JP2508006B2 - オリゴデオキシヌクレオチドの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は遺伝子工学等の分野で有用なオリゴデオキシ
ヌクレオチドの製造法に関するものである。

従来の技術 オリゴデオキシヌクレオチドを製造するための方法と
しては、現在、リン酸トリエステル法（反応式
（１））、ホスホルクロリド法（反応式（２））および
ホスホルアミダイト法（反応式（３））が広く使用され
ている（リン酸トリエステル法の詳細については、C.B.
Reese,Tetrahedron,34,3143（1978），ホスホルクロリ
ド法については、R.L.Letsingerら、J.Am.Chem.Soc.,9
7,3278（1975），またホスホルアミダイト法について
は、M.H.Carurthersら、Tetrahedron Lett.,22,1859（1
981）を参照されたい）。

（式中、R⁴およびR⁵は保護基をあらわし；R⁷は高分子担
体を含有していてもよい保護基をあらわし、B¹およびB²
は同一でも異なつてもよくかつそれぞれ保護基を有する
こともある塩基残基をあらわす。また脱水剤は2,4,6−
トリイソプロピルベンゼンスルホニルテトラゾリド等を
あらわす。） （式中、R⁴，R⁵，R⁷，B¹およびB²は前記と同じ意味をあ
らわす。） （式中、R⁴，R⁵，R⁷，B¹およびB²は前記と同じ意味をあ
らわし；またはR⁸はアルキル基等をあらわす。） 発明が解決しようとする問題点 リン酸トリエステル法を用いて、オリゴデオキシヌク
レオチドを製造する場合の利点は、製造中間体である化
合物〔VI〕が酸素および水に対して安定である故に、化
合物（VI）の取扱いおよび反応（１）の操作が簡単であ
ることである。したがつてリン酸トリエステル法がオリ
ゴデオキシヌクレオチド製造法の主流を占めてきた。し
かしこの方法には、反応（１）の反応速度がさほど大き
くないためにオリゴ体の製造に時間を要するという欠点
がある。

一方、ホスホルクロリド法およびホスホルアミダイト
法の長所は製造中間体である化合物〔IX〕および〔Ｘ〕
がアルコール性水酸基との反応、つまり化合物〔VII〕
との反応およびそれにひきつづいて行うヨウ素水等によ
る酸化反応がすみやかに進行するために、目的化合物
〔VIII〕が短時間に得られることである。しかし、上記
方法には、化合物〔IX〕および〔Ｘ〕、とりわけ化合物
〔IX〕が酸素あるいは水に対して不安定であるために、
その保存中あるいは反応（２）および（３）の操作中に
分解しないように注意を払う必要があること等の欠点が
ある。実際、化合物〔IX〕は一般に生成系からの単離が
困難であるほどの不安定さであり、また化合物〔Ｘ〕は
弱酸の存在下でさえもＰ−Ｎ結合が容易に切断される程
度に不安定であることが知られている。

問題点を解決するための手段、作用および効果 本発明者らは、上述のごとき従来技術の状況にかんが
み、安定な製造中間体を用いてかつすみやかにオリゴデ
オキシヌクレオチドを与える方法を開発することを目的
として鋭意研究を重ねた結果、反応（４）に示す方法が
この目的を有利に達成することを見い出して本発明を完
成した。

したがつて本発明は、上述したようなオリゴデオキシ
ヌクレオチド製造のための方法の利点、すなわち安定で
取扱いが容易な製造中間体を用いかつすみやかな反応に
よるオリゴデオキシヌクレオチドの製造法に関するもの
であり、具体的には、一般式〔Ｉ〕で示されるトリアル
キルスタンニルアゾール化合物および一般式〔II〕で示
される塩基の存在下で、一般式〔III〕で示されるデオ
キシヌクレオチドホスホルスルフイド化合物と一般式
〔IV〕で示されるデオキシヌクレオチド化合物とを反応
させた後、酸化反応を行なわせることを特徴とする一般
式〔Ｖ〕で示されるオリゴデオキシヌクレオチドの製造
法を提供するものである。

▲R¹ ₃SnX▼ 〔Ｉ〕 （式中、R¹はアルキル基をあらわし;Xはアゾリル基をあ
らわす。） R²▲NR³ ₂▼ 〔II〕 （式中、R²は水素原子，アルキル基またはアリール基を
あらわし；R³はアルキル基をあらわすか、または２個の
R³が隣接する窒素原子とともにヘテロ原子として１ない
し２個の窒素原子，酸素原子またはイオウ原子を含有し
てもよい複素環基をあらわすかあるいはR²と２個のR³が
隣接する窒素原子とともにヘテロ原子として１ないし２
個の窒素原子、酸素原子またはイオウ原子を含有しても
よい複素環基をあらわす。） （式中、R⁴およびR⁵は保護基をあらわし；R⁶はアリール
基をあらわし；B¹およびB²は同一でも異なつてもよくか
つそれぞれ保護基を有することもある塩基残基をあらわ
し；n¹は０または正の整数をあらわすが、ただしn¹が２
以上の場合にはB²は同一の塩基残基に限定されない。） （式中、R⁵は前記と同じ意味をあらわし；R⁷は高分子担
体を含有していてもよい保護基をあらわし；B³およびB⁴
は同一でも異なつてもよくかつそれぞれ保護基を有する
こともある塩基残基をあらわし；n²は０または正の整数
をあらわすが、ただしn²が２以上の場合にはB⁴は同一の
塩基残基に限定されない。） （式中、R⁴，R⁵，R⁷，B¹，B²，B³，B⁴，n¹およびn²は前
記と同じ意味をあらわす。） したがつて、本発明に従う反応は反応式（４）で表わ
すことができる。

一般式〔Ｉ〕で示されるトリアルキルスタンニルアゾ
ール化合物について説明すると、その有機基R¹はアルキ
ル基であればよく、具体的にはメチル基，エチル基,n−
プロピル基,n−ブチル基等の第一級アルキル基,i−プロ
ピル基,s−ブチル基等の第二級アルキル基,t−ブチル基
等の第三級アルキル基等を挙げることができる。これら
のアルキル基のうちで化合物（Ｉ）のR¹としてどれを用
いるかについては化合物〔Ｉ〕の製造の容易さおよびそ
の安定性等を考慮して決めればよく、特に限定されない
が、それが容易で良好な安定性を与えるエチル基,n−プ
ロピル基およびｎ−ブチル基が好んで用いられる。また
アゾリル基Ｘとしては、イミダゾリル基,3−ニトロイミ
ダゾリル基，ベンズイミダゾリル基,1,2,3−トリアゾリ
ル基.1,2,4−トリアゾリル基,3−ニトロ−1,2,4−トリ
アゾリル基，ベンゾトリアゾリル基,5−クロロベンゾト
リアゾリル基,5−ニトロベンゾトリアゾリル基，テトラ
ゾリル基等を挙げることができる。これらのアゾリル基
のうちで化合物〔Ｉ〕のＸとしてどれを用いるかについ
ては限定的ではないが、一般には化合物〔Ｉ〕の製造の
容易さおよび反応（４）を良好に進行させる程度によつ
て決められ、それが容易でかつ良好な進行性を与えるイ
ミダゾリル基.1,2,3−トリアゾリル基,1,2,4−トリアゾ
リル基，ベンゾトリアゾリル基およびテトラゾリル基等
が好んで用いられる。化合物〔Ｉ〕は本発明者らがすで
に示した方法、すなわち反応（５）により容易に製造す
ることができる（特願昭60−165858号明細書（特開昭62
−026286号）参照）。

（式中、R¹およびＸは前記と同じ意味をあらわす。） 本発明方法の反応（４）に用いられる一般式〔II〕で
示される塩基について説明すると、化合物〔II〕はその
R²が水素原子，アルキル基（たとえばメチル基，エチル
基,n−プロピル基.i−プロピル基,n−ブチル基等）また
はアリール基（たとえばフエニル基,4−メチルフエニル
基等）であるときに、R³はアルキル基（たとえばメチル
基，エチル基,n−プロピル基,i−プロピル基,n−ブチル
基等）であるかあるいは２個のR³が隣接する窒素原子と
一体となつて１ないし２個の窒素原子，酸素原子または
イオウ原子を含有してもよい複素環基（たとえばピペリ
ジノ基,2,6−ジメチルピペリジノ基，ピロリル基，モル
ホリノ基，チオモルホリノ基，イミダゾリル基,2−メチ
ルイミダゾリル基，ベンズイミダゾリル基,1,2,4−トリ
アゾリル基,3−メチル−1,2,4−トリアゾリル基等）を
形成するようなものを挙げることができ、またさらに化
合物〔II〕としてはR²と２個のR³とが隣接する窒素原子
と一体となつてヘテロ原子として１ないし２個の窒素原
子，酸素原子またイオウ原子を含有してもよい複素環
（たとえばピリジン,2,6−ジメチルピリジン,4−ジメチ
ルアミノピリジン，オキサゾール，チアゾール，ピリミ
ジン，ピラジン，キノリン,s−トリアジン等）化合物を
挙げることもできる。これら化合物〔II〕の中から、反
応（４）のためにどれを用いるかについては限定的では
ないが、そのpKaが５〜12の範囲のものが好んで用いら
れる。

つぎに一般式〔III〕で示されるデオキシヌクレオチ
ドホスホルスルフイド化合物について説明すると、その
保護基R⁴は基本的にはすべてのヒドロキシ保護基が可能
である。具体的にはオリゴデオキシヌクレオチドを製造
する際にその有用性が認められたヒドロキシ保護基、た
とてばトリフエニルメチル基,4−メトキシトリフエニル
メチル基,4,4′−ジメトキシトリフエニルメチル基等の
トリアリールメチル基，ピキシル基（すなわち９−フエ
ニルキサンテン−９−イル基），アルコキシカルボニル
基，アリールオキシカルボニル基，アリールチオアルキ
ルオキシカルボニル基，さらにｔ−ブチルジメチルシリ
ル基のようなトリアルキルシリル基等を挙げることがで
きる。これらのヒドロキシ保護基の中から化合物〔II
I〕のR⁴としてどれを選ぶかについては限定的ではない
が、トリアリールメチル基はそれらの導入と脱保護が容
易である点で好ましく使用し得るものである。

また化合物〔III〕の有機基R⁵としては、基本的には
すべてのリン酸塩保護基が可能である。具体的にはオリ
ゴヌクレオチドを製造するために開発された保護基、た
とえば炭素数が５までの低級アルキル基、シアノアルキ
ル基，ハロアルキル基，アリールスルホニルアルキル
基，アリル基，アリール基およびハロアリール基等を挙
げることができる。これらのうちで化合物〔III〕のR⁵
としてどれを選ぶかについては限定的ではないが、オリ
ゴヌクレオチド製造のためのリン酸塩保護基としてその
有用性が確認されているメチル基，β−シアノエチル
基，アリル基および２−クロロフエニル基が好んで用い
られる。

つぎに化合物〔III〕の有機基R⁶について説明する
と、それはアリール基であればよく、具体的にはフエニ
ル基,2−メチルフエニル基,4−メチルフエニル基,2,4−
ジメチルフエニル基,2,6−ジメチルフエニル基,2,4,6−
トリメチルフエニル基,2−クロロフエニル基,4−ニトロ
フエニル基,3,4−ジクロロフエニル基，α−ナフチル基
等を挙げることができる。これらのアリール基のうちで
R⁶としてどれを選ぶかについては化合物〔IV〕における
保護基R⁵の種類等により異なるので限定することはでき
ないが、化合物〔III〕の製造の容易さおよび安定性等
を考慮すると、一般にそれが容易でかつ良好な安定性を
与える２−メチルフエニル基,2,6−ジメチルフエニル基
等の２−位に置換基をもつアリール基が好んで用いられ
る。

つぎに化合物〔III〕における塩基残基、B¹およびB²
について説明すると、代表的なものとしては一般式〔X
I〕で示される３位に保護基を有することもあるチミン
残基、一般式〔XII〕で示される４位のアミノ基に保護
基を有することもあるシトシン残基、一般式〔XIII〕で
示される６位のアミノ基に保護基を有することもあるア
デニン残基、一般式〔XIV〕で示される1,2,6位のアミド
基，アミノ基およびケト基に保護基を有することもある
グアニン残基等を挙げることができる。

これら塩基の保護基としては、オリゴヌクレオチド製
造に際してその有用性が認められたトリアリールメチル
基．トリアルキルシリルアルキル基，アリールチオアル
キル基，フタロイル基，アリールオキシカルボニル基，
アルコキシカルボニル基，ジアリールカルバモイル基，
アリールカルボニル基，アルキルカルボニル基，アリル
基等を挙げることができる（一般式〔XI〕〜〔XIV〕で
示される塩基残基にどの保護基を用いるかについては、
すでに多くの報文や総説に示されている。たとえば、畑
辻明ら、有機合成化学協会誌，42,429（1984）を参照さ
れたい）。

つぎに化合物〔III〕のn¹について説明すると、それ
は０または正の整数が可能である。オリゴデオキシヌク
レオチドの製造中間体として化合物〔III〕のn¹を実際
にどの数にするかということについては限定することが
できないが、化合物（III）の製造の容易さから判断す
ると、それが容易な０あるいは１の場合が一般的であ
り、、好んで用いられる。

一般式〔III〕で示されるホスホルスルフイド化合物
は、反応式（６）に示すように、一般式〔XV〕で示され
るデオキシヌクレオチドと一般式〔XVI〕で示される1,
2,4−トリアゾリルホスフイン化合物との反応により製
造することができる（製造法の詳細については本出願人
自身の出願に係る特願昭60−245326号（特開昭62−2018
95号）および昭和61年７月23日付出願の特願昭61−1718
25号（特開昭63−30479号）明細書を参照された
い。）。

（式中、R⁴，R⁵，R⁶，B¹，B²およびn¹は前記と同じ意味
をあらわす。） つぎに一般式〔IV〕で示されるデオキシヌクレオチド
化合物について説明すると、その有機基R⁵は上述したよ
うなリン酸塩保護基であり、また塩基残基B³およびB⁴は
一般式〔XI〕〜〔XIV〕に示した構造をもち、上述した
ような保護基を有することもある塩基残基である。また
化合物〔IV〕の有機基R⁷は基本的にはオリゴデオキシヌ
クレオチドを製造するために開発された３′−ヒドロキ
シ保護基が可能である。具体的にはアセチル基，ベンゾ
イル基，レブリニル基,t−ブチルジメチルシリル基ある
いは一般式〔XVII〕で示される構造をもつ有機基等が挙
げられる。

−Y₁−NHCO−Y₂−CO− 〔XVII〕 （式中、は高分子担体をあらわし；Y₁およびY₂は隣接
する高分子担体，アミド基およびカルボニル基と共有結
合をすることができる有機基をあらわす。） 高分子担体としてはシリカゲル，ポリスチレン等が挙
げられる。またY₁とY₂は限定的ではないが、炭素数が１
〜10までのアルキレン基がしばしば用いられる。上述の
保護基のうちで化合物〔IV〕のR₇としてどれを選ぶかは
反応（４）の反応形態によつて決められる。すなわち化
合物〔III〕と〔IV〕を反応溶媒に溶解し、いわゆる液
相均一反応を行わせてオリゴデオキシヌクレオチドを製
造する場合には、アセチル基，ベンゾイル基,t−ブチル
ジメチルシリル基等が用いられる。また化合物〔III〕
と〔IV〕を固相不均一系で反応させてオリゴ体を製造す
る場合には、有機基〔XVII〕が用いられる。

化合物〔IV〕のn²は製造しようとするオリゴデオキシ
ヌクレオチドの長さにより決まるが一般に上述した液相
法によりオリゴ体を製造する場合は、n²は０〜30の範囲
が、また固相法によりそれを製造する際には、０〜200
の範囲が一般的である。

本発明にしたがう反応（４）は、通常は化合物〔Ｉ〕
および化合物〔II〕の存在下で化合物〔III〕と〔IV〕
とのカツプリング反応を行わせ、次いでそのカツプリン
グ生成物のリン原子を酸化する反応からなる。まず化合
物〔III〕と〔IV〕とのカツプリング反応について説明
すると、当該反応は有機溶媒中で円滑に進行し、かかる
溶媒としては塩化メチレン，クロロホルム,1,1−ジクロ
ロエタン,1,2−ジクロロエタン，テトラヒドロフラン,p
−ジオキサン，ベンゼン，トルエン等を挙げることがで
きる。これらの溶媒は、使用に際して適当な乾燥剤で乾
燥後、蒸留等により精製したものを用いた方がよい。反
応は通常は室温で行わせるが、０°〜35℃の範囲で行つ
てもよい。また化合物〔Ｉ〕〜化合物〔IV〕の各モル比
は、化合物〔IV〕の１当量に対して化合物〔Ｉ〕を１〜
100倍当量、化合物〔II〕を１〜200倍当量、化合物〔II
I〕を１〜40倍当量用いるのが一般的である。当該反応
は概して１時間以内で終結するが、化合物〔IV〕の保護
基R⁷がアセチル基，ベンゾイル基，レブリニル基あるい
はｔ−ブチルジメチルシリル基等の場合、すなわち上述
したように液相反応である場合には、その終結は薄層ク
ロマトグラフイー（TLC）や¹HNMR等により確認すること
ができるので、それを確認してから酸化反応を行うのが
よい。また化合物〔IV〕のR⁷が一般式〔XVII〕で示され
る有機基である場合、つまり上述したように固相反応系
である場合には、TLCや¹HNMR等により反応の終結を知る
ことができないので、通常は上記カツプリング反応を一
定時間行わせた後に酸化反応を行い、生成したオリゴデ
オキシヌクレオチド化合物〔VI〕の保護基R⁴を脱保護
し、その生成量から反応終結時間が決められる。この際
R⁴がジメトキシトリチル基あるいはモノメトキシトリチ
ル基等のトリアリールメチル誘導体の場合は、酸による
脱保護の際に生ずるトリチルカチオンの吸光度（いわゆ
るトリチルカチオンテストであり、ジメトキシトリチル
カチオンは498nm,モノメトキシトリチルカチオンは475n
mにおけるもの）を測定することにより、容易にそれを
決めることができる。

つぎに本発明にしたがう反応（４）における酸化反応
について説明すると、当該反応はヨウ素−水系.m−クロ
ロ過安息香酸，ヨードベンゼンジアセテートあるいは酸
化窒素等を用いて行うことができる。これらの試薬のう
ちで、反応（４）の酸化反応のために、どれを用いるか
については限定的ではないが、ヨウ素−水系はその入手
が容易でかつ安価であることから好ましく用いられる。
この場合の酸化反応は−78°〜35℃の範囲で、化合物
〔IV〕に対して１〜200倍用い、１〜５分間反応させる
のがよい。

このように反応（４）により製造したオリゴデオキシ
ヌクレオチド化合物〔Ｖ〕よりもさらに長鎖のオリゴ体
を製造したい場合には、化合物〔Ｖ〕の保護基R⁴を既知
の方法により選択的に脱離させ（R⁴がジメトキシトリチ
ル基やモノメトキシトリチル基のようなトリアリールメ
チル誘導体の場合には、ベンゼンスルホン酸，ジクロロ
酢酸，トリクロロ酢酸のようなプロトン酸や臭化亜鉛の
ようなルイス酸がしばしば用いられる），化合物〔XVII
I〕としたのち、これを化合物〔IV〕の代りに用いて反
応（４）を行えばよい。

この場合、上述した液相法では、化合物〔XVIII〕を
シリカゲルクロマトグラフイー等により単離、精製した
後、これと化合物〔III〕とを反応させるのが一般的で
ある。

一方、固相法の場合には、化合物〔XVIII〕を単離、
精製することができないので、通常は化合物〔Ｖ〕の保
護基R⁴を脱離させて化合物〔XVIII〕とする前に、反応
（４）で未反応となつた化合物〔IV〕の５′−OH基を適
当な方法でいわゆるキヤツピング（capping）してか
ら、保護基R⁴を脱離させた後、化合物〔III〕と反応さ
せる方法がとられる。

（式中、R⁵，R⁷，B¹，B²，B³，B⁴，n¹およびn²は前記と
同じ意味をあらわす。） 上記のキヤツピング反応は、基本的には化合物〔IV〕
の５−OH基と安定な化学結合を形成するような反応であ
ればよくたとえば、無水酢酸−塩基（ピリジンあるいは
2,6−ジメチルピリジンと４−ジメチルアミノピリジン
の組み合せがしばしば用いられる）系によるエステル化
反応がしばしば用いられる。

なお本明細書において用いられる略号の意味はつぎの
とおりである。

Et;エチル基,n−Pr;n−プロピル基,n−Bu;n−ブチル基,
Bz;ベンゾイル基,TBDMS;t−ブチルジメチルシリル基,DM
Tr;4,4′−ジメトキシトリチル基,MMTr;4−モノメトキ
シトリチル基,T;チミン残基，C^bz；N⁴−ベンゾイルシト
シン残基，A^bz；N⁶−ベンゾイルアデニン残基，G^ib；N²
−イソブチリルグアニン残基。

実施例 以下実施例によつて、本発明を具体的に説明するが、
本発明は実施例に限定されるものではない。

実施例１ ３′−Ｏ−ベンゾイルチミジン〔IV〕（1.73g,5ミリ
モル）に、５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン−
３′−Ｏ−（２−クロロフエニルオキシ−２−メチルフ
エニルチオ）ホスフイン〔III〕（5.78g,7ミリモル），
トリエチルスタンニル−1,2,4−トリアゾール〔Ｉ〕
（4.11g,15ミリモル）および1,2−ジクロロエタン（50m
l）をこの順序で加えた。その後直ちにピリジン（4.0m
l,50ミリモル）を加えた。室温で５分間攪拌した後、ヨ
ウ素（6.35g,25ミリモル）をテトラヒドロフラン（100m
l），ピリジン（5.5ml）および水（5.5ml）に溶解した
溶液を加えた。室温で１分間攪拌し、反応液を飽和炭酸
水素ナトリウム水溶液（50ml×３）で洗浄後、有機層を
無水硫酸マグネシウムで乾燥した。過後、液を減圧
下に濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフイ
ーに通し、クロロホルム−メタノール（10:1）により溶
出した。溶出液を濃縮乾固し、生成したあわ状固体を減
圧下乾燥し、4.84g（収率91％）のＰ−２−クロロフエ
ニル−５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジル−（３′
→５′）−３′−Ｏ−ベンゾイルチミジン〔Ｖ〕を得
た。

Rf（CHCl₃:MeOH＝10:1）＝0.57,¹ HNMR（CDCl₃,TMS）：δ1.40（s,3H,5−CH₃）， 1.82（s,3H,5−CH ₃）,2.10−2.90（m,4H,2×２′）， 3.10−3.65（m,2H,5′）,3.66（s,6H,2×CH ₃O−）， 4.05−4.70（m,4H,2×４′および５′）,5.20− 5.60（m,2H,2×３′）,6.38（ｔ−2H,J＝7.0Hz,2×
１′）， 6.60−6.90（m,4H,ph）,6.90−8.00（m,20H,2×６およ
びph）および9.88（s,2H,NＨ）ppm。

実施例２−５ 第１表−Ａに記載したデオキシヌクレオチドホスホル
スルフイド化合物〔III〕，トリアルキルスタンニルア
ゾール〔Ｉ〕，塩基〔II〕およびデオキシヌクレオチド
化合物〔IV〕を用い、実施例１と同様の操作を行い、第
１表−Ｂに記載したデオキシヌクレオチドまたはトリデ
オキシヌクレオチドを得た。

実施例６ ポリスチレン（）に担持された５′−Ｏ−ジメトキ
シトリチルチミジン（担持量120マイクロモル/g,市販
品）に1,2−ジクロロエタン中５％トリクロロ酢酸を反
応させて得たチミジンポリスチレン樹脂〔IV〕（10mg.
1.2マイクロモル）にトリエチルスタンニルイミダゾー
ル〔Ｉ〕（10mg,36マイクロモル）とジイソプロピルア
ミン〔II〕（3.64mg,36マイクロモル）の1,2−ジクロロ
エタン（0.2ml）溶液を加え、直ちに５′−Ｏ−ジメト
キシトリチルチミジン−３′−Ｏ−（２−クロロフエニ
ルオキシ−２−メチルフエニルチオ）ホスフイン〔II
I〕（20mg,24マイクロモル）の1,2−ジクロロエタン
（0.15ml）溶液を添加した。室温で４分間振盪反応させ
た後、1,2−ジクロロエタンと過剰の化合物〔Ｉ〕，〔I
I〕および〔III〕をＧ−４グラスフイルターを通して
別し、残留したポリスチレン樹脂をメタノール（3ml）
とピリジン（3ml）で洗浄した。その後テトラヒドロフ
ラン／ピリジン／水（0.45ml/0.025ml/0.025ml）混合物
中のヨウ素（30mg,120マイクロモル）を加え、室温で２
分間振盪反応させた。過剰のヨウ素を含むテトラヒドロ
フラン／ピリジン／水混合液はＧ−４グラスフイルター
を通して別され、残留したポリスチレン樹脂をピリジ
ン（5ml×２）および1,2−ジクロロエタン（5ml）で洗
浄した。その樹脂の一部のトリチルカチオンテスト（49
8nmにおける吸光度測定、このテスト方法の評価は、た
とえば H.G.Gassenら、“Chemical and Enzymatic Synthesis o
f Gene Fragments",Verlag Chemie（Wainheim）,1982年
とその引用文献を参照されたい。）は98％の収率で上記
反応が進行していることを示した。この収率は生成物の
保護基を以下に示す方法で脱保護したのち、得られた脱
保護体の高速液体クロマトグラフイー（HPLC）による分
析によつて確認された。すなわち、上記の樹脂にsyn−
４−ニトロベンズアルドキシム（50mg,300マイクロモ
ル）と1,1,3,3−テトラメチルグアニジン（34.5mg,300
マイクロモル）をｐ−ジオキサン（0.3ml）と水（0.3m
l）に溶解した溶液を加え、室温に10時間放置して反応
させた。その後、この混合物を過し、液を濃縮し、
残渣に80％酢酸（1.5ml）を加え、室温で30分間反応さ
せた。酢酸および水を減圧下留去し、残渣に水（1m
l），エーテル（5ml）を加え、脱保護体を水で抽出し
た。さらに水層をエーテル（5ml×４）で洗浄した後、
その水層のHPLC分析（第１図参照）を行つた結果、それ
はチミジンのダイマー（ｄ（TpT））とチミジン（dT）
が約98対２の割合で生成していることを示した。なお第
１図および以下の第２〜４図に示す結果は、カラムとし
てUNISIL PACK（5C18−250A型，ガスクロ工業製）を用
い、pH7.0の0.1M酢酸トリエチルアンモニウム中５〜25
％アセトニトリルで30分間の傾斜溶離により溶出して得
られるものである。

実施例７ ポリスチレン（）に担持されたジメトキシトリチル
チミジン（担持量120マイクロモル/g,市販品）に1,2−
ジクロロエタン中５％トリクロロ酢酸を反応させて得た
チミジンポリスチレン樹脂〔IV〕（10mg,1,2マイクロモ
ル）にトリ−ｎ−ブチルスタンニル−1,2,4−トリアゾ
ール〔Ｉ〕（34.4mg,96マイクロモル）と２−メチルイ
ミダゾール〔II〕（9.85mg,120マイクロモル）の1,2−
ジクロロエタン（0.20ml）溶液を加え、直ちにN⁴−ベン
ゾイル−５′−Ｏ−ジメトキシトリチルデオキシシチジ
ン−３′−Ｏ−（２−クロロフエニルオキシ−２−メチ
ルフエニルチオ）ホスフイン〔III〕（22mg,24マイクロ
モル）の1,2−ジクロロエタン（0.15ml）溶液を添加し
た。室温で４分間振盪反応させた後、 1,2−ジクロロエタンと過剰の化合物〔Ｉ〕，〔II〕お
よび〔III〕をＧ−４グラスフイルターを通して別
し、残留したポリスチレン樹脂をメタノール（3ml）と
ピリジン（3ml）で洗浄した。その後、テトラヒドロフ
ラン／ピリジン／水（0.45ml/0.025ml/0.025ml）混合物
中のヨウ素（30mg,120マイクロモル）を加え、室温で２
分間振盪反応させた。過剰のヨウ素を含むテトラヒドロ
フラン／ピリジン／水混合液はＧ−４グラスフイルター
を通して別され、残つたポリスチレン樹脂をピリジン
（5ml×２）および1,2−ジクロロエタン（5ml）で洗浄
した。その樹脂の一部のトリチルカチオンテストは98％
の収率で上記反応が進行していることを示した。この収
率は生成物の脱保護により生成した脱保護体のHPLC分析
により確認された。すなわち、上記の樹脂にsyn−４−
ニトロベンズアルドキシム（50mg,300マイクロモル）と
1,1,3,3−テトラメチルグアニジン（34.5mg,300マイク
ロモル）をＰ−ジオキサン（0.3ml）と水（0.3ml）に溶
解した溶液を加え、室温で10時間反応させた。その後、
28％アンモニア水（1ml）を加え、60℃で５時間反応さ
せた。この混合物を過し、液を濃縮し、残渣に80％
酢酸（1.5ml）を加え、室温で30分反応させた。酢酸お
よび水を減圧下留去し、残渣に水（1ml）とエーテル（5
ml）を加え、脱保護体を水で抽出した。さらに水層をエ
ーテル（5ml×４）で洗浄した後、その水層のHPLC分析
（第２図参照）を行つた結果、それはデオキシシチジン
とチミジンのダイマー（ｄ（CpT），〔Ｖ′〕）とチミ
ジン（dT）が約98対２の割合で生成していることを示し
た。

実施例８ ポリスチレン（）に担持されたチミジン〔IV〕（10
mg,1.2マイクロモル），トリ−ｎ−ブチルスタンニルベ
ンゾトリアゾール〔Ｉ〕（39mg,96マイクロモル）,1−
メチルイミダゾール〔II〕（9.85mg,120マイクロモル）
およびN⁶−ベンゾイル−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル
デオキシアデノシン−３′−Ｏ−（２−クロロフエニル
オキシ−２−メチルフエニルチオ）ホスフイン〔III〕
（23mg,24マイクロモル）とを実施例７と同様に反応さ
せ、次いで酸化反応と脱保護反応を実施例７と同様に行
い、トリチルカチオンテストとHPLC分析（第３図参照）
を行つた結果、上記反応が99％の収率で進行しているこ
とが確認され、HPLCは生成物の99％がデオキシアデノシ
ンとチミジンのダイマー（ｄ（ApT）であることを示し
た。

実施例９ ポリスチレン（）に担持されたチミジン〔IV〕（n²
＝０の場合、10mg,1.2マイクロモル），トリ−ｎ−プロ
ピルスタンニルベンゾトリアゾール〔Ｉ〕（35mg,96マ
イクロモル）,1−メチルイミダゾール〔II〕（9.85g,12
0マイクロモル）および５′−Ｏ−ジメトキシトリチル
チミジン−３′−Ｏ−（２−クロロフエニルオキシ−２
−メチルフエニルチオ）ホスフイン〔III〕（20mg,24マ
イクロモル）とを実施例６と同様に反応させた後、ヨウ
素（30mg,120マイクロモル）を含むテトラヒドロフラン
／ピリジン／水（0.45ml/0.025ml/0.025ml）混合液で実
施例６と同様に酸化反応を行つた。過剰のヨウ素を含む
混合液をＧ−４グラスフイルターを通して別し、残留
ポリスチレン樹脂をピリジン（5ml×２）で洗浄後、４
−ジメチルアミノピリジン（12.2mg,100マイクロモル）
を含む無水酢酸（0.18ml）とピリジン（1.2ml）の混合
液を加え、室温で２分間振盪し、キヤツピング反応を行
つた。過剰の上記混合液を別し、残留樹脂を1,2−ジ
クロロエタン（5ml）で洗浄し、これに1,2−ジクロロエ
タン中５％トリクロロ酢酸（2ml）を加え、室温で１分
間振盪反応させ、ジメトキシトリチル基を脱保護した。
過剰の上記試薬をＧ−４グラスフイルターを通して別
し、残留樹脂をピリジン（5ml）と1,2−ジクロロエタン
（5ml）で洗浄した。この樹脂（上記式〔IV〕でn²＝１
の場合）に化合物〔Ｉ〕〜〔III〕を上記と同量加え、
同様にカツプリング反応を行つた。さらに、酸化反応と
キヤツピング反応を上記と同様に行い、残留樹脂を1,2
−ジクロロエタン（5ml）で洗浄した。その後、1,2−ジ
クロロエタン中５％トリクロロ酢酸でジメトキシトリチ
ル基を脱保護し、上記式〔IV〕でN²＝２の場合、すなわ
ちポリスチレンに担持されたチミジンのトリマーを得
た。この操作をさらに５回（すなわち上記式〔IV〕でn²
＝７まで）くり返し、チミジンのオクタマーとしたの
ち、化合物〔Ｉ〕〜〔III〕およびヨウ素を上記と同量
用い、カツプリング反応および酸化反応を同様に行つ
た。その樹脂をピリジン（5ml×２）および1,2−ジクロ
ロエタン（5ml）で洗浄したのち、トリチルカチオンテ
ストを実施例６と同様に行つたところ、化合物〔Ｖ〕
（n²＝７の場合）が全収率85％で生成していることが確
認された。その後syn−４−ニトロベンズアルドキシム
（150mg,900マイクロモル）と1,1,3,3−テトラメチルグ
アニジン（103.5mg,900マイクロモル）を含むｐ−ジオ
キサン（0.9ml）と水（0.9ml）の混合液、さらに80％酢
酸（2ml）で実施例６と同様に脱保護した。得られた粗
生成物のHPLC分析（第４図参照）の結果、チミジンのノ
ナマーの存在が確認された。

なお本発明方法の製造中間体として用いたデオキシヌ
クレオチドホスホルスルフイド化合物〔III〕の物性値
は以下のとおりである。

〔実施例１−4,6および９〕 Rf値（CHCl₃:MeOH＝80:1）＝0.30¹ HNMR（CDCl₃,TMS）δ;1.46（s,3H,5−CH ₃）， 2.20−2.85（m,5H,2.28と2.38に一重線を含む.2′およ
びCH ₃C₆H₄S−）,3.35−3.65（m,2H,5′）,3.69（s,3H,C
H ₃OC₆H₄O−）,3.70（s,3H,CH ₃OC₆H₄O−）,4.25−4.50
（m,1H,4′）,5.45−5.80（m,1H,3′）,6.49（t,1H,J＝
7.0Hz,1′）,6.65−6.90（m,4H,ph）,6.90−7.75（m,18
H,6およびph）,10.3（s,1H,NＨ）ppm。

〔実施例５〕 Rf値（CHCl₃:MeOH＝20:1）＝0.36¹ HNMR（CDCl₃,TMS）δ;1.35（s,3H,5−CH ₃）,1.84（s,3
H,5−CH ₃）,1.90−2.85（m,7H,2.34に一重線を含む．CH
₃C₆H₄S−および２×２′）,2.85−3.65（m,2H,5′）,3.
73（s,6H,2×CH ₃OC₆H₄−）,3.95−4.70（m,4H,2×４′
および５′）5.05−5.65（m,2H,2×３′）,6.05−6.55
（m,2H,2×１′）,6.60−6.85（m,4H,ph）,6.85−7.60
（m,23H,phおよび２×６）,9.28（s,1H,NＨ）,9.36（s,
1H,NＨ）ppm。

〔実施例７〕 Rf値（CHCl₃:MeOH＝80:1）＝0.48¹ HNMR（CDCl₃,TMS）δ;2.20−2.70（m,4H,2.29と2.36に
一重線を含む.0.5×２′およびCH₃C₆H₄S−）,2.80−3.1
0（m,1H,0.5×２′）,3.40−3.90（m,8H,3.65と3.69に
一重線を含む,5′および２×CH ₃OC₆H₄−）,4.30−4.60
（m,1H,4′）,5.40−5.70（m,1H,3′）,6.36（t,1H,J＝
7.0Hz,1′）,6.65−7.70（m,26H,ph）,7.80−8.00（m,1
H,5）,8.10−8.30（m,1H,6）,10.6（s,1H,NＨ）ppm。

〔実施例８〕 Rf値（CHCl₃:MeOH＝80:1）＝0.34¹ HNMR（CDCl₃,TMS）δ;2.31（s,1.5H,0.5×CH ₃C₆H₄S
−）,2.37（s,1.5H,0.5×CH ₃C₆H₄S−）,2.55−3.25（m,
2H,2′）,3.25−3.60（m,2H,5′）,3.70（s,6H,2×CH ₃O
C₆H₄−）,4.35−4.65（m,1H,4′）,5.45−5.75（m,1H,
3′）,6.30−6.85（m,5H,1′およびph）,6.85−7.60
（m,20H,ph）,7.75−8.05（m,2H,ph）,8.05−8.20（m,1
H,2）,8.55−8.75（m,1H,8）,8.88（s,1H,NＨ）ppm。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第４図はそれぞれ実施例6,7,8および９で製造
された本発明の目的化合物オリゴデオキシヌクレオチド
（Ｖ）の脱保護生成物の高速液体クロマトグラフイーの
溶離曲線を示し、dTはチミジンを、ｄ（TpT）はチミジ
ンのダイマーを、ｄ（CpT）はデオキシシチジンとチミ
ジンのダイマーを、dApTはデオキシアデノシンとチミジ
ンのダイマーをそしてd(Tp)₈Tはチミジンのノナマーを
それぞれ意味する。

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】一般式〔Ｉ〕で示されるトリアルキルスタ
   ンニルアゾール化合物および一般式〔II〕で示される塩
   基の存在下で、一般式〔III〕で示されるデオキシヌク
   レオチドホスホルスルフイド化合物と一般式〔IV〕で示
   されるデオキシヌクレオチド化合物とを反応させた後、
   酸化反応を行なわせることを特徴とする一般式〔Ｖ〕で
   示されるオリゴデオキシヌクレオチドの製造法。 ▲R¹ ₃SnX▼ 〔Ｉ〕 （式中、R¹はアルキル基をあらわし;Xはアゾリル基をあ
   らわす。） R²▲NR³ ₂▼ 〔II〕 （式中、R²は水素原子，アルキル基またはアリール基を
   あらわし；R³はアルキル基をあらわすか、または２個の
   R³が隣接する窒素原子とともにヘテロ原子として１ない
   し２個の窒素原子，酸素原子またはイオウ原子を含有し
   てもよい複素環基をあらわすか、あるいはR²と２個のR³
   が隣接する窒素原子とともにヘテロ原子として１ないし
   ２個の窒素原子，酸素原子またはイオウ原子を含有して
   もよい複素環基をあらわす。） （式中、R⁴およびR⁵は保護基をあらわし；R⁶はアリール
   基をあらわし；B¹およびB²は同一でも異なつてもよくか
   つそれぞれ保護基を有することもある塩基残基をあらわ
   し；n¹は０または正の整数をあらわすが、ただしn¹が２
   以上の場合にはB²は同一の塩基残基に限定されない。） （式中、R⁵は前記と同じ意味をあらわし；R⁷は高分子担
   体を含有してもよい保護基をあらわし；B³およびB⁴は同
   一でも異なつてもよくかつそれぞれ保護基を有すること
   もある塩基残基をあらわし；n²は０または正の整数をあ
   らわすが、ただしn²が２以上の場合にはB⁴は同一の塩基
   残基に限定されない。） （式中、R⁴，R⁵，R⁷，B¹，B²，B³，B⁴，n¹およびn²は前
   記と同じ意味をあらわす。）