JPH06508144A - シリルリン酸化試薬及び該試薬を使用する方法 - Google Patents
シリルリン酸化試薬及び該試薬を使用する方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
シリルリン酸化試薬及び該試薬を使用する方法本発明は一般にシリルアルコール
、その合成及びその使用に係る。より詳細には、本発明は特定のシリルアルコー
ル及び、ヒドロキシルよりもむしろ炭素に結合したケイ素原子を有するシリルア
ルコールの合成方法に係る。本発明は更に、オリゴヌクレオチドをリン酸化する
ための試薬及び方法、並びにリン酸化オリゴヌクレオチドの精製に有用な中間化
合物及び方法に係る。
本願は参考資料として本明細書の一部とする同一名義の米国特許第5,113.
005号に関連する。
発明の背景
化学的に合成されたオリゴヌクレオチドはしばらく以前からハイブリダイゼーシ
ョンアッセイで使用されており、今日ではかなり日常的に行われている。しかし
ながら、生物学的プロセスを模倣する使用、例えば鋳型上の核酸プローブのハイ
ブリダイゼーションとそれに続く連結のためには、リガーゼの適正な基質を提供
するように通常の5° ヒドロキシル末端をリン酸基に変換しなければならない
。リン酸化方法は後述するような酵素法及び合成法を含む。本発明は、シリル置
換アルコールを有用な試薬とする特定の合成方法に係る。
シリル置換アルコールの合成は従来有機ボランの酸化により達せられている。有
機ポランはグリニヤール反応又はビニル−及びアリル−シランのヒドロホウ素化
により製造されている。この手法はK u m a d aら、 J、Orga
nometal、Chem、 6:490−495 (1966)及び5eyf
erth、J、Am、Chem。
Sac、 8に1844 (1959)に記載されている。
この手法は必要なビニル又はアリルシランが合成可能な場合又は市販されている
場合にしか利用できない。一方、所望のビニルシランが市販されていない場合又
は合成が困難な場合にはこの方法は有用ではない。
α−シリルエステルはクロロシラン及びα−ブロモエステルをレフオルマドスキ
ー条件下で亜鉛と反応させることにより製造されている。Fe5sendenら
、J、Org、Chem、32 :3535 (1967)参照。
これらの合成方法の主要な欠点は望ましくない生成物をもたらし、収率を低下さ
せる副反応が生じ得るという点にある。シリル置換エステルを対応するシリル置
換アルコールに加水分解するための従来方法では、一般にカルバニオン中間体が
形成される。β−シリル置換アルコールではシラノールとオレフィンに分解する
可能性があり、α−シリル置換アルコールでは、Brook転位によりシリル保
護エーテルを生じる。即ち、これらのカルバニオン中間体では脱離反応の傾向が
強く、ケイ素原子は酸素原子にシフトし、R,S i OH副生物を形成する。
この傾向は反応が強酸中で行われる場合及びケイ素上で置換された基が格別嵩高
な場合に特に顕著である。
オレフィンの二重結合間にH及びシリル化合物を付加するヒドロシル化(hyd
rosilation)も文献中に記載されている。Co I Imanら、
Pr1ncipIes and Applications of Organ
otransition Metal Chemistry、 Univers
ity 5cience Books (1980) p、384−389及び
Pegramら、 Carbohydrate Re5earch 184 :
276 (1988)参照。特に関連するヒドロシル化反応において、Sal
imgareevaら。
Zh、0bshch、Khim 48 (4):930−31 (1978)(
ロシア)(C,A、 89:146961yも参照)はジメチルシランによる酢
酸ビニルのヒドロシル化を報告している。この反応では2種のシリル置換生成物
、即ちモノアセテートとジアセテートが生成された。しかしながら、シリルアル
コールの合成又は嵩高のシリル置換化合物の使用もしくは合成について記載され
ていない。
Hondaら、 Tetrahedron Letters、 22 (22)
: 2093−2096 (1981)は、シリル基が2個のフェニル置換基と
1個のメチル置換基を担持するβ−シリル置換エタノールを記載している。Ho
ndaらはオリゴヌクレオチド合成でヌクレオチド間に保護リン酸基を配置する
リン酸化剤を製造するためにこの化合物を使用した。置換シリル保護基を除去す
ると、シリルフルオライド化合物、エチレン及びリン酸基が得られる。置換シリ
ルエタノールは、Ge r l ach、 He 1v Chim、 Acta
、 60:3039 (1977)の手順の変法に従ってビスフェニルメチルシ
リルアセテートをL i A I Haで還元することにより得られた。
他のシリル置換エタノールは文献に記載されているが、主にアルキル置換シリル
基を含む。このようなシリルエタノールの例及びその引用文献基を以下の表に示
す。
トリフェニルシラン(アルコールでない)はLesageら、 J、Org、C
hem 55:5413 (1990)により有用な還元剤として記載されてい
る。
Hondaら(前出)の方法以外に、オリゴヌクレオチドの5゛末端をリン酸化
するための数種の方法が知られている。オリゴヌクレオチドを合成し、固体支持
体から除去した後にポリヌクレオチドキナーゼを使用する酵素法が最初に使用さ
れた。その他に、固体支持体から除去する前に合成オリゴヌクレオチドを化学的
にリン酸化するための方法及び試薬が教示されている。これらの教示の一部を以
下に記載する。
Kondoら、 Nucl、Ac1ds Res、Symposium 5er
ies 16:161−164(1985)は5′末端をリン酸化するためのホ
スホトリエステル(1)及びホスホラミシト(2)試薬を記載している。リン酸
化は鎖中の最後のヌクレオチドとして付加される特別のニリン酸化(3°−5゛
)ヌクレオチドを調製することにより達せられる。3′ リン酸基はホスホトリ
エステル又はホスホラミシトを介して伸長するヌクレオチド鎖に結合される。5
° リン酸基は最終的に除去される保護基で保護される。
Uhlmannら、 Tetrahedron Letters 27 (9)
: 1023−1026 (1986)は、ブロッキング基としてp−ニトロ
フェニルエチル基を使用するホスホラミシトリン酸化試薬を記載している。
この文献によると、疎水性p−ニトロフェニルエチルは逆相HPLCによりリン
酸化化合物を非リン酸化化合物から分離できるという利点がある。
しかしながら、Uhlmannらはp−二トロフェニルエチル「ハンドル(ha
nd l e)Jが結合した6量体しか使用しなかった。20量体でp−ニトロ
フェニルエチルハンドルを使用する同様のアプローチがG、Zon、HPLCi
n Biotechnology、 (W、S。
Hancock編)、 J、Wiley & 5ons。
New York、 NY、 pp359−363 (1990)の第14章に
記載されている。Zonによりこの方法で得られた精製結果はかろうじて許容で
きる程度である。
Maruggら、Nucl、Ac1ds Res、 12 (22):8639
−8651 (1984)は、新規リン酸化剤として2−シアノ−1,1−ジメ
チルエトキシジクロロホスフィンを記載している。この物質は塩基性条件下で除
去されるという利点があると主張されている。
Himmelsbachら、TetrahedronLetters 23 (
46):4793−4796 (1982)は、新規リン酸化剤としてビス−(
p−ニトロフェニルエチル)ホスホロモノクロリゾートを記載している。
Van der Marelら、 Tetrahedr。
n Letters、 22 (19):1463−1466(1981)は、
モルホリノホスホロビス−3−二トロー1.2.4−トリアシリデートを記載し
ている。
Hornら、Tetrahedron Letters27 (39):470
5−4708 (1986)は、遊離後にリン酸化効率を監視するために使用可
能な4,4′ ジメトキシトリチル基を含むリン酸化試薬を記載している。この
開示はEP−A−304215の開示及び5゜Phosphate−Onとして
知られる市販のC1antech製品に非常に類似していると思われる。
Lipshutzら、Tetrahedron Letters 30 (51
): 7149−7152 (1989)(“Lipshutz 1989”)
、Lipshutzら、Tetrahedron Letters 21:3
343−3346 (1980) (”Lipschutz 1980”)及び
Von Peter 5ieber、 He1vetica Chimica
Acta60 : 2711 (1977)はいずれもシリル保護基の除去にお
けるフッ化物の使用を開示している。この点で、これらの文献はHondaら(
上記参照)の開示内容に類似している。
上記試薬及び方法の各々は合成オリゴヌクレオチドのリン酸化に適しているが、
各々欠点もある。例えば、上記文献の各々は天然5° リン酸基を生成するため
にリン酸基ブロッキング基を除去するための方法を開示している。リン酸化の程
度を監視することが可能な検出可能な特徴(例えば色)を有するブロッキング剤
を開示しているものもある(例えばHornら)。リン酸化の程度はこの手段に
より監視することができるが、精製手段は提供されていない。
Uhlmannらは、開裂前に疎水性p−ニトロフェニルエチル基を使用してH
PLCによりリン酸化6量体を分離できることを示唆している。Uh 1man
nにより言及されている保護6量体は比較的低分子/保護基質量比を有しており
、一般に非常に短いため、ハイブリダイゼーシコンアッセイで必要な特性を提供
することができない。
しかしながら、これらの文献のうちでシリル置換基を含むリン酸化/ブロッキン
グ試薬を教示しているものは皆無である。更に、非リン酸化不良生成物からリン
酸化ヌクレオチドを精製するためにシリル保護基を使用できることを示唆してい
るものも皆無である。本発明の目的はこれらの欠点を解決することである。
第1の態様によると、本発明は式:
(式中、R5、R6及びR7はH;アルキル、アリール、置換アルキル、置換ア
リール;アルキル、アリール、置換アルキル及び置換アリールのオキサ及びチア
類似体;並びにハロゲンから構成される群から独立して選択され、Qはホスホラ
ミシト、アルキルホスホネート、ホスホン酸水素塩及びホスホトリエステルから
構成される群から選択される部分を表す)を有する、ヌクレオシドの5゛末端の
リン酸化用試薬に係る。R3、R6及びR7は一般にアルキル、アリール、置換
アリール及び置換アルキルから選択され、理想的にはアリール基又は立体的に嵩
高なアルキルのような疎水性基である。このような基の例としては、フェニル、
置換フェニル、ナフチル、トリフェニルメチル、t−ブチル、ネオペンチル、ネ
オヘキシル、シクロヘキシル、3−ペンチル及び3−エチル−3−ペンチルが挙
げられる。
Qはホスホラミシトを表す場合には式:[式中、R8は一般に2−シアノエチル
、メチル、エチル、2−アルキルスルホニルエチル、2− (p−二トロフェニ
ル)エチル、2−(9−フルオレニル)エチル、2−(2−アントラキノニル)
エチル、2−アルキルチオエチル、2−アリールチオエチノペ2−トリハロメチ
ルエチノペ2−フェニルエチル及び2−(2−ナフチル)エチルから構成される
群から選択され、R1及びR1゜はHl又は炭素数1〜6の直鎖もしくは枝分か
れ鎖アルキルから独立して選択される]を有する。このようなホスホラミシト試
薬の一般的な例は2−シアノエチル−N、N−ジインプロビルアミノホスホラミ
シトである。
Qはホスホネートを表す場合には、式:(式中、YはH及びアルキルから構成さ
れる群から選択され、R8は上記と同様に選択される)を有する。Qはホスホト
リエステルを表す場合には、Yがヒドロキシル又はアルコキシである以外はホス
ホネートと同一の式を有する。
Yがアルキル又はアルコキシである場合には、低級アルキル及び低級アルコキシ
が好適である。
別の態様によると本発明は、
a)リン中間体が3価状態である場合にはその後の段階で5価状態に酸化すると
いう条件で、オリゴヌクレオチドの5゛ ヒドロキシルを上記試薬のいずれかと
反応させ、シリル基により保護されたリン中間体を形成する段階と、b)R,離
脱基を除去する段階と、
C)ホスホジエステルを脱保護し、5°末端リン酸を生成する段階とを含む、オ
リゴヌクレオチドの5′ ヒドロキシル末端を化学的にリン酸化する方法に係る
。
脱保護段階は、保護ホスホジエステルをフッ化物イオン(例えばテトラブチルア
ンモニウムフルオライド)と反応させ、シリルフルオライド、エチレン及び末端
リン酸基を生成することにより実施され得る。方法は好ましくは前記脱保護段階
前にシリル保護ホスホジエステル生成物を非リン酸化生成物から分離する別の段
階を含む。分離は、シリル部分上の区別可能な置換基に基づいてクロマトグラフ
ィーにより実施され得る。
最後の態様によると本発明は、保護5′末端リン酸基を有しており且つ式:
(式中、R6、R,及びR2は独立して上記に定義したように選択され、ZはH
又はOHであり、BASEは核酸塩基A、C,G、TもしくはUの1種又はその
類似体を表す)を有するヌクレオシドに係る。前記ヌクレオシドは糖の3゛位を
介して固体支持体又は鎖中の他のヌクレオシドに結合され得る。好ましくは、R
6、R6及びR7は上記と同様に疎水性であり、精製「ハンドルJとして機能す
る。
図面の簡単な説明
図1は不良生成物(8,4分のピーク1)からのリン酸化オリゴヌクレオチド(
15,5分のピーク4)の分離を示すクロマトグラムである。クロマトグラムは
流速1.5mL/分のWaters μBondapak(登録商標)CI8カ
ラム、3.9mmX150mmから作成した。溶剤Aは100mM)リエチルア
ンモニウムアセテートであり、溶剤Bはアセトニトリルである。A:Bの比が時
刻二〇では90:10.時刻215分では60 : 40、時刻=25では60
: 40、時刻=30では90 : 10となるような直線勾配表に従って溶
剤を混合した。検出値は260nmの吸光度単位で表した(実施例10a参照)
。
図2は他の生成物(例えばシリルフルオライド)からの脱保護リン酸化オリゴヌ
クレオチド(8,4分のピーク1)の分離を示すクロマトグラムである。条件は
図1の場合と同じである(実施例10b参照)。
一般に、「アルキル」、「アルケニル」及び「アリール」のような用語は、有機
化学業者により通常使用されている意味を有する。例えばアルキルは一般に、1
個の水素を除去することによりアルカンから誘導され得る1価の直鎖又は枝分か
れ鎖脂肪族基を意味し、一般式C@H!ailを有する。アルキル基は1〜約3
0個の炭素、より実質的には1〜約15又は20個の炭素を有し得る。「低級ア
ルキル」なる用語は炭素数1〜約6のアルキルを意味する。低級アルキルの例と
しては、CHs−1CHs CH2−1CH,CH(CHs)−及びCHs (
CHり 4−が挙げられる。本明細書中で使用する「アルキル」なる用語はシク
ロアルキル及び直鎖アルキルを含む。従って、シクロヘキシル等が含まれる。
「アルケニル」は、1個の水素を除去することによりアルケンから誘導され得る
1価の直鎖又は枝分かれ鎖脂肪族基を意味し、一般式C,H1m−1を有する。
アルケニル基は1〜約30個の炭素、より実質的には1〜約20個の炭素を有し
得る。「低級アルケニル」なる用語は炭素数1〜約6のアルケニルを意味する。
「オレフィン」はアルケニルと同義である。
本明細書中で使用する「アルキレン」なる用語は30個未満の炭素原子を有する
2価の直鎖又は枝分かれ鎖スペーサー基を意味し、非限定的な例として一〇〇!
−1−CH(CH3)−1CH(CzHs)−1−CH(CHs)CH。
−1−(CH,)$−等が挙げられる。一般にアルキレンスペーサー基は脂肪族
である。
「アリール」は、1個の水素を除去することにより芳香族炭化水素から誘導され
得る1価の基を意味する。アリール置換基はフェニル及びナフチルのような環構
造を有する。
典型的には、アリール置換基は平面状であり、平面の相対向する側に各炭素のπ
電子雲が残存する。
アルキル、アルケニル及びアリールは一般には炭素及び水素以外の原子をもたな
い(即ちヘテロ原子をもたない)基に限定されるが、本発明ではこのような制限
がない。ヘテロ原子、特に酸素及び硫黄がR基に存在し、夫々「オキサ」及び「
チア」類似体を形成してもよい。しかしながら、脱離が予想されるので、R基が
該当分子に結合している1価の点から2個の炭素が除去された酸素原子を有する
オキサ類似体を避けることが望ましい。オキサ類似体の例としては、アルコキシ
(例えばt−ブトキシ、イソプロピルオキシ及びエトキシ)、フェノキシ及びエ
ーテル置換基がある。
本明細書中で使用される「置換」なる用語は、R基に共有結合した部分の存在を
意味し、非限定的な例としてはハライド(特にBr及びCI)、ニトロ、低級ア
ルコキシ(炭素原子数1〜6、特にメトキシ及びエトキシ)、低級アルキル(炭
素原子数1〜6、特にメチル及びエチル)、ヒドロキシ及びアミノ(場合により
保護基が必要)が挙げられる。所望の溶解度及び所望の化合物の疎水性による制
約と有機化学原理の立体的制約下で、R基上の置換基の位置及び数は任意である
。特定の置換としては、アリール基が1価の点を含むアルキル置換基を担持する
1価アリール基(例えばトルイル)を意味するアルカリールや、アリール基を担
持する1価アルキル基を意味するアラルキル基を挙げることができる。後者の場
合、アルキル基は1価の点を含む。ベンジルはアラルキル基の1例である。
本明細書中で使用される「立体的に嵩高」なる用語は、比較的大きい体積を占め
る置換基を意味する。5個以上の炭素を有するアリール基はl換アリール基と同
様に「立体的に嵩高」であるとみなされる。アルキル及びアルケニル基は少なく
とも4個の炭素を有しており且つ枝分かれ形状に配置されているときに「立体的
に嵩高」であり、枝数が多いほど嵩高である。t−ブチル以上の体積を占める全
アルキル及びフェニル以上の体積を占める全アリールは「立体的に嵩高」である
とみなされる。従って、ネオペンチル、ネオヘキシル等がこの範躊に入る。
「疎水性」なる用語は一般に、水溶液に比較的溶けにくく、実質的に水と混合し
ない化合物を意味する。具体的には、水/オクタツール分配試験でオクタツール
に対して0゜51以上の分配係数を有する場合に化合物は疎水性であるとみなさ
れる。
B、シリルアルコール合成
以下に記載する本発明ではどのような方法により製造したシリルアルコールも有
用であり得る。後述する理由で2−シリル−エタン−1−オール(すなわちβ−
シリルエタノール、シラプロパツール)が好適である。有機化学業者には自明の
ことであるが、「β−シリルエタノール」と「シラプロパツール」は同義であり
、区別なしに使用され得る。前者命名法はシリル基(RsSi )をエタノール
上の置換基とみなし、後者命名法はケイ素原子を主鎖の一部とみなしている。
公知製造方法の例については本明細書の発明の背景の項に記載した。しかしなが
ら、ここに記載する新規合成方法は特に有用である。
ビニルエステルはエステル結合の片側(酸素側)のアルケニル基の存在により特
徴付けられるオレフィンエステルである。ビニルエステルは式:
(式中、R,はアルケニルであり、RbはH又はアルキル、通常は低級アルキル
、好ましくはメチルである)により表され得る。本発明によると、R1は炭素数
2〜約30であり得るが、低級アルケニルがより一般的である。本発明で有用な
このようなエステルの例としては、ビニルアセテート、イソプロペニルアセテー
ト、ブテニルアセテート、ペンテニルアセテート等が挙げられる。二重結合が末
端位置にあるエステル、特にビニルアセテートが好ましい。
金属触媒の存在下で式R35iHのシランを使用してこのようなエステルをヒド
ロシル化すると、アルケニル基R8の二重結合間にH及びシリル基(RsSt
)が付加される。ヒドロシル化はR基として好ましくはアルキル、アリール、置
換アルキル又は置換アリールを担持するシランを必要とする。シランのR基は更
に、独立してハロゲン及び/又はアルキル、アリール、置換アルキル及び置換ア
リールのオキサ又はチア類似体を含み得る。シラン上には1.2又は3個のR基
が存在し得る。後述する使用のためには、嵩高で疎水性の置換基が好適である。
フェニル、t−ブチル、ネオペンチル等が嵩高基の例である。
ヒドロシル化に有用な金属触媒としては、遷移金属錯体、特にコバルト、ニッケ
ル、白金、ツクラジウム及びロジウムの錯体が挙げられるが、他の触媒も使用で
きる。特定の錯体の例としては、CO□(Co)。、HIP t C1s ;
(RhCI (Co) 2) 2及び前出のCo 11manらの表6.5に記
載の他の錯体がある。
触媒ヒドロシル化は以下の条件下で実施され得る。アセテート対シランのモル比
は約30:1〜約1:2であり、好ましくは約1:1である。10:1又は2:
1のような中間比も予想される。金属触媒のモル百分率は約0.01%〜1%〜
約3ましくは約0.2%〜約2%であり得る。
百分率が低いとより長い反応時間又はより高温が必要になる。(RhCI (C
O) 212の場合、最適モル%は約0゜25%〜約1.0%である。他の触媒
では、最適濃度は文献又は日常実験から得られる。室温で約50〜70時間、好
ましくは2週間以内で反応は最良である。しかしながら、高温で短時間、例えば
82Cで24時間未満でもよい。主要試薬の濃度は酢酸ビニル中純液からトルエ
ン中4M、好ましくはトルエン巾約IMとすべきである。この触媒段階の他の反
応条件は、参考資料として本明細書の一部とするCo 11manらの文献に記
載されている。
ヒドロシル化ではシリル基が二重結合の両側に結合し、■−及び2−置換生成物
を生じるので、2種の主要生成物が生成される。必要に応じてこれらの生成物を
分離し、クロマトグラフィー(例えばフラッシュカラム又はHPLCのようなシ
リカに基づくクロマトグラフィー)により精製することができる。しかしながら
、場合によっては精製は非常に簡易化される。ビニルアセテートをエステルとし
て使用する場合にも同様に次のように2種の生成物が得られる。
水性又はアルコール性緩塩基中で加水分解すると、アセテートはアルコールに変
換される。しかしながら、1−シリル置換アルコールは不安定であり、自然にB
rook転位しくA、G、Brook、Accounts Chemical
Re5earch、 7:77 (1974))、下記化合物・
を生じる。2〜シリル置換アルコールはこの転位を受けない。2−ンリル置換生
成物はアルコールとして挙動し、シリルエーテルはエーテルとして挙動するので
、2種の生成物はシリカゲルクロマトグラフィー、特にHPLCを使用してこれ
らの特性に基づいて容易に分離される。追って実施例に記載するように、この加
水分解反応は酢酸塩の中間精製なしに同一容器中で実施することができる。
加水分解条件は注意深(制御することが好ましい。アニオン形の2−又はβ−置
換中間体は発明の背景の項に記載したようにシラノールに分解する。しかしなが
ら、望ましくない生成物の形成を最小限にするような反応条件を選択することが
できる。まず第1に、好ましくは約3〜8のpKbを有する緩塩基を選択する。
許容可能な塩基としては、H2B O3−1HP O42−1SO3!−1HC
Os−及びC03!−のナトリウム又はカリウム塩が挙げられる。解離傾向の弱
い緩塩基は従来技術で教示されている強塩基又は水素化物(例えばL i A
I H4)よりもアニオン種をプロトン付加状態に維持する傾向がある。
塩基は、塩基:アセテートモル比が約0.01:1〜約3=1、好ましくは0.
1:1〜2.5:1、最適には1:1〜2:1となるように配合すべきである。
反応は一般に0.5〜24時間であるが、好ましくは約1時間である。
更に、溶剤は望ましくない生成物の形成を最小限にするように選択され得る。例
えば、特定溶剤中の塩基の溶解度により塩基仕度は変化する。溶液中で進行中の
イオン化平衡を緩衝するように実質的な量の塩基を不溶性に維持することが望ま
しい。また、プロトン性溶剤はアニオン種の形成を停止できるので非プロトン性
溶剤よりも好ましい。適切なプロトン性溶剤としては水、メタノール及びエタノ
ールが挙げられる。反応は水性媒体中で行われるが、溶剤としてメタノールを使
用することが好ましい。
この方法により合成されるシリルアルコール及び他の方法により合成されるシリ
ルアルコールは、別項に記載するリン酸化試薬及び保護剤の合成に有用である。
C,シリルアルコール
上記方法を使用して多数のシリル置換アルコールを合成することができるが、あ
る類のシリルアルコールが特に有用である。ケイ素に結合した3個の大形で嵩高
の基を有するシリルアルコールを合成することは従来方法には記載されていない
。これは、Kumadaら及び5eyferth、前出の文献により教示されて
いるようなビニルシランを介する主要な従来技術の合成方法が、必要な嵩高基で
適切に置換されたビニルシラン試薬を必要とするためである。
恐ら(立体的理由により、嵩高のビニルシランは容易に入手できず、容易に合成
できない。トリフェニルシランは公知である(Lesageら、 前出参照)が
、このような嵩高のシランは嵩高のビニルシランを形成するためにビニル基と関
連付けられていない。
一方、一般式:
[式中、R7、R2及びR3はアリール(例えばフェニル及びナフチル):置換
アリール(例えばメトキシフェニル又はニトロフェニル);アラルキル(例えば
トリフェニルメチル);枝分かれ鎖中に少な(とも4個の炭素を有するアルカリ
ール及びアルキル又は置換アルキル(例えばt−ブチル、ネオペンチル、ネオヘ
キシル、シクロヘキシル、3−ペンチル及び3−エチル−3−ペンチル)のよう
な立体的に嵩高の基から独立して選択される]を有する立体的に嵩高のシリルア
ルコールを上記方法により製造することができる。上式中、nは2〜約20の整
数、通常は2〜約6、最適には2である。化合物の例を下表に列挙するが、化合
物の例は表中の例に止まらない。
表2= 新規シリルアルコールの例
R,R,R,旦
フェニルフェニル フェニル2
フエニル フェニル フェニル 6
フエニル フェニル t−ブチル 2
フエニル t−ブチル t−ブチル 2フエニル ナフチル ネオペンチル 2
t−ブチル t−ブチル ネオペンチル 2フエニル ナフチル t−ブチル
2
フエニル t−ブチル ネオヘキシル 2フエニル フェニル フェニル 3
フエニル フェニル t−ブチル 3
t−ブチル t−ブチル フェニル 3フエニル ナフチル ネオペンチル 3
t−ブチル t−ブチル ネオペンチル 3フエニル ナフチル t−ブチル
3
フエニ/lz t−ブチル ネオヘキシル 3後述する理由から置換嵩高基は非
極性置換基を有することが好ましい。
上述のように、シリルアルコールはリン酸化剤及び保護剤を製造するのに有用で
ある。これらの物質については以下に詳述する。
D、リン酸化試薬
多種の試薬がオリゴヌクレオチドをリン酸化することができ、即ちオリゴヌクレ
オチドの末端にリン酸基を加えることができる。一般に、これらの試薬はホスホ
トリエステル試薬、ホスホネート試薬(水素又はアルキル)及びホスホラミシト
(phosphoramidi te)試薬として分類される。これらの試薬の
各々がオリゴヌクレオチドをリン酸化する機序については文献に記載されている
。
新規リン酸化試薬は式:
(式中、R,、R,及びR7はH;アルキル、アリール、置換アルキル、置換ア
リール;アルキル、アリール、置換アルキル、置換アリールのオキサ及びチア類
似体:並びにハロゲンから独立して選択され、Qはホスホラミシト、アルキルホ
スホネート、ホスホン酸水素塩及びホスホトリエステルから構成される群から選
択される部分を表す)により表される。
ホスホラミシトの場合、Qは式:
[式中、Raは一般に2−シアノエチル、メチル、エチル、2−アルキルスルホ
ニルエチル、2−(p−ニトロフェニル)エチル、2−(9−フルオレニル)エ
チル、2−(2−アントラキノニル)エチル、2−アルキルチオエチル、2−ア
リールチオエチル、2−トリハロメチルエチル、2−フェニルエチル及び2−(
2−ナフチル)エチルから構成される群から選択され、Ro及びRIoは一般に
Hl又は炭素数1〜6の直鎖もしくは枝分かれ鎖アルキルから独立して選択され
る]を有する。非常に一般的なホスホラミシト部分において、R8は2−シアノ
エチルであり、Re及びR1゜はいずれもイソプロピルである。
新規シリルホスホラミシトはクロロホスホラミシトをシリル置換アルコールと反
応させることにより常法で製造され得る。例えば参考資料として本明細書の一部
とするK。
5ter Tetrahedron Letters。
24 : 5843 (1983)を参照されたい。ここでは、2−シリル−エ
タン−1−オールを使用するのが好ましい。
反応条件は文献から周知である。
ホスホトリエステル試薬の場合、Qは式:(式中、Yはヒドロキシル又はアルコ
キシである)を有する。
ホスホン酸水素塩又はアルキルホスホネート試薬の場合、Qは上記式を有するが
Yは夫々H又はアルキルである。
E、リン酸化剤を使用する方法
上記ホスホラミシト、ホスホトリエステル及びホスホネート試薬は、オリゴヌク
レオチド、特に固体支持体上で合成されたオリゴヌクレオチドをリン酸化するた
めの方法で使用することができる。単一のヌクレオシドやもっと長いポリヌクレ
オチドも同様にリン酸化できることは当業者に理解されよう。簡単にするために
、「オリゴヌクレオチド」なる用語は1〜数百個のヌクレオシドサブユニットを
有する構造を含むものと理解されたい。
オリゴヌクレオチドの合成方法としては多(の方法が文献から公知であり、使用
される特定方法は本発明には関係ない。しかしながら、一般には自動合成が好ま
しく、ABl 380A 5ynthesizer又はMilligen 87
00 5ynthesizerのような市販の装置を使用して実施することがで
きる。
このような自動合成器により使用される反応段階は一般に当業者に公知であるの
でここで繰り返す必要はない。しかしながら、ホスホラミシト又はホスホン酸水
素塩試薬を使用する場合には、形成される中間体が3優麗リン酸塩であることに
留意されたい。後段階で中間体を酸化し、生物学的に有用な5価リン酸塩を得る
。この酸化段階は例えば自動合成方法でヨウ素を使用して容易に実施される。
本発明の主要な利点は、支持体からオリゴヌクレオチドを除去せずに合成と同一
の装置でリン酸化段階を実施できるという点にある。あるいは、存在するアミノ
及びヒドロキシ基が保護され得るという条件下で、他の方法(例えば酵素法)に
より合成したオリゴヌクレオチドを本発明の方法によりリン酸化してもよい。
公知のリン酸化方法は発明の背景の項で説明したが、シリル試薬を使用している
ものは皆無である。本発明によると、前項に記載したように調製したリン酸化試
薬の任意のものを使用してオリゴヌクレオチドをリン酸化することができる。方
法及び条件は従来通りであるが、試薬は新規である。実施例により詳細を説明す
るが、方法は一般にオリゴヌクレオシドの5″ ヒドロキシルを上記リン酸化試
薬と反応させ、最終的にシリル基により保護されたホスホジエステルを形成する
ことからなる。
シリルで保護されたリン酸化中間体は下記構造:(式中、R8、R6及びR7は
上記のように選択され、ZはH又はOHであり、B A S E l;!核酸塩
基A、C,G、TもしくはUの1種又はその類似体を表す)を有する。末端ヌク
レオシドは3゛炭素で支持体に結合される(単一ヌクレオシドをリン酸化する場
合)か、又はより一般には1個以上の他のヌクレオシドの鎖に結合され得る(オ
リゴヌクレオチドを形成する)。一般に、このようなヌクレオシド鎖はホスホジ
エステル結合を介して結合されるが、他の結合も可能である(例えばアルキルホ
スホネート中性プローブ)。自明のことながら、ZがHであるならばヌクレオシ
ドはデオキシリボヌクレオシドであり、ZがOHであるならばリボヌクレオシド
である。塩基A、C,G、T又はUの類似体は、オリゴヌクレオチドに取り込ま
れた場合に夫々の相補的塩基とのワトランークリック型塩基対合が許容可能な化
合物である。参考資料として本明細書の一部とするUSPTO公報1114 0
G 43には数種の塩基類似体の例が記載されている。
生物学的用途(例えば鋳型案内連結)のためにはシリル保護基を除去しなければ
ならないが、保護中間体も有用である。シリル基は特に嵩高の疎水性置換基R6
、R6及びR1を有する場合、クロマトグラフィー(例えばHPLC)により非
リン酸化不良生成物からリン酸化オリゴヌクレオチドを精製及び分離するための
「ハンドル」として有用である。R基が十分に疎水性であるならば、シリル保護
基を有するオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドが5G量体の長さに近い場
合でも非リン酸化非保護オリゴヌクレオチドから容易に区別できる。当然のこと
ながら、もっと短い長さも容易に分離される。従って、リン酸化の首尾を監視す
るためには有用であるが、生成物を分離又は精製するためには有用でない公知ト
リチル保護基よりも一歩前進した。
所望に応じてリン酸化及び/又は分離後に脱保護段階を実施し、5′末端リン酸
基を生成してもよい。脱保護段階は所望のリン酸基を生成するために有用な任意
の方法により実施される。上述のようにシリル置換基が酸素に対してβ位にある
ときに特に有用な好適方法は、保護ホスホジエステルをフッ化物イオンと反応さ
せ、シリルフルオライド、エチレン及び末端リン酸基を得る。テトラブチルアン
モニウムフルオライド(TBAF)はシリル保護基を除去するために有用なフッ
化物イオンである。この反応は、上記リン酸化試薬を使用する場合にエチレンの
遊離により駆動される。例えばGrob、He1v、Chim、Acta。
38 : 594 (1955)参照。このため、2−シリル−エタン−1−オ
ール(β−シリルエタノール)が好適なシリルアルコール試薬である(ホスホジ
エステルのケイ素と酸素の間に2個の炭素を有するので、エチレンをGr。
b脱離することが可能である)。脱保護段階では他の部分はβシリル−エタノー
ル誘導体はど容易に除去されない。
「保護」基及び「脱保護」段階は、リン酸基の酸素に結合したシラプロピル置換
基に関連する。保護基は酸素原子に影響するその後の反応から通常の意味での「
保護」を与えるものであってもよいし、与えないものでありでもよい。
しかしながら、シラプロピル基を使用してリン酸化オリゴヌクレオチドを非リン
酸化不良生成物から分離する能力と、所望のリン酸基を得るための後続する基の
除去とにより、保護基なる用語は「ハンドル」と同義として使用される。
以下、非限定的な実施例により本発明をより詳細に説明A、シリルアルコールの
調製:
実施例1:
a) 1. 1. 1−トリフェニル−3−アセトキシ−1−シラプロパン(3
)の調製
酢酸ビニル(1)3.69mL (40mmo l) 、トリフェニルシラン(
2)10.42g (40mmo 1)及びRh2C12(Co)477.8m
g (0,25mmo 1)をトルエン40mLに溶解してなる溶液を室温でN
、雰囲気下に合計63時間撹拌した。この規模で反応を数回繰り返し、予期不能
な誘導期後、迅速に発熱した。この反応の拡大は予め用意した冷却浴で実施すべ
きである。非常に暗色の反応混合物を脱色用活性炭5gで処理し、混合物を短時
間煮沸した。冷却後、混合物をCe1ite(登録商標)の1cmパッドで濾過
し、濾液及び洗液を集めた。溶剤を蒸発させ、残渣を減圧乾燥した。この時点で
粗材料を加水分解段階に移した。NMR分析によると、a:β比は1:1.57
であった。化合物同定の目的で以下のプロトコルを実施した。 25mm1.D
、x150mm長シリカゲルカラム上でシクロヘキサン中4%EtOAcを使用
して粗材料の100mgサンプルをフラッシュクロマトグラフィーにかけた。M
eOHから再結晶後、化合物(3)29mgを得た。mp67−68℃。
IR: (CDCIs、cm”) 3070 (m)。
1728 (vs)、 1425 (vs)、 1249 (vS)。
MS: (DCI/NHs)m/e364(M+NH4)。
NMR: (300MHz、 CDzC1りδ7.6−7゜3 (m、15H,
〕xニル)、 4.22 (AlB2のδ3.2H,CH20)、 1.87
(s、3H,CHs)、 1゜86 (A2B2のA 2. 2 H,CHzs
i)。
”CNMR: (75MHz、CDCl5) δ171゜1 (C=O)、 1
35.5 (メタ)、134(イブソ)、129.7(パラ)、128(オルト
)、 62゜1(CH2O)、21(Me)、14.4(CHzS i )。
元素分析: C22H2xo zs 1の計算値C76,26゜H6,40;
実測値C76,45,H6,37゜b)1,1.1−トリフェニル−1−シラプ
ロパン−3−オール(4)の調製
粗化合物(3)をMeOHloomLに溶解させ、K。
coslo、ogを一度に加えた。反応は室温で1時間撹拌後に完了した。固体
を濾別し、濾液を濃縮した。濃縮残渣を100/100mL H,O/EtOA
c間で分配した。溶剤を有機層から除去後、残渣を減圧乾燥した。41mm 1
.D、x15Qmm長シリカゲルカラムを使用してフラッシュクロマトグラフィ
ー(シクロヘキサン中18%E tOAc、R+=0.32)にかけ、化合物(
4)3゜42g(28%)を得た。シクロヘキサンから再結晶させ、分析サンプ
ルを純白固体として得た。mp96−97℃。
IR: (CDCIs、cm−’) 3616(m)。
2970 (m)、 1429 (vs)。
MS+ (FAB/DMF−Kl) m/e343(M十K)。
NMR: (300MHz、CD5OD)δ7.55−7.3 (m、15H,
)xニル)、 3.73 (AtBiのB!、2H,CH20) 、1.78
(A2BtのA、、2H。
CHzSi)。
”CNMR: (75MHz、CDCl s)δ135゜5(メタ)、 134
.4(イプソ)、 129.6(バラ)、 128(オルト)、 59.8 (
CHzO)。
18.7 (CHzS i)。
元素分析: CzoHtoOS i ・0.2H!0の計算値:C77,98,
H6,67; 実測値:C77,92、H6,62゜
実施例2:
a)1.1−ジメチル−1−フェニル−3−アセトキシ−1−シラプロパンの調
製
PhMezS iH6,13mL (40mmo 1)及び酢酸ビニル3.69
mLをトルエン40mLに溶解してなる溶液にRh*CI x (Go)δ61
.3mg (0,16mmo1)を加えた。すぐに反応物は熱及び気体を発生し
た。
5分以内に山吹色の反応物は濃茶色に変色した。1時間後、反応は完了した。反
応物を実施例1aに記載したように処理し、組付加物8.39gを得た。陽子N
MR分析によると、a:β付加比は1.44:1.0であった。サンプル100
mgを実施例1aと同様にフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、標記化
合物28mgを無色油状物として得た。
IR: (CDCIg、 cm−’) 2960(m)。
1724 (vs)、 1426 (m)、 1255 (vS)。
MS : (DCl/NHs)m/e 240(M+NH4)。
NMR: (300MHz、CDCIg)67.6−7゜3 (m、5H,フェ
ニル) 、4. 18 (A!BlのB、。
2H,CHg0)、 1.99 (s、3H,Me)、 1゜25 (AlB2
(OA!、2H,CH!S i)、 0.35 (S。
6H,SiMe)。
”CNMR: (75MHz、CDCIg) δ171゜1 (CO)、 13
8 (イプソ)、 133.4(メタ)。
129.2(バラ)、 127.9(オルト)、 62゜3 (CHtO)、
21.1 (Me)、 16.5 (CHtS i)、 −2,9(S iMe
)。
元素分析: C1!H1,0!Siの計算値:C64,82、H8,16゜実測
値: C65,02,H8,07゜
b)1.1−ジメチル−1−フェニル−1−シラプロパン−3−オールの調製
上記すからの粗生成物の残り8.29gを実施例1の場合と同様に処理し、1,
1−ジメチル−1−フェニル−1−シラプロパン−3−オール1.64gを無色
油状物として得た(全体収率23%)。
IR: (CDC13,cm−’) 3616 (m)。
2960 (m)、 1425 (m)、 1251 (s)。
MS + (D Cl / NHs) m/ e 198 (M+NH4)。
NMR: (300MHz、CDCIg)δ7.6−7゜3 (m、5H,フェ
ニル)、 3.75 (A、B!のB2゜2H,CHzO)、 1.49 (s
、1.2H,OH)。
1.22 (AzBzのA!、2H,CHtS i)、 0.33 (s、5H
,SiMe)。
”CNMR: (75MHz、CDCl5) 6138゜5(イブソ)、 13
3.4(メタ)、 129(バラ)。
127.8 (オルト)、 59.9 (CHIO)、 21、 1 (CHt
S i)、 −2,8(S iMe) 。
元素分析: C8゜H+5OSi・0.LH!Oの計算値:C65,92,H8
゜99; 実測値:C65,95、H8,97゜
実施例3
a)1.1.1−トリエチル−3−アセトキシ−1−シラプロパンの調製
Et3SiH6,39mL (40mmol)及び酢酸ビニル3.69mL (
40mmo 1)をトルエン40mLに溶解してなる溶液にRhtC1x(Co
)461.3mg(0,16mmo I)を加えた。注意: 反応物は熱及びガ
スを発生する。約5分以内に反応混合物は暗色に変色した。1時間後にTLC分
析(シクロヘキサン中10%EtOAc)により反応は完了したと判断した。必
要に応じて実施例1aに記載したように反応物を処理及び精製した。
b)1.1.1−トリエチル−1−シラプロパン−3−オールの調製
a)からの粗生成物をトリフェニルシリルエタノールの場合(実施例1)と同様
に処理すると、i、i、i−トリエチル−1−シラプロパン−3−オールが得ら
れる。
実施例4: 1,1.1−1リフェニル−1−シラヘプタン−7−オール(5)
の調製
ピリジン/無水酢酸15/15mL中でアルコール4゜8mL (40mmo
l)を4時間還流することにより5−ヘキサン−1−オールの酢酸塩を調製した
。溶剤を減圧下に除去し、残渣を十分に減圧乾燥した。粗酢酸塩をトルエン40
m Lに溶解させ、トリフェニルシラン10.42g。
次いでRhzCI z (Co) 477.8mg (0,25mmol)を加
えた。反応物を室温でN2雰囲気下に24時間撹拌すると、この間に反応物は濃
茶色に変色した。多少量の異性体2−メチル−i、1.1−トリフェニルシラヘ
キサン−6−オールを予想することができる。必要に応じて異性体をクロマトグ
ラフィーにより分離することができる。
実施例1aに記載したように処理した後、1bに記載したように塩基加水分解し
、標記化合物(5)を得た。
B、リン酸化試薬の調製:
実施例5: 2−トリメチルシリルエチル−2−シアノエチル−N、N−ジイソ
ブロピルアミノホスホラミシト(1)の調製
2−トリメチルシリルエタノール(Aldrich Chemical、 Mi
lwaukee、Wlの市販品、又は上記実施例2と同様に調製)573μL(
4mmol)及び1−Pr、NEtl、39mL (8mmol)をOCTHF
8mLに溶解してなる溶液に2−シアノエチル−N。
N−ジイソプロピルアミノクロローホスホラミシト892μL (4mmo 1
)を一度に加えた。反応物はほぼ即座に著しく濁った。水浴を除去し、反応物を
室温で一晩、合計19時間撹拌した。濾過して1−Pr、NEt−HCIを除去
後、THFを蒸発させた。残渣を50150mL Et OA c / 0 、
1 M N a I COs、pH12間で分配した。
相分離及び有機相の溶剤除去後、残渣を減圧乾燥した。150mmX25mm
IDカラム上でシクロヘキサン中12%EtOAcを使用してフラッシュクロマ
トグラフィーにかけ、標記化合物573.8mg (78%)を氷状−白色粘性
油状物として得た(シクロヘキサン中15%EtOAc中でR,=0.65)。
MS : (DC1,NHI) 319 (M+H) 、 291 (M−HC
N)。
NMR: (CD2C1t)δ3.9−3.62 (m、4H)、 3.56(
dsept、2H,JcM=7.0Hz。
JPH=10.OH2,NH)、 2.59 (t、2H,J”6.2Hz、C
HzCH)、 1.15 (dd、12H。
Jc11=7.o、J+++=2.2Hz、Me)、 0.97(tQ、2H,
J=8.0.0.7Hz、CH*Si)。
0.03 (s、9H,SiMe)。
実施例5: 2−トリフェニルシリルエチル−2−シアノエチル−N、N−ジイ
ソプロビルアミノホスホラミシト(6)の調製
化合物(4)3.04g (10mmo l) 、1−Pr。
NE t 4.18mL (24mmo I)及び4.4−ジメチルアミノピリ
ジン5mgt−Oc′CTHF15mLi:溶解してなる溶液に、2−シアノエ
チル−N、N−ジインブロピルアミノクロロホスホラミシト(5)2.68mL
(12mmol)を一度に加えた。白色沈殿がほぼ即座に形成された。0℃で
30分後に反応は完了した。溶剤の除去後、残渣を100/100mL O,I
M NatCOs/E t。
Acの間で分配し、相を分離した。水相をEtOAc50mLで再抽出し、有機
相を合わせて濃縮及び減圧乾燥した。
41mm1.D、x150mm長シリカゲルカラムを使用してフラッシュクロマ
トグラフィー(シクロヘキサン中10%EtOAc)にかけ、−晩減圧乾燥後に
(6)3.35gを粘性無色油状物として得た(66%)。この材料を数週間か
けて一20℃フリーザーで徐々に結晶させた。クロマトグラフィー中、フラッシ
ュクロマトグラフィーに使用される分画管又はシリカゲル中の外来酸の影響を最
小限にするために、各フラクションにNEt、100μLを加えた。
IR: (フィルム、cm−’)2962 (m)、 1426(m)。 ′
MS: (DCI/NHs)m/e505(M+H)。
NMR: (300MHz、CD5CN)δ7.6−7゜3 (m、15H,フ
ェール)、3.9−3. 7 (m、 2H,CHzO)、 3.66 (dt
、2H,Jcl+=5.9H2,JPM=7.7H2,CHIO)、 3.51
(dsept、2H,Jc++=6.5Hz、jp、l=9.9Hz、NH)
、 2.54 (t、2H,J=5.5H2,CHICN)、 1.87 (b
r t、2H,J=6.3Hz、CHas i)、 1.07 (dd、12H
,Jcu=6.6Hz、J=、I=29.4Hz、ME)。
”CNMR: (75MHz、CD5CN)δ136゜3(メタ)、 135.
5(イブソ)、 130.7(バラ)、 129(オルト)、 117.7 (
CN)、 61、 1 (d、JPc=18. 3Hz、CHzO)、 59゜
3 (d、J−c”18. 3Hz、CHzO)、 43. 6(d、J−cm
12.2Hz、NCH)、 24.8 (仮想t、Jpe=7. 3Hz、Me
)、 21 (d、JPC=7゜3Hz、CHICN)、 17. 2 (d、
JPc=7. 3Hz、CH,Si) 。
”P NMR: (202MHz、CD5CN) δ14チル−N、N−ジイソ
プロビルアミノホスホラミシトの調製
実施例3bの生成物を出発化合物として使用した以外は実施例5と同様に操作し
、標記化合物を得た。
実施例8: 2−ビスメチルフェニルシリルエチル−2−シアノエチル−N、N
−ジイソブロピルアミノホスホラミシトの調製
実施例2bの生成物を出発化合物として使用した以外は実施例6と同様に操作し
、標記化合物を得た。
実施例9: トリフェニルシリルエチルホスホン酸水素塩−DBU試薬の調製
N−メチルモルホリン(8g当量)、トリアゾール(33当量)及びPCI、(
10当量)の溶液に0℃でトリフェニルシリルエタノールを加えた。反応物をこ
の温度で2゜5時間撹拌した。100Mm 1.5−ジアザビシクロ[5,4,
0]ウンデク−5−エン(DBU)−重炭酸塩を加えることにより反応を停止し
、相を分離した。有機相をストリップして減圧乾燥し、粗ホスホン酸水素塩−D
BUをクロマトグラフィーにより精製した。
C,リン酸化保護オリゴヌクレオチドの調製及びその脱保護
実施例10:
a)DNAの自動リン酸化における(6)の使用ホスホラミシト(6)(上記実
施例6)を使用してABl (Foster C1ty、 CA)380A D
NA5ynthes i zerにより25量体オリゴヌクレオチドを1μmo
ルベルでリン酸化した。「待機」時間(ホスホラミシト溶液と支持体との接触時
間)及び「洗浄」時間をいずれも2倍にした以外は、製造業者の合成プログラム
に従ってホスホラミシトカップリングを行った。分取HPLCの結果、図1に示
すように全長オリゴから不良配列の分離が観察された。
b)リン酸化オリゴヌクレオチドの脱保護a)から収集した材料(7)を減圧乾
燥した後、エタノール沈殿させた。次にDMSO/1.0Mテトラ−n−ブチル
アンモニウムフルオライド(TBAF) (A l d r ich、Mi 1
waukee、Wl)100/100μLを使用して精製DNAを脱シリル化し
た。反応は68℃加熱ブロック中で3.5時間行った。反応物を水300μLで
500μLに希釈し、反応物をNAP−5カラム(Pharmacia、Pis
cataway、NJ)に通すことにより脱塩した。溶離液1.0mLを減圧乾
燥した後、エタノール沈殿させ、精製された末端リン酸化DNAを得た。
この材料のHPLC分析を図2に示す。
実施例11・
実施例6のホスホラミシト試薬の代わりに実施例5のホスホラミシト試薬を使用
した以外は実施例10と同様に操作した。
実施例6のホスホラミシト試薬の代わりに実施例7のホスホラミシト試薬を使用
した以外は実施例10と同様に操実施例6のホスホラミシト試薬の代わりに実施
例8のホスホラミシト試薬を使用した以外は実施例10と同様に操カップリング
試薬を塩化アダマントイルとし、キャッピング試薬をホスホン酸水素β−シアノ
エチルとした以外は、Froehlerら、Tetrahedron Lett
ers、 27:469−472 (1986)の一般反応プロトコル及び条件
に従い、実施例9からの試薬を使用してオリゴヌクレオチドをリン酸化した。5
′−ヒドロキシオリゴヌクレオチドを塩化アダマントイル触媒によりホスホン酸
水素トリフェニルシリルエチルとカップリング後、オリゴヌクレオチド中の全ホ
スホン酸水素塩結合をヨウ素でホスホジエステル酸化状態まで酸化した。得られ
たオリゴヌクレオチドは、ホスホラミシト化学を使用して調製される同一配列の
DNAと同様にHPLC上で分離することができる。この材料をホスホラミシト
により調製されるオリゴヌクレオチドと同様に脱シリル化してもよい。
FIG、 2
補正書の写しく翻訳文)提出書(特許法第184条の8)平成5年12月7日−
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.式: ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中、R5、R6及びR7はH;アルキル、アリール、置換アルキル、置換ア リール;アルキル、アリール、置換アルキル及び置換アリールのオキサ及びチア 類似体;並びにハロゲンから構成される群から独立して選択され、Qはホスホラ ミジト、アルキルホスホネート、ホスホン酸水素塩及びホスホトリエステルから 構成される群から選択される部分を表す)を有する、ヌクレオシドの5′末端の リン酸化用試薬。 2.Qが式: ▲数式、化学式、表等があります▼ [式中、R8は2−シアノエチル、メチル、エチル、2−アルキルスルホニルエ チル、2−(p−ニトロフェニル)エチル、2−(9−フルオレニル)エチル、 2−(2−アントラキノニル)エチル、2−アルキルチオエチル、2−アリール チオエチル、2−トリハロメチルエチル、2−フェニルエチル及び2−(2−ナ フチル)エチルから構成される群から選択され、R9及びR10はH、又は炭素 数1〜6の直鎖もしくは枝分かれ鎖アルキルから独立して選択される]を有する ホスホラミジト部分からなることを特徴とする請求項1に記載の試薬。 3.R5、R6及びR7が疎水性基であることを特徴とする請求項2に記載の試 薬。 4.R5、R6及びR7が立体的に嵩高であり且つアルキル、アリール、置換ア ルキル及び置換アリールから構成される群から独立して選択されることを特徴と する請求項2に記載の試薬。 5.R5、R6及びR7が各々フェニルであることを特徴とする請求項4に記載 の試薬。 6.Qが式: ▲数式、化学式、表等があります▼ [式中、YはH、アルキル、ヒドロキシル、アルコキシから構成される群から選 択され、R8は2−シアノエチル、メチル、エチル、2−アルキルスルホニルエ チル、2−(p−ニトロフェニル)エチル、2−(9−フルオレニル)エチル、 2−(2−アントラキノニル)エチル、2−アルキルチオエチル、2−アリール チオエチル、2−トリハロメチルエチル、2−フェニルエチル及び2−(2−ナ フチル)エチルから構成される群から選択される]を有する部分からなることを 特徴とする請求項1に記載の試薬。 7.YがH又は低級アルキルであることを特徴とする請求項6に記載の試薬。 8.Yがヒドロキシル又は低級アルコキシであることを特徴とする請求項6に記 載の試薬。 9.R5、R6及びR7が疎水性基であることを特徴とする請求項6に記載の試 薬。 11.R5、R6及びR7が立体的に嵩高であり且つアルキル、アリール、置換 アルキル及び置換アリールから構成される群から独立して選択されることを特徴 とする請求項9に記載の試薬。 12.a)リン中間体が3価状態である場合にはその後の段階で5価状態に酸化 するという条件で、オリゴヌクレオチドの5′ヒドロキシルを請求項1に記載の 試薬と反応させ、シリル基により保護されたリン中間体を形成する段階と、 b)R8離脱基を除去する段階と、 c)ホスホジエステルを脱保護し、5′末端リン酸基を生成する段階とを含む、 オリゴヌクレオチドの5′ヒドロキシル末端を化学的にリン酸化する方法。 13.脱保護段階が、保護ホスホジエステルをフッ化物イオンと反応させ、シリ ルフルオライド、エチレン及び末端リン酸基を生成することにより実施されるこ とを特徴とする請求項12に記載の方法。 14.シリル部分上の区別可能な置換基に基づいてクロマトグラフィーにより、 前記脱保護段階前にシリル保護ホスホジエステル生成物を非リン酸化生成物から 分離する別の段階を含むことを特徴とする請求項12に記載の方法。 15.保護5′末端リン酸基を有しており且つ式:▲数式、化学式、表等があり ます▼ (式中、R5、R6及びR7は独立してH;アルキル、アリール、置換アルキル 、置換アリール;アルキル、アリール、置換アルキル及び置換アリールのオキサ 及びチア類似体;並びにハロゲンから構成される群から選択され、ZはH又はO Hであり、BASEは核酸塩基A,C,G,TもしくはUの1種又はその類似体 を表す)を有するヌクレオシド。 16.R5、R6及びR7が疎水性基であることを特徴とする請求項15に記載 のヌクレオシド。 17.R5、R6及びR7が立体的に嵩高であり且つアルキル、アリール、置換 アルキル及び置換アリールから構成される群から独立して選択されることを特徴 とする請求項15に記載のヌクレオシド。 18.R5、R6及びR7が各々フェニルであることを特徴とする請求項17に 記載のヌクレオシド。
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