施例5は、DAP修飾ホスホロチオエートアンチセンスヌクレオチドがin vivoでの抗原チャレンジ後に起こるロイコトリエンD4に対する気道過敏性を阻害することに効果があり、そして従来のPSオリゴヌクレオチドよりも効果的な傾向であることを示す。2つのDAP修飾オリゴヌクレオチドの組み合わせは、それぞれのオリゴヌクレオチド単独よりも効果的であり、相乗作用が確認されている。
g）実施例6は、DAP修飾ホスホロチオエートアンチセンスヌクレオチドが従来のオリゴヌクレオチドよりも、in vivoでの抗原チャレンジ後に起こるロイコトリエンD4に対する気道過敏性を阻害することにより、効果的であることを示す。ASA4に関しては好中球およびマクロファージを減少させ、そしてまたリンパ球を著しく減少させる強い傾向があったのに対し、これらの効果は従来のPSアンチセンスオリゴヌクレオチドでは直面することがなかった。AS141に関しては、好中球を減少させそしてまたリンパ球およびマクロファージを著しく減少させる強い傾向があったのに対し、これらの効果は従来のPSアンチセンスオリゴヌクレオチドでは直面することがなかった。ASA4およびAS141の組み合わせに関しては、好中球を減少させそしてまたリンパ球およびマクロファージを著しく減少させる強い傾向があったのに対し、これらの効果は従来のPSアンチセンスオリゴヌクレオチドでは直面することがなかった。
h）実施例7は、アデノシンがラットの肺において前炎症性効果を有し、好酸球を選択的に補充すること、およびそれはリンパ球に対しては著しい効果は有していないことを示す。同時に、実施例7はDAPが好酸球流入を阻害すること、つまりDAP自身がアデノシンのアンタゴニストであることの説明を示す。
【００７３】
上記の7つの実施例は、DAP置換アンチセンスおよびDAPの類似体を有するアンチセンスが、遊離アデノシンヌクレオシドあるいはアデノシンを含有する非修飾アンチセンス化合物より肺／気道に関して本質的により効果的であり、そしてかなり毒性が低いことを示す。
【００７４】
また、WO 00/09525およびWO 00/62736にて示唆されたこととは対照的に、28％までのアデノシン塩基を有するアンチセンスがアデノシンではなくDAPを含有するアンチセンスと同じくらい大きく好酸球流入を阻害する能力があったため（図7参照）、アンチセンスに含有されるアデノシンは前炎症性ではない。しかし、DAP含有オリゴヌクレオチドもまたリンパ球およびマクロファージ流入を阻害したため（図7）、およびアデノシンがリンパ球流入に影響を与えないため（図8）、アンチセンスに含有されるDAPはアデノシン受容体とは関連しない機序を通してその効果を発揮する。
【００７５】
要約すると、従って、DAPアンチセンスは喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性疾患、好酸球性咳嗽、肺線維症、嚢胞性線維症、病原体感染、遺伝性疾患および肺癌、および炎症が関係するその他の疾患などの呼吸器疾患の治療および予防のためのアンチセンス療法およびワクチンの開発の改善された技術プラットホームを提供する。また、DAP自体およびその類似体は、哺乳動物における炎症を阻害するための抗炎症薬の強い可能性を有する。
【００７６】
本発明のいくつかの態様が記載された一方で、本発明がさらなる修飾の可能性を有し、そして本特許出願がいかなる変更、使用、あるいは適用を網羅し、一般的に本発明の原則に従い、そして発明に関係する当該技術分野での知識あるいは慣行の範囲にあるような本開示からの逸脱を含む意図があることが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１Ａ】図1A、1B、1C、および1Dは、アデニン、アデノシン、イノシン、2'6'-ジアミノプリン（2-アミノ-2'-デオキシアデノシン；DAP）およびDAPの様々な類似体を示す。
【図１Ｂ】図1A、1B、1C、および1Dは、アデニン、アデノシン、イノシン、2'6'-ジアミノプリン（2-アミノ-2'-デオキシアデノシン；DAP）およびDAPの様々な類似体を示す。
【図１Ｃ】図1A、1B、1C、および1Dは、アデニン、アデノシン、イノシン、2'6'-ジアミノプリン（2-アミノ-2'-デオキシアデノシン；DAP）およびDAPの様々な類似体を示す。
【図１Ｄ】図1A、1B、1C、および1Dは、アデニン、アデノシン、イノシン、2'6'-ジアミノプリン（2-アミノ-2'-デオキシアデノシン；DAP）およびDAPの様々な類似体を示す。
【図２Ａ】図2Aは、U937細胞におけるヒトGM-CSF、IL-3およびIL-5受容体の共通のベータ鎖に対する様々なアンチセンスの生物学的効果を示す半定量PCRの像である。1 = 非処理細胞; 2 = アンチセンスAS107で処理した細胞; 3 = 2アデノシン塩基の代わりにDAPを含有するアンチセンスAS107（AS107-DAP）で処理した細胞;およびM = 分子量マーカー。G3PDH 450 bp = G3PDHハウスキーピング遺伝子が見出される塩基の番号; GM-CSFRβ340 bp: 共通のベータ鎖バンドが見出される塩基の番号。
【図２Ｂ】図2Bは、TF-1細胞におけるヒトGM-CSF、IL-3およびIL-5受容体の共通のベータ鎖に対するアンチセンスの生物学的効果を示す半定量PCRの像である。1 = 非処理細胞; 2 = アンチセンスAS107で処理した細胞; 3 = 2アデノシン塩基の代わりにDAPを含有するアンチセンスAS107（AS107-DAP）で処理した細胞;およびM = 分子量マーカー。G3PDH 450 bpはG3PDHハウスキーピング遺伝子が見出される塩基の番号; β鎖340 bpは共通のベータ鎖バンドが見出される塩基の番号。
【図３】図3は、アンチセンスにおいてアデノシンをその類似体であるイノシンで置換したTF-1細胞における、ヒトGM-CSF、IL-3およびIL-5受容体の共通のベータ鎖に対する生物学的効果を示す半定量PCRの像である。1 = 非処理細胞; 2 = センスAS107で処理した細胞; 3 = アンチセンスAS107で処理した細胞; 4 = 2アデノシン塩基の代わりにイノシンを含有するアンチセンスAS107（AS107-I）で処理した細胞; 5 = 1塩基ミスマッチを有するアンチセンスAS107で処理した細胞;およびM = 分子量マーカー。G3PDH 450 bpはG3PDHハウスキーピング遺伝子が見出される塩基の番号; β鎖340 bpは共通のベータ鎖バンドが見出される塩基の番号。
【図４Ａ】図4Aは、感作したブラウンノルウェーラットの肺抵抗性に対する、ラットGM-CSF、IL-3およびIL-5受容体の共通のベータ鎖に対して示されるアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（AS141）の気管内投与の効果を、2アデノシン塩基の代わりにDAPを含有する同じアンチセンス（AS141-DAP）の効果と比較して示すグラフである。肺抵抗性は、各々のオリゴヌクレオチドの60μgの用量を投与した後0-2時間測定した。
【図４Ｂ】図4Bは、感作したブラウンノルウェーラットの肺抵抗性に対する、ラットGM-CSF、IL-3およびIL-5受容体の共通のベータ鎖に対して示されるアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（AS141）の気管内投与の効果を、2アデノシン塩基の代わりにイノシンを含有する同じアンチセンス（AS141-イノシン）の効果と比較して示すグラフである。肺抵抗性は、各々のオリゴヌクレオチドの60μgの用量を投与した後0-2時間測定した。
【図５】図5は、感作したラットの肺抵抗性に対する、アデノシン、DAP（2-アミノ-2'デオキシアデノシン）およびその類似体の気管内点滴注入の効果を示すグラフである。
【図６Ａ】図6Aは、ラットCCR3およびIL-3／IL-5／GM-CSF受容体の共通β鎖に対するオリゴヌクレオチドアンチセンスにおけるDAPの組み込みは、これらのアンチセンスのin vivoでの生理学的効果を増加することを示す棒グラフである。アンチセンスの生物学的活性は喘息のラットモデルで測定した：非チャレンジ対照；チャレンジ対照；200μgのアンチセンスASA4およびAS141（18ヌクレオチド）で処理したラット；アデノシン塩基の代わりにDAPを含有する200μgのアンチセンスASA4およびAS141（ASA4-DAP; 141-DAP）で処理したラット；200μgのミスマッチアンチセンスASA4およびAS141で処理したラット；および200μgのASA4-DAPおよびAS141-DAPミスマッチアンチセンスで処理したラット。ロイコトリエンD4に対する感応性はオボアルブミンチャレンジ後15時間測定した。
【図６Ｂ】図6Bは、2つの通常および2つのDAP含有オリゴヌクレオチドの組み合わせ（全50μg）は、50μgの各々のオリゴヌクレオチド単体よりも効果的であることを示す棒グラフである。
【図７Ａ】図7Aは、DAPを含有するCCR3に対するオリゴヌクレオチドは、DAPなしのオリゴヌクレオチドよりも、抗原チャレンジ後のin vivoでの肺炎症の阻害がより効果的であることを示す棒グラフである。
【図７Ｂ】図7Bは、DAPを含有するIL-3／IL-5／GM-CSF受容体の共通β鎖に対するオリゴヌクレオチドは、DAPなしのオリゴヌクレオチドよりも、抗原チャレンジ後のin vivoでの肺炎症の阻害がより効果的であることを示す棒グラフである。
【図７Ｃ】図7Cは、2つのDAP含有オリゴヌクレオチドの組み合わせ（全50μg）は、2つのDAPなしの通常オリゴヌクレオチドの組み合わせよりも、抗原チャレンジ後のin vivoでの肺炎症の阻害がより効果的であることを示す棒グラフである。
【図８】図8は、アデノシンはラットの肺内での好酸球の補充を選択的に増加させるが、DAPは増加させないこと、およびDAPはアデノシンの前-炎症性効果（pro-inflammatory effects）のアンタゴニストであることを示す棒グラフである。
関連する出願
本出願は、2001年7月6日に出願された合衆国仮出願60/303,071の優先権を主張し、これによりその開示は完全にここで参考文献により受け入れられる。
【０００２】
発明の背景
（ a ） 発明の分野
本発明は核酸分子のin vivo効率を増加するための、およびまた哺乳動物において炎症を阻害するためのヌクレオチド代替物の使用に関する。
【０００３】
さらに具体的には、本発明は抗炎症組成物における、およびまたin vivoでの生理学的効率の増加および毒性の減少を有する核酸分子の調製のための、2'6'ジアミノプリン（DAP）およびその類似体のそれ自体の使用に関する。
【０００４】
（ a ） 先行する技術の簡単な説明
核酸分子の使用に基づく治療的アプローチは、ますます一般的になってきている。遺伝子をベースとする治療およびアンチセンスをベースとする治療は、おそらく近い将来に医学を根本的に変化させるであろう。
【０００５】
現在までの治療としての核酸分子、さらに具体的にはアンチセンスオリゴヌクレオチドの問題は、毒性（全身性および局所性の両方）、安定性、および細胞表面タンパク質への非特異的結合である。アンチセンスオリゴヌクレオチドの毒性は種間で様々であるようであり、ラットは最も感受性が高いが、毒性は治療的に効果のある用量以上の用量で現れる（総説として、ST Crooke, Hematologic Pathology, 1995,9:5972参照）。肺／呼吸器疾患では、治療的なアンチセンス／遺伝子の投与に関連する核酸分子毒性は次のものを含む：免疫刺激の増加、肺への単核球性-炎症性浸潤、およびおそらく気道の過敏性および気管支収縮。
【０００６】
毒性の問題を回避するための最適とまではいかない解決法が、今日までにいくつか提案された。最も一般的なものの中には、様々な修飾DNA塩基、RNA塩基、および／または修飾バックボーン構造を含有する核酸分子の調製がある。例えば、WO 99/67378は修飾糖に基づくアンチセンスオリゴヌクレオチド構築物を記載する。また、NyceはWO 00/09525およびWO 00/62736にて、明らかにはされていないが、呼吸器疾患を治療するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドに含まれるアデノシン塩基が肺での毒性の主要な原因であることを主張した。その結果、Nyceは低アデノシンオリゴヌクレオチド、およびアデノシン塩基をアデノシンの類似体で置換したオリゴヌクレオチドを提案する。しかし、Nyceが提案した低アデノシンオリゴヌクレオチドおよびアデノシン類似体は、それらの生物学的活性についてあるいは毒性を減少するとされることについて、これまで何ら試験されていない。
【０００７】
2',6'-ジアミノプリンヌクレオシド（2-アミノ-2'-デオキシアデノシン；DAP）は、シアノファージS-2Lによりアデノシンの代わりにDNAに存在することが見出された（Cheng, X., Annu Rev Biophys Biomol Struct 24: 293-318, 1995; Khudyakov, I. Y., et al., Virology 88 : 8-18,1978）。それ以来、2',6'-ジアミノプリンヌクレオチド（DAP）は、とりわけヒト免疫不全ウイルス（HIV）複製をin vitroで選択的に阻害する能力のある2-アミノ-2',3'-ジデオキシアデノシン（DAPではない）などの抗ウイルス化合物の合成のための化学的な開始点として、広く使用および研究された（Balzarini, J. et al., Biochem. & Biophys. Res. Communications 145: 269-76,1987）。しかし、アンチセンスオリゴヌクレオチドあるいは遺伝子治療法におけるDAPの使用は、今まで示唆されたことはない。
【０００８】
また、US特許番号 5,925,624および番号 5,889,178は、2,6-ジアミノプリン-ベータ-D-リボフラヌロンアミドの誘導体を記載する。これらの誘導体は抗炎症効果（大半は好中球のスーパーオキシド放出に対する）を有し、呼吸器疾患の治療に使用されうるが、それらはDAPおよびその類似体の化学式とは異なる化学式を有している。
【０００９】
要約すれば、今日までDAP自体を抗炎症組成物にて使用しうるという示唆あるいは証拠はなく、またDAPおよびその類似体を、核酸分子（遺伝子構築物およびアンチセンス）中に、これらのオリゴのin vivo効率を増加させるために組み込みうるという示唆あるいは例示はなかった。
【００１０】
従って、2'6-ジアミノプリンおよび／またはその類似体を含むより効果的な抗炎症組成物が必要とされる。
また、高い効果および低い毒性を示す一方で、体内で安定を維持する核酸分子が長い間必要と思われている。
【００１１】
さらに具体的に、2'6'-ジアミノプリン（DAP）およびその類似体などのヌクレオチド代替物を組み込む核酸分子の必要性、同じものを含む組成物の必要性、および特に遺伝子およびアンチセンス治療法においてこれらの核酸分子を使用する方法の必要性が存在する。ヌクレオチド代替物による塩基の置換がアンチセンスオリゴヌクレオチドの安定性、結合性、分解効率および毒性に影響を与えうるかどうかのテスト、および細胞、培養あるいは動物における生物学的活性に関するそのような修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのテストは、今まで誰も行っていない。
【００１２】
本発明はこれらの必要性、および以下の明細書を読むことで当業者に明らかとなるであろうその他の必要性を満たす。
【００１３】
発明の概要
本発明の目的は、高い効果および低い毒性を示す一方で、体内で安定を維持する遺伝子構築物およびアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸分子を提供することである。
【００１４】
本発明の観点によれば、少なくとも1つのヌクレオチド代替物を核酸分子に組み込むことを含む、哺乳動物に投与する核酸分子のin vivoでの効率を増加させるための方法が提供される。そのような組み込みは、哺乳動物に投与するとき、ヌクレオチド代替物を組み込まない核酸分子と比較して、核酸分子のin vivoでの生理学的効率を増加させ、またその毒性を減少させる。好ましい態様によると、ヌクレオチド代替物は核酸分子にその中でアデノシン塩基を置換するために組み込まれる。さらに好ましくは、ヌクレオチド代替物は2'6'-ジアミノプリンおよびその類似体から成る群から選択される。好ましい2'6'-ジアミノプリン類似体には、2,6-ジアミノプリンへミスルフェート（2,6-diaminopurine hemisulfate）、2-アミノ-9-(B-D-2'-デオキシリボフラノシル)プリン、7-デアザ-2'-デオキシアデノシン、N6-メチル-2'-デオキシアデノシン、2-アミノアデノシン／2,6-ジアミノプリンリボシド、それらの塩およびそれらの機能的誘導体を含む。
【００１５】
本発明はまた、哺乳動物被検体に少なくとも1つの核酸分子をin vivoで投与するための改善された方法に関する。改善は、核酸分子の中に少なくとも1つの2'6'-ジアミノプリンおよび／またはその類似体を組み込むことから成る。好ましくは、2'6'-ジアミノプリンあるいはその類似体を、核酸分子内にその中でアデノシン塩基を置換するために組み込む。
【００１６】
本発明のもう1つの観点によると、アンチセンスオリゴヌクレオチドから選択された単離あるいは精製された核酸分子、および治療的遺伝子産物をコードする配列を含む核酸分子、本発明に従って2'6'-ジアミノプリンおよびその類似体から成る群から選択されるヌクレオチド代替物を含む核酸分子が提供される。
【００１７】
本発明のもう1つの観点によると、先に定義された少なくとも1つの核酸分子と、医薬的に許容可能なキャリアとを含む医薬的な組成物が提供される。本発明の組成物は、呼吸器系疾患、神経疾患、心血管疾患、リウマチ性疾患、消化器疾患、皮膚疾患、眼疾患、泌尿器系疾患、癌、病原体感染、および遺伝性疾患、好酸球増加症、全身炎症、および癌から選択される疾患を治療および／または予防するために有用でありうる。
【００１８】
本発明のさらなる観点によると、先に定義されたように治療的有効量あるいは予防的有効量の少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、それを必要とする哺乳動物の呼吸器系に直接投与するステップを含む、アンチセンス治療の方法が提供される。この方法は、呼吸器系疾患、癌、病原体感染、および遺伝性疾患、およびさらに具体的には、肺線維症、成人呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、好酸球性気管支炎、喘息、アレルギー、副鼻腔炎、呼吸器合胞体ウイルスあるいはその他の気道感染ウイルスおよび好酸球増加症などの肺、気道および／または鼻の炎症に関係する呼吸器系疾患を予防および／または治療するのに有用である。
【００１９】
本発明のもう1つの観点によると、2'6'-ジアミノプリンおよびその類似体から成る群から選択されるヌクレオチド代替物の使用を含む、哺乳動物における炎症を阻害するための方法が提供される。典型的に、2'6'-ジアミノプリンあるいはその類似体を哺乳動物に投与する。好ましくは、2'6'-ジアミノプリンおよびその類似体それ自体を抗炎症組成物において使用するが、しかしそれらはまた核酸分子中に組み込まれうる。関連する観点では、本発明は：2'6'-ジアミノプリンおよびその類似体から成る群から選択されるアデノシンアンタゴニスト化合物；および医薬的に許容可能なキャリア；を含む抗炎症組成物に関係する。もう1つの関連する観点は、抗炎症組成物の調製のための2'6'-ジアミノプリンおよび／またはその類似体の使用に関係する。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、高い効果および低い毒性を示す一方で、体内で安定を維持する遺伝子構築物およびアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸分子に関する。それはまた、炎症を阻害するために2'6'-ジアミノプリンおよびその類似体を使用することに関する。
【００２１】
本発明の観点によれば、哺乳動物に投与する核酸分子のin vivoでの効率を増加させるための方法が提供される。この方法は、少なくとも1つのヌクレオチド代替物を核酸分子に組み込むステップを含む。後述の実施例にて示すように、そのような組み込みは、ヌクレオチド代替物を組み込まない核酸分子と比較して、哺乳動物に投与するとき、核酸分子のin vivoでの生理学的効率を増加させ、また核酸分子の毒性を減少させる。
【００２２】
核酸分子の“毒性の減少”は、当該技術分野で知られる原理を使用して評価しうる。本発明の好ましい態様によると、ヌクレオチド代替物を組み込む核酸分子がin vivoでのより低い炎症特性を示し、およびそれによって毒性を減少させるように、ヌクレオチド代替物が選択される。さらに好ましくは、この修飾を組み込む核酸分子がリンパ球、好酸球、マクロファージおよび／または好中球がこれらの核酸分子を投与する部位および／または疾患の部位へ補充されることを阻害できるように、ヌクレオチド代替物が選択される。
【００２３】
本発明の好ましい態様によると、ヌクレオチド代替物は核酸分子中にそこでアデノシン塩基を置換するために組み込まれる。好ましくは、ヌクレオチド代替物は2'6'-ジアミノプリン（図1参照）またはその類似体である。本明細書中で使用される場合、“2'6'-ジアミノプリンの類似体”には2'6'-ジアミノプリンと同様な構造、および実質的に同一な生物学的な活性／効率を有するすべての化合物が含まれる。好ましい2'6'-ジアミノプリン類似体はまた図1に示され、および：2,6-ジアミノプリンへミスルフェート（1H-プリン-2,6-ジアミン、スルフェート(2:1); CAS 69369-16-0）、2-アミノ-9-(B-D-2'-デオキシリボフラノシル)プリン（CAS 3616-24-8）、7-デアザ-2'-デオキシアデノシン（CAS 60129-59-1）、N6-メチル-2'-デオキシアデノシン（CAS 2002-35-9）、2-アミノアデノシン／2,6-ジアミノプリリボシド（CAS 209610-08）、およびそれらの塩を含む。
【００２４】
2'6'-ジアミノプリン類似体には、2'6'-ジアミノプリンの全ての機能的誘導体、すなわち2'6'-ジアミノプリンおよび／または図1に示すその類似体の生物学的な活性／効率と実質的に同様な生物学的な活性／効率を保持する全ての化合物、もまた含まれる。
【００２５】
本発明のもう1つの観点によると、先に定義されるように2'6'-ジアミノプリンおよびその類似体から成る群から選択されるヌクレオチド代替物を含む単離あるいは精製された核酸分子が提供される。本発明の核酸分子は、治療的遺伝子産物をコードする配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド、2本鎖RNA（RNAiとして）あるいは核酸分子からなっていてもよい。好ましくは、ヌクレオチド代替物は核酸分子中にその中でアデノシン塩基を置換するために組み込まれる。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、“核酸分子”という表現は、完全な遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む、1つあるいはそれ以上のヌクレオチドを有するいずれかのDNA、kRNA配列あるいは分子を意味する。その用語は、天然あるいは非天然であろうとも特定の細胞、組織あるいは器官で起こる全ての核酸を包含することを意図する。これにはDNAおよびその断片、RNAおよびその断片、cDNAおよびその断片、発現配列タグ、ランダム化人工配列を含む人工配列が含まれる。
【００２７】
本発明の核酸分子は、当該技術分野でよく知られる方法を使用して合成される。それらはDNA、あるいはRNAの形態であってもよく、それらはメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホジエステル、ホスホロジチオエート、ボラノホスフェート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、チオエーテル、カーボネート、カルバメート、スルフェート、スルホネート、スルファメート、スルホンアミド、スルホン、スルファイト、スルホキシド、スルフィド、ヒドロキシルアミン、メチレン（メチルイミノ）、メチレンオキシ（メチルイミノ）、およびホスホールアミデート残基などの1つあるいは複数のモノヌクレオチド連結残基を含みうる。
【００２８】
DAP塩基およびその類似体は、従来のホスホールアミダイト化学を使用して、DNAおよびRNA配列に化学的に導入しうる。あるいは、DAPは当該技術分野でよく知られるように、DAPトリホスフェートおよびポリメラーゼの使用を通して、酵素的方法によってDNAおよびRNA中に組み込むことができる。興味深いことに、DAP-トリホスフェートはDNA合成酵素のためにATPの真の類似体として作用する（Rackwitz, H.R., et al. Eur J Biochem 72: 191-200, 1977）
【００２９】
本発明の核酸分子はまた、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣体（peptidomimetics）、低分子化学物質、リガンド、脂質、核酸、あるいは炭水化物部分などの“キャリア”分子に連結しうる。
【００３０】
本発明の核酸分子のサイズは所望する使用により変わるであろうし、オリゴは典型的には2から約10000ヌクレオチドを有する。さらに好ましくは、アンチセンス核酸分子のサイズは約10から約100ヌクレオチドまで変わるであろうが、治療的遺伝子産物をコードする配列を含む核酸分子のサイズは典型的には約100から約10000ヌクレオチドまで変わるであろう。
【００３１】
本発明の核酸分子は、様々な疾患の治療および／または予防に有用でありうる。本核酸分子から恩恵を受けうる疾患の典型的な例には、呼吸器系疾患、神経疾患、心血管疾患、リウマチ性疾患、消化器疾患、皮膚疾患、眼疾患、泌尿器系疾患、癌、病原体感染、遺伝性疾患、好酸球増加症、全身炎症、および癌が含まれる。最も好ましい核酸分子には、以下の表1に記載したオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００３２】
【表１】
本発明のDAP-置換核酸分子は効率の改善および／または毒性の減少を有しているため、それらは遺伝子治療およびDNAワクチン方法に使用しうる。例えば、DAP-置換核酸分子は、呼吸器系の病原体の増殖を阻害するための治療薬；肺／気道／鼻における新生物細胞増殖を治療あるいは予防するための治療薬あるいはワクチン；嚢胞性線維症などの、肺／気道／鼻の遺伝性疾患を治療するための治療薬あるいはワクチン；および喘息、アレルギー、慢性閉塞性肺疾患、肺線維症、慢性咳嗽および粘液産生、成人呼吸窮迫症候群、全身炎症、炎症性疾患、癌、病原体感染（例えば、副鼻腔炎、呼吸器合胞体ウイルスあるいはその他のウイルス性呼吸気道感染）、遺伝性疾患、あるいはいずれかの呼吸器系の疾患の治療および／または予防のための治療薬あるいはワクチン、として使用されうる。加えて、DAPおよびその類似体は、遺伝子治療中に起こる免疫反応を減少させるために、および／または遺伝子治療方法の効率を改善するために、アデニンあるいはいずれかの他の塩基の代わりに遺伝子内に挿入しうるか、あるいは遺伝子と共同して（例えば、コード領域あるいは非コード領域に組み込まれる）投与しうる。
【００３４】
より具体的には、DAP-置換核酸分子は、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、リノウイルス、インフルエンザウイルス、細菌および疾患を起こすその他の病因などの呼吸器病原体の複製を阻害することにより、病原体感染を治療するため、および／またはそれらが起こることを予防するために使用されうる。同様に、抗腫瘍活性を有するDAP-置換核酸分子は、肺癌あるいはその他の癌の治療および予防のために使用されうる。DAP-置換DNAあるいは遺伝子はまた、呼吸気道の遺伝性疾患（例えば、嚢胞性線維症）の治療などの遺伝子に対する炎症反応が望まれないところでの治療的適応のために特に有用である。
【００３５】
所望する使用によって、DAP-核酸分子がプラスミドあるいはウイルスなどのベクターに組み込まれること、およびそれが治療的遺伝子産物をコードする配列を含むことが必要となりうる。
【００３６】
本発明の好ましい態様によると、核酸分子はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。以下の実施例に示すように、DAP-置換アンチセンスオリゴヌクレオチドは効率の改善および／または毒性の減少を有する。従って、これらのアンチセンスは、少なくとも1つの肺／気道／鼻のメディエーターあるいは受容体に対して示される治療薬あるいはワクチンとして、喘息あるいはアレルギー性鼻炎に存在する炎症反応を阻害するための治療薬として、およびアレルギーあるいは喘息の発症を予防するための、あるいはこれらの疾患を有する患者を脱感作するための治療薬として使用されうる。
【００３７】
例えば、DAP-置換アンチセンスオリゴヌクレオチドは、メディエーターおよび受容体をコードする核酸配列、あるいは炎症プロセスのその他の成分に対して示されうるものであり、そしてこれらのタンパク質の発現を阻害することにより、肺／気道（喘息、慢性閉塞性肺疾患の治療薬）あるいは鼻（アレルギー性鼻炎）、あるいは副鼻腔（慢性副鼻腔炎）において炎症プロセスを消しうるであろう。
【００３８】
従って、本発明のさらなる観点は、アンチセンス療法の方法、つまり先に定義したように治療的有効量あるいは予防的有効量の少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、それを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む方法に関する。この方法は、呼吸器系疾患、神経疾患、心血管疾患、リウマチ性疾患、消化器疾患、皮膚疾患、眼疾患、泌尿器系疾患、癌、病原体感染、遺伝性疾患、全身炎症および癌を予防および／または治療するために特に有用である。
【００３９】
好ましい態様によると、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、肺線維症、成人呼吸促進症候群、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、好酸球性気管支炎、喘息、アレルギー、アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎および好酸球増加症などの肺、気道および／または鼻の炎症に関係する呼吸器系疾患を予防および／または治療するために、呼吸器系に直接的に投与される。
【００４０】
好ましくは、本発明の核酸分子は、先に定義された少なくとも1つの核酸分子、および医薬的に許容可能なキャリアを含む医薬的組成物に組み込まれうる。
【００４１】
本発明の組成物中に存在する核酸分子の量は、治療的有効量である。核酸分子の治療的有効量は、組成物が投与される宿主の中で、過度に負の効果を起こさずにその生物学的機能を行うために必要な量である。使用される核酸分子および投与される組成物の正確な量は、オリゴ生物学的活性、治療される条件の型、投与の様式、ならびに組成物中のその他の有効成分などの因子によって変わりうる。典型的には、組成物は約1％から約90％の核酸分子から成り、および約20μgから約20 mgの核酸分子が投与されるであろう。
【００４２】
組成物の医薬的に許容可能なキャリアは、固体キャリア、液体キャリアおよび気相キャリアから成る群から選択されうる。有利なことに、キャリアは脂質粒子、脂質小胞、微結晶およびサーファクタントから成る群から選択される。
【００４３】
さらなる薬剤を本発明の組成物に加えることができる。例えば、本発明の組成物はまた、薬物、抗酸化剤、サーファクタント、香料添加剤、揮発性油分、緩衝化剤、分散剤、推進剤、および防腐剤などの薬剤を含みうる。医薬的組成物の調製のため、当該技術分野でよく知られた方法を使用しうる。
【００４４】
本発明の核酸分子および組成物は、様々な投与経路を通して与えられうる。例えば、組成物は、例えば、滅菌注射用水性あるいは油性懸濁液として、滅菌注射用調製物の形で投与されうる。これらの懸濁液は、適した分散剤あるいは湿潤剤および懸濁化剤を使用して、当該技術分野で知られた技術によって製剤化されうる。滅菌注射用調製物はまた、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤あるいは溶剤中の滅菌注射用液体あるいは懸濁液でありうる。それらは非経口的に、例えば、静脈内、筋肉内あるは皮下に注射あるいは輸液によって与えられうる。本発明の核酸分子および組成物はまた、局所投与のためにクリームあるいは軟膏として製剤化されうる。それらはまた、加圧型噴霧器、鼻腔用スプレー、ネブライザー、定量吸入器、ドライパウダー吸入器、あるいはカプセルにより被験体の気道に投与されうる。適した用量は、組成物中の各々の成分の量、所望する効果（即効あるいは長期）、治療される疾患あるいは障害、投与経路および治療される個人の年齢および体重などの因子により変わるであろう。いずれにしても、本発明の核酸分子および組成物を投与するために、当該技術分野でよく知られた方法が使用されうる。
【００４５】
前述のように、本発明は哺乳動物において炎症を阻害するための2'6'-ジアミノプリンおよびその類似体の使用に関する。従って、本発明はまた：2'6'-ジアミノプリンおよび／またはその類似体；および医薬的に許容可能なキャリア；を含む抗炎症組成物を提供する。本発明はまた、医薬的組成物における2'6'-ジアミノプリンおよびその類似体自体の使用および／またはこの（これらの）化合物の使用を含む、哺乳動物において炎症を阻害するための方法を提供する。2'6'-ジアミノプリンおよびその類似体は、それ自体投与されうるし、あるいはアミノ酸、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物、低分子化学物質、リガンド、脂質、核酸、あるいは炭水化物部分などの“キャリア”分子に連結して組み込まれうる。好ましい態様において、2'6'-ジアミノプリンおよび／またはその類似体は核酸分子中に組み込まれ、体による核酸分子の分解の結果、2'6'-ジアミノプリンおよび／またはその類似体は放出される。
【００４６】
関連する観点において、本発明は2'6'-ジアミノプリンおよびその類似体からなる群から選択されるアデノシンアンタゴニスト化合物；および医薬的に許容可能なキャリア；を含む抗炎症組成物に関係する。もう1つの関連する観点は、抗炎症組成物の調製のための2'6'-ジアミノプリンおよび／またはその類似体の使用に関係する。
【００４７】
本発明の抗炎症組成物は、アデノシン受容体の活性化が実質亭に毒性であり、さらにより具体的には、全身性、器官特異的あるいは組織特異的炎症であるいずれかの疾患（局所あるいは全身）の予防および／または治療のために特に有用でありうる。さらに具体的には、本発明の抗炎症組成物は、癌、呼吸器系疾患、神経疾患、心血管疾患、リウマチ性疾患、消化器疾患、皮膚疾患、眼疾患および泌尿器系疾患が関連するおよび／または原因となるいずれかの炎症の予防および／または治療のために特に有用でありうる。本発明の抗炎症組成物から恩恵を受けうる呼吸器系疾患のさらに具体的な例には、肺線維症、成人呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、好酸球性気管支炎、喘息、アレルギー、および好酸球増加症が含まれる。
【００４８】
上述したように、本発明の組成物中にて使用する2'6'-ジアミノプリンおよびその類似体の量、投与する組成物の量およびその投与の経路は、当該技術分野でよく知られる様々な因子により変わりうる。
【００４９】
後述の実施例によってすぐに説明するように：（1）本発明は2,6-ジアミノプリンの類似体に基づき、アデノシンを置換する、新規アンチセンス技術を提供する；（2）アデノシンの代替物は全てが同程度に効果的というわけではなく、DAPおよびその類似体は他のものより驚くほど効果的である；（3）本発明の核酸分子は、標準的なアンチセンスオリゴヌクレオチドと比べて、標的タンパク質の合成を阻害する点で、同等に驚くほど一層効果的である；（4）DAPをベースとするアンチセンスが従来のアンチセンスオリゴヌクレオチドより著しい抗炎症効果を有しているため、本発明によるDAPをベースとするアンチセンス技術は既存の技術より強力であり、および重大な進歩を構成する；（5）DAP-核酸分子は、アデノシン受容体の阻害に関係しないような機序によりそれらの抗炎症効果を発揮するようである；（6）本核酸分子はいずれかの炎症疾患および／または肺／気道にとって毒性を著しく減少した；（7）本発明のDAP-核酸分子、組成物および方法の使用は、（DAPを含まない）通常のアンチセンスを使用するよりも、より効果的でありうる；および（8）最後に、2'6'-ジアミノプリンそれ自体およびその類似体は抗炎症活性を有する。
【００５０】
実施例
以下の実施例は、本発明の広範囲の適用の実例であり、その範囲を限定する意図はない。修飾および変化は、その中で本発明の意図および範囲を逸脱せずに行われうる。本明細書中に記載されるものと同様あるいは同等ないずれかの方法および材料は、本発明のテストを実行する際に使用されうるが、好ましい方法および材料が記載される。
【００５１】
A）イントロダクション
アンチセンスオリゴヌクレオチド（AS）は、科学文献および特許文献にて広く記載された新規分野の薬剤である。この治療的ストラテジーは、1つあるいはいくつかの遺伝子の過剰発現が疾患の存在あるいは持続を引き起こすと信じられているいずれかの疾患に潜在的に適用されうる。効率の向上および抗炎症効率の向上によりASは、喘息、細気管支炎、ウイルスあるいはその他の形式の感染、鼻炎、嚢胞性線維症、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、好酸球性およびその他の形式の咳、肺線維症、成人呼吸窮迫症候群、結膜炎およびその他の形式の眼あるいは皮膚炎症疾患を含む全ての呼吸器疾患のための重要な治療的ストラテジーとなりうる。
【００５２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの全身性効果および毒性のレビューは、ST Crooke（Hematologic Pathology, 9: 5972; 1995）によりまとめられた。PSオリゴヌクレオチドの毒性を回避する1つの方法は、PSオリゴヌクレオチドを治療するために設定した疾患の部位に投与し、全身への分配およびその結果それに関連する毒性を最小限にすることである。PS ASオリゴヌクレオチドはマウスあるいはウサギの肺に噴霧された（Templin MV et al. Antisense and nucleic acid drug development, 10: 359-368; 2000; Ali S et al. Am J Respir Critic Care Med 163: 989-993; 2001）。治療的に効果がある考えられる用量では、全身への分配は非常に少ないという結果が示された。しかし、高用量では少しのマクロファージおよび単核球を伴って、主にリンパ球および好中球を含む多発性の細胞性浸潤がマウスの肺で起こる。オリゴヌクレオチドに含まれるアデノシン塩基は前炎症性効果あるいは抗炎症効果を有するであろうが、我々は先に特許WO 99/66037にて、CCR3受容体に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、18 merあたりに5アデノシンを含有するもの（27.7％アデノシン）が、ラットにてin vivoで喘息性反応を効果的に阻害したことを報告した。
【００５３】
類似体による塩基の置換がアンチセンスオリゴヌクレオチドの安定性、結合、分解効率および毒性に影響を与えうるかどうかのテストを系統的には誰も行っておらず、またそれらを培養中あるいは動物中の細胞における生物学的活性についてテストすることも行われていない。2,6-ジアミノプリン（DAP）は、シアノファージS-2Lによりアデノシンの代わりにDNA中に存在することが見出された（Cheng, X., Annu Rev Biophys Biomol Struct 24: 293-318,1995; Khudyakov, I. Y., et al., Virology 88: 8-18, 1978）。DAPは二本鎖DNAの構造を変化させ、A:T二本鎖と比較するとき、（シトシンおよびグアノシンにより形成される三重水素結合と同様に）D:T二本鎖にて三重水素結合を導入する（Chollett, A. and Kawashima, E. of Biogen SA (Geneva), Nucleic Acids Research 16: 305-17, 1988）。この余分な水素結合により、DNA-DNAハイブリダイゼーションの間における選択性およびハイブリダイゼーション強度が増加し、ならびにいくつかの制限酵素の開裂の阻害が引き起こされる（Bailly, C. and Waring, M.J., Nucleic Acids Research 23: 885-92,1995 ; Bailly, C. et al. PNAS 93: 13623-8, 1996）。
【００５４】
DAPにおけるC2炭素のさらなるN2アミノ基は塩基対合のために使用される。さらなる結合はDNA二本鎖の安定性を増加させ、B-およびZ-DNA両方の副溝をより親水性にする。アデノシンをDAPに置換することは、DNA含有DAPのTm、つまり2つの二本鎖相補DNA鎖が溶解する温度、をDAP残基毎に1.5℃上昇させる（Hoheisel, J.D., Lehrach, H., FEBS Letters 274: 103-6, 1990）。従って、DAPおよびその類似体は、複数の塩基の置換だけでなく、一つの塩基の置換としてオリゴヌクレオチド内に含まれるとき、遺伝子治療に組み込まれるとき、あるいは以下に見られるように、単独で投与されるとき、ASオリゴヌクレオチドの効率および抗炎症活性を増加する可能性を有する。
【００５５】
B）材料と方法
細胞株を用いた実験
実験は、（本明細書中に援用される）国際出願WO 99/66037に記載されるIL-3、IL-5およびGM-CSF受容体の共通ベータサブユニットに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、アデノシンを2-アミノ-2'-デオキシアデノシンあるいはイノシンのどちらかで置換することによって修飾したとき、この受容体の発現および機能を阻害しうるかどうかを評価するために行われた。TF-1およびU937細胞は、高レベルのGM-CSF受容体を発現する。加えて、TF-1細胞は生存に関して、GM-CSFに依存している。これらの細胞は、10％熱不活化ウシ胎仔血清、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびl-グルタミンを補充したRPMI 1640中で5％CO2中37℃にて培養した（TF-1細胞にはGM-CSFを補充した）。それらを12時間、培地のみ、あるいはIL-3、IL-5およびGM-CSF受容体の共通ベータサブユニットに対するセンス（107S: 5'-ACCATCCCGCTGCAGACCC-3'; SEQID番号:19）あるいはアンチセンス（107A:5'-GGGTCTGCAGCGGGATGGT-3'; SEQ ID NO: 20）オリゴヌクレオチドを用いた培地のどちらかで培養した。107A-DAPの配列は5'-GGGTCTGCDapGCGGGDapTGGT-3'（SEQ ID NO: 21）；107A-イノシン（107A-I）の配列は：5'-GGGTCTGCIGCGGGITGGT-3'（SEQ ID NO: 22）であった。細胞を回収して3回洗浄した。そして、RNAを回収し、受容体のベータ鎖の存在を半定量RT-PCRによって評価した。
【００５６】
動物
6-8週齢および220-275 gのブラウンノルウェーラットを、Harlan-Sprague-Dawley（Walkerville, MD）から得た。ラットは従来の動物施設で維持した。
【００５７】
オボアルブミンへの感作
ラットの能動感作は、1 mgの鶏卵オボアルブミン（OA）（Sigma, St.Louis, MO）および3.5 mgの水酸化アルミニウムゲル（BDH Chemicals, Poole, UK）を含有する1 mlの生理食塩水を皮下注射することにより行った。
【００５８】
オボアルブミンチャレンジ
オボアルブミンでの感作後14日目に、65 mg/kgでのペントタールを用いて全身麻酔しおよび気管内挿管した後、オボアルブミンチャレンジを60μl中200マイクログラムのオボアルブミンを気管内に注入することで行う。8時間あるいは15時間の後、ラットを全身麻酔後に再び挿管して、そして5回の0.9％生理食塩水5 mlの喉頭注入することからなる肺洗浄を行う。細胞を洗浄して、計数してそしてCytospin IIITMにてスライド上で遠心分離する。差異細胞計数を行う。
【００５９】
気道反応の測定
肺抵抗性を測定する道具および方法論は先に記載されているとおりである（Renzi, P. M., et al. Am. Rev. Respir. Dis 146:163-169, 1992）。全身麻酔は腹腔内へのペントタール（50 mg/kg）あるいはウレタン（1.1 g/kg）のどちらかを用いて導入した。そして、気管内挿管は6 cm長のPE-240TMポリエチレンカテーテルを使用して行った。熱パッドを使用して、一定体温を維持し、そして電子温度計を用いて継続的に直腸温をモニターした（TelethermometerTM, Yellow Springs Instrument Co., Yellowsprings, OH）。肺抵抗性（RL）は動物を側臥位にして自然換気呼吸の間測定した。流量は小さなPlexiglassTMボックス（容積265 ml）の内側に気管チューブの先端を置くことにより測定した。差圧トランスデューサー（MP-45+ 2 cm. H20; Validyne Corp, Northridge, CA）と連結したFleishTM No. 0呼吸気流計をボックスの他の端に取り付けて気流を測定し、そして量はフローシグナルの数値積分法により得た。食道圧の変化は、生理食塩水で満たしたカテーテルおよび差圧トランスデューサー（Sanborn 267 BCTM; Hewlett Packard, Waltham, MA）を使用することによって測定した。トランスデューサーのその他の端子はボックスに接続した。食道カテーテルは、より短い長さ（6 cm）のチュービング（PE-100TM）を取り付けた20 cm長のポリエチレンチュービング（PE-200TM）から構成された。肺圧差は食道およびボックス圧の間の差として算出した。気道反応は、市販ソフトウェア（RHT-Infodat Inc., Montreal, Quebec, Canada）を使用して多重線形回帰によって肺の運動方程式に適合させて決定させたRLから評価した。
【００６０】
通常あるいは修飾したPSアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与直後の、肺抵抗性の測定
オボアルブミンでの感作後14日目に、65 mg/kgのペントタールを用いて全身麻酔しおよび気管内挿管した後、GM-CSF、IL-3およびIL-5受容体のラット共通ベータ鎖に対するPS ASオリゴヌクレオチド（AS141A:5'-TGGCACTTTAGGTGGCTG-3'; SEQ ID NO: 23）の60μgを気管内に注入した。肺抵抗性は基準にて、30分間の間5分毎に、そして15分間隔で、測定した。アデノシンをDAPに置換した修飾AS141、つまりAS141-DAP（5'-TGGCDapCTTTDapGGTGGCTG-3'; SEQ ID NO: 24）、あるいはイノシンで置換したAS141-I（5'-TGGCICTTTIGGTGGCTG-3'; SEQ ID NO: 25）を用いて同様な実験を繰り返した。
【００６１】
アデノシンおよびDAPヌクレオシドおよびその他の特異的なDAP類似体に対する気道反応を評価する実験
感作後14日に、ラットはペントタール（65 mg/kg）を用いて全身麻酔して、挿管して、そして基準RLを測定した。ラットには、50μlの生理食塩水あるいは酢酸を加えた生理食塩水中で0.125μgから100μgの用量幅にわって、アデノシン（CAS 58-61-7）、2,6ジアミノプリンヘミスルフェート塩（CAS 69369−16−0）、DAP（2-アミノ-2'-デオキシアデノシン; CAS 4546-70-7）、2-アミノ-9-（B-D-2'-デオキシリボフラノシル）プリン（CAS 3616-24-8）、7-デアザ-2'デオキシアデノシン（CAS 60129-59-1）、N6-メチル-2'-デオキシアデノシン（CAS 2002-35-9）、2-アミノアデノシン／2,6ジアミノプリンリボシド（CAS 2096-10-08）の増分用量を気管内に投与した。各々の投与の直後に、RLを測定した。DAPは次のように溶解した：3 mgのDAPを100μlの酢酸と組み合わせて、追加の生理食塩水によって1.5から3 mlに調節して、そして70℃に加熱した。これにより最終濃度は1から2μg/μlとなった。希釈は同じ緩衝液によって行った。対照動物は示したように同じ最終濃度で酢酸を用いた生理食塩水を投与した。
【００６２】
抗原チャレンジ後のロイコトリエンD4反応を評価する実験
我々は、ラットCCR3受容体に対するアンチセンスASA4（5'-ACTCATATTCATAGGGTG-3'; SEQ ID NO: 26）が抗原チャレンジ後に肺内への好酸球の流入を効果的に阻害することを先に示した（WO 99/66037参照）。我々は、これらの実験のために同じオリゴヌクレオチド配列を使用した。14日目に、ラットをペントタール（65 mg/kg）を用いて全身麻酔した後に挿管して、50μlの0.9％NaCl中200μgのASA4、ASA4-DAP（5'-DapCTCDapTDapTTCDapTDapGGGTG-3'; SEQ ID NO: 27）、ミスマッチASA4-DAP（5'-CDapTCDapT TDapTCATGDapGGTG-3'; SEQ ID NO: 28）、AS141-DAP（5'-TGGCDapCTTTDapGGTGGCTG-3'; SEQ ID NO: 29）、ミスマッチAS141-DAP（5'-GTGCCDapTTTGDapGTGGCTG-3'; SEQ ID NO: 30）、ASA4-DAPおよびASA141-DAPの組み合わせ（全100μg）あるいは生理食塩水を気管内に投与した。10分後、オボアルブミンチャレンジを50μlの0.9％生理食塩水中200マイクログラムのオボアルブミンを気管内に注射することにより行った。15時間後、ラットを全身麻酔した後に再び挿管して、基準肺抵抗性を測定して、基準肺抵抗性が2倍になるまで（EC200）2倍濃度のロイコトリエンD4（50 ngから1600 ng）を気管内に接種した。
【００６３】
抗原チャレンジ後の肺内への細胞流入を評価する実験
14日目に、ラットをペントタール（65 mg/kg）を用いて全身麻酔した後に挿管して、50μlの0.9％NaCl中200μgのASA4、ASA4-DAP（5'-DapCTCDapTDapTTCDapTDapGGGTG-3'; SEQ ID NO: 27）、AS141-DAP（5'-TGGCDapCTTTDapGGTGGCTG-3'; SEQ ID NO: 29）、ミスマッチAS141-DAP（5'-GTGCCDapTTTGDapGTGGCTG-3'; SEQ ID NO: 30）、ASA4-DAPおよびASA141-DAPの組み合わせ（全100μg）あるいは生理食塩水を気管内に投与した。20分後、オボアルブミンチャレンジを50μlの0.9％生理食塩水中200μgのオボアルブミンを気管内に注射することにより行った。15時間後、ラットを全身麻酔した後に再び挿管して、そして5回の5 mlの喉頭注入を含有する肺洗浄を行った。細胞を洗浄して、計数してそしてCytospin IIITMにてスライド上で遠心分離した。最後に差異細胞計数を行った。
【００６４】
アデノシンあるいはDAP投与後の肺内への細胞流入を評価する実験
感作の14日後に、ラットをペントタール65 mg/kgを用いて麻酔した後に挿管して、そして50μl中100μgのアデノシンあるいは2-アミノ-2'-デオキシアデノシン、あるいは2-アミノ-2'-デオキシアデノシンに続いて10分後にアデノシン、あるいは生理食塩水にて気管内に注入した。15時間後、ラットをペントタールを用いて全身麻酔した後に挿管して、そして肺洗浄を行い、そして上記のように細胞を計数した。
【００６５】
C）結果
実施例 1：DAPによるアデノシンの置換は、in vitroにて通常のホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドと少なくとも同等の効果がある
実験の最初のセットは、DAPによるアデノシンの置換がASオリゴヌクレオチドのin vitroでの効率に影響するかどうかを決定するために設計された。図2Aにて注目すべきは、ヒトGM-CSF、IL-3およびIL-5受容体の共通ベータ鎖に対するアンチセンスの生物学的効果は、この受容体を発現するU937細胞において、アデノシンを2-アミノ-2'デオキシアデノシンにより置換することによっては影響されないということである。AS107は2アデノシン塩基を含有する19 merのオリゴヌクレオチドである。アデノシン塩基はDAPにより置換された（AS107-DAP）。この修飾オリゴヌクレオチドは、半定量PCR（ハウスキーピング遺伝子としてG3PDHを有する）によって評価するとき、共通ベータ鎖のmRNAの阻害においてはアデノシン含有AS107（AS107）と少なくとも同等の効果がある。
その他の細胞株での効率を確認するため、生存についてGM-CSFに依存するTF1細胞にて繰り返し実験を行った。図2Bにて注目すべきは、ヒトGM-CSF、IL-3およびIL-5受容体の共通ベータ鎖に対するAS107-DAPは、mRNA発現の阻害においてはアデノシン含有AS107（AS107）と少なくとも同等の効果があったということである。アンチセンスオリゴヌクレオチドにおけるDAPによるアデノシンの置換はin vitroでは効果的である。
【００６６】
実施例 2：ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれるとき全てのアデノシンの代替物が遺伝子の阻害に効果的というわけではない
アデノシンの置換がアンチセンスオリゴヌクレオチドの効率に影響を与えうるかどうかを決定するために実験を行った。図3にて注目すべきは、上述したように同じアンチセンスオリゴヌクレオチド（AS107）の効果は両方のアデノシンをイノシンに置換するときには消失するということである。イノシン含有アンチセンス（AS107-I）は、半定量PCRによって評価して、そしてアデノシン含有AS107と比較するとき、mRNA発現の阻害に関して効果はなかった。培地のみ、10μmol濃度のAS107あるいはAS107-Iと共にU937細胞をRNA単離前の6時間インキュベーションすること、および半定量PCRを行うことにより実験を行った。
【００６７】
実施例 3：アデノシンと関連しないホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドの気管内注入後に肺抵抗性の増加が起こる
50μlの生理食塩水に含有されるホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドの急速気管内注入後の肺抵抗性の効果を評価するために実験を行った。
図4Aは、感作したブラウンノルウェー（BN）ラットの肺抵抗性に対する、各々60μg用量での、ラットGM-CSF、IL-3およびIL-5受容体の共通ベータ鎖に対するアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（AS141、2アデノシンを含有する19 merオリゴヌクレオチド）の気管内投与の効果、および同じ配列のDAP-置換ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を説明する。これらの実験および続くものに関して、感作したブラウンノルウェーラットは先に記載したように利用した（Renzi PM, Am Rev Respir Dis 146:163-9; 1992）。リン酸緩衝生理食塩水の注射は、最大25％増の肺抵抗性の穏やかな増加を引き起こした。通常のアンチセンスは、15％以下のアデノシンを含み、中等度の肺抵抗性の増加（87％）を引き起こした。DAP修飾オリゴヌクレオチドは肺抵抗性の穏やかから中等度の増加（33％）を引き起こした。NyceはWO 00/62736およびWO 00/09525において、肺抵抗性の増加はオリゴヌクレオチドに含まれるアデノシンにより引き起こされることを示唆した。しかし、オリゴヌクレオチドにはアデノシンを分解および放出する時間（2-3分間）を見出せないであろうし、そして利用したアンチセンスオリゴヌクレオチドは10％しかアデノシンを含有していなかった（それは、WO 00/62736およびWO 00/09525によると、肺抵抗性に対する効果を有さない）。
イノシンはアデノシンに比べて肺／気道の気管支収縮は引き起こさないことが知られているので、AS141において2イノシンで置換した2アデノシンにより気管支攣縮が起きたのかどうかを評価するためにアッセイを行った（Mann, J.C. et al., J Appl Physiol 61: 1667-76, 1986）。図4Bに示すように、ラットGM-CSF、IL-3およびIL-5受容体の共通ベータ鎖に対する同じアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（AS141）においてイノシンでアデノシンを置換したもの（AS141-イノシン）の気管内投与もまた、肺抵抗性の一時的な増加（108％まで）を引き起こした。これらの結果は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの気管内注入はアデノシンとは関連しないように思われている機序により、一時的に肺抵抗性を増加させることを示す。
【００６８】
実施例 4：肺抵抗性に対する様々なDAP類似体の効果
我々はブラウンノルウェーラットにおいて肺抵抗性に対するDAP類似体の気管内投与およびアデノシンの気管内投与の効果を評価した。図5に示すように、アデノシン、DAP、および5つの異なるDAPの類似体を研究した。各々の化合物に関して、最少6尾のラットを研究し、そして平均％基準肺抵抗性を、DAPあるいはその類似体の気管内用量の関数として示す。この図で示されるように、肺抵抗性は5μgのアデノシンの濃度では次第にピークまで増加するのに対し、これは研究中には2-アミノ-2'デオキシアデノシン（DAP）あるいはその類似体では起こらない。これらの結果は、アデノシンとは対照的に、DAPおよびその類似体は肺抵抗性を著しくは増加させないことを示す。オリゴヌクレオチドは肺内では徐々に分解されるため、アデノシンの代わりにこれらの化合物を使用することは予期せず好都合になりうる。
【００６９】
実施例 5：DAP修飾ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、in vivoでの抗原チャレンジ後に起こる気道過敏性を阻害するのに効果的である。
ラットCCR3および喘息のラットモデルにおけるIL-3／IL-5／GM-CSF受容体の共通β鎖に対するDAP修飾アンチセンスのin vivoでの生物学的活性を図6Aに示す。ASA4は、CCR3受容体の阻害および抗原チャレンジ後に起こる好酸球流入の阻害を示した18 merのホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドである（WO 99/66037参照）。ASA141もまた、IL-3／IL-5／GM-CSF受容体の共通β鎖の阻害および抗原チャレンジ後に起こる好酸球流入の阻害を示した18 merのホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドである（WO 99/66037参照）。ASA4は5アデノシン塩基を含有する（28％アデノシン）。AS143は2アデノシン塩基を含有する。ASA4-DAPは、ASを与えていないラット（チャレンジした対象; p＜0.01）あるいはDAPミスマッチ処理ラットと比較するとき、オボアルブミンチャレンジ後15時間でロイコトリエンD4に対する気道過敏性を著しく減少させたということに注目すべきである。また、ASA4-DAPは非修飾ASA4よりも効果的な傾向があり、そして非チャレンジラットから得た結果と違いがなかったことにも注目すべきである。AS141もまた、対照チャレンジおよび141-DAPミスマッチ処理ラットと比較するとき、LTD4に対する過敏性を著しき減少させた（P＜0.05）。さらに、CCR3および共通β鎖オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて処理したラットにおいて、各々のアンチセンスオリゴヌクレオチドのものと比較すると、LTD4に対する気道過敏性が著しく減少し、そしてこの組み合わせはDAPオリゴヌクレオチドの組み合わせ（全50μg；図6B）と同等の効果であった。
【００７０】
実施例 6：DAP修飾ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、従来のアンチセンスオリゴヌクレオチドより、in vivoでの抗原チャレンジ後に起こる気道炎症を阻害するのに効果的である
これらの実験は、ラットCCR3受容体あるいはIL-3、5およびGM-CSFの共通ベータ鎖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて行った。オボアルブミン感作およびチャレンジされたラットは、オボアルブミンチャレンジの10分前に、生理食塩水、200μgの通常ASA4あるいは200μgのASA4-DAPの気管内注入により処理した。15時間後、ラットを麻酔して挿管して、そして気管支肺胞洗浄を総細胞計測および差異のために行った。結果は、両方の通常ASA4（図7A）およびAS141（図7B）および両方のASA4-DAPおよびAS141-DAPが好酸球の補充を効果的に阻害したことを示す（各々84％および83％まで；図7A）。しかし、AS4DAPは好中球およびマクロファージを減少させる傾向があり、そしてリンパ球の補充を著しく減少させた（74％まで）。141-DAPは同じくマクロファージの補充を著しく減少させた（p＜0.05）。2つのA4-DAPおよび141-DAPオリゴヌクレオチドの組み合わせ（全200μg）もまた、リンパ球およびマクロファージの補充を著しく減少させた（図7C）。これらの結果は、DAP修飾オリゴヌクレオチドが通常のオリゴヌクレオチドより効果的であるだけでなく、より広範な抗炎症効果を有していることを示す。
【００７１】
実施例 7：アデノシンは好酸球の補充に特異的である肺における前炎症性（pro-inflammatory）効果を有しており、DAPはアデノシンの前炎症性効果のアンタゴニストである
他の実験において、6尾の感作はしたがチャレンジしていないブラウンノルウェーラットの群をペントタールで麻酔し、そして気管内に挿管した。そして、ラットに（1）生理食塩水（対照）、（2）100μgのアデノシン、（3）100μgの2-アミノ-2'-デオキシアデノシン（DAP）あるいは（4）100μgのDAPのいずれかを、続いて10分後に100μgのアデノシンを気管内注入した。肺洗浄のために15時間後にラットを覚醒させ、再び麻酔および挿管をした。洗浄液から回収した媒質に存在した細胞を計数して、そして差異をCytospinTMスライド上で得た。
図8に示すように、アデノシンは肺において前炎症性であり、他の細胞型に著しい影響は及ぼさずに好酸球の選択的補充（10倍以上の増加）をもたらした。対して、DAPは肺洗浄の細胞性を増加させず、そしてアデノシンにより誘導される好酸球の補充を完全に阻害した。
【００７２】
D) 結論
上記のことを考慮すると、DAP置換アンチセンスオリゴヌクレオチドは、非修飾アンチセンスあるいはイノシン修飾アンチセンスと比較するとき次の利点を有する：
a）図1から8に示されるようにそして本特許出願に記載されるように、DAPおよびDAP類似体の化学的構造および特性はアデノシンとは異なる。これらの異なる化学的性質は、DAPおよび／またはDAP類似体を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、非修飾アンチセンスと比べて異なる化学的性質、ハイブリダイゼーション特性および安定性を有するようにする。
b）実施例1は、DAPホスホロチオエートアンチセンスがin vitroにて異なる細胞株でどのくらい効果的なのかを示す。
c）実施例2は、（イノシンで示されるように）ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれるとき、アデノシンの代替物のすべてが遺伝子を阻害することに効果的であるわけではないことを示す。
d）実施例3は、肺抵抗性の増加はホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドの気管内注入後に起こること、およびこの増加はアデノシンとは関連しないことを示す。実際、イノシンはアデノシン受容体を刺激しないのにもかかわらず、イノシンオリゴで肺抵抗性の増加が認められた。しかし、この増加はDAP修飾オリゴのものよりも重要度は低かった。
e）実施例4は、アデノシン、DAPおよびDAPの類似体の様々な代替物はin vivoにて気管内注入をするとき肺抵抗性に対して異なる効果を有するが、これらの化合物は全てアデノシンよりも毒性が低かった。例えば、図5で示すように、ピークアデノシン毒性（5μg）では、テストした化合物の相対的順位は、アデノシン＞N6-メチル-2'デオキシアデノシン＞DAPを含む残りであった。しかし、5倍低い濃度（1μg）では、毒性順位は異なり、アデノシン＞2-アミノ-2デオキシアデノシン／DAP＞残りであった。遊離DAP塩基は構造対照として、毒性に糖が要求されるかどうかを決定するために使用した。
f）実施例5は、DAP修飾ホスホロチオエートアンチセンスヌクレオチドがin vivoでの抗原チャレンジ後に起こるロイコトリエンD4に対する気道過敏性を阻害することに効果があり、そして従来のPSオリゴヌクレオチドよりも効果的な傾向であることを示す。2つのDAP修飾オリゴヌクレオチドの組み合わせは、それぞれのオリゴヌクレオチド単独よりも効果的であり、相乗作用が確認されている。
g）実施例6は、DAP修飾ホスホロチオエートアンチセンスヌクレオチドが従来のオリゴヌクレオチドよりも、in vivoでの抗原チャレンジ後に起こるロイコトリエンD4に対する気道過敏性を阻害することにより、効果的であることを示す。ASA4に関しては好中球およびマクロファージを減少させ、そしてまたリンパ球を著しく減少させる強い傾向があったのに対し、これらの効果は従来のPSアンチセンスオリゴヌクレオチドでは直面することがなかった。AS141に関しては、好中球を減少させそしてまたリンパ球およびマクロファージを著しく減少させる強い傾向があったのに対し、これらの効果は従来のPSアンチセンスオリゴヌクレオチドでは直面することがなかった。ASA4およびAS141の組み合わせに関しては、好中球を減少させそしてまたリンパ球およびマクロファージを著しく減少させる強い傾向があったのに対し、これらの効果は従来のPSアンチセンスオリゴヌクレオチドでは直面することがなかった。
h）実施例7は、アデノシンがラットの肺において前炎症性効果を有し、好酸球を選択的に補充すること、およびそれはリンパ球に対しては著しい効果は有していないことを示す。同時に、実施例7はDAPが好酸球流入を阻害すること、つまりDAP自身がアデノシンのアンタゴニストであることの説明を示す。
【００７３】
上記の7つの実施例は、DAP置換アンチセンスおよびDAPの類似体を有するアンチセンスが、遊離アデノシンヌクレオシドあるいはアデノシンを含有する非修飾アンチセンス化合物より肺／気道に関して本質的により効果的であり、そしてかなり毒性が低いことを示す。
【００７４】
また、WO 00/09525およびWO 00/62736にて示唆されたこととは対照的に、28％までのアデノシン塩基を有するアンチセンスがアデノシンではなくDAPを含有するアンチセンスと同じくらい大きく好酸球流入を阻害する能力があったため（図7参照）、アンチセンスに含有されるアデノシンは前炎症性ではない。しかし、DAP含有オリゴヌクレオチドもまたリンパ球およびマクロファージ流入を阻害したため（図7）、およびアデノシンがリンパ球流入に影響を与えないため（図8）、アンチセンスに含有されるDAPはアデノシン受容体とは関連しない機序を通してその効果を発揮する。
【００７５】
要約すると、従って、DAPアンチセンスは喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性疾患、好酸球性咳嗽、肺線維症、嚢胞性線維症、病原体感染、遺伝性疾患および肺癌、および炎症が関係するその他の疾患などの呼吸器疾患の治療および予防のためのアンチセンス療法およびワクチンの開発の改善された技術プラットホームを提供する。また、DAP自体およびその類似体は、哺乳動物における炎症を阻害するための抗炎症薬の強い可能性を有する。
【００７６】
本発明のいくつかの態様が記載された一方で、本発明がさらなる修飾の可能性を有し、そして本特許出願がいかなる変更、使用、あるいは適用を網羅し、一般的に本発明の原則に従い、そして発明に関係する当該技術分野での知識あるいは慣行の範囲にあるような本開示からの逸脱を含む意図があることが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１Ａ】図1A、1B、1C、および1Dは、アデニン、アデノシン、イノシン、2'6'-ジアミノプリン（2-アミノ-2'-デオキシアデノシン；DAP）およびDAPの様々な類似体を示す。
【図１Ｂ】図1A、1B、1C、および1Dは、アデニン、アデノシン、イノシン、2'6'-ジアミノプリン（2-アミノ-2'-デオキシアデノシン；DAP）およびDAPの様々な類似体を示す。
【図１Ｃ】図1A、1B、1C、および1Dは、アデニン、アデノシン、イノシン、2'6'-ジアミノプリン（2-アミノ-2'-デオキシアデノシン；DAP）およびDAPの様々な類似体を示す。
【図１Ｄ】図1A、1B、1C、および1Dは、アデニン、アデノシン、イノシン、2'6'-ジアミノプリン（2-アミノ-2'-デオキシアデノシン；DAP）およびDAPの様々な類似体を示す。
【図２Ａ】図2Aは、U937細胞におけるヒトGM-CSF、IL-3およびIL-5受容体の共通のベータ鎖に対する様々なアンチセンスの生物学的効果を示す半定量PCRの像である。1 = 非処理細胞; 2 = アンチセンスAS107で処理した細胞; 3 = 2アデノシン塩基の代わりにDAPを含有するアンチセンスAS107（AS107-DAP）で処理した細胞;およびM = 分子量マーカー。G3PDH 450 bp = G3PDHハウスキーピング遺伝子が見出される塩基の番号; GM-CSFRβ340 bp: 共通のベータ鎖バンドが見出される塩基の番号。
【図２Ｂ】図2Bは、TF-1細胞におけるヒトGM-CSF、IL-3およびIL-5受容体の共通のベータ鎖に対するアンチセンスの生物学的効果を示す半定量PCRの像である。1 = 非処理細胞; 2 = アンチセンスAS107で処理した細胞; 3 = 2アデノシン塩基の代わりにDAPを含有するアンチセンスAS107（AS107-DAP）で処理した細胞;およびM = 分子量マーカー。G3PDH 450 bpはG3PDHハウスキーピング遺伝子が見出される塩基の番号; β鎖340 bpは共通のベータ鎖バンドが見出される塩基の番号。
【図３】図3は、アンチセンスにおいてアデノシンをその類似体であるイノシンで置換したTF-1細胞における、ヒトGM-CSF、IL-3およびIL-5受容体の共通のベータ鎖に対する生物学的効果を示す半定量PCRの像である。1 = 非処理細胞; 2 = センスAS107で処理した細胞; 3 = アンチセンスAS107で処理した細胞; 4 = 2アデノシン塩基の代わりにイノシンを含有するアンチセンスAS107（AS107-I）で処理した細胞; 5 = 1塩基ミスマッチを有するアンチセンスAS107で処理した細胞;およびM = 分子量マーカー。G3PDH 450 bpはG3PDHハウスキーピング遺伝子が見出される塩基の番号; β鎖340 bpは共通のベータ鎖バンドが見出される塩基の番号。
【図４Ａ】図4Aは、感作したブラウンノルウェーラットの肺抵抗性に対する、ラットGM-CSF、IL-3およびIL-5受容体の共通のベータ鎖に対して示されるアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（AS141）の気管内投与の効果を、2アデノシン塩基の代わりにDAPを含有する同じアンチセンス（AS141-DAP）の効果と比較して示すグラフである。肺抵抗性は、各々のオリゴヌクレオチドの60μgの用量を投与した後0-2時間測定した。
【図４Ｂ】図4Bは、感作したブラウンノルウェーラットの肺抵抗性に対する、ラットGM-CSF、IL-3およびIL-5受容体の共通のベータ鎖に対して示されるアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（AS141）の気管内投与の効果を、2アデノシン塩基の代わりにイノシンを含有する同じアンチセンス（AS141-イノシン）の効果と比較して示すグラフである。肺抵抗性は、各々のオリゴヌクレオチドの60μgの用量を投与した後0-2時間測定した。
【図５】図5は、感作したラットの肺抵抗性に対する、アデノシン、DAP（2-アミノ-2'デオキシアデノシン）およびその類似体の気管内点滴注入の効果を示すグラフである。
【図６Ａ】図6Aは、ラットCCR3およびIL-3／IL-5／GM-CSF受容体の共通β鎖に対するオリゴヌクレオチドアンチセンスにおけるDAPの組み込みは、これらのアンチセンスのin vivoでの生理学的効果を増加することを示す棒グラフである。アンチセンスの生物学的活性は喘息のラットモデルで測定した：非チャレンジ対照；チャレンジ対照；200μgのアンチセンスASA4およびAS141（18ヌクレオチド）で処理したラット；アデノシン塩基の代わりにDAPを含有する200μgのアンチセンスASA4およびAS141（ASA4-DAP; 141-DAP）で処理したラット；200μgのミスマッチアンチセンスASA4およびAS141で処理したラット；および200μgのASA4-DAPおよびAS141-DAPミスマッチアンチセンスで処理したラット。ロイコトリエンD4に対する感応性はオボアルブミンチャレンジ後15時間測定した。
【図６Ｂ】図6Bは、2つの通常および2つのDAP含有オリゴヌクレオチドの組み合わせ（全50μg）は、50μgの各々のオリゴヌクレオチド単体よりも効果的であることを示す棒グラフである。
【図７Ａ】図7Aは、DAPを含有するCCR3に対するオリゴヌクレオチドは、DAPなしのオリゴヌクレオチドよりも、抗原チャレンジ後のin vivoでの肺炎症の阻害がより効果的であることを示す棒グラフである。
【図７Ｂ】図7Bは、DAPを含有するIL-3／IL-5／GM-CSF受容体の共通β鎖に対するオリゴヌクレオチドは、DAPなしのオリゴヌクレオチドよりも、抗原チャレンジ後のin vivoでの肺炎症の阻害がより効果的であることを示す棒グラフである。
【図７Ｃ】図7Cは、2つのDAP含有オリゴヌクレオチドの組み合わせ（全50μg）は、2つのDAPなしの通常オリゴヌクレオチドの組み合わせよりも、抗原チャレンジ後のin vivoでの肺炎症の阻害がより効果的であることを示す棒グラフである。
【図８】図8は、アデノシンはラットの肺内での好酸球の補充を選択的に増加させるが、DAPは増加させないこと、およびDAPはアデノシンの前-炎症性効果（pro-inflammatory effects）のアンタゴニストであることを示す棒グラフである。
Claims (55)
- 哺乳動物に投与する核酸分子中に少なくとも1つのヌクレオチド代替物を組み込むことを含む、前記の核酸分子のin vivoでの効率を増加する方法。
- 前記の組み込みが前記の核酸分子のin vivoでの生理学的効果を増加させる、請求項1の方法。
- 前記のヌクレオチド代替物を組み込む核酸分子が、前記のヌクレオチド代替物に組み込まれない核酸分子と比べて哺乳動物に投与されるときに毒性の減少を示す、請求項1の方法。
- 前記の組み込みが前記の核酸分子のin vivoでの炎症特性を減少させる、請求項3の方法。
- 前記のヌクレオチド代替物を組み込む核酸分子がリンパ球の補充を阻害する能力を有する、請求項4の方法。
- 前記のヌクレオチド代替物を組み込む核酸分子が好酸球の補充を阻害する能力を有する、請求項4の方法。
- 前記のヌクレオチド代替物を組み込む核酸分子がマクロファージの補充を阻害する能力を有する、請求項4の方法。
- 前記のヌクレオチド代替物を組み込む核酸分子が好中球の補充を阻害する能力を有する、請求項4の方法。
- 前記の阻害が前記の核酸分子を投与する部位で起こる、請求項5から8のいずれかの方法。
- ヌクレオチド代替物が、前記の核酸分子中にその中でアデノシン塩基を置換するために組み込まれる、請求項1から8のいずれかの方法。
- 前記のヌクレオチド代替物が2'6'-ジアミノプリンおよびその類似体からなる群から選択される、請求項1から9のいずれかの方法。
- 前記の2'6'-ジアミノプリンの類似体が2,6-ジアミノプリンへミスルフェート、2-アミノ-9-（B-D-2'-デオキシリボフラノシル）プリン、7-デアザ-2'-デオキシアデノシン、N6-メチル-2'-デオキシアデノシン、2-アミノアデノシン／2,6-ジアミノプリンリボシド、それらの塩およびそれらの機能的誘導体からなる群から選択される、請求項11の方法。
- 2'6'-ジアミノプリンが前記の核酸分子中にその中で少なくとも1つのアデノシン塩基を置換するために組み込まれる、請求項12の方法。
- 前記のin vivoでの炎症が前記の哺乳動物の気道内において治療的アンチセンスオリゴヌクレオチドをその中に投与した後に起こる、請求項3の方法。
- 少なくとも1つのヌクレオチド代替物が組み込まれる治療的アンチセンスオリゴヌクレオチドの前記哺乳動物内への投与が肺の気管支収縮および／または肺の過敏性を阻害および／または減少させる、請求項14の方法。
- 哺乳動物被検体への少なくとも1つの核酸分子のin vivo投与を含む方法における、少なくとも1つの2'6'-ジアミノプリンおよび／またはその類似体が前記の核酸分子に組み込まれる改善。
- 2'6'-ジアミノプリンあるいはその類似体が前記の核酸分子中にその中で少なくとも1つのアデノシン塩基を置換するために組み込まれる、請求項16の方法。
- 2'6'-ジアミノプリン、2'6'-ジアミノプリンの類似体およびそれらの機能的誘導体からなる群から選択されるヌクレオチド代替物を含む、単離あるいは精製される核酸分子であって、前記核酸分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび治療的遺伝子産物のための配列コーディングを含む核酸分子から選択される、前記単離あるいは精製される核酸分子。
- 前記の2'6'-ジアミノプリンの類似体が2,6-ジアミノプリンへミスルフェート、2-アミノ-9-（B-D-2'-デオキシリボフラノシル）プリン、7-デアザ-2'-デオキシアデノシン、N6-メチル-2'-デオキシアデノシン、2-アミノアデノシン／2,6-ジアミノプリンリボシド、それらの塩およびそれらの機能的誘導体からなる群から選択される、請求項18の核酸分子。
- 前記のヌクレオチド代替物が前記核酸分子中にその中でアデノシン塩基を置換するために組み込まれる、請求項18あるいは19の核酸分子。
- メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホジエステル、ホスホロジチオエート、ボラノホスフェート、ホルムアセチル、チオホルムアセチル、チオエーテル、カーボネート、カルバメート、スルフェート、スルホネート、スルファメート、スルホンアミド、スルホン、スルファイト、スルホキシド、スルフィド、ヒドロキシルアミン、メチレン（メチイミノ）、メチレンオキシ（メチルイミノ）、およびホスホールアミデート残基からなる群から選択される少なくとも1つのモノヌクレオチド連結残基を含む、請求項18から20のいずれか1つの核酸分子。
- 前記の核酸分子がDNAからなる、請求項18から21のいずれか1つの核酸分子。
- 前記の核酸分子がRNAからなる、請求項18から21のいずれか1つの核酸分子。
- 2から約10000ヌクレオチドまでを含む、請求項18から22のいずれか1つの請求項の核酸分子。
- 前記核酸分子がアミノ酸、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物、低分子化学物質、リガンド、脂質、核酸、あるいは炭水化物部分からなる群から選択される分子に連結する、請求項18から24のいずれか1つの核酸分子。
- 前記核酸分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項18から25のいずれか1つの核酸分子。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが約10から約100ヌクレオチドを含む、請求項26の核酸分子。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがSEQ ID NO: 1から18からなる群から選択される核酸配列を有する、請求項27の核酸分子。
- 前記核酸分子が治療的遺伝子産物のための配列コーディングを含む、請求項18から25のいずれか1つの核酸分子。
- 請求項18から29にて定義されるような核酸分子からなる群から選択される少なくとも1つの核酸分子、および医薬的に許容可能なキャリアを含む、医薬的組成物。
- 呼吸器系疾患、神経疾患、心血管疾患、リウマチ性疾患、消化器疾患、皮膚疾患、眼疾患、泌尿器系疾患、癌、病原体感染、遺伝性疾患、好酸球増加症、全身炎症、および癌からなる群から選択される疾患を治療および／または予防するための、請求項30の組成物。
- 前記核酸分子が組成物の約1％から約90％の量で存在する、請求項30から31の組成物。
- 薬物、抗酸化剤、サーファクタント、香料添加剤、揮発性油分、緩衝化剤、分散剤、推進剤、および防腐剤からなる群から選択される薬剤をさらに含む、請求項30から32のいずれかの組成物。
- 前記の医薬的に許容可能なキャリアが固体キャリア、液体キャリアおよびガス相キャリアからなる群から選択される、請求項30から33のいずれかの組成物。
- 前記の医薬的に許容可能なキャリアが液体粒子、液体小胞、微結晶およびサーファクタントからなる群から選択される、請求項34の組成物。
- 2'6'-ジアミノプリンおよびその類似体からなる群から選択されるヌクレオチド代替物を含む少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの治療的有効量あるいは予防的有効量を、それを必要とする哺乳動物被検体に投与することを含む、アンチセンス療法の方法。
- 前記の2'6'-ジアミノプリンの類似体が2,6-ジアミノプリンへミスルフェート、2-アミノ-9-（B-D-2'-デオキシリボフラノシル）プリン、7-デアザ-2'-デオキシアデノシン、N6-メチル-2'-デオキシアデノシン、2-アミノアデノシン／2,6-ジアミノプリンリボシド、それらの塩およびそれらの機能的誘導体からなる群から選択される、請求項36の方法。
- 呼吸器系疾患、神経疾患、心血管疾患、リウマチ性疾患、消化器疾患、皮膚疾患、眼疾患、泌尿器系疾患、癌、病原体感染、遺伝性疾患、好酸球増加症、全身炎症、および癌からなる群から選択される疾患を治療および／または予防するための、請求項37の方法。
- 呼吸器系疾患が肺、気道および／または鼻の炎症に関連する病気である、請求項38の方法。
- 呼吸器系疾患が肺線維症、成人呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、好酸球性気管支炎、喘息、アレルギー、アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎および好酸球増加症からなる群から選択される、請求項38の方法。
- 呼吸器系疾患が喘息でありおよび前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがSEQ ID NO: 1から18からなる群から選択される核酸配列を有する、請求項40の方法。
- 前記の少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが前記の哺乳動物被検体の呼吸器系に直接的に投与される、請求項36から41のいずれか1つの方法。
- 前記哺乳動物の体重kgあたり約2μgから約1 mgまでのアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、請求項36から42のいずれか1つの方法。
- 前記の投与が加圧型噴霧器、鼻腔用スプレー、ネブライザー、定量吸入器、ドライパウダー吸入器、あるいはカプセルにより行われる、請求項36から43のいずれか1つの方法。
- 2'6'-ジアミノプリンまたは2'6'-ジアミノプリンの類似体を哺乳動物に投与することを含む、前記哺乳動物における炎症を阻害するための方法。
- 前記の2'6'-ジアミノプリンの類似体が2,6-ジアミノプリンへミスルフェート、2-アミノ-9-（B-D-2'-デオキシリボフラノシル）プリン、7-デアザ-2'-デオキシアデノシン、N6-メチル-2'-デオキシアデノシン、2-アミノアデノシン／2,6-ジアミノプリンリボシド、それらの塩およびそれらの機能的誘導体からなる群から選択される、請求項45の方法。
- 前記の炎症が呼吸器系疾患、神経疾患、心血管疾患、リウマチ性疾患、消化器疾患、皮膚疾患、眼疾患、泌尿器系疾患および癌からなる群から選択される疾患によって関連付けられるおよび／または引き起こされる、請求項45あるいは46の方法。
- 前記の呼吸器系疾患が肺線維症、成人呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、好酸球性気管支炎、喘息、アレルギー、アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎および好酸球増加症からなる群から選択される、請求項47の方法。
- 前記の2'6'-ジアミノプリンおよびその類似体が前記の哺乳動物の呼吸器系に直接的に投与される、請求項48の方法。
- 前記の投与が加圧型噴霧器、鼻腔用スプレー、ネブライザー、定量吸入器、ドライパウダー吸入器、あるいはカプセルにより行われる、請求項49の方法。
- 前記哺乳動物の体重kgあたり約2μgから約1 mgまでの2'6'-ジアミノプリンまたはその類似体を投与することを含む、請求項45から50のいずれか1つの方法。
- 前記の2'6'-ジアミノプリンまたはその類似体が核酸分子中に組み込まれる、請求項45から51のいずれかの方法。
- 前記核酸分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項52の方法。
- 2'6'-ジアミノプリンおよびその類似体からなる群から選択されるアデノシンアンタゴニスト化合物；および医薬的に許容可能なキャリア：を含む抗炎症組成物。
- 抗炎症組成物の調製のための2'6'-ジアミノプリンおよび／またはその類似体の使用。
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