JP5698206B2 - ローダミン標識されたオリゴヌクレオチドを合成するために有用な試薬 - Google Patents
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Description
この出願は、米国特許法§119(e)の下、2006年3月31日に出願された仮出願第60/787,777号(この開示は、その全体が参考として本明細書に援用される)に対する利益を主張する。
蛍光染料の、検出標識としての使用は、分子生物学、細胞生物学、および分子遺伝学において広く行われている。例えば、蛍光標識オリゴヌクレオチドの使用は、現在、種々の異なるアッセイにおいて広く使用されている。そのようなアッセイとして、例えば、ポリヌクレオチド配列決定、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)、核酸アレイにおけるハイブリダイゼーションアッセイ、蛍光偏光実験、および核酸増幅アッセイ、例えば、蛍光プローブおよび/またはプライマーによって行われるポリメラーゼ連鎖増幅アッセイなどのアッセイが挙げられる。
一局面において、本開示は、適切な波長の入射光によって照射されると蛍光を発するローダミン染料を含む標識によって、合成オリゴヌクレオチドを標識するのに有用な試薬を提供する。この標識は、単一のローダミン染料を含むことが可能であるが、あるいは、複数の染料の少なくとも一つがローダミン染料である、染料ネットワークを含むことが可能である。これらの試薬は、オリゴヌクレオチドの段階的合成の際、合成オリゴヌクレオチドを直接ローダミン含有標識によって標識するのに使用することが可能であり、このため、ローダミン染料によって標識されるオリゴヌクレオチドを得るために必要な操作工程が低減される。さらに、標識が、段階合成の際、直接オリゴヌクレオチドに付着されるので、標識オリゴヌクレオチドからの、未結合標識の、HPLC分離−これは、現在行われている、ローダミンNHSエステルなどの、合成後ローダミン標識試薬を用いる場合には必要となる−が不要になる。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
オリゴヌクレオチドを標識するのに有用な試薬であって、N−保護NH−ローダミン部分を含む標識部分を含む、試薬。
(項目2)
リン酸エステル前駆体基をさらに含む、項目1に記載の試薬。
(項目3)
構造式(VII):
(VII) LM−L−PEP
による化合物であって、ここで、LMは、前記標識部分を表し、PEPは、前記リン酸エステル前駆体基を表し、Lは、該リン酸エステル前駆体基に該標識部分を連結する、任意のリンカーを表す化合物である、項目2に記載の試薬。
(項目4)
Lが、−Z−(CH 2 ) 3−6 −O−、−Z−(CH 2 ) a −[(Ar) b −(CH 2 ) a ] c −O−、−Z−(CH 2 ) a −[C≡C−(CH 2 ) a ] c −O−、−Z−(CH 2 ) a −[C≡C−(Ar) b ] c −(CH 2 ) a −O−、−Z−(CH 2 ) d −NH−C(O)−[(CH 2 ) a −(Ar)−(CH 2 ) a −C(O)−NH] c− (CH 2 ) d −O−、および−Z−[CH 2 (CH 2 ) e O] f −CH 2 (CH 2 ) e O−から選ばれ、
ここで、
Zは、他とは独立して、官能基F z によって与えられる連結を表し;
各aは、他とは独立して、0から4の範囲の整数を表し;
各bは、他とは独立して、1から2の範囲の整数を表し;
各cは、他とは独立して、1から5の範囲の整数を表し;
各dは、他とは独立して、1から10の範囲の整数を表し;
各eは、他とは独立して、1から4の範囲の整数を表し;
各fは、他とは独立して、1から10の範囲の整数を表し;かつ、
各Arは、他とは独立して、任意に置換される単環または多環のシクロアルキレン、シクロヘテロアルキネン、アリーレン、またはヘテロアリーレン基を表す、
、項目3に記載の試薬。
(項目5)
各Arが、他とは独立して、シクロヘキサン、ピペラジン、ベンゼン、ナフタレン、フェノール、フラン、ピリジン、ピペリジン、イミダゾール、ピロリジン、またはオキサジゾールから得られる基である、項目4に記載の試薬。
(項目6)
構造式(VII.1):
による化合物であって、
ここで、Bは、適切に保護される核酸塩基を表し、L 2 は、標識部分LMに核酸塩基Bを連結するリンカーを表す化合物である、項目3に記載の試薬。
(項目7)
前記核酸塩基が、アデニン、7−デアザグアニン、グアニン、7−デアザグアニン、シトシン、ウラシル、チミン、イノシン、キサンテン、およびヒポキサンテンから選ばれる、項目6に記載の試薬。
(項目8)
Bが、A iBu 、A Pac 、C Ac 、G iPr−Pac 、T、およびUから選ばれる、項目7に記載の試薬。
(項目9)
L 2 が、−C≡C−CH 2 −NH−、−C≡C−C(O)−、−CH=CH−NH−、−CH=CH−C(O)−、−C≡C−CH 2 −NH−C(O)−(CH 2 ) 1−6 −NH−、−CH=CH−C(O)−NH−(CH 2 ) 1−6 −NH−C(O)−、−C≡CH−CH 2 −O−CH 2 CH 2 −[O−CH 2 CH 2 ] 0−6 −NH−、−C≡C−C≡C−CH 2 −O−CH 2 CH 2 −[O−CH 2 CH 2 ] 0−6 −NH−、−C≡C−(Ar) 1−2 −C≡C−CH 2 −O−CH 2 CH 2 −[O−CH 2 CH 2 ] 0−6 −NH−、−C≡C−(Ar) 1−2 −O−CH 2 CH 2 −[O−CH 2 CH 2 ] 0−6 −NH−、および−C≡C−(Ar) 1−2 −O−CH 2 CH 2 −[O−CH 2 CH 2 ] 0−6 −NH−から選ばれ、ここで、Arは項目4に定義した通りである、、項目6に記載の試薬。
(項目10)
−B−L 2 −が、下記:
から選ばれる、項目6に記載の試薬。
(項目11)
適切に保護される合成ハンドルをさらに含む、項目2に記載の試薬。
(項目12)
構造式(VIII):
(VIII) R e O−L−LM−L−PEP
による化合物であって、ここで、R e は、酸不安定保護基を表し、各Lは、他とは独立して、任意のリンカーを表し、LMは、前記標識部分を表し、かつ、PEPは、前記リン酸エステル前駆体基を表す化合物である、項目11に記載の試薬。
(項目13)
構造式(IX):
による化合物であって、ここで、LMは、前記標識部分を表し、Lはリンカーを表し、R e は、酸不安定保護基を表し、かつ、PEPは、前記リン酸エステル前駆体基を表す化合物である、項目11に記載の試薬。
(項目14)
構造式(IX.1):
による化合物であって、ここで、−Z−は、官能基F z によって与えられる連結の一部を表し、同じであっても、異なっていてもよい、Sp 1 、Sp 2 、およびSp 3 は、それぞれ、スペーサー成分を表し、かつ、Gは、CH、N、または、アリーレン、フェニレン、ヘテロアリーレン、低級シクロアルキレン、シクロヘキシレン、および/または低級シクロヘテロアルキレンを含む基を表す化合物である、項目13に記載の試薬。
(項目15)
Sp 1 、Sp 2 、およびSp 3 が、それぞれ互いに独立に、1から10個の炭素原子を含むアルキレン鎖、−(CH 2 ) a −[(Ar) b −(CH 2 ) a ] c −、−(CH 2 ) a −[C≡C−(CH 2 ) a ] c −、−(CH 2 ) a −[C≡C−(Ar) b ] c −(CH 2 ) a −、−(CH 2 ) d −NH−C(O)−[(CH 2 ) a −(Ar)−(CH 2 ) a −C(O)−NH] c− (CH 2 ) d −、および、−[CH 2 (CH 2 ) e O] f −CH 2 (CH 2 )−から選ばれ、ここで、a、b、c、d、e、f、およびArは、項目4に定義した通りである、項目14に記載の試薬。
(項目16)
構造式(IX.2)、(IX.3)、(IX.4)、または(IX.5):
による化合物であって、ここで、Bは適切に保護される核酸塩基を表し、L 2 は、核酸塩基Bに標識部分LMを連結するリンカーを表し、構造(IX.4)において、R 11 は、保護基を表す化合物である、項目13に記載の試薬。
(項目17)
前記核酸塩基が、アデニン、7−デアザグアニン、グアニン、7−デアザグアニン、シトシン、ウラシル、チミン、イノシン、キサンテン、およびヒポキサンテンから選ばれる、項目16に記載の試薬。
(項目18)
Bが、A iBu 、A Pac 、C Ac 、G iPr−Pac 、T、およびUから選ばれる、項目17に記載の試薬。
(項目19)
L 2 が、−C≡C−CH 2 −NH−、−C≡C−C(O)−、−CH=CH−NH−、−CH=CH−C(O)−、−C≡C−CH 2 −NH−C(O)−(CH 2 ) 1−6 −NH−、−CH=CH−C(O)−NH−(CH 2 ) 1−6 −NH−C(O)−、−C≡CH−CH 2 −O−CH 2 CH 2 −[O−CH 2 CH 2 ] 0−6 −NH−、−C≡C−C≡C−CH 2 −O−CH 2 CH 2 −[O−CH 2 CH 2 ] 0−6 −NH−、−C≡C−(Ar) 1−2 −C≡C−CH 2 −O−CH 2 CH 2 −[O−CH 2 CH 2 ] 0−6 −NH−、−C≡C−(Ar) 1−2 −O−CH 2 CH 2 −[O−CH 2 CH 2 ] 0−6 −NH−、および−C≡C−(Ar) 1−2 −O−CH 2 CH 2 −[O−CH 2 CH 2 ] 0−6 −NH−から選ばれ、ここで、Arは項目4に定義した通りである、項目16に記載の試薬。
(項目20)
−B−L 2 −が、下記:
から選ばれる、項目16に記載の試薬。
(項目21)
前記リン酸エステル前駆体基が、ホスホロアミダイト基およびH−ホスホネート基を含む、項目2−20のいずれか1項に記載の試薬。
(項目22)
前記リン酸エステル前駆体基が、式(P.1):
のホスホロアミダイトを含み、ここで、
R 20 は、1から10個の炭素原子を含む、直鎖、分枝、または環状の、飽和または不飽和のアルキル、2−シアノエチル、6から10個の環炭素原子を含むアリール、および、6から10個の環炭素原子、および1から10個のアルキレン炭素原子を含むアリールアルキルから選ばれ;および、
R 21 およびR 22 は、それぞれ互いに独立に、1から10個の炭素原子を含む、直鎖、分枝、または環状の、飽和または不飽和のアルキル、6から10個の環炭素原子を含むアリール、および、6から10個の環炭素原子、および1から10個のアルキレン炭素原子を含むアリールアルキルから選ばれるか、またはそれとは別に、R 21 およびR 22 は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、5から6個の環原子を含む、飽和または不飽和環を形成し、該環原子のうちの一つまたは二つは、図示された窒素原子に加えて、O、N、およびSから選ばれるヘテロ原子であってもよい、
項目21に記載の試薬。
(項目23)
R 20 が、ベータ−シアノエチルであり、R 21 およびR 22 が、それぞれ、イソプロピルである、項目22に記載の試薬。
(項目24)
固相支持体、および、適切に保護される合成ハンドルをさらに含む、項目1に記載の試薬。
(項目25)
構造式(X):
による化合物であって、ここで、LMは前記標識部分を表し、Lは、任意に選択的に切断可能なリンカーを表し、R e は、酸不安定な保護基を表す化合物である、項目21に記載の試薬。
(項目26)
構造式(XI.1):
による化合物であって、ここで、Z、G、Sp 1 、Sp 2 、およびR e は、先に項目14に定義した通りであり、Sp 4 は、選択的に切断可能なスペーサー成分を表す化合物である、項目25に記載の試薬。
(項目27)
Sp 1 およびSp 2 が、それぞれ互いに独立に、1から10個の炭素原子を含むアルキレン鎖、−(CH 2 ) a −[(Ar) b −(CH 2 ) a ] c −、−(CH 2 ) a −[C≡C−(CH 2 ) a ] c −、−(CH 2 ) a −[C≡C−(Ar) b ] c −(CH 2 ) a −、−(CH 2 ) d −NH−C(O)−[(CH 2 ) a −(Ar)−(CH 2 ) a −C(O)−NH] c− (CH 2 ) d −、および、−[CH 2 (CH 2 ) e O] f −CH 2 (CH 2 )−から選ばれ、ここで、a、b、c、d、e、f、およびArは、項目4に定義した通りであり、かつSp 4 がエステル結合を含む、項目26に記載の試薬。
(項目28)
構造式(X.2)、(X.3)、(X.4)、または(X.5):
による化合物であって、ここで、B、L 2 、およびR 11 が、先に項目16において定義した通りである化合物である、項目25に記載の試薬。
(項目29)
前記核酸塩基が、アデニン、7−デアザグアニン、グアニン、7−デアザグアニン、シトシン、ウラシル、チミン、イノシン、キサンテン、およびヒポキサンテンから選ばれる、項目28に記載の試薬。
(項目30)
Bが、A iBu 、A Pac 、C Ac 、G iPr−Pac 、T、およびUから選ばれる、項目28に記載の試薬。
(項目31)
L 2 が、−C≡C−CH 2 −NH−、−C≡C−C(O)−、−CH=CH−NH−、−CH=CH−C(O)−、−C≡C−CH 2 −NH−C(O)−(CH 2 ) 1−6 −NH−、−CH=CH−C(O)−NH−(CH 2 ) 1−6 −NH−C(O)−、−C≡CH−CH 2 −O−CH 2 CH 2 −[O−CH 2 CH 2 ] 0−6 −NH−、−C≡C−C≡C−CH 2 −O−CH 2 CH 2 −[O−CH 2 CH 2 ] 0−6 −NH−、−C≡C−(Ar) 1−2 −C≡C−CH 2 −O−CH 2 CH 2 −[O−CH 2 CH 2 ] 0−6 −NH−、−C≡C−(Ar) 1−2 −O−CH 2 CH 2 −[O−CH 2 CH 2 ] 0−6 −NH−、および−C≡C−(Ar) 1−2 −O−CH 2 CH 2 −[O−CH 2 CH 2 ] 0−6 −NH−から選ばれ、ここで、Arは項目4に定義した通りである、項目28に記載の試薬。
(項目32)
−B−L 2 −が、下記:
から選ばれる、項目28に記載の試薬。
(項目33)
R e が4’,4’’−ジメトキシトリチルである、項目11−32のいずれか1項に記載の試薬。
(項目34)
前記N−保護NH−ローダミン部分が、構造式(IIIa)、(IIIb)、または(IIIc):
から選ばれる構造を含み、ここで:
R’は、R 3’ および水素から選ばれ;
R’’は、R 6’ および水素から選ばれ;
R 9 は、アシル保護基であり;
R 1’ 、R 2’ 、R 2’’ 、R 4’ 、R 4’’ 、R 5’ 、R 5’’ 、R 7’ 、R 7’’ 、R 8’ 、R 4 、R 5 、R 6 、およびR 7 は、単独で占める場合、それぞれ、互いに独立に、水素、低級アルキル、(C6−C14)アリール、(C7−C20)アリールアルキル、5−14員ヘテロアリール、6−20員ヘテロアリールアルキル、−R b 、および−(CH 2 ) x −R b から選ばれ、ここでxは、1から10の範囲の整数であり、R b は、−X、−OH、−OR a 、−SH、−SR a 、−NH 2 、−NHR a 、−NR c R c 、−N + R c R c R c 、ペルハロ低級アルキル、トリハロメチル、トリフルオロメチル、−B(OH) 3 、−B(OR a ) 3 、−B(OH)O − 、−B(OR a ) 2 O − 、−B(OH)(O − ) 2 、−B(OR a )(O − ) 2 、−P(OH) 2 、−P(OH)O − 、−P(OR a ) 2 、−P(OR a )O − 、−P(O)(OH) 2 、−P(O)(OH)O − 、−P(O)(O − ) 2 、−P(O)(OR a ) 2 、−P(O)(OR a )O − 、−P(O)(OH)(OR a )、−OP(OH) 2 、−OP(OH)O − 、−OP(OR a ) 2 、−OP(OR a )O − 、−OP(O)(OH) 2 、−OP(O)(OH)O − 、−OP(O)(O − ) 2 、−OP(O)(OR a ) 2 、−OP(O)(OR a )O − 、−OP(O)(OR a )(OH)、−S(O) 2 O − 、−S(O) 2 OH、−S(O) 2 R a 、−C(O)H、−C(O)R a 、−C(S)X、−C(O)O − 、−C(O)OH、−C(O)NH 2 、−C(O)NHR a 、−C(O)NR c R c 、−C(S)NH 2 、−C(O)NHR a 、−C(O)NR c R c 、−C(NH)NH 2 、−C(NH)NHR a 、および−C(NH)NR c R c から選ばれ、ここで、Xはハロであり、各R a は、他と独立に、低級アルキル、(C6−C14)アリール、(C7−C20)アリールアルキル、5−14員ヘテロアリール、および6−20員ヘテロアリールアルキルから選ばれ、各R c は、他と独立に、R a であるか、またはそれとは別に、同じ窒素原子に結合する二つのR c は、その窒素原子と一緒になって、5−8員の飽和または未飽和の環であって、通常、O、N、およびSから選ばれる、同じまたは異なる環ヘテロ原子のうちの一つ以上を任意に含んでよい環を形成し、
または、それとは別に、R 1’ およびR 2’ 、またはR 7’ およびR 8’ は、それらが結合する炭素原子と一緒に合わされて、任意に置換される(C6−C14)アリール架橋を形成するか、および/または、R 4’ およびR 4’’ 、および/またはR 5’ およびR 5’’ は、それらが結合する炭素原子と一緒に合わされてベンゾ基を形成し;
R 3’ およびR 6’ は、単独で占める場合、それぞれ、互いに独立に、低級アルキル、(C6−C14)アリール、(C7−C20)アリールアルキル、5−14員ヘテロアリール、および6−20員ヘテロアリールアルキルから選ばれ、または、それとは別に、構造式(IIIa)の化合物におけるR 3’ およびR 2’ 、またはR 4’ および/またはR 6’ 、およびR 5’ またはR 7’ 、構造式(IIIb)の化合物におけるR 3’ およびR 2’ 、またはR 4’ および/またはR 6’ 、およびR 5’ またはR 7’’ 、または、構造式(IIIc)の化合物におけるR 3’ およびR 2’ 、またはR 4’ および/またはR 6’ 、およびR 5’ またはR 7’’ は、その結合する原子と一緒に合わされて、同じか、または異なる低級アルキル、ベンゾ、またはピリド基のうちの一つ以上によって任意に置換される、5−または6−員の、飽和または不飽和環を形成し、
ただし、構造式(IIIa)の化合物におけるR 2’ 、R 4’ 、R 5’ 、R 7’ 、R 5 、またはR 6 のうちの少なくとも一つ、構造式(IIIb)の化合物におけるR 2’ 、R 4’ 、R 5’ 、R 7’’ 、R 5 、またはR 6 のうちの少なくとも一つ、構造式(IIIc)の化合物におけるR 2’’ 、R 4’ 、R 5’ 、R 7’’ 、R 5 、またはR 6 のうちの少なくとも一つが、式−Y−の基を含み、Yは、官能基F y によって与えられる連結の一部を表す、
、項目1−33のいずれか1項に記載の試薬。
(項目35)
前記N−保護NH−ローダミン部分が、構造式(IIIa.1)、(IIIa.2)、(IIIb.1)、(IIIb.2)、(IIIc.1)、および(IIIc.2):
から選ばれる構造を含み、
ここで、R’、R’’、R 1’ 、R 2’ 、R 2’’ 、R 3’ 、R 4’ 、R 4’’ 、R 5’ 、R 5’’ 、R 6’ 、R 7’ 、R 7’’ 、R 8’ 、R 4 、R 5 、R 6 、R 7 、R 9 、およびYは、先に項目34において定義された通りである、項目34に記載の試薬。
(項目36)
前記N−保護NH−ローダミン部分が、下記:
(i)Yは、−C(O)−、−S(O) 2 −、−S−、および−NH−から選ばれ;
(ii) R 4 およびR 7 は、それぞれ、クロロであり;
(iii) R 1’ およびR 8’ は、それぞれ、水素であり;
(iv) R 1’ およびR 2’ 、または、R 7’ およびR 8’ は、一緒に合わされてベンゾ基を形成し;
(v) R 2’ およびR 7’ は、それぞれ、水素または低級アルキルであり;
(vi) R’はR 3’ であり、かつ、R’’はR 6’ であり;
(vii) R’はR 3’ であり、R’’はR 6’ であり、かつ、R 3’ およびR 6’ は、隣接炭素原子における置換基と一緒に合わされて、−CH 2 CH 2 −、−CH 2 CH 2 CH 2 −、−C(CH 3 ) 2 CH=C(CH 3 )−、−C(CH 3 ) 2 CH=CH−、−CH 2 −C(CH 3 ) 2 −、および
から選ばれる基を形成する、
から選ばれる一つ以上の適用可能な特徴を有する、項目34または35に記載の試薬。
(項目37)
R 9 が、式−C(O)R 10 のアリール基であり、ここで、R 10 は、水素、低級アルキル、メチル、−CX 3 、−CHX 2 、−CH 2 X、−CH 2 −OR d 、および、低級アルキル、メチル、−X、−OR d 、シアノ、またはニトロ基によって任意に一置換されるフェニルから選ばれ、ここで、R d は、低級アルキル、フェニル、およびピリジルから選ばれ、各Xは、ハロ基、通常はフルオロ、またはクロロである、項目31−34に記載の試薬。
(項目38)
R 10 が、メチルおよびトリフルオロメチルから選ばれる、項目37に記載の試薬。
(項目39)
前記標識部分が、前記N−保護NH−ローダミン部分に対するドナーおよび/またはアクセプター部分をさらに含む、項目1−38のいずれか1項に記載の試薬。
(項目40)
前記標識部分が、前記N−保護NH−ローダミン部分に対するドナー部分をさらに含む、項目1−38のいずれか1項に記載の試薬。
(項目41)
前記ドナー部分が、N−保護NH−ローダミン部分またはO−保護フルオレセイン部分を含む、項目40に記載の試薬。
(項目42)
前記ドナー部分の2’−、2’’−、4’−、5’−、7’−、7’’−、5−、または6−位置が、前記N−保護NH−ローダミン部分の2’−、2’’−、4’−、5’−、7’−、7’’−、5−、または6−位置に連結される、項目41に記載の試薬。
(項目43)
前記ドナー部分と前記N−保護NH−ローダミン部分が、頭部対頭部方向において連結される、項目42に記載の試薬。
(項目44)
前記ドナー部分と前記N−保護NH−ローダミン部分が、頭部対尾部方向において連結される、項目42に記載の試薬。
(項目45)
前記ドナー部分と前記N−保護NH−ローダミン部分が、尾部対尾部方向において連結される、項目42に記載の試薬。
(項目46)
前記ドナー部分と前記N−保護NH−ローダミン部分が、側部対側部方向において連結される、項目42に記載の試薬。
(項目47)
前記ドナー部分と前記N−保護NH−ローダミン部分が、側部対頭部方向において連結される、項目42に記載の試薬。
(項目48)
前記ドナー部分と前記N−保護NH−ローダミン部分が、側部対尾部方向において連結される、項目42に記載の試薬。
(項目49)
前記標識部分が、構造式(VI):
(VI) A−Z 1 −Sp−Z 2 −D
を含み、ここで、Aは、前記N−保護NH−ローダミン部分を表し、Dは、前記ドナー部分を表し、同じであっても、異なっていてもよいZ 1 およびZ 2 は、官能基F z を含む連結部分によって提供される連結の一部を表し、かつ、Spは、スペーサー成分を表す、項目42に記載の試薬。
(項目50)
Aが、以下の構造式A.1、A.2、A.3、A.4、A.5、およびA.6から選ばれ、Dが、以下の構造式D.1、D.2、D.3、D.4、D.5、およびD.6から選ばれるか、または、Aが、以下の構造式A.7、A.8、A.9、A.10、A.11、およびA.12から選ばれ、Dが、以下の構造式D.7、D.8、D.9、D.10、D.11、およびD.12から選ばれ:
ここで:
E 1 は、−NHR 9 、−NR 3’ R 9 、および−OR 9b から選ばれ;
E 2 は、−NHR 9 、−NR 6’ R 9 、および−OR 9b から選ばれ;
R 9b は、R 9 であり;
Y 1a 、Y 1b 、Y 2a 、Y 2b 、Y 3a 、およびY 3b は、それぞれ互いに独立に、−O−、−S−、−NH−、−C(O)−、および−S(O) 2 −から選ばれ;および、
R’、R’’、R 1’ 、R 2’ 、R 2’’ 、R 3’ 、R 4’ 、R 4’’ 、R 5’ 、R 5’’ 、R 6’ 、R 7’ 、R 7’’ 、R 8’ 、R 4 、R 5 、R 6 、R 7 、およびR 9 は、先に項目34において定義した通りであり、ただし、E 1 およびE 2 が−OR 9b である場合、R 1’ およびR 2’ 、および/またはR 7’ およびR 8’ は、それらが結合する炭素原子のみと一緒に合わされて、任意に置換される(C6−C14)アリール架橋を形成する、
、項目49に記載の試薬。
(項目51)
構造式A.1−A.12および/またはD.1−D.12が、下記の特徴:
(i)Y 1a 、Y 2a 、およびY 3a は、それぞれ互いに独立に、−C(O)−および−S(O) 2 −から選ばれ;
(ii)Y 1b 、Y 2b 、およびY 3b は、−NHであり;
(iii)R 4 およびR 7 は、それぞれクロロであり;
(iv) R 1’ およびR 8’ は、それぞれ水素であり;
(v) R 1’ およびR 2’ 、またはR 7’ およびR 8’ は、一緒に合わされてベンゾ基を形成し;
(vi)R 2’ およびR 7’ は、それぞれ、水素または低級アルキルであり;
(vii)R’はR 3’ であり、R’’はR 6’ であり;および、
(viii)R’はR 3’ であり、R’’はR 6’ であり、かつ、R 3’ およびR 6’ は、隣接炭素原子における置換基と一緒に合わされて、−CH 2 CH 2 −、−CH 2 CH 2 CH 2 −、−C(CH 3 ) 2 CH=C(CH 3 )−、−C(CH 3 ) 2 CH=CH−、−CH 2 −C(CH 3 ) 2 −、および
から選ばれる基を形成する、
から選ばれる、一つ以上の適用可能な特徴を有する、項目50に記載の試薬。
(項目52)
Y 1a 、Y 2a 、およびY 3a は−NHであり;Y 1b 、Y 2b 、およびY 3b は、−C(O)−および−S(O) 2 −から選ばれ;Z 1 は−C(O)−および−S(O) 2 −から選ばれ;Z 2 は−NH−であり、かつ、Spは、−(CH 2 ) a −[(Ar) b −(CH 2 ) a ] c −、−(CH 2 ) a −[C≡C−(CH 2 ) a ] c −、−(CH 2 ) a −[C≡C−(Ar) b ] c −(CH 2 ) a −、−(CH 2 ) d −NH−C(O)−[(CH 2 ) a −(Ar)−(CH 2 ) a −C(O)−NH] c− (CH 2 ) d −、および−[CH 2 (CH 2 ) e O] f −CH 2 (CH 2 )−から選ばれ、ここで、a、b、c、d、e、f、およびArは、先に項目4に定義した通りである、項目50に記載の試薬。
(項目53)
構造式D.1−D.12において、R 1’ およびR 2’ および/またはR 7’ およびR 8’ が、それらの結合する炭素原子と一緒に合わされてベンゾ基を形成する、項目50−52に記載の試薬。
(項目54)
E 1 およびE 2 が、それぞれ、−OR 9b である、項目50−53に記載の試薬。
(項目55)
R 9b は、R 10b が低級アルキルである、式−C(O)R 10b のアリール基である、項目54に記載の試薬。
(項目56)
R 10b がt−ブチルである、項目55に記載の試薬。
(項目57)
R 9 が、式−C(O)R 10 のアリール基であり、ここで、R 10 は、水素、低級アルキル、メチル、−CX 3 、−CHX 2 、−CH 2 X、−CH 2 −OR d 、および、低級アルキル、メチル、−X、−OR d 、シアノ、またはニトロ基によって任意に一置換されるフェニルから選ばれ、ここで、R d は、低級アルキル、フェニル、およびピリジルから選ばれ、各Xは、ハロ基、通常はフルオロ、またはクロロである、項目50−56に記載の試薬。
(項目58)
R 10 が、メチルおよびトリフルオロメチルから選ばれる、項目57に記載の試薬。
(項目59)
N−保護NH−ローダミン部分を含む標識部分を含むオリゴヌクレオチド。
(項目60)
前記N−保護NH−ローダミン部分が、項目31−58のいずれか1項に記載の構造を含む、項目59に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目61)
前記標識部分が、前記オリゴヌクレオチドの3’−、または5’−ヒドロキシルに連結される、項目59に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目62)
前記標識部分が、前記オリゴヌクレオチドの核酸塩基に連結される、項目59に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目63)
前記オリゴヌクレオチドが、固相支持体に結合される、項目59に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目64)
前記オリゴヌクレオチドが、前記N−保護NH−ローダミン部分のドナーおよび/またはアクセプター部分によってさらに標識される、項目59に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目65)
前記オリゴヌクレオチドが、クエンチャー部分によってさらに標識される、項目59に記載のヌクレオチド。
(項目66)
前記オリゴヌクレオチドが、小溝結合部分によってさらに標識される、項目59に記載のオリゴヌクレオチド。
前述の一般的説明、および後述の詳細な説明は、共に、例示と説明のためのみのものであって、本明細書に記載される組成物および方法を限定することを意図するものではないことを理解しなければならない。本開示において、「または」の使用は、別様に言明しない限り、「および/または」を意味する。同様に、「複数対象を含む」、「単数対象を含む」、「含む」、「単数対象を包含する」、「複数対象を包含する」、および「包含する」という用言は、限定的であることを意図するものではない。
本明細書で用いる場合、下記の用語および語句は、下記の意味を持つことが意図される。
本開示は、ローダミン染料を含む標識部分を担持するオリゴヌクレオチドを化学的に合成するために使用することが可能な試薬を提供する。従来、一部は、オリゴヌクレオチドの段階的化学合成において一般的に用いられる合成および/または脱保護条件に対して安定なローダミン含有合成試薬の入手の難しさのために、ローダミン標識オリゴヌクレオチドを化学的に合成することが困難であった。現在、アセチル基などの塩基不安定な保護基でNH−ローダミン染料の環外アミン基を保護することによって、オリゴヌクレオチドの固相合成に一般的に用いられる化学的合成および脱保護条件に対して安定なN−保護NH−ローダミン染料が得られることが発見された。その結果、ローダミン染料を含む標識部分で標識したオリゴヌクレオチドを合成するために使用される試薬の中に、N−保護NH−ローダミンを組み込むことが可能となり、そのため、標識を合成後に付着させる必要が回避される。標識は合成時に付着されるので、得られる標識オリゴヌクレオチドは、HPLCを使用することなく使用に備えて精製することが可能である。
本明細書に記載される試薬を構成する、各種の基および成分は、通常、リンカーによって互いに接続される。いずれのものであれ、ある特定のリンカーとして何を選ぶかは、一部は、互いに連結される成分の内容に依存する。一般に、リンカーは、標識オリゴヌクレオチドの合成のために用いられる合成条件、例えば、亜リン酸トリエステル法によってオリゴヌクレオチドを合成するために一般的に用いられる条件に対して安定なものである限り、原子または官能基同士の、事実上任意の組み合わせを含むことが可能な、スペーサ成分を含み、その構造は直線状、分枝状、または環状であってもよく、あるいは、直線、分枝、および/または環状構造の組み合わせを含んでもよい。このスペーサー成分は、モノマー性であってもよいし、あるいは、ポリマー性の領域であっても、ポリマー性領域を含んでもよい。スペーサー成分は、特定の性質、例えば、特定条件下に分断される能力、または、特定の、剛性度、屈曲度、疎水度、および/または親水度を持つように設計されてもよい。
**アジ化アシルは再編成されてイソシアネートとなることが可能である。
本明細書に記載される試薬は全て、環外アミン基において、特異的性質を有する保護基によって保護されるNH−ローダミン染料を含む標識部分を含む。一般に、ローダミン染料は、四つの主要な特性によって特徴づけられる。すなわち、(1)親キサンテン環;(2)環外アミン置換基;(3)環外イミニウム置換基;および(4)オルト位置においてカルボキシル基によって置換されるフェニル基である。環外アミンおよび/またはイミニウム基は、通常、親キサンテン環のC3およびC6炭素原子に配置される。もっとも、親キサンテン環が、C3およびC4炭素、および/またはC5およびC6炭素に融合するベンゾ基を含む「拡張型」ローダミンも知られている。これらの拡張型ローダミンでは、特徴的環外アミンおよびイミニウム基は、拡張型キサンテン環の対応位置に配置される。
R’は、R3’および水素から選ばれ;
R’’は、R6’および水素から選ばれ;
R9は、任意に式−C(O)R10のアシル保護基であり、式中R10は上に定義した通りであり;
R1’、R2’、R2’’、R4’、R4’’、R5’、R5’’、R7’、R7’’、およびR8’は、単独で占める場合、それぞれ、互いに独立に、水素、低級アルキル、(C6−C14)アリール、(C7−C20)アリールアルキル、5−14員ヘテロアリール、6−20員ヘテロアリールアルキル、−Rb、および−(CH2)x−Rbから選ばれ、ここでxおよびRbは上に定義した通りであり、または、それとは別に、R1’およびR2’、またはR7’およびR8’は、それらが結合する炭素原子と一緒に合わされて、ベンゾ基を形成するか、および/または、R4’およびR4’’、および/またはR5’およびR5’’は、それらが結合する炭素原子と一緒に合わされてベンゾ基を形成し;
R3’およびR6’は、単独で占める場合、それぞれ、互いに独立に、低級アルキル、(C6−C14)アリール、(C7−C20)アリールアルキル、5−14員ヘテロアリール、および6−20員ヘテロアリールアルキルから選ばれ、または、それとは別に、構造式(IIIa)の化合物におけるR3’およびR2’、またはR4’および/またはR6’、およびR5’またはR7’、構造式(IIIb)の化合物におけるR3’およびR2’、またはR4’および/またはR6’、およびR5’またはR7’’、または、構造式(IIIc)の化合物におけるR3’およびR2’’、またはR4’および/またはR6’、およびR5’またはR7’’は、その結合する原子と一緒に合わされて、1から4個のヘテロ原子(通常、O、N、およびSから選ばれる)を任意に含んでもよく、かつ、同じか、または異なる低級アルキル、ベンゾ、またはピリド基のうちの一つ以上によって任意に置換される、5−または6−員の、飽和または不飽和環を形成し;および、
R4、R5、R6、およびR7は、それぞれ、互いに独立に、水素、低級アルキル、(C6−C14)アリール、(C7−C20)アリールアルキル、6−14員ヘテロアリール、7−20員ヘテロアリールアルキル、−Rb、および−(CH2)x−Rbから選ばれ、ここでxおよびRbは上に定義した通りであり、
ただし、構造式(IIIa)の化合物におけるR2’、R4’、R5’、R7’、R5、またはR6のうちの少なくとも一つ、構造式(IIIb)の化合物におけるR2’、R4’、R5’、R7’’、R5、またはR6のうちの少なくとも一つ、構造式(IIIc)の化合物におけるR2’’、R4’、R5’、R7’’、R5、またはR6のうちの少なくとも一つが、式−Y−の基を含み、Yは、前述の官能基Fyを含む連結基によって与えられる結合の一部を表す。
R’およびR’’がそれぞれエチルであり;
R1’、R4’、R5’、およびR6’がそれぞれ水素であり;
R2’、およびR7’がそれぞれメチルであり、
R4、およびR7がそれぞれクロロであり、
R5、またはR6の内の一方が水素で、他方が−C(O)−である
ローダミンを排除する。
(i)Yは、−C(O)−、−S(O)2−、−S−、および−NH−から選ばれ;
(ii) R4およびR7は、それぞれ、クロロであり;
(iii) R1’およびR8’は、それぞれ、水素であり;
(iv) R1’およびR2’、または、R7’およびR8’は、一緒に合わされてベンゾ基を形成し;
(v) R2’およびR7’は、それぞれ、水素または低級アルキルであり;
(vi) R’はR3’であり、かつ、R’’はR6’であり;
(vii) R’はR3’であり、R’’はR6’であり、かつ、R3’およびR6’は、隣接炭素原子における置換基と一緒に合わされて、−CH2CH2−、−CH2CH2CH2−、−C(CH3)2CH=C(CH3)−、−C(CH3)2CH=CH−、−CH2−C(CH3)2−、および
オリゴヌクレオチドを合成するために用いられる条件、例えば、亜リン酸トリエステル法による、オリゴヌクレオチド合成および酸化に用いられる条件に対しては安定であるが、合成オリゴヌクレオチドの脱保護および/または、合成樹脂からの合成オリゴヌクレオチドの切り離しのために通常用いられる条件、例えば、室温または55℃での濃縮水酸化アンモニウムにおけるインキュベーションに対しては不安定である。
される成分間の、最短の連続経路を定義する化学結合の長さの合計を計算することによって定量される、連結される成分間の距離を指す)のリンカーを介して連結するのが有利であることが以前に見出されている。いずれの動作理論によっても、それに拘束されることを意図するものではないが、ドナーとアクセプターを、その発色団を互いに接触させることなく互いにごく近傍に保持する傾向を持つリンカーは、優れて効率的なエネルギー転移を実現すると考えられる。この点で、リンカーの剛性および長さは結合パラメータである。一般に、短いリンカーほど(例えば、約5から12Aの長さを持つリンカー)、程度の
高い剛性を含まなければならない。長いリンカーほど(例えば、約15から30Aの範囲
の長さを持つリンカー)、程度の低い剛性を含むことが可能であり、場合によっては剛性を含まないことも可能である。短い、無剛性(柔軟性)リンカーは避けなければならない。
(L.1) −Z−(CH2)a−[(Ar)b−(CH2)a]c−Z−;
(L.2) −Z−(CH2)a−[C≡C−(CH2)a]c−Z−;
(L.3) −Z−(CH2)a−[C≡C−(Ar)b]c−(CH2)a−Z−;
(L.4) −Z−(CH2)a−NH−C(O)−[(CH2)a−(Ar)−(CH2)a−C(O)−NH]c−(CH2)a−Z−;および、
(L.5)−Z−[CH2(CH2)eO]−CH2(CH2)eO−。
(VI) A−Z1−Sp−Z2−D
ここで、Aは、N−保護NH−ローダミンアクセプターを表し、Dは、ドナー、例えば、N−保護NH−ローダミン、またはO−保護フルオレセインドナーを表し、Z1およびZ2は、前述したように、官能基Fzを含む連結部分によって提供される結合部分を表し、Spは、前述したようにスペーサー成分を表す。ある特定実施態様では、Aは、下記に示す、構造式A.1、A.2、A.3、A.4、A.5、およびA.6から選ばれ、Dは、構造式D.1、D.2、D.3、D.4、D.5、およびD.6から選ばれる。ある特定実施態様では、Aは、下記に示す、構造式A.7、A.8、A.9、A.10、A.11、およびA.12から選ばれ、Dは、構造式D.7、D.8、D.9、D.10、D.11、およびD.12から選ばれる。
E1は、−NHR9、−NR3’R9、および−OR9bから選ばれ;
E2は、−NHR9、−NR6’R9、および−OR9bから選ばれ;
R9bは、R9であり;
Y1a、Y1b、Y2a、Y2b、Y3a、およびY3bは、それぞれ互いに独立に、−O−、−S−、−NH−、−C(O)−、および−S(O)2−から選ばれ;および、
R’、R’’、R1’、R2’、R2’’、R3’、R4’、R4’’、R5’、R5’’、R6’、R7’、R7’’、R8’、R4、R5、R6、およびR7は、構造式(IIIa)、(IIIb)、および(IIIc)に関して以前に定義した通りであり、ただし、E1およびE2が−OR9bである場合、R1’およびR2’、およびR7’およびR8’は、同時にベンゾおよび/またはピリド基を含む。
(Sp.1) −(CH2)a−[(Ar)b−(CH2)a]c−;
(Sp.2) −(CH2)a−[C≡C−(CH2)a]c−;
(Sp.3) −(CH2)a−[C≡C−(Ar)b]c−(CH2)a−;
(Sp.4) −(CH2)a−NH−C(O)−[(CH2)a−(Ar)−(CH2)a−C(O)−NH]c−(CH2)a−;および、
(Sp.5) −[CH2(CH2)eO]f−CH2(CH2)−、ここで、a、b、c、d、e、f、およびArは、以前に定義した通りである。
本明細書に記載される試薬の、多くの実施態様が、リン酸エステル前駆体基(“PEP”)を含む。標識オリゴヌクレオチドを合成するために段階的合成を用いる場合、PEPは、新生の合成オリゴヌクレオチドの5’−ヒドロキシル基であってもよい、利用可能な任意のヒドロキシル基に結合され、最終的に、任意の必要な酸化および/または脱保護工程の後、合成オリゴヌクレオチドに標識部分を連結する結合に貢献する。形成される結合は、従来技術で知られるように、リン酸エステル結合か、または、修飾されたリン酸エステル結合である。
R20は、1から10個の炭素原子を含む、直鎖、分枝、または環状の、飽和または不飽和のアルキル、2−シアノエチル、6から10個の環炭素原子を含むアリール、および、6から10個の環炭素原子、および1から10個のアルキレン炭素原子を含むアリールアルキルから選ばれ;および、
R21およびR22は、それぞれ互いに独立に、1から10個の炭素原子を含む、直鎖、分枝、または環状の、飽和または不飽和のアルキル、6から10個の環炭素原子を含むアリール、および、6から10個の環炭素原子、および1から10個のアルキレン炭素原子を含むアリールアルキルから選ばれるか、またはそれとは別に、R21およびR22は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、5から6個の環原子を含む、飽和または不飽和環を形成する。該環原子のうちの一つまたは二つは、図示された窒素原子に加えて、O、N、およびSから選ばれるヘテロ原子であってもよい。
本明細書に記載される試薬の多くの実施態様は、適切な脱保護後、要すれば、合成標識オリゴヌクレオチドに対し追加の基または成分を付着させるために使用することが可能な部位を提供する、一つ以上の合成ハンドルを含む。これらの基は、標識オリゴヌクレオチド合成の進行時に合成ハンドルに付着させることが可能であるし、あるいはそれとは別に、合成ハンドルが、合成後、脱保護されて、追加の基または成分の付着が可能とされる官能基を顕すようにすることが可能である。例えば、合成ハンドルは、標識オリゴヌクレオチドの合成を実行するのに用いられる条件に対しては安定な保護基によって保護される、一次アミン基を含むことも可能である。合成後、合成オリゴヌクレオチド上の、他の各種保護基の除去と同時に、またはそれとは別に、この保護基を除去することによって、それに対して追加の基および/または成分を付着させることが可能な一次アミノ基が得られる。
本明細書に記載される試薬の多くの実施態様は、他の成分および/または基が付着する固相支持体を含む。この固相支持体は、通常、他の成分の付着のために好適な連結基を担うリンカーが付着する、アミノまたはヒドロキシル基などの官能基によって活性化される。
本明細書に記載される合成試薬のある実施態様は、下記の構造式(VII)によって記述される:
(VII) LM−L−PEP
ここで、LMは、本明細書に記載される標識部分を表し、Lは、本明細書に記載される任意のリンカーを表し、PEPは、本明細書に記載されるリン酸エステル前駆体基を表す。この試薬は、さらに別の基または成分、例えば、合成ハンドルを含むことが可能である。ある実施態様では、合成試薬は、標識部分およびPEP基を含み、別の成分または基を含まない。このような合成試薬は、オリゴヌクレオチドの段階的合成時、ヒドロキシル基に結合させることが可能であり、何よりも、合成オリゴヌクレオチドの末端ヒドロキシル基、通常は5’−ヒドロキシルであるが、に、標識部分を付着させるのに有用である。
LMは、上に特異的に明らかにした標識部分実施態様のうちの一つであり;
Lは、−Z−(CH2)3−6−O−、−Z−(CH2)a−[(Ar)b−(CH2)a]c−O−、−Z−(CH2)a−[C≡C−(CH2)a]c−O−、−Z−(CH2)a−[C≡C−(Ar)b]c−(CH2)a−O−、−Z−(CH2)d−NH−C(O)−[(CH2)a−(Ar)−(CH2)a−C(O)−NH]c−(CH2)d−O−、−Z−[CH2(CH2)eO]f−CH2(CH2)eO−、および、Z2がOである、図2に示すリンカーの一つから選ばれ;および、
PEPは、ホスホロアミダイト基、例えば、前述の構造式P.1のホスホロアミダイト基である。ある実施態様では、リンカーLにおけるZは−NH−である。
本明細書に記載される合成試薬は、追加の基および/または成分の付着のために有用な、一つ以上の合成ハンドルを任意に含んでもよい。前述のように、Reが酸不安定な保護基を表す、式−OReの合成ハンドルを含む合成試薬は、追加のヌクレオチドが付着することが可能な、一次ヒドロキシル基を与える。その結果、この合成ハンドルを含む合成試薬は、5’−ヒドロキシル、3’−ヒドロキシル、または、一つ以上の内部位置において、合成オリゴヌクレオチドを標識するために使用することが可能である。これら合成試薬はさらに、互いに結合することも、または、他のホスホロアミダイト標識試薬に結合することも可能であり、そのため複数の標識部分を含むオリゴヌクレオチドの合成が可能となる。
(VIII) ReO−L−LM−L−PEP
ここで、Lは、他方に対して独立に、任意のリンカーを表し、LMは、標識部分を表し、かつ、PEPは、リン酸エステル前駆体基を表す。好適な保護基Re、リンカーL、標識部分LM、およびリン酸エステル前駆体基の非限定的例としては、上に具体的に例示したものが挙げられる。
本明細書に記載される試薬の多くの実施態様は、固相支持体を含む。このような試薬は、一般に、固相支持体、本明細書に記載の標識部分、および合成ハンドルを含むが、さらに追加の基または成分、例えば、追加の標識部分、クエンチャー(quencher)部分、特に、オリゴヌクレオチド二重体を安定化するために有用な合成ハンドルおよび/または基、例えば、塩基ペア間に介在する仲介因子(介在因子)、および、二重小溝に結合する因子(小溝結合、またはMGB介在因子)を含んでもよい。固相支持体、標識部分、合成ハンドル、および任意に追加される成分は、それぞれの機能を実行する能力を妨げない限り、どのような方式、方向性で相互に連結させてもよい。
本開示を通じて記載される、各種成分、基、およびリンカーの特定実施態様は、本明細書に記載される試薬の全てに含めることが可能であることを理解しなければならない。さらに、各種の特異的実施態様は、互いに、任意の組み合わせで、あたかもその特異的組み合わせが具体的に明示されるかのように組み合わせることが可能である。特異的例として、本明細書に記載される標識部分LMの特異的実施態様の内の任意の一つを、本明細書に記載される、非ヌクレオシド性およびヌクレオシド性固相支持体および合成試薬の、特異的に例示される実施態様のいずれかの中に含めることが可能である。もう一つの特異的例として、リン酸エステル前駆体基PEPの特異的実施態様の内の任意の一つ、例えば、上記の構造式(P.1)のホスホロアミダイト基を、本明細書に記載される合成試薬の内の任意の一つの中に含めることが可能である。
本明細書に記載される各種試薬は、直接合成樹脂の上で、ローダミン染料によって標識されるオリゴヌクレオチドを合成するための、オリゴヌクレオチドの段階的合成において使用することが可能である。したがって、これら各種試薬は、合成後の手間のかかる修飾を要することなく、無数の異なるローダミンによってオリゴヌクレオチドを合成的に標識する能力を利用可能とする。NHローダミン染料によって標識されたオリゴヌクレオチドを合成するための、例示の合成試薬の使用が、図9に示される。
N−保護NH−ローダミンホスホロアミダイト合成試薬の合成
C5−、またはC6−位置にカルボキシル置換基を含む、親NH−ローダミン染料を、米国特許第4,622,400号、米国特許第5,750,409号、米国特許第5,847,162号、米国特許第6,017,712号、米国特許第6,080,852号、米国特許第6,184,379号、または米国特許第6,248,884号に記載されるように合成した。次に、この親NH−ローダミン染料を、環外アミンにおいて、アセチル、またはトリフルオロアセチ保護基によって保護し、得られたN−保護NH−ローダミン染料を、対応するNHSエステル誘導体を介してヒドロキシル−アミド誘導体に変換し、このヒドロキシル官能基を、標準手順を用いて、ホスホロアミダイトに変換した。全体的スキームを下記に示す。
mg,2.904 mmol)の溶液に、DCC (599 mg,2.904 mmol)を加えた。この反応混合物を室温で2時間攪拌し、次いで、反応混合物をろ過した。ろ液を、DCM(80 mL)で希釈し、H2O(50 mL x 2)で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、ろ過し、蒸発した。残渣をシリカ(溶出液として、AcOH/MeOH/EtOAc/DCMの、1:1:20:78から1:5:20:74の勾配を使用)によるフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。適切な分画を分留したところ、680 mg(100%)の、ビスアセチルN−保護NH−ローダミンNHSエステル10が得られた。
ヘテロダイマー染料ネットワークの合成
N−保護NH−ローダミンに連結したO−保護フルオレセインを含む染料ネットワークを、下記に示すようにして合成した:
ヘテロダイマー染料ネットワークホスホロアミダイトの合成
標識部分としてヘテロダイマー染料ネットワークを含むホスホロアミダイト合成試薬は、下記に示すように合成された:
mmol)、DIPEA(1.028 mL)、および無水ピバル酸(0.702 mL)の混合物を、室温で1日攪拌した。H2O(40 mL)を加え、攪拌を1時間続けた。この反応混合物をDCM(50 mL)で希釈し、H2Oで洗浄した。水層をDCM(40 mL)で抽出した。合わせた有機層を乾燥し(Na2SO4)、ろ過し、蒸発した。残渣をシリカ(溶出液として、MeOH /DCMの、3%から15%の勾配を使用)によるフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。適切な分画を分留したところ、0.145 mmol(84%)の、ビス−アセチルビス−ピバロイルヘテロダイマー染料誘導体21(DIPEA塩として)が得られた。
(3:20:77,3 mL)の溶液で希釈し、シリカゲルクロマトグラフィー(溶出液として、TEA:MeOH:EtOAc:DCMの、3:0:20:77から3:5:20:72の勾配を使用)によって精製した。適切な分画を分留し、DCM/ヘキサンによって沈殿させたところ、75 mg(74%)のヘテロダイマー染料ホスホロアミダイト25が得られた。
任意の合成ハンドルを含む、非ヌクレオシド性ホスホロアミダイト合成試薬の合成
式−OReの、任意の合成ハンドルを含む、非ヌクレオシド性ホスホロアミダイト合成試薬を、下記に示すように合成した:
標識オリゴヌクレオチドの固相合成
N−保護NH−ローダミンホスホロアミダイト合成試薬によって標識されたオリゴヌクレオチドを、AB3900自動式DNA合成機において標準動作条件を用いポリスチレン固相支持体の上で合成した。N−保護NH−ローダミンホスホロアミダイトは、結合反応用のアセトニトリル溶媒に対して可溶であり、N−保護NH−ローダミン染料アダクトは、繰り返しの合成サイクルに対して安定であった。合成サイクルは、ヌクレオチド間リン酸結合を生成するために、ジクロロ酢酸によるDMTの除去、ヌクレオシドホスホロアミダイトモノマーの添加、無水酢酸によるキャップ形成、および、ヨウ素による酸化を用いた。さらに、このクラスのNH−ローダミンは、合成された標識オリゴヌクレオチドを脱保護し、それを固相支持体から切り離すために用いられる条件(水酸化アンモニウムによる60℃、12時間の処理)にたいしても安定であることが判明した。この標識オリゴヌクレオチドを合成するために用いられた全体スキームを下記に示す:
この合成試薬によって合成された標識オリゴヌクレオチドは、優れた分光特性を示す
NH−ローダミン、またはNH−ローダミン−フルオレセイン染料ペアによって標識されたポリ(dT)10オリゴヌクレオチドを、上に示すようにして合成した。切り離し後、蛍光スペクトラムを記録した。合成した標識オリゴは全て、優れた蛍光特性を示した。
Claims (13)
- NH−ローダミン−フルオレセインエネルギー転移染料ペアで標識されたオリゴヌクレオチドであって、以下:
(a)該オリゴヌクレオチドの5’ヒドロキシルに非ヌクレオチド性試薬をカップリングさせて、NH−ローダミン標識されたオリゴヌクレオチドを得る工程であって、該試薬は、以下の構造式(IX.1):
のものであり、ここで、
LMは、標識部分を表し;
Reは、酸に不安定な保護基を表し;
PEPは、ホスホロアミダイト基、2−クロロフェニルリン酸基、2,5−ジクロロフェニルリン酸基またはH−ホスホネート基であるリン酸エステル前駆体基を表し;
−Z−は、官能基Fzによって寄与される結合の一部を表し、ここで、Fzは相補的官能基Fyと反応することが可能であり、そして、FyまたはFzの一方が求核基を含み、FyおよびFzの他方が求電子基を含み;
Sp1、Sp2およびSp3は、同じであっても異なっていてもよく、それぞれ互いに独立して、1〜10個の炭素原子を含むアルキレン鎖または−[CH2(CH2)eO]f−CH2(CH2)−を表し、ここで、各eは、それぞれ独立して1〜4の範囲の整数を表し、そして、各fは、それぞれ独立して1〜10の範囲の整数を表し;
Gは、CHまたはNを表し;そして
該標識部分は、N−保護NH−ローダミン部分を含み、ここで、該N−保護NH−ローダミン部分は、以下の構造式(IIIa)、(IIIb)および(IIIc):
から選択される構造を含み、ここで:
R’は、R3’および水素から選択され;
R”は、R6’および水素から選択され;
R9は、アシル保護基であり;
R1’、R2’、R2”、R4’、R4”、R5’、R5”、R7’、R7”、R8’、R4、R5、R6およびR7は、単独で占める場合、それぞれ互いに独立して、水素、低級アルキル、(C6−C14)アリール、(C7−C20)アリールアルキル、5員〜14員のヘテロアリール、6員〜20員のヘテロアリールアルキル、−Rbおよび−(CH2)x−Rbから選択され、ここで、低級アルキルとは(C1−C8)アルキルを意味し、xは1〜10の範囲の整数であり、Rbは、−X、−OH、−ORa、−SH、−SRa、−NH2、−NHRa、−NRcRc、−N+RcRcRc、ペルハロ低級アルキル、トリハロメチル、トリフルオロメチル、−B(OH)3、−B(ORa)3、−B(OH)O−、−B(ORa)2O−、−B(OH)(O−)2、−B(ORa)(O−)2、−P(OH)2、−P(OH)O−、−P(ORa)2、−P(ORa)O−、−P(O)(OH)2、−P(O)(OH)O−、−P(O)(O−)2、−P(O)(ORa)2、−P(O)(ORa)O−、−P(O)(OH)(ORa)、−OP(OH)2、−OP(OH)O−、−OP(ORa)2、−OP(ORa)O−、−OP(O)(OH)2、−OP(O)(OH)O−、−OP(O)(O−)2、−OP(O)(ORa)2、−OP(O)(ORa)O−、−OP(O)(ORa)(OH)、−S(O)2O−、−S(O)2OH、−S(O)2Ra、−C(O)H、−C(O)Ra、−C(S)X、−C(O)O−、−C(O)OH、−C(O)NH2、−C(O)NHRa、−C(O)NRcRc、−C(S)NH2、−C(O)NHRa、−C(O)NRcRc、−C(NH)NH2、−C(NH)NHRaおよび−C(NH)NRcRcから選択され、ここで、Xはハロであり、各Raは互いに独立して、低級アルキル、(C6−C14)アリール、(C7−C20)アリールアルキル、5員〜14員のヘテロアリールおよび6員〜20員のヘテロアリールアルキルから選択され、そして、各Rcは互いに独立してRaであるか、あるいは、同じ窒素原子に結合した2つのRcはその窒素原子と一緒になって5員〜8員の飽和または不飽和環を形成し得、該環は任意に、通常O、NおよびSから選択される同じかまたは異なる環ヘテロ原子を1つ以上含み得るか、あるいは、
R1’とR2’またはR7’とR8’が、それらが結合する炭素原子と一緒になって、任意に置換される(C6−C14)アリール架橋を形成し;および/または、R4’とR4”および/またはR5’とR5”が、それらが結合する炭素原子と一緒になって、ベンゾ基を形成し;そして、
R3’およびR6’は、単独で占める場合、それぞれ互いに独立して、低級アルキル、(C6−C14)アリール、(C7−C20)アリールアルキル、5員〜14員のヘテロアリールおよび6員〜20員のヘテロアリールアルキルから選択されるか、あるいは、
構造式(IIIa)の化合物におけるR3’とR2’もしくはR4’、および/または、R6’とR5’もしくはR7’、構造式(IIIb)の化合物におけるR3’とR2’もしくはR4’、および/または、R6’とR5’もしくはR7”、または、構造式(IIIc)の化合物におけるR3’とR2”もしくはR4’、および/または、R6’とR5’もしくはR7”が、それらが結合する原子と一緒になって、1つ以上の同じかまたは異なる低級アルキル、ベンゾもしくはピリド基で任意に置換される5員または6員の飽和または不飽和環を形成し、
但し、構造式(IIIa)の化合物におけるR2’、R4’、R5’、R7’、R5またはR6のうち1つ、構造式(IIIb)の化合物におけるR2’、R4’、R5’、R7”、R5またはR6のうち1つ、または、構造式(IIIc)の化合物におけるR2”、R4’、R5’、R7”、R5またはR6のうち1つは、式−Y−の基であり、ここで、Yは、官能基Fyによって寄与される共有結合の一部を表し、ここで、Fyは相補的官能基Fzと反応して共有結合を形成することが可能であり、そして、FyまたはFzの一方が求核基を含み、FyおよびFzの他方が求電子基を含む、工程;
(b)該酸に不安定な保護基Reを該NH−ローダミン標識されたオリゴヌクレオチドから除去する工程;
(c)O−保護フルオレセインホスホロアミダイトとカップリングさせて、標識され、支持体に結合したオリゴヌクレオチドを得る工程;ならびに
(d)該標識され、支持体に結合したオリゴヌクレオチドを脱保護および切断して、NH−ローダミン−フルオレセインエネルギー転移染料ペアで標識されたオリゴヌクレオチドを得る工程
を包含する段階的な様式で、支持体に結合したオリゴヌクレオチドを該染料ペアの各メンバーで標識することによって得られる、標識されたオリゴヌクレオチド。 - 前記構造式(IX.1)の試薬におけるリン酸エステル前駆体基が、ホスホロアミダイト基またはH−ホスホネート基である、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記構造式(IX.1)の試薬におけるリン酸エステル前駆体基が、以下の式(P.1):
のホスホロアミダイトであり、ここで:
R20は、1〜10個の炭素原子を含む、直鎖、分枝または環状の、飽和または不飽和アルキル、2−シアノエチル、6〜10個の環炭素原子を含むアリール、および、6〜10個の環炭素原子および1〜10個のアルキレン炭素原子を含むアリールアルキルから選択され;かつ
R21およびR22は、それぞれ互いに独立して、1〜10個の炭素原子を含む、直鎖、分枝または環状の、飽和または不飽和アルキル、6〜10個の環炭素原子を含むアリール、および、6〜10個の環炭素原子および1〜10個のアルキレン炭素原子を含むアリールアルキルから選択されるか、あるいは、
R21およびR22は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、5〜6個の環原子を含む、飽和または不飽和環を形成し、該環原子のうちの1つまたは2つは、示された窒素原子に加えて、O、N、およびSから選択されるヘテロ原子であってもよい、請求項2に記載のオリゴヌクレオチド。 - R20がβ−シアノエチルであり、かつ、R21およびR22がそれぞれイソプロピルである、請求項3に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記構造式(IX.1)の試薬におけるReが、4’,4”−ジメトキシトリチルである、請求項1〜4のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記N−保護NH−ローダミン部分が、以下の(i)〜(vii):
(i)Yが、−C(O)−、−S(O)2−、−S−および−NH−から選択される;
(ii)R4およびR7がそれぞれクロロである;
(iii)R1’およびR8’がそれぞれ水素である;
(iv)R1’とR2’またはR7’とR8’が一緒になってベンゾ基を形成する;
(v)R2’およびR7’がそれぞれ水素または低級アルキルである;
(vi)R’がR3’であり、かつ、R”がR6’である;および
(vii)R’がR3’であり、R”がR6’であり、かつ、R3’とR6’が、隣接炭素原子における置換基と一緒になって、−CH2CH2−、−CH2CH2CH2−、−C(CH3)2CH=C(CH3)−、−C(CH3)2CH=CH−、−CH2−C(CH3)2−および
から選択される基を形成する;
から選択される1つ以上の適用可能な特徴を有する、請求項1〜6のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。 - R9が、式−C(O)R10であり、ここで、R10は、水素、低級アルキル、−CX3、−CHX2、−CH2X、−CH2−ORd、および、低級アルキル、−X、−ORd、シアノもしくはニトロ基で任意に一置換されるフェニルから選択され、ここで、Rdは、低級アルキル、フェニルおよびピリジルから選択され、そして、各Xはハロ基である、請求項1〜7のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
- Xはフルオロまたはクロロである、請求項8に記載のオリゴヌクレオチド。
- R10がメチルまたはトリフルオロメチルである、請求項8または9に記載のオリゴヌクレオチド。
- R10がメチルで置換されるフェニルである、請求項8に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記O−保護フルオレセインホスホロアミダイト試薬が、O−保護FAMホスホロアミダイト試薬である、請求項1〜11のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
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