JP2508006B2 - オリゴデオキシヌクレオチドの製造法 - Google Patents
オリゴデオキシヌクレオチドの製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は遺伝子工学等の分野で有用なオリゴデオキシ
ヌクレオチドの製造法に関するものである。
ヌクレオチドの製造法に関するものである。
従来の技術 オリゴデオキシヌクレオチドを製造するための方法と
しては、現在、リン酸トリエステル法(反応式
(1))、ホスホルクロリド法(反応式(2))および
ホスホルアミダイト法(反応式(3))が広く使用され
ている(リン酸トリエステル法の詳細については、C.B.
Reese,Tetrahedron,34,3143(1978),ホスホルクロリ
ド法については、R.L.Letsingerら、J.Am.Chem.Soc.,9
7,3278(1975),またホスホルアミダイト法について
は、M.H.Carurthersら、Tetrahedron Lett.,22,1859(1
981)を参照されたい)。
しては、現在、リン酸トリエステル法(反応式
(1))、ホスホルクロリド法(反応式(2))および
ホスホルアミダイト法(反応式(3))が広く使用され
ている(リン酸トリエステル法の詳細については、C.B.
Reese,Tetrahedron,34,3143(1978),ホスホルクロリ
ド法については、R.L.Letsingerら、J.Am.Chem.Soc.,9
7,3278(1975),またホスホルアミダイト法について
は、M.H.Carurthersら、Tetrahedron Lett.,22,1859(1
981)を参照されたい)。
(式中、R4およびR5は保護基をあらわし;R7は高分子担
体を含有していてもよい保護基をあらわし、B1およびB2
は同一でも異なつてもよくかつそれぞれ保護基を有する
こともある塩基残基をあらわす。また脱水剤は2,4,6−
トリイソプロピルベンゼンスルホニルテトラゾリド等を
あらわす。) (式中、R4,R5,R7,B1およびB2は前記と同じ意味をあ
らわす。) (式中、R4,R5,R7,B1およびB2は前記と同じ意味をあ
らわし;またはR8はアルキル基等をあらわす。) 発明が解決しようとする問題点 リン酸トリエステル法を用いて、オリゴデオキシヌク
レオチドを製造する場合の利点は、製造中間体である化
合物〔VI〕が酸素および水に対して安定である故に、化
合物(VI)の取扱いおよび反応(1)の操作が簡単であ
ることである。したがつてリン酸トリエステル法がオリ
ゴデオキシヌクレオチド製造法の主流を占めてきた。し
かしこの方法には、反応(1)の反応速度がさほど大き
くないためにオリゴ体の製造に時間を要するという欠点
がある。
体を含有していてもよい保護基をあらわし、B1およびB2
は同一でも異なつてもよくかつそれぞれ保護基を有する
こともある塩基残基をあらわす。また脱水剤は2,4,6−
トリイソプロピルベンゼンスルホニルテトラゾリド等を
あらわす。) (式中、R4,R5,R7,B1およびB2は前記と同じ意味をあ
らわす。) (式中、R4,R5,R7,B1およびB2は前記と同じ意味をあ
らわし;またはR8はアルキル基等をあらわす。) 発明が解決しようとする問題点 リン酸トリエステル法を用いて、オリゴデオキシヌク
レオチドを製造する場合の利点は、製造中間体である化
合物〔VI〕が酸素および水に対して安定である故に、化
合物(VI)の取扱いおよび反応(1)の操作が簡単であ
ることである。したがつてリン酸トリエステル法がオリ
ゴデオキシヌクレオチド製造法の主流を占めてきた。し
かしこの方法には、反応(1)の反応速度がさほど大き
くないためにオリゴ体の製造に時間を要するという欠点
がある。
一方、ホスホルクロリド法およびホスホルアミダイト
法の長所は製造中間体である化合物〔IX〕および〔X〕
がアルコール性水酸基との反応、つまり化合物〔VII〕
との反応およびそれにひきつづいて行うヨウ素水等によ
る酸化反応がすみやかに進行するために、目的化合物
〔VIII〕が短時間に得られることである。しかし、上記
方法には、化合物〔IX〕および〔X〕、とりわけ化合物
〔IX〕が酸素あるいは水に対して不安定であるために、
その保存中あるいは反応(2)および(3)の操作中に
分解しないように注意を払う必要があること等の欠点が
ある。実際、化合物〔IX〕は一般に生成系からの単離が
困難であるほどの不安定さであり、また化合物〔X〕は
弱酸の存在下でさえもP−N結合が容易に切断される程
度に不安定であることが知られている。
法の長所は製造中間体である化合物〔IX〕および〔X〕
がアルコール性水酸基との反応、つまり化合物〔VII〕
との反応およびそれにひきつづいて行うヨウ素水等によ
る酸化反応がすみやかに進行するために、目的化合物
〔VIII〕が短時間に得られることである。しかし、上記
方法には、化合物〔IX〕および〔X〕、とりわけ化合物
〔IX〕が酸素あるいは水に対して不安定であるために、
その保存中あるいは反応(2)および(3)の操作中に
分解しないように注意を払う必要があること等の欠点が
ある。実際、化合物〔IX〕は一般に生成系からの単離が
困難であるほどの不安定さであり、また化合物〔X〕は
弱酸の存在下でさえもP−N結合が容易に切断される程
度に不安定であることが知られている。
問題点を解決するための手段、作用および効果 本発明者らは、上述のごとき従来技術の状況にかんが
み、安定な製造中間体を用いてかつすみやかにオリゴデ
オキシヌクレオチドを与える方法を開発することを目的
として鋭意研究を重ねた結果、反応(4)に示す方法が
この目的を有利に達成することを見い出して本発明を完
成した。
み、安定な製造中間体を用いてかつすみやかにオリゴデ
オキシヌクレオチドを与える方法を開発することを目的
として鋭意研究を重ねた結果、反応(4)に示す方法が
この目的を有利に達成することを見い出して本発明を完
成した。
したがつて本発明は、上述したようなオリゴデオキシ
ヌクレオチド製造のための方法の利点、すなわち安定で
取扱いが容易な製造中間体を用いかつすみやかな反応に
よるオリゴデオキシヌクレオチドの製造法に関するもの
であり、具体的には、一般式〔I〕で示されるトリアル
キルスタンニルアゾール化合物および一般式〔II〕で示
される塩基の存在下で、一般式〔III〕で示されるデオ
キシヌクレオチドホスホルスルフイド化合物と一般式
〔IV〕で示されるデオキシヌクレオチド化合物とを反応
させた後、酸化反応を行なわせることを特徴とする一般
式〔V〕で示されるオリゴデオキシヌクレオチドの製造
法を提供するものである。
ヌクレオチド製造のための方法の利点、すなわち安定で
取扱いが容易な製造中間体を用いかつすみやかな反応に
よるオリゴデオキシヌクレオチドの製造法に関するもの
であり、具体的には、一般式〔I〕で示されるトリアル
キルスタンニルアゾール化合物および一般式〔II〕で示
される塩基の存在下で、一般式〔III〕で示されるデオ
キシヌクレオチドホスホルスルフイド化合物と一般式
〔IV〕で示されるデオキシヌクレオチド化合物とを反応
させた後、酸化反応を行なわせることを特徴とする一般
式〔V〕で示されるオリゴデオキシヌクレオチドの製造
法を提供するものである。
▲R1 3SnX▼ 〔I〕 (式中、R1はアルキル基をあらわし;Xはアゾリル基をあ
らわす。) R2▲NR3 2▼ 〔II〕 (式中、R2は水素原子,アルキル基またはアリール基を
あらわし;R3はアルキル基をあらわすか、または2個の
R3が隣接する窒素原子とともにヘテロ原子として1ない
し2個の窒素原子,酸素原子またはイオウ原子を含有し
てもよい複素環基をあらわすかあるいはR2と2個のR3が
隣接する窒素原子とともにヘテロ原子として1ないし2
個の窒素原子、酸素原子またはイオウ原子を含有しても
よい複素環基をあらわす。) (式中、R4およびR5は保護基をあらわし;R6はアリール
基をあらわし;B1およびB2は同一でも異なつてもよくか
つそれぞれ保護基を有することもある塩基残基をあらわ
し;n1は0または正の整数をあらわすが、ただしn1が2
以上の場合にはB2は同一の塩基残基に限定されない。) (式中、R5は前記と同じ意味をあらわし;R7は高分子担
体を含有していてもよい保護基をあらわし;B3およびB4
は同一でも異なつてもよくかつそれぞれ保護基を有する
こともある塩基残基をあらわし;n2は0または正の整数
をあらわすが、ただしn2が2以上の場合にはB4は同一の
塩基残基に限定されない。) (式中、R4,R5,R7,B1,B2,B3,B4,n1およびn2は前
記と同じ意味をあらわす。) したがつて、本発明に従う反応は反応式(4)で表わ
すことができる。
らわす。) R2▲NR3 2▼ 〔II〕 (式中、R2は水素原子,アルキル基またはアリール基を
あらわし;R3はアルキル基をあらわすか、または2個の
R3が隣接する窒素原子とともにヘテロ原子として1ない
し2個の窒素原子,酸素原子またはイオウ原子を含有し
てもよい複素環基をあらわすかあるいはR2と2個のR3が
隣接する窒素原子とともにヘテロ原子として1ないし2
個の窒素原子、酸素原子またはイオウ原子を含有しても
よい複素環基をあらわす。) (式中、R4およびR5は保護基をあらわし;R6はアリール
基をあらわし;B1およびB2は同一でも異なつてもよくか
つそれぞれ保護基を有することもある塩基残基をあらわ
し;n1は0または正の整数をあらわすが、ただしn1が2
以上の場合にはB2は同一の塩基残基に限定されない。) (式中、R5は前記と同じ意味をあらわし;R7は高分子担
体を含有していてもよい保護基をあらわし;B3およびB4
は同一でも異なつてもよくかつそれぞれ保護基を有する
こともある塩基残基をあらわし;n2は0または正の整数
をあらわすが、ただしn2が2以上の場合にはB4は同一の
塩基残基に限定されない。) (式中、R4,R5,R7,B1,B2,B3,B4,n1およびn2は前
記と同じ意味をあらわす。) したがつて、本発明に従う反応は反応式(4)で表わ
すことができる。
一般式〔I〕で示されるトリアルキルスタンニルアゾ
ール化合物について説明すると、その有機基R1はアルキ
ル基であればよく、具体的にはメチル基,エチル基,n−
プロピル基,n−ブチル基等の第一級アルキル基,i−プロ
ピル基,s−ブチル基等の第二級アルキル基,t−ブチル基
等の第三級アルキル基等を挙げることができる。これら
のアルキル基のうちで化合物(I)のR1としてどれを用
いるかについては化合物〔I〕の製造の容易さおよびそ
の安定性等を考慮して決めればよく、特に限定されない
が、それが容易で良好な安定性を与えるエチル基,n−プ
ロピル基およびn−ブチル基が好んで用いられる。また
アゾリル基Xとしては、イミダゾリル基,3−ニトロイミ
ダゾリル基,ベンズイミダゾリル基,1,2,3−トリアゾリ
ル基.1,2,4−トリアゾリル基,3−ニトロ−1,2,4−トリ
アゾリル基,ベンゾトリアゾリル基,5−クロロベンゾト
リアゾリル基,5−ニトロベンゾトリアゾリル基,テトラ
ゾリル基等を挙げることができる。これらのアゾリル基
のうちで化合物〔I〕のXとしてどれを用いるかについ
ては限定的ではないが、一般には化合物〔I〕の製造の
容易さおよび反応(4)を良好に進行させる程度によつ
て決められ、それが容易でかつ良好な進行性を与えるイ
ミダゾリル基.1,2,3−トリアゾリル基,1,2,4−トリアゾ
リル基,ベンゾトリアゾリル基およびテトラゾリル基等
が好んで用いられる。化合物〔I〕は本発明者らがすで
に示した方法、すなわち反応(5)により容易に製造す
ることができる(特願昭60−165858号明細書(特開昭62
−026286号)参照)。
ール化合物について説明すると、その有機基R1はアルキ
ル基であればよく、具体的にはメチル基,エチル基,n−
プロピル基,n−ブチル基等の第一級アルキル基,i−プロ
ピル基,s−ブチル基等の第二級アルキル基,t−ブチル基
等の第三級アルキル基等を挙げることができる。これら
のアルキル基のうちで化合物(I)のR1としてどれを用
いるかについては化合物〔I〕の製造の容易さおよびそ
の安定性等を考慮して決めればよく、特に限定されない
が、それが容易で良好な安定性を与えるエチル基,n−プ
ロピル基およびn−ブチル基が好んで用いられる。また
アゾリル基Xとしては、イミダゾリル基,3−ニトロイミ
ダゾリル基,ベンズイミダゾリル基,1,2,3−トリアゾリ
ル基.1,2,4−トリアゾリル基,3−ニトロ−1,2,4−トリ
アゾリル基,ベンゾトリアゾリル基,5−クロロベンゾト
リアゾリル基,5−ニトロベンゾトリアゾリル基,テトラ
ゾリル基等を挙げることができる。これらのアゾリル基
のうちで化合物〔I〕のXとしてどれを用いるかについ
ては限定的ではないが、一般には化合物〔I〕の製造の
容易さおよび反応(4)を良好に進行させる程度によつ
て決められ、それが容易でかつ良好な進行性を与えるイ
ミダゾリル基.1,2,3−トリアゾリル基,1,2,4−トリアゾ
リル基,ベンゾトリアゾリル基およびテトラゾリル基等
が好んで用いられる。化合物〔I〕は本発明者らがすで
に示した方法、すなわち反応(5)により容易に製造す
ることができる(特願昭60−165858号明細書(特開昭62
−026286号)参照)。
(式中、R1およびXは前記と同じ意味をあらわす。) 本発明方法の反応(4)に用いられる一般式〔II〕で
示される塩基について説明すると、化合物〔II〕はその
R2が水素原子,アルキル基(たとえばメチル基,エチル
基,n−プロピル基.i−プロピル基,n−ブチル基等)また
はアリール基(たとえばフエニル基,4−メチルフエニル
基等)であるときに、R3はアルキル基(たとえばメチル
基,エチル基,n−プロピル基,i−プロピル基,n−ブチル
基等)であるかあるいは2個のR3が隣接する窒素原子と
一体となつて1ないし2個の窒素原子,酸素原子または
イオウ原子を含有してもよい複素環基(たとえばピペリ
ジノ基,2,6−ジメチルピペリジノ基,ピロリル基,モル
ホリノ基,チオモルホリノ基,イミダゾリル基,2−メチ
ルイミダゾリル基,ベンズイミダゾリル基,1,2,4−トリ
アゾリル基,3−メチル−1,2,4−トリアゾリル基等)を
形成するようなものを挙げることができ、またさらに化
合物〔II〕としてはR2と2個のR3とが隣接する窒素原子
と一体となつてヘテロ原子として1ないし2個の窒素原
子,酸素原子またイオウ原子を含有してもよい複素環
(たとえばピリジン,2,6−ジメチルピリジン,4−ジメチ
ルアミノピリジン,オキサゾール,チアゾール,ピリミ
ジン,ピラジン,キノリン,s−トリアジン等)化合物を
挙げることもできる。これら化合物〔II〕の中から、反
応(4)のためにどれを用いるかについては限定的では
ないが、そのpKaが5〜12の範囲のものが好んで用いら
れる。
示される塩基について説明すると、化合物〔II〕はその
R2が水素原子,アルキル基(たとえばメチル基,エチル
基,n−プロピル基.i−プロピル基,n−ブチル基等)また
はアリール基(たとえばフエニル基,4−メチルフエニル
基等)であるときに、R3はアルキル基(たとえばメチル
基,エチル基,n−プロピル基,i−プロピル基,n−ブチル
基等)であるかあるいは2個のR3が隣接する窒素原子と
一体となつて1ないし2個の窒素原子,酸素原子または
イオウ原子を含有してもよい複素環基(たとえばピペリ
ジノ基,2,6−ジメチルピペリジノ基,ピロリル基,モル
ホリノ基,チオモルホリノ基,イミダゾリル基,2−メチ
ルイミダゾリル基,ベンズイミダゾリル基,1,2,4−トリ
アゾリル基,3−メチル−1,2,4−トリアゾリル基等)を
形成するようなものを挙げることができ、またさらに化
合物〔II〕としてはR2と2個のR3とが隣接する窒素原子
と一体となつてヘテロ原子として1ないし2個の窒素原
子,酸素原子またイオウ原子を含有してもよい複素環
(たとえばピリジン,2,6−ジメチルピリジン,4−ジメチ
ルアミノピリジン,オキサゾール,チアゾール,ピリミ
ジン,ピラジン,キノリン,s−トリアジン等)化合物を
挙げることもできる。これら化合物〔II〕の中から、反
応(4)のためにどれを用いるかについては限定的では
ないが、そのpKaが5〜12の範囲のものが好んで用いら
れる。
つぎに一般式〔III〕で示されるデオキシヌクレオチ
ドホスホルスルフイド化合物について説明すると、その
保護基R4は基本的にはすべてのヒドロキシ保護基が可能
である。具体的にはオリゴデオキシヌクレオチドを製造
する際にその有用性が認められたヒドロキシ保護基、た
とてばトリフエニルメチル基,4−メトキシトリフエニル
メチル基,4,4′−ジメトキシトリフエニルメチル基等の
トリアリールメチル基,ピキシル基(すなわち9−フエ
ニルキサンテン−9−イル基),アルコキシカルボニル
基,アリールオキシカルボニル基,アリールチオアルキ
ルオキシカルボニル基,さらにt−ブチルジメチルシリ
ル基のようなトリアルキルシリル基等を挙げることがで
きる。これらのヒドロキシ保護基の中から化合物〔II
I〕のR4としてどれを選ぶかについては限定的ではない
が、トリアリールメチル基はそれらの導入と脱保護が容
易である点で好ましく使用し得るものである。
ドホスホルスルフイド化合物について説明すると、その
保護基R4は基本的にはすべてのヒドロキシ保護基が可能
である。具体的にはオリゴデオキシヌクレオチドを製造
する際にその有用性が認められたヒドロキシ保護基、た
とてばトリフエニルメチル基,4−メトキシトリフエニル
メチル基,4,4′−ジメトキシトリフエニルメチル基等の
トリアリールメチル基,ピキシル基(すなわち9−フエ
ニルキサンテン−9−イル基),アルコキシカルボニル
基,アリールオキシカルボニル基,アリールチオアルキ
ルオキシカルボニル基,さらにt−ブチルジメチルシリ
ル基のようなトリアルキルシリル基等を挙げることがで
きる。これらのヒドロキシ保護基の中から化合物〔II
I〕のR4としてどれを選ぶかについては限定的ではない
が、トリアリールメチル基はそれらの導入と脱保護が容
易である点で好ましく使用し得るものである。
また化合物〔III〕の有機基R5としては、基本的には
すべてのリン酸塩保護基が可能である。具体的にはオリ
ゴヌクレオチドを製造するために開発された保護基、た
とえば炭素数が5までの低級アルキル基、シアノアルキ
ル基,ハロアルキル基,アリールスルホニルアルキル
基,アリル基,アリール基およびハロアリール基等を挙
げることができる。これらのうちで化合物〔III〕のR5
としてどれを選ぶかについては限定的ではないが、オリ
ゴヌクレオチド製造のためのリン酸塩保護基としてその
有用性が確認されているメチル基,β−シアノエチル
基,アリル基および2−クロロフエニル基が好んで用い
られる。
すべてのリン酸塩保護基が可能である。具体的にはオリ
ゴヌクレオチドを製造するために開発された保護基、た
とえば炭素数が5までの低級アルキル基、シアノアルキ
ル基,ハロアルキル基,アリールスルホニルアルキル
基,アリル基,アリール基およびハロアリール基等を挙
げることができる。これらのうちで化合物〔III〕のR5
としてどれを選ぶかについては限定的ではないが、オリ
ゴヌクレオチド製造のためのリン酸塩保護基としてその
有用性が確認されているメチル基,β−シアノエチル
基,アリル基および2−クロロフエニル基が好んで用い
られる。
つぎに化合物〔III〕の有機基R6について説明する
と、それはアリール基であればよく、具体的にはフエニ
ル基,2−メチルフエニル基,4−メチルフエニル基,2,4−
ジメチルフエニル基,2,6−ジメチルフエニル基,2,4,6−
トリメチルフエニル基,2−クロロフエニル基,4−ニトロ
フエニル基,3,4−ジクロロフエニル基,α−ナフチル基
等を挙げることができる。これらのアリール基のうちで
R6としてどれを選ぶかについては化合物〔IV〕における
保護基R5の種類等により異なるので限定することはでき
ないが、化合物〔III〕の製造の容易さおよび安定性等
を考慮すると、一般にそれが容易でかつ良好な安定性を
与える2−メチルフエニル基,2,6−ジメチルフエニル基
等の2−位に置換基をもつアリール基が好んで用いられ
る。
と、それはアリール基であればよく、具体的にはフエニ
ル基,2−メチルフエニル基,4−メチルフエニル基,2,4−
ジメチルフエニル基,2,6−ジメチルフエニル基,2,4,6−
トリメチルフエニル基,2−クロロフエニル基,4−ニトロ
フエニル基,3,4−ジクロロフエニル基,α−ナフチル基
等を挙げることができる。これらのアリール基のうちで
R6としてどれを選ぶかについては化合物〔IV〕における
保護基R5の種類等により異なるので限定することはでき
ないが、化合物〔III〕の製造の容易さおよび安定性等
を考慮すると、一般にそれが容易でかつ良好な安定性を
与える2−メチルフエニル基,2,6−ジメチルフエニル基
等の2−位に置換基をもつアリール基が好んで用いられ
る。
つぎに化合物〔III〕における塩基残基、B1およびB2
について説明すると、代表的なものとしては一般式〔X
I〕で示される3位に保護基を有することもあるチミン
残基、一般式〔XII〕で示される4位のアミノ基に保護
基を有することもあるシトシン残基、一般式〔XIII〕で
示される6位のアミノ基に保護基を有することもあるア
デニン残基、一般式〔XIV〕で示される1,2,6位のアミド
基,アミノ基およびケト基に保護基を有することもある
グアニン残基等を挙げることができる。
について説明すると、代表的なものとしては一般式〔X
I〕で示される3位に保護基を有することもあるチミン
残基、一般式〔XII〕で示される4位のアミノ基に保護
基を有することもあるシトシン残基、一般式〔XIII〕で
示される6位のアミノ基に保護基を有することもあるア
デニン残基、一般式〔XIV〕で示される1,2,6位のアミド
基,アミノ基およびケト基に保護基を有することもある
グアニン残基等を挙げることができる。
これら塩基の保護基としては、オリゴヌクレオチド製
造に際してその有用性が認められたトリアリールメチル
基.トリアルキルシリルアルキル基,アリールチオアル
キル基,フタロイル基,アリールオキシカルボニル基,
アルコキシカルボニル基,ジアリールカルバモイル基,
アリールカルボニル基,アルキルカルボニル基,アリル
基等を挙げることができる(一般式〔XI〕〜〔XIV〕で
示される塩基残基にどの保護基を用いるかについては、
すでに多くの報文や総説に示されている。たとえば、畑
辻明ら、有機合成化学協会誌,42,429(1984)を参照さ
れたい)。
造に際してその有用性が認められたトリアリールメチル
基.トリアルキルシリルアルキル基,アリールチオアル
キル基,フタロイル基,アリールオキシカルボニル基,
アルコキシカルボニル基,ジアリールカルバモイル基,
アリールカルボニル基,アルキルカルボニル基,アリル
基等を挙げることができる(一般式〔XI〕〜〔XIV〕で
示される塩基残基にどの保護基を用いるかについては、
すでに多くの報文や総説に示されている。たとえば、畑
辻明ら、有機合成化学協会誌,42,429(1984)を参照さ
れたい)。
つぎに化合物〔III〕のn1について説明すると、それ
は0または正の整数が可能である。オリゴデオキシヌク
レオチドの製造中間体として化合物〔III〕のn1を実際
にどの数にするかということについては限定することが
できないが、化合物(III)の製造の容易さから判断す
ると、それが容易な0あるいは1の場合が一般的であ
り、、好んで用いられる。
は0または正の整数が可能である。オリゴデオキシヌク
レオチドの製造中間体として化合物〔III〕のn1を実際
にどの数にするかということについては限定することが
できないが、化合物(III)の製造の容易さから判断す
ると、それが容易な0あるいは1の場合が一般的であ
り、、好んで用いられる。
一般式〔III〕で示されるホスホルスルフイド化合物
は、反応式(6)に示すように、一般式〔XV〕で示され
るデオキシヌクレオチドと一般式〔XVI〕で示される1,
2,4−トリアゾリルホスフイン化合物との反応により製
造することができる(製造法の詳細については本出願人
自身の出願に係る特願昭60−245326号(特開昭62−2018
95号)および昭和61年7月23日付出願の特願昭61−1718
25号(特開昭63−30479号)明細書を参照された
い。)。
は、反応式(6)に示すように、一般式〔XV〕で示され
るデオキシヌクレオチドと一般式〔XVI〕で示される1,
2,4−トリアゾリルホスフイン化合物との反応により製
造することができる(製造法の詳細については本出願人
自身の出願に係る特願昭60−245326号(特開昭62−2018
95号)および昭和61年7月23日付出願の特願昭61−1718
25号(特開昭63−30479号)明細書を参照された
い。)。
(式中、R4,R5,R6,B1,B2およびn1は前記と同じ意味
をあらわす。) つぎに一般式〔IV〕で示されるデオキシヌクレオチド
化合物について説明すると、その有機基R5は上述したよ
うなリン酸塩保護基であり、また塩基残基B3およびB4は
一般式〔XI〕〜〔XIV〕に示した構造をもち、上述した
ような保護基を有することもある塩基残基である。また
化合物〔IV〕の有機基R7は基本的にはオリゴデオキシヌ
クレオチドを製造するために開発された3′−ヒドロキ
シ保護基が可能である。具体的にはアセチル基,ベンゾ
イル基,レブリニル基,t−ブチルジメチルシリル基ある
いは一般式〔XVII〕で示される構造をもつ有機基等が挙
げられる。
をあらわす。) つぎに一般式〔IV〕で示されるデオキシヌクレオチド
化合物について説明すると、その有機基R5は上述したよ
うなリン酸塩保護基であり、また塩基残基B3およびB4は
一般式〔XI〕〜〔XIV〕に示した構造をもち、上述した
ような保護基を有することもある塩基残基である。また
化合物〔IV〕の有機基R7は基本的にはオリゴデオキシヌ
クレオチドを製造するために開発された3′−ヒドロキ
シ保護基が可能である。具体的にはアセチル基,ベンゾ
イル基,レブリニル基,t−ブチルジメチルシリル基ある
いは一般式〔XVII〕で示される構造をもつ有機基等が挙
げられる。
−Y1−NHCO−Y2−CO− 〔XVII〕 (式中、は高分子担体をあらわし;Y1およびY2は隣接
する高分子担体,アミド基およびカルボニル基と共有結
合をすることができる有機基をあらわす。) 高分子担体としてはシリカゲル,ポリスチレン等が挙
げられる。またY1とY2は限定的ではないが、炭素数が1
〜10までのアルキレン基がしばしば用いられる。上述の
保護基のうちで化合物〔IV〕のR7としてどれを選ぶかは
反応(4)の反応形態によつて決められる。すなわち化
合物〔III〕と〔IV〕を反応溶媒に溶解し、いわゆる液
相均一反応を行わせてオリゴデオキシヌクレオチドを製
造する場合には、アセチル基,ベンゾイル基,t−ブチル
ジメチルシリル基等が用いられる。また化合物〔III〕
と〔IV〕を固相不均一系で反応させてオリゴ体を製造す
る場合には、有機基〔XVII〕が用いられる。
する高分子担体,アミド基およびカルボニル基と共有結
合をすることができる有機基をあらわす。) 高分子担体としてはシリカゲル,ポリスチレン等が挙
げられる。またY1とY2は限定的ではないが、炭素数が1
〜10までのアルキレン基がしばしば用いられる。上述の
保護基のうちで化合物〔IV〕のR7としてどれを選ぶかは
反応(4)の反応形態によつて決められる。すなわち化
合物〔III〕と〔IV〕を反応溶媒に溶解し、いわゆる液
相均一反応を行わせてオリゴデオキシヌクレオチドを製
造する場合には、アセチル基,ベンゾイル基,t−ブチル
ジメチルシリル基等が用いられる。また化合物〔III〕
と〔IV〕を固相不均一系で反応させてオリゴ体を製造す
る場合には、有機基〔XVII〕が用いられる。
化合物〔IV〕のn2は製造しようとするオリゴデオキシ
ヌクレオチドの長さにより決まるが一般に上述した液相
法によりオリゴ体を製造する場合は、n2は0〜30の範囲
が、また固相法によりそれを製造する際には、0〜200
の範囲が一般的である。
ヌクレオチドの長さにより決まるが一般に上述した液相
法によりオリゴ体を製造する場合は、n2は0〜30の範囲
が、また固相法によりそれを製造する際には、0〜200
の範囲が一般的である。
本発明にしたがう反応(4)は、通常は化合物〔I〕
および化合物〔II〕の存在下で化合物〔III〕と〔IV〕
とのカツプリング反応を行わせ、次いでそのカツプリン
グ生成物のリン原子を酸化する反応からなる。まず化合
物〔III〕と〔IV〕とのカツプリング反応について説明
すると、当該反応は有機溶媒中で円滑に進行し、かかる
溶媒としては塩化メチレン,クロロホルム,1,1−ジクロ
ロエタン,1,2−ジクロロエタン,テトラヒドロフラン,p
−ジオキサン,ベンゼン,トルエン等を挙げることがで
きる。これらの溶媒は、使用に際して適当な乾燥剤で乾
燥後、蒸留等により精製したものを用いた方がよい。反
応は通常は室温で行わせるが、0°〜35℃の範囲で行つ
てもよい。また化合物〔I〕〜化合物〔IV〕の各モル比
は、化合物〔IV〕の1当量に対して化合物〔I〕を1〜
100倍当量、化合物〔II〕を1〜200倍当量、化合物〔II
I〕を1〜40倍当量用いるのが一般的である。当該反応
は概して1時間以内で終結するが、化合物〔IV〕の保護
基R7がアセチル基,ベンゾイル基,レブリニル基あるい
はt−ブチルジメチルシリル基等の場合、すなわち上述
したように液相反応である場合には、その終結は薄層ク
ロマトグラフイー(TLC)や1HNMR等により確認すること
ができるので、それを確認してから酸化反応を行うのが
よい。また化合物〔IV〕のR7が一般式〔XVII〕で示され
る有機基である場合、つまり上述したように固相反応系
である場合には、TLCや1HNMR等により反応の終結を知る
ことができないので、通常は上記カツプリング反応を一
定時間行わせた後に酸化反応を行い、生成したオリゴデ
オキシヌクレオチド化合物〔VI〕の保護基R4を脱保護
し、その生成量から反応終結時間が決められる。この際
R4がジメトキシトリチル基あるいはモノメトキシトリチ
ル基等のトリアリールメチル誘導体の場合は、酸による
脱保護の際に生ずるトリチルカチオンの吸光度(いわゆ
るトリチルカチオンテストであり、ジメトキシトリチル
カチオンは498nm,モノメトキシトリチルカチオンは475n
mにおけるもの)を測定することにより、容易にそれを
決めることができる。
および化合物〔II〕の存在下で化合物〔III〕と〔IV〕
とのカツプリング反応を行わせ、次いでそのカツプリン
グ生成物のリン原子を酸化する反応からなる。まず化合
物〔III〕と〔IV〕とのカツプリング反応について説明
すると、当該反応は有機溶媒中で円滑に進行し、かかる
溶媒としては塩化メチレン,クロロホルム,1,1−ジクロ
ロエタン,1,2−ジクロロエタン,テトラヒドロフラン,p
−ジオキサン,ベンゼン,トルエン等を挙げることがで
きる。これらの溶媒は、使用に際して適当な乾燥剤で乾
燥後、蒸留等により精製したものを用いた方がよい。反
応は通常は室温で行わせるが、0°〜35℃の範囲で行つ
てもよい。また化合物〔I〕〜化合物〔IV〕の各モル比
は、化合物〔IV〕の1当量に対して化合物〔I〕を1〜
100倍当量、化合物〔II〕を1〜200倍当量、化合物〔II
I〕を1〜40倍当量用いるのが一般的である。当該反応
は概して1時間以内で終結するが、化合物〔IV〕の保護
基R7がアセチル基,ベンゾイル基,レブリニル基あるい
はt−ブチルジメチルシリル基等の場合、すなわち上述
したように液相反応である場合には、その終結は薄層ク
ロマトグラフイー(TLC)や1HNMR等により確認すること
ができるので、それを確認してから酸化反応を行うのが
よい。また化合物〔IV〕のR7が一般式〔XVII〕で示され
る有機基である場合、つまり上述したように固相反応系
である場合には、TLCや1HNMR等により反応の終結を知る
ことができないので、通常は上記カツプリング反応を一
定時間行わせた後に酸化反応を行い、生成したオリゴデ
オキシヌクレオチド化合物〔VI〕の保護基R4を脱保護
し、その生成量から反応終結時間が決められる。この際
R4がジメトキシトリチル基あるいはモノメトキシトリチ
ル基等のトリアリールメチル誘導体の場合は、酸による
脱保護の際に生ずるトリチルカチオンの吸光度(いわゆ
るトリチルカチオンテストであり、ジメトキシトリチル
カチオンは498nm,モノメトキシトリチルカチオンは475n
mにおけるもの)を測定することにより、容易にそれを
決めることができる。
つぎに本発明にしたがう反応(4)における酸化反応
について説明すると、当該反応はヨウ素−水系.m−クロ
ロ過安息香酸,ヨードベンゼンジアセテートあるいは酸
化窒素等を用いて行うことができる。これらの試薬のう
ちで、反応(4)の酸化反応のために、どれを用いるか
については限定的ではないが、ヨウ素−水系はその入手
が容易でかつ安価であることから好ましく用いられる。
この場合の酸化反応は−78°〜35℃の範囲で、化合物
〔IV〕に対して1〜200倍用い、1〜5分間反応させる
のがよい。
について説明すると、当該反応はヨウ素−水系.m−クロ
ロ過安息香酸,ヨードベンゼンジアセテートあるいは酸
化窒素等を用いて行うことができる。これらの試薬のう
ちで、反応(4)の酸化反応のために、どれを用いるか
については限定的ではないが、ヨウ素−水系はその入手
が容易でかつ安価であることから好ましく用いられる。
この場合の酸化反応は−78°〜35℃の範囲で、化合物
〔IV〕に対して1〜200倍用い、1〜5分間反応させる
のがよい。
このように反応(4)により製造したオリゴデオキシ
ヌクレオチド化合物〔V〕よりもさらに長鎖のオリゴ体
を製造したい場合には、化合物〔V〕の保護基R4を既知
の方法により選択的に脱離させ(R4がジメトキシトリチ
ル基やモノメトキシトリチル基のようなトリアリールメ
チル誘導体の場合には、ベンゼンスルホン酸,ジクロロ
酢酸,トリクロロ酢酸のようなプロトン酸や臭化亜鉛の
ようなルイス酸がしばしば用いられる),化合物〔XVII
I〕としたのち、これを化合物〔IV〕の代りに用いて反
応(4)を行えばよい。
ヌクレオチド化合物〔V〕よりもさらに長鎖のオリゴ体
を製造したい場合には、化合物〔V〕の保護基R4を既知
の方法により選択的に脱離させ(R4がジメトキシトリチ
ル基やモノメトキシトリチル基のようなトリアリールメ
チル誘導体の場合には、ベンゼンスルホン酸,ジクロロ
酢酸,トリクロロ酢酸のようなプロトン酸や臭化亜鉛の
ようなルイス酸がしばしば用いられる),化合物〔XVII
I〕としたのち、これを化合物〔IV〕の代りに用いて反
応(4)を行えばよい。
この場合、上述した液相法では、化合物〔XVIII〕を
シリカゲルクロマトグラフイー等により単離、精製した
後、これと化合物〔III〕とを反応させるのが一般的で
ある。
シリカゲルクロマトグラフイー等により単離、精製した
後、これと化合物〔III〕とを反応させるのが一般的で
ある。
一方、固相法の場合には、化合物〔XVIII〕を単離、
精製することができないので、通常は化合物〔V〕の保
護基R4を脱離させて化合物〔XVIII〕とする前に、反応
(4)で未反応となつた化合物〔IV〕の5′−OH基を適
当な方法でいわゆるキヤツピング(capping)してか
ら、保護基R4を脱離させた後、化合物〔III〕と反応さ
せる方法がとられる。
精製することができないので、通常は化合物〔V〕の保
護基R4を脱離させて化合物〔XVIII〕とする前に、反応
(4)で未反応となつた化合物〔IV〕の5′−OH基を適
当な方法でいわゆるキヤツピング(capping)してか
ら、保護基R4を脱離させた後、化合物〔III〕と反応さ
せる方法がとられる。
(式中、R5,R7,B1,B2,B3,B4,n1およびn2は前記と
同じ意味をあらわす。) 上記のキヤツピング反応は、基本的には化合物〔IV〕
の5−OH基と安定な化学結合を形成するような反応であ
ればよくたとえば、無水酢酸−塩基(ピリジンあるいは
2,6−ジメチルピリジンと4−ジメチルアミノピリジン
の組み合せがしばしば用いられる)系によるエステル化
反応がしばしば用いられる。
同じ意味をあらわす。) 上記のキヤツピング反応は、基本的には化合物〔IV〕
の5−OH基と安定な化学結合を形成するような反応であ
ればよくたとえば、無水酢酸−塩基(ピリジンあるいは
2,6−ジメチルピリジンと4−ジメチルアミノピリジン
の組み合せがしばしば用いられる)系によるエステル化
反応がしばしば用いられる。
なお本明細書において用いられる略号の意味はつぎの
とおりである。
とおりである。
Et;エチル基,n−Pr;n−プロピル基,n−Bu;n−ブチル基,
Bz;ベンゾイル基,TBDMS;t−ブチルジメチルシリル基,DM
Tr;4,4′−ジメトキシトリチル基,MMTr;4−モノメトキ
シトリチル基,T;チミン残基,Cbz;N4−ベンゾイルシト
シン残基,Abz;N6−ベンゾイルアデニン残基,Gib;N2
−イソブチリルグアニン残基。
Bz;ベンゾイル基,TBDMS;t−ブチルジメチルシリル基,DM
Tr;4,4′−ジメトキシトリチル基,MMTr;4−モノメトキ
シトリチル基,T;チミン残基,Cbz;N4−ベンゾイルシト
シン残基,Abz;N6−ベンゾイルアデニン残基,Gib;N2
−イソブチリルグアニン残基。
実施例 以下実施例によつて、本発明を具体的に説明するが、
本発明は実施例に限定されるものではない。
本発明は実施例に限定されるものではない。
実施例1 3′−O−ベンゾイルチミジン〔IV〕(1.73g,5ミリ
モル)に、5′−O−ジメトキシトリチルチミジン−
3′−O−(2−クロロフエニルオキシ−2−メチルフ
エニルチオ)ホスフイン〔III〕(5.78g,7ミリモル),
トリエチルスタンニル−1,2,4−トリアゾール〔I〕
(4.11g,15ミリモル)および1,2−ジクロロエタン(50m
l)をこの順序で加えた。その後直ちにピリジン(4.0m
l,50ミリモル)を加えた。室温で5分間攪拌した後、ヨ
ウ素(6.35g,25ミリモル)をテトラヒドロフラン(100m
l),ピリジン(5.5ml)および水(5.5ml)に溶解した
溶液を加えた。室温で1分間攪拌し、反応液を飽和炭酸
水素ナトリウム水溶液(50ml×3)で洗浄後、有機層を
無水硫酸マグネシウムで乾燥した。過後、液を減圧
下に濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフイ
ーに通し、クロロホルム−メタノール(10:1)により溶
出した。溶出液を濃縮乾固し、生成したあわ状固体を減
圧下乾燥し、4.84g(収率91%)のP−2−クロロフエ
ニル−5′−O−ジメトキシトリチルチミジル−(3′
→5′)−3′−O−ベンゾイルチミジン〔V〕を得
た。
モル)に、5′−O−ジメトキシトリチルチミジン−
3′−O−(2−クロロフエニルオキシ−2−メチルフ
エニルチオ)ホスフイン〔III〕(5.78g,7ミリモル),
トリエチルスタンニル−1,2,4−トリアゾール〔I〕
(4.11g,15ミリモル)および1,2−ジクロロエタン(50m
l)をこの順序で加えた。その後直ちにピリジン(4.0m
l,50ミリモル)を加えた。室温で5分間攪拌した後、ヨ
ウ素(6.35g,25ミリモル)をテトラヒドロフラン(100m
l),ピリジン(5.5ml)および水(5.5ml)に溶解した
溶液を加えた。室温で1分間攪拌し、反応液を飽和炭酸
水素ナトリウム水溶液(50ml×3)で洗浄後、有機層を
無水硫酸マグネシウムで乾燥した。過後、液を減圧
下に濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフイ
ーに通し、クロロホルム−メタノール(10:1)により溶
出した。溶出液を濃縮乾固し、生成したあわ状固体を減
圧下乾燥し、4.84g(収率91%)のP−2−クロロフエ
ニル−5′−O−ジメトキシトリチルチミジル−(3′
→5′)−3′−O−ベンゾイルチミジン〔V〕を得
た。
Rf(CHCl3:MeOH=10:1)=0.57,1 HNMR(CDCl3,TMS):δ1.40(s,3H,5−CH3), 1.82(s,3H,5−CH 3),2.10−2.90(m,4H,2×2′), 3.10−3.65(m,2H,5′),3.66(s,6H,2×CH 3O−), 4.05−4.70(m,4H,2×4′および5′),5.20− 5.60(m,2H,2×3′),6.38(t−2H,J=7.0Hz,2×
1′), 6.60−6.90(m,4H,ph),6.90−8.00(m,20H,2×6およ
びph)および9.88(s,2H,NH)ppm。
1′), 6.60−6.90(m,4H,ph),6.90−8.00(m,20H,2×6およ
びph)および9.88(s,2H,NH)ppm。
実施例2−5 第1表−Aに記載したデオキシヌクレオチドホスホル
スルフイド化合物〔III〕,トリアルキルスタンニルア
ゾール〔I〕,塩基〔II〕およびデオキシヌクレオチド
化合物〔IV〕を用い、実施例1と同様の操作を行い、第
1表−Bに記載したデオキシヌクレオチドまたはトリデ
オキシヌクレオチドを得た。
スルフイド化合物〔III〕,トリアルキルスタンニルア
ゾール〔I〕,塩基〔II〕およびデオキシヌクレオチド
化合物〔IV〕を用い、実施例1と同様の操作を行い、第
1表−Bに記載したデオキシヌクレオチドまたはトリデ
オキシヌクレオチドを得た。
実施例6 ポリスチレン()に担持された5′−O−ジメトキ
シトリチルチミジン(担持量120マイクロモル/g,市販
品)に1,2−ジクロロエタン中5%トリクロロ酢酸を反
応させて得たチミジンポリスチレン樹脂〔IV〕(10mg.
1.2マイクロモル)にトリエチルスタンニルイミダゾー
ル〔I〕(10mg,36マイクロモル)とジイソプロピルア
ミン〔II〕(3.64mg,36マイクロモル)の1,2−ジクロロ
エタン(0.2ml)溶液を加え、直ちに5′−O−ジメト
キシトリチルチミジン−3′−O−(2−クロロフエニ
ルオキシ−2−メチルフエニルチオ)ホスフイン〔II
I〕(20mg,24マイクロモル)の1,2−ジクロロエタン
(0.15ml)溶液を添加した。室温で4分間振盪反応させ
た後、1,2−ジクロロエタンと過剰の化合物〔I〕,〔I
I〕および〔III〕をG−4グラスフイルターを通して
別し、残留したポリスチレン樹脂をメタノール(3ml)
とピリジン(3ml)で洗浄した。その後テトラヒドロフ
ラン/ピリジン/水(0.45ml/0.025ml/0.025ml)混合物
中のヨウ素(30mg,120マイクロモル)を加え、室温で2
分間振盪反応させた。過剰のヨウ素を含むテトラヒドロ
フラン/ピリジン/水混合液はG−4グラスフイルター
を通して別され、残留したポリスチレン樹脂をピリジ
ン(5ml×2)および1,2−ジクロロエタン(5ml)で洗
浄した。その樹脂の一部のトリチルカチオンテスト(49
8nmにおける吸光度測定、このテスト方法の評価は、た
とえば H.G.Gassenら、“Chemical and Enzymatic Synthesis o
f Gene Fragments",Verlag Chemie(Wainheim),1982年
とその引用文献を参照されたい。)は98%の収率で上記
反応が進行していることを示した。この収率は生成物の
保護基を以下に示す方法で脱保護したのち、得られた脱
保護体の高速液体クロマトグラフイー(HPLC)による分
析によつて確認された。すなわち、上記の樹脂にsyn−
4−ニトロベンズアルドキシム(50mg,300マイクロモ
ル)と1,1,3,3−テトラメチルグアニジン(34.5mg,300
マイクロモル)をp−ジオキサン(0.3ml)と水(0.3m
l)に溶解した溶液を加え、室温に10時間放置して反応
させた。その後、この混合物を過し、液を濃縮し、
残渣に80%酢酸(1.5ml)を加え、室温で30分間反応さ
せた。酢酸および水を減圧下留去し、残渣に水(1m
l),エーテル(5ml)を加え、脱保護体を水で抽出し
た。さらに水層をエーテル(5ml×4)で洗浄した後、
その水層のHPLC分析(第1図参照)を行つた結果、それ
はチミジンのダイマー(d(TpT))とチミジン(dT)
が約98対2の割合で生成していることを示した。なお第
1図および以下の第2〜4図に示す結果は、カラムとし
てUNISIL PACK(5C18−250A型,ガスクロ工業製)を用
い、pH7.0の0.1M酢酸トリエチルアンモニウム中5〜25
%アセトニトリルで30分間の傾斜溶離により溶出して得
られるものである。
シトリチルチミジン(担持量120マイクロモル/g,市販
品)に1,2−ジクロロエタン中5%トリクロロ酢酸を反
応させて得たチミジンポリスチレン樹脂〔IV〕(10mg.
1.2マイクロモル)にトリエチルスタンニルイミダゾー
ル〔I〕(10mg,36マイクロモル)とジイソプロピルア
ミン〔II〕(3.64mg,36マイクロモル)の1,2−ジクロロ
エタン(0.2ml)溶液を加え、直ちに5′−O−ジメト
キシトリチルチミジン−3′−O−(2−クロロフエニ
ルオキシ−2−メチルフエニルチオ)ホスフイン〔II
I〕(20mg,24マイクロモル)の1,2−ジクロロエタン
(0.15ml)溶液を添加した。室温で4分間振盪反応させ
た後、1,2−ジクロロエタンと過剰の化合物〔I〕,〔I
I〕および〔III〕をG−4グラスフイルターを通して
別し、残留したポリスチレン樹脂をメタノール(3ml)
とピリジン(3ml)で洗浄した。その後テトラヒドロフ
ラン/ピリジン/水(0.45ml/0.025ml/0.025ml)混合物
中のヨウ素(30mg,120マイクロモル)を加え、室温で2
分間振盪反応させた。過剰のヨウ素を含むテトラヒドロ
フラン/ピリジン/水混合液はG−4グラスフイルター
を通して別され、残留したポリスチレン樹脂をピリジ
ン(5ml×2)および1,2−ジクロロエタン(5ml)で洗
浄した。その樹脂の一部のトリチルカチオンテスト(49
8nmにおける吸光度測定、このテスト方法の評価は、た
とえば H.G.Gassenら、“Chemical and Enzymatic Synthesis o
f Gene Fragments",Verlag Chemie(Wainheim),1982年
とその引用文献を参照されたい。)は98%の収率で上記
反応が進行していることを示した。この収率は生成物の
保護基を以下に示す方法で脱保護したのち、得られた脱
保護体の高速液体クロマトグラフイー(HPLC)による分
析によつて確認された。すなわち、上記の樹脂にsyn−
4−ニトロベンズアルドキシム(50mg,300マイクロモ
ル)と1,1,3,3−テトラメチルグアニジン(34.5mg,300
マイクロモル)をp−ジオキサン(0.3ml)と水(0.3m
l)に溶解した溶液を加え、室温に10時間放置して反応
させた。その後、この混合物を過し、液を濃縮し、
残渣に80%酢酸(1.5ml)を加え、室温で30分間反応さ
せた。酢酸および水を減圧下留去し、残渣に水(1m
l),エーテル(5ml)を加え、脱保護体を水で抽出し
た。さらに水層をエーテル(5ml×4)で洗浄した後、
その水層のHPLC分析(第1図参照)を行つた結果、それ
はチミジンのダイマー(d(TpT))とチミジン(dT)
が約98対2の割合で生成していることを示した。なお第
1図および以下の第2〜4図に示す結果は、カラムとし
てUNISIL PACK(5C18−250A型,ガスクロ工業製)を用
い、pH7.0の0.1M酢酸トリエチルアンモニウム中5〜25
%アセトニトリルで30分間の傾斜溶離により溶出して得
られるものである。
実施例7 ポリスチレン()に担持されたジメトキシトリチル
チミジン(担持量120マイクロモル/g,市販品)に1,2−
ジクロロエタン中5%トリクロロ酢酸を反応させて得た
チミジンポリスチレン樹脂〔IV〕(10mg,1,2マイクロモ
ル)にトリ−n−ブチルスタンニル−1,2,4−トリアゾ
ール〔I〕(34.4mg,96マイクロモル)と2−メチルイ
ミダゾール〔II〕(9.85mg,120マイクロモル)の1,2−
ジクロロエタン(0.20ml)溶液を加え、直ちにN4−ベン
ゾイル−5′−O−ジメトキシトリチルデオキシシチジ
ン−3′−O−(2−クロロフエニルオキシ−2−メチ
ルフエニルチオ)ホスフイン〔III〕(22mg,24マイクロ
モル)の1,2−ジクロロエタン(0.15ml)溶液を添加し
た。室温で4分間振盪反応させた後、 1,2−ジクロロエタンと過剰の化合物〔I〕,〔II〕お
よび〔III〕をG−4グラスフイルターを通して別
し、残留したポリスチレン樹脂をメタノール(3ml)と
ピリジン(3ml)で洗浄した。その後、テトラヒドロフ
ラン/ピリジン/水(0.45ml/0.025ml/0.025ml)混合物
中のヨウ素(30mg,120マイクロモル)を加え、室温で2
分間振盪反応させた。過剰のヨウ素を含むテトラヒドロ
フラン/ピリジン/水混合液はG−4グラスフイルター
を通して別され、残つたポリスチレン樹脂をピリジン
(5ml×2)および1,2−ジクロロエタン(5ml)で洗浄
した。その樹脂の一部のトリチルカチオンテストは98%
の収率で上記反応が進行していることを示した。この収
率は生成物の脱保護により生成した脱保護体のHPLC分析
により確認された。すなわち、上記の樹脂にsyn−4−
ニトロベンズアルドキシム(50mg,300マイクロモル)と
1,1,3,3−テトラメチルグアニジン(34.5mg,300マイク
ロモル)をP−ジオキサン(0.3ml)と水(0.3ml)に溶
解した溶液を加え、室温で10時間反応させた。その後、
28%アンモニア水(1ml)を加え、60℃で5時間反応さ
せた。この混合物を過し、液を濃縮し、残渣に80%
酢酸(1.5ml)を加え、室温で30分反応させた。酢酸お
よび水を減圧下留去し、残渣に水(1ml)とエーテル(5
ml)を加え、脱保護体を水で抽出した。さらに水層をエ
ーテル(5ml×4)で洗浄した後、その水層のHPLC分析
(第2図参照)を行つた結果、それはデオキシシチジン
とチミジンのダイマー(d(CpT),〔V′〕)とチミ
ジン(dT)が約98対2の割合で生成していることを示し
た。
チミジン(担持量120マイクロモル/g,市販品)に1,2−
ジクロロエタン中5%トリクロロ酢酸を反応させて得た
チミジンポリスチレン樹脂〔IV〕(10mg,1,2マイクロモ
ル)にトリ−n−ブチルスタンニル−1,2,4−トリアゾ
ール〔I〕(34.4mg,96マイクロモル)と2−メチルイ
ミダゾール〔II〕(9.85mg,120マイクロモル)の1,2−
ジクロロエタン(0.20ml)溶液を加え、直ちにN4−ベン
ゾイル−5′−O−ジメトキシトリチルデオキシシチジ
ン−3′−O−(2−クロロフエニルオキシ−2−メチ
ルフエニルチオ)ホスフイン〔III〕(22mg,24マイクロ
モル)の1,2−ジクロロエタン(0.15ml)溶液を添加し
た。室温で4分間振盪反応させた後、 1,2−ジクロロエタンと過剰の化合物〔I〕,〔II〕お
よび〔III〕をG−4グラスフイルターを通して別
し、残留したポリスチレン樹脂をメタノール(3ml)と
ピリジン(3ml)で洗浄した。その後、テトラヒドロフ
ラン/ピリジン/水(0.45ml/0.025ml/0.025ml)混合物
中のヨウ素(30mg,120マイクロモル)を加え、室温で2
分間振盪反応させた。過剰のヨウ素を含むテトラヒドロ
フラン/ピリジン/水混合液はG−4グラスフイルター
を通して別され、残つたポリスチレン樹脂をピリジン
(5ml×2)および1,2−ジクロロエタン(5ml)で洗浄
した。その樹脂の一部のトリチルカチオンテストは98%
の収率で上記反応が進行していることを示した。この収
率は生成物の脱保護により生成した脱保護体のHPLC分析
により確認された。すなわち、上記の樹脂にsyn−4−
ニトロベンズアルドキシム(50mg,300マイクロモル)と
1,1,3,3−テトラメチルグアニジン(34.5mg,300マイク
ロモル)をP−ジオキサン(0.3ml)と水(0.3ml)に溶
解した溶液を加え、室温で10時間反応させた。その後、
28%アンモニア水(1ml)を加え、60℃で5時間反応さ
せた。この混合物を過し、液を濃縮し、残渣に80%
酢酸(1.5ml)を加え、室温で30分反応させた。酢酸お
よび水を減圧下留去し、残渣に水(1ml)とエーテル(5
ml)を加え、脱保護体を水で抽出した。さらに水層をエ
ーテル(5ml×4)で洗浄した後、その水層のHPLC分析
(第2図参照)を行つた結果、それはデオキシシチジン
とチミジンのダイマー(d(CpT),〔V′〕)とチミ
ジン(dT)が約98対2の割合で生成していることを示し
た。
実施例8 ポリスチレン()に担持されたチミジン〔IV〕(10
mg,1.2マイクロモル),トリ−n−ブチルスタンニルベ
ンゾトリアゾール〔I〕(39mg,96マイクロモル),1−
メチルイミダゾール〔II〕(9.85mg,120マイクロモル)
およびN6−ベンゾイル−5′−O−ジメトキシトリチル
デオキシアデノシン−3′−O−(2−クロロフエニル
オキシ−2−メチルフエニルチオ)ホスフイン〔III〕
(23mg,24マイクロモル)とを実施例7と同様に反応さ
せ、次いで酸化反応と脱保護反応を実施例7と同様に行
い、トリチルカチオンテストとHPLC分析(第3図参照)
を行つた結果、上記反応が99%の収率で進行しているこ
とが確認され、HPLCは生成物の99%がデオキシアデノシ
ンとチミジンのダイマー(d(ApT)であることを示し
た。
mg,1.2マイクロモル),トリ−n−ブチルスタンニルベ
ンゾトリアゾール〔I〕(39mg,96マイクロモル),1−
メチルイミダゾール〔II〕(9.85mg,120マイクロモル)
およびN6−ベンゾイル−5′−O−ジメトキシトリチル
デオキシアデノシン−3′−O−(2−クロロフエニル
オキシ−2−メチルフエニルチオ)ホスフイン〔III〕
(23mg,24マイクロモル)とを実施例7と同様に反応さ
せ、次いで酸化反応と脱保護反応を実施例7と同様に行
い、トリチルカチオンテストとHPLC分析(第3図参照)
を行つた結果、上記反応が99%の収率で進行しているこ
とが確認され、HPLCは生成物の99%がデオキシアデノシ
ンとチミジンのダイマー(d(ApT)であることを示し
た。
実施例9 ポリスチレン()に担持されたチミジン〔IV〕(n2
=0の場合、10mg,1.2マイクロモル),トリ−n−プロ
ピルスタンニルベンゾトリアゾール〔I〕(35mg,96マ
イクロモル),1−メチルイミダゾール〔II〕(9.85g,12
0マイクロモル)および5′−O−ジメトキシトリチル
チミジン−3′−O−(2−クロロフエニルオキシ−2
−メチルフエニルチオ)ホスフイン〔III〕(20mg,24マ
イクロモル)とを実施例6と同様に反応させた後、ヨウ
素(30mg,120マイクロモル)を含むテトラヒドロフラン
/ピリジン/水(0.45ml/0.025ml/0.025ml)混合液で実
施例6と同様に酸化反応を行つた。過剰のヨウ素を含む
混合液をG−4グラスフイルターを通して別し、残留
ポリスチレン樹脂をピリジン(5ml×2)で洗浄後、4
−ジメチルアミノピリジン(12.2mg,100マイクロモル)
を含む無水酢酸(0.18ml)とピリジン(1.2ml)の混合
液を加え、室温で2分間振盪し、キヤツピング反応を行
つた。過剰の上記混合液を別し、残留樹脂を1,2−ジ
クロロエタン(5ml)で洗浄し、これに1,2−ジクロロエ
タン中5%トリクロロ酢酸(2ml)を加え、室温で1分
間振盪反応させ、ジメトキシトリチル基を脱保護した。
過剰の上記試薬をG−4グラスフイルターを通して別
し、残留樹脂をピリジン(5ml)と1,2−ジクロロエタン
(5ml)で洗浄した。この樹脂(上記式〔IV〕でn2=1
の場合)に化合物〔I〕〜〔III〕を上記と同量加え、
同様にカツプリング反応を行つた。さらに、酸化反応と
キヤツピング反応を上記と同様に行い、残留樹脂を1,2
−ジクロロエタン(5ml)で洗浄した。その後、1,2−ジ
クロロエタン中5%トリクロロ酢酸でジメトキシトリチ
ル基を脱保護し、上記式〔IV〕でN2=2の場合、すなわ
ちポリスチレンに担持されたチミジンのトリマーを得
た。この操作をさらに5回(すなわち上記式〔IV〕でn2
=7まで)くり返し、チミジンのオクタマーとしたの
ち、化合物〔I〕〜〔III〕およびヨウ素を上記と同量
用い、カツプリング反応および酸化反応を同様に行つ
た。その樹脂をピリジン(5ml×2)および1,2−ジクロ
ロエタン(5ml)で洗浄したのち、トリチルカチオンテ
ストを実施例6と同様に行つたところ、化合物〔V〕
(n2=7の場合)が全収率85%で生成していることが確
認された。その後syn−4−ニトロベンズアルドキシム
(150mg,900マイクロモル)と1,1,3,3−テトラメチルグ
アニジン(103.5mg,900マイクロモル)を含むp−ジオ
キサン(0.9ml)と水(0.9ml)の混合液、さらに80%酢
酸(2ml)で実施例6と同様に脱保護した。得られた粗
生成物のHPLC分析(第4図参照)の結果、チミジンのノ
ナマーの存在が確認された。
=0の場合、10mg,1.2マイクロモル),トリ−n−プロ
ピルスタンニルベンゾトリアゾール〔I〕(35mg,96マ
イクロモル),1−メチルイミダゾール〔II〕(9.85g,12
0マイクロモル)および5′−O−ジメトキシトリチル
チミジン−3′−O−(2−クロロフエニルオキシ−2
−メチルフエニルチオ)ホスフイン〔III〕(20mg,24マ
イクロモル)とを実施例6と同様に反応させた後、ヨウ
素(30mg,120マイクロモル)を含むテトラヒドロフラン
/ピリジン/水(0.45ml/0.025ml/0.025ml)混合液で実
施例6と同様に酸化反応を行つた。過剰のヨウ素を含む
混合液をG−4グラスフイルターを通して別し、残留
ポリスチレン樹脂をピリジン(5ml×2)で洗浄後、4
−ジメチルアミノピリジン(12.2mg,100マイクロモル)
を含む無水酢酸(0.18ml)とピリジン(1.2ml)の混合
液を加え、室温で2分間振盪し、キヤツピング反応を行
つた。過剰の上記混合液を別し、残留樹脂を1,2−ジ
クロロエタン(5ml)で洗浄し、これに1,2−ジクロロエ
タン中5%トリクロロ酢酸(2ml)を加え、室温で1分
間振盪反応させ、ジメトキシトリチル基を脱保護した。
過剰の上記試薬をG−4グラスフイルターを通して別
し、残留樹脂をピリジン(5ml)と1,2−ジクロロエタン
(5ml)で洗浄した。この樹脂(上記式〔IV〕でn2=1
の場合)に化合物〔I〕〜〔III〕を上記と同量加え、
同様にカツプリング反応を行つた。さらに、酸化反応と
キヤツピング反応を上記と同様に行い、残留樹脂を1,2
−ジクロロエタン(5ml)で洗浄した。その後、1,2−ジ
クロロエタン中5%トリクロロ酢酸でジメトキシトリチ
ル基を脱保護し、上記式〔IV〕でN2=2の場合、すなわ
ちポリスチレンに担持されたチミジンのトリマーを得
た。この操作をさらに5回(すなわち上記式〔IV〕でn2
=7まで)くり返し、チミジンのオクタマーとしたの
ち、化合物〔I〕〜〔III〕およびヨウ素を上記と同量
用い、カツプリング反応および酸化反応を同様に行つ
た。その樹脂をピリジン(5ml×2)および1,2−ジクロ
ロエタン(5ml)で洗浄したのち、トリチルカチオンテ
ストを実施例6と同様に行つたところ、化合物〔V〕
(n2=7の場合)が全収率85%で生成していることが確
認された。その後syn−4−ニトロベンズアルドキシム
(150mg,900マイクロモル)と1,1,3,3−テトラメチルグ
アニジン(103.5mg,900マイクロモル)を含むp−ジオ
キサン(0.9ml)と水(0.9ml)の混合液、さらに80%酢
酸(2ml)で実施例6と同様に脱保護した。得られた粗
生成物のHPLC分析(第4図参照)の結果、チミジンのノ
ナマーの存在が確認された。
なお本発明方法の製造中間体として用いたデオキシヌ
クレオチドホスホルスルフイド化合物〔III〕の物性値
は以下のとおりである。
クレオチドホスホルスルフイド化合物〔III〕の物性値
は以下のとおりである。
〔実施例1−4,6および9〕 Rf値(CHCl3:MeOH=80:1)=0.301 HNMR(CDCl3,TMS)δ;1.46(s,3H,5−CH 3), 2.20−2.85(m,5H,2.28と2.38に一重線を含む.2′およ
びCH 3C6H4S−),3.35−3.65(m,2H,5′),3.69(s,3H,C
H 3OC6H4O−),3.70(s,3H,CH 3OC6H4O−),4.25−4.50
(m,1H,4′),5.45−5.80(m,1H,3′),6.49(t,1H,J=
7.0Hz,1′),6.65−6.90(m,4H,ph),6.90−7.75(m,18
H,6およびph),10.3(s,1H,NH)ppm。
びCH 3C6H4S−),3.35−3.65(m,2H,5′),3.69(s,3H,C
H 3OC6H4O−),3.70(s,3H,CH 3OC6H4O−),4.25−4.50
(m,1H,4′),5.45−5.80(m,1H,3′),6.49(t,1H,J=
7.0Hz,1′),6.65−6.90(m,4H,ph),6.90−7.75(m,18
H,6およびph),10.3(s,1H,NH)ppm。
〔実施例5〕 Rf値(CHCl3:MeOH=20:1)=0.361 HNMR(CDCl3,TMS)δ;1.35(s,3H,5−CH 3),1.84(s,3
H,5−CH 3),1.90−2.85(m,7H,2.34に一重線を含む.CH
3C6H4S−および2×2′),2.85−3.65(m,2H,5′),3.
73(s,6H,2×CH 3OC6H4−),3.95−4.70(m,4H,2×4′
および5′)5.05−5.65(m,2H,2×3′),6.05−6.55
(m,2H,2×1′),6.60−6.85(m,4H,ph),6.85−7.60
(m,23H,phおよび2×6),9.28(s,1H,NH),9.36(s,
1H,NH)ppm。
H,5−CH 3),1.90−2.85(m,7H,2.34に一重線を含む.CH
3C6H4S−および2×2′),2.85−3.65(m,2H,5′),3.
73(s,6H,2×CH 3OC6H4−),3.95−4.70(m,4H,2×4′
および5′)5.05−5.65(m,2H,2×3′),6.05−6.55
(m,2H,2×1′),6.60−6.85(m,4H,ph),6.85−7.60
(m,23H,phおよび2×6),9.28(s,1H,NH),9.36(s,
1H,NH)ppm。
〔実施例7〕 Rf値(CHCl3:MeOH=80:1)=0.481 HNMR(CDCl3,TMS)δ;2.20−2.70(m,4H,2.29と2.36に
一重線を含む.0.5×2′およびCH3C6H4S−),2.80−3.1
0(m,1H,0.5×2′),3.40−3.90(m,8H,3.65と3.69に
一重線を含む,5′および2×CH 3OC6H4−),4.30−4.60
(m,1H,4′),5.40−5.70(m,1H,3′),6.36(t,1H,J=
7.0Hz,1′),6.65−7.70(m,26H,ph),7.80−8.00(m,1
H,5),8.10−8.30(m,1H,6),10.6(s,1H,NH)ppm。
一重線を含む.0.5×2′およびCH3C6H4S−),2.80−3.1
0(m,1H,0.5×2′),3.40−3.90(m,8H,3.65と3.69に
一重線を含む,5′および2×CH 3OC6H4−),4.30−4.60
(m,1H,4′),5.40−5.70(m,1H,3′),6.36(t,1H,J=
7.0Hz,1′),6.65−7.70(m,26H,ph),7.80−8.00(m,1
H,5),8.10−8.30(m,1H,6),10.6(s,1H,NH)ppm。
〔実施例8〕 Rf値(CHCl3:MeOH=80:1)=0.341 HNMR(CDCl3,TMS)δ;2.31(s,1.5H,0.5×CH 3C6H4S
−),2.37(s,1.5H,0.5×CH 3C6H4S−),2.55−3.25(m,
2H,2′),3.25−3.60(m,2H,5′),3.70(s,6H,2×CH 3O
C6H4−),4.35−4.65(m,1H,4′),5.45−5.75(m,1H,
3′),6.30−6.85(m,5H,1′およびph),6.85−7.60
(m,20H,ph),7.75−8.05(m,2H,ph),8.05−8.20(m,1
H,2),8.55−8.75(m,1H,8),8.88(s,1H,NH)ppm。
−),2.37(s,1.5H,0.5×CH 3C6H4S−),2.55−3.25(m,
2H,2′),3.25−3.60(m,2H,5′),3.70(s,6H,2×CH 3O
C6H4−),4.35−4.65(m,1H,4′),5.45−5.75(m,1H,
3′),6.30−6.85(m,5H,1′およびph),6.85−7.60
(m,20H,ph),7.75−8.05(m,2H,ph),8.05−8.20(m,1
H,2),8.55−8.75(m,1H,8),8.88(s,1H,NH)ppm。
第1図〜第4図はそれぞれ実施例6,7,8および9で製造
された本発明の目的化合物オリゴデオキシヌクレオチド
(V)の脱保護生成物の高速液体クロマトグラフイーの
溶離曲線を示し、dTはチミジンを、d(TpT)はチミジ
ンのダイマーを、d(CpT)はデオキシシチジンとチミ
ジンのダイマーを、dApTはデオキシアデノシンとチミジ
ンのダイマーをそしてd(Tp)8Tはチミジンのノナマーを
それぞれ意味する。
された本発明の目的化合物オリゴデオキシヌクレオチド
(V)の脱保護生成物の高速液体クロマトグラフイーの
溶離曲線を示し、dTはチミジンを、d(TpT)はチミジ
ンのダイマーを、d(CpT)はデオキシシチジンとチミ
ジンのダイマーを、dApTはデオキシアデノシンとチミジ
ンのダイマーをそしてd(Tp)8Tはチミジンのノナマーを
それぞれ意味する。
Claims (1)
- 【請求項1】一般式〔I〕で示されるトリアルキルスタ
ンニルアゾール化合物および一般式〔II〕で示される塩
基の存在下で、一般式〔III〕で示されるデオキシヌク
レオチドホスホルスルフイド化合物と一般式〔IV〕で示
されるデオキシヌクレオチド化合物とを反応させた後、
酸化反応を行なわせることを特徴とする一般式〔V〕で
示されるオリゴデオキシヌクレオチドの製造法。 ▲R1 3SnX▼ 〔I〕 (式中、R1はアルキル基をあらわし;Xはアゾリル基をあ
らわす。) R2▲NR3 2▼ 〔II〕 (式中、R2は水素原子,アルキル基またはアリール基を
あらわし;R3はアルキル基をあらわすか、または2個の
R3が隣接する窒素原子とともにヘテロ原子として1ない
し2個の窒素原子,酸素原子またはイオウ原子を含有し
てもよい複素環基をあらわすか、あるいはR2と2個のR3
が隣接する窒素原子とともにヘテロ原子として1ないし
2個の窒素原子,酸素原子またはイオウ原子を含有して
もよい複素環基をあらわす。) (式中、R4およびR5は保護基をあらわし;R6はアリール
基をあらわし;B1およびB2は同一でも異なつてもよくか
つそれぞれ保護基を有することもある塩基残基をあらわ
し;n1は0または正の整数をあらわすが、ただしn1が2
以上の場合にはB2は同一の塩基残基に限定されない。) (式中、R5は前記と同じ意味をあらわし;R7は高分子担
体を含有してもよい保護基をあらわし;B3およびB4は同
一でも異なつてもよくかつそれぞれ保護基を有すること
もある塩基残基をあらわし;n2は0または正の整数をあ
らわすが、ただしn2が2以上の場合にはB4は同一の塩基
残基に限定されない。) (式中、R4,R5,R7,B1,B2,B3,B4,n1およびn2は前
記と同じ意味をあらわす。)
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61180002A JP2508006B2 (ja) | 1986-08-01 | 1986-08-01 | オリゴデオキシヌクレオチドの製造法 |
US06/925,890 US4808708A (en) | 1985-11-02 | 1986-10-30 | Phosphorsulfide derivatives of deoxynucleosides or deoxynucleotides and their uses |
DE19863637243 DE3637243A1 (de) | 1985-11-02 | 1986-11-03 | Neue phosphorsulfidderivate von deoxynucleosiden oder deoxynucleotiden und deren verwendung |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61180002A JP2508006B2 (ja) | 1986-08-01 | 1986-08-01 | オリゴデオキシヌクレオチドの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6339894A JPS6339894A (ja) | 1988-02-20 |
JP2508006B2 true JP2508006B2 (ja) | 1996-06-19 |
Family
ID=16075734
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61180002A Expired - Fee Related JP2508006B2 (ja) | 1985-11-02 | 1986-08-01 | オリゴデオキシヌクレオチドの製造法 |
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Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2508006B2 (ja) |
-
1986
- 1986-08-01 JP JP61180002A patent/JP2508006B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6339894A (ja) | 1988-02-20 |
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