JP7393807B2 - オリゴヌクレオチド合成に用いるマルチフルオラスブロックマーおよびこれを用いたオリゴヌクレオチド合成方法 - Google Patents
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Description
本発明は、オリゴヌクレオチド合成におけるマルチフルオラスブロックマーおよびこれを用いたオリゴヌクレオチド合成方法に関するものである。
近年、天然型または修飾オリゴヌクレオチドを基本骨格とする核酸医薬への注目度が高まっている。目的とした作用が得られるように設計した核酸医薬を得るために、化学合成法が広く用いられている。
化学合成法の一つとして、比較的短鎖のオリゴヌクレオチド合成に用いられる、液相中で全ての反応を進めていく液相合成法が広く知られている。最近では、その液相合成法に、フルオラスタグ（親フルオロカーボン性の置換基）を適用しようとする試みが行われている（特許文献１、特許文献２）。
汎用されている液相合成法においては、比較的短鎖のオリゴヌクレオチドを合成するためであっても、例えば、アミダイトとヌクレオシドとのカップリング反応や、次の反応基点を得るための脱保護反応など、数十工程の反応が必要となる。その多くの工程において、カラムクロマトグラフィー等を用いた精製を必要とする。精製は、多くの場合が煩雑であるため、汎用されている液相合成法によって大量のオリゴヌクレオチドを合成することは容易ではない。
また、特許文献１、特許文献２などで用いられているフルオラスタグは、その構造が複雑であり、容易に入手することができないため、コストも高くなる。
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、入手が容易なフルオラスタグを用い、精製負荷を低減できる、オリゴヌクレオチド合成に用いるマルチフルオラスブロックマーおよびこれを用いたオリゴヌクレオチド合成方法を提供することを目的とする。
上記課題を解決するために、本発明のオリゴヌクレオチド合成に用いるマルチフルオラスブロックマーおよびこれを用いたオリゴヌクレオチド合成方法は以下の手段を採用する。
本発明の第１の態様は、下記式（Ｉ）で表されるヌクレオシド保護体であって、
前記式（Ｉ）中、Ｂは天然型または修飾ヌクレオシド塩基であり；Ｒ１、Ｒ２は、独立して、Ｈまたは、酸性、塩基性または中性条件下で脱保護可能な保護基であり；Ｆ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒは、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＯである場合にはＯ（ＣＨ２）ｎ（ＣＦ２）ｍＣＦ３であり、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＮである場合にはＮＨ（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ（ＣＦ２）ｍＣＦ３であり、ｎは１または２であり、ｍは１～２０の整数であり；Ｙは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＯＣＨ３、メトキシエチル、ＣＮ、ＣＦ３、または、アシル系保護基、エーテル系保護基、シリル系保護基で保護された水酸基であり；Ｚは、Ｈ、アルキル、Ｏ－アルキル、Ｎ－アルキル、ハロゲンであるか、または、前記Ｙとの間でＺ－Ｙ結合を形成する。
本発明の第１の態様は、下記式（Ｉ）で表されるヌクレオシド保護体であって、
本発明の第２の態様は、下記式（ＩＩ）で表される５´－末端保護ヌクレオシドホスホロアミダイトであって、
前記式（ＩＩ）中、Ｂは天然型または修飾ヌクレオシド塩基であり；Ｒ１は、酸性、塩基性または中性条件下で脱保護可能な保護基であり；Ｒ３は、リン酸保護基、好ましくはＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＨ３、またはＣＨ２（ＣＨ２）ｘＹＧであって、ＹがＮＨまたはＳであり、Ｇがアリルまたはアシル基であり、ｘが０～３であるか、または、Ｒ３と、リン原子に結合する窒素原子に結合するＲ４の一つとが結合して形成される環であり、；Ｒ４は、置換または未置換の脂肪族基、置換または未置換の芳香族基であり；Ｆ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒは、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＯである場合にはＯ（ＣＨ２）ｎ（ＣＦ２）ｍＣＦ３であり、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＮである場合にはＮＨ（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ（ＣＦ２）ｍＣＦ３であり、ｎは１または２であり、ｍは１～２０の整数であり；Ｙは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＯＣＨ３、メトキシエチル、ＣＮ、ＣＦ３、または、アシル系保護基、エーテル系保護基、シリル系保護基で保護された水酸基であり；Ｚは、Ｈ、アルキル、Ｏ－アルキル、Ｎ－アルキル、ハロゲンであるか、または、前記Ｙとの間でＺ－Ｙ結合を形成する。
本発明の第３の態様は、下記式（ＩＩＩ）で表されるフルオラスブロックマーアミダイトである。
前記式（ＩＩＩ）中、Ｂは天然型または修飾ヌクレオシド塩基であり；Ｒ１は、酸性、塩基性または中性条件下で脱保護可能な保護基であり；Ｒ３は、リン酸保護基、好ましくはＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＨ３、または、ＣＨ２（ＣＨ２）ｔＲＧであって、ＲがＮＨまたはＳであり、Ｇがアリルまたはアシル基であり、ｔが０～３であるか、または、Ｒ３と、アミダイト部分を形成するリン原子に結合する窒素原子に結合するＲ５の一つとが結合して形成される環であり；Ｒ５は、置換または未置換の脂肪族基、置換または未置換の芳香族基であり；Ｐｒｏは、無保護、ヌクレオシド塩基の保護基またはＦ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒであって、Ｆ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒは、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＯである場合にはＯ（ＣＨ２）ｎ（ＣＦ２）ｍＣＦ３であり、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＮである場合にはＮＨ（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ（ＣＦ２）ｍＣＦ３であり、ｎは１または２であり、ｍは１～２０の整数であり；Ｘは、ＯまたはＳであり；ｐは０～２７の整数であり；Ｙは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＯＣＨ３、メトキシエチル、ＣＮ、ＣＦ３、または、アシル系保護基、エーテル系保護基、シリル系保護基で保護された水酸基であり；Ｚは、Ｈ、アルキル、Ｏ－アルキル、Ｎ－アルキル、ハロゲンであるか、または、前記Ｙとの間でＺ－Ｙ結合を形成する。上記式（ＩＩＩ）で表されるフルオラスブロックマーアミダイトは、ＰｒｏまたはＲ１，Ｒ３のいずれかにおいて、少なくとも一つのＦ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒを有する。
本発明の第４の態様は、下記式（ＩＶ）で表されるマルチフルオラスブロックマーである。
前記式（ＩＶ）中、Ｂは天然型または修飾ヌクレオシド塩基であり；Ｒ１は、酸性、塩基性または中性条件下で脱保護可能な保護基であり；Ｒ３は、リン酸の保護基、好ましくはＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＨ３、または、ＣＨ２（ＣＨ２）ｔＲＧであって、ＲがＮＨまたはＳであり、Ｇがアリルまたはアシル基であり、ｔが０～３であり；Ｐｒｏは、無保護、ヌクレオシド塩基の保護基またはＦ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒであって、Ｆ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒは、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＯである場合にはＯ（ＣＨ２）ｎ（ＣＦ２）ｍＣＦ３であり、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＮである場合にはＮＨ（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ（ＣＦ２）ｍＣＦ３であり、ｎは１または２であり、ｍは１～２０の整数であり；ＸはＯまたはＳであり；ｌは０から５８の整数であり；Ｒ７は、（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）２（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２） ｎ （ＣＦ２） ｍ ＣＦ３またはシリル系保護基であり、ｎは１または２であり、ｍは１～２０の整数であり；Ｙは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＯＣＨ３、メトキシエチル、ＣＮ、ＣＦ３、または、アシル系保護基、エーテル系保護基、シリル系保護基で保護された水酸基であり；Ｚは、Ｈ、アルキル、Ｏ－アルキル、Ｎ－アルキル、ハロゲンであるか、または、前記Ｙとの間でＺ－Ｙ結合を形成する。上記式（ＩＶ）で表されるマルチフルオラスブロックマーは、ＰｒｏまたはＲ１，Ｒ３のいずれかにおいて、少なくとも一つのＦ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒを有する。
本発明の第５の態様は、上記式（ＩＩＩ）で表されるフルオラスブロックマーアミダイトまたは、下記式（ＩＩ´）で表される、５´－末端保護ヌクレオシドＨ－ホスホネートと、下記式（Ｖ）で表される３´－末端にフルオラスアンカーが結合したヌクレオシドとをカップリング反応させる工程を含む、上記式（ＩＶ）で表されるマルチフルオラスブロックマーの合成方法である。下記式（ＩＩ´）および式（Ｖ）中、Ｂは天然型または修飾ヌクレオシド塩基であり；Ｒ１は、酸性、塩基性または中性条件下で脱保護可能な保護基であり；Ｆ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒは、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＯである場合にはＯ（ＣＨ２）ｎ（ＣＦ２）ｍＣＦ３であり、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＮである場合にはＮＨ（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ（ＣＦ２）ｍＣＦ３であり、ｎは１または２であり、ｍは１～２０の整数であり；Ｙは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＯＣＨ３、メトキシエチル、ＣＮ、ＣＦ３、または、アシル系保護基、エーテル系保護基、シリル系保護基で保護された水酸基であり；Ｚは、Ｈ、アルキル、Ｏ－アルキル、Ｎ－アルキル、ハロゲンであるか、または、前記Ｙとの間でＺ－Ｙ結合を形成し；Ｒ
７
は、（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ
２
）
２
（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ
２
）
ｎ
（ＣＦ
２
）
ｍ
ＣＦ
３
またはシリル系保護基であり、ｎは１または２である。
本発明の塩基部分をフルオラス保護したヌクレオシド、塩基部分をフルオラス保護した５´－末端保護ヌクレオシドホスホロアミダイト、およびマルチフルオラスブロックマーを用いてオリゴヌクレオチドを合成する方法によれば、フルオラスアンカーの構造やその導入数を調製することで、オリゴヌクレオチド合成の中間体の溶解性や、精製負荷を低減することができる。これにより、より汎用性の高い方法でオリゴヌクレオチドを合成することができる。
以下に、本発明に係るオリゴヌクレオチド合成に用いるマルチフルオラスブロックマーおよびこれを用いたオリゴヌクレオチド合成方法の実施形態について説明する。
第１の実施形態におけるヌクレオシド保護体は、下記式（Ｉ）で表される構造を有する。
上記式（Ｉ）中、Ｂは天然型または修飾ヌクレオシド塩基であり；Ｒ１、Ｒ２は、独立して、Ｈまたは、酸性、塩基性または中性条件下で脱保護可能な保護基であり；Ｆ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒは、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＯである場合にはＯ（ＣＨ２）ｎ（ＣＦ２）ｍＣＦ３であり、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＮである場合にはＮＨ（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ（ＣＦ２）ｍＣＦ３であり、ｎは１または２であり、ｍは１～２０の整数であり；Ｙは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＯＣＨ３、メトキシエチル、ＣＮ、ＣＦ３、または、アシル系保護基、エーテル系保護基、シリル系保護基で保護された水酸基であり；Ｚは、Ｈ、アルキル、Ｏ－アルキル、Ｎ－アルキル、ハロゲンであるか、または、前記Ｙとの間でＺ－Ｙ結合を形成する。Ｚ－Ｙ結合の例として、置換または無置換のＣ２～Ｃ６アルキレン基、－Ｓ－、－ＣＯ－、－ＣＳ－、－ＣＯＯ－、－ＯＣＯＮＲ６－（Ｒ６はＨまたはＣ１～Ｃ６アルキル基）、－ＣＯＮＲ６－、－ＣＳＮＲ６－などが挙げられる。
上記式（Ｉ）に記載のヌクレオシド保護体は、（１）３´，５´－水酸基を保護したヌクレオシドの塩基部分に、市販のフルオラスアルコールを反応させて塩基を保護し、（２）（１）で得られた化合物の３´，５´－水酸基の保護基を脱保護することで合成することができる。
上記式（Ｉ）に記載のヌクレオシド保護体において、塩基部分の保護は、市販されているフルオラスアルコールを用いて、光延反応や塩化ベンゼンスルホン酸を用いる反応を適用することで行うことができる。本実施形態においては、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ノナフルオロ－１－ヘキサノール、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－トリデカフルオロ－１－オクタノール、１Ｈ，１Ｈ－ペンタデカフルオロ－１－オクタノールなどを用いることができる。市販されているフルオラスアルコールを用いることができるため、従来法よりも、より簡便かつ低コストで上記式（Ｉ）に記載のヌクレオシド保護体を合成することができる。Ｆ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒを導入したヌクレオシド誘導体の具体例としては、以下の化合物が挙げられる。
第２の実施形態は、下記式（ＩＩ）で表される５´－末端保護ヌクレオシドホスホロアミダイトである。
上記式（ＩＩ）中、Ｂは天然型または修飾ヌクレオシド塩基であり；Ｒ１は、酸性、塩基性または中性条件下で脱保護可能な保護基であり；Ｒ３は、リン酸保護基、好ましくはＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＨ３または、ＣＨ２（ＣＨ２）ｘＹＧであって、ＹがＮＨまたはＳであり、Ｇがアリルまたはアシル基であり、ｘが０～３であるか、または、Ｒ３とリン原子に結合する窒素原子に結合するＲ４の一つとが結合して形成される環であり；Ｒ４は、置換または未置換の脂肪族基、置換または未置換の芳香族基であり；Ｆ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒは、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＯである場合にはＯ（ＣＨ２）ｎ（ＣＦ２）ｍＣＦ３であり、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＮである場合にはＮＨ（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ（ＣＦ２）ｍＣＦ３であり、ｎは１または２であり、ｍは１～２０の整数であり；Ｙは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＯＣＨ３、メトキシエチル、ＣＮ、ＣＦ３、または、アシル系保護基、エーテル系保護基、シリル系保護基で保護された水酸基であり；Ｚは、Ｈ、アルキル、Ｏ－アルキル、Ｎ－アルキル、ハロゲンであるか、または、前記Ｙとの間でＺ－Ｙ結合を形成する。Ｚ－Ｙ結合の例は、上記式（Ｉ）で表される化合物と同様である。
上記式（ＩＩ）に記載の３´－ホスホロアミダイトは、（１）上記式（Ｉ）で表される３´，５´－無保護ヌクレオシドの５´－水酸基を、公知の方法で選択的に保護し、（２）（１）で得られた５´－保護３´－無保護ヌクレオシドに、ＮＣＣＨ２ＣＨ２ＯＰ［Ｎ（ｉ－Ｃ３Ｈ７）２］２、ＣＨ２＝ＣＨＣＨ２ＯＰ［Ｎ（ｉ－Ｃ３Ｈ７）２］２などといった３価のリン酸化剤と反応させることで合成することができる。工程（２）は、公知の方法で行うことが可能である。
第３の実施形態は、下記式（ＩＩＩ）で表されるフルオラスブロックマーアミダイトである。
前記式（ＩＩＩ）中、Ｂは天然型または修飾ヌクレオシド塩基であり；Ｒ１は、酸性、塩基性または中性条件下で脱保護可能な保護基であり；Ｒ３は、リン酸保護基、好ましくはＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＨ３、または、ＣＨ２（ＣＨ２） ｔ
ＲＧであって、ＲがＮＨまたはＳであり、Ｇがアリルまたはアシル基であり、ｔが０～３であるか、またはＲ３と、リン原子に結合する窒素原子に結合するＲ５の一つとが結合して形成される環であり；Ｒ５は、置換または未置換の脂肪族基、置換または未置換の芳香族基であり；Ｐｒｏは、無保護、ヌクレオシド塩基の保護基またはＦ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒであって、Ｆ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒは、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＯである場合にはＯ（ＣＨ２）ｎ（ＣＦ２）ｍＣＦ３であり、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＮである場合にはＮＨ（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ（ＣＦ２）ｍＣＦ３であり、ｎは１または２であり、ｍは１～２０の整数であり；ＸはＯまたはＳであり；ｐは０～２７の整数であり；Ｙは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＯＣＨ３、メトキシエチル、ＣＮ、ＣＦ３、または、アシル系保護基、エーテル系保護基、シリル系保護基で保護された水酸基であり；Ｚは、Ｈ、アルキル、Ｏ－アルキル、Ｎ－アルキル、ハロゲンであるか、または、前記Ｙとの間でＺ－Ｙ結合を形成する。Ｚ－Ｙ結合の例は、上記式（Ｉ）で表される化合物と同様である。上記式（ＩＩＩ）で表されるフルオラスブロックマーアミダイトは、ＰｒｏまたはＲ１，Ｒ３のいずれかにおいて、少なくとも一つのＦ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒを有する。本明細書においてブロックマーとは、２量体以上のヌクレオチドであって、アミダイトや３´－または５´－水酸基無保護のヌクレオシド、ヌクレオチド等と縮合反応を行うことでさらに長鎖のヌクレオチドを形成するための合成ブロックとなるヌクレオチド単位である。マルチフルオラスブロックマーとは、フルオラスタグを複数含むブロックマーである。
前記式（ＩＩＩ）で表されるフルオラスブロックマーアミダイトは、（１）上記式（ＩＩ）で表される５´－末端保護ヌクレオシドホスホロアミダイト、または、下記式（ＩＩ´）で表される、５´－末端保護ヌクレオシドＨ－ホスホネートと、下記式（Ｖ）で表される３´－末端にフルオラスアンカーが結合したヌクレオシドとを反応させて中間体を合成し、（２）得られた中間体の３´－末端に結合したフルオラスアンカーが結合したヌクレオシドのフルオラスアンカーを除去して３´－無保護体を得て、（３）無保護となった３´－水酸基にＮＣＣＨ２ＣＨ２ＯＰ［Ｎ（ｉ－Ｃ３Ｈ７）２］２、ＣＨ２＝ＣＨＣＨ２ＯＰ［Ｎ（ｉ－Ｃ３Ｈ７）２］２などといった３価のリン酸化剤と反応させて３´－ホスホロアミダイトを生成させるか、または、トリフェニルホスファイトと反応させた後にトリエチルアミンで加水分解を行う条件、三塩化リンを反応させた後に加水分解を行う、などといった条件下で３´－Ｈ－ホスホネートを生成させ、（４）目的とする鎖長のフルオラスブロックマーアミダイトが得られるまで、上記工程（１）から（３）を繰り返すことで合成することができる。下記式（ＩＩ´）および式（Ｖ）中、Ｂは天然型または修飾ヌクレオシド塩基であり；Ｒ１は、酸性、塩基性または中性条件下で脱保護可能な保護基であり；Ｆ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒは、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＯである場合にはＯ（ＣＨ２）ｎ（ＣＦ２）ｍＣＦ３であり、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＮである場合にはＮＨ（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ（ＣＦ２）ｍＣＦ３であり、ｎは１または２であり、ｍは１～２０の整数であり；Ｙは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＯＣＨ３、メトキシエチル、ＣＮ、ＣＦ３、または、アシル系保護基、エーテル系保護基、シリル系保護基で保護された水酸基であり；Ｚは、Ｈ、アルキル、Ｏ－アルキル、Ｎ－アルキル、ハロゲンであるか、または、前記Ｙとの間でＺ－Ｙ結合を形成し；Ｒ
７
は、（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ
２
）
２
（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ
２
）
ｎ
（ＣＦ
２
）
ｍ
ＣＦ
３
またはシリル系保護基であり、ｎは１または２である。
第４の実施形態は、下記式（ＩＶ）で表されるマルチフルオラスブロックマーである。
前記式（ＩＶ）中、Ｂは天然型または修飾ヌクレオシド塩基であり；Ｒ１は、酸性、塩基性または中性条件下で脱保護可能な保護基であり；Ｒ３は、リン酸保護基、好ましくはＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＨ３、または、ＣＨ２（ＣＨ２） ｔ
ＲＧであって、ＲがＮＨまたはＳであり、Ｇがアリルまたはアシル基であり、ｔが０～３であり；Ｐｒｏは、無保護、ヌクレオシド塩基の保護基またはＦ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒであって、Ｆ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒは、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＯである場合にはＯ（ＣＨ２）ｎ（ＣＦ２）ｍＣＦ３であり、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＮである場合にはＮＨ（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ（ＣＦ２）ｍＣＦ３であり、ｎは１または２であり、ｍは１～２０の整数であり；ＸはＯまたはＳであり；ｌは０～５８の整数であり；Ｒ７は、（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）２（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ（ＣＦ２）ｍＣＦ３またはシリル系保護基であり、ｎは１または２であり、ｍは１～２０の整数であり；Ｙは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＯＣＨ３、メトキシエチル、ＣＮ、ＣＦ３、または、アシル系保護基、エーテル系保護基、シリル系保護基で保護された水酸基であり；Ｚは、Ｈ、アルキル、Ｏ－アルキル、Ｎ－アルキル、ハロゲンであるか、または、前記Ｙとの間でＺ－Ｙ結合を形成する。Ｚ－Ｙ結合の例は、上記式（Ｉ）で表される化合物と同様である。上記式（ＩＶ）で表されるマルチフルオラスブロックマーは、ＰｒｏまたはＲ１，Ｒ３のいずれかにおいて、少なくとも一つのＦ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒを有する。
第５の実施形態は、上記式（ＩＩＩ）で表されるフルオラスブロックマーアミダイトまたは、下記式（ＩＩ´）で表される、５´－末端保護ヌクレオシドＨ－ホスホネートと、下記式（Ｖ）で表される３´－末端にフルオラスアンカーが結合したヌクレオシドとをカップリング反応させる工程を含む、上記式（ＩＶ）で表されるマルチフルオラスブロックマーの合成方法である。下記式（ＩＩ´）および式（Ｖ）中、Ｂは天然型または修飾ヌクレオシド塩基であり；Ｒ１は、酸性、塩基性または中性条件下で脱保護可能な保護基であり；Ｆ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒは、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＯである場合にはＯ（ＣＨ２）ｎ（ＣＦ２）ｍＣＦ３であり、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＮである場合にはＮＨ（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ（ＣＦ２）ｍＣＦ３であり、ｎは１または２であり、ｍは１～２０の整数であり；Ｙは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＯＣＨ３、メトキシエチル、ＣＮ、ＣＦ３、または、アシル系保護基、エーテル系保護基、シリル系保護基で保護された水酸基であり；Ｚは、Ｈ、アルキル、Ｏ－アルキル、Ｎ－アルキル、ハロゲンであるか、または、前記Ｙとの間でＺ－Ｙ結合を形成し；Ｒ
７
は、（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ
２
）
２
（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ
２
）
ｎ
（ＣＦ
２
）
ｍ
ＣＦ
３
またはシリル系保護基であり、ｎは１または２である。
本実施形態におけるマルチフルオラスブロックマーは、（１）上記式（ＩＩ）で表される５´－末端保護ヌクレオシドホスホロアミダイト、または、上記式（ＩＩ´）で表される、５´－末端保護ヌクレオシドＨ－ホスホネートと、上記式（Ｖ）で表される３´－末端にフルオラスアンカーが結合したヌクレオシドとを反応させて中間体を合成し、（２）得られた中間体の３´－末端に結合したフルオラスアンカーが結合したヌクレオシドのフルオラスアンカーを除去して３´－無保護体を得て、（３）無保護となった３´－水酸基にＮＣＣＨ２ＣＨ２ＯＰ［Ｎ（ｉ－Ｃ３Ｈ７）２］２、ＣＨ２＝ＣＨＣＨ２ＯＰ［Ｎ（ｉ－Ｃ３Ｈ７）２］２などといった３価のリン酸化剤と反応させて３´－ホスホロアミダイトを生成させるか、または、トリフェニルホスファイト、ジフェニルホスファイト、三塩化リン、２－クロロ－４Ｈ－１，３，２－ジオキサホスホリン－４－オンなどといったリン酸化剤と反応させた後に加水分解を行って３´－Ｈ－ホスホネートを生成させ、（４）目的とする鎖長のフルオラスブロックマーアミダイトが得られるまで、上記工程（１）から（３）を繰り返すことで合成することができる。
上記実施形態におけるマルチフルオラスブロックマーは、以下に記載する別法でも合成することができる。上記式（ＩＩＩ）で表されるフルオラスブロックマーアミダイトと、下記式（ＶＩ）で表される、５´－末端が無保護、３´－末端にＨ－ホスホネートを有するフルオラスブロックマーＨ－ホスホネートと、上記式（ＩＶ）で表されるマルチフルオラスブロックマーの５´－末端を脱保護したものとを、いわゆるワンポットでカップリングさせことによって、目的の鎖長を有するマルチフルオラスブロックマーを得ることができる。目的物の鎖長に応じて、５´－保護フルオラスブロックマーアミダイトとフルオラスブロックマーＨ－ホスホネートとのカップリングで得られた化合物の５´－末端を脱保護し、再度、フルオラスブロックマーアミダイトと反応させて、鎖長が伸びたフルオラスブロックマーＨ－ホスホネートを合成した後に５´－末端を脱保護して、上記のワンポットカップリング反応に供してもよい。さらなる別法として、マルチフルオラスブロックマーの３´－末端を、フルオラスアンカーに替えて固相担体に結合させたものを用いて上記反応を行うことによっても、固相担体に結合したマルチフルオラスブロックマーを合成することができる。なお、３´－末端にフルオラスアンカーを有するマルチフルオラスブロックマー、３´－末端が固相担体に結合したマルチフルオラスブロックマーのいずれについても、各部位の脱保護反応を行うことで、オリゴヌクレオチドが得られる。脱保護条件を選択することで、必要な部分にのみ保護基を残した修飾オリゴヌクレオチドを合成することも可能である。上記式（ＩＶ）で表されるマルチフルオラスブロックマーは、ＰｒｏまたはＲ１，Ｒ３のいずれかにおいて、少なくとも一つのＦ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒを有する。これにより、マルチフルオラスブロックマーの有する親和性を利用して、汎用されている保護基を用いる場合と比べて、中間体や生成物の分離精製を簡便にすることができる。
上記実施形態におけるヌクレオシド塩基は、アデニル基、グアニル基、シトシニル基、チミニル基、ウラシル基などの天然型塩基、５－メチルシトシニル基、５－フルオロウラシル基、７－メチルグアニル基、７－デアザアデニル基などの修飾塩基を含む。本明細書中の「修飾ヌクレオシド塩基」には、アミノ基、カルボニル基、ヒドロキシル基、チオール基など、反応性官能基を有する塩基が含まれる。上記のような反応性官能基に対して、フルオラスアルコール由来のフルオラス保護基が導入される。ヌクレオシド塩基を保護する保護基としては、アシル基、ベンゾイル基、アリルオキシカルボニル基などが挙げられる。
上記実施形態における脂肪族基は、飽和または不飽和の、直鎖状または分岐しているＣ１－Ｃ１８炭化水素、飽和または不飽和の環状Ｃ３－Ｃ１８炭化水素を含む。好ましくは、飽和または不飽和の、Ｃ１－Ｃ８炭化水素またはＣ３－Ｃ８環状炭化水素である。本実施形態における芳香族基は、フェニル基などの炭素環式芳香環、ナフチル基などの炭素環式芳香環または非炭素式芳香環に縮合した炭素環式芳香環を含む。本実施形態における脂肪族基、芳香族基は、飽和または不飽和の、Ｃ１－Ｃ８炭化水素またはＣ３－Ｃ８環状炭化水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、芳香環などの置換基で置換されていてもよい。リン原子に結合した窒素原子に結合しているのは、好ましくは、直鎖状または分岐しているアルキル基や、ピロリジン、ジエチルアミン、モルホリノ基などの２級アミノ基であり、さらに好ましくはイソプロピル基である。また、リン原子に結合した窒素原子に結合したアルキル基の一端部が、隣接する窒素原子に結合して形成されている環であってもよい。
上記実施形態における、隣接するヌクレオシドを結合するリン酸の保護基としては、オリゴヌクレオチド合成で汎用されるリン酸保護基を用いることができる。好ましくは、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、－ＯＣＨ３、２－クロロフェニル基、フェニル基、または、Ｒ ３ と、リン原子に結合する窒素原子に結合するＲ
４
またはＲ
５ の一つとが結合して形成される環であってもよい。上記以外の保護基として、塩基性条件下で脱保護可能な－ＣＨ２ＣＨ２Ｅ（Ｅは電子吸引性基）、フッ素含有保護基が挙げられる。
本実施形態における５´－水酸基の保護基は、酸性条件、塩基性条件または中性条件下で除去可能な保護基を含む。酸性条件下で除去可能な保護基は、置換または未置換のトリチル基を含むエーテル系保護基、ピキシル基、置換または未置換のテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）基を含み、代表的な保護基として４，４´－ジメトキシトリチル基がある。中性条件下で除去可能な保護基の例としてシリル系保護基があり、具体的には、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、ｔ－ブチルジフェニルシリル基、トリフェニルシリル基を含む。塩基性条件下で除去可能な保護基の例として、Ｆｍｏｃ基、ピバロイル基がある。上記以外の保護基として、アルキル基、アシル基、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、アルコキシアルキル基、カルバモイル基等が挙げられる。
上記実施形態において、３´－無保護水酸基をアミダイト化する工程においては、３´－無保護ヌクレオシドの溶液（０．１～０．４Ｍ）に、３価のリン酸化剤（３´－無保護ヌクレオシドの１．０５～２．０当量）および活性化剤（３´－無保護ヌクレオシドの０．４～０．８当量）を加え、室温で１０～２０時間攪拌する。得られた３´－ホスホロアミダイトをシリカゲルで精製する。
上記実施形態においては、式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）で表される３´－ホスホロアミダイトに対して、アミダイト部分を活性化する活性化剤を添加した後、上記式（Ｖ）で表される３´－末端にフルオラスアンカーが結合したヌクレオシドをカップリングさせることで、式（ＩＶ）で表されるマルチフルオラスブロックマーが得られる。活性化剤の代表的なものとしては、１Ｈ－テトラゾール、Ｓ－エチルチオテトラゾール、ジシアノイミダゾール、ジクロロイミダゾール、スルホン酸とアゾールまたは３級アミンの塩があるが、これらに限定されない。反応は、ジクロロメタン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ＤＭＦ、トルエン等の溶媒を乾燥させたものの中で行う。
上記実施形態におけるブロックマーアミダイトやマルチフルオラスブロックマーを合成する場合には、１塩基ずつ伸張させていく方法の別法として、既に２量体以上となっているブロックマーアミダイトを、３´－末端にフルオラスアンカーが結合したヌクレオシドと縮合させることで、２以上の塩基分を一度に伸張させることもできる。
上記式（ＩＩＩ）で表されるブロックマーアミダイトを用いて行うマルチフルオラスブロックマーの合成は、溶液中で行う（以下、「液相合成法」という）ことができる。上述した方法でマルチフルオラスブロックマーを合成した後、市販されているシリカゲル、オクタデシルやジオール等で修飾されたシリカゲル、フルオラス固相抽出用のシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーにて簡便に精製することができる。市販されているフルオラス固相抽出用のシリカゲルとしては、Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入可能なＦｌｕｏｒｏｆｌａｓｈ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ４０μｍが一例としてあげられる。液相合成法では、固相樹脂上でカップリング反応を行う固相合成法と比べて、大量スケール（１０倍～１００倍以上）で合成することができる。よって、より低コストでオリゴヌクレオチド合成用のマルチフルオラスブロックマーを合成することができる。有機溶媒と水またはフルオラス溶媒と有機溶媒、フルオラス溶媒と水による分液操作や、それら２相系の向流クロマトグラフィー、晶析・粉体化による簡易精製なども適用可能である。
また、マルチフルオラスブロックマーのヌクレオシド塩基部分に保護基として導入する本発明のＦ－アンカーの数を調整する、換言すると、一部のヌクレオシド塩基部分には本発明のＦ－アンカーを導入し、残りのヌクレオシド塩基部分には汎用される保護基を用いることで、フルオラス固相抽出用のシリカゲルとのアフィニティを変化させることができる。これにより、マルチフルオラスブロックマーをフルオラス固相抽出用のシリカゲル側に残るようにし、反応の副生成物や過剰な試薬との分離をより簡便に行うことができる。またマルチフルオラスブロックマー合成の中間体の段階でも、溶媒への溶解性を変化させることができることで、シリカゲルクロマトグラフィーによる精製ではなく、アフィニティクロマトグラフィーによる精製や、フルオラス溶媒－炭化水素系有機溶媒での分配による精製が可能となる。このように、本発明のマルチフルオラスブロックマーは、合成する量やその鎖長に応じて、精製方法を適宜選択することができる。
上記式（ＩＶ）で表されるマルチフルオラスブロックマーを用いたオリゴヌクレオチドの合成においては、例えば、マルチフルオラスブロックマー合成の段階で、３価のリン酸を酸化剤ではなく硫化剤と反応させて、５価のリン酸の一部をチオホスフェートとすることができる。したがって、ブロックマー合成の途中段階でチオホスフェートとしたマルチフルオラスブロックマーを合成しておくことで、狙った位置に確実にチオホスフェートを導入したオリゴヌクレオチドを合成することができる。
以下の実施例は、本発明の実施形態を説明し、例示するものである。実施例１に示す手順に従い、上記式（ＩＩ）で表される化合物の一例である塩基部フルオラス保護ホスホロアミダイトを製造した。また、実施例２に示す手順に従い、上記式（ＩＶ）で表される化合物の一例であるマルチフルオラスブロックマーを製造した。さらに、実施例３に示す手順に従い、上記式（ＩＩＩ）で表される化合物の一つであるブロックマーホスホロアミダイト６量体ホスホロアミダイトと、上記式（ＩＶ）で表される化合物の一例であるマルチフルオラスブロックマーとを用いてオリゴヌクレオチド１９量体の合成を行った。
（実施例１）ヌクレオシド塩基部フルオラス保護ホスホロアミダイトの合成
ステップ１：３´，５´－保護ヌクレオシドの塩基部のフルオラス保護
ステップ１：３´，５´－保護ヌクレオシドの塩基部のフルオラス保護
公知の方法により合成可能である３´，５´－ビス－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルチミジン１（２．４ｇ，５．０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２５ｍＬ）に溶かし、０°Ｃにした。そこへトリフェニルホスフィン（１．４ｇ，５．５ｍｍｏｌ）、４０％ジエチルアゾジカルボキシレート／トルエン溶液（２．５ｍＬ，５．５ｍｍｏｌ）、さらに１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－トリデカフルオロ－１－オクタノール２（２．０ｇ，１．２ｍＬ，５．５ｍｍｏｌ）を加え、１２時間撹拌した。反応溶液をそのまま濃縮し、析出した固体を濾別、ヘキサン：酢酸エチル＝１：１溶液で洗浄したのち、得られた溶液を再び濃縮し、粗生成物とした。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。ヘキサン：酢酸エチル＝４：１で溶出された分画を回収し、目的とする３´，５´－ビス－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル－４－Ｏ－１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－トリデカフルオロ－１Ｈ－オクチルチミジン３を３．３ｇ（４．１ｍｍｏｌ）、８１％収率にて得た。ＥＳＩ－ＴＯＦ Ｍａｓｓ：８４０．３［Ｍ＋Ｎａ＋］＋．
ステップ２：３´，５´－保護－塩基部フルオラス保護ヌクレオシドの３´，５´脱保護
化合物３（１．６ｇ，２．０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（３２ｍＬ）に溶かし、０°Ｃにした。そこへ酢酸（１２０ｍｇ，０．１１ｍＬ，２．０ｍｏｌ）、さらに１．０Ｍテトラブチルアンモニウムフルオリド／テトラヒドロフラン溶液（８．０ｍＬ，８．０ｍｍｏｌ）を加え、１２時間撹拌した。反応溶液を一部濃縮して５ｍＬ程度の容積とし、得られた反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。酢酸エチルで溶出された分画を回収し、目的とする４－Ｏ－１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－トリデカフルオロ－１Ｈ－オクチルチミジン４を１．２ｇ（２．０ｍｍｏｌ）、９８％収率にて得た。ＥＳＩ－ＴＯＦ Ｍａｓｓ：６１２．０［Ｍ＋Ｎａ＋］＋．
ステップ３：３´，５´－無保護－塩基部フルオラス保護ヌクレオシドの５´－保護
化合物４（１．２ｇ，２．０ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド：ピリジン＝１：１溶液（１０ｍＬ）に溶かし、そこへ４，４－ジメチルアミノピリジン（２４ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ）、および、ジメトキシトリチルクロリド（８１０ｍｇ，２．４ｍｍｏｌ）を加え、９０分撹拌した。反応溶液に酢酸エチル（１００ｍＬ）を加え、０．２Ｎ塩酸水溶液で３回有機層を洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムにて乾燥させ、濾過後溶媒を留去し、粗生成物を得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、ヘキサン：酢酸エチル＝７：３で溶出された分画を回収し、目的とする５´－ジメトキシトリチル－４－Ｏ－１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－トリデカフルオロ－１Ｈ－オクチルチミジン５を１．５ｇ（１．７ｍｍｏｌ）、８３％収率にて得た。ＥＳＩ－ＴＯＦ Ｍａｓｓ：９１４．７［Ｍ＋Ｎａ＋］＋.
ステップ４：５´－保護－３´－無保護－塩基部フルオラス保護ヌクレオシドのアミダイト化
化合物５（１．４ｇ，１．６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン：アセトニトリル＝１：１溶液（１６ｍＬ）に溶かし、そこへ１Ｈ－テトラゾール（８０ｍｇ，１．１ｍｍｏｌ）を加え、０°Ｃにて１５分撹拌した。そこへアリルテトライソプロピルホスホロアミダイト（７１０ｍｇ，０．７４ｍＬ，２．４ｍｍｏｌ）を加え、反応を開始した。１５時間後、この反応混合物をそのままシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、ヘキサン：酢酸エチル＝９：１で溶出された分画を回収し、目的とするアリル５’－ジメトキシトリチル－４－Ｏ－１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－トリデカフルオロ－１Ｈ－オクチルチミジン－３’－ホスホロアミダイト６を１．６ｇ（１．４ｍｍｏｌ）、８９％収率にて得た。ＵＰＬＣ測定により９７％純度であることが示された。ＥＳＩ－ＴＯＦ Ｍａｓｓ：１０７９．２［Ｍ＋Ｈ＋］＋．化合物６のＥＳＩ－ＴＯＦスペクトルを図１に示した。
（実施例２）マルチフルオラスブロックマーの合成
ステップ５：塩基部フルオラス保護ヌクレオシドの２量体合成
ステップ５：塩基部フルオラス保護ヌクレオシドの２量体合成
化合物６（５２０ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ）と文献記載の方法により合成可能な化合物７（２８０ｍｇ，０．４０ｍｍｏｌ）を混合後、真空乾燥させ、そこへアルゴン気流を充填し常圧にした。ここへモレキュラーシーブス３Ａ（８００ｍｇ）を加え、次いでジクロロメタン：アセトニトリル＝１：１溶液（８ｍＬ）を加え、２時間撹拌した。そこへ１Ｈ－テトラゾール（１１０ｍｇ，１．６ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３０分撹拌した。反応の進行を確認した後、３１ｗｔ％２－ブタノンペルオキシド／ジイソ酪酸－２，２，４－トリメチル－１，３－ペンタン溶液（０．３９ｍＬ，０．６ｍｍｏｌ）を加え、反応を継続した。３０分後、この反応混合物をセライト濾過し、溶液量が８ｍＬになるまで濃縮したのち、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。ヘキサン：酢酸エチル＝２：３で溶出された分画を回収し、目的とするビスフルオラスＴＴブロックマー８を６４０ｍｇ（０．３８ｍｍｏｌ）、９４％収率にて得た。ＵＰＬＣ測定により９８％純度であることが示された。ＥＳＩ－ＴＯＦ Ｍａｓｓ：１６８０．６［Ｍ－Ｈ＋］－．化合物８のＥＳＩ－ＴＯＦスペクトルを図２に示した。
（実施例３）６量体ホスホロアミダイトを用いるオリゴヌクレオチド１９量体の液相合成
ステップ６：６量体ホスホロアミダイトと５´－保護－３´－フルオラスアンカー結合ヌクレオシドとの縮合反応
ステップ６：６量体ホスホロアミダイトと５´－保護－３´－フルオラスアンカー結合ヌクレオシドとの縮合反応
化合物９（４００ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）と公知の方法により合成可能な化合物７（１００ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）を混合後、真空乾燥させ、そこへアルゴン気流を充填し常圧にした。ここへモレキュラーシーブス３Ａ（６００ｍｇ）を加え、次いでジクロロメタン：アセトニトリル＝１：１溶液（６ｍＬ）を加え、２時間撹拌した。そこへ５－エチル－１Ｈ－テトラゾール（７８ｍｇ，０．６０ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３０分撹拌した。反応の進行を確認した後、３１ｗｔ％２－ブタノンペルオキシド／ジイソ酪酸－２，２，４－トリメチル－１，３－ペンタン溶液（０．１５ｍＬ，０．３０ｍｍｏｌ）を加え、反応を継続した。３０分後、この反応混合物をセライト濾過し、溶液量が５ｍＬになるまで濃縮したのち、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。ジクロロメタン：メタノール＝２０：１で溶出された分画を回収し、目的とするＴ７量体１０を２６０ｍｇ（０．０８４ｍｍｏｌ）、５６％収率にて得た。ＥＳＩ－ＴＯＦ Ｍａｓｓ：１５５２．２［Ｍ＋２Ｎａ＋］＋．
ステップ７：５´－保護－３´－フルオラスアンカー結合ヌクレオチド７量体の５´－脱保護
化合物１０（２３０ｍｇ，０．０７６ｍｍｏｌ）にジクロロメタン：アセトニトリル＝４：１溶液（４ｍＬ）を加え、溶解させた後、氷浴に浸し０°Ｃとした。そこへジクロロ酢酸（２００ｍｇ，０．１３ｍＬ，１．５ｍｍｏｌ）を加え、３０分撹拌した。反応の進行を確認した後、この反応混合物をそのままシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。ジクロロメタン：メタノール＝１３：１で溶出された分画を回収し、目的とする脱トリチルされたＴ７量体１１を１８０ｍｇ（０．０６５ｍｍｏｌ）、８６％収率にて得た。
ステップ８：５´－保護６量体ブロックマーアミダイトと５´－無保護－３´－フルオラスアンカー結合ヌクレオチド７量体との縮合による５´－保護ヌクレオチド１３量体合成
化合物９（２４０ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）と化合物１１（２１０ｍｇ，０．０７６ｍｍｏｌ）を混合後、真空乾燥させ、そこへアルゴン気流を充填し常圧にした。ここへモレキュラーシーブス３Ａ（５００ｍｇ）を加え、次いでジクロロメタン：アセトニトリル＝１：１溶液（５ｍＬ）を加え、２時間撹拌した。そこへ５－エチル－１Ｈ－テトラゾール（４０ｍｇ，０．３０ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３０分撹拌した。反応の進行を確認した後、３１ｗｔ％２－ブタノンペルオキシド／ジイソ酪酸－２，２，４－トリメチル－１，３－ペンタン溶液（０．０７３ｍＬ，０．１１ｍｍｏｌ）を加え、反応を継続した。３０分後、この反応混合物をセライト濾過し、溶液量が５ｍＬになるまで濃縮したのち、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。ジクロロメタン：メタノール＝９：１で溶出された分画を回収し、目的とするＴ１３量体１２を２６０ｍｇ（０．０５１ｍｍｏｌ）、７３％収率にて得た。
ステップ９：５´－保護ヌクレオチド１３量体の５´－脱保護
化合物１２（４８０ｍｇ，０．０９３ｍｍｏｌ）にジクロロメタン：アセトニトリル＝４：１溶液（４．５ｍＬ）を加え、溶解させた後、氷浴に浸し０°Ｃとした。そこへジクロロ酢酸（２４０ｍｇ，０．１５ｍＬ，１．９ｍｍｏｌ）を加え、３０分撹拌した。反応の進行を確認した後、この反応混合物をそのままシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。ジクロロメタン：メタノール＝９：１で溶出された分画を回収し、目的とする脱トリチルされたＴ１３量体１３を２４０ｍｇ（０．０５０ｍｍｏｌ）、５２％収率にて得た。得られた化合物が、目的とする１３量体であることは、得られた化合物の一部をアンモニア加水分解に供し、Ｔ１３量体を示す分子イオンピーク［Ｍ－Ｈ＋］－３８８９．６７（計算値３８８９．６４）を観測したことにより確認している。
ステップ１０：５´－保護６量体ブロックマーアミダイトと５´－無保護－３´－フルオラスアンカー結合ヌクレオチド１３量体との縮合による５´－保護－３´－フルオラスアンカー結合ヌクレオチド１９量体合成
化合物９（２３０ｍｇ，０．０９３ｍｍｏｌ）と化合物１３（３００ｍｇ，０．０６２ｍｍｏｌ）を混合後、真空乾燥させ、そこへアルゴン気流を充填し常圧にした。ここへモレキュラーシーブス３Ａ（５００ｍｇ）を加え、次いでジクロロメタン：アセトニトリル＝１：１溶液（５ｍＬ）を加え、２時間撹拌した。そこへ５－エチル－１Ｈ－テトラゾール（３２ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３０分撹拌した。反応の進行を確認した後、３１ｗｔ％２－ブタノンペルオキシド／ジイソ酪酸－２，２，４－トリメチル－１，３－ペンタン溶液（０．０６０ｍＬ，０．０９３ｍｍｏｌ）を加え、反応を継続した。３０分後、この反応混合物をセライト濾過し、溶液量が５ｍＬになるまで濃縮したのち、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。ジクロロメタン：メタノール＝６：１で溶出された分画を回収し、目的とする、５´－保護－リン酸保護－３´－フルオラスアンカー結合Ｔ１９量体１４を８２ｍｇ（０．０１１ｍｍｏｌ）、１８％収率にて得た。
ステップ１１：５´－保護－３´－フルオラスアンカー結合ヌクレオチド１９量体の脱保護
化合物１４を１％ β－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌのメタノール：濃アンモニア水＝１：１溶液に溶解させ、５０°Ｃで１２時間撹拌した。反応生成物を、市販の精製キットに供し、ジメトキシトリチル基の除去および精製を行うことで、目的とする化合物１５が得られることを確認した。目的とする１９量体であることは、Ｔ１９量体を示す分子イオンピーク［Ｍ－Ｈ－］－５７１４．００（分子式Ｃ１９０Ｈ２４７Ｎ３８Ｏ１３１Ｐ１８
－，計算値５７１３．９１）を観測したことにより確認している。得られたＴ１９量体１５のＵＰＬＣスペクトルを図３に、ＥＳＩ－ＴＯＦマススペクトルを図４に、それぞれ示した。
（実施例４）塩基部がフルオラス保護されたヌクレオシドを用いた１１量体の合成
ステップ１２：５´－保護－塩基部フルオラス保護ヌクレオシド－３´－アミダイトと５´－無保護－３´－保護－ヌクレオチド３量体との縮合による、塩基部フルオラス保護ヌクレオシドを含む５´，３´－保護ヌクレオチド４量体合成
化合物１６（１．０５ｇ，１．００ｍｍｏｌ）と化合物４（１．３４ｇ，１．２０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン－アセトニトリル１：１混合物（１６ｍＬ）に溶かし、さらに１Ｈ－テトラゾール（３５０ｍｇ，５．００ｍｍｏｌ）を加え撹拌した。１５分後、３１ｗｔ％ ２－ｂｕｔａｎｏｎｅ ｐｅｒｏｘｉｄｅ（９６６μＬ，１．５０ｍｍｏｌ）を滴下して１５分撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル１００％）にて原料がほぼ消失したことを確認し、分液洗浄後、カラムクロマトグラフィーに供し、目的とする５´，３´－保護ヌクレオチド４量体１７を得た（１．９３ｇ，０．９３ｍｍｏｌ，９３％収率，純度９７％）。構造は３１ＰＮＭＲ、ＥＳＩ－ＭＳにより、純度はＵＰＬＣにて確認した）。
ステップ１２：５´－保護－塩基部フルオラス保護ヌクレオシド－３´－アミダイトと５´－無保護－３´－保護－ヌクレオチド３量体との縮合による、塩基部フルオラス保護ヌクレオシドを含む５´，３´－保護ヌクレオチド４量体合成
ステップ１３：塩基部フルオラス保護ヌクレオシドを含む５´，３´－保護ヌクレオチド４量体の３´－脱保護
５´，３´－保護ヌクレオチド４量体１７（１．８７ｇ，０．９００ｍｍｏｌ）に酢酸（５１．４μＬ，０．９００ｍｍｏｌ）を加え０℃まで冷却した。１．０Ｍ ＴＢＡＦ ｉｎ ＴＨＦ（１．８０ｍＬ，１．８０ｍｍｏｌ）を滴下して３時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル＝１００％）にて原料がほぼ消失したことを確認し、分液洗浄後、カラムクロマトグラフィーに供し、目的とする３´－脱保護４量体１８を得た（１．３５ｇ，０．６８９ｍｍｏｌ，７６．７％収率，純度９３％）。構造は３１ＰＮＭＲ、ＥＳＩ－ＭＳにより、純度はＵＰＬＣにて確認した。
ステップ１４：塩基部フルオラス保護ヌクレオシドを含む５´－保護ヌクレオチド４量体の３´－アミダイト化
化合物１８（１．２７ｇ，０．６５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン－アセトニトリル１：１混合物（１６ｍＬ）に溶かし、さらに１Ｈ－テトラゾール（５９．０ｍｇ，０．８４５ｍｍｏｌ）とＮ－メチルイミダゾール（２１．０μＬ，０．２６０ｍｍｏｌ）を加え、０℃にした。１５分後、アリル－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロアミダイト（４６９μＬ，１．６３ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。４日後、ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）にて原料がほぼ消失したことを確認し、反応混合液をそのままカラムクロマトグラフィーに供し、目的とする４量体アミダイト体１９を得た（０．８７３ｇ，０．４０ｍｍｏｌ，６２．６％収率，純度９８．３％）。構造はＥＳＩ－ＭＳにより、純度はＵＰＬＣにて確認した。
ステップ１５：塩基部フルオラス保護ヌクレオシドを含む５´－保護ヌクレオチド４量体３´－アミダイトと５´－無保護－３´－保護ヌクレオチド３量体との縮合による、塩基部フルオラス保護ヌクレオシドを含む５´，３´－保護ヌクレオチド７量体合成
化合物１６（０．５３７ｇ，０．２５ｍｍｏｌ）と４量体アミダイト１９（０．２８８ｇ，０．２７５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン－アセトニトリル１：１混合物（５ｍＬ）に溶かし、さらに５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（７０．１ｍｇ，１．００ｍｍｏｌ）を加え撹拌した。９０分後、３１ｗｔ％ ２－ｂｕｔａｎｏｎｅ ｐｅｒｏｘｉｄｅ（２４１μＬ，０．３７５ｍｍｏｌ）を滴下して６０分撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル：メタノール＝９：１）にて原料がほぼ消失したことを確認し、分液洗浄後、カラムクロマトグラフィーに供し、目的とする７量体２０を得た（０．６５５ｇ，０．２１１ｍｍｏｌ，８４．３％収率，純度９６．７％）。構造はＥＳＩ－ＭＳにより、純度はＵＰＬＣにて確認した。
ステップ１６：塩基部フルオラス保護ヌクレオシドを含む５´，３´－保護ヌクレオチド７量体の５´－脱保護
化合物２０（０．６５５ｇ，０．２１１ｍｍｏｌ）にジクロロメタン（４ｍＬ）を加え０℃まで冷却した。ジクロロ酢酸（０．３４９ｍＬ，４．２２ｍｍｏｌ）を滴下して３０分撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル：メタノール＝９：１）にて原料がほぼ消失したことを確認し、反応液をカラムクロマトグラフィーに供し、目的とする５´－無保護７量体２１を得た（０．４６８ｇ，０．６８９ｍｍｏｌ，７９．１％収率，純度９２．４％）。純度はＵＰＬＣにて確認した。
ステップ１７：塩基部フルオラス保護ヌクレオシドを含む５´－保護ヌクレオチド４量体３´－アミダイトと塩基部フルオラス保護ヌクレオシドを含む５´－無保護－３´－保護ヌクレオチド７量体との縮合による、塩基部フルオラス保護ヌクレオシドを含む５´，３´－保護ヌクレオチド１１量体合成
５´－無保護７量体２１（０．３１１ｇ，０．１００ｍｍｏｌ）と４量体アミダイト１９（０．２３６ｇ，０．１１０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン－アセトニトリル１：１混合物（２ｍＬ）に溶かし、さらに１Ｈ－テトラゾール（４２．０ｍｇ，６．００ｍｍｏｌ）およびＮ－メチルイミダゾール（１６μＬ，０．２００ｍｍｏｌ）を加え撹拌した。９０分後、３１ｗｔ％ ２－ｂｕｔａｎｏｎｅ ｐｅｒｏｘｉｄｅ（１００μＬ，０．１５０ｍｍｏｌ）を滴下して６０分撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル：メタノール＝９：１）にて原料がほぼ消失したことを確認し、分液洗浄後、カラムクロマトグラフィーに供し、目的とする塩基部フルオラス保護ヌクレオシドを含む５´，３´－保護ヌクレオチド１１量体２２を得た（０．４５０ｇ，０．０９２０ｍｍｏｌ，９２％収率，純度９６．７％）。純度はＵＰＬＣにて確認した。ＵＰＬＣスペクトルを図５に示した。
得られた塩基部フルオラス保護ヌクレオシドを含む５´，３´－保護ヌクレオチド１１量体２２に対して汎用される方法で脱保護を行うことで、保護基を除去したヌクレオチド１１量体を得ることができる。
得られた塩基部フルオラス保護ヌクレオシドを含む５´，３´－保護ヌクレオチド１１量体２２に対して汎用される方法で脱保護を行うことで、保護基を除去したヌクレオチド１１量体を得ることができる。
従来法で合成したｄＴＡ１９配列を有するヌクレオチド２０量体の脱保護後の純度と、本発明のフルオラスタグを用いた合成法によって合成したｄＴＡ１９配列を有するヌクレオチド２０量体の脱保護後の純度とを比較したＵＰＬＣスペクトルを図６に示す。（ａ）が従来法で合成したｄＴＡ１９２０量体のスペクトル、（ｂ）が本発明のフルオラスタグを５´－末端Ｔの塩基部分に有するｄＴＡ１９２０量体のスペクトルである。フルオラスタグを残した状態となるように脱保護を行い、精製に供したことで、従来法で合成した２０量体よりも高い純度で２０量体が得られたことが分かる。フルオラスタグが有する高い脂溶性により、分離精製にあたって保持時間が大きく変わることで、従来法よりも簡便に単離精製を行うことができることが示された。
本実施形態のマルチフルオラスブロックマーは、市販されているフッ化炭素誘導体をそのまま用いてフルオラスアンカーを導入することで合成することができる。また、目的に応じて、フルオラスアンカー中のフッ素の数を変更することが容易に可能である。このため、目的とするフルオラスタグを得るために複雑な工程を必要とする、従来法によるヌクレオシドへのフルオラスタグ導入よりも、低コストかつ容易に目的物を得ることができる。
また、先述したような問題に起因して、従来法によるヌクレオシドへのフルオラスタグ導入は、フルオラスタグの導入数に制限があり、汎用性が高くない。これに対して、本実施形態のマルチフルオラスブロックマーの合成は、フルオラスアンカーの導入数を調製することで、オリゴヌクレオチド合成の中間体の溶解性や、精製負荷を低減することができる。これにより、より汎用性が高い合成法とすることができる。また、フルオラスタグは、合成するブロックマーやオリゴヌクレオチドの長さや配列に応じて、ヌクレオシド塩基部分に導入したり，ヌクレオシドの３´－末端の保護基に導入することができる。
また、本実施形態のマルチフルオラスブロックマーを用いたオリゴヌクレオチド合成方法は、ブロックマーの段階で酸化／硫化した５価のリン酸結合部分を形成しておくことができる。したがって、オリゴヌクレオチド中の一部のリン酸結合のみを他の部分のリン酸結合と異なる酸化／硫化状態とする場合においても、オリゴヌクレオチド合成の手順を変えることなく、より簡便に、目的とする修飾されたリン酸結合部分を含むオリゴヌクレオチドを合成することができる。
また、これまでに用いられているフルオラスタグを導入したブロックマーは、そのフルオラスタグの物性に影響を受けることで、オリゴヌクレオチド合成における鎖長伸張時の精製方法が煩雑となっていた。これに対し、マルチフルオラスブロックマーの合成方法およびマルチフルオラスブロックマーを用いたオリゴヌクレオチド合成方法は、その鎖長に応じて、シリカゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィーによる精製、フルオラス溶媒－炭化水素系有機溶媒での分配など、精製方法の選択の自由度が大きい。このため、従来法によるフルオラスタグを用いたオリゴヌクレオチド合成方法よりも、より簡便な精製で目的とするオリゴヌクレオチドを得ることができる。
また、本実施形態のマルチフルオラスブロックマーを用いたオリゴヌクレオチド合成方法によれば、同じＮ量体のオリゴヌクレオチドを合成するにあたって、汎用されてきた液相合成法で１塩基ずつ伸長を行う方法と比べて、必要となる工程数を減らすことができる。したがって、目的とする長さのオリゴヌクレオチドの収率を向上させることができる。
Claims (5)
- 下記式（Ｉ）で表される、オリゴヌクレオチド合成に用いるヌクレオシド保護体であって、
前記酸性条件下で脱保護可能な保護基が、置換または未置換のトリチル基、ピキシル基、置換または未置換のテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）基から選択され、
前記塩基性条件下で脱保護可能な保護基が、Ｆｍｏｃ基、ピバロイル基から選択され、
前記中性条件下で脱保護可能な保護基が、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、ｔ－ブチルジフェニルシリル基、トリフェニルシリル基から選択され、
前記アシル系保護基が、アシル基、アセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基から選択され、
前記エーテル系保護基が、ピキシル基、置換または未置換のテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）基から選択され、
前記シリル系保護基が、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、ｔ－ブチルジフェニルシリル基、トリフェニルシリル基から選択される、ヌクレオシド保護体。 - 下記式（ＩＩ）で表される、オリゴヌクレオチド合成に用いる５´－末端保護ヌクレオシドホスホロアミダイトであって、
前記酸性条件下で脱保護可能な保護基が、置換または未置換のトリチル基、ピキシル基、置換または未置換のテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）基から選択され、
前記塩基性条件下で脱保護可能な保護基が、Ｆｍｏｃ基、ピバロイル基から選択され、
前記中性条件下で脱保護可能な保護基が、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、ｔ－ブチルジフェニルシリル基、トリフェニルシリル基から選択され、
前記アシル系保護基が、アシル基、アセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基から選択され、
前記エーテル系保護基が、ピキシル基、置換または未置換のテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）基から選択され、
前記シリル系保護基が、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、ｔ－ブチルジフェニルシリル基、トリフェニルシリル基から選択され、
前記リン酸基の保護基が、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、－ＯＣＨ３、２－クロロフェニル基、フェニル基から選択される、５´－末端保護ヌクレオシドホスホロアミダイト。 - 下記式（ＩＩＩ）で表される、オリゴヌクレオチド合成に用いるフルオラスブロックマーアミダイトであって、
前記酸性条件下で脱保護可能な保護基が、置換または未置換のトリチル基、ピキシル基、置換または未置換のテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）基から選択され、
前記塩基性条件下で脱保護可能な保護基が、Ｆｍｏｃ基、ピバロイル基から選択され、
前記中性条件下で脱保護可能な保護基が、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、ｔ－ブチルジフェニルシリル基、トリフェニルシリル基から選択され、
前記ヌクレオシド塩基の保護基が、アシル基、ベンゾイル基、アリルオキシカルボニル基から選択され、
前記アシル系保護基が、アシル基、アセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基から選択され、
前記エーテル系保護基が、ピキシル基、置換または未置換のテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）基から選択され、
前記シリル系保護基が、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、ｔ－ブチルジフェニルシリル基、トリフェニルシリル基から選択され、
前記リン酸基の保護基が、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、フッ素含有保護基、－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、－ＯＣＨ３、２－クロロフェニル基、フェニル基から選択され、前記フッ素含有保護基はＯ（ＣＨ ２ ） ｎ （ＣＦ ２ ） ｍ ＣＦ ３ で表され、ｎは１または２であり、ｍは１～２０の整数である、フルオラスブロックマーアミダイト。 - 下記式（ＩＶ）で表される、オリゴヌクレオチド合成に用いるマルチフルオラスブロックマーであって、
前記酸性条件下で脱保護可能な保護基が、置換または未置換のトリチル基、ピキシル基、置換または未置換のテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）基から選択され、
前記塩基性条件下で脱保護可能な保護基が、Ｆｍｏｃ基、ピバロイル基から選択され、
前記中性条件下で脱保護可能な保護基が、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、ｔ－ブチルジフェニルシリル基、トリフェニルシリル基から選択され、
前記ヌクレオシド塩基の保護基が、アシル基、ベンゾイル基、アリルオキシカルボニル基から選択され、
前記アシル系保護基が、アシル基、アセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基から選択され、
前記エーテル系保護基が、ピキシル基、置換または未置換のテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）基から選択され、
前記シリル系保護基が、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、ｔ－ブチルジフェニルシリル基、トリフェニルシリル基から選択され、
前記リン酸基の保護基が、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、フッ素含有保護基、－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、－ＯＣＨ３、２－クロロフェニル基、フェニル基から選択され、前記フッ素含有保護基はＯ（ＣＨ ２ ） ｎ （ＣＦ ２ ） ｍ ＣＦ ３ で表され、ｎは１または２であり、ｍは１～２０の整数である、マルチフルオラスブロックマー。 - 請求項３に記載の上記式（ＩＩＩ）で表されるフルオラスブロックマーアミダイトまたは、下記式（ＩＩ´）で表される、５´－末端保護ヌクレオシドＨ－ホスホネートと、下記式（Ｖ）で表される３´－末端にフルオラスアンカーが結合したヌクレオシドとをカップリング反応させる工程を含む、請求項４に記載の下記式（ＩＶ）で表される、オリゴヌクレオチド合成に用いるマルチフルオラスブロックマーの合成方法であって、
前記酸性条件下で脱保護可能な保護基が、置換または未置換のトリチル基、ピキシル基、置換または未置換のテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）基から選択され、
前記塩基性条件下で脱保護可能な保護基が、Ｆｍｏｃ基、ピバロイル基から選択され、
前記中性条件下で脱保護可能な保護基が、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、ｔ－ブチルジフェニルシリル基、トリフェニルシリル基から選択され、
前記アシル系保護基が、アシル基、アセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基から選択され、
前記エーテル系保護基が、ピキシル基、置換または未置換のテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）基から選択され、
前記シリル系保護基が、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、ｔ－ブチルジフェニルシリル基、トリフェニルシリル基から選択される、マルチフルオラスブロックマーの合成方法。
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