JPH06508150A

JPH06508150A - 置換シリルアルコール

Info

Publication number: JPH06508150A
Application number: JP5500938A
Authority: JP
Inventors: セレブスキ，ジヨセフ・イー
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1991-06-07
Filing date: 1992-06-05
Publication date: 1994-09-14
Also published as: EP0591302A4; AU2180192A; WO1992022557A1; AU654249B2; US5159095A; EP0591302A1; CA2107910A1; KR940701398A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】置換シリルアルコール本発明は一般にシリルアルコール、その合成及びその使用に係る。より詳細には、本発明は特定のシリルアルコール及び、ヒドロキシルよりもむしろ炭素に結合したケイ素原子を有するシリルアルコールの合成方法に係る。本発明は更に、オリゴヌクレオチドをリン酸化するための試薬及び方法、並びにリン酸化オリゴヌクレオチドの精製に有用な中間化合物及び方法に係る。

本願は参考資料として本明細書の一部とする同一名義の米国特許第５，１１３．００５号に関連する。

発明の背景化学的に合成されたオリゴヌクレオチドはしばらく以前からハイブリダイゼーションアッセイで使用されており、今日ではかなり日常的に行われている。しかしながら、生物学的プロセスを模倣する使用、例えば鋳型上の核酸プローブのハイブリダイゼーションとそれに続（連結のためには、リガーゼの適正な基質を提供するように通常の５°　ヒドロキシル末端をリン酸基に変換しなければならない。リン酸化方法は後述するような酵素法及び合成法を含む。本発明は、シリル置換アルコールを有用な試薬とする特定の合成方法に係る。

シリル置換アルコールの合成は従来有機ボランの酸化により達せられている。有機ボランはグリニヤール反応又はビニル−及びアリル−シランのヒドロホウ素化により製造されている。この手法はＫｕｍａｄａら、　Ｊ、Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌ、ｃｈｅｍ、　６：４９０−４９５　（１９６６）及び５ｅｙｆｅｒｔｈ、　Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、　８１　：　１８４４　（１９５９）に記載されている。

この手法は必要なビニル又はアリルシランが合成可能な場合又は市販されている場合にしか利用できない。一方、所望のビニルシランが市販されていない場合又は合成が困難な場合にはこの方法は有用ではない。

α−シリルエステルはクロロシラン及びα−ブロモエステルをレフオルマドスキー条件下で亜鉛と反応させることにより製造されている。Ｆｅ５ｓｅｎｄｅｎら、Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｉ″Ｉｅｍ、３２　：　３５３５　（１９６７）参照。

これらの合成方法の主要な欠点は望ましくない生成物をもたらし、収率を低下させる副反応が生じ得るという点にある。シリル置換エステルを対応するシリル置換アルコールに加水分解するための従来方法では、一般にカルバニオン中間体が形成される。β−シリル置換アルコールではシラノールとオレフィンに分解する可能性があり、α−シリル置換アルコールでは、Ｂｒｏｏｋ転位によりシリル保護エーテルを生じる。即ち、これらのカルバニオン中間体では脱離反応の傾向が強く、ケイ素原子は酸素原子にシフトし、Ｒ５５ｉＯＨ副生物を形成する。この傾向は反応が強酸中で行われる場合及びケイ素上で置換された基が格別嵩高な場合に特に顕著である。

オレフィンの二重結合間にＨ及びシリル化合物を付加するヒドロシル化（ｈｙｄｒｏｓｉ　Ｉａｔｉｏｎ）も文献中に記載されている。Ｃｏ　ｌ　１ｍａｎら、　Ｐｒ１ｎｃｉｐＩｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｏｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ　Ｍｅｔａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｂｏｏｋｓ　（１９８０）　Ｉ）、３８４−３８９及びＰｅｇｒａｍら、　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１８４　：　２７６　（１９８８）参照。特に関連するヒドロシル化反応において、Ｓａｌｉｍｇａｒｅｅｖａら。

Ｚｈ、０ｂｓｈｃｈ、Ｋｈｉｍ　４８　（４）：９３０−３１　（１９７８）（ロシア）（Ｃ，Ａ、　８９：１４６９６１ｙも参照）はジメチルシランによる酢酸ビニルのヒドロシル化を報告している。この反応では２種のシリル置換生成物、即ちモノアセテートとジアセテートが生成された。しかしながら、シリルアルコールの合成又は嵩高のシリル置換化合物の使用もしくは合成について記載されていない。

Ｈｏｎｄａら、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　２２　（２２）：　２０９３−２０９６　（１９８１）は、シリル基が２個のフェニル置換基と１個のメチル置換基を担持するβ−シリル置換エタノールを記載している。Ｈｏｎｄａらはオリゴヌクレオチド合成でヌクレオチド間に保護リン酸基を配置するリン酸化剤を製造するためにこの化合物を使用した。置換シリル保護基を除去すると、シリルフルオライド化合物、エチレン及びリン酸基が得られる。置換シリルエタノールは、Ｇｅｒｌａｃｈ、Ｈｅ１ｖ　Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ、　６０：３０３９（１９７７）の手順の変法に従ってビスフェニルメチルシリルアセテートをＬｉＡｌＨ４で還元することにより得られた。

他のシリル置換エタノールは文献に記載されているが、主にアルキル置換シリル基を含む。このようなシリルエタノールの例及びその引用文献名を以下の表に示す。

トリフェニルシラン（アルコールでない）はＬｅｓａｇｅら、　Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ　５５：５４１３　（１９９０）により有用な還元剤として記載されている。

Ｈｏｎｄａら（前出）の方法以外に、オリゴヌクレオチドの５゛末端をリン酸化するための数種の方法が知られている。オリゴヌクレオチドを合成し、固体支持体から除去した後にポリヌクレオチドキナーゼを使用する酵素法が最初に使用された。その他に、固体支持体から除去する前に合成オリゴヌクレオチドを化学的にリン酸化するための方法及び試薬が教示されている。これらの教示の一部を以下に記載する。

Ｋｏｎｄｏら、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　５ｅｒｉｅｓ　１６：１６１−１６４（１９８５）は５′末端をリン酸化するためのホスホトリエステル（１）及びホスホラミシト（２）試薬を記載している。リン酸化は鎖中の最後のヌクレオチドとして付加される特別のニリン酸化（３’　−５ ’　）ヌクレオチドを調製することにより達せられる。３゛　リン酸基はホスホトリエステル又はホスホラミシトを介して伸長するヌクレオチド鎖に結合される。５°　リン酸基は最終的に除去される保護基で保護される。

Ｕｈｌｍａｎｎら、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２７　（９）：　１０２３−１０２６　（１９８６）は、ブロッキング基としてｐ−ニトロフェニルエチル基を使用するホスホラミシトリン酸化試薬を記載している。

この文献によると、疎水性ｐ−ニトロフェニルエチルは逆相ＨＰＬＣによりリン酸化化合物を非リン酸化化合物から分離できるという利点がある。

しかしながら、Ｕｈｌｍａｎｎらはｐ−ニトロフェニルエチル［ハンドル（ｈａｎｄｌｅ）Ｊが結合した６量体しか使用しなかった。２０量体でｐ−ニトロフェニルエチルハンドルを使用する同様のアプローチがＧ、Ｚｏｎ、ＨＰＬＣｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　（Ｗ、Ｓ。

Ｈａｎｃｏｃｋ編）、　Ｊ、Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ、　ｐｐ３５９−３６３　（１９９０）の第１４章に記載されている。Ｚｏｎによりこの方法で得られた精製結果はかろうじて許容できる程度である。

Ｍ　ａ　ｒ　ｕ　ｇ　ｇら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２　（２２）＋　８６３９−８６５１　（１９８４）は、新規リン酸化剤として２−シアノ− １，１−ジメチルエトキシジクロロホスフィンを記載している。この物質は塩基性条件下で除去されるという利点があると主張されている。

Ｈｉｍｍｅ　Ｉ　５ｂａｃｈら、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ　２３　（４６）：４７９３−４７９６　（１９８２）は、新規リン酸化剤としてビス −（ｐ−ニトロフェニルエチル）ホスホロモノクロリゾートを記載している。

Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｍａｒｅｌら、　Ｔｅｔｒａｈｅａｒ。

ｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　２２　（１９）：１４６３−１４６６　（１９８１）は、モルホリノホスホロビス−３−二トロー１．２．４−トリアシリデートを記載している。

Ｈｏｒｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ２７　（３９）：４７０５−４７０８　（１９８６）は、遊離後にリン酸化効率を監視するために使用可能な４，４°　ジメトキシトリチル基を含むリン酸化試薬を記載している。この開示はＥＰ−Ａ−３０４２１５の開示及び５゜Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｏｎとして知られる市販のＣ１ｏｎｔｅｃｈ製品に非常に類似していると思われる。

Ｌｉｐｓｈｕｔｚら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　３０　（５１）：　７１４９−７１５２　（１９８９）（“Ｌｉｐｓｈｕｔｚ　１９８９”）、Ｌｉｐｓｈｕｔｚら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２１：３３４３−３３４６　（１９８０）　（“Ｌｉｐｓｃｈｕｔｚ　１９８０”）及びＹｏｎ　Ｐｅｔｅｒ　５ｉｅｂｅｒ、　Ｈｅ１ｖｅｔｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ６０　：　２７１１　（１９７７）はいずれもシリル保護基の除去におけるフッ化物の使用を開示している。この点で、これらの文献はＨｏｎｄａら（上記参照）の開示内容に類似している。

上記試薬及び方法の各々は合成オリゴヌクレオチドのリン酸化に適しているが、各々欠点もある。例えば、上記文献の各々は天然５°　リン酸基を生成するためにリン酸基ブロッキング基を除去するための方法を開示している。リン酸化の程度を監視することが可能な検出可能な特徴（例えば色）を有するブロッキング剤を開示しているものもある（例えばＨｏｒｎら）。リン酸化の程度はこの手段により監視することができるが、精製手段は提供されていない。

Ｕｈｌｍａｎｎらは、開裂前に疎水性ｐ−ニトロフェニルエチル基を使用してＨＰＬＣによりリン酸化６量体を分離できることを示唆している。Ｕｈ　１ｍａｎｎにより言及されている保護６量体は比較的低分子／保護基質量比を有しており、一般に非常に短いため、ハイブリダイゼーションアッセイで必要な特性を提供することができない。

しかしながら、これらの文献のうちでシリル置換基を含むリン酸化／ブロッキング試薬を教示しているものは皆無である。更に、非リン酸化不良生成物からリン酸化ヌクレオチドを精製するためにシリル保護基を使用できることを示唆しているものも皆無である。本発明の目的はこれらの欠点を解決することである。

発明の要約第１の態様によると、本発明は式：（式中、Ｒ，、Ｒ，及びＲ８はアリール、置換アリール及び立体的に嵩高な置換又は非置換アルキルから構成される群から独立して選択され、ｎは２〜約２０の整数、より多くの場合は２〜約６、理想的には２である）のアルコール化合物に係る。Ｒ，、Ｒ，及びＲ３のいずれかがアリール、置換アリール又はアラルキルである場合、芳香族部分は一般に少な（とも５個の炭素原子を有する環を含む。

このような基の例としてはフェニル、ナフチル、メトキシフェニル、トルイル及びトリフェニルメチルが挙げられる。Ｒ，、Ｒ。

及びＲ３のいずれかがアルキル又は置換アルキルである場合、これらの基は枝分かれ及び／又は環状鎖中に少なくとも４個の炭素を有する立体的に嵩高のアルキルを含む。このような基の例としてはｔ−ブチル、ネオペンチル、ネオヘキシル、シクロヘキシル、３−ペンチル及び３−エチル−３−ペンチルが挙げられる。

別の態様によると、本発明は式：（式中、Ｒ，、Ｒ，及びＲ３は独立して上記アルコールについて定義したように選択され、Ｒ４は低級アルキル、特にメチルであり、ｎは２〜約２０の整数、より多くの場合は２〜約６、理想的には２である）のエステル、特に酢酸エステルに係る。好適なＲ１，Ｒｓ及びＲ３置換基は上記アルコールと同一である。

図面の簡単な説明図１は不良生成物（８，４分のピーク１）からのリン酸化オリゴヌクレオチド（１５，５分のピーク４）の分離を示すクロマトグラムである。クロマトグラムは流速１．５ｍＬ／分のＷａｔｅｒｓ　μＢｏｎｄａｐａｋ（登録商標）Ｃ１８カラム、３．９ｍｍｘ１５０ｍｍから作成した。溶剤Ａは１００ｍＭ）リエチルアンモニウムアセテ−１・であり、溶剤Ｂはアセトニトリルである。Ａ：Ｂの比が時刻二〇では９０　：　１０、時刻＝１５分では６０　：　４０、時刻＝２５では６０　：　４０、時刻＝３０では９０　：　１０となるような直線勾配表に従って溶剤を混合した。検出値は２６０ｎｍの吸光度単位で表した（実施例１０ａ参照）。

図２は他の生成物（例えばシリルフルオライド）からの脱保護リン酸化オリゴヌクレオチド（８，４分のピーク１）の分離を示すクロマトグラムである。条件は図１の場合と同じである（実施例１０ｂ参照）。

一般に、「アルキル」、「アルケニル」及び「アリール」のような用語は、有機化学業者により通常使用されている意味を有する。例えばアルキルは一般に、１個の水素を除去することによりアルカンから誘導され得る１価の直鎖又は枝分かれ鎖脂肪族基を意味し、一般式Ｃ＊Ｈ１ｍ＋１を有する。アルキル基は１〜約３０個の炭素、より実質的には１〜約１５又は２０個の炭素を有し得る。「低級アルキル」なる用語は炭素数１〜約６のアルキルを意味する。低級アルキルの例としては、ＣＨ３−１ＣＨｓ　ＣＨｚ−１ＣＨＩＣＨ（ＣＨ３）−及びＣＨ３（ＣＨＩ）４−が挙げられる。本明細書中で使用する「アルキル」なる用語はシクロアルキル及び直鎖アルキルを含む。従って、シクロヘキシル等が含まれる。

「アルケニル」は、１個の水素を除去することによりアルケンから誘導され得る１価の直鎖又は枝分かれ鎖脂肪族基を意味し、一般式Ｃ＊Ｈ２ｍ−１を有する。

アルケニル基は１〜約３０個の炭素、より実質的には１〜約２０個の炭素を有し得る。「低級アルケニル」なる用語は炭素数１〜約６のアルケニルを意味する。

「オレフィン」はアルケニルと同義である。

本明細書中で使用する「アルキレン」なる用語は３０個未鵬の炭素原子を有する２価の直鎖又は枝分かれ鎖スペーサー基を意味し、非限定的な例として−ＣＨ！ −１−ＣＨ（ＣＨ，）−１ＣＨ（ＣＩＨ８）−１ＣＨ（ＣＨｉ）　ＣＨ！−１（ＣＨ＊）ｓ−等が挙げられる。一般にアルキレンスペーサー基は脂肪族である。

「アリール」は、１個の水素を除去することにより芳香族炭化水素から誘導され得る１価の基を意味する。アリール置換基はフェニル及びナフチルのような環構造を有する。

典型的には、アリール置換基は平面状であり、平面の相対向する側に各炭素のπ 電子雲が残存する。

アルキル、アルケニル及びアリールは一般には炭素及び水素以外の原子をもたない（即ちヘテロ原子をもたない）基に限定されるが、本発明ではこのような制限がない。ヘテロ原子、特に酸素及び硫黄がＲ基に存在し、夫々「オキサ」及び「チア」類似体を形成してもよい。しかしながら、脱離が予想されるので、Ｒ基が該当分子に結合している１価の点から２個の炭素が除去された酸素原子を有するオキサ類似体を避けることが望ましい。オキサ類似体の例としては、アルコキシ（例えばｔ−ブトキシ、イソプロピルオキシ及びエトキシ）、フェノキシ及びエーテル置換基がある。

本明細書中で使用される「置換」なる用語は、Ｒ基に共特表千６−５０８１５０　（６）有結合した部分の存在を意味し、非限定的な例としてはハライド（特にＢｒ及びＣＩ）、ニトロ、低級アルコキシ（炭素原子数１〜６、特にメトキシ及びエトキシ）、低級アルキル（炭素原子数１〜６、特にメチル及びエチル）、ヒドロキシ及びアミノ（場合により保護基が必要）が挙げられる。所望の溶解度及び所望の化合物の疎水性による制約と有機化学原理の立体的制約下で、Ｒ基上の置換基の位置及び数は任意である。特定の置換としては、アリール基が１価の点を含むアルキル置換基を担持する１価アリール基（例えばトルイル）を意味するアルカリールや、アリール基を担持する１価アルキル基を意味するアラルキル基を挙げることができる。後者の場合、アルキル基は１価の点を含む。ベンジルはアラルキル基の１例である。

本明細書中で使用される「立体的に嵩高」なる用語は、比較的大きい体積を占める置換基を意味する。５個以上の炭素を有するアリール基は置換アリール基と同様に「立体的に嵩高」であるとみなされる。アルキル及びアルケニル基は少な（とも４個の炭素を有しており且つ枝分かれ形状に配置されているときに「立体的に嵩高」であり、枝数が多いほど嵩高である。ｔ−ブチル以上の体積を占める全アルキル及びフェニル以上の体積を占める全アリールは「立体的に嵩高」であるとみなされる。従って、ネオペンチル、ネオヘキシル等がこの範喀に入る。

「疎水性」なる用語は一般に、水溶液に比較的溶けに（く、実質的に水と混合しない化合物を意味する。具体的には、水／オクタツール分配試験でオクタツールに対して０゜５１以上の分配係数を有する場合に化合物は疎水性であるとみなされる。

Ｂ、シリルアルコール合成以下に記載する本発明ではどのような方法により製造したシリルアルコールも有用であり得る。後述する理由で２−シリル−エタン−１−オール（すなわちβ− シリルエタノール、シラプロパツール）が好適である。有機化学業者には自明のことであるが、「β−シリルエタノール「シラプロパツール」は同義であり、区別なしに使用され得る。前者命名法はシリル基（ＲＩＳ　ｉ−）をエタノール上の置換基とみなし、後者命名法はケイ素原子を主鎖の一部とみなしている。

公知製造方法の例については本明細書の発明の背景の項に記載した。しかしながら、ここに記載する新規合成方法は特に有用である。

ビニルエステルはエステル結合の片側（酸素側）のアルケニル基の存在により特徴付けられるオレフィンエステルである。ビニルエステルは式：（式中、Ｒ．はアルケニルであり、Ｒ１はＨ又はアルキル、通常は低級アルキル、好ましくはメチルである）により表され得る。本発明によると、Ｒ．は炭素数２〜約３０であり得るが、低級アルケニルがより一般的である。本発明で有用なこのようなエステルの例としては、ビニルアセテート、イソプロペニルアセテート、ブテニルアセテート、ペンテニルアセテート等が挙げられる。二重結合が末端位置にあるエステル、特にビニルアセテートが好ましい。

金属触媒の存在下で式Ｒ．ＳｉＨのシランを使用してこのようなエステルをヒドロシル化すると、アルケニル基Ｒ、の二重結合間にＨ及びシリル基（ＲＩＳｉ− ）が付加される。ヒドロシル化はＲ基として好ましくはアルキル、アリール、置換アルキル又は置換アリールを担持するシランを必要とする。シランのＲ基は更に、独立してハロゲン及び／又はアルキル、アリール、置換アルキル及び置換アリールのオキサ又はチア類似体を含み得る。シラン上には１．２又は３個のＲ基が存在し得る。後述する使用のためには、嵩高で疎水性の置換基が好適である。

フェニル、ｔ−ブチル、ネオペンチル等が嵩高基の例である。

ヒドロシル化に有用な金属触媒としては、遷移金属錯体、特にコバルト、ニッケル、白金、パラジウム及びロジウムの錯体が挙げられるが、他の触媒も使用できる。特定の錯体の例としては、Ｃ０２（Ｃｏ）ＩＩ、ＨｘＰ　ｔ　ＣＩｓ；　１ＲｈＣＩ　（Ｃｏ）　２１　ｚ及び前出のＣｏｌｌｍａｎらの表６．５に記載の他の錯体がある。

触媒ヒドロシル化は以下の条件下で実施され得る。アセテート対シランのモル比は約３−０　：　１〜約１：２であり、好ましくは約１：１である。１０：１又は２：１のような中間比も予想される。金属触媒のモル百分率は約０．０１％〜１％〜約３ましくは約０．２％〜約２％であり得る。

百分率が低いとより長い反応時間又はより高温が必要になる。！ＲｈＣＩ　（Ｃｏ）　ｄ　２の場合、最適モル％は約０゜２５％〜約１．０％である。他の触媒では、最適濃度は文献又は日常実験から得られる。室温で約５０〜７０時間、好ましくは２週間以内で反応は最良である。しかしながら、高温で短時間、例えば８２℃で２４時間未満でもよい。主要試薬の濃度は酢酸ビニル中純液からトルエン中４Ｍ、好ましくはトルエン巾約ＩＭとすべきである。この触媒段階の他の反応条件は、参考資料として本明細書の一部とするＣｏ　ｌ　１ｍａｎらの文献に記載されている。

ヒドロシル化ではシリル基が二重結合の両側に結合し、１−及び２−置換生成物を生じるので、２種の主要生成物が生成される。必要に応じてこれらの生成物を分離し、クロマトグラフィー（例えばフラッシュカラム又はＨＰＬＣのようなシリカに基づくクロマトグラフィー）により精製することができる。しかしながら、場合によっては精製は非常に簡易化される。ビニルアセテートをエステルとして使用する場合にも同様に次のように２種の生成物が得られる。

水性又はアルコール性緩塩基中で加水分解すると、アセテートはアルコールに変換される。しかしながら、１−シリル置換アルコールは不安定であり、自然にＢｒｏｏｋ転位しくＡ、Ｇ、Ｂｒｏｏｋ、Ａｃｃｏｕｎｔｓ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　７：７７　（１９７４））、下記化合物：を生じる。２−シリル置換アルコールはこの転位を受けない。２−シリル置換生成物はアルコールとして挙動し、シリルエーテルはエーテルとして挙動するので、２種の生成物はシリカゲルクロマトグラフィー、特にＨＰＬＣを使用してこれらの特性に基づいて容易に分離される。追つて実施例に記載するように、この加水分解反応は酢酸塩の中間精製なしに同一容器中で実施することができる。

加水分解条件は注意深く制御することが好ましい。アニオン形の２＝又はβ−置換中間体は発明の背景の項に記載したようにシラノールに分解する。しかしながら、望ましくない生成物の形成を最小限にするような反応条件を選択することができる。まず第１に、好ましくは約３〜８のｐＫｂを有する緩塩基を選択する。

許容可能な塩基としては、Ｈ２ＢＯ３−１ＨＰ　Ｏ４ｍ−１ＳＯ，Ｚ−１ＨＣＯ，−及びｃ　ｏ　ｓ”−ノナトリウム又はカリウム塩が挙げられる。解離傾向の弱い緩塩基は従来技術で教示されている強塩基又は水素化物（例えばＬ　ｉ　Ａ　Ｉ　Ｈ４）よりもアニオン種をプロトン付加状態に維持する傾向がある。

塩基は、塩基：アセテートモル比が約０．０１：１〜約３＝１、好ましくは０．１：１〜２．５：１、最適には１：１〜２：１となるように配合すべきである。

反応は一般に０．５〜２４時間であるが、好ましくは約１時間である。

更に、溶剤は望ましくない生成物の形成を最小限にするように選択され得る。例えば、特定溶剤中の塩基の溶解度により塩基性度は変化する。溶液中で進行中のイオン化平衡を緩衝するように実質的な量の塩基を不溶性に維持することが望ましい。また、プロトン性溶剤はアニオン種の形成を停止できるので非プロトン性溶剤よりも好ましい。適切なプロトン性溶剤としては水、メタノール及びエタノールが挙げられる。反応は水性媒体中で行われるが、溶剤としてメタノールを使用することが好ましい。

この方法により合成されるシリルアルコール及び他の方法により合成されるシリルアルコールは、別項に記載するリン酸化試薬及び保護剤の合成に有用である。

Ｃ，シリルアルコール上記方法を使用して多数のシリル置換アルコールを合成することができるが、ある類のシリルアルコールが特に有用である。ケイ素に結合した３個の大形で嵩高の基を有するシリルアルコールを合成することは従来方法には記載されていない。これは、Ｋｕｍａｄａら及び５ｅｙｆｅｒｔｈ、前出の文献により教示されているようなビニルシランを介する主要な従来技術の合成方法が、必要な嵩高基で適切に置換されたビニルシラン試薬を必要とするためである。

恐らく立体的理由により、嵩高のビニルシランは容易に入手できず、容易に合成できない。トリフェニルシランは公知である（Ｌｅｓａｇｅら、　前出参照）が、このような嵩高のシランは嵩高のビニルシランを形成するためにビニル基と関連付けられていない。

一方、一般式：［式中、Ｒ１，Ｒ１及びＲ３はアリール（例えばフェニル及びナフチル）；置換アリール（例えばメトキシフェニル又はニトロフェニル）；アラルキル（例えばトリフェニルメチル）；枝分かれ鎖中に少なくとも４個の炭素を有するアルカリール及びアルキル又は置換アルキル（例えばｔ−ブチル、ネオペンチル、ネオヘキシル、シクロヘキシル、３−ペンチル及び３−エチル−３−ペンチル）のような立体的に嵩高の基から独立して選択される］を有する立体的に嵩高のシリルアルコールを上記方法により製造することができる。上式中、ｎは２〜約２０の整数、通常は２〜約６、最適には２である。化合物の例を下表に列挙するが、化合物の例は表中の例に止まらない。

表２：　新規シリルアルコールの例Ｒ，Ｒ，Ｒｉ旦 ■■■■■■■―■■■■■■１−轡−１１−一−−■−輪−一時一雫フェニル　フェニル　フェニル　２フエニル　フェニル　フェニル６フエニル　フェニル　ｔ−ブチル　２フエニル　ｔ−ブチル　ｔ−ブチル　２フエニル　ナフチル　ネオペンチル　２ｔ−ブチル　ｔ−ブチル　ネオペンチル　２フエニル　ナフチル　ｔ−ブチル　２フエニル　ｔ−ブチル　ネオヘキシル　２フェニル　フェニル　フェニル３フエニル　フェニル　ｔ−ブチル　３ｔ−ブチル　ｔ−ブチル　フェニル　３フエニル　ナフチル　ネオペンチル　３ｔ−ブチル　ｔ−ブチル　ネオペンチル　３フエニル　ナフチル　ｔ−ブチル　３フエニル　ｔ−ブチル　ネオヘキシル　３後述する理由から置換嵩高基は非極性置換基を有することが好ましい。

上述のように、シリルアルコールはリン酸化剤及び保護剤を製造するのに有用である。これらの物質については以下に詳述する。

Ｄ、リン酸化試薬多種の試薬がオリゴヌクレオチドをリン酸化することができ、即ちオリゴヌクレオチドの末端にリン酸基を加えることができる。一般に、これらの試薬はホスホトリエステル試薬、ホスホネート試薬（水素又はアルキル）及びホスホラミシト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉ　ｔｅ）試薬として分類される。これらの試薬の各々がオリゴヌクレオチドをリン酸化する機序については文献に記載されている。

新規リン酸化試薬は式：（式中、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７はＨ；アルキル、アリール、置換アルキル、置換アリール；アルキル、アリール、置換アルキル、置換アリールのオキサ及びチア類似体；並びに）１０ゲンから独立して選択され、Ｑはホスホラミシト、アルキルホスホネート、ホスホン酸水素塩及びホスホトリエステルから構成される群から選択される部分を表す）により表される。

ホスホラミシトの場合、Ｑは式：［式中、Ｒｓは一般に２−シアノエチル、メチル、エチル、２−アルキルスルホニルエチル、２−　（ｐ−ニトロフェニル）エチル、２−（９−フルオレニル）エチル、２−（２−アントラキノニル）エチル、２−アルキルチオエチル、２− アリールチオエチル、２−トリハロメチルエチル、２−フェニルエチル及び２− （２−ナフチル）エチルから構成される群から選択され、Ｒ，及びＲＨＩは一般にＨｌ又は炭素数１〜６の直鎖もしくは枝分かれ鎖アルキルから独立して選択される］を有する。非常に一般的なホスホラミシト部分において、Ｒ８は２−シアノエチルであり、Ｒｅ及びＲ１１ｌはいずれもイソプロピルである。

新規シリルホスホラミシトはクロロホスホラミシトをシリル置換アルコールと反応させることにより常法で製造され得る。例えば参考資料として本明細書の一部とするＫ。

５ｔｅｒ　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ。

２４　：　５８４３　（１９８３）を参照されたい。ここでは、２−シリル−エタン−１−オールを使用するのが好ましい。

反応条件は文献から周知である。

ホスホトリエステル試薬の場合、Ｑは式二（式中、Ｙはヒドロキシル又はアルコキシである）を有する。

ホスホン酸水素塩又はアルキルホスホネート試薬の場合、Ｑは上記式を有するがＹは夫々Ｈ又はアルキルである。

Ｅ、リン酸化剤を使用する方法上記ホスホラミシト、ホスホトリエステル及びホスホネート試薬は、オリゴヌクレオチド、特に固体支持体上で合成されたオリゴヌクレオチドをリン酸化するための方法で使用することができる。単一のヌクレオシドやもつと長いポリヌクレオチドも同様にリン酸化できることは当業者に理解されよう。簡単にするために、「オリゴヌクレオチド」なる用語は１〜数百個のヌクレオシドサブユニットを有する構造を含むものと理解されたい。

オリゴヌクレオチドの合成方法としては多（の方法が文献から公知であり、使用される特定方法は本発明には関係ない。しかしながら、一般には自動合成が好ましく、ＡＢｌ　３８０Ａ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ又はＭｉ　１１　ｉｇｅｎ　８７ＱＱ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒのような市販の装置を使用して実施することができる。

このような自動合成器により使用される反応段階は一般に当業者に公知であるのでここで繰り返す必要はない。しかしながら、ホスホラミシト又はホスホン酸水素塩試薬を使用する場合には、形成される中間体が３優麗リン酸塩であることに留意されたい。後段階で中間体を酸化し、生物学的に有用な５価リン酸塩を得る。この酸化段階は例えば自動合成方法でヨウ素を使用して容易に実施される。

本発明の主要な利点は、支持体からオリゴヌクレオチドを除去せずに合成と同一の装置でリン酸化段階を実施できるという点にある。あるいは、存在するアミノ及びヒドロキシ基が保護され得るという条件下で、他の方法（例えば酵素法）により合成したオリゴヌクレオチドを本発明の方法によりリン酸化してもよい。

公知のリン酸化方法は発明の背景の項で説明したが、シリル試薬を使用しているものは皆無である。本発明によると、前項に記載したように調製したリン酸化試薬の任意のものを使用してオリゴヌクレオチドをリン酸化することができる。方法及び条件は従来通りであるが、試薬は新規である。実施例により詳細を説明するが、方法は一般にオリゴヌクレオシドの５゛　ヒドロキシルを上記リン酸化試薬と反応させ、最終的にシリル基により保護されたホスホジエステルを形成することからなる。

シリルで保護されたリン酸化中間体は下記構造＝（式中、Ｒ５１Ｒ・及びＲ７は上記のように選択され、ＺはＨ又はＯＨであり、ＢＡＳＥは核酸塩基Ａ、Ｃ，Ｇ、ＴもしくはＵの１種又はその類似体を表す）を有する。末端ヌクレオシドは３ °炭素で支持体に結合される（単一ヌクレオシドをリン酸化する場合）か、又はより一般には１個以上の他のヌクレオシドの鎖に結合され得る（オリゴヌクレオチドを形成する）。一般に、このようなヌクレオシド鎖はホスホジエステル結合を介して結合されるが、他の結合も可能である（例えばアルキルホスホネート中性プローブ）。自明のことながら、ＺがＨであるならばヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドであり、２がＯＨであるならばリボヌクレオシドである。塩基Ａ、Ｃ，Ｇ、Ｔ又はＵの類似体は、オリゴヌクレオチドに取り込まれた場合に夫々の相補的塩基とのワトソンークリック型塩基対合が許容可能な化合物である。

参考資料として本明細書の一部とするＵＳＰＴＯ公報１１１４　０Ｇ　４３には数種の塩基類似体の例が記載されている。

生物学的用途（例えば鋳型案内連結）のためにはシリル保護基を除去しなければならないが、保護中間体も有用である。シリル基は特に嵩高の疎水性置換基Ｒ５、Ｒ６及びＲフを有する場合、クロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ）により非リン酸化不良生成物からリン酸化オリゴヌクレオチドを精製及び分離するための「ハンドル」として有用である。Ｒ基が十分に疎水性であるならば、シリル保護基を有するオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドが５Ｇ量体の長さに近い場合でも非リン酸化非保護オリゴヌクレオチドから容易に区別できる。当然のことながら、もっと短い長さも容易に分離される。従って、リン酸化の首尾を監視するためには有用であるが、生成物を分離又は精製するためには有用でない公知トリチル保護基よりも一歩前進した。

所望に応じてリン酸化及び／又は分離後に脱保護段階を実施し、５゛末端リン酸基を生成してもよい。脱保護段階は所望のリン酸基を生成するために有用な任意の方法により実施される。上述のようにシリル置換基が酸素に対してβ位にあるときに特に有用な好適方法は、保護ホスホジエステルをフッ化物イオンと反応させ、シリルフルオライド、エチレン及び末端リン酸基を得る。テトラブチルアンモニウムフルオライド（ＴＢＡＦ）はシリル保護基を除去するために有用なフッ化物イオンである。この反応は、上記リン酸化試薬を使用する場合にエチレンの遊離により駆動される。例えばＧｒｏｂ、Ｈｅ　Ｉｖ、Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ。

３８　：　５９４　（１９５５）参照。このため、２−シリル−エタン−１−オール（β−シリルエタノール）が好適なシリルアルコール試薬である（ホスホジエステルのケイ素と酸素の間に２個の炭素を有するので、エチレンをＧｒ。

ｂ脱離することが可能である）。脱保護段階では他の部分はβシリル−エタノール誘導体はど容易に除去されない。

「保護」基及び「脱保護」段階は、リン酸基の酸素に結合したシラプロピル置換基に関連する。保護基は酸素原子に影響するその後の反応から通常の意味での「保護」を与えるものであってもよいし、与えないものであってもよい。

しかしながら、シラプロピル基を使用してリン酸化オリゴヌクレオチドを非リン酸化不良生成物から分離する能力と、所望のリン酸基を得るための後続する基の除去とにより、保護基なる用語は「ハンドル」と同義として使用される。

以下、非限定的な実施例により本発明をより詳細に説明Ａ、シリルアルコールの調製：ａ）１，１．１−１リフェニル−３−アセトキシ−１−シラプロパン（３）の調製Ｓ％１０Ａｃ＋Ｈ８ｌＰｈ５（リ　（２）酢酸ビニル（１）３．６９ｍＬ　（４０ｍｍｏ　１）　、トリフェニルシラン（２）１０．４２ｇ　（４０ｍｍｏ　Ｉ）及びＲｈ＊ＣＩｔ　（Ｃｏ）４７７．８ｍｇ　（０，２５ｍｍｏ　１）をトルエン４０ｍＬに溶解してなる溶液を室温でＮ！雰囲気下に合計６３時間撹拌した。この規模で反応を数回繰り返し、予期不能な誘導期後、迅速に発熱した。この反応の拡大は予め用意した冷却浴で実施すべきである。非常に暗色の反応混合物を脱色用活性炭５ｇで処理し、混合物を短時間煮沸した。冷却後、混合物をＣｅ１ｉｔｅ（登録商標）の１ｃｍパッドで濾過し、濾液及び洗液を集めた。溶剤を蒸発させ、残渣を減圧乾燥した。この時点で粗材料を加水分解段階に移した。ＮＭＲ分析によると、ａ：β比は１：１．５７であった。化合物同定の目的で以下のプロトコルを実施した。２５ｍｍ１．Ｄ、ｘ１５０ｍｍ長シリカゲルカラム上でシクロヘキサン中４％ＥｔＯＡｃを使用して粗材料の１００ｍｇサンプルをフラッシュクロマトグラフィーにかけた。Ｍ　ｅ　ＯＨから再結晶後、化合物（３）２９ｍｇを得た。ｍｐ６７−６８℃。

ＩＲ：　（ＣＤＣｉｓ、ｃｍ−１）　３０７０　（ｍ）。

１７２８（ｖｓ）、　１４２５（ｖｓ）、　１２４９（ｖＳ）。

ＭＳ　：　（Ｄ　Ｃｌ　／　ＮＨｓ）　ｍ／　ｅ　３６４　（Ｍ十ＮＨ４）。

ＮＭＲ：　（３００ＭＨｚ、　ＣＤｚＣ１りδ７．６−７゜３　（ｍ、１５Ｈ，フェニル）、　４．２２　（ＡｌＢ２のＨ８，２Ｈ，ＣＨ！０）、　１．８７　（Ｓ、３Ｈ，ＣＨｓ）、　１゜８６（ＡｌＢ２のＡ　！＋　２８．　ＣＨｔｓ　１　）。

”ＣＮＭＲ：　（７５ＭＨｚ、ＣＤＣＩｍ）６１７１゜１　（Ｃｍ０）、　１３５．５　（メタ）、１３４（イプソ）、　１２９．７　（バラ）、　１２８（オルト）、　６２゜１（ＣＨｚＯ）、　２１（Ｍｅ）、　１４．４（ＣＨｘＳｉ）。

元素分析：　Ｃ！！Ｈ！！Ｏｔｓ　ｉの計算値Ｃ７６，２６゜Ｈ６，４０；　実測値Ｃ７６，４５，Ｈ６，３７゜ｂ）１，１．１−トリフェニル−１−シラブロノくシー３−特表平６−５０８１５０　（１１）オール（４）の調製粗化合物（３）をＭｅＯＨｌｏｏｍＬに溶解させ、Ｋ。

ｃｏｓｌＯ，Ｏｇを一度に加えた。反応は室温で１時間撹拌後に完了した。固体を濾別し、濾液を濃縮した。濃縮残渣を１００／　１００ｍＬ　Ｈ＊Ｏ／　Ｅ　ｔ　ＯＡ　ｃ間で分配した。溶剤を有機層から除去後、残渣を減圧乾燥した。４１ｍｍ　ｌ、Ｄ、ｘ１５Ｑｍｍ長シリカゲルカラムを使用してフラッシュクロマトグラフィー（シクロヘキサン中１８％ＥｔＯＡｃ、Ｒｃ＝０．３２）にかけ、化合物（４）３゜４２ｇ　（２８％）を得た。シクロヘキサンから再結晶させ、分析サンプルを純白固体として得た。ｍｐ９６−９７℃。

ＩＲ：　（ＣＤＣ１ｍ、ｃｍ−’）　３６１６（ｍ）。

２９７０　（ｍ）、　１４２９　（ｖｓ）。

ＭＳ　：　（ＦＡＢ／ＤＭＦ−Ｋｌ）　ｍ／ｅ３４３　（Ｍ＋Ｋ）。

ＮＭＲ：　（３００ＭＨｚ、ＣＤ５ＯＤ）δ７．５５−７．３　（ｍ、１５Ｈ，フェニル）、　３．７３　（ＡｔＢ２のＢ！、２Ｈ，ＣＨ２Ｏ）、　１．７８　（ＡｔＢｚのＡｔ、２Ｈ。

ＣＨｔｓ　ｉ）　。

”ＣＮＭＲ：　（７５ＭＨｚ、ＣＤ０１ｇ）　δ１３５゜５（メタ）、　１３４．４（イブソ）、　１２９．６（バラ）、　１２８（オルト）、　５９．８　（ＣＨ２Ｏ）。

１８、　７　（ＣＨｚＳ　ｉ　）　。

元素分析：　ＣｚｅＨｔｅＯ８ｉ　・０．２Ｈ！Ｏの計算値：Ｃ７７，９８，Ｈ６，６７；　実測値：Ｃ７７，９２、Ｈ６，６２゜実施例２：ａ）１．１−ジメチル−１−フェニル−３−アセトキシ−１−シラプロパンの調製ＰｈＭｅｘＳｉＨ６，１３ｍＬ　（４０ｍｍｏｌ）及び酢酸ビニル３．６９ｍＬをトルエン４０ｍＬに溶解してなる溶液ｉ：Ｒｈ＊ｃ　１　ｔ（Ｇｏ）４６１．３ｍｇ　（０，１１３ｍｍｏｆ）を加えた。すぐに反応物は熱及び気体を発生した。

５分以内に山吹色の反応物は濃茶色に変色した。１時間後、反応は完了した。反応物を実施例１ａに記載したように処理し、組付加物８．３９ｇを得た。陽子ＮＭＲ分析によると、ａ：β付加比は１．４４：１．０であった。サンプル１００ｍｇを実施例１ａと同様にフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、標記化合物２８ｍｇを無色油状物として得た。

ＩＲ：　（ＣＤＣＩｓ、　Ｃｍ−リ　２９６０（ｍ）。

１７２４　（ｖｓ）、　１４２６　（ｍ）、　１２５５　（ｖＳ）。

ＭＳ：　（ＤＣＩ／ＮＨｎ）ｍ／ｅ２４０（Ｍ＋ＮＨｎ）。

ＮＭＲ：　（３００ＭＨｚ、　ＣＤＣ１ｇ）６７．６−７゜３　（ｍ、５Ｈ，）ｓ＝ル）、　４．１８　（Ａ１Ｂ！のＢ！。

２Ｈ，ＣＨｚＯ）、　１．９９　（ｓ、３Ｈ，Ｍｅ）、　１゜２５（ＡｌＢ２のＡｔ、２Ｈ，ＣＨｔＳ　ｉ）、　０．３５　（ｓ。

６Ｈ，ＳｉＭｅ）。

重”ＣＮＭＲ：　（７５ＭＨｚ、ＣＤＣ１５）　δ　１７１゜１　（Ｃｏ）、　１３８　（イプソ）、　１３３．４（メタ）。

１２９．２（バラ）、　１２７．９（オルト）、　６２゜３　（ＣＨ！０）、　２１．１　（Ｍｅ）　、１６．５　（ＣＨｔＳ　ｉ）、　−２，９（Ｓ　ｉＭｅ）。

元素分析：　ＣＩｍ８１１０　！Ｓ　ｉの計算値：Ｃ６４，８２、Ｈ８，１６゜実測値：　Ｃ６５，０２，Ｈ８，０ｂ）１．１−ジメチル−１−フェニル−１− シラプロパン−３−オールの調製上記すからの粗生成物の残り８．２９ｇを実施例１の場合と同様に処理し、１．１−ジメチル−１−フェニル−１−シラプロパン−３−オール１．６４ｇを無色油状物として得た（全体収率２３％）。

ＩＲ：　（ＣＤＣＩ、、ｃｍ”）　３６１６　（ｍ）。

２９６０　（ｍ）、　１４２５　（ｍ）、　１２５１　（ｓ）。

ＭＳ　：　（Ｄ　Ｃ１／　ＮＨｓ）　ｍ／　ｅ　１９８　（Ｍ＋ＮＨ４）。

ＮＭＲ：　（３００ＭＨｚ、ＣＤＣ１５）δ７．６−７゜３　（ｍ、５Ｈ，フェニル）、　３．７５　（ＡｚＢｚのＢ！。

２Ｈ，ＣＨｚＯ）、　１．４９　（ｓ、１．２Ｈ，ＯＨ）。

１．２２　（ＡＩＢ！のＡｓ、２Ｈ，ＣＨＩＳ　ｉ　）　、０．３３　（ｓ、６Ｈ，ＳｉＭｅ）。

１３ＣＮＭＲ：　（７５ＭＨｚ、　ＣＤＣ１ｇ）δ１３８゜５（イブソ）、　１３３．４（メタ）、　１２９（バラ）。

１２７．８（オルト）、　５９．９　（ＣＨ２Ｏ）、　２１．１　（ＣＨ２Ｓ　ｉ）、−２，８（Ｓ　ｉＭｅ）。

元素分析：Ｃ１゜Ｈ＋ａＯＳｉ・０．１．ＨｚＯの計算値：Ｃ６５，９２，Ｈ８，９９；　実測値：Ｃ６５，９５、Ｈ８，９７゜実施例３ａ）１，１．１−１−ジエチル−３−アセトキシ−１−シラプロパンの調製Ｅｔ３ＳｉＨ６，３９ｍＬ　（４０ｍｍｏｌ）及び酢酸ビニル３．６９ｍＬ　（４０ｍｍｏ　１）をトルエン４０ｍＬに溶解してなる溶液にＲｈｚＣｌｔ（Ｃｏ）４６１．３ｍｇ（０，１６ｍｍｏ　１）を加えた。注意：　反応物は熱及びガスを発生する。約５分以内に反応混合物は暗色に変色した。１時間後にＴＬＣ分析（シクロヘキサン中１０％ＥｔＯＡｃ）により反応は完了したと判断した。必要に応じて実施例１ａに記載したように反応物を処理及び精製した。

ｂ）１．１．１−トリエチル−１−シラプロパン−３−オールの調製ａ）からの粗生成物をトリフェニルシリルエタノールの場合（実施例１）と同様に処理すると、ｉ、ｉ、ｔ−ｔ−ジエチル−１−シラプロパン−３−オールが得られる。

実施例４：１，１．１−トリフェニル−１−シラへブタン−７−オール（５）の調製Ｐｆｉ、９１′＼／＼／＼１０Ｎピリジン／無水酢酸１５／１５ｍＬ中でアルコール４゜８ｍＬ　（４０ｍｍｏ　ｌ）を４時間還流することにより５−ヘキサン−１−オールの酢酸塩を調製した。溶剤を減圧下に除去し、残渣を十分に減圧乾燥した。粗酢酸塩をトルエン４０ｍＬに溶解させ、トリフェニルシラン１０．４２ｇ。

次いでＲｈＩＣＩｔ（Ｃｏ）４７７．８ｍｇ　（０，２５ｍｍｏ１）を加えた。

反応物を室温でＮ、雰囲気下に２４時間撹拌すると、この間に反応物は濃茶色に変色した。多少量の異性体２−メチル−１，１，１−トリフェニルシラヘキサン −６−オールを予想することができる。必要に応じて異性体をクロマトグラフィーにより分離することができる。

実施例１ａに記載したように処理した後、１ｂに記載したように塩基加水分解し、標記化合物（５）を得た。

Ｂ、リン酸化試薬の調製：実施例５：　２−トリメチルシリルエチル−２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソブロピルアミノホスホラミシト（１）の調製２−トリメチルシリルエタノール（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉ　ｃａ　Ｉ、Ｍｉ　１ｗａｕｋｅｅ、Ｗｌの市販品、又は上記実施例２と同様に調製）５７３μ Ｌ　（４ｍｍｏ　り及び１−Ｐｒ、ＮＥｔ　１．３９ｍＬ　（８ｍｍｏ　１）を０℃ＴＨＦ８ｍＬに溶解してなる溶液に２−シアノエチル−Ｎ、′Ｎ−ジイソプロビルアミノクロローホスホラミジシト９２μｌ、（４ｍｍｏ　ｌ）を一度に加えた。反応物はほぼ即座に著しく濁った。水浴を除去し、反応物を室温で一晩、合計１９時間撹拌した。濾過して１−Ｐｒ１ＮＥｔ−ＨＣＩを除去後、ＴＨＦを蒸発させた。残渣を５０１５０ｍＬ　ＥｔＯＡｃｌｏ、ＬＭ　ＮａｘＣＯｓ、ｐＨ１２間で分配した。

相分離及び有機相の溶剤除去後、残渣を減圧乾燥した。１５０ｍｍＸ２５ｍｍ　ＩＤカラム上でシクロヘキサン中１２％ＥｔＯＡｃを使用してフラッシュクロマトグラフィーにかけ、標記化合物５７３．８ｍｇ　（７８％）を氷状−白色粘性油状物として得た（シクロヘキサン中１５％ＥｔＯＡｃ中でＲ，＝０．６５）。

ＭＳ　：　（Ｄｅ　ｌ、　ＮＨｓ）　３１９　（Ｍ＋Ｈ）　、　２９１　（Ｍ− ＨＣＮ）。

ＮＭＲ：　（ＣＤｔＣｌｌ）　δ３．　９−３．　６２　（ｍ、４Ｈ）、　３．　５６　（ｄｓｅｐｔ、２Ｈ，Ｊｃｎ＝７．　０Ｈｚ。

Ｊ−−＝１０．　０Ｈｚ、ＮＨ）、　２．　５９　（ｔ、２Ｂ、Ｊ＝６．　２Ｈｚ、ＣＨＩＣＨ）、　１．　１５　（ｄｄ、１２Ｈ。

ＪＣＮ＝７．　０．　Ｊ　ＰＭ＝２．　２Ｈｚ、Ｍｅ）　、０．　９７（ｔｑ、２Ｈ，Ｊ＝８．０，０．７Ｈｚ、ＣＨ＊Ｓｉ）。

０、　０３　（ｓ、９Ｈ，Ｓ　ｉＭｅ）　。

エチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホラミシト（６）の調製化合物（４）３．０４ｇ　（１０ｍｍｏ　１）　、１−Ｐｒ２ＮＥｔ４．１８ｍＬ　（２４ｍｍｏｌ）及び４．４−ジメチルアミノピリジン５ｍｇを０℃ＴＨＦ１５ｍＬに溶解してなる溶液に、２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスホラミシト（５）２．６８ｍＬ　（１２ｍｍｏ　１）を一度に加えた。白色沈殿がほぼ即座に形成された。０℃で３０分後に反応は完了した。溶剤の除去後、残渣を１００／１００ｍＬ　Ｏ，ＩＭ　ＮａｘＣＯｓ／ＥｔＯＡｃの間で分配し、相を分離した。水相をＥｔＯＡｃ５０ｍＬで再抽出し、有機相を合わせて濃縮及び減圧乾燥した。

４１ｍｍ１．Ｄ、ｘ１５Ｑｍｍ長シリカゲルカラムを使用してフラッシュクロマトグラフィー（シクロヘキサン中１０％ＥｔＯＡｃ）にかけ、−晩減圧乾燥後に（６）３．３５ｇを粘性無色油状物として得た（６６％）。この材料を数週間かけて一２０℃フリーザーで徐々に結晶させた。クロマトグラフィー中、フラッシュクロマトグラフィーに使用される分画管又はシリカゲル中の外来酸の影響を最小限にするために、各フラクションにＮＥｔｌｌＯＯμＬを加えた。

ＩＲ：　（フィルム、Ｃｍ−’）２９６２　（ｍ）、　１４２６（ｍ）。

ＭＳ：　（ＤＣＩ／ＮＨｓ）ｍ／ｅ５０５（Ｍ＋Ｈ）。

ＮＭＲ：　（３００ＭＨｚ、ＣＤ５ＣＮ）　δ７．　６−７゜３　（ｍ、１５Ｈ，フェニル）、３．９−３．７　（ｍ、　２Ｈ，ＣＨｔＯ）、　３．　６６　（ｄｔ、２Ｈ，ＪｃＭ＝５．　９Ｈ２，ＪｐＨ＝７．　７Ｈ２，ＣＨｔＯ）、　３．　５１　（ｄｓｅｐｔ、２Ｈ，Ｊｃ＋＋＝５．　６Ｈｚ、ＪＰＩＩ：９．　９Ｈ２，ＮＨ）、　２．　５４　（ｔ、２Ｈ，Ｊ＝５．　５Ｈ２，ＣＨＩＣＮ）、　１．　８７　（ｂｒ　ｔ、２Ｈ，Ｊ　＝６．　３Ｈｚ、ＣＨａｓ　ｊ）　、　１．　０７　（ｄｄ、１２Ｈ，Ｊｃ、ｌ＝６．　６Ｈｚ、Ｊ　ＰＨ＝　２９．　４　Ｈｚ、ＭＥ）　。

”ＣＮＭＲ：　（７５ＭＨｚ、ＣＤ、ＣＮ）　δ１３６゜３（メタ）、　１３５．５（イプソ）、　１３０．７（バラ）、　１２９（オルト）、　１１７．７　（ＣＮ）、　６１、　１　（ｄ、Ｊ＝ｃ＝１８．　３Ｈｚ、ＣＨｔＯ）、　５９゜３　（ｄ、Ｊ＝ｃ＝１８．　３Ｈｚ、ＣＨｔＯ）、　４３．　６（ｄ、Ｊ−ｃ＝１２．２Ｈｚ、ＮＣＲ）、　２４．８　（仮想ｔ、ＪＰＣ＝７．　３Ｈ２，Ｍｅ）　、２１　（ｄ、Ｊｐｃ＝７゜３Ｈｚ、ＣＨｉＣＮ）、　１７．　２　（ｄ、ＪＰｃ＝７．　３Ｈｚ、ｃＨ＊ｓｉ）　。

”Ｐ　ＮＭＲ：　（２０２ＭＨｚ、ＣＤ５ＣＮ）　δ１４５、６゜実施例７：　２−）ジエチルシリルエチル−２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソブロピルアミノホスホラミシトの調製実施例３ｂの生成物を出発化合物として使用した以外は実施例５と同様に操作し、標記化合物を得た。

実施例８：　２−ビスメチルフェニルシリルエチル−２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ −ジイソプロビルアミノホスホラミシトの調製実施例２ｂの生成物を出発化合物として使用した以外は実施例６と同様に操作し、標記化合物を得た。

実施例９：　トリフェニルシリルエチルホスホン酸水素塩−ＤＢＵ試薬の調製Ｎ−メチルモルホリン（８ｇ当量）、トリアゾール（３３当量）及びＰＣＩｇ（１０当量）の溶液に０℃でトリフェニルシリルエタノールを加えた。反応物をこの温度で２゜５時間撹拌した。１００Ｍｍ　１．５−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデク−５−エン（Ｄ　Ｂ　Ｕ）−重炭酸塩を加えることにより反応を停止し、相を分離した。有機相をストリップして減圧乾燥し、粗ホスホン酸水素塩 −ＤＢＵをクロマトグラフィーにより精製した。

Ｃ，リン酸化保護オリゴヌクレオチドの調製及びその脱保護ａ）ＤＮＡの自動リン酸化における（６）の使用ホスホラミシト（６）（上記実施例６）を使用してＡＢｌ（Ｆｏｓｔｅｒ　ｃｉｔｙ、ＣＡ）３８０Ａ　ＤＮＡ５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒにより２５量体オリゴヌクレオチドを１μｍｏルベルでリン酸化した。「待機」時間（ホスホラミシト溶液と支持体との接触時間）及び「洗浄１時間をいずれも２倍にした以外は、製造業者の合成プログラムに従ってホスホラミシトカップリングを行った。分取ＨＰＬＣの結果、図１に示すように全長オリゴから不良配列の分離が観察された。

ｂ）リン酸化オリゴヌクレオチドの脱保護（７）　（ＩＩ）＋　Ｐｈ５ＳＩＦ　＋　Ｃ２Ｈ４ａ）から収集した材料（７）を減圧乾燥した後、エタノール沈殿させた。次にＤＭＳＯ／１．０Ｍテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオライド（ＴＢＡＦ）　（Ａ　１　ｄ　ｒ　ｉｃｈ、Ｍｉ　１ｗａｕｋｅｅ、Ｗｌ）１００／１００μＬを使用して精製ＤＮＡを脱シリル化した。反応は６８℃加熱ブロック中で３．５時間行った。反応物を水３００μＩ、で５００μＬに希釈し、反応物をＮＡＰ− ５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に通すことにより脱塩した。溶離液１．ＯｍＬを減圧乾燥した後、エタノール沈殿させ、精製された末端リン酸化ＤＮＡを得た。

この材料のＨＰＬＣ分析を図２に示す。

実施例１１：実施例６のホスホラミシト試薬の代わりに実施例５のホスホラミシト試薬を使用した以外は実施例１０と同様に操実施例６のホスホラミシト試薬の代わりに実施例７のホスホラミシト試薬を使用した以外は実施例１０と同様に操実施例６のホスホラミシト試薬の代わりに実施例８のホスホラミシト試薬を使用した以外は実施例１０と同様に操カップリング試薬を塩化アダマントイルとし、キャッピング試薬をホスホン酸水素β−シアノエチルとした以外は、Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　２７：４６９−４７２　（１９８６）の一般反応プロトコル及び条件に従い、実施例９からの試薬を使用してオリゴヌクレオチドをリン酸化した。５°−ヒドロキシオリゴヌクレオチドを塩化アダマントイル触媒によりポスホン酸水素トリフェニルシリルエチルとカップリング後、オリゴヌクレオチド中の全ホスホン酸水素塩結合をヨウ素でホスホジエステル酸化状態まで酸化した。得られたオリゴヌクレオチドは、ホスホラミシト化学を使用して調製される同一配列のＤＮＡと同様にＨＰＬＣ上で分離することができる。この材料をホスホラミシトにより調製されるオリゴヌクレオチドと同様に脱シリル化してもよい。

Claims

【特許請求の範囲】

１．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ１，Ｒ２及びＲ３はアリール、置換アリール及び立体的に嵩高な置換又は非置換アルキルから構成される群から独立して選択され、ｎは２〜約２０の整数である）のアルコール化合物。
２．Ｒ１，Ｒ２及びＲ３が独立してアリール又は置換アリールであることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
３．Ｒ１，Ｒ２及びＲ３が各々フェニルであることを特徴とする請求項２に記載の化合物。
４．Ｒ１，Ｒ２及びＲ３が、嵩高のアルキル、嵩高の置換アルキル、嵩高のアラルキル又は嵩高の置換アラルキルから構成される群から独立して選択されることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
５．Ｒ１，Ｒ２及びＲ３が、フェニル、置換フェニル、ナフチル、トリフェニルメチル、ｔ−ブチル、ネオペンチル、ネオヘキシル、シクロヘキシル、３−ペンチル及び３−エチル−３−ペンチルから構成される群から独立して選択されることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
６．ｎが２であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
７．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ１，Ｒ２及びＲ３はアリール、置換アリール及び立体的に嵩高な置換又は非置換アルキルから構成される群から独立して選択され、Ｒ４は低級アルキルであり、ｎは約２〜２０の整数である）のエステル化合物。
８．Ｒ１，Ｒ２及びＲ３が独立してアリール又は置換アリールであることを特徴とする請求項７に記載の化合物。
９．Ｒ１，Ｒ２及びＲ３が各々フェニルであることを特徴とする請求項８に記載の化合物。
１０．Ｒ１，Ｒ２及びＲ３が、嵩高のアルキル、嵩高の置換アルキル、嵩高のアラルキル又は嵩高の置換アラルキルから構成される群から独立して選択されることを特徴とする請求項７に記載の化合物。
１１．Ｒ１，Ｒ２及びＲ３が、フェニル、置換フェニル、ナフチル、トリフェニルメチル、ｔ−ブチル、ネオペンチル、ネオヘキシル、シクロヘキシル、３−ペンチル及び３−エチル−３−ペンチルから構成される群から独立して選択されることを特徴とする請求項７に記載の化合物。
１２．ｎが２であることを特徴とする請求項１１に記載の化合物。