FR3047251A1 - Installation pour la mise en œuvre d'un procede de synthese enzymatique d'acides nucleiques - Google Patents

Abstract

Installation d'un procédé de synthèse enzymatique d'acides nucléiques de grande longueur comprenant : i) un dispositif de synthèse comportant - au moins une chambre d'élongation (1) formée d'un réacteur unique renfermant au moins un support fixe d'accrochage de fragments d'acides nucléiques en cours d'élongation comprenant une multiplicité de sites réactionnels d'élongation, - des sources d'alimentation (33) en réactifs connectées à la chambre d'élongation, - des moyens d'évacuation (26) des excédents ou déchets de ladite chambre d'élongation, - des moyens de modification des conditions de fonctionnement du dispositif de synthèse, tels que des moyens de régulation de la température, ladite chambre d'élongation (1) étant configurée pour réaliser au moins un cycle d'élongation desdits fragments d'acides nucléiques comprenant au moins une étape d'addition enzymatique des nucléotides se déroulant en milieu aqueux, ii) un système informatique central incluant au moins une interface de contrôle et un logiciel pilote, apte à piloter les conditions de fonctionnement dudit dispositif de synthèse et le déroulement de la synthèse.

Description

La présente invention concerne une installation pour la mise en oeuvre d’un procédé de synthèse enzymatique d’acides nucléiques, en particulier d’acides nucléiques de grande longueur, notamment une installation pouvant être pilotée par ordinateur.

DOMAINE DE L’INVENTION

La majorité des techniques d’analyse de biologie moléculaire faisant intervenir de l’acide nucléique (ADN ou ARN), ou encore la modification génétique d’êtres vivants, quelles qu’en soit les fins, impliquent l’utilisation de fragments d’ADN ou d’ARN synthétiques. Ces fragments dont le type, simple brin ou double brin, ainsi que la longueur, de 3 à plusieurs millions de bases ou paires de bases, peuvent varier, doivent être synthétisés avant utilisation.

Le processus classique de synthèse d’acide nucléique, utilisant la « chimie phosphoramidite », est long et complexe et fait intervenir plusieurs étapes dont certaines ne sont pas automatisées. Pour des fragments dont la longueur est inférieure à 150 bases ou paires de bases il est possible de synthétiser l’acide nucléique à l’aide d’un oligosynthétiseur préalablement programmé pour réaliser une séquence définie à l’avance. Pour des fragments plus longs, des étapes successives d’assemblage sont nécessaires. Dans la vaste majorité des cas, des étapes de purification intermédiaires et finales seront nécessaires pour obtenir un fragment d’acide nucléique de qualité suffisante. Dans tous les cas, le chercheur opérant dans un laboratoire n’est pas en mesure de synthétiser l’acide nucléique de façon simple et rapide à partir de son ordinateur individuel.

En conséquence, il existe un besoin, pour les activités de recherche et de développement, d’analyse ou de tout type d’activité requérant l’utilisation d’acide nucléique, d’un dispositif de synthèse d’acide nucléique qui soit contrôlé directement par ordinateur et qui permette, de manière simple et rapide, de synthétiser le ou les fragments d’acide nucléique désiré en une unique opération de la part du chercheur opérant dans un laboratoire. Il existe également un besoin d’amélioration des performances de la synthèse d’acide nucléique. Une des voies envisagées est la synthèse d’acide nucléique par catalyse enzymatique, dont les performances sont potentiellement largement supérieures à la synthèse par catalyse chimique. Il n’existe

pas aujourd’hui de synthétiseur adapté à cette nouvelle technologue de synthèse. ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE

Les méthodes actuelles de synthèse d’acide nucléique font toujours intervenir, suivant les besoins, des opérations de synthèse chimique de fragments de taille limitée ainsi que des opérations d’assemblage de ces fragments en fragments plus longs suivant l’usage qui leur est destiné.

Les opérations de synthèse chimique sont réalisées à partir de dispositifs de type oligo-synthétiseur vendu dans le commerce ou à l’aide de dispositifs robotisés réalisés à façon par les sociétés de synthèse d’acide nucléique. Cependant, dans les deux cas, le chercheur expérimentateur n’a pas la possibilité de simplement et directement, en communiquant directement avec le dispositif de synthèse depuis n’importe quel ordinateur préalablement paramétré, de synthétiser le fragment d’acide nucléique désiré. Il doit passer par une procédure dédiée et souvent indirecte qui ne lui permet pas de manipuler à la fois l’acide nucléique sous forme virtuelle, en utilisant un logiciel dédié à la manipulation de séquence d’acide nucléique, et sous forme réelle par simple commande de l’opération de synthèse.

Les opérations d’assemblage sont le plus souvent réalisées par des étapes expérimentales manuelles. Elles peuvent néanmoins être automatisées par l’emploi de dispositif robotique sur mesure. Ces dispositifs sont alors contrôlés en fonction des étapes à réaliser et non en fonction de la séquence de l’acide nucléique à assembler. Dans les deux cas, le chercheur expérimentateur n’a pas la possibilité de simplement et directement, en communiquant directement avec le dispositif d’assemblage depuis n’importe quel ordinateur préalablement paramétré, d’assembler le fragment d’acide nucléique désiré. Il doit passer par une procédure dédiée et souvent indirecte qui ne lui permet pas de manipuler à la fois l’acide nucléique sous forme virtuelle, en utilisant un logiciel dédié à la manipulation de séquence d’acide nucléique, et sous forme réelle par simple commande de synthèse. A ce jour, aucun dispositif de laboratoire permettant la synthèse directe d’acide nucléique en une unique opération et depuis un ordinateur, préalablement paramétré et permettant de facilement manipuler virtuellement de l’acide nucléique, n’est disponible.

De plus, il n’existe aujourd’hui aucun dispositif permettant de synthétiser des acides nucléiques à façon en utilisant une catalyse enzymatique. Les synthétiseurs actuels utilisent une méthode chimique appelée phosphoramidite. Les réactifs utilisés sont organiques et néfastes pour l’environnement. De plus, des limitations inhérentes à cette méthode de synthèse chimique empêchent la synthèse de fragments de plus de 150 nucléotides.

BUTS DE l’INVENTION

Un premier but de l’invention est de proposer un dispositif de synthèse d’acide nucléique contrôlé par ordinateur et permettant à un expérimentateur de synthétiser à façon l’acide nucléique dont il a besoin en une unique opération pilotée depuis son ordinateur.

Les inventeurs ont mis au point récemment une nouvelle méthode de synthèse d’acides nucléiques mettant en œuvre une catalyse enzymatique, décrite dans la demande de brevet WO 2015/159023. Le cycle de synthèse qui utilise une enzyme de polymérisation est réalisable en milieux aqueux et ne présente pas les limitations inhérentes à la méthode chimique. Le procédé enzymatique permet de synthétiser sans assemblage des fragments d’acides nucléiques de grande longueur (plusieurs centaines voire milliers de nucléotides) avec une très grande précision.

Un autre but de l’invention est donc de proposer un dispositif de synthèse d’acide nucléique, contrôlé par ordinateur, permettant de réaliser la synthèse d’acides nucléiques de grande longueur par voie enzymatique, en milieu aqueux.

RESUME DE L’INVENTION A cet effet, la présente invention propose une installation pour la mise en œuvre d’un procédé de synthèse enzymatique d’acides nucléiques, en particulier d’acides nucléiques de grande longueur, comprenant : i) un dispositif de synthèse comportant : - au moins une chambre d’élongation, chaque chambre d’élongation étant formée d’un réacteur unique renfermant au moins un support fixe d’accrochage de fragments d’acides nucléiques en cours d’élongation comprenant une multiplicité de sites réactionnels d’élongation, - des sources d’alimentation en nucléotides, enzyme(s), éventuelles amorces, solution(s) de lavage et/ou solution(s) tampon(s), lesdites sources d’alimentation étant connectées à la chambre d’élongation, - des moyens d’évacuation des excédents ou déchets de ladite chambre d’élongation, - des moyens de modification des conditions de fonctionnement du dispositif de synthèse, tels que des moyens de régulation de la température, ladite chambre d’élongation étant configurée pour permettre de réaliser au moins un cycle d’élongation desdits fragments d’acide nucléiques comprenant plusieurs étapes dont au moins une étape d’addition enzymatique des nucléotides se déroulant en milieu aqueux, ii) un système informatique central incluant au moins une interface de contrôle et un logiciel pilote, apte à piloter les conditions de fonctionnement dudit dispositif de synthèse et le déroulement de la synthèse.

Un aspect central de l’installation selon l’invention est la chambre d’élongation qui est constituée d’un réacteur unique. Le fonctionnement du dispositif de synthèse, et les conditions opératoires de la synthèse est ainsi facilement pilotable par un ordinateur.

De préférence, le dispositif de synthèse comprend : - au moins une chambre d’élongation, chaque chambre d’élongation étant formée d’un réacteur unique renfermant deux types de supports d’accrochage des fragments d’acides nucléiques en cours d’élongation : d’une part un support fixe comprenant une multiplicité de sites réactionnels d’élongation et d’autre part des supports mobiles aptes à interagir avec les fragments d’acides nucléiques en cours d’élongation au niveau desdits sites réactionnels, - et des moyens d’immobilisation de la totalité ou de certains supports mobiles présélectionnés.

Ce dispositif de synthèse de laboratoire est un équipement autonome et automatisé permettant la synthèse de fragments d’acide nucléique dont le type, simple brin ou double brin, ainsi que la longueur, de 3 à plusieurs millions de bases ou paires de bases, peuvent varier et dont la séquence, ainsi que les caractéristiques sont communiquées par un ou plusieurs ordinateurs. Contrairement aux oligosynthétiseurs existants aujourd’hui, le dispositif de synthèse de l’installation selon l’invention permet de réaliser une synthèse qui ne requiert pas d’étapes d’assemblage de plusieurs oligonucléotides pour synthétiser un fragment de plus de 150 nucléotides.

De manière avantageuse, le dispositif de synthèse comprend des moyens physiques de sélection différenciée des sites réactionnels à activer ou à désactiver avant un cycle d’élongation, afin de pouvoir contrôler de manière différenciée la séquence des acides nucléiques synthétisés dans chacun de ces sites réactionnels.

Par exemple, lesdits moyens physiques de sélection peuvent comprendre un système optique incluant des rayonnements électromagnétiques. Dans ce cas la chambre d’élongation est avantageusement équipée de parois transparentes auxdits rayonnements, le système optique dirigeant lesdits rayonnements sur des sites réactionnels prédéterminés, lesdits rayonnements étant choisis de préférence dans le domaine du visible ou de l’infra-rouge et étant aptes à modifier l’accrochage, ou provoquer le décrochage, du fragment d’acide nucléique sur le support correspondant, par modification de la structure du nucléotide terminal dudit fragment d’acide nucléique.

Dans le mode de réalisation de l’invention où le réacteur de la chambre d’élongation renferme deux types de supports d’accrochage des fragments d’acides nucléiques, ledit support fixe comprend au moins une carte matrice interchangeable, logée, en position de fonctionnement, dans la chambre d’élongation, la surface de ladite carte matrice comportant une multiplicité de sites réactionnels sous la forme de zones fonctionnalisées (par exemple sous la forme de patch) et/ou d’alvéoles et/ou de nanopuits.

Ladite carte matrice peut comprendre un ou plusieurs réseau(x) d’alvéoles et/ou de nano-puits, chaque alvéole ou nano-puits constituant un site spécifique réactionnel d’élongation.

De manière avantageuse, chaque alvéole ou nano-puits présente des parois dont la surface est fonctionnalisée et apte à fixer une première extrémité de fragments d’acide nucléique, de préférence l’extrémité 5’ desdits fragments d’acides nucléiques.

Plus particulièrement, chaque alvéole ou nano-puits peut constituer un réceptacle pour lesdits supports mobiles, la surface extérieure des dits supports mobiles étant fonctionnalisée (par greffage ou revêtement) et apte à fixer une seconde extrémité des fragments d’acides nucléiques, de préférence l’extrémité 3' desdits fragments d'acides nucléiques.

Ainsi les fragments d’acides nucléiques en cours d’élongation peuvent être soit « accrochés » aux sites réactionnels de la carte matrice (support fixe), soit « accrochés » aux supports mobiles, soit « accrochés » à ces deux supports, par leurs extrémités respectives, ou encore alternativement à l’un ou à l’autre de ces supports, selon les conditions opératoires (ou de fonctionnement) de la chambre d’élongation, en fonction de l’étape correspondante de la synthèse desdits acides nucléiques.

Selon une variante avantageuse de l’invention, lesdits supports mobiles sont sous la forme de billes, de préférence de billes comprenant un matériau ferromagnétique, lesdits moyens d’immobilisation ou de répulsion de la totalité ou de certains supports mobiles présélectionnés comprenant un générateur de champ magnétique.

Ainsi les moyens de modification des conditions de fonctionnement peuvent être des moyens de modifications des conditions opératoires au sein de de la chambre d’élongation, permettant l’accrochage ou le décrochage des fragments d’acides nucléiques du support fixe à des conditions opératoires différentes de celles des supports mobiles. Ces conditions peuvent être des conditions physiques telles que température, rayonnement électromagnétique, potentiel électrique ou champ magnétique.

Par exemple, ces moyens de modifications des conditions opératoires sont des moyens d’adaptation de la température de la chambre d’élongation aux conditions thermiques d’accrochage ou de décrochage des fragments d’acides nucléiques de l’un ou l’autre des différents supports.

De manière avantageuse, la chambre d’élongation comporte un ou plusieurs conduits d’introduction des réactifs, ou solutions de lavage, ou solutions tampons dans le réseau d’alvéoles ou de nano-puits de la carte matrice, le ou les conduit(s) d’introduction étant disposé(s) entre la face, dénommée face supérieure, de ladite carte présentant les ouvertures des alvéoles ou nano-puits et un couvercle transparent aux rayonnements électromagnétiques.

Dans ce cas, de manière avantageuse, les parois de fond des alvéoles ou nano-puits de la carte matrice comportent des orifices communiquant avec un ou plusieurs conduits d’évacuation de liquides disposé(s) au-dessous de la face, dénommée face inférieure, de ladite carte, les sections de passage desdits orifices présentant un diamètre inférieur à celui desdits supports mobiles, tels que des billes.

Ainsi les réactifs non utilisés, solution tampon en excès, solutions de lavage et/ou les fragments erronés, peuvent être aisément évacués de la chambre d’élongation, tout en maintenant les supports mobiles au sein des alvéoles ou nano-puits de la carte matrice.

De préférence, l’installation selon l’invention comporte également un dispositif de contrôle du déroulement de l’élongation. Elle comprend aussi au moins un ordinateur incluant le logiciel pilote qui commande le fonctionnement du dispositif de synthèse.

En variant elle peut comprendre plusieurs ordinateurs reliés par liaison filaire ou par liaison sans fil à un serveur, et sont aptes à commander le fonctionnement du dispositif de synthèse.

De manière avantageuse, l’installation selon la présente invention comprend au moins un ordinateur apte à permettre la manipulation virtuelle de la ou des séquences d’acide nucléiques à synthétiser.

DESCRIPTION DES FIGURES L'invention sera bien comprise à la lecture de la description suivante d'exemples de réalisation, en référence aux dessins annexés dans lesquels :

La Figure 1 représente différents exemples (A, B ou C) de configuration de l'installation selon l'invention avec interaction entre le dispositif de synthèse et le ou les ordinateurs permettant le contrôle de la synthèse.

La Figure 2 représente un exemple de diagramme conceptuel de l'ensemble de l'installation selon l'invention incluant le dispositif de synthèse d’acide nucléique. Les doubles flèches pleines représentent le flux d’information et de données informatiques. Les traits pointillés représentent le flux d’énergie. Les doubles flèches à double trait représentent les flux de matières.

La Figure 3 est un diagramme schématique d'un exemple de mode opératoire présentant les étapes séparant la manipulation virtuelle des séquences de leur synthèse en utilisant le dispositif de synthèse contrôlé par un ordinateur. Les doubles cadres représentent des opérations effectuées par l’expérimentateur, les cadres simples représentent les étapes réalisées par les différents systèmes informatiques et par le dispositif de synthèse d’acide nucléique.

La Figure 4 est un schéma en coupe partielle de la chambre d’élongation dans laquelle est insérée une carte matrice. Le haut de la chambre d’élongation est constitué d’un matériau translucide.

La Figure 5 est un schéma de dessus d'une chambre d’élongation comprenant une carte matrice.

La Figure 6 est une vue de dessus d’un nano-puits cylindrique.

La Figure 7 est un schéma en coupe du dispositif de synthèse.

La Figure 8 schématise un exemple de système d’injection des réactifs vers la chambre d'élongation.

DESCRIPTION DES MODES DE REALISATION PREFERES DE L’INVENTION

En se référant aux figures, et comme mentionné ci-dessus, la chambre d’élongation 1 peut renfermer une carte matrice 21 amovible servant de support fixe lors de la synthèse des acides nucléiques.

Cette carte matrice 21 est avantageusement divisée en plusieurs sites d’élongation dans lesquels sont synthétisés en parallèle des fragments d’acides nucléiques qui peuvent être de séquences différentes. Lors d’une étape de synthèse, les réactifs sont injectés dans la chambre d’élongation et distribués à tous les sites d’élongation Le contrôle de la séquence des fragments synthétisés se fait par un contrôle des conditions physiques au niveau de chaque site d’élongation.

Ces sites d’élongation peuvent être des patchs fonctionnalisés ou des alvéoles ou nano-puits 22 ménagés dans la carte matrice. Le matériau constitutif de la matrice peut être à base d’un ou plusieurs matériaux choisis parmi l’acier, l'aluminium, le silicium ou tout alliage métallique constitué de deux ou plus des éléments suivants: Fe, Se, Ge, As, Si, Au, Ar, Al, Cu, Pd, Co, Ni, Zn, Pt, Cd, Hg, Rh, Ir, Ga, In, Ti, V, Zr, et pouvant renfermer également un pour plusieurs des éléments ci-après : Mg, Ca, B, C, O, N, S, F, Cl, P, I, Br ; verre, polydiméthylsiloxane, polyméthylméthacrylate, copolymère d’oléfine cyclique, polycarbonate, SU-'S photoresist, polyimide, polyéthylène téréphthalate, polychlorure de vinyl, Teflon® ou tout polymère organique comprenant des atomes d’halogène.

Faisant face aux sites d’élongation disposés en surface supérieure de cette carte matrice 21 peut se trouver une paroi 24 en matériau translucide.

Les alvéoles ou nano-puits 22 de la carte matrice peuvent être cylindriques, sphériques ou parallélépipédiques. Leur distribution sur la carte matrice peut être organisée en réseau, en particulier diédraux ou cycliques. Le volume des alvéoles ou puits peut varier de 1pL à plusieurs millilitres.

Une partie définie de la surface des sites d’élongation de la carte matrice 21 possède avantageusement des propriétés physico-chimiques particulières qui permettent la création de liaisons covalentes avec des acides nucléiques ou des protéines. Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention les surfaces constituant le fond et les parois des nano-puits 22 de la carte matrice 21 qui constituent ledit premier support d'accrochage comportent un revêtement 25 de surface spécifique dont les caractéristiques permettent une fonctionnalisation de la surface tel qu’un oxyde métallique, une fonctionnalisation chimique ou un revêtement protéique qui permet par exemple l'établissement de liaisons covalentes avec des fragments d'acides nucléiques ou des fragments peptidiques.

Le second support d'accrochage est avantageusement formé par des billes, mobiles dans la chambre d'élongation, et dont les dimensions sont telles qu'elles sont aptes à se loger dans les alvéoles ou nano-puits de la carte matrice. Ces billes peuvent être constituées de matériaux ferromagnétique, de polymère ou de résine, et recouvertes d’un revêtement de surface spécifique, tel que des fragments d’acide nucléique de longueur comprise entre 10 et 10.000 nucléotides, une protéine de reconnaissance et fixation d’affinité telles que des anticorps, des récepteurs d’hormones, l’avidine ou l’une de ses formes modifiées, récepteur de neurotransmetteur, l’antidigioxine ou l’une de ses formes modifiées, la lectine ou l’une de ses formes modifiées, la glutathionne-S-transférase ou l’une de ses formes modifiées ; un métal de transition ou un oxyde métallique comprenant un ou plusieurs des métaux suivants: Cu, Pd, Co, Ni, Zn, Pt, Cd, Hg, Rh, Ir, Ga, In, Ti.

La chambre d'élongation 1 peut posséder dans sa partie inférieure des moyens d'évacuation des réactifs et solutions (par exemple réactifs en excès ou déchets) appelés conduits d'évacuation 26. La carte matrice 21 est disposée de façon à créer une séparation de ces conduits d'évacuation 26 d'avec le reste de la chambre d'élongation 1. Les conduits d'évacuation 26 collectent réactifs et solutions à éliminer, via la présence d'orifices 27 spécifiques ménagés au fond des nano-puits 22. Les nano-puits peuvent posséder une ou plusieurs ouvertures et le nombre d'ouvertures peut varier d'un nano-puits à l'autre. La section géométrique de ces ouvertures possède une forme et une taille spécifique. Des sections de type circulaire, polygonale ou elliptique sont des exemples non limitatifs de formes que peuvent prendre les ouvertures vers les conduits d'évacuation 26. La taille de la section des ouvertures peut être calculée de telle sorte que certains des éléments intervenant dans le procédé de synthèse de l’acide nucléique ne puissent pas passer des sites réactionnels de la chambre d’élongation aux conduits d’évacuation 26. D’autres réactifs peuvent néanmoins emprunter ces orifices, qui agissent alors comme des filtres.

La forme de la carte matrice 21 est choisie de manière à s'insérer parfaitement dans la chambre d'élongation 1.

Le dispositif de synthèse comporte des sources d’alimentation 33 en réactifs, nucléotides, enzyme(s), amorces, solutions de lavage ou solutions tampon, connectées à la chambre d’élongation 1 par une ou plusieurs vanne(s) d’entrée 30 reliée(s) à un dispositif de sélection desdits réactifs qui interviennent dans le procédé de synthèse. Ladite chambre d’élongation possède également une ou plusieurs vanne(s) de sortie 31 permettant d’évacuer la solution contenue dans la chambre d’élongation.

Les conduits d’évacuation 26 précédemment cités possèdent également une ou plusieurs vannes de sortie 35 permettant d’évacuer les déchets pour pouvoir soit les recycler soit les jeter. Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, une ou plusieurs des vannes de sortie 31 de la chambre d'élongation sont reliées auxdits conduits d'évacuation 26. Dans un autre mode de réalisation préféré de la présente invention, le système de vannes est organisé de façon à favoriser et accélérer le remplissage des nano-puits 22 de la carte matrice 21. Cet effet est obtenu par exemple en combinant judicieusement l'application d'une pression à certaines vannes d'entrée des réactifs avec l'application d'une dépression à certaines vannes de sortie des réactifs.

Dispositifs de contrôle 3 et moyens de modification des conditions physiques dans la chambre d’élongation.

Le cycle de synthèse d’acide nucléique requiert des conditions physiques particulières pour s’effectuer avec des performances optimales. Différents paramètres peuvent être contrôlables dans la chambre d’élongation : - Rayonnement électromagnétique. Faisant face à la paroi 24 translucide de la chambre d’élongation 1 se trouve un système optique 34 qui permet d’envoyer vers la carte matrice des impulsions électromagnétiques. Un système avec ou sans masque permet de sélectionner les sites réactionnels actifs à éclairer. Ce système peut bénéficier du phénomène de plasmon décrit dans la littérature (résonance de l’onde lumineuse lorsque la longueur d’onde coïncide avec la taille caractéristique des sites d’élongation). -Température. Le système optique évoqué ci-dessus peut également chauffer des zones de la chambre de manière sélective en utilisant par exemple des longueurs d’onde du domaine de l’infrarouge. La température peut également être contrôlée par effet Joule, effet thermo électrique, rayonnement. -Champ magnétique. Le champ magnétique peut être contrôlé dans la chambre d’élongation grâce à l’utilisation d’électroaimants ou d’aimants permanents. - Electricité. Peut être contrôlé une différence de potentiel entre les parois de la chambre d’élongation ou un courant à travers celle-ci.

Ces modules de contrôle des conditions physiques peuvent être intégrés à la chambre d’élongation elle-même.

Un dispositif d’injection 2 des réactifs dans la chambre d’élongation 1 permet notamment d’assurer la bonne injection séquentielle des réactifs 17 conformément au cycle de synthèse, d’empêcher toute contamination entre réactifs, et d’assurer le mélange des réactifs si besoin. Dans une configuration préférée de l’invention, l’injection des réactifs est faite en combinant des contrôleurs de pression 16 et des vannes actives 19. Afin d’éviter toute contamination entre les réactifs, tous les canaux d’injection de réactifs peuvent être lavés à chaque étape du cycle de synthèse.

Pour que le dispositif de synthèse d’acide nucléique puisse fonctionner de manière autonome, dans une certaine mesure, pour une certaine durée et pour la synthèse d’un certain nombre de fragments d’une certaine longueur, sont prévus des dispositifs de stockage 4 de tous les réactifs nécessaires au processus de synthèse d’acide nucléique. Ces dispositifs, d’une capacité variable suivant le réactif considéré, sont actifs ou passifs suivant la nature des réactifs à stocker. Les dispositifs de stockage 4 sont directement reliés à certains systèmes d’entrée de la chambre d’élongation 1 à travers le système d’injection des réactifs 2. Le rôle des dispositifs de stockage 4 est donc être notamment de conserver les réactifs dans des conditions optimales (de température par exemple).

Ces dispositifs de stockage 4 peuvent également posséder des capteurs aptes à vérifier la qualité et la nature des éléments stockés. Ces capteurs peuvent alors communiquer avec le système informatique central 9 du dispositif de synthèse d’acide nucléique. Les dispositifs de stockage 4 des réactifs permettent de recharger facilement les réactifs, de façon comparable au changement des cartouches d’encre dans une imprimante papier. Tous les réactifs utilisés sont avantageusement en milieu aqueux. Les réactifs utilisés peuvent être en particulier, des nucléotides, des tampons de réaction, l'enzyme de polymérisation, des billes magnétiques fonctionnalisées, un produit de déprotection des nucléotides, des solutions de lavage.

Suivant la nature des déchets de synthèse et suivant la connectivité du dispositif de synthèse d’acide nucléique, la présence de dispositifs de rétention 5 ou de recyclage des déchets peut être nécessaire. Dans le cas de recyclage, les dispositifs de rétention ou de recyclage sont connectés aux dispositifs de stockage 4 ou directement au conduit d'entrée de la chambre d’élongation 1, mais sont, dans tous les cas, directement reliés aux sortie de la chambre d’élongation 1, en permettant l’évacuation efficace de ces éléments indésirables de la chambre d’élongation 1. Des capteurs permettant la vérification des éléments retenus ou recyclés du point de vue de leur quantité, de leur qualité et de leur nature, peuvent communiquer avec le système informatique central 9 du dispositif de synthèse d’acide nucléique.

Afin de surveiller, évaluer et contrôler l’état, la quantité ou la qualité du processus de synthèse d’acide nucléique un dispositif de contrôle de l'élongation 6 est présent. Ce dispositif comprend divers capteurs et permet de suivre le processus de synthèse d’un point de vue cinétique, l’évolution des concentrations des différents réactifs, produits et déchets de la synthèse, analyser l’état des différents constituants présents dans la chambre d’élongation 1, et analyser les paramètres physico-chimiques présents dans la chambre d’élongation 1. Ce dispositif est directement relié à la chambre d’élongation 1 et communique avec le système informatique central 9. Les informations communiquées, de natures très diverses, peuvent faire l’objet d’une analyse partielle avant diffusion au système informatique central 9. Le rôle d’un tel dispositif de contrôle est d’assurer un suivi du processus de synthèse des acides nucléiques, de fournir les informations nécessaires à l’élaboration de paramètres de synthèse optimaux, de repérer les disfonctionnements éventuels afin de prendre des mesures pour rétablir un fonctionnement optimal et afin d’en informer l’opérateur.

Un autre aspect particulier de l’invention concerne l’entrée et le châssis de maintien des cartes matrices 7 dans la chambre d’élongation 1. La carte matrice peut être introduite, au moyen d'un dispositif d'insertion 7, dans le dispositif de synthèse par une entrée ou trappe d’entrée et peut être maintenue dans la chambre d’élongation par un châssis. Ces éléments peuvent être indépendants ou partie intégrale de la chambre d’élongation 1, et en interactions avec les différents éléments de stockage 4 de rétention ou recyclage 5 et de contrôle 6. Ces éléments peuvent être universels en s’adaptant à plusieurs types de supports ou réceptacles ou bien spécifiques de certains types de supports ou réceptacles. Ces éléments peuvent également être amovibles de façon à être remplacés par d’autres éléments de même fonction mais adaptés à différents types de support ou réceptacles. Des effecteurs et des capteurs peuvent aussi faire partie de ces éléments, avec pour rôle de déplacer le châssis afin de permettre l’insertion du support ou réceptacle, permettre l’entrée du support ou réceptacle, favoriser le bon positionnement du support ou réceptacle, permettre la liaison optimale avec ou l’insertion optimale dans, la chambre d’élongation 1. Ces effecteurs et ces capteurs communiquent avantageusement avec le système informatique central 9 du dispositif de synthèse d’acide nucléique et peuvent être actionnés directement depuis l’interface de contrôle 8. Le changement de carte matrice dans la chambre d’élongation peut se faire de manière totalement automatisée, à la manière de l’insertion d’un CD dans un ordinateur.

Afin de pouvoir réaliser des commandes basiques une interface de contrôle 8 peut être présente. De même, afin de connaître l’état du dispositif de synthèse d’acide nucléique, une interface visuelle ou sonore peut être présente. Ces éléments de contrôle et de signalisation peuvent être reliés au système informatique central 9. Le rôle de l’interface de contrôle permet en particulier à un opérateur de visualiser l’état général du dispositif de synthèse, le niveau des réactifs, ainsi que le niveau des dispositifs de stockage des produits finis et des déchets, les conditions physicochimiques qui régnent dans la chambre d’élongation 1, les paramètres du système informatique central 9 et notamment la connectivité du dispositif de synthèse d’acide nucléique. Il peut aussi permettre à un opérateur de visualiser l’état d’avancement du processus d’élongation ainsi que la nature de l’acide nucléique en cours de synthèse, la provenance de la commande ayant abouti à la synthèse en cours, d’activer les fonctions basiques du dispositif de synthèse d’acide nucléique, telles que l’ouverture et la fermeture des dispositifs d’entrée ou sortie, la restitution d’échantillons, le départ ou la mise en suspens d’une synthèse, la mise hors ou sous tension de l’appareil, le paramétrage des différentes alarmes.

Le système informatique central 9, pilotant la synthèse d’acide nucléique et permettant la communication avec un ordinateur possédant le logiciel pilote 10, comprend les éléments classiques d'un ordinateur portable, notamment un processeur central, des cartes d’acquisition, des ports informatiques, un dispositif de mémoire vive, un dispositif de stockage de données, des cartes de communication filaires ou non filaires, une carte mère et un dispositif graphique. Le rôle du système informatique est destiné à acquérir les données correspondant aux séquences d’acide nucléique à synthétiser ainsi que commander le processus de synthèse à la manière d’un automate. Le système informatique peut donc communiquer avec tous les composants cités précédemment afin de réguler leur fonctionnement. Il peut également avoir une autonomie de décision, basé sur un comportement préalablement défini, afin d’orienter le processus de synthèse dans le but d’obtenir les meilleurs résultats possibles. Le système informatique peut donc être paramétré par un logiciel de contrôle de type « firmware » ou logiciel interne.

Un logiciel pilote 10 est installé sur les ordinateurs des chercheurs désirant synthétiser des acides nucléiques et désirant manipuler des séquences d’acide nucléique. Ce logiciel, similaire aux logiciels dédiés à la manipulation de séquences d’acide nucléique, possède une fonctionnalité supplémentaire permettant par activation d’une simple commande, d’engendrer la synthèse, immédiate ou différée, de tout ou d’une partie de la séquence d’acide nucléique considérée. Ce logiciel permet également de paramétrer de façon simple et rapide le dispositif de synthèse d’acide nucléique. Ce logiciel peut en outre n’être qu’un logiciel intermédiaire de type « logiciel pilote » servant à la communication et au paramétrage du dispositif de synthèse de l’acide nucléique. Le logiciel pilote pourra être intégré au système d’exploitation de l’ordinateur et ainsi permettre le contrôle du dispositif de synthèse d’acides nucléiques à partir de plusieurs interfaces (voir figure 1) et autres logiciels.

Le dispositif de synthèse d’acide nucléique est alimenté en électricité comme source d’énergie principale. A cet effet, des éléments apportant la puissance 11 électrique nécessaire sont présents dans le dispositif de synthèse d’acide nucléique. Ces éléments peuvent notamment comprendre des transformateurs électriques permettant de passer d’un courant public à un courant utilisable par les différents effecteurs et capteurs présents dans le dispositif de synthèse d’acide nucléique, de circuits électroniques de puissance et de capacitance, et de sources de pression permettant l’injection des réactifs. Les éléments de puissance 11 sont commandés par l’interface 8 et peuvent alimenter tous les dispositifs et systèmes présents dans l'installation de synthèse d’acide nucléique.

Avantageusement plusieurs dispositifs de synthèse d’acide nucléique peuvent être supervisés par un même ordinateur ou serveur informatique. Inversement, un même dispositif de synthèse d’acide nucléique peut recevoir des informations de la part de plusieurs ordinateurs 13 ou serveurs 14 informatiques.

Le dispositif de synthèse d’acide nucléique décrit se démarque donc des oligosynthétiseurs actuels, notamment par : -La capacité à synthétiser le ou les fragments d’acide nucléique désirés par l’opérateur d’une façon simple et rapide. -L’utilisation d’un cycle de synthèse utilisant une catalyse enzymatique, et la réalisation de plusieurs synthèses en parallèle dans la même chambre d’élongation. Pour chaque site d’élongation, l’addition ou la non-addition d’un nucléotide à chaque injection des nucléotides dans la chambre d’élongation est gérée par un contrôle des conditions physiques au niveau de chaque site d’élongation. -L’absence d’utilisation de réactifs organiques néfastes pour l’environnement -La capacité à synthétiser le ou les fragments d’acide nucléique désirés de manière directe de façon transparente pour l’opérateur, mettant en œuvre le procédé selon WO 2015/159023 qui ne nécessite pas d’étapes de purification à la fin de la synthèse des fragments d’acide nucléique, ni d’étapes d’assemblage pour synthétiser des fragments de plus de 150 nucléotides. -La programmation et la commande du dispositif de synthèse sont directement réalisées par une interface logicielle permettant également à l’opérateur de manipuler ses séquences d’acide nucléique afin de les éditer, les stocker, les réviser ou les modifier. -Le dispositif présente une taille limitée et peut prendre place sur la majorité des paillasses dans les laboratoires des opérateurs. -La possibilité de programmer le dispositif de synthèse pour des travaux consécutifs de natures différentes sans devoir réaliser d'intervention sur le dispositif en lui-même. Seules des opérations de commande depuis le logiciel dédié sont nécessaires à réaliser toutes les synthèses désirées, dans la limite de disponibilité des matières premières dans leurs différents dispositifs de stockage.

EXEMPLES

Le schéma de la Figure 1 décrit un exemple de mise en oeuvre de l'installation selon l’invention. Différents modes de connexion et d’utilisation sont représentés. Tous permettent à un ou des opérateurs d’obtenir la synthèse des acides nucléiques par utilisation du dispositif de synthèse d’acide et d'un ordinateur. Dans le premier cas (A), l’ordinateur 13 de l’expérimentateur est directement relié au dispositif de synthèse 15 par une connexion filaire. Dans le second cas (B), plusieurs ordinateurs 13 de plusieurs expérimentateurs sont reliés par des connexions filaires à un serveur 14. Ce dernier est lui-même relié au dispositif de synthèse 15. Bien que non représenté sur le schéma plusieurs dispositifs de synthèse 15 peuvent être reliés simultanément au serveur. Enfin, dans le troisième cas (C), plusieurs ordinateurs 13 sont reliés à un serveur 14 avec une technologie sans fil. Cette liaison peut être directe ou transiter à travers un intranet local ou même internet via une connexion sécurisée. Comme dans le second cas, plusieurs dispositifs de synthèse peuvent être reliés à ce serveur 14 et permettent la synthèse des acides nucléiques désirés.

Le diagramme de la Figure 2 présente un exemple d’architecture conceptuelle d’une installation de synthèse d’acide nucléique, en présentant également les différentes interactions entre les éléments de cette installation. Les interactions présentées ici sont essentiellement de trois natures : flux d’information et de données informatiques, flux d’énergie et flux de matière. Dans l’exemple présenté l’opérateur peut interagir avec le dispositif de synthèse dans plusieurs cas : i) L’opérateur commande le processus de synthèse par l’utilisation d’un logiciel ou d’un pilote installé sur son ordinateur. ii) L’opérateur commande directement le dispositif de synthèse d’acide nucléique via l’interface de contrôle 8 pour des commandes simples ou de maintenance. L’opérateur est également en mesure de savoir quel est le statut du dispositif de synthèse en observant les différents signaux et informations donnés par cette même interface de contrôle. iii) L’opérateur apporte le support ou réceptacle dans lequel les échantillons d’acide nucléique seront synthétisés à l’issue du processus de synthèse. iv) L’opérateur récupère les différents échantillons d’acide nucléique dont il a commandé la synthèse. v) L’opérateur, lors d’opérations de maintenance périodiques, remplit les dispositifs de stockage 4 de matières premières et vide les dispositifs de rétention de matière première usagée.

Les éléments de puissance fournissent l’énergie électrique nécessaire au fonctionnement de tous les éléments de l'installation. Le système central distribue, centralise et commande les informations et commandes nécessaires au fonctionnement de tous les éléments du dispositif de synthèse, et cela afin d’assurer une coordination optimale. Enfin, les dispositifs de stockage, de rétention, d’entrée et de sortie assurent le transit et la fourniture des matières nécessaires à la synthèse à la chambre d’élongation 1 qui constitue alors le cœur du dispositif en assurant la synthèse des molécules d’acides nucléiques.

Le diagramme de la Figure 3 présente un exemple de mode opératoire à suivre pour réaliser la synthèse d’une séquence d’acide nucléique à partir d’une séquence virtuelle manipulée sur l’ordinateur d’un expérimentateur. L’expérimentateur manipule selon son désir la séquence d’acide nucléique d’intérêt de façon à obtenir une séquence finale satisfaisante. Il presse ensuite une commande proposée sous forme de bouton virtuel relatif à la synthèse de sa séquence. Une fenêtre proposant différents paramètres tels que l’étendue de la séquence à synthétiser, le type d’acide nucléique, la quantité à synthétiser, ou encore le délai de synthèse, permet à l’utilisateur de faire ses choix. Finalement une procédure de validation des différents paramètres par pression sur un bouton de type « synthétiser » ou « ok » permet de déclencher la procédure de synthèse. Cette dernière comporte d’abord une étape d’encodage par le logiciel ou pilote présent sur l’ordinateur 13 ou le serveur 14 de l’expérimentateur. Vient ensuite une phase de transfert de données via différents canaux jusqu’à la réception de ces données sous forme opérationnelle par le dispositif de synthèse d’acide nucléique. Via le système informatique central 9, ce dernier réalise la programmation et la coordination de la synthèse de la séquence suivant les paramètres définis par l’expérimentateur. La synthèse des molécules d’acide nucléique commence alors. Suivant les paramètres choisis l’expérimentateur pourra être informé en temps réel de l’état d’avancement de la synthèse ainsi que de la qualité de cette dernière. Il pourra également être informé lors de la finalisation de sa synthèse afin de pouvoir récupérer ses échantillons.

Un exemple de chambre d’élongation est schématisé sur la figure 4. La carte 21 dans laquelle se trouvent les nano-puits 22 est amovible et est tenue par des joints sur ses arêtes. Lorsque la carte est en Silicium, les nano-puits 22 peuvent être fabriqués par photolithographie de manière classique. La paroi 24 supérieure de la chambre d’élongation 1 peut-être en verre, par exemple, pour laisser passer la lumière. La partie centrale constituée de la carte matrice sépare ainsi les conduits d’évacuation 26 du reste de la chambre d’élongation. La surface interne des nano-puits 22 est recouverte d'une couche d'amino-propyl-triethoxy-silane (APTES) par trempage dans une solution d'APTES à 2 %.

La chambre et la carte matrice, schématisées à la figure 5, sont ici de section rectangulaire, et la carte matrice possède 231 nano-puits cylindriques répartis en 11 lignes et 21 colonnes selon une distribution en réseau à base carré. Les cercles de plus grand diamètre sur la gauche et la droite de la chambre d’élongation représentent les vannes d’entrée 30 et de sortie 31 des réactifs.

La Figure 6 montre un exemple de nano-puits 22 de forme cylindrique, dans le fond 32 duquel sont ménagés des trous 27 cylindriques permettant l'évacuation de certains réactifs ou déchets vers le conduit d'évacuation 26. Les nano-puits 22 comme les trous 27 peuvent être formés de manière classique par photolithographie. Le fond 32 et les parois du nano-puits 22 sont recouverts dans cet exemple de fragments d’ADN de capture, fixés par réaction avec le revêtement de surface constituée par le APTES.

La surface schématisée en pointillés représente la surface permettant la réalisation d'une liaison covalente avec des fragments d'acides nucléiques ou des protéines.

Un système optique (Figure 7) comprenant une source 36 de rayonnements électromagnétiques et des lentilles 37, miroirs ou masques, permet d’illuminer les nano-puits indépendamment les uns des autres et peut être réalisé avec ou sans masque obstruant. Le système optique permet également de chauffer les nano-puits de manière sélective en utilisant une longueur d’onde dans le domaine de l’infrarouge. Les vannes d’entrée 30 et de sortie 31 de la chambre permettent de faire entrer les réactifs dans les nano-puits et d’évacuer les déchets de manière efficace. Le champ magnétique dans la chambre d’élongation est contrôlable par un électroaimant (non représenté) que l’on place par exemple sous les conduits d’évacuation 26, ou sous le fond 29 de la chambre d'élongation.

Le schéma de la Figure 8 présente un exemple de système d’injection des réactifs composé de voies de pression et de vannes 19. Cet exemple permet l’injection séquentielle de réactifs, en évitant au maximum les contaminations grâce à des étapes de lavage des canaux micro-fluidiques entre chaque injection de réactif au moyen de solution de lavage 18. Le dispositif d’injection peut utiliser des pousse-seringues, des contrôleurs de pression et des vannes.

Les vannes peuvent être électroniques ou des vannes intégrées à une carte micro-fluidique (vanne Quake ou autre). Chacun des canaux d’injection des réactifs est lavé en amont de la jonction avec les autres canaux afin d’éviter au maximum les contaminations.

Un exemple de réalisation détaillé d'une synthèse d'acides nucléiques au moyen d'une installation conforme à la présente invention, est décrit ci-après.

Le dispositif de synthèse est initialement préparé de la manière suivante. Une carte matrice 21 est insérée dans la chambre d’élongation 1 du dispositif de synthèse par l’intermédiaire de la paroi 24 formant couvercle transparent. Cette carte matrice 21 comporte n nano-puits 22, n étant compris entre 1 et 109. Des fragments d'acides nucléiques, amorces, sont immobilisés aux parois latérales 25 et au fond 32 des nano-puits 22 possédant une fonctionnalisation adéquate.

Au cours de la synthèse d’acide nucléique, un cycle d’addition d’un nucléotide A dans les nano-puits désirés est décrit ci-après :

Avant le début de chaque cycle de synthèse, les fragments d’acide nucléique sont fixés aux parois des nano-puits 22 à leur extrémité 5’, et à une bille magnétique 28 à leur extrémité 3’. Déprotection lumineuse Le système optique 34 est paramétré de façon à ne focaliser que sur les nano-puits 22 dans lesquels on souhaite ajouter le nucléotide A au cours de ce cycle de synthèse. Pour chacun de ces nano-puits 22, par l’intermédiaire du couvercle transparent formant la paroi 24 supérieure de la chambre d’élongation, un puise lumineux d’une longueur d’onde optimale est activé pendant une durée permettant de déprotéger le nucléotide et le décrocher de la bille magnétique 28. Les différentes vannes d’entrée des réactifs 30, de sortie 31 des réactifs et de sortie des conduits d’évacuation 26 restent en position fermée durant toute cette étape.

Lavage pour élimination des billes magnétiques Un système de génération de champs magnétiques (non représenté) accolé au fond 29 de la chambre d’élongation est paramétré de façon à créer un champ magnétique répulsif pour les billes magnétiques au sein des nano-puits 22 ayant subit le puise lumineux lors de l’étape précédente. Les moyens d'alimentation en réactif 33 sont maintenant paramétrés de façon à permettre l’introduction dans la chambre d’élongation, par l’intermédiaire de la vanne d’entrée des réactifs 30 ouverte, d’une solution de lavage 18. Cette solution de lavage pénètre dans le conduit d'entrée 23 et permet l’élimination des billes magnétiques repoussées vers le couvercle 24, par l’intermédiaire de la vanne de sortie des réactifs 31 alors en position ouverte. La vanne de sortie des conduits d’évacuation 20 reste en position fermée. Durant cette étape de lavage la température des nano-puits 22 est maintenue à une valeur optimale par l’intermédiaire d’un système de contrôle de la température (non représenté) accolé au fond 29 de la chambre d’élongation. A la fin de cette étape, les moyens d'alimentation en réactifs 33 reprennent leur paramétrage initial et les différentes vannes d’entrée des réactifs 30, de sortie des réactifs 31 et de sortie des conduits d’évacuation 26 passent ou restent en position fermée.

Introduction des réactifs d’élongation Les moyens d'alimentation en réactifs 33 sont maintenant paramétrés de telle sorte que les réactifs comportant des catalyseurs enzymatiques et des nucléotides A soient introduits dans la chambre d’élongation par l’intermédiaire de la vanne d’entrée des réactifs 30 en position ouverte. Dans les n nano-puits 22 que comporte la carte matrice 21, viennent alors s’ajouter aux fragments en cours d’élongation les réactifs nécessaires à l’élongation de ces dits fragments. Durant le remplissage des nano-puits 22 la vanne de sortie 31 des réactifs est maintenue ouverte. La vanne de sortie des conduits d’évacuation 26 peut être ouverte en fin de remplissage pour s’assurer que les réactifs pénètrent jusqu’au fond des nano-puits 22. Une fois le remplissage terminé, les vannes d’entrée 30 des réactifs, de sortie 31 des réactifs et de sortie des conduits d’évacuation 26 se referment. Le système accolé au fond 29 de la chambre d’élongation permet ensuite de maintenir les nano-puits 22 à une température optimisée pour cette étape d’addition. Dans les nano-puits qui n’ont pas été déprotégés par le puise lumineux, l’étape d’addition n’a pas lieu. Les différentes vannes d’entrée 30 des réactifs, de sortie 31 des réactifs et de sortie 35 des conduits d’évacuation 26 restent en position fermée. A la fin de cette étape, les moyens d'alimentation en réactifs 13 reprennent leur paramétrage initial et les différentes vannes d’entrée 30 des réactifs, de sortie 31 des réactifs et de sortie 35 des conduits d’évacuation 26 passent ou restent en position fermée.

Lavage réactifs en excès Les moyens d'alimentation en réactif 33 sont maintenant paramétrés de façon à permettre l’introduction d’une solution de lavage dans la chambre d’élongation, par l’intermédiaire de la vanne d’entrée 30 des réactifs ouverte. Cette solution de lavage pénètre dans la totalité des nano-puits 22 et permet l’élimination des réactifs précédents, par l’intermédiaire des trous 27 et des conduits d’évacuation 26 débouchant sur la vanne de sortie 35 des conduits d’évacuation alors en position ouverte. La vanne de sortie 31 des réactifs reste en position fermée. Durant cette étape de lavage la température des nano-puits 22 est maintenue à une valeur optimale par l’intermédiaire d’un système de contrôle de la température accolé au fond 29 de la chambre d’élongation. A la fin de cette étape, les moyens d'alimentation en réactif 33 reprennent leur paramétrage initial et les différentes vannes d’entrée 30 des réactifs, de sortie 31 des réactifs et de sortie 35 des conduits d’évacuation passent ou restent en position fermée.

Introduction des billes magnétiques Les moyens d'alimentation en réactifs 33 sont maintenant paramétrés de façon à permettre l’introduction dans la chambre d’élongation 1, par l’intermédiaire de la vanne d’entrée 30 des réactifs ouverte, d’une suspension de billes magnétiques constituant le second support solide 28. Cette suspension de billes magnétiques se répartit et pénètre dans tous les nano-puits 22 et interagit avec les fragments d'acides nucléiques qui viennent de subir une étape d’addition. Durant le remplissage des nano-puits 22 la vanne de sortie 31 des réactifs est maintenue ouverte. Une fois le remplissage terminé, les vannes d’entrée 30 des réactifs et de sortie 31 des réactifs se referment. Le système accolé au fond 29 de la chambre d’élongation permet ensuite de maintenir les nano-puits 22 à une température optimisée pour permettre le décrochage des fragments d'acides nucléiques en cours d’élongation du premier support, constitué par les parois latérales 25 et le fond 32 des nano-puits 22, et leur accrochage au second support 28 constitué par les billes magnétiques. Les différentes vannes d’entrée 30 des réactifs, de sortie 31 des réactifs et de sortie 35 des conduits d’évacuation 26 restent en position fermée. A la fin de cette étape les moyens d'alimentation en réactif 33 reprennent leur paramétrage initial et les différentes vannes d’entrée 30 des réactifs, de sortie 31 des réactifs et de sortie 35 des conduits d’évacuation 26 passent ou restent en position fermée.

Lavage des fragments non élongués Les moyens d'alimentation en réactifs 33 sont maintenant paramétrés de façon à permettre l’introduction d’une solution de lavage dans la chambre d’élongation, par l’intermédiaire de la vanne d’entrée 30 des réactifs ouverte. Cette solution de lavage pénètre dans la totalité des nano-puits 22 et permet l’élimination des fragments, non fixés sur le second support 28, par l’intermédiaire des trous d’évacuation 27 et des conduits d’évacuation 26 débouchant sur la vanne de sortie 35 alors en position ouverte. La vanne de sortie 31 des réactifs reste en position fermée. Durant cette étape de lavage la température des nano-puits 22 est maintenue à une valeur optimale par l’intermédiaire du système de contrôle de la température. A la fin de cette étape, les moyens d'alimentation en réactif 33 reprennent leur paramétrage initial et les différentes vannes d’entrée 30 des réactifs, de sortie 31 des réactifs et de sortie 35 des conduits d’évacuation 26 passent ou restent en position fermée.

Liaison au premier support Le système de contrôle de la température accolé au fond 29 de la chambre d’élongation est activé de façon à générer une température optimale au sein des nano-puits 22 de façon à permettre l’accrochage des fragments d'acides nucléiques en cours d’élongation aux parois latérales 25 et au fond 32 des nano-puits 22. Durant cette étape, les différentes vannes d’entrée 30 des réactifs, de sortie 31 des réactifs et de sortie 35 des conduits d’évacuation 26 passent ou restent en position fermée. L’ensemble de ces étapes est contrôlé par ordinateur. L’utilisateur n’intervient pas dans la synthèse entre le moment où il la demande et la fin de la synthèse.

Une fois la synthèse de l’acide nucléique terminée, l’utilisateur récupère la carte matrice dont chacun des nano-puits contient des fragments d’acides nucléiques de séquences différentes.

Claims (17)

1. REVENDICATIONS

   1. Installation pour la mise en œuvre d’un procédé de synthèse enzymatique d’acides nucléiques, en particulier d’acides nucléiques de grande longueur, comprenant : i) un dispositif de synthèse comportant : - au moins une chambre d’élongation (1), chaque chambre d’élongation étant formée d’un réacteur unique renfermant au moins un support fixe d’accrochage de fragments d’acides nucléiques en cours d’élongation comprenant une multiplicité de sites réactionnels d’élongation, - des sources d’alimentation (33) en nucléotides, enzyme(s), éventuelles amorces, solution(s) de lavage et/ou solution(s) tampon(s), lesdites sources d’alimentation (33) étant connectées à la chambre d’élongation, - des moyens d’évacuation (26) des excédents ou déchets de ladite chambre d’élongation (1), - des moyens de modification des conditions de fonctionnement du dispositif de synthèse, tels que des moyens de régulation de la température, ladite chambre d’élongation (1) étant configurée pour permettre de réaliser au moins un cycle d’élongation desdits fragments d’acide nucléiques comprenant plusieurs étapes dont au moins une étape d’addition enzymatique des nucléotides se déroulant en milieu aqueux ii) un système informatique central (9) incluant au moins une interface de contrôle et un logiciel pilote, apte à piloter les conditions de fonctionnement dudit dispositif de synthèse et le déroulement de la synthèse.
2. 2. Installation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le dispositif de synthèse comprend : - au moins une chambre d’élongation (1), chaque chambre d’élongation étant formée d’un réacteur unique renfermant deux types de supports d’accrochage des fragments d’acides nucléiques en cours d’élongation : d’une part un support fixe comprenant une multiplicité de sites réactionnels d’élongation et d’autre part des supports mobiles (28) aptes à interagir avec les fragments d’acides nucléiques en cours d’élongation au niveau desdits sites réactionnels, - et des moyens d’immobilisation de la totalité ou de certains supports mobiles présélectionnés.
3. 3. Installation selon l’une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le dispositif de synthèse comprend des moyens physiques de sélection différenciée des sites réactionnels à activer ou à désactiver avant un cycle d’élongation.
4. 4. Installation selon la revendication 3, caractérisée en ce que lesdits moyens physiques de sélection comprennent un système optique (34) incluant des rayonnements électromagnétiques et en ce que la chambre d’élongation est équipée de parois (24) transparentes auxdits rayonnements, le système optique (34) dirigeant lesdits rayonnements sur des sites réactionnels prédéterminés, lesdits rayonnements étant choisis de préférence dans le domaine du visible ou de l’infrarouge et étant aptes à modifier l’accrochage, ou provoquer le décrochage, du fragment d’acide nucléique sur le support correspondant, par modification de la structure du nucléotide terminal dudit fragment d’acide nucléique.
5. 5. Installation selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit support fixe comprend au moins une carte matrice (21) interchangeable, logée, en position de fonctionnement, dans la chambre d’élongation, la surface de ladite carte matrice comportant une multiplicité de sites réactionnels sous la forme de zones fonctionnalisées (patch) et/ou d’alvéoles et/ou de nano-puits.
6. 6. Installation selon la revendication 5, caractérisée en ce que ladite carte matrice (21) comprend un ou plusieurs réseau(x) d’alvéoles et/ou de nano-puits (22), chaque alvéole ou nano-puits constituant un site spécifique réactionnel d’élongation.
7. 7. Installation selon la revendication 5 ou 6, caractérisée en ce que chaque alvéole ou nano-puits (22) présente des parois dont la surface est fonctionnalisée et apte à fixer une première extrémité de fragments d’acide nucléique, de préférence l’extrémité 5’ desdits fragments d’acides nucléiques.
8. 8. Installation selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce que chaque alvéole ou nano-puits constitue un réceptacle pour lesdits supports mobiles, la surface extérieure des dits supports mobiles étant fonctionnalisée et apte à fixer une seconde extrémité des fragments d’acides nucléiques, de préférence l’extrémité (3’) desdits fragments d’acides nucléiques.
9. 9. Installation selon l’une quelconque des revendications 2 à 8, caractérisée en ce que lesdits supports mobiles (28) sont sous la forme de billes, de préférence de billes comprenant un matériau ferromagnétique, lesdits moyens d’immobilisation ou de répulsion de la totalité ou de certains supports mobiles présélectionnés comprenant un générateur de champ magnétique.
10. 10. Installation selon l’une quelconque des revendications 2 à 9, caractérisée en ce que les moyens de modification des conditions de fonctionnement sont des moyens de modifications des conditions opératoires au sein de de la chambre d’élongation, permettant l’accrochage ou le décrochage des fragments d’acides nucléiques du support fixe à des conditions opératoires différentes de celles des supports mobiles.
11. 11. Installation selon la revendication 10, caractérisée en ce que lesdits moyens de modifications des conditions opératoires sont des moyens d’adaptation de la température de la chambre d’élongation aux conditions thermiques d’accrochage ou de décrochage des fragments d’acides nucléiques de l’un ou l’autre des différents supports.
12. 12. Installation selon l’une quelconque des revendications 5 à 11, caractérisée en ce que la chambre d’élongation comporte un ou plusieurs conduits d’introduction des réactifs, ou solutions de lavage, ou solutions tampons dans le réseau d’alvéoles ou de nano-puits de la carte matrice, le ou les conduit(s) d’introduction étant disposé(s) entre la face, dénommée face supérieure, de ladite carte présentant les ouvertures des alvéoles ou nano-puits et un couvercle transparent aux rayonnements électromagnétiques.
13. 13. Installation selon la revendication 12, caractérisée en ce que les parois de fond des alvéoles ou nano-puits de la carte matrice comportent des orifices (27) communiquant avec un ou plusieurs conduits d’évacuation (26) de liquides disposé(s) au-dessous de la face, dénommée face inférieure, de ladite carte, les sections de passage desdits orifices présentant un diamètre inférieur à celui desdits supports mobiles, tels que des billes.
14. 14. Installation selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu’elle comporte également un dispositif de contrôle (du déroulement) de l’élongation.
15. 15. Installation selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu’elle comprend au moins un ordinateur (13) incluant le logiciel pilote qui commande le fonctionnement du dispositif de synthèse.
16. 16. Installation selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu’elle comprend plusieurs ordinateurs (13) reliés par liaison filaire ou par liaison sans fil à un serveur, et sont aptes à commander le fonctionnement du dispositif de synthèse.
17. 17. Installation selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu’elle comprend au moins un ordinateur (13) apte à permettre la manipulation virtuelle de la ou des séquences d’acide nucléiques à synthétiser.