FR2836720A1 - Dispositif d'analyse d'une molecule comprenant un support pour des molecules et une chambre de reception d'une molecule - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un dispositif d'analyse d'une molécule, comprenant : - un support (8) apte à porter au moins unemolécule fixée au support; et- une chambre (26) apte à contenir un liquide (52) en mettant le liquide en contact avec le support.La chambre est agencée pour être rigidement fixée au support.

Description

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La présente invention se rapporte à des dispositifs d'analyse de composés biologiques.

Les puces à ADN permettent de mesurer et de visualiser très rapidement les différences d'expression entre des gènes et ceci à l'échelle d'un génome complet.

Si la mise en oeuvre de la technique est assez compliquée, son principe est très simple. Cette technique consiste à placer sur une surface de quelques millimètres ou centimètres carrés plusieurs centaines de séquences d'ADN spécifiques d'un organisme donné généralement obtenues par RT-PCR (Real Time Polymerase Chain Reaction, à savoir PCR en temps réel) et appelées des sondes. On met ces fragments en contact avec une population de brins d'ADN dont on souhaite connaître la composition. L'hybridation éventuelle entre une sonde et de l'ADN étudié est alors observée, et indique la présence ou l'absence d'expression d'un gène, dans le cas d'utilisation d'ADN complémentaires issus de la retrotranscription d'ARN m, ou de l'organisme recherché dans le cas d'utilisation d'ADN extrait d'un échantillon biologique au sein du quel on recherche un pathogène.

On peut également développer des puces à protéines sur lesquelles on fixe par exemple des anticorps ou des antigènes et l'on détecte, dans l'échantillon biologique, la présence de, respectivement, l'antigène ou l'anticorps complémentaire.

On peut également fixer d'autres macromolécules et utiliser de tels supports pour déterminer la présence de ligands desdites macromolécules dans des échantillons étudiés (notamment le sang, l'urine, ou tout autre fluide biologique).

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Les puces à ADN présentent, par rapport aux méthodes classiques d'hybridation un avantage majeur : grâce aux techniques de miniaturisation, elles permettent l'hybridation simultanée d'un nombre de sondes considérable sur une surface totale utile

2 inférieure à 1 cm2. Les supports sur lesquels sont fixées les sondes se présentent sous la forme de surfaces planes ou poreuses (naturellement ou percées de puits) composées de matériaux tels que : - le verre, matériau peu onéreux, inerte et mécaniquement stable. La petite plaque de verre, substrat de la puce, peut notamment être recouverte d'une grille de PTFE (qui détermine des zones hydrophiles et hydrophobes), - les polymères qui sont à la base d'autres techniques, et plus précisément le polypyrrole, le polypropylène, le polycarbonate...

- le silicium, couramment utilisé pour la \ fabrication des puces électroniques à cause de ses propriétés semi-conductrices ; et - les métaux, notamment l'or et le platine.

Quel que soit le support choisi, il peut être traité pour former un réseau dense et régulier de microsurfaces et sur chacune de celles-ci est greffée une sonde d'ADN synthétique. A cette fin, il existe deux méthodes : le transfert de brins d'ADN obtenu par biosynthèse ou synthèse chimique ou sa synthèse chimique in situ.

La synthèse préalable à la fixation des sondes permet de fixer des sondes relativement longues, dépassant 40 nucléotides. Le transfert de ces sondes sur la puce peut se faire au moyen de micropipettes, de

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micropointes, par des dispositifs de type jet d'encre ou par adressage électrochimique. Dans ce dernier cas, la puce est composée d'un support en silicium recouvert, à chaque plot, d'une mini-électrode en or. Chaque sonde rejoint un plot particulier lorsque les mini-électrodes sont mises sous tension sélective.

La synthèse in situ : dans ce cas, la construction des sondes se fait par dépôt de couches successives des quatre bases de l'ADN sur un support en verre. C'est un masque, dont la configuration varie à chaque dépôt d'une couche, qui permet aux bases de s'empiler correctement.

Le rôle de chaque sonde est de reconnaître, dans un mélange appliqué à la surface de la biopuce, une séquence d'ADN. Généralement cette séquence est amplifiée par PCR puis marquée par fluorescence, préparée en solution et mise en contact avec la biopuce.

D'autres méthodes de marquages peuvent être utilisées. On distingue généralement trois familles : a) optiques, à savoir chimioluminescents, fluorophores, chromophores, b) radioactifs et c) électromagnétiques.

La phase d'hybridation est réalisée dans un incubateur (station fluidique) et est suivie d'un lavage destiné à débarrasser la puce des cibles nucléiques non hybridées. Elle permet de déterminer à quelle sonde s'est appariée la séquence d'ADN analysée.

La plupart des procédés reposent sur l'utilisation d'un scanner qui permet de repérer les sondes d'ADN devenues fluorescentes, c'est-à-dire ayant donné lieu à une hybridation. D'autres procédés se fondent sur les modifications des charges électriques du support en silicium où sont fixées les sondes, ou sur la différence de conductivité observée après appariement. La mesure de

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ces modifications permet de repérer les associations spécifiques entre les sondes et l'ADN cible.

Les possibilités d'utilisation des puces à ADN, protéines et autres microsystèmes (aussi appelés microarrays) sont multiples, et couvrent plusieurs domaines : - le diagnostic, notamment les immunoessais (hormone, cancer), domaine de la microbiologie (détection de l'ADN de pathogènes ou de complexe antigène/anticorps), facteurs aggravants cardiovasculaires...

- la pharmacie, notamment le criblage de produits (étude de la liaison de composés avec leurs cibles), la mise au point de médicaments (étude des effets sur l'expression de certains gènes), la pharmacogénomique (étude des variations génomiques, ponctuelles ou non, entre individus)...

- la recherche, avec des possibilités de séquençage et analyse de séquences, tri moléculaire, étude simplifiée des différentes voies métaboliques...

- l'agroalimentaire, notamment la classification de produits, l'étude de l'origine de certains ingrédients, l'étude et la caractérisation des contaminations...

- l'environnement, notamment l'étude des contaminations microbiologiques, des polluants, des plantes...

Le séquençage par hybridation (SPH) est différent de la méthode enzymatique (méthode de Sanger), qui peut être considérée comme une épellation de la séquence, c'est-à-dire une lecture base par base. Le SPH procède par lecture de petits blocs. L'analyse porte sur des sous-séquences chevauchantes qui sont lues et

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réassemblées au moyen d'un programme informatique qui reconstitue la séquence étudiée.

Le séquençage par biopuces constitue une alternative intéressante et plus précise à la méthode classique du séquençage en termes d'automatisation et de réduction des coûts et des durées d'exécution.

L'identification de cibles pour la recherche thérapeutique est effectuée par la compréhension plus fine du génome et de sa régulation apportée par les biopuces. Ainsi, grâce aux puces à ADN, ont été mis en évidence de nouveaux gènes s'exprimant spécifiquement dans le tissu cérébral de l'enfant, ou apparaissant en association à des pathologies inflammatoires rhumatismales ou intestinales. Les biopuces peuvent donc contribuer à l'identification de cibles thérapeutiques pour la recherche pharmaceutique. Elles peuvent aussi servir à déterminer la résistance aux antibiotiques de certaines souches microbiennes pour permettre de mieux lutter contre celles-ci.

La pharmacogénétique consiste à identifier les allèles impliqués dans l'efficacité (ou l'inefficacité) d'un produit, ou ses effets indésirables. Elle conduit à une meilleure compréhension des mécanismes d'action des médicaments. En montrant qu'une molécule a sur une cible une action variable, la biopuce ouvre le champ des potentiels thérapeutiques. Elle permet aussi d'identifier les effets secondaires d'un produit et, lors des essais cliniques, de faire des mesures de toxicité. Cela est fondé sur les légères différences pouvant exister dans la séquence génomique entre les différents individus.

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Le diagnostic des maladies infectieuses et génétiques s'effectue par analyse de la présence d'une séquence ou d'un antigène spécifique d'un agent infectieux donné. Les biopuces peuvent porter les déterminants spécifiques de plusieurs agents et permettre ainsi une identification rapide et précise.

Cela permet également de définir les sous-types des agents infectieux, ce qui est un avantage pour la qualité du traitement à apporter.

En dehors du secteur médical, trois secteurs industriels non négligeables offrent des débouchés aux biopuces : - L'agro-alimentaire : par exemple le suivi des bactéries productrices de ferments lactiques, ou la détection des séquences provenant d'organismes génétiquement modifiés dans les semences.

- L'environnement : l'analyse bactérienne de l'eau de consommation, la détection des agents infectieux dans l'alimentation, l'air ou l'eau (Salmonella, Listeria, Legionnella).

- La menace bactériologique ou chimique : en déterminant par avance les modifications du fonctionnement génétique des cellules immunitaires occasionnées par des agents toxiques, on peut identifier rapidement les produits chimiques (mercure, dioxine...) ou bactériologiques (bacille du charbon ou de la diphtérie...) disséminés par un éventuel agresseur.

L'apparition de nouvelles technologies a bouleversé la recherche de nouveaux médicaments dans sa phase initiale. Celle-ci inclut tout d'abord la synthèse et l'isolement de nouvelles molécules, puis leur essai sur

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des systèmes biologiques permettant de présupposer un intérêt thérapeutique éventuel.

Trois approches ont profondément transformé cette recherche.

1. Les techniques conformationnelles
La théorie des récepteurs postule que c'est l'union de la molécule de médicament avec une macromolécule (une protéine en général) qui est à l'origine de l'effet pharmacodynamique et plus généralement de la réponse thérapeutique. Cette union est fortement spécifique : seules quelques molécules privilégiées en sont capables.

On dit que le médicament est comme"la clé dans la serrure". On sait maintenant déterminer la conformation dans l'espace des protéines, notamment grâce à la radiocristallographie aux rayons X, donc celle des récepteurs. Dans certains cas, on peut donc prévoir quelles structures devront présenter les molécules pour pouvoir s'unir à eux, notamment à l'aide de la modélisation informatique (conception assistée par ordinateur).

Il est indispensable de connaître au départ le récepteur pertinent, c'est-à-dire d'avoir une hypothèse physio-pathologique et d'avoir été capable d'identifier et d'isoler la protéine qui le porte.

2. La chimie combinatoire
Il est désormais possible de synthétiser en une seule opération plusieurs centaines de molécules. C'est ce que l'on appelle la chimie combinatoire. On part de la structure de base déterminée a priori comme il vient d'être dit et l'on génère systématiquement toutes les variations possibles en greffant des radicaux chimiques, des chaînes latérales, en modifiant le squelette, etc.

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Cela se fait non plus étape par étape, mais en mettant en présence les réactifs nécessaires. On obtient ainsi d'un seul coup plusieurs centaines de molécules. Toutes les opérations, synthèse, isolement et identification, sont miniaturisées et automatisées. Le gain de temps et l'abaissement des coûts sont considérables. On peut ainsi constituer une bibliothèque de plusieurs milliers de dérivés en quelques mois.

3. Le criblage à haut débit
Le problème est alors d'identifier parmi toutes ces molécules celles qui sont pourvues des propriétés biologiques les plus intéressantes. Le gain de temps et l'augmentation de la productivité, apportés par la chimie combinatoire, l'auraient été en vain si la productivité de cette phase de repérage, appelée "criblage", n'avait pas été aussi améliorée. Aux essais longs et limités de la pharmacologie expérimentale classique, a succédé une technique qui permet d'essayer dans le minimum de temps des milliers de molécules.

Le test consiste à mettre en présence la substance à tester et un système biochimique (une enzyme par exemple) et à mesurer l'importance de la réaction éventuelle. L'essai, peut être fait simultanément avec un grand nombre de systèmes de significations très diverses. En fait, tout est miniaturisé et automatisé et toutes les opérations se déroulent sans intervention humaine.

Tout est fonction du modèle utilisé, ce qui met l'accent sur l'importance des hypothèses physiopathologiques. Les systèmes biologiques testés ne sont pas indifférents : ce sont ceux dont on pense qu'ils interviennent de manière cruciale dans le

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déterminisme de la maladie. Ainsi, cette recherche appliquée, dont les progrès sont si remarquables, elle est totalement tributaire de la recherche fondamentale en amont.

On sélectionne enfin les macromolécules les plus prometteuses, compte tenu de leurs résultats aux tests, mais aussi d'autres considérations comme leur facilité de synthèse ou leur pharmacocinétique.

Ainsi, il est essentiel de pouvoir passer au crible les nouvelles molécules réalisées par chimie combinatoire et d'obtenir les meilleures données notamment de liaison au récepteur le plus rapidement possible. On réalise alors un criblage à haut débit, consistant à identifier les molécules actives par mise en contact avec la cible biologique. Ces cibles peuvent par exemple être des protéines dont on a identifié expérimentalement l'implication dans tel ou tel processus pathologique.

Jusqu'au début des années 1990, les essais traditionnels en éprouvette permettaient à une personne de tester 2000 composés par an. L'emploi de microplaques à 96 puits a ensuite permis de réaliser 6 000 essais par jour et par robot sur une même cible. Aujourd'hui les microplaques comportent 384 puits, certaines pouvant aller jusqu'à 1 536 puits. Ces progrès ont permis de multiplier les tests et, également, de réduire les coûts car les essais sont"miniaturisés"et utilisent des volumes d'échantillons très réduits.

Le criblage à haut-débit se caractérise par l'utilisation de robots capables de gérer simultanément de grands nombres de microplaques, facilement

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manipulables et stockables, où sont effectués des milliers de tests par jour.

Le criblage à haut-débit est issu des progrès de la robotique. Il repose sur des systèmes capables de réaliser des taches séquentielles indépendantes telles que dilution, pipetage et répartition de composés dans des cupules ou puits, agitation, incubation et lecture des résultats. Ils sont pilotés par des logiciels spécifiquement adaptés au type d'analyse à réaliser. Les essais sont effectués dans des microplaques standard identifiées par un code à barres et manipulées par la "main"d'un robot : celle-ci prend la plaque vide, ajoute les réactifs nécessaires et les composés à tester, gère le temps de la réaction puis passe la plaque à un lecteur pour connaître le résultat. Pour visualiser les réactions issues de la mise en contact, dans les puits, de la molécule et de la cible, on utilise des méthodes basées sur la radioactivité ou, bien souvent, la fluorescence. Ces résultats sont stockés et analysés grâce à des ordinateurs.

Ainsi qu'on l'a vu ci-dessus, il est extrêmement important de pouvoir disposer d'un système pour étudier les liaisons entre des composés et leurs cibles, ainsi que les cinétiques de liaison. Les systèmes existant actuellement ne permettent pas d'effectuer une telle étude, dans la mesure où l'analyse des liaisons entre les macromolécules fixées sur un support solide et les macromolécules en solution est effectuée en général après plusieurs étapes de rinçage pour réduire les liaisons non spécifiques et le risque de faux-positifs. Il est donc impossible avec les systèmes actuels de pouvoir réaliser de façon simple et rapide une analyse

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de cinétique de liaison entre des molécules en solution et des molécules sur support solide.

La présente invention se propose de répondre aux besoins ainsi démontrés en fournissant un dispositif permettant d'effectuer des études de liaison de composés à grande échelle, en augmentant la vitesse et en réduisant les coûts de fonctionnement. Ce système peut être aisément automatisé et peut être mis en oeuvre pour toutes les utilisations ci-dessus énoncées.

Il est important de noter qu'aux exemples définis de façon préférentielle ci-dessous, et notamment les supports, on peut aisément substituer des supports fabriqués avec des matériaux tels que décrits ci-dessus. L'exposé qui précède n'est destiné qu'à rappeler le contexte et le domaine d'application de l'invention, en particulier la fabrication, l'utilisation et les procédés d'analyse des micro-supports biologiques.

En vue de la réalisation de ce but, on prévoit selon l'invention un dispositif d'analyse d'une molécule, comprenant : - un support apte à porter au moins une molécule fixée au support ; et une chambre apte à contenir un liquide en mettant le liquide en contact avec le support, la chambre étant agencée pour être rigidement fixée au support.

Selon les cas, on pourra prévoir que la molécule à analyser, en général une molécule organique, voire une macromolécule organique, sera fixée ou bien au support pour mise en contact avec une ou plusieurs molécules contenues dans le liquide, ou au contraire contenue initialement dans le liquide pour mise en contact avec

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une ou plusieurs molécules fixées initialement au support.

Le dispositif selon l'invention pourra présenter en outre au moins l'une quelconque des caractéristiques suivantes : - le support présente au moins deux zones aptes à porter des molécules fixées aux zones, le dispositif comprenant au moins deux chambres aptes à contenir deux liquides respectifs en mettant les liquides en contact avec les zones respectives, les chambres étant agencées pour être rigidement fixées au support ; - les molécules de chaque zone sont disposées de façon annulaire dans la zone ; - les zones appartiennent à une pièce commune d'un seul tenant ; - le support comprend un socle et des éléments de support formant chacun une des zones et aptes à être fixés au socle ; les éléments de support ont une forme de disque ; - il comporte un bâti, le support étant monté mobile par rapport au bâti, par exemple mobile à rotation par rapport au bâti, notamment autour d'un axe de rotation horizontal et/ou perpendiculaire à une épaisseur du support ; - il comprend des moyens d'entraînement du support par rapport au bâti, par exemple agencés pour coopérer avec le support sans contact, de façon électromagnétique ; - le support a une forme de disque ; - la ou chaque chambre a une forme à symétrie de révolution autour d'un axe principal de la chambre ;

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- la ou chaque chambre est fixée à demeure au support ; - la ou chaque chambre est montée mobile par rapport au support ; - il comprend un organe de compartimentation apte à être mis en contact de façon amovible avec le support ; - il comprend un bâti, l'organe de compartimentation et le support étant agencés pour être reçus dans le bâti en étant mobiles l'un par rapport à l'autre ; - il comporte un bâti présentant une enceinte apte à recevoir le support et des moyens pour introduire un liquide dans l'enceinte et/ou extraire un liquide hors de l'enceinte ; - la ou chaque chambre comprend un orifice ; l'orifice est obstrué par un élément compressible apte à être traversé par une aiguille pour qu'elle débouche dans la chambre ; - il comporte des moyens d'analyse d'une interaction de la ou de chaque molécule fixée au support avec une molécule présente dans le liquide ; - l'interaction comprend une liaison entre les molécules ; les moyens d'analyse sont agencés pour être sensibles à un rayonnement résultant de l'interaction ; - les molécules sont des acides nucléiques, des protéines, des peptides ou toute autre molécule apte à interagir avec des composés biologiques ; et - il est agencé de sorte que la molécule à analyser se trouve dans le liquide avant mise en contact

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du liquide avec le support afin qu'elle interagisse avec la molécule fixée au support.

On prévoit également selon l'invention un procédé d'analyse d'une molécule comprenant les étapes consistant à : - fixer au moins une molécule à un support ; et - mettre un liquide contenu dans une chambre en contact avec le support, la chambre étant rigidement fixée au support.

Dans un mode de réalisation, la molécule à analyser se trouve dans le liquide avant mise en contact du liquide avec le support.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront encore dans la description suivante d'un mode préféré de réalisation de l'invention et des variantes données à titre d'exemples non limitatifs. En référence aux dessins annexés : - les figures 1 et 2 sont deux vues partielles en coupe axiale d'un dispositif selon l'invention dans deux configurations différentes de fonctionnement ; - les figures 3 et 4 présentent deux possibilités pour la disposition des éléments de support sur le socle ; - la figure 5 est une vue partielle en coupe axiale d'une partie du dispositif de la figure 1 montrant l'introduction d'un échantillon dans une chambre ; - la figure 6 est une vue en coupe du dispositif de la figure 1 suivant un plan perpendiculaire à l'axe de rotation, montrant les conduits de circulation de fluide dans l'enceinte ; et

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- la figure 7 est une vue analogue à la figure 2 montrant une variante de réalisation du dispositif.

On a illustré aux figures 1 et 2 un mode préféré de réalisation du dispositif d'analyse d'une macromolécule selon l'invention. Il pourra s'agir par exemple comme expliqué plus haut d'un dispositif pour l'analyse d'un génome.

Le dispositif 2 comprend un bâti 4 définissant en son sein une enceinte fermée 6. Le dispositif comprend par ailleurs un support 8 ainsi qu'un organe de compartimentation 10, tous deux étant ici essentiellement plans. Le support 8 et l'organe 10 ont chacun ici une forme de disque et ont sensiblement même diamètre. Ils sont destinés à être disposés de façon concentrique en ayant même axe 12. Compte tenu de cette forme en disque que présentent ces deux organes dans le présent exemple, nous les appellerons dans la suite respectivement disque porte-sondes et disque de compartimentation .

Le disque porte-sonde 8 (DPS) comprend un socle 14 en forme de disque plan. Le DPS comprend également plusieurs éléments de support 16 ayant chacun en l'espèce une forme de disque plan. Le rayon de ces disques 16 est beaucoup plus petit que le rayon du socle 14 sachant que les éléments de support 16 sont destinés à être fixés les uns à côté des autres sur une même face frontale 18 du socle 14.

Le rayon des éléments de support 16 variera en fonction du nombre d'éléments que l'on souhaite disposer simultanément sur la face 18. On a illustré ainsi à la figure 3 une possibilité de réalisation dans laquelle la

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face 18 porte quatre éléments de support 16 tandis que la figure 4 présente un exemple dans lequel cette face porte dix-huit éléments de support 16.

Le nombre et les dimensions des éléments de support 16 étant déterminés, ceux-ci pourront être disposés de différentes façons sur la face 18. Ils pourront par exemple être disposés suivant une matrice rectangulaire comme c'est le cas à la figure 3. Une telle disposition facilite la manipulation et le repérage des éléments de support par des moyens robotisés. Alternativement, les éléments de support 16 pourront être disposés de sorte que leurs centres forment des cercles concentriques autour de l'axe 12 comme c'est le cas sur la figure 4.

Cette disposition permet en général d'occuper la plus grande partie de la face 18 du socle 14.

Les éléments de support 16 sont rapportés sur le socle 14 pour être fixés rigidement à celui-ci. Dans le présente exemple, ils présentent chacun sur leur face 19 demeurant libre des macromolécules de test ou sondes 20 destinées à interagir avec des macromolécules présentes dans l'échantillon liquide à analyser comme on le verra plus loin.

De préférence, les macromolécules 20, représentées par un point sur l'un des disques de la figure 3, sont disposées de façon annulaire sur la face 19 des éléments de support par référence à l'axe 22 de ceux-ci, laissant ainsi inoccupée une zone centrale du disque. Alternativement, on pourrait prévoir que l'ensemble de la surface 19 est recouverte par les macromolécules 20.

Les macromolécules sont disposées sur la face 19 préalablement à la fixation des éléments de support 16 sur le socle 14. Cette disposition est effectuée selon

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des techniques classiques connues en elles-mêmes et qui ne seront pas détaillées ici.

Pour faciliter la lecture des résultats de l'analyse comme on le verra plus loin, le socle 14 ainsi que chacun des éléments de support 16 sont réalisés suivant une technologique classique telle que celle des disques compacts (CD), des DVD (digital versatile disque), etc. permettant le codage d'un signal et sa lecture par des moyens adaptés. Les disques de type CD ont pour avantage de supporter des températures élevées compte tenu de leur réalisation en polycarbonate. De plus, ils portent des signaux d'adressage permettant le repérage des sondes 20.

Le disque de compartimentation (DC) 10 présente une face 24 destinée à s'étendre en regard de la face 18 du DPS, de façon concentrique à celle-ci. La face 24 du DC présente des chambres 26 en nombre égal au nombre des éléments de support 16 et disposées de façon homologue à la disposition des éléments de support de façon à s'étendre respectivement en regard et en correspondance avec ceux-ci. Chaque chambre 26 a en l'espèce une forme cylindrique coaxiale à l'axe 22 de l'élément de support correspondant. Dans le présent exemple, la section de la chambre 26 dans un plan perpendiculaire à l'axe 22 a une forme circulaire.

La figure 1 illustre une configuration du DC et du DPS dans lesquels ceux-ci sont éloignés l'un de l'autre tandis que la figure 2 illustre une configuration dans laquelle ils sont en contact l'un avec l'autre. Ainsi sur la figure 2, chaque chambre 26 est obturée du côté de la face 24 par l'élément de support correspondant, les macromolécules 20 s'étendant ainsi dans la chambre

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26. A l'inverse, sur la figure 1, la chambre 26 est ouverte du côté de la face 24 compte tenu de l'éloignement des éléments de support 16.

Des moyens d'étanchéité sont prévus au niveau de chaque chambre 26, par exemple sous la forme d'un joint 30, pour assurer une fermeture étanche de la chambre 26 du côté de la face 24 par l'élément de support 16 correspondant.

A son extrémité opposée à l'élément de support 16, chaque chambre 26 est obturée par la paroi du disque de compartimentation 10. Toutefois, elle présente d'une part une ouverture cylindrique 32 obturée par un élément compressible 34, par exemple en élastomère comme illustré à la figure 5. D'autre part, elle présente une deuxième ouverture 36 destinée comme on le verra plus tard à éviter les surpressions à l'intérieur de la chambre. Cette ouverture a des dimensions suffisamment réduites pour autoriser une sortie de gaz hors de la chambre tout en interdisant une sortie de liquide par cette même ouverture. Cette deuxième ouverture 36 sera de préférence disposée à proximité de l'axe 22 de la chambre, voire sur cet axe.

Le bâti 4 est dimensionné pour recevoir dans l'enceinte 6 le DC 10 ainsi que le DPS 8 aussi bien en position ouverte comme sur la figure 1 qu'en position fermée comme sur la figure 2. Le dispositif comprend des moyens de montage permettant de les maintenir l'un en regard de l'autre et de guider leur mouvement l'un par rapport à l'autre pour qu'ils puissent passer à l'intérieur de l'enceinte 6 de l'une à l'autre des deux positions.

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Le dispositif comprend des moyens d'entraînement 38 permettant de mettre l'ensemble constitué par les deux disques en rotation autour de leur axe commun 12. Ces moyens d'entraînement seront de préférence agencés pour coopérer de façon électromagnétique avec des éléments 40 disposés dans les disques afin d'entraîner ceux-ci dans l'enceinte 6 sans contact à travers la paroi du bâti.

Le dispositif comporte également des moyens 42 pour analyser une interaction éventuelle ou l'absence d'interaction entre l'une des macromolécules 20 et une macromolécule présente dans l'échantillon à analyser.

Les moyens d'analyse pourront être sensibles à un signal résultant de l'interaction, ce signal pouvant être d'ordre optique, électromagnétique ou radioactif par exemple. Cette lecture peut être effectuée à travers une fenêtre ménagée dans une des parois du bâti. Toutefois, de préférence, on ferra en sorte que le ou les matériaux du bâti, du DC 10 et du DPS 8 soient transparents au signal d'analyse pour ne pas perturber celui-ci.

Compte tenu de la mise en rotation des deux disques dans l'enceinte 6 autour de l'axe 12, il est suffisant que les moyens d'analyse 42 puissent effectuer la lecture suivant une ligne 44 s'étendant radialement par référence à l'axe 12 comme illustré à la figure 6. On pourra par exemple prévoir que les moyens de lecture 42 présentent une tête de lecture mobile le long de cette ligne 44.

Comme illustré à la figure 6, le bâti 4 comporte par ailleurs des moyens pour introduire un fluide tel qu'un liquide dans l'enceinte 6, l'en extraire, ou encore le mettre en circulation dans l'enceinte. Ces moyens comportent notamment des conduits 46 débouchant

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environ à mi hauteur de l'enceinte ou encore en partie basse de celle-ci pour faciliter l'évacuation d'un liquide hors de l'enceinte. L'enceinte pourra présenter par ailleurs une ouverture supérieure 48 permettant d'éviter les surpressions dans l'enceinte ou permettant l'évacuation d'une bulle d'air lorsque l'enceinte doit être remplie complètement avec un liquide. Ces moyens sont également agencés de façon connue et non détaillée pour permettre le cas échéant d'introduire ou d'extraire différents types de liquides dans l'enceinte.

Nous allons maintenant décrire un exemple d'utilisation du dispositif selon l'invention.

L'opérateur installe tout d'abord les macromolécules 20 sur la face 19 des éléments de support 16. Il fixe ensuite les éléments de support sur le socle 14. Puis l'opérateur accole le disque de compartimentation 10 sur le disque porte-sondes 8 ainsi constitué de façon à fermer les chambres 26.

L'opérateur introduit ensuite dans les chambres 26 respectives des échantillons liquides 52 comprenant des composés ou macromolécules à analyser. Chaque échantillon pourra comprendre par exemple une population de fragments d'ADN à analyser correspondant à un ou plusieurs génomes. La présente invention a pour avantage que plusieurs analyses différentes les unes des autres peuvent être effectuées simultanément. Ainsi, on peut analyser simultanément plusieurs échantillons suivant des modalités identiques. Par ailleurs, des analyses obéissant à des modalités d'exécution différentes peuvent être effectuées simultanément. Par exemple, dans une des chambres 26, on pourra effectuer une recherche HIV tandis qu'une autre des chambres servira en même

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temps à un typage d'EBV (Epstein Bar Virus), d'autres chambres étant par ailleurs consacrées à une recherche de Chlamydiae ou à un typage du gène CF (Cystic Fibrosis).

Dans le présent mode de réalisation, l'opérateur introduit chaque échantillon 52 dans la chambre 26 au moyen d'une seringue en perçant l'élément 34 avec l'aiguille 50 de la seringue. Celle-ci débouchant dans la chambre 26, l'échantillon 52 à analyser peut être introduit dans celle-ci comme illustré à la figure 5.

Comme on le voit, chaque chambre 26 forme un miniréacteur. Cette introduction peut se faire alors que les deux disques accolés s'étendent horizontalement avec leur axe commun 12 vertical sur un appui plan adapté.

On introduit ensuite les deux disques dans le bâti 4 comme illustré à la figure 2 et on obture celui-ci de façon adapté. Les disques sont alors verticaux avec leur axe 12 horizontal.

On actionne les moyens 38 pour mettre les deux disques formant un ensemble rigide en rotation autour de l'axe 12. Comme on le voit sur la figure 2, la quantité d'échantillon 52 introduite dans chaque chambre 26 est très inférieure au volume total de la chambre de sorte que le niveau supérieur 54 de l'échantillon ne s'étend pas jusqu'à l'axe 22 de la chambre. Compte tenu de la gravité, l'échantillon 52 demeure en partie basse de la chambre au cours de la rotation. Il est donc en contact avec la zone correspondante de l'élément de support 16.

Compte tenu de la rotation, l'échantillon parcourt la plus grande partie de la chambre et vient en contact avec l'ensemble des macromolécules disposées sur l'élément de support.

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A ce stade, on peut éventuellement ajuster la température et la faire varier au cours du temps si nécessaire pour favoriser telle ou telle réaction entre l'échantillon 52 et les sondes 20, par exemple si l'on cherche à effectuer une hybridation.

Après incubation durant une période adaptée, on ajuste la température pour que la réaction soit bloquée.

On remplit ensuite l'ensemble de l'enceinte 6 avec un liquide de lavage ayant une composition adaptée pour favoriser l'arrêt des différentes réactions et pour éviter les réactions croisées.

On sépare ensuite le disque de compartimentation du disque porte-sondes en les éloignant l'un de l'autre pour les replacer dans la configuration de la figure 1 toujours à l'intérieur de l'enceinte 6 et sans interrompre leur mouvement de rotation. Dans ces conditions, l'intégrité des mini-réacteurs formés par les chambres 26 est rompue de sorte que les échantillons individuels 52 se trouvent mélangés dans le liquide de lavage.

Celui-ci est ensuite éliminé à travers les conduits 46 et remplacé rapidement par un liquide de lavage propre pour éviter des problèmes de réactions croisées.

A ce stade, le niveau du liquide de lavage doit être tel que la totalité de la surface du disque porte-sondes se trouve immergée dans le liquide à un moment ou à un autre de la rotation. Le liquide de lavage sera de préférence apporté en flux continu pour optimiser la dissolution des réactifs résiduels et faciliter leur élimination rapide du réacteur.

A l'issue de ce lavage, les résultats de l'analyse peuvent être lus grâce aux moyens 42 qui détectent un

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rayonnement adapté résultant de l'interaction de chaque macromolécule 20 avec l'un des composés présents dans l'échantillon correspondant ou qui détectent l'absence d'une telle interaction.

Dans la configuration ouverte illustrée à la figure 1, on pourra également mettre l'ensemble des macromolécules 20 en contact avec des réactifs communs (tels que des révélateurs) et non pas seulement avec des produits de lavage.

On a illustré à la figure 7 une variante de réalisation du dispositif de l'invention. Dans la description qui va suivre, les éléments analogues à ceux de la figure 1 portent des références numériques augmentées de 100. Seule varie en l'espèce la configuration du disque de compartimentation 10 et du disque porte-sondes 8.

Dans le présent exemple, le DPS 108 et le DC 110 sont fixés rigidement l'un à l'autre et ne sont pas destinés à être rendus mobiles l'un par rapport à l'autre. De plus, ils sont constitués par une superposition de feuillets. Ainsi le DPS est constitué en l'espèce par un simple feuillet 108. Un deuxième feuillet 111 est accolé à celui-ci et présente des cavités formant les chambres 126. Un troisième feuillet 113 recouvre le deuxième feuillet. Les feuillets 108 et 113 obturent chaque chambre 126 a ses deux extrémités axiales en prenant en sandwich le feuillet 111 interposé entre ceux-ci. Le feuillet 113 présente les ouvertures 32 permettant l'introduction des échantillons dans les chambres 26. Enfin, un quatrième feuillet 115 vient recouvrir le troisième feuillet du côté opposé au

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deuxième feuillet afin d'obturer ces ouvertures. Les feuillets 111,113 et 115 forment le DC 110 tandis que le feuillet 108 constitue le DPS 108.

Le quatrième feuillet 115 est initialement séparé des trois premiers qui sont quant à eux fournis à l'opérateur en étant déjà fixés les uns aux autres.

L'opérateur remplit les chambres 126 avec les échantillons 52 en ayant préalablement disposé l'ensemble horizontalement. Il obture ensuite les ouvertures 32 avec le quatrième feuillet 115 en fixant celui-ci à l'ensemble. Il introduit enfin cet ensemble dans le bâti et effectue l'analyse comme précité.

Cette variante de réalisation est adaptée aux situations dans lesquelles il n'est pas nécessaire d'effectuer un lavage pour mener à bien l'analyse. C'est par exemple le cas lorsque le produit de réaction permet l'émission d'un signal de fluorescence indiquant sa formation ou au contraire inhibe l'émission de fluorescence. D'ailleurs, dans cette variante, il ne sera en général pas nécessaire de disposer l'ensemble DC-DPS dans une enceinte 6 particulière, le lavage étant souvent inutile. Seuls pourront être utiles les moyens d'entraînement et les moyens d'incubation.

Un avantage de l'invention est qu'elle permet d'analyser un nombre élevé d'échantillons simultanément. L'invention a pour avantage de rendre relativement simple le déroulement de l'analyse en réduisant les manipulations des macromolécules de test et des échantillons. En particulier, ceux-ci n'ont pas besoin d'être manipulés en cours d'analyse.

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Le composé présent dans le liquide sera de préférence marqué afin de pouvoir détecter sa présence à un point précis du support correspondant à une sonde donnée, ce qui renseigne sur la liaison existant entre les deux molécules. La cinétique de liaison pourra alors être étudiée en fonction de l'intensité du signal lu à une position donnée. Inversement, on peut également marquer les sondes 20 sur le support 8 de sorte qu'un signal soit émis lorsqu'un composé se lie à la sonde.

Bien entendu, on pourra apporter à l'invention de nombreuses modifications sans sortir du cadre de celleci.

Ainsi que cela est illustré dans la variante de la figure 7, on pourra prévoir plus généralement (et par exemple dans le mode de réalisation de la figure 1) que les macromolécules 20 ou sondes sont disposées directement sur le socle 14 sans utiliser des éléments de support intermédiaires 16. Toutefois, l'emploi de ces derniers introduit plus de souplesse dans la programmation des différentes analyses. Ainsi l'utilisateur pourra disposer de stocks des différents éléments de support 16 associés respectivement à des analyses classiques utilisables à la demande suivant les besoins du moment.

On pourra prévoir que chaque échantillon 52 occupe la totalité du volume de la chambre 26 associée ou tout au moins une portion suffisante de celle-ci pour qu'il recouvre totalement les sondes. Dans ce cas, la rotation du DPS n'est pas nécessaire pendant la réaction et on pourra prévoir que le disque de compartimentation est confondu avec l'une des parois du bâti 4. Dans ces conditions, seul le disque porte-sondes serait mobile

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par rapport au bâti pour permettre son éloignement du disque de compartimentation et favoriser le lavage.

De même, si le volume de chaque échantillon le permet, le dispositif peut être placé horizontalement c'est-à-dire avec son axe 12 vertical pendant la période de la réaction des échantillons sur les sondes, puis être disposé verticalement juste avant la séparation des disques et les lavages qui suivent.

Sachant que, dans le mode de réalisation des figures 1 et 2, une grande partie de chaque chambre 26 ne contient pas d'échantillon, il est possible d'effectuer en cours de réaction avec les moyens 42 une analyse des macromolécules 20 portées par les portions des éléments de support 16 non recouvertes par l'échantillon 52. Toutefois, cela nécessite d'accroître les possibilités de mouvement des moyens de lecture 42 par rapport au disque.

Bien que dans les exemples qui précédent on a décrit un organe porte-sondes et un organe de compartimentation ayant une forme de disque, celle-ci n'est pas strictement nécessaire et on pourra prévoir d'autres formes telles que des formes de polygones réguliers.

De même, indépendamment de la forme de ces organes, on pourra modifier la forme des éléments de support 16 qui n'auront pas nécessairement une forme circulaire.

Le dispositif pourra comprendre une enceinte 26 unique. Enfin, les sondes pourront être contenues initialement dans l'échantillon liquide tandis que la ou les molécules à analyser seront initialement fixées au support.

Claims (28)

Revendications

1. Dispositif d'analyse d'une molécule, comprenant - un support (8 ; 108) apte à porter au moins une molécule (20) fixée au support ; et une chambre (26 ; 126) apte à contenir un liquide (52) en mettant le liquide en contact avec le support, caractérisé en ce que la chambre est agencée pour être rigidement fixée au support.

2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support (8 ; 108) présente au moins deux zones (16) aptes à porter des molécules (20) fixées aux zones, le dispositif comprenant au moins deux chambres (26 ; 126) aptes à contenir deux liquides (52) respectifs en mettant les liquides en contact avec les zones respectives, les chambres étant agencées pour être rigidement fixées au support.

3. Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que les molécules (20) de chaque zone (16) sont disposées de façon annulaire dans la zone.

4 Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que les zones appartiennent à une pièce commune (108) d'un seul tenant.

5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 à 3, caractérisé en ce que le support (8) comprend un socle (14) et des éléments de support (16) formant chacun une des zones et aptes à être fixés au socle.

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6. Dispositif selon la revendication 5, caractérisé en ce que les éléments de support (16) ont une forme de disque.

7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comporte un bâti (4), le support (8 ; 108) étant monté mobile par rapport au bâti.

8. Dispositif selon la revendication 7, caractérisé en ce que le support (8 ; 108) est monté mobile à rotation par rapport au bâti.

9. Dispositif selon la revendication 8, caractérisé en ce que le support présente un axe de rotation horizontal (12).

10. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce que le support présente un axe de rotation (12) perpendiculaire à une épaisseur du support (8).

11. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens d'entraînement (38) du support (8) par rapport au bâti (4).

12. Dispositif selon la revendication 11, caractérisé en ce que les moyens d'entraînement (38) sont agencés pour coopérer avec le support sans contact, de façon électromagnétique.

13. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le support (8 ; 108) a une forme de disque.

14. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la ou chaque chambre (26 ; 126) a une forme à symétrie de révolution autour d'un axe principal (22) de la chambre.

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15. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que la ou chaque chambre (126) est fixée à demeure au support (108).

16. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que la ou chaque chambre (26) est montée mobile par rapport au support (8).

17. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend un organe de compartimentation (10) apte à être mis en contact de façon amovible avec le support (8).

18. Dispositif selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il comprend un bâti (4), l'organe de compartimentation (10) et le support (8) étant agencés pour être reçus dans le bâti en étant mobiles l'un par rapport à l'autre.

19. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé en ce qu'il comporte un bâti (4) présentant une enceinte (6) apte à recevoir le support (8) et des moyens (46) pour introduire un liquide dans l'enceinte et/ou extraire un liquide hors de l'enceinte.

20. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, caractérisé en ce que la ou chaque chambre (26 ; 126) comprend un orifice (32).

21. Dispositif selon la revendication 20, caractérisé en ce que l'orifice (32) est obstrué par un élément compressible (34) apte à être traversé par une aiguille (50) pour qu'elle débouche dans la chambre (26).

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22. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens (42) d'analyse d'une interaction de la ou de chaque molécule (20) fixée au support (8 ; 108) avec une molécule présente dans le liquide (52).

23. Dispositif selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'interaction comprend une liaison entre les molécules.

24. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 22 ou 23, caractérisé en ce que les moyens d'analyse (42) sont agencés pour être sensibles à un rayonnement résultant de l'interaction.

25. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 24, caractérisé en ce que les molécules (20) sont des acides nucléiques, des protéines ou de peptides.

26. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 25, caractérisé en ce qu'il est agencé de sorte que la molécule à analyser se trouve dans le liquide avant mise en contact du liquide avec le support.

27. Procédé d'analyse d'une molécule, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : - fixer au moins une molécule (20) à un support (8 ; 108) ; et - mettre un liquide (52) contenu dans une chambre (26 ; 126) en contact avec le support, la chambre étant rigidement fixée au support.

28. Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que la molécule à analyser se trouve dans le liquide avant mise en contact du liquide avec le support.