JP2002540788A - プロセシング酵素を用いるポリヌクレオチド合成 - Google Patents

プロセシング酵素を用いるポリヌクレオチド合成

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JP2002540788A JP2000609564A JP2000609564A JP2002540788A JP 2002540788 A JP2002540788 A JP 2002540788A JP 2000609564 A JP2000609564 A JP 2000609564A JP 2000609564 A JP2000609564 A JP 2000609564A JP 2002540788 A JP2002540788 A JP 2002540788A
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Abstract

(57)【要約】 ポリヌクレオチドの合成方法であって、下記の工程：（ｉ）ポリヌクレオチドプロセシング酵素(例えば、ポリメラーゼやＴｄＴ)をヌクレオチド基質と酵素活性に適した条件で反応せしめ、（ii）酵素の配座を調節して(例えば、放射を用いて)、予め測定したヌクレオチドの取り込みを可能にすることを含む方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 現在、合成ポリヌクレオチドに対する需要は大きく、大部分は、ポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）またはポリヌクレオチド配列決定のストラテジーにおいて、
プライマーとして使用される既知の配列のオリゴヌクレオチドに対する必要性に
よる。最近、この需要はポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアレイの出現
により、一層増加している。これらのアレイは、固体支持体（チップ）上に接合
しており、試験されるべき試料とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプロー
ブかまたは標識されたオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズし得る試料
を持つ（Lysov, Dovl. Akad. Nauk SSSR(1988)303:1508-1511;Banis et al, J.T
hero. Biol.,135:303-307;Dramnac et al, Genomics,4:114-128）。そのため、
このハイブリダイゼーションパターンは、標的ポリヌクレオチド配列を再構築す
るために使用される。この技術は、光発生（発光）オリゴヌクレオチドアレイの
使用によってさらに利用されやすくなっている（Fador et al, Proc. Natl. Sci
. USA(1994)91: 5022-5026）。
【０００２】 全ての現行技術は、生成し得る合成ポリヌクレオチドの長さおよび低収率に関
する一連の問題において制限を受けている。また、それらは、非常に多くの操作
を用いるので達成するためにかなりの期間がかかる。
【０００３】 そのため、合成されるポリヌクレオチドの最高鎖長を顕著に増加させ、そのよ
うなポリヌクレオチドが合成される割合を増加させるポリヌクレオチドの合成に
関する改良された方法の必要性が存在する。そのような方法をオートメーション
化により実施し、現存の方法に付随する煩雑さとコストを低下させるのが望まれ
る。
【０００４】 （発明の要旨） 本発明は、ポリヌクレオチドプロセシング酵素内での配座変化をつくるために
電磁波放射の使用を実現したことに基づく。この酵素に適用する放射を制御して
、つくられるポリヌクレオチド鎖の配列を予め決定できる。このことは、正常な
インビボポリヌクレオチド集合過程を操作して、リアルタイムで「合成」ポリヌ
クレオチドの産生を可能にする。
【０００５】 本発明によるポリヌクレオチド合成方法は下記の工程を含む。 （ｉ）ポリヌクレオチドプロセシング酵素をヌクレオチド基質と適当な条件で反
応せしめ、 （ii）酵素の三次元配座に影響を与えるように、酵素を制御された環境(放射を
含む)にさらし、次いでつくられたポリヌクレオチドの配列を決定する／に影響
を及ぼす。
【０００６】 （発明の説明） プロセシング酵素の配座を制御するのに放射を使用する場合、多数の技法を用
いて試料に放射を適用できる。これには、一過性波分光法、特に表面プラスモン
共鳴(ＳＰＲ)分光法がある。
【０００７】 レーザー法(放射の刺激放出による光増幅)によるプロセシング酵素に対する放
射の使用は、その装置によりつくられる放射の単色性および制御性からして、特
に本発明に適用できる。
【０００８】 プロセシング酵素の配座構造の制御は、その作用を発揮する環境を制御するこ
とによりなし得る。反応媒体のｐＨおよび塩含量／濃度などの条件の変化が三次
元構造に作用し、従って酵素系の活性に影響を及ぼすことが知られている(Wong
et al. Biochemistry (1991) 30: 526-537)。
【０００９】 特定のヌクレオチドの付加およびその後の合成反応は、特定のヌクレオチドの
付加に特異的な配座変化をなすプロセシング酵素の能力を、与えられた放射の形
態に従って、直接的につくることにより、完了できる。これは、プロセシング分
子(またはそれに関連する分子)が、放射を配座変化に移行または導入し得る化学
的／部分的／ペプチド基を含有するように、分子を操作(当分野の遺伝子操作法
による)することによりなし得る。これらの化学的／部分的基は、大きくなるポ
リヌクレオチド鎖に付加されるヌクレオチドについて選択されるように、位置し
得る。従って、この方法は、「リアルタイム」で進行し、高速のポリヌクレオチ
ド合成をなすことができる。
【００１０】 ポリヌクレオチドの合成についての本発明方法は、上記のように、ポリヌクレ
オチドプロセシング酵素が位置する環境の制御、およびその後の該酵素の三次元
配座の制御を含む。この三次元配座は順に、大きくなるポリヌクレオチド鎖に基
質ヌクレオチドが付加されたか、および/またはどの基質ヌクレオチドが付加さ
れたかを選択する。
【００１１】 本明細書で使用する用語「ポリヌクレオチド」は、広く解されるべきであり、
修飾されたＤＮＡおよびＲＮＡを含むＤＮＡおよびＲＮＡ、さらに他のハイブリ
ダイズ核酸様分子、例えば、ペプチド核酸(ＰＮＡ)を含む。
【００１２】 本明細書で使用する用語「ポリヌクレオチドプロセシング／重合化酵素」は、
広く解されるべきであり、ポリヌクレオチドをつくるために１つのヌクレオチド
を他のヌクレオチドに付加し得るユビキチン性タンパク質に関する。この群には
、勿論、すべてのポリメラーゼ、ＤＮＡ-およびＲＮＡ-依存性ポリメラーゼの両
方、さらに末端デオキシヌクレオチド・トランスフェラーゼなどの酵素群を含む
(Kato et al. J. Biol. Chem. (1967) 242: 2780; Frohman et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, (1988) 85: 8998)。
【００１３】 ポリヌクレオチドの合成を制御するためにポリヌクレオチドプロセシング酵素
を使用することは、本方法の成功のためにいくつかの利点を提供する。第１に、
固相合成における反応収量についての問題が有機分子の高能率的な触媒性により
回避される。第２に、合成速度およびポリヌクレオチド鎖伸張が現在使用されて
いるものよりも何十倍の規模で大きい。これもその本来の環境における酵素系の
必要条件に由来する。
【００１４】 本発明の別の重要な態様は、多数のポリヌクレオチドプロセシング酵素がその
本来の環境／形態においてポリヌクレオチド合成を開始するために、存在するポ
リヌクレオチド・テンプレートを必要とするが、本発明では必ずしもそうでない
ことである。ヌクレオチド(クリック-ワトソン)塩基の対形成の効果およびその
後の相補的鎖構築の効果は、プロセシング酵素の三次元配座(および結果の速度
論的パラメーター)に最終的には依存するので、重合されたヌクレオチドの配列
を外部から制御するために、この系を破壊し利用できる。したがって、本発明の
ポリメラーゼの使用の具体的な例において、つくられた「合成」ポリヌクレオチ
ド鎖は、テンプレート・ポリヌクレオチド鎖の相補的複写でないことがある(多
くの場合、複写でない)。活性部位変異によるポリメラーゼ機能の破壊は当分野
で知られているが(Freemort et al. Proteins (1986) 1: 66-73)、重要なのは、
破壊が配座的／空間的に調節されていない。このような破壊／変異は、本発明に
とって、ジデオキシヌクレオチドを差別しないようにポリメラーゼの自然への忠
実性を低下さす形態を取ることがある。このことにより、変異のポリメラーゼが
溶液中のいかなるヌクレオチドをも、大きくなるポリヌクレオチド鎖中に、ポリ
ヌクレオチド・テンプレートのヌクレオチド配列に独立的に、挿入し得る。分子
クローニングに固着された結合部位修飾の本質(すなわち、外部的リアルタイム
配座調節)は既知であり、ポリメラーゼ活性部位に向けられる。例えば、大腸菌
ポリメラーゼＩのＰｈｅ７６２は基質ヌクレオチドと直接的に相互作用するアミ
ノ酸の一つである(Joyce et al. Ann. Rev. Biochem. (1994) 63: 777-822; Ast
ake et al. J. Niol. Chem. (1995) 270: 1945-54)。このアミノ酸をＴｒｙに転
換すると、ジデオキシヌクレオチドを差別しない変異ＤＮＡポリメラーゼとなる
。参照、ＵＳ-Ａ-５６１４３６５および同じくＵＳ出願０８／５２５０８７、１
９９５年９月８日出願、名称：変異ＤＮＡポリメラーゼおよびその使用(出典明
示により本明細書の一部とする)。
【００１５】 以来、誤りの割合を下げ、ポリメラーゼを解明するために、これらの改変の特
徴が調べられ、核酸合成におけるヌクレオチドの誤まった挿入の減少および/ま
たは重合化の信頼性の増大がなされた。参照、ＷＯ-Ａ-９９／１０３６６(出典
明示により本明細書の一部とする)。この出願は、ポリメラーゼのヌクレオチド
結合ドメイン(例えば、Ｏ-ヘリックス)の改変または変異による高い信頼性のポ
リメラーゼをつくる方法に関する。
【００１６】 本発明の重要な態様は、光子および/または光子由来エネルギーとの相互作用
により調節され得る構造／配座を有するタンパク質／ペプチド／化学基／部分の
使用である。このような基は、限定でないが、光子エネルギーを変換する生物分
子、合成染料化合物、エネルギー吸収化学基を含む。本発明の好ましい実施態様
は、ポリメラーゼ活性部位(例えば、Ｏ-ヘリックス)配座およびポリメラーゼ活
性を調節する生物的光子変換物質の使用を含む。この生物的変換物質の群は、限
定でないが、光収集(ＬＨ)複合体／分子および系関与光合成(例えば、ＬＨ１や
ＬＨ２などの細菌性複合体、参照、Papiz et al. Trends Plant Sci. (1996) 1:
198-206)、直接的光子駆動光子ポンプ複合体／サブユニット(例えば、Halobact
erium salinarium の紫膜由来のバクテリオロドプシン(ＢＲ)、参照、Oka et al
. Biophy. J. (1999) 76: 1018-1023)、知覚色素(例えば、網膜性および関連タ
ンパク質複合体)、天然蛍光タンパク質および工学処理誘導体(例えば、緑色蛍光
タンパク質(ＧＦＰ)；Heim et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91: 12
501-12504)を含む。
【００１７】 全体の機能に影響し、本発明において制御された配座の調節のために標的とな
るポリメラーゼ分子の活性部位は、限定でないが、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの
Ｏ-ヘリックス、Ｋ-ヘリックス、Ｏ-Ｐ間ループまたは他のポリメラーゼにおけ
る類似の位置を含む。参照、ＷＯ-Ａ-９８／４０４９６。
【００１８】 ２以上のペプチド／タンパク質の配列および構造を遺伝子学的に「融合する」
方法は、既知であり、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)の場合に広く用いられて、融
合変異体すなわち「シャメレオン」タンパク質を構築し、Ｃａ２＋などの特異的
基質の蛍光標識をつくり、スペクトル応答を調節する(Heim et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1994) 91: 12501-12504; Heim et al. (1997) 388: 882-887)
。
【００１９】 好ましい実施態様において、Ｔ７ポリメラーゼのＯ-ヘリックスをＧＦＰの蛍
光変異体に融合せしめる。これにより、融合タンパク質においてヌクレオチド基
質の親和性を、異なる波長の光との遭遇および選択のＧＦＰ変異の亜型に応じて
調節できる。
【００２０】 別の好ましい実施態様において、光子変換タンパク質およびポリメラーゼを別
個にクローン化し、橋かけ反応に関与し得る反応性側鎖を各タンパク質構造中に
所望の位置で部位選択的に導入する(例えば、ポリメラーゼ中のＯ-ヘリックス)
。
【００２１】 反応性基をタンパク質に接着せしめるために多くの方策を使用できる。この方
策には、限定でないが、部位指向変異形成法および非天然型アミノ酸変異形成法
(Anthony-Cahil et al. (1989) Trends Biochem. Sci. 14: 400)があり、システ
インが導入されて、ケトンが生じる橋かけの部位として働く。２つの反応性基を
含有する橋かけ試薬を用いて、選択した側基を共有結合で連結せしめる(Hauglan
d, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Edition, M
olecular Probes, p94-106)。このような橋かけ反応の例は、チオ(システインか
ら誘導)-チオール橋かけ、アミン-アミン橋かけ、アミン-チオール橋かけ、アミ
ン-カルボン酸橋かけ、アミン-炭水化物橋かけ、チオール-炭水化物橋かけを含
む。
【００２２】 すでに概記したように、いくつかの環境において、既存ポリヌクレオチド鎖の
存在は、テンプレート指向合成を行うために必要でないことがある。例えば、現
行の組換え遺伝子操作法で「設計する」ためにクローン化されている広く改変さ
れたポリメラーゼを使用することが可能である。すでに述べたように、これらの
ポリメラーゼの配座は外的制御(好ましくは放射源)下であり得、酵素のヌクレオ
チド基質の特異性を外的に操作して、大きくなるポリヌクレオチドの重合化配列
を特異的に決定する。さらに、ある群のポリヌクレオチド合成酵素は、合成のた
め出発のポリヌクレオチド・テンプレートを、その「本来の」環境においてすら
も必要としない。このような群は、酵素の末端デオキシヌクレオチド・トランス
フェラーゼ群である。末端デオキシヌクレオチド・トランスフェラーゼ(ＴｄＴ)
は、デオキシヌクレオシド・トリホスフェート由来のモノヌクレオチドをＤＮＡ
イニシエーターの末端３'-ヒドロキシに、無機ホスフェートを放出して、繰り返
し付加することの触媒となる。この酵素は、少なくとも３つのホスフェート基お
よびイニシエーターとして働く３'-ＯＨを含有するオリゴデスオキシヌクレオチ
ドを必要とする。
【００２３】 従って、本発明の別の実施態様において、固体支持体から伸張した遊離の３'-
ＯＨがＴｄＴについてのイニシエーターとして働き、処理された酵素が、酵素に
適用された放射の制御下に基質ヌクレオチドの付加によりポリヌクレオチドをつ
くる。この系のさらに簡単であるが遅い実施態様において、基質として利用可能
のいかなるヌクレオチドを重合するために酵素をつくることができ、もって溶液
中に存在するヌクレオチドを制御して、合成されたポリヌクレオチドの配列を決
定する。
【００２４】 他の実施態様において、ＴｄＴまたはポリメラーゼ(またはいかなる他のポリ
ヌクレオチド・ポリメラーゼ)を固体支持体に結合せしめ、ヌクレオチドおよび/
または放射を、結合時に酵素に利用され得るようにつくる。この実施態様によっ
て、放射および/または基質の適用を局在化し、新しいポリヌクレオチド鎖を溶
液中に大きくする。この立体配置は追加の利点を有する。すなわち、所望のポリ
ヌクレオチドが一旦合成されると、ヌクレオチドは結合酵素から放出され、過程
が再び始まる(すなわち、これは再生過程である)。
【００２５】 本発明の好ましい別の実施態様は、空間でのポリヌクレオチドプロセシング／
ポリメラーゼ酵素系の局在化を含む。この局在化は、限定でないが、固体支持体
上での固定化形態を取りうる。空間でのポリメラーゼの局在化はこの方法が成功
するためのいくつかの重要な利点を提供する。第１に、適用された放射／制御さ
れた環境の望ましくない弱化に関する問題が減少する。空間におけるポリメラー
ゼの正確な局在化がわかり、局在の環境調節(例えば、レーザーパルス)によって
容易に選択的に制御できるからである。第２に、ポリメラーゼに直接的に関連し
ない局所環境／基質(例えば、ヌクレオチド)と酵素系との望ましくない／非制御
の相互作用(またはランダムエネルギー弱化)が非常に低下する。これが特に関係
するのは、本発明の範囲内で想起されるように、放射(例えば、光子の)を用いて
ポリメラーゼの配座形態を制御／弱化するときである。
【００２６】 固定化は当分野で既知の標準的な方法を用いて実施できる。特に、標準的アミ
ンカプリング法による固定化を、リガンド結合アミンのデキストランまたはヒド
ロキシスクシニミドエステル活性化表面などへの接着で使用できる。本発明の好
ましい実施態様において、ポリメラーゼの固定化は、屈折率の変化を測定し得る
ＳＰＲセンサーチップ表面上に行う。生物分子を光センサーに固定するのに用い
る方法の例は、ＥＰ-Ａ-０５８９８６７および Loefas et al. Biosens. Bioele
ctron. (1995) 10: 813-822 に開示されている。
【００２７】 空間内の局所化も使用でき、これは本発明のさらなる実施態様であり、レーザ
ー・ピンセットまたは光トラップ系(Sheetz, Ed., Laser Tweezers in Cell Bio
logy, vol.55 of Methods in Cell Biology (Academic Press, New York, 1997)
)の使用による。光ピンセットは光が事物の上に力を及ぼすとの事実を利用する
。均一ビードや細菌細胞などの誘電粒子を、顕微鏡対物を通して収束されている
レーザー光線の中心部のあたりに接着および捕捉する。適用の力が捕捉中心から
捕捉ビードを、力に対する移動の直線的依存性でもって移動せしめる。ポリメラ
ーゼなどの生物分子を、本発明の実施態様において、ポリスチレンまたはシリカ
のビードに結合せしめ得る。これらのビードは直径が通常１μｍ以下である。次
いで、この捕捉を用いて、固定化ポリメラーゼを反応流細胞内で所望の実験設計
／制御環境中に導く。
【００２８】 本発明で使用するポリヌクレオチド重合化酵素は、いかなる既知の型でもあり
得る。例えば、ポリメラーゼは、Ｔ７遺伝子５ポリメラーゼやＴａｑポリメラー
ゼなどのいかなるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼでもあり得る。標的ポリヌク
レオチドがＲＮＡ分子であると、ポリメラーゼはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラー
ゼすなわち逆転写酵素、またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼすなわちＲＮＡ
レプリカーゼであり得る。ＴｄＴが好ましい。
【００２９】 核磁気共鳴(ＮＭＲ)分光法(Bradley et al. J. Mol. Bio. (1990) 215: 607-6
22)および電子常磁性共鳴(ＥＰＲ)分光法(Todd et al. Biochemistry (1991) 30
: 5515-5523)はさらなる好ましい方法であって、ポリヌクレオチド重合化酵素を
特殊な型の放射にかけて、配座的制御による特異的ヌクレオチド付加をする。同
時に構造／配座のデータのフィードバックができる。この技法を用いて、酵素分
子の応答を測定することも可能である。ＮＭＲ分光法では、化合物の磁性を測定
する。化合物の核を適用の磁場と放射周波数放射との併用によりエネルギー的に
方向つける。核に及ぶエネルギーがスピン状態間のエネルギー相違(適用場の方
向に同方向平行または逆平行間の相違)に等しいとき、共鳴として知られている
状態が起きる。あるスピン状態から別のスピン状態への変化に関連するエネルギ
ーの吸収および続く放出を放射周波数受容器で検出する。
【００３０】 本発明の他の実施態様において、出発の３'-ＯＨをビードに接着する。例えば
、ビオチンの一端をビオチニル化し、ストレプタビジン被覆ポリスチレン球体に
接着し(Chu et al. Optical Society of America, Washington, DC, (1990), 8:
202)、フロー細胞中の光トラップに保持する(Ashkin et al, Opt. Lett. (1986
) 11: 288)。ポリヌクレオチドプロセシング酵素が(外部制御の下)新しいポリヌ
クレオチドを合成するので、この新しいポリヌクレオチドは、光トラップ(光ピ
ンセットとしても知られる)経由で空間に移動されて、プロセシング酵素を検出
の場に保持する。この系は逆にも働き、結合ポリヌクレオチドプロセシング酵素
が光トラップに保持される。
【００３１】 下記実施例は本発明を説明する。 実施例 下記の分析を改変 BIAcore(商標)2000システム(BIAcore AB, Uppsala, Sweden
)および光センサー／制御／反応表面としてのセンサーチップＣＭ５(Research g
rade, BIAcore AB)で実施した。機器は統合μ-流状カートリッジ(ＩＦＣ)を備え
、１回の試料注入により４細胞における分析ができる。
【００３２】 システイン標識バクテリオロドプシンの製造 バクテリオロドプシン(ＢＲ)は、Halobacterium salinarium の紫膜における
光駆動性プロトンポンプである。ＢＳの光サイクルはレチン発色団による光子の
吸収で始まる。部位特異的変異Ｉｌｅ２２２-＞Ｃｙｓ(システイン変異)の導入(
Erlanson et al. Thtrahedron (1997) 53: 12041)を、ｂｏｐ遺伝子に行った。
バクテリオロドプシンの最近の構造モデルによると(Lanyi et al. Science (199
9) 286: 255-260)、Ｉｌｅ２２２はヘリックスＧの細胞質末端に位置している。
Ｘ線研究(Lanyi et al. Science (1999) 286: 255-260)および重原子標識法(Lan
yl et al. Biophys. J. (1999) 76: 1018-1023)は、光子吸収に関連するヘリッ
クスＧ内での主要な構造的／配座的変化を示している。変化されたｂｏｐ遺伝子
は、それを非統合ベクター中に、選択マーカーとしてノボビオシン耐性を用い、
挿入することにより構築した。Halobacterium salinarium を、Ni et al. Gene
(1990) 90: 169-172 & Needleman et al. J. Biol. Chem. (1991) 266: 11478-1
1484 に記載のように形質転換した。変異タンパク質を紫膜(ＰＭ)シートとして
Halobacterium salinarium から精製した。これは、Oesterhelt および Stoecke
nius., Methods Enzymol. (1974) 31: 667-678 記載の標準法による。
【００３３】 システイン標識Ｔ７ポリメラーゼの製造 Ｔ７ポリメラーゼコード配列を含有する発現ベクターを構築した。部位特異的
変異の導入(Erlanson et al. Thtrahedron (1997) 53: 12041)を、Ｏヘリックス
コード領域にＡｒｇ５１８-＞Ｃｙｓ５１８で行った。細胞ペレットをフレンチ
プレスで溶解し、酵素の精製を、Ｎｉ-ニトリロトリ酢酸親和性クロマトグラフ
ィー、次いでカチオン交換クロマトグラフィー(スルフォプロピル-セファロース
急流)、最後にサイズ排除クロマトグラフィーで行った。
【００３４】 チオール-チオール架橋反応 １０μＭの変異Ｔ７および１０μＭのバクテリオロドプシンを、２ｍＭβ-メ
ルカプトエタノール(架橋反応の特異性を増すために加えた)を含有するＨｅｐｅ
ｓ緩衝液(１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０.０５％界面活性剤
Ｐ２０(BIAcore AB, Uppsala, Sweden)、ｐＨ７.４)に加えた。２５℃で２時間
インキュベートした後、架橋反応をチオールキャッピング剤、メチルメタンチオ
ールスルホネート(２０ｍＭ)を加えて停止し、産物をＳＤＳポリアクリルアミド
・ゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)により非還元条件で確認した。次いでバクテ
リオロドプシン-ポリメラーゼ複合体をアニオン交換クロマトグラフィーのＭｏ
ｎｏ-Ｑで精製し、Ｈｅｐｅｓ緩衝液中に再懸濁した(複合体、８ｍｇ／ｍｌ)。
【００３５】 バクテリオロドプシン-ポリメラーゼ複合体の固定化 バクテリオロドプシン-ポリメラーゼのセンサーチップへの固定を、Joensson
et al, Biotechniques (1991) 11: 620-627 に従って実施した。簡単にいうと、
センサーチップ環境をＨｅｐｅｓ緩衝液(１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの
ＮａＣｌ、０.０５％界面活性剤Ｐ２０(BIAcore AB, Uppsala, Sweden)で平衡に
した。同量のＮ-ヒドロキシスクシニミド(０.１Ｍ水）およびＮ-エチル-Ｎ'-(ジ
メチルアミノプロピル)カルボジイミド(ＥＤＣ)(０.１Ｍ水)を混合し、チップ(
ＣＭ５)表面に注入して、カルボキシメチル化デキストランを活性にした。バク
テリオロドプシン-ポリメラーゼ複合体を１０ｍＭの酢酸ナトリウム(１００μｌ
、ｐＨ５)と混合し、活性表面に注入した。最後に、センサーチップ表面上の残
留Ｎ-ヒドロキシスクシニミドエステルをエタノールアミン(３５μｌ、１Ｍ水、
ｐＨ８.５)と反応させ、非結合のバクテリオロドプシン-ポリメラーゼを表面か
ら洗い出した。Ｈｅｐｅｓ緩衝液を温度２５℃で継続して流し(５μｌ／分)、固
定化を完了した。
【００３６】 オリゴヌクレオチド ＷＯ-Ａ-９９／０５３１５に配列番号１および配列番号２として定義されてい
る非活性標的およびプライマーのオリゴヌクレオチドを使用した。２つのポリヌ
クレオチドをハイブリダイズ条件で反応せしめて標的−プライマー複合体を得た
。
【００３７】 ついでプライム化ＤＮＡを、６０ｍＭのカルボニルジホスフェート(複合体の
完全性を保持するため)および８０ｍＭのチオレドキシンを含有する緩衝液(２０
ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ７.５、８ｍＭのＭｇＣｌ２、４％(Ｖ／Ｖ)グリセ
ロール、５ｍＭジチオトレイトール(ＤＤＴ)、４０ｍｇウシ血清アルブミン)中
に懸濁し、センサーチップ表面に注入し、バクテリオロドプシン／ポリメラーゼ
／チオレドキシン／ＤＮＡ複合体の形成によってバクテリオロドプシン-ポリメ
ラーゼ複合体に結合せしめた。
【００３８】 ＤＮＡ合成 この工程の実施に、ＷＯ-Ａ-９９／０５３１５に記載の方法を用いた。その図
１に記載の装置で、単光色を細胞に送り込むための１つの焦点アッセンブリ(５)
のみを用いた。
【００３９】 新たに合成したポリヌクレオチドである第１所望ヌクレオチドを液状細胞(６)
に流速３０μｌ／分および温度２５℃で導入し、集積のデータを１０Ｈｚで記録
した。ヌクレオチドが焦点アッセンブリ(５)を通過するので、単色光を波長バン
ド３００−６００ｎｍに調律し(固体ジオード調律レーザーにより)、ＳＰＲ信号
を監視する。ＳＰＲにより配座ヌクレオチドの付加が生じたことがわかると、適
用のレーザー・パレスを保持する。次いで、Ｈｅｐｅｓ緩衝液のみをチップ表面
に１０分間、流速３０μｌ／分で導入し、未反応のヌクレオチドを除去する。続
いて、次の所望のヌクレオチドを加え、ポリヌクレオチドの所望の長さについて
サイクルを繰り返す。
【００４０】 あるいは、すべてのヌクレオチドを流細胞中に一気に流速３０μｌ／分で導入
し、所望のヌクレオチドが所望の配列に加えられるように、付帯単色レーザー光
を波長範囲３００−６００で弱める。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ダニエル・ヘンリー・デンシャム イギリス、ティキュー９・６ビーエック ス、デボン、ニアー・トトネス、ブロード ヘンプストン、ビーストン・クロス、ジ・ オールド・ミル Ｆターム(参考） 4B064 AF27 CA21 CA32 CB27 DA01 DA13 DA20

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ポリヌクレオチドの合成方法であって、下記の工程： （ｉ）ポリヌクレオチドプロセシング酵素をヌクレオチド基質と酵素活性に適し
    た条件で反応せしめ、 （ii）酵素の配座を調節して、予め測定したヌクレオチドの取り込みを可能にす
    ること、 を含む方法。
  2. 【請求項２】 配座が表面プラスモン共鳴により調節される、請求項１の方
    法。
  3. 【請求項３】 配座がレーザーにより調節される、請求項１の方法。
  4. 【請求項４】 配座が適用された放射により調節される、請求項１−３の方
    法。
  5. 【請求項５】 酵素が適用された放射の場内に固着される、請求項４の方法
    。
  6. 【請求項６】 酵素が固体支持体上に固定される、請求項１−５の方法。
  7. 【請求項７】 酵素がポリメラーゼである、請求項１−６の方法。
  8. 【請求項８】 酵素が末端デオキシヌクレオチド・トランスフェラーゼであ
    る、請求項１−６の方法。
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