JP2673605B2 - リン酸化剤およびそれを用いたホスホジエステル結合形成法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、リン酸化剤およびそれを用いたホスホジエ
ステル結合形成法に関するものである。

［従来技術］ ホスホジエステル結合は核酸をはじめとしてリン脂
質、糖ホスフェート、補酵素等多くの生体分子に普遍的
に存在している。これらの分子は生物がその機能を発現
し、自らの種を保存するためには必須のものである。こ
の生体分子の持つ優れた機能を模倣し、有機化学の知識
を活用することにより化学、さらに工学のレベルでの応
用をはかろうとする動きが近年活発になってきている。
このためホスホジエステル結合を有する分子を効率良く
合成することは、近年の有機合成の最も重要な問題の１
つとなっていた。

最も普通に考えれば、ホスホジエステル結合を形成す
るには、２種類のアルコール成分を２価のリン酸化剤で
順次リン酸化するのが最も簡単かつ合理的な方法であ
る。この目的のために最も良く用いられるリン酸化剤
は、フェニルリン酸ジクロリドをはじめとするクロロホ
スフェート類である（ケミストリー・アンド・フィジッ
クス・オブ・リピッド41巻、1980年、１頁など）。特に
フェニルリン酸ジクロリドは現在では市販されており、
このものを用いて２種類のアルコールを順次リン酸化す
るという方法は、核酸やリン脂質合成では最も初期から
用いられている単純かつ確実な方法である。しかしこの
リン酸剤は脱離基としての塩素原子を２個含む２官能性
試薬であり、１回目と２回目のリン酸エステル化にほと
んど反応性の差がないため、不要な対称リン酸エステル
の副生を伴うことが従来大きな欠点となっていた。例え
ば初期の核酸合成研究でもこの方法が用いられ、1978年
にReeseらはフェニルリン酸ジクロリドを用いてTpTの合
成を報告したが、この場合もやはり３′→３′ジヌクレ
オチドエステルの副生が問題点として指摘されている
（テトラヘドロン34巻、1978年、3143頁）。

このような問題点を回避するため、各種の方法がこれ
までに開発されてきた。まず、Reeseらは、２種類の能
力の異なる脱離基ＸおよびＹ（脱離能:X＞Ｙ）を有する
リン酸化剤を検討した結果、脱離基のうち１個をｐ−ニ
トロフェノキシ基に置換したリン酸化剤として［３］を
見出し、オリゴヌクレオチド合成への適用を検討した
が、stepwiseな合成にしか適用できず、汎用性という点
で良い結果が得られなかった（テトラヘドロンレターズ
1978年,2727頁）。

また３価のリン酸化剤を用いる方法も、核酸合成研究
から発展してきた。これは３価のリンの高い反応性を利
用してインターヌクレオチド結合を形成した後、リンを
３価から５価に酸化してトリエステルとする方法であ
る。初期の研究ではホスホロクロリダイトを用いて反応
が検討され（テトラヘドロンレターズ21巻、1980年、71
9頁）、非常に迅速に目的物が得られることが見出され
たが、やはりこの場合も３′→３′ジヌクレオチドエス
テルが副生しやすく、また３価のリンが湿気に対して非
常に不安定なこと、ブロック結合ができないことから、
液相法ではこの方法は実用的でなかった。

その後Caruthersらのグループにより反応が詳細に検
討され、モルホリダイト、およびジイソプロピルアミダ
イトが充分に実用的であることが見出された（ヌクレイ
ック・アシッド・リサーチ11巻、1983年、2575頁、ジャ
ーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ10
5巻、1983年、661頁）。縮合反応終了後、ヨウ素−水で
酸化して目的とする保護リン酸トリエステルを収率良く
得ることができる。このアミダイト法を用いる核酸合成
は、担体や反応条件に種々の改良が加えられて現在では
ほとんどルーチン化され、これを機械化した核酸自動合
成機も市販されている。またBoomらはヌクレオペプチド
類の合成にアミダイト法を適用し、大きな成果をあげて
いる（テトラヘドロン44巻、1988年、6515頁）。さらに
ホスファイト法はリン脂質の合成に対しても適用可能で
あり、幾つかのリン脂質やその誘導体の合成が報告され
ている（例えばテトラヘドロン・レターズ29巻、1988
年、3631頁、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミス
トリー51巻、1986年、2368頁）。

しかし３価のリン酸化剤を用いる方法は、操作が繁雑
なのが難点である。例えばクロリダイトを用いる方法で
は、不要な対称体の副生を減らすため−78℃という低温
で反応を行う必要があり、またアミダイト法でも厳密な
無水条件が必要とされる。そのため極く少量を合成すれ
ばよい核酸類とは異なり、リン脂質合成等においては、
ホスファイト法は実用的なスケールでは問題が多いと言
わざるをえない。

これに対し、塩素原子以外の置換基でリン原子を活性
化した、２官能基性でありながら単官能性の性質を示す
５価のリン酸化剤が最近見出され、実用的な方法となっ
ている。

まず、Katagiri,Narangらは塩素原子の代りにアゾー
ルでリン原子を活性化したホスホロジトリアゾリド
［４］を見出し、不要な３′→３′ジヌクレオチドエス
テルを副生することなく非対称リン酸エステルを得るこ
とに成功した（ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカ
ル・ソサイアティ97巻、1975年、7332頁）。

また1981年にBoomらによって報告された１−ヒドロキ
シベンゾトリアゾール（HOBt）エステル［５］も有用な
リン酸化剤である（テトラヘドロン・レターズ22巻、19
81年、3887頁）。この方法はインターヌクレオチオ結合
の形成やリン脂質、ヌクレオペプチド合成にも適用可能
であり、収率良く目的物を得ることができると報告され
ているが、脱離する１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
を除くのに手間がかかり、操作性に問題が残る。

Kuniedaらは、２−オキサゾロンを置換したリン酸化
剤［６］の利用を報告している（テトラヘドロン・レタ
ーズ21巻、1987年、2375頁）。彼らは［６］によるリン
酸化が触媒量の金属イオン（アセチルアセトネートの形
で用いられる）により活性化されることを見出し、その
活性化の程度が金属の種類により異なることを利用し
て、１回目と２回目のリン酸化に差をもたせ、非対称な
リン酸エステルを得ることに成功している。しかしこの
方法も、単純かつ実用的であるかという観点からみる
と、まだまだ不十分である。

また、Ramirezらはリン酸の保護基が同時に活性化基
の役割も兼ねている試薬として、環状エンジオール誘導
体［７］を見出し［彼等はこれをCyclic Endiol Phosph
oryl（CEP）derivativeと呼んでいる］、２種類の異な
るアルコールから非対称ホスホジエステル結合を得る方
法を報告している（シンセシス1985年、449頁）。

このように非対称なホスホジエステル結合を有する化
合物を得る方法として各種の方法が発表されているが、
大抵の場合は不要な対称体を副生することが大きな欠点
となっていた。さらにこれらの方法は厳密な無水条件や
超低温を必要としたり、また試薬の調製に手間がかか
る、その試薬の保存安定性が悪い等の理由で必ずしも実
用的なものではなかった。

［発明が解決しようとする課題］ 従って本発明の目的は、ある程度大量のスケールでも
反応が行えるように、試薬が安定であり、かつ温和な条
件ですみやかに、選択性良く反応が進行するような新規
なリン酸化剤を提供することにある。さらに本発明の目
的は、反応終了後、通常の後処理操作だけで目的物を単
離することができるような、実用的な非対称ホスホジエ
ステル結合を形成する方法を提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 本発明の目的は、下記一般式［１］で表わされるリン
酸化剤、およびそれを用い、２種類の異なるアルコール
を順次縮合した後、リン酸の保護基であるＲ基を除去し
て非対称なホスホジエステル結合を形成する方法により
達成された。

式中Ｒはリン酸の保護基を表わす。ここでいうリン酸
の保護基とは通常の核酸、リン脂質合成において用いら
れる既知のものなら何でもよく、例えばフェニル基、ｏ
−クロロフェニル基等のアリール基、メチル基、2,2,2
−トリクロロエチル基、2,2,2−トリブロモエチル基、
２−シアノエチル基、シクロプロピルメチル基等のアル
キル基、アリル基等のなかから、目的とする化合物の性
質、脱保護条件を考慮して適宜選択される。ただし前駆
体となる保護リン酸ジクロリドの入手の容易さを考慮す
るとフェニル基、メチル基等が好ましい。

また式中Ｘは脱離基として作用する、下記一般式
［２］で表わされる複素環残基を表わす。

Ｙは存在するかあるいは存在しないヘテロ原子を表わ
し、存在する場合は酸素または硫黄原子である。Ｚは少
なくとも１個の窒素原子を環構成成分として含む複素環
核であり、他の芳香環と縮合していてもよい。このよう
な含窒素複素環としては、アゾール類（イミダゾール、
ピラゾール、トリアゾール、テトラゾール、ベンゾピラ
ゾール、ベンゾトリアゾール、ピラゾロトリアゾール
等）、環内に少なくとも１つの窒素原子と他のヘテロ原
子（酸素、硫黄、セレン等）を有するヘテロ環（オキサ
ゾール、チアゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾオキサ
ゾール等）、環状イミド等があげられる。ＷはHXのpKa
が3.0〜9.0の範囲に設定されるような置換基であれば何
でもよい。好ましくはフェニル基のような芳香族基、ニ
トロ基、ハロゲン基、スルホ基、アルコキシカルボニル
基、アリールオキシカルホニル基、アルキルスルホニル
基、アリールスルホニル基、シアノ基のような電子吸引
性基である。フェニル基、アルキル基は置換基を有して
もいてよいが、好ましい置換基はニトロ基、ハロゲン原
子、アルコキシカルボニル基である。またＷは２ケ以上
であってもよい。

さらに本発明の特徴は、以上の様に定義される脱離基
Ｘの共役酸HXのpKaが3.0〜9.0の範囲にあることが好ま
しいということである。この条件は本発明のリン酸化剤
が不要な対称体を副生せず、かつ適切な反応性を有する
ために特に重要である。

上記リン酸化剤は、相当するリン酸ジクロリドの溶液
にトリエチルアミンやピリジンのような３級アミンの存
在下、HXの溶液を室温で滴下することにより容易に調製
できる。用いられる溶媒としては、テトラヒドロフラ
ン、塩化メチレン、1,4−ジオキサン等のなかから、基
質の溶解性等を考慮して適宜選択される。この際アミン
の塩酸塩が生成するが、通常このものは除去することな
くそのまま引続くリン酸化反応に利用できる。

以下に一般式［１］で表わされるリン酸化剤の具体例
と、それを用いた反応例を示すが、本発明はこれらにな
んら限定されるものではない。

リン酸化剤［１］の一般的な調製法を、Ｒ＝Phの場合を
例にとって説明する。

フェニルリン酸ジクロリド（10mmol）のテトラヒドロ
フラン溶液に、HX（20mmol）とトリエチルアミン（20mm
ol）のテトラヒドロフラン溶液を氷冷しながら滴下す
る。反応液はトリエチルアミン塩酸塩の生成のため瞬時
に白濁する。反応混合物を室温まで昇温しながら30〜60
分撹拌した後、そのままリン酸化に用いる。

実施例１ リン酸化剤［８］を用いた完全保護ホスファ
チジルエタノールアミン体の合成（Ｒ＝Ph） フェニルリン酸ジクロリド（1.05g）のテトラヒドロ
フラン溶液に、３−ニトロ−1H−1,2,4−トリアゾール
（1.14g）とトリエチルアミン（1.01g）のテトラヒドロ
フラン溶液を氷冷しながら滴下した。反応混合物を室温
まで昇温しながら30分撹拌した後、引続くリン酸化に用
いた。

上記の方法により調製した［８］（5mmol）のテトラ
ヒドロフラン溶液に、（Ｓ）−2,3−ジ−０−ヘキサデ
シル−１−グリセロール［2.16g、文献［バイオケミス
トリー（Biochemistry）２、394（1963）］記載の方法
に従い調製］のテトラヒドロフラン溶液を10分かけて加
え、反応混合物を室温で30分撹拌した。TLCで原料の消
失を確認したのち、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルエタノ
ールアミン（650mg）とＮ−メチルイミダゾール（410m
g）のテトラヒドロフラン溶液を滴下した。反応混合物
を室温で30分間撹拌、TLCで反応の完結を確認したのち
反応液に適当量の水を加え、有機層を分取、水層を酢酸
エチルで抽出した。有機層をあわせて水で洗浄後、無水
硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウムを濾過して
除き、濾液を減圧濃縮して目的物を無色油状物として得
た。このものは低温ではロウ状に固化した。

このものは精製しなくても充分純粋であり、通常は次
の反応にそのまま利用できるが、ここではシリカゲルク
ロマトグラフィー（溶出液ヘキサン／酢酸エチル＝20/1
〜8/1）で精製し、目的物を2.8g（収率83.4％）得た。

以下に物性値を示す。

IR ν_max（Nujol）3330（ｍ）,3060（ｗ）,1720（ｓ）,
1595（ｍ）,1495（ｓ）,1280（ｓ）,1170（ｓ）,1120
（ｓ）,1060（sh）,1125（ｓ）,950（ｓ）,765（ｍ）,6
90（ｍ）cm^{-1 1}H NMRδ（200MHz,溶媒CDCl₃,標準物質TM
S）0.89（6H,deformed t,J＝6Hz）,1.28（52H,br s）,
1.44（9H,s）,1.40−1.60（4H,br）,3.37−3.70（9H,
m）,4.10−4.38（4H,m）,5.00−5.18（1H,br）,7.16−
7.40（5H,m）． FAB−MS 862［（Ｍ＋Na）^＋］ このようにして得た完全保護ホスチファチジルエタノ
ールアミン体は、公知の方法により脱保護し、目的とす
る非対称ホスホジエステル結合を有するホスファチジル
エタノールアミンを得ることができる。

実施例２ リン酸化剤［８］を用いた完全保護ホスファ
チジルセリン体の合成（Ｒ＝Ph） （Ｓ）−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルセリンベンジル
エステル［1.48g、文献［シンセシス（Synthesis）961
（1979）］記載の方法に従い調製］と（Ｓ）−2,3−ジ
−０−ヘキサデシル−１−グリセロール（2.70g）を用
いて実施例１に記載の方法とほぼ同様の反応時間、操作
により目的物を無色ロウ状物質として4.09g（収率82
％）得た。

以下に物性値を示す。

IR ν_max（Nujol）3260（ｍ）,2930（ｓ）,2860（ｓ）,
1745（ｓ）,1705（ｓ）,1600（ｍ）,1495（ｍ）,1270
（ｓ）,1210（ｓ）,1165（ｓ）,1065（ｓ）,1030（ｓ）
cm^{-1 1}H NMRδ（200MHz,溶媒CDCl₃,標準物質TMS）0.87
（6H,deformed t,J＝6Hz）,1.25（52H,br s）,1.45（9
H,s）,1.43−1.60（4H,br）,3,36−3.66（7H,m）,4.05
−4.30（2H,m）,4.33−4.65（3H,m）,5.08−5. 24
（2H,m）,5.48−5.68（1H,m）,7.11−7.40（10H,m）． FAB−MS 974［（Ｍ＋Ｈ）^＋］ このようにして得た完全保護ホスファチジルセリン体
は公知の常法により脱保護し、目的とする非対称ホスホ
ジエステル結合を有するホスファチジルセリンを得るこ
とができる。

比較例１ フェニルリン酸ジクロリドを用いた完全保護
ホスファチジルセリン体の合成 フェニルホスホロジクロリデート（PhOPOCl₂,2.74g、
市販品）の乾燥テトラヒドロフラン溶液に、（Ｓ）−Ｎ
−ｔ−ブトキシカルボニルセリンベンジルエステル（2.
95g）とＮ−メチルイミダゾール（1.07g）の乾燥テトラ
ヒドロフラン溶液を20分かけて加えた。反応混合物を室
温で10分間撹拌したのち、（Ｓ）−2,3−ジ−０−ヘキ
サデシル−１−グリセロール（5.4g）とＮ−メチルイミ
ダゾール（1.07g）の乾燥テトラヒドロフラン溶液を10
分かけて加え、室温に14時間放置した。反応液を水100m
lにあけ、クロロホルム100mlにて４回抽出した。有機層
をあわせて水150mlで１回洗浄後無水硫酸ナトリウムで
乾燥した。硫酸ナトリウムを濾過して除き、濾液を減圧
濃縮して無色油状物を得た。

この粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出
液ヘキサン／酢酸エチル＝20/1〜8/1）で精製し、目的
物を無色ロウ状物質として3.41g（収率35％）得た。

物性値は実施例２に記載のものと完全に一致した。

比較例２ フェニルリン酸ジトリアゾリドを用いた完全
保護ホスファチジルエタノールアミン体の合成 フェニルリン酸ジクロリド（1.05g）のテトラヒドロ
フラン溶液に、1H−1,2,4−トリアゾール（690mg）とト
リエチルアミン（1.01g）のテトラヒドロフラン溶液を
氷冷しながら滴下した。反応液はトリエチルアミン塩酸
塩の生成のため瞬時に白濁した。反応混合物を室温まで
昇温しながら30分撹拌した後、引続くリン酸化に用い
た。

上記の方法により調製したリン酸化剤のテトラヒドロ
フラン溶液に、（Ｓ）−2,3−ジ−０−ヘキサデシル−
１−グリセロール（2.16g）のテトラヒドロフラン溶液
を10分かけて加え、反応混合物を室温で６時間撹拌し
た。TLCで原料の消失を確認したのち、Ｎ−ｔ−ブトキ
シカルボニルエタノールアミン（650mg）とＮ−メチル
イミダゾール（410mg）のテトラヒドロフラン溶液を加
え、反応完結まで室温で15時間撹拌した。以下実施例１
に記載の方法とほぼ同様の後処理、精製により、目的物
を無色ロウ状物質として2.11g（収率63％）得た。

物性値は実施例１に記載のものと完全に一致した。

以下に各種リン酸化剤を用いた反応例と、目的物の収
率を＜表１＞にまとめて示す。実験方法は実施例１、２
に記載の方法とほぼ同様に行った。

［発明の効果］ 本発明の化合物は、２種類の異なるアルコールから非
対称なリン酸ジエステルを選択性良く形成するのに有用
なリン酸化剤である。このリン酸化剤は、トリエチルア
ミンやピリジンのような３級アミンの存在下、相当する
リン酸ジクロリドとHX（例えば、３−ニトロ−1,2,4−
トリアゾールや１−フェニル−５−メルカプト−1H−テ
トラゾール等）を、適当な溶媒中室温で反応することに
より容易に調製できる。この操作には極端な低温や厳密
な無水条件は必要なく、操作はきわめて容易である。さ
らに実施例からも明らかなように、２段階のリン酸化反
応は迅速かつ不要な対称体をほとんど全く副生しないた
め収率も良く、クロマトグラフィー等による精製操作も
通常不要である。また脱離基として作用する３−ニトロ
−1,2,4−トリアゾール等は水洗いにより容易に除去可
能であり、この点でも操作性が良い。このようにクリー
ンかつ大量反応が実現できる点で本発明の化合物は優れ
ており、本発明の効果はきわめて大きい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅ ｒｓ，Ｖｏｌ．28，Ｎｏ．21，ＰＰ. 2375〜2378，1987 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅ ｒｓ，Ｖｏｌ．22，Ｎｏ．39，ＰＰ. 3887〜3890，1981 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍ ｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏ ｃｉｅｔｙ，Ｖｏｌ．97，ＰＰ．7332〜 7337，1975

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記一般式〔１〕で表されるリン酸化剤。 式中、Ｒはフェニル基又はメチル基を表し、Ｘは脱離基
   として作用する、下記一般式〔２〕で表されるアゾール
   類、環内に少なくとも１つの窒素原子と他のヘテロ原子
   を有するヘテロ環又は環状イミドを表す。 Ｙは存在しても存在しなくてもよく、存在する場合には
   酸素または硫黄原子である。Ｚは少なくとも１個の窒素
   原子を環構成成分として含むアゾール類、環内に少なく
   とも１つの窒素原子と他のヘテロ原子を有するヘテロ環
   又は環状イミドである。Ｗはニトロ基、ハロゲン原子ま
   たはアルコキシカルボニル基である。
2. 【請求項２】Ｘの共役酸HXのpKaが3.0〜9.0の範囲にあ
   る、請求項１記載のリン酸化剤。
3. 【請求項３】請求項１に記載したリン酸化剤を用い、２
   種類の異なるアルコールを順次縮合した後、リン酸の保
   護基であるＲ基を除去して非対称なホスホジエステル結
   合を形成する方法。