JPWO2020235658A5

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Publication number: JPWO2020235658A5
Application number: JP2021520862A
Authority: JP
Filing date: 2020-05-21
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2040-05-21

Description

前記式（ＩＶ）中、Ｂは天然型または修飾ヌクレオシド塩基であり；Ｒ^１は、酸性、塩基性または中性条件下で脱保護可能な保護基であり；Ｒ^３は、リン酸の保護基、好ましくはＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ、ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２、ＯＣＨ_３、または、ＣＨ_２（ＣＨ_２）_ｔＲＧであって、ＲがＮＨまたはＳであり、Ｇがアリルまたはアシル基であり、ｔが０～３であり；Ｐｒｏは、無保護、ヌクレオシド塩基の保護基またはＦ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒであって、Ｆ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒは、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＯである場合にはＯ（ＣＨ_２）_ｎ（ＣＦ_２）_ｍＣＦ_３であり、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＮである場合にはＮＨ（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ（ＣＦ_２）_ｍＣＦ_３であり、ｎは１または２であり、ｍは１～２０の整数であり；ＸはＯまたはＳであり；ｌは０から５８の整数であり；Ｒ^７は、（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ_２）_２（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ（ＣＦ_２）_ｍＣＦ_３またはシリル系保護基であり、ｎは１または２であり、ｍは１～２０の整数であり；Ｙは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＯＣＨ_３、メトキシエチル、ＣＮ、ＣＦ_３、または、アシル系保護基、エーテル系保護基、シリル系保護基で保護された水酸基であり；Ｚは、Ｈ、アルキル、Ｏ－アルキル、Ｎ－アルキル、ハロゲンであるか、または、前記Ｙとの間でＺ－Ｙ結合を形成する。上記式（ＩＶ）で表されるマルチフルオラスブロックマーは、ＰｒｏまたはＲ^１，Ｒ^３のいずれかにおいて、少なくとも一つのＦ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒを有する。

本発明の第５の態様は、上記式（ＩＩＩ）で表されるフルオラスブロックマーアミダイトまたは、下記式（ＩＩ´）で表される、５´－末端保護ヌクレオシドＨ－ホスホネートと、下記式（Ｖ）で表される３´－末端にフルオラスアンカーが結合したヌクレオシドとをカップリング反応させる工程を含む、上記式（ＩＶ）で表されるマルチフルオラスブロックマーの合成方法である。下記式（ＩＩ´）および式（Ｖ）中、Ｂは天然型または修飾ヌクレオシド塩基であり；Ｒ^１は、酸性、塩基性または中性条件下で脱保護可能な保護基であり；Ｆ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒは、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＯである場合にはＯ（ＣＨ_２）_ｎ（ＣＦ_２）_ｍＣＦ_３であり、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＮである場合にはＮＨ（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ（ＣＦ_２）_ｍＣＦ_３であり、ｎは１または２であり、ｍは１～２０の整数であり；Ｙは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＯＣＨ_３、メトキシエチル、ＣＮ、ＣＦ_３、または、アシル系保護基、エーテル系保護基、シリル系保護基で保護された水酸基であり；Ｚは、Ｈ、アルキル、Ｏ－アルキル、Ｎ－アルキル、ハロゲンであるか、または、前記Ｙとの間でＺ－Ｙ結合を形成し；Ｒ ^７は、（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ _２） _２（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ _２） _ｎ（ＣＦ _２） _ｍＣＦ _３またはシリル系保護基であり、ｎは１または２である。

前記式（ＩＩＩ）中、Ｂは天然型または修飾ヌクレオシド塩基であり；Ｒ^１は、酸性、塩基性または中性条件下で脱保護可能な保護基であり；Ｒ^３は、リン酸保護基、好ましくはＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ、ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２、ＯＣＨ_３、または、ＣＨ_２（ＣＨ_２）_ｔＲＧであって、ＲがＮＨまたはＳであり、Ｇがアリルまたはアシル基であり、ｔが０～３であるか、またはＲ^３と、リン原子に結合する窒素原子に結合するＲ^５の一つとが結合して形成される環であり；Ｒ^５は、置換または未置換の脂肪族基、置換または未置換の芳香族基であり；Ｐｒｏは、無保護、ヌクレオシド塩基の保護基またはＦ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒであって、Ｆ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒは、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＯである場合にはＯ（ＣＨ_２）_ｎ（ＣＦ_２）_ｍＣＦ_３であり、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＮである場合にはＮＨ（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ（ＣＦ_２）_ｍＣＦ_３であり、ｎは１または２であり、ｍは１～２０の整数であり；ＸはＯまたはＳであり；ｐは０～２７の整数であり；Ｙは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＯＣＨ_３、メトキシエチル、ＣＮ、ＣＦ_３、または、アシル系保護基、エーテル系保護基、シリル系保護基で保護された水酸基であり；Ｚは、Ｈ、アルキル、Ｏ－アルキル、Ｎ－アルキル、ハロゲンであるか、または、前記Ｙとの間でＺ－Ｙ結合を形成する。Ｚ－Ｙ結合の例は、上記式（Ｉ）で表される化合物と同様である。上記式（ＩＩＩ）で表されるフルオラスブロックマーアミダイトは、ＰｒｏまたはＲ^１，Ｒ^３のいずれかにおいて、少なくとも一つのＦ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒを有する。本明細書においてブロックマーとは、２量体以上のヌクレオチドであって、アミダイトや３´－または５´－水酸基無保護のヌクレオシド、ヌクレオチド等と縮合反応を行うことでさらに長鎖のヌクレオチドを形成するための合成ブロックとなるヌクレオチド単位である。マルチフルオラスブロックマーとは、フルオラスタグを複数含むブロックマーである。

前記式（ＩＩＩ）で表されるフルオラスブロックマーアミダイトは、（１）上記式（ＩＩ）で表される５´－末端保護ヌクレオシドホスホロアミダイト、または、下記式（ＩＩ´）で表される、５´－末端保護ヌクレオシドＨ－ホスホネートと、下記式（Ｖ）で表される３´－末端にフルオラスアンカーが結合したヌクレオシドとを反応させて中間体を合成し、（２）得られた中間体の３´－末端に結合したフルオラスアンカーが結合したヌクレオシドのフルオラスアンカーを除去して３´－無保護体を得て、（３）無保護となった３´－水酸基にＮＣＣＨ_２ＣＨ_２ＯＰ［Ｎ（ｉ－Ｃ_３Ｈ_７）_２］_２、ＣＨ_２＝ＣＨＣＨ_２ＯＰ［Ｎ（ｉ－Ｃ_３Ｈ_７）_２］_２などといった３価のリン酸化剤と反応させて３´－ホスホロアミダイトを生成させるか、または、トリフェニルホスファイトと反応させた後にトリエチルアミンで加水分解を行う条件、三塩化リンを反応させた後に加水分解を行う、などといった条件下で３´－Ｈ－ホスホネートを生成させ、（４）目的とする鎖長のフルオラスブロックマーアミダイトが得られるまで、上記工程（１）から（３）を繰り返すことで合成することができる。下記式（ＩＩ´）および式（Ｖ）中、Ｂは天然型または修飾ヌクレオシド塩基であり；Ｒ^１は、酸性、塩基性または中性条件下で脱保護可能な保護基であり；Ｆ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒは、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＯである場合にはＯ（ＣＨ_２）_ｎ（ＣＦ_２）_ｍＣＦ_３であり、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＮである場合にはＮＨ（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ（ＣＦ_２）_ｍＣＦ_３であり、ｎは１または２であり、ｍは１～２０の整数であり；Ｙは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＯＣＨ_３、メトキシエチル、ＣＮ、ＣＦ_３、または、アシル系保護基、エーテル系保護基、シリル系保護基で保護された水酸基であり；Ｚは、Ｈ、アルキル、Ｏ－アルキル、Ｎ－アルキル、ハロゲンであるか、または、前記Ｙとの間でＺ－Ｙ結合を形成し；Ｒ ^７は、（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ _２） _２（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ _２） _ｎ（ＣＦ _２） _ｍＣＦ _３またはシリル系保護基であり、ｎは１または２である。

前記式（ＩＶ）中、Ｂは天然型または修飾ヌクレオシド塩基であり；Ｒ^１は、酸性、塩基性または中性条件下で脱保護可能な保護基であり；Ｒ^３は、リン酸保護基、好ましくはＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ、ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２、ＯＣＨ_３、または、ＣＨ_２（ＣＨ_２）_ｔＲＧであって、ＲがＮＨまたはＳであり、Ｇがアリルまたはアシル基であり、ｔが０～３であり；Ｐｒｏは、無保護、ヌクレオシド塩基の保護基またはＦ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒであって、Ｆ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒは、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＯである場合にはＯ（ＣＨ_２）_ｎ（ＣＦ_２）_ｍＣＦ_３であり、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＮである場合にはＮＨ（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ（ＣＦ_２）_ｍＣＦ_３であり、ｎは１または２であり、ｍは１～２０の整数であり；ＸはＯまたはＳであり；ｌは０～５８の整数であり；Ｒ^７は、（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ_２）_２（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ_２）ｎ（ＣＦ_２）ｍＣＦ_３またはシリル系保護基であり、ｎは１または２であり、ｍは１～２０の整数であり；Ｙは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＯＣＨ_３、メトキシエチル、ＣＮ、ＣＦ_３、または、アシル系保護基、エーテル系保護基、シリル系保護基で保護された水酸基であり；Ｚは、Ｈ、アルキル、Ｏ－アルキル、Ｎ－アルキル、ハロゲンであるか、または、前記Ｙとの間でＺ－Ｙ結合を形成する。Ｚ－Ｙ結合の例は、上記式（Ｉ）で表される化合物と同様である。上記式（ＩＶ）で表されるマルチフルオラスブロックマーは、ＰｒｏまたはＲ^１，Ｒ^３のいずれかにおいて、少なくとも一つのＦ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒを有する。

第５の実施形態は、上記式（ＩＩＩ）で表されるフルオラスブロックマーアミダイトまたは、下記式（ＩＩ´）で表される、５´－末端保護ヌクレオシドＨ－ホスホネートと、下記式（Ｖ）で表される３´－末端にフルオラスアンカーが結合したヌクレオシドとをカップリング反応させる工程を含む、上記式（ＩＶ）で表されるマルチフルオラスブロックマーの合成方法である。下記式（ＩＩ´）および式（Ｖ）中、Ｂは天然型または修飾ヌクレオシド塩基であり；Ｒ^１は、酸性、塩基性または中性条件下で脱保護可能な保護基であり；Ｆ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒは、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＯである場合にはＯ（ＣＨ_２）_ｎ（ＣＦ_２）_ｍＣＦ_３であり、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＮである場合にはＮＨ（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ（ＣＦ_２）_ｍＣＦ_３であり、ｎは１または２であり、ｍは１～２０の整数であり；Ｙは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＯＣＨ_３、メトキシエチル、ＣＮ、ＣＦ_３、または、アシル系保護基、エーテル系保護基、シリル系保護基で保護された水酸基であり；Ｚは、Ｈ、アルキル、Ｏ－アルキル、Ｎ－アルキル、ハロゲンであるか、または、前記Ｙとの間でＺ－Ｙ結合を形成し；Ｒ ^７は、（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ _２） _２（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ _２） _ｎ（ＣＦ _２） _ｍＣＦ _３またはシリル系保護基であり、ｎは１または２である。

上記実施形態における、隣接するヌクレオシドを結合するリン酸の保護基としては、オリゴヌクレオチド合成で汎用されるリン酸保護基を用いることができる。好ましくは、－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ、－ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２、－ＯＣＨ_３、２－クロロフェニル基、フェニル基、または、Ｒ^３と、リン原子に結合する窒素原子に結合するＲ ^４またはＲ ^５の一つとが結合して形成される環であってもよい。上記以外の保護基として、塩基性条件下で脱保護可能な－ＣＨ_２ＣＨ_２Ｅ（Ｅは電子吸引性基）、フッ素含有保護基が挙げられる。

化合物１０（２３０ｍｇ，０．０７６ｍｍｏｌ）にジクロロメタン：アセトニトリル＝４：１溶液（４ｍＬ）を加え、溶解させた後、氷浴に浸し０°Ｃとした。そこへジクロロ酢酸（２００ｍｇ，０．１３ｍＬ，１．５ｍｍｏｌ）を加え、３０分撹拌した。反応の進行を確認した後、この反応混合物をそのままシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。ジクロロメタン：メタノール＝１３：１で溶出された分画を回収し、目的とする脱トリチルされたＴ７量体１１を１８０ｍｇ（０．０６５ｍｍｏｌ）、８６％収率にて得た。

化合物１２（４８０ｍｇ，０．０９３ｍｍｏｌ）にジクロロメタン：アセトニトリル＝４：１溶液（４．５ｍＬ）を加え、溶解させた後、氷浴に浸し０°Ｃとした。そこへジクロロ酢酸（２４０ｍｇ，０．１５ｍＬ，１．９ｍｍｏｌ）を加え、３０分撹拌した。反応の進行を確認した後、この反応混合物をそのままシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。ジクロロメタン：メタノール＝９：１で溶出された分画を回収し、目的とする脱トリチルされたＴ１３量体１３を２４０ｍｇ（０．０５０ｍｍｏｌ）、５２％収率にて得た。得られた化合物が、目的とする１３量体であることは、得られた化合物の一部をアンモニア加水分解に供し、Ｔ１３量体を示す分子イオンピーク［Ｍ－Ｈ^＋］^－３８８９．６７（計算値３８８９．６４）を観測したことにより確認している。

ステップ１１：５´－保護－３´－フルオラスアンカー結合ヌクレオチド１９量体の脱保護

Claims

下記式（Ｉ）で表されるヌクレオシド保護体であって、

前記式（Ｉ）中、Ｂは天然型または修飾ヌクレオシド塩基であり；Ｒ^１、Ｒ^２は、独立して、Ｈまたは、酸性、塩基性または中性条件下で脱保護可能な保護基であり；Ｆ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒは、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＯである場合にはＯ（ＣＨ_２）_ｎ（ＣＦ_２）_ｍＣＦ_３であり、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＮである場合にはＮＨ（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ（ＣＦ_２）_ｍＣＦ_３であり、ｎは１または２であり、ｍは２～２０の整数であり；Ｙは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＯＣＨ_３、メトキシエチル、ＣＮ、ＣＦ_３、または、アシル系保護基、エーテル系保護基、シリル系保護基で保護された水酸基であり；Ｚは、Ｈ、アルキル、Ｏ－アルキル、Ｎ－アルキル、ハロゲンであるか、または、前記Ｙとの間でＺ－Ｙ結合を形成する、ヌクレオシド保護体。
下記式（ＩＩＩ）で表されるフルオラスブロックマーアミダイトであって、

前記式（ＩＩＩ）中、Ｂは天然型または修飾ヌクレオシド塩基であり；Ｒ^１は、酸性、塩基性または中性条件下で脱保護可能な保護基であり；Ｒ^３は、リン酸基の保護基であるか、または、Ｒ^３と、アミダイト部分を形成するリン原子に結合する窒素原子に結合するＲ^５の一つとが結合して形成される環であり；Ｒ^５は、置換または未置換の脂肪族基、置換または未置換の芳香族基であり；Ｐｒｏは、無保護、ヌクレオシド塩基の保護基またはＦ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒであって、Ｆ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒは、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＯである場合にはＯ（ＣＨ_２）_ｎ（ＣＦ_２）_ｍＣＦ_３であり、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＮである場合にはＮＨ（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ（ＣＦ_２）_ｍＣＦ_３であり、ｎは１または２であり、ｍは１～２０の整数であり；Ｘは、ＯまたはＳであり；ｐは０～２７の整数であり；；Ｙは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＯＣＨ_３、メトキシエチル、ＣＮ、ＣＦ_３、または、アシル系保護基、エーテル系保護基、シリル系保護基で保護された水酸基であり；Ｚは、Ｈ、アルキル、Ｏ－アルキル、Ｎ－アルキル、ハロゲンであるか、または、前記Ｙとの間でＺ－Ｙ結合を形成し；ＰｒｏまたはＲ^１，Ｒ^３のいずれかにおいて、少なくとも一つのＦ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒを有する、フルオラスブロックマーアミダイト。
請求項３に記載の上記式（ＩＩＩ）で表されるフルオラスブロックマーアミダイトまたは、下記式（ＩＩ´）で表される、５´－末端保護ヌクレオシドＨ－ホスホネートと、下記式（Ｖ）で表される３´－末端にフルオラスアンカーが結合したヌクレオシドとをカップリング反応させる工程を含む、請求項４に記載の下記式（ＩＶ）で表されるマルチフルオラスブロックマーの合成方法であって、

上記式（ＩＩ´）および式（Ｖ）中、Ｂは天然型または修飾ヌクレオシド塩基であり；Ｒ^１は、酸性、塩基性または中性条件下で脱保護可能な保護基であり；Ｆ－ｐｒｏｔｅｃｔｏｒは、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＯである場合にはＯ（ＣＨ_２）_ｎ（ＣＦ_２）_ｍＣＦ_３であり、ヌクレオシド塩基Ｂの被保護部がＮである場合にはＮＨ（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ（ＣＦ_２）_ｍＣＦ_３であり、ｎは１または２であり、ｍは１～２０の整数であり；Ｙは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＯＣＨ_３、メトキシエチル、ＣＮ、ＣＦ_３、または、アシル系保護基、エーテル系保護基、シリル系保護基で保護された水酸基であり；Ｚは、Ｈ、アルキル、Ｏ－アルキル、Ｎ－アルキル、ハロゲンであるか、または、前記Ｙとの間でＺ－Ｙ結合を形成し；Ｒ^７は、（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ_２）_２（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ_２）ｎ（ＣＦ_２）ｍＣＦ_３またはシリル系保護基であり、ｎは１または２であり、ｍは１～２０の整数である、マルチフルオラスブロックマーの合成方法。