FR2823999A1 - Dispositif miniature de separation et d'isolement d'objets biologiques et utilisations - Google Patents
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Abstract
La présente invention est relative à un dispositif miniature de séparation et d'isolement d'objets biologiques, à l'utilisation d'un tel dispositif pour l'isolement, la séparation, la culture et/ ou l'analyse d'objets biologiques et à un procédé de séparation et d'isolement d'objets biologiques mettant en ouvre ce dispositif.
Description
2 5 biocapteurs.
La présente invention est relative à un dispositif miniature de séparation et d'isolement d'objets biologiques, à un procédé de séparation et d'isolement d'objets biologiques mettant en _uvre ce dispositif ainsi qu'à ses applications. La biologie, et en particulier la génomique, connaît actuellement une révolution dans la façon de générer et de traiter les données de ses analyses. Alors que de plus en plus de données de séquences génétiques sont disponibles grâce aux grands projets de séquençages des organismes, les acteurs de la biologie, du monde médical et de l'industrie pharmaceutique cherchent à intégrer l'ensemble de ces données dans
des analyses à grande échelle et multiparamétriques.
Le monde des microtechnologies, en particulier celui des microsystèmes, a les moyens de répondre à cette demande grâce à ses acquis en miniaturisation, en fonctionnalisation des surfaces, en microfluidique et en techniques
de fabrication à grande échelle et à faible coût.
Actuellement, le mariage de ces deux mondes a donné lieu à des outils d'analyse multiparamétriques connus sous le nom de puces à ADN. Ces outils sont dédiés à l'analyse de macromolécules biologiques (protéines et principalement ADN). I1 existe un nombre important de recherches de part le monde dans des domaines très variés qui intègrent, via les microtechnologies, des protocoles
biologiques à des dimensions de plus en plus réduites.
Par exemple, les plaques de microtitration sont passées d'un format standard de 96 puits à un format de 384 puis de 1536 puits au fur et à mesure des progrès de la robotique. L'utilisation de ces microtechniques de plus en plus miniaturisoes permet de diminuer les volumes des réactifs utilisés et ainsi de réduire
les coûts d'analyse.
Dans le cas particulier des puces à ADN, le principe d'analyse consiste à ordonner en matriçage X-Y des sondes nucléiques à des pas de plus en plus
petits, de l'ordre de 20 1lm.
De même, l'étape de traitement des échantillons biologiques subit la course à la réduction de taille avec l'intégration de plus en plus commune de réactions de p olyméri s ati on en chaîne (PC R) dans de s puce s à ADN ou de foncti on de I yse des cellules. C'est ainsi qu'il a déjà été proposé, notamment dans le brevet US 6,071,394 de séparer et fixer des cellules sur des puces électroniques par diélectrophorèse, les cellules en suspension dans un tampon approprié étant séparées en fonction de leurs propriétés diélectriques. Cependant cette technique ne permet pas
de séparer et d'isoler des objets biologiques uniques pour des analyses individualisées.
La tendance actuelle qui passe par une réduction des volumes de réactifs utilisés a également pour conséquence l'utilisation de tests des analytes sur des réactifs biologiques fixés sur des surfaces solides, de façon à abandonner
progressivement l'utilisation de tests en tubes avec des solutions homogènes.
C'est ainsi qu'il a déjà été proposé diverses solutions pour la fixation de molécules biologiques d'intérêt sur différents matériaux tels que le verre, le plastique ou le métal. Par exemple, pour la fixation des sondes nucléiques sur substrat, l 5 trois approches principales sont actuellement connues: - I'utilisation d'un substrat en verre recouvert de poly-L-lysine qui est un polymère présentant une affinité avec les sondes nucléiques (Schena M. et al., science, 1995, 270 (5235), 467-470), - l 'util isati on de verre recouvert d 'un s il ane fonctionnal i sé, la sonde nucléique portant alors une fonction complémentaire de façon à former une liaison covalente avec le silane (O'Donnell M.J. et al., Anal. Chem., 1997, 69, 2438-2443), - l'utilisation d'électrodes métalliques, en or par exemple, permettant la copolymérisation d'un monomère simple et d'un monomère porteur de la sonde nocléique. De même, dans le domaine de la protéomique, il a notamment été rapporté la fixation de peptides par l'intermédiaire de polymères conducteurs portant des fonctions pyrroles (polypyrroles), (Livache T. et al., Biosensors & Bioelectronics,
1998, 13, 629-634).
Il est également possible de fixer des objets blologiques vivants tels que des bactéries ou des cellules eucaryotes sur des substrats solides par différentes techniques: - greffage d'anticorps spécifiques de la cellule à fixer sur un substrat solide; il existe en effet des anticorps contre les micro-organismes couramment utilisés en biologie moléculaire (bactéries, levures), tels que les anticorps anti-E. coli 1434 vendus par la société Fitzgerald Industries International, Inc., ainsi que des anticorps contre des récepteurs de surfaces (récepteurs CD) des cellules eucaryotes supérieures lymphoïdes, - greffage de peptides spécifiques de certains types cellulaires sur le support (Holland J. et a/., Biomaterials, 1996, 17, 2147-2156), - fonctionnalisation non spécifique du support par des polymères permettant l'adbésion cellulaire (Aframian D. J. et al., Tissue Eng., 2000, 6 (3), 209 216). Ces techniques sont intéressantes dans la mesure o elles génèrent la formation de liaisons spécifiques entre l'objet biologique à fixer et le support, cependant elles nécessitent de nombreuses étapes de préparation et d'isolement avant
que ceux-ci puissent enfin être fixés individuellement sur le support.
Les Inventeurs se sont donc fixés pour but de pourvoir à un nouveau dispositif miniature de séparation et d'isolement d'objets biologiques permettant de conserver une approche matricielle à grand nombre de points dans laquelle chaque point contient un et un seul type ou catégorie de l'objet biologique, mais dans lequel les opérations préalables de préparation, de séparation ou d'isolement peuvent étre évitées ou réduites, diminuant ainsi considérablement le nombre de manipulations et
de pipetages de l'objet biologique à traiter.
La présente invention a donc pour objet un dispositif miniature de séparation et/ou d'isolement d'objets biologiques, comportant au moins une première électrode intégrée au dispositif, constitué par une structure pourvue d'une matrice de microcuvettes réactionnelles, chaque microcuvette comportant un fond sur au moins une partie duquel est fixé un réactif apte à fixer l'objet biologique à isoler de façon à co nstituer une zone de réception, caractérisé en ce l edit fond est dépourvu de trou et que la surface maximale dudit fond de chaque microcuvette est définie de manière à isoler un objet biologique unique, ladite structure étant liée à un circuit d'alimentation pour crcer une différence de potentiel entre ladite première électrode et au moins une
deuxième électrode intégrée ou externe au dispositif.
- Grâce à ce dispositif, il est désormais possible de ne fixer qu'un seul obj et biologique par microcuvette étant donné que la surface d'accroche de l'obj et biologique à fixer recouvre totalement la zone de réception, chaque microcuvette ne contenant donc qu'un seul type d'objet biologique sélectionné et fixé qui peut ensuite être traité collectivement. Par conséquent, selon l'invention, la zone d'accroche de l'objet biologique à fixer a soit une surface sensiblement identique à la surface de la zone de
réception, soit une surface supérieure à la surface de la zone de réception.
S el on l' invention, la surfac e maximale du fond de chaque microcuvette est de préférence inférieure ou égale à deux fois la plus petite surface de l'objet biologique à isoler. Dans une forme de mise en _uvre préférée de l'invention, la surface dudit fond est inférieure ou égale à la plus petite surface de l'objet
biologique à isoler.
Plus particulièrement, cette surface est généralement comprise entre
1 pm2 et 400 rm2, notamment entre 1 et 50 1lm2.
Selon l'invention, la surface maximale du fond de chaque microcuvette est de préférence inférieure à la plus petite surface de l'objet biologique à isoler. Selon l'invention, un objet biologique est caractérisé par son contenant et son contenu. Le contenant correspond à tout élément permettant de compartimenter le contenu. Le contenant peut par exemple être la paroi d'une cellule bactérienne, l'enveloppe d'un virus, la membrane d'une cellule, une double couche lipidique, des micelles, une bicouche phospholipidique traversce par des protéines intrinsèques, etc. le contenu correspond au matériel biologique isolé dans un compartiment qu'est le contenant. Le contenu peut par exemple correspondre à des acides nucléiques, des protéines, des ribosomes, des vésicules membranaires ou à un
mélange complexe de ceux-ci.
A titre d'exemple d'objet biologique, on peut citer toute cellule, saine ou non, qu'elle soit procaryote ou eucaryote, les virus, les liposomes, etc A titre d'exemple de cellule, on peut citer les bactéries, les levures, les champignons, les microalgues et également des cellules d'origine végétale,
animales et humaines.
A titre d'exemple de virus, on peut citer le virus HIV, les bactériophages, etc Le dispositif conforme à l'invention peut être avantageusement utilisé dans le domaine de l'analyse cellulaire par fixation d'un seul objet biologique d'intérêt sur la zone de réception qui constitue en fait une zone piège ou par fixation ultérieure d'un ou plusieurs éléments dérivés de l'objet biologique d'intérêt préalablement fixé, ces dérivés incluant les produits issus de la Iyse éventuelle des objets biologiques, de leur traitement par PCR localisée ou tout autre traitement biologique, chimique ou électrique. Lorsque ces dérivés correspondent à des acides nucléiques, on parle de puces à ADN et lorsque ces dérivés correspondent à des
protéines, on parle de puces à protéines.
La matrice de microcuvettes réactionnelles peut être surmontée au moins en partie d'une ou plusieurs couches de matériaux isolants et/ou d'une grille en plastique biocompatible rapportée, de façon à former une matrice de microréservoirs, chaque microréservoir contenant au moins une microcuvette. Ces microréservoirs
peuvent par exemple être réalisés par lithogravure de la couche de matériau isolant.
Les matériaux isolants peuvent par exemple étre choisis parmi les polymères isolants tels que les polyimides et les résines telles que par exemple les
résines SU-g.
La taille des microréservoirs est définie de manière à traiter, dans un volume minimal, I'objet biologique unique isolé. Ces microréservoirs ont généralement une largeur et/ou une longueur comprise entre 5 et 500 m et
préDérentiellement entre 5 et 100 1lm.
Selon une forme de réalisation particulière de l'invention, le dispositif miniature peut être comporter une alternance de couches conductrices
(électrodes) et de couches de matériaux isolants.
Selon une forme de réalisation de l'invention, une face de la
première électrode intégrée au dispositif peut constituer le fond des microcuvettes.
Selon une autre forme de réalisation de l'invention, le fond des microcuvettes du dispositif est constitué par une couche en verre, en plastique ou en .. slcum. Lorsque le dispositif conforme à l'invention comporte une deuxième électrode intégrée, celle-ci est déposée sur une première couche de matériau isolant et
est située dans un plan espacé du fond des microcuvettes.
Lorsque le dispositif conforme à l'invention comporte une deuxième électrode externe, celle-ci peut être solidaire d'un capot ou d'un couvercle, de
prétérence constitué par une ou plusieurs couches de matériau isolant.
Par conséquent une des couches de matériaux isolants peut ne pas faire partie intégrante du dispositif conforme à l'invention mais se présenter sous la forme d'une pièce rapportée amovible (cache, capot, couvercle) venant recouvrir au
moins en partie ledit dispositif et contenant éventuellement au moins une électrode.
Le dispositif conforme à l'invention peut aussi comporter au moins une troisième électrode intégrée au dispositif, une deuxième couche de matériau isolant étant interposée entre la deuxième et la troisième électrode. Dans ce cas, et selon une variante de l'invention, le dispositif peut comporter plusieurs deuxièmes
et/ou troisièmes électrodes isolées entre elles.
Le dispositif conforme à l'invention peut également être équipé d'un
circuit intégré de multiplexage d'au moins certaines desdites électrodes.
Le circuit de multiplexage intégré à ce dispositif peut servir à différentes fonctions: fixation de différents réactifs au sein d'un même dispositif, chauffage isolé des zones de réception, mesure locale de pH, lecture d'un signal électrique, etc. Dans les dispositifs conformes à l'invention, au moins un bord d'une des deuxièmes et/ou troisièmes électrodes et/ou d'une des premières et/ou deuxièmes couches de matériaux isolant peut constituer au moins une partie d'un bord d'un
microréservoir.
Selon l'invention, les premières, deuxièmes et troisièmes électrodes, ainsi que l'électrode externe sont constituces par au moins une couche métallique par
exemple en chrome, en or ou en platine.
Ces couches métalliques ont en général une épaisseur comprise entre
0,1 et 10 1lm.
La nature du réactif utilisé pour la fixation des objets biologiques peut varier en fonction de la nature des objets à fixer et de la nature du fond des microcuvettes. En effet, lorsque le fond des microcuvettes est constitué par une électrode telle que décrite ci-dessus, le réactif utilisé est de prétérence choisi parmi les copolymères conducteurs, tels que par exemple les polypyrroles, sur lesquels sont fixés des protéines, des peptides ou toutes molécules spécifiques du type d'objet biologique à fixer telles que par exemple des anticorps, des récepteurs, des glycoprotéines, des lectines, des molécules d'adhésion cellulaire ("Cell Adhesion Molecules": CAM), la laminine, la fibronectine, les intégrines, les sucres, etc Les copolymères conducteurs sont par exemple décrits dans la
demande internationale WO 94/22889.
Les poly pyrroles sont particulièrement préférés selon l'invention.
Les molécules spécifiques fixces sur les monomères du copolymère conducteur peuvent notamment être choisies parmi la protéine A, la protéine G. la fibrone ctine et p lus généralement, parmi le s protéines d'adhés ion ce llul aire et le s
anticorps dirigés contre des récepteurs de surface.
La fixation de ces molécules sur les monomères du copolymère conducteur et en particulier sur les monomères pyrroles peut être effectuée suivant différentes techniques: - soit les molécules spécifiques sont fixées directement sur les monomères d'un polymère conducteur lesdits monomères étant porteurs de fonctions -NHS ou aldéhydes capables de réagir avec les fonctions amines primaires de la molécule utilisée, - soit les molécules spécifiques sont fixées indirectement sur les monomères d'un polymère conducteur porteur de la fonction biotine, au moyen d'un empilement chimique successif streptavidine-biotine-molécule spécifique. Pour réaliser cet empilement chimique, le dispositif conforme à l'invention est alors traité collectivement de façon à réaliser la copolymérisation des monomères du polymère conducteur porteur de la fonction biotine, puis à traiter ledit dispositif par de la streptavidine puis avec une molécule spécifique lice à la biotine, pour obtenir des
copolymères pyrrole-biotine-streptavidine-biotine-molécule spécifique.
Dans une première forme de mise en _uvre, le réactif utilisé pour fixer l'objet biologique peut étre spécifique de celui-ci pour permettre une interaction
directe: réactif de la microcuvette-objet biologique.
Dans une deuxTème forme de mise en _uvre, le réactif utilisé n'est pas spécifique de l'objet biologique. Ce dernier devra donc être fonctionnalisé. A cet effet, les objets biologiques à fixer pourront, par exemple, être préalablement fonctionnalisés par des anticorps spécifiques pouvant réagir avec les réactifs utilisés. Dans ce cas, la protéine A ou G fixée uniquement sur la zone piège par l'intermédiaire du polymère conducteur, va reconnaître le fragment Fc des
anticorps fixés préalablement sur les objets à immobiliser.
Parmi les peptides pouvant être fixés sur les monomères du copolymère conducteur, on peut notamment citer les peptides de liaison spécifiques des récepteurs membranaires de surface de l'objet biologique à fixer, tels que par exemple des peptides contenant la séquence arginine-glycineaspartate (RGD) et qui ont une affinité pour les intégrines (protéines d'adhésion cellulaire à Ia surface des
cellules eucaryotes).
Lorsque le fond des microcuvettes est constitué par une couche en verre, en plastique ou en silicium, le réactif utilisé est de prétérence: - un polymère non spécifique du type d'objet à fixer tel que par exemple de la poly-L-lysine ou de la fibronectine; ledit polymère étant déposé
localement sur les zones de réception (technique "lift-off': dépôt d'une résine photo-
imageable, insolation localisée puis dépôt du polymère sur la résine, puis déLlocage de la résine), - une protéine ou un peptide; dans ce cas les protéines et les peptides sont fixés à ladite couche en verre, en plastique ou en silicium recouverte d'une couche de silane modifié par des fonctions -NHS ou aldéhydes sur lesquelles est fixé ledit réactif; les protéines et les poptides utilisés dans ce cas étant de même
nature que ceux décrits ci-dessus.
Ainsi que décrit ci-dessus, le dispositif conforme à l'invention peut comporter plusieurs premières et/ou deuxièmes et/ou troisièmes électrodes. Ces électrodes peuvent être so it indépendantes, microréservo ir par microréservoir, pour permettre la lecture d'un signal électrique en réponse à une réaction ayant eu lieu dans la microcuvette, soit reliées entre elles pour permettre un traitement identique dans toutes les microcuvettes, tel que par exemple l'application d'un champ électrique de
lyse des objets biologiques ou un champ électrique de copolymérisation.
Les différents niveaux d'électrodes peuvent permettre la fixation S spécifique des objets biologiques, puis une fois les objets fxés dans les microcuvettes, la lyse de ces objets puis, lorsqu'il s'agit par exemple de cellules biologiques, la fixation par copolymérisation électrique des sondes nucléiques issues d'une amplification nucléotidique effectuée directement dans chacun des microréservoirs, de
façon à obtenir des microréservoirs porteurs de sondes nucléiques en grande quantité.
Lorsque le dispositif conforme à l'invention est équipé d'un circuit intégré de multiplexage, il est alors possible de prévoir la fixation de réactifs différents dans les microcuvettes d'un même dispositif et le traitement de l'ensemble des signaux
émis par les électrodes de chaque microréservoir.
Lorsqu'il est équipé d'un circuit intégré de multiplexage, le dispositif conforme à l'invention peut donc comporter des microcuvettes renfermant des réactifs différents de façon à permettre la fixation d'objets biologiques de types différents sur
un seul dispositif.
La présence d'électrodes associces à un circuit intégré de multiplexage permet également la détection électrique au niveau d'une microcuvette ou d'un microréservoir, cette détection étant par exemple associée au suivi du comportement électrique d'un objet biologique ou du relargage de molécules en
réponse à une agression chimique ou physique.
Le dispositif miniature conforme à l'invention peut être équipé d'un moyen de fermeture, tel que par exemple un capot ou un film transparent, permettant
d'obturer individuellement ou collectivement tous les microréservoirs.
D'autres caractéristiques du dispositif miniature conforme à l'invention apparaissent sur les 1 à 9 annexées dans lesquelles: - la figure 1 représente un dispositif miniature selon l'invention, équipé d'un support 7 et d'un circuit d'alimentation électrique 103, dans lequel le fond de chaque microcuvette S est constitué par une première électrode 1 formant une zone de réception 9 sur laquelle est fixé un réactif, la première électrode 1 étant surmontée par une première couche de matériau isolant 2 sur laquelle repose une deuxième électrode 3 surmontée d'une deuxième couche de matériau isolant 4 formant des microréservoirs 6, - la figure 2 représente un dispositif miniature selon l'invention, équipé d'un support 27 et d'un circuit d'alimentation électrique 103, dans lequel le fond de chaque microcuvette 25 est constitué par une première électrode 21 formant une zone de réception 29 sur laquelle est fixé un réactif, la première électrode 21 étant surmontée par une première couche de matériau isolant 22 sur laquelle repose une deuxième couche de matériau isolant 24 formant des microréservoirs 26, ce dispositif étant équipé d'une électrode externe 28, - la figure 3 représente un dispositif miniature selon l'invention, équipé d'un support 37 et d'un cTrcuit d'alimentation électrique 103, dans lequel le fond de chaque microcuvette 35 est constitué par une première électrode 31 formant une zone de réception 39 sur laquelle est fixé un réactif, la première électrode 31 étant surmontée par une première couche de matériau isolant 32 sur laquelle repose une deuxième électrode 33 surmontée d'une deuxième couche de matériau isolant 34 formant des microréservoirs 36, ce dispositif étant équipé d'une électrode externe 38, - la figure 4 représente un dispositif miniature selon l'invention, équipé d'un support 47 et d'un circuit d'alimentation électrique 103, contenant une pluralité de premières électrodes 41 électriquement isolées entres elles et dans lequel le fond de chaque microcuvette 45 est constitué par une première électrode 41 formant une zone de réception 49 sur laquelle est fixé un réactif, les premières électrodes 41 étant en partie surmontées par une première couche de matériau isolant 42 sur laquelle repose une deuxième électrode 43 surmontée d'une deuxième couche de matériau isolant 44 formant des microréservoirs 46, ce dispositif étant équipé d'une électrode externe 48, - la figure 5 représente un dispositif miniature se lon l ' invention, équipé d'un support 50 et d'un circuit d'alimentation électrique 103, contenant une pluralité de premières électrodes 51 électriquement isolées entres elles et dans lequel le fond de chaque microcuvette 55 est constitué par une première électrode 51 formant une zone de réception 59 sur laquelle est fixé un réactif, les premières électrodes 51 étant en partie surmontées par une première couche de matériau isolant 52 sur laquelle repose une deuxième électrode 53 surmontée d'une deuxième couche de matériau isolant 54 formant des microréservoirs 56, ce dispositif étant équipé d'une électrode externe 58 et d'un circuit intégré de multiplexage 104, - la figure 6 représente un dispositif miniature selon l'invention, équipé d'un support 67, dans lequel le fond de chaque microcuvette 65 est constitué par une première électrode 61 formant une zone de réception 69 sur laquelle est fixé un réactif, la première électrode 61 étant surmontée par une première couche de matériau isolant 62 sur laquelle repose une deuxième électrode 63 surmontée d'une deuxième couche de matériau isolant 64 elle-même surmontée par une troisième électrode 101 sur laquelle repose une troisième couche de matériau isolant 102 formant des microréservoirs 66, - la figure 7 représente un dispositif miniature selon 1'invention identique à celui représenté sur la figure 1 sauf qu'il comporte en outre un moyen de fermeture amovible 100 permettant de fermer chacun des microréservoirs 76, - la figure 8 représente un dispositif miniature selon l'invention identique à celui représenté sur la figure 5 sanf qu'il comporte en outre un moyen de fermeture amovible 100 permettant de fermer chacun des microréservoirs 86 dans lequel est intégré une électrode externe 88, - la figure 9 représente un dispositif miniature selon 1'invention, équipé d'un support 97 et d'un circuit d'alimentation électrique 103, dans lequel le fond de chaque microcuvette 95 est constitué par une couche de verre ou de silicium 93 formant une zone de réception 99 sur laquelle est fixé un réactif, ladite couche de verre ou de silicium 93 étant surmontée par une première couche de matériau isolant 92 formant des microréservoirs 96 sur laquelle repose une première électrode 91 elle méme surmontée par une deuxième couche de matériau isolant 94, ce dispositif étant
équipé d'une électrode externe 98.
Il est bien sûr entendu que les dispositifs illustrés sur ces figures correspondent à des formes particulières de réalisation de l'invention et n'en
constituent en aucune façon une limitation.
Les procédés de fabrication de tels dispositifs sont connus et décrits
par exemple dans la demande de brevet FR-A-2 781 886.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un dispositif miniature conforme à l'invention pour l'isolement, la séparation, la culture
et/ou l'analyse d'objets biologiques.
A titre d'exemple, les dispositifs miniatures conformes à l'invention, et en particulier les dispositifs du type de ceux représentés par la figure 2 peuvent être utilisés pour fixer un objet biologique unique par microcuvette tel que par exemple une cellule blologique, ces cellules étant ensuite cultivées directement sur le dispositif pour amplifier les cellules par divisions cellulaires successives. On obtient ainsi un dispositif comportant une population homogène de cellules dans chaque microréservoir. Les cellules filles issues des divisions cellulaires peuvent ensuite étre
récupérées alors que les cellules mères restent fixces sur le fond des microcuvettes.
Les dispositifs conformes à l'invention permettent donc de ne récupérer que des cellules filles correspondant par conséquent uniquement aux lignées cellulaires capables de se diviser. Cette utilisation est intéressante dans la mesure o elle permet d'éliminer les cellules mortes d'une culture bactérienne transformées par
des plasmides et traitées par un antibiotique.
Les dispositifs conformes à l'invention peuvent également être utilisés comme moyen d'analyse du contenu d'un panel hétérogène de cellules, par immobilisation de cellules différentes dans une matrice ordonnée à raison d'une cellule par microcuvette, puis extraction des macromolécules que l'on souhaite analyser. Dans cette optique, on peut - soit utiliser des dispositifs munis d'une pluralité de premières électrodes indépendantes tels que les dispositifs des figures 4 et 5, pour fixer des réactifs différents spécifiques de chaque type de cellules à immobiliser, - soit utiliser un dispositif tel que celui de la figure 9 comportant des microcuvettes dont le fond est constitué par une couche en verre porteur d'une fonction chimique de couplage ou un dispositif tel que ceux représentés par les figures 1 et 3, et pipeter localement des réactifs spécifiques en fonction de chaque type de
cellule à immobiliser.
L'immobilisation des cellules se fait ensuite par exemple par trempage du dispositif dans une culture hétérogène de cellules ou par trempages successifs dans différentes cultures de cellules homogènes, la présence de réactifs
spécifiques à chaque type de cellules permettant d'ordonner la matrice de cellules. La deuxième électrode présente dans tous les dispositifs utilisés pour
immobiliser ces cellules peut être soit pré-fonctionnalisée collectivement (par exemple par des anticorps spécifiques pour extraire de chaque type cellulaire un type de protéine), soit plus généralement être utilisée pour fxer par électrochimie un produit
issu de la cellule à la suite par exemple d'une réaction de PCR.
Les dispositifs illustrés sur les figures 4 et 5 peuvent également être utilisés pour réaliser un criblage à haut déLit (High Throughput Screening: HTS) de réactifs chimiques ou biologiques sur les cellules. Dans ce cas, la pluralité de premières électrodes indépendantes permet une mesure électrique individualisée en réponse à l'action de réactifs chimiques ou biologiques sur les cellules dans les microréservoirs. Ces criblages HTS peuvent être effectués sur des cellules animales en culture et dans ce cas, la surface du fond des microcuvettes est égale ou inférieure à la plus petite section des cellules à tester, soit environ lOO 1lm2 pour des cellules
animales classiques.
De plus, les dispositifs conformes à l'invention peuvent être utilisés
pour effectuer une électroporation fugace des cellules.
L'invention a aussi pour objet un procédé de séparation et/ou d'isolement d'objets biologiques caractérisé en ce qu'il consiste: - dans une première étape, à mettre en contact au moins un dispositif miniature tel que défini précédemment, avec une solution d'objets biologiques homogénéisée, en particulier avec une solution de culture de cellules biologiques, pour permettre la fixation desdits objets au fond des microcuvettes sur les zones de réception, à raison d'au plus un objet biologique par microcuvette, - puis dans une deuxième étape, à laver les objets biologiques non fixés, de façon à obtenir un dispositif miniature sur lequel sont immobilisées les objets
à isoler.
Les objets biologiques ainsi isolés et fixés sur le dispositif peuvent ensuite être étudiés selon les techniques décrites précédemment, par exemple par
mesure de la variation leurs propriétés électriques sous l'effet d'un principe actif.
Lorsque le dispositif miniature utilisé selon ce procédé comporte un circuit de multiplexage, il est alors possible d'effectuer des mesures électriques
individualisées dans chaque microcuvette.
Le procédé conforme à l'invention peut éventuellement comporter une troisième étape au cours de laquelle les objets fixés au fond des microcuvettes, notamment lorsqu'il s'agit de cellules biologiques, sont Iysés de façon à libérer le matériel génétique qu'ils contiennent dans le microréservoir correspondant à la
microcuvette o ils ont été fixés.
La lyse des objets fixés peut être effectuée par choc électrique, choc
thermique ou sonication.
Le matériel génétique ainsi libéré peut ensuite, dans une quatrième étape, être arnplifié collectivement par PCR par introduction dans les microcuvettes des différents réactifs nocessaires à une réaction de PCR, ces réactifs comprenant notamment au moins une amorce fonctionnalisée par des groupements pyrrole. Les séquences amplifiées ainsi obtenues sont ensuite fixées, lors d'une cinquième étape,
sur une électrode par électropolymérisation, de manière collective.
Selon une forme de réalisation particulière de ce procédé, les
troisième et quatrième étapes peuvent être réalisées simultanément.
Selon encore une autre forme de réalisation particulière de l'invention, et lorsque l'on utilise des dispositifs tels que ceux illustrés par les figures 1 et 3 ou un dispositif tel que celui représenté par la figure 9, il est possible d'utiliser ces dispositifs comme outil de criblage pour la recherche de ligands protéiques ou
nucléotidiques d'une cible donnée.
Dans le cas de la recherche d'un ligand protéique, la culture cellulaire de départ est alors une banque cellulaire d'expression et on procède à
l'immobilisation des cellules de la banque comme décrit précédemment.
Les dispositifs utilisés selon cette variante sont préalablement fonctionnalisés par la cible au niveau d'une électrode. La cible peutêtre une molécule telle qu'un peptide, une protéine, une séquence nucléotidique, un poptidoglycane, un sucre ou encore toute autre molécule chimique. Cette cible peut également être fo nctionnal i s ée par un groupement pyrro le et être ainsi fixée sur une él ectro de par électropolymérisation. Dans chaque microcuvette, une protéine recombinante va être exprimoe par la cellule immobilisée et libérée de la cellule, soit par sécrétion, soit par la lyse de la cellule. Pendant cette expression au sein de chaque cellule, il est possible d'incorporer des précurseurs protéiques marqués (tels que par exemple la méthionine S35) de façon à ce que la protéine ainsi exprimée soit, elle aussi, marquée. Les protéines montrant une affinité avec la cible vont se fixer spécifiquement sur l'électrode fonctionnalisée avec la cible. Si les protéines ont été marquées pendant leur expression, on peut alors procéder à leur détection. Sinon, la détection de l'interaction protéine/ligand doit être effectuée selon une étape supplémentaire consistant par exemple à faire réagir un anticorps anti-épitope universel marqué, et dans ce cas, il faut utiliser une banque d'expression exprimant toutes les protéines recombinantes avec cet épitope universel Les puits positifs contiennent ainsi les ligands protéiques potentiels de la cible. Le niveau d'affinité de ce ligand peut par exemple être estimé au moyen de lavages successifs de plus en plus stringents ou par compétition avec d'autres ligands connus. Une fois la réaction telle que décrite ci-dessus effectuée, il reste à
récupérer les clones correspondant aux puits positifs.
Si la cellule immobilisée est encore viable, cette récupération peut se faire par simple mise en culture du dispositif et pipetage des cellules filles dans les
puits positifs comme décrit précédemment.
Si la réaction telle que décrite ci-dessus est délétère pour la division cellulaire, on aura pris soin au préalable de faire une duplication du dispositif initial
contenant les cellules individualisces de la banque (puce A).
Une méthode de duplication consiste par exemple à mettre en culture la puce A puis de transtérer de manière dirigée les cellules flles vers un nouveau dispositif identique (puce B), les microréservoirs de la puce A étant
éventuellement mis en vis à vis avec les microréservoirs de la puce B. sous agitation.
La puce A subit alors le traitement tel que déQrit précédemment afin de déterminer les puits contenant le ligand protéique d'intérêt tandis que la puce B permet de récupérer les clones correspondant à ces puits positifs, par exemple par pipetage. A titre d'exemple de cette forme de réalisation particulière de l'invention, la banque cellulaire d'expression est une banque d'expression, sécrétrice d'anticorps ou de sous-domaines d'anticorps. La cible fixce sur l'électrode est une protéine, un peptide, un virus, un oligonucléotide, contre lequel on cherche un anticorps. :. f
Claims (33)
1. Dispositif miniature de séparation et/ou d'isolement d'objets biologiques comportant au moins une première électrode intogrée au dispositif, constitué par une structure pourvue d'une matrice de microcuvettes réactionnelles, chaque microcuvette comportant un fond sur au moins une partie duquel est fixé un réactif apte à fixer l'objet biologique à isoler de façon à constituer une zone de réception, caractérisé en ce ledit fond est dépourvu de trou et que la surface maximale dudit fond de chaque microcuvette est définie de manière à isoler un objet biologique unique, ladite structure étant liée à un circuit d'alimentation pour créer une différence de potentiel entre ladite première électrode et au moins une deuxième électrode
intégrée ou externe au dispositif.
2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la surface maximale du fond de chaque microcuvette est de prétérence inférieure ou
égale à deux fois la plus petite surface de l'objet biologique à isoler.
3. Dispositif selon la revendication 2, caractérisé par le fait que la surface dadit fond est inférieure ou égale à la plus petite surface de l'objet biologique à isoler.
4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications l à 3,
caractérisés par le fait que la surface maximale du fond de chaque microcuvette est
comprise entre 1 pm2 et 400 m2.
5. Dispositif selon la revendication 4, caractérisée par le fait que la
surface maximale du fond de chaque microcuvette est comprise entre l et 50 1lm2.
6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précèdentes,
caractérisé par le fait que la matrice de microcuvettes réactionnelles est surmontée au moins en partie d'une ou plusieurs couches de matériaux isolants et/ou d'une grille en
plastique biocompatible rapportée, de façon à former une matrice de microréservoirs.
7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes,
caractérisé par le fait qu'une face de la première électrode intogrée au dispositif
constitue le fond des microcuvettes.
8. Dispositif selon l'une quelconque des revendications l à 6,
caractérisé par le fait que le fond des microcuvettes est constitué par une couche en
verre, en plastique ou en silicium.
9. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 6 à 8,
caractérisé par le fait que les matériaux isolants sont choisis parmi les polyimides et ,.
es resmes.
10. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 6 à 9,
caractérisé par le fait que les microréservoirs présentent une largeur et/ou une
longueur comprise entre 5 et 500 m.
11. Dispositif selon l'une quelcouque des revendications
précédentes, caractérisé par le fait qu'il comporte plusieurs dites premières électrodes
électriquement isolées entre elles.
12. Dispositif selon l'une quelcouque des revendications
précédentes, caractérisé par le fait que la deuxième électrode est intégrée au dispositif et qu'elle est déposée sur une première couche de matériau isolant et située dans un
plan espacé du fond desdites microcuvettes.
13. Dispositif selon l'une quelconque des revendications
précédentes, caractérisé par le fait qu'il comporte au moins une troisième électrode intégrée au dispositif, une deuxième couche de matériau isolant étant interposée entre
la deuxième et la troisième électrode.
14. Dispositif selon la revendication 13, caractérisé par le fait qu'il
comporte plusieurs dites deuxièmes etlou troisièmes électrodes isolées entre elles.
15. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 11,
caractérisé par le fait que la deuxième électrode est externe est qu'elle est solidaire
d'un capot ou d'un couvercle.
16. Dispositif selon l'une quelconque des revendications
précédentes, caractérisé par le fait qu'il est équipé d'un circuit intégré de multiplexage
d'au moins certaines desdites électrodes.
17. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 7 et 9 à 16,
caractérisé par le fait que ledit réactif est choisi parmi les copolymères conducteurs sur lesquels sont fixés des protéines, des peptides ou toutes molécules spécifiques du
type de cellule à fixer.
18. Dispositif selon la revendication 17, caractérisé par le fait que les
copolymères conducteurs sont choisis parmi les polypyrroles.
. 19. Dispositif selon la revendication 17 ou 18, caractérisé par le fait que le réactif est un copolymère pyrrole-biotine-streptavidine-biotinemolécule - specfique.
20. Dispositif selon la revendication 8, caractérisé par le fait que ledit réactif est choisi parmi des polymères non spécifiques du type de cellule à fixer.
21. Dispositif selon la revendication 20, caractérisé par le fait que
lesdits polymères sont de la poly-L-lysine.
22. Dispositif selon la revendication 8, caractérisé par le fait que le réactif est une protéine ou un peptide et que ladite couche en verre, en plastique ou en silicium est recouverte d'une couche de silane modifié par des fonctions -NHS ou
aldéhydes sur lesquelles est fxé ledit réactif.
23. Dispositif selon la revendication 16, caractérisé par le fait qu'il
comporte des microcuvettes renfermant des réactifs différents.
24. Dispositif selon l'une quelconque des revendications
précédentes, caractérisé par le fait qu'il est équipé d'un moyen de fermeture.
25. Utilisation d'au moins un dispositif miniature tel que défini à
l'une quelconque des revendications précédentes, pour l'isolement, la séparation, la
culture et/ou l'analyse d'objets biologiques.
26. Procédé de séparation et/ou d'isolement d'objets biologiques caractérisé en ce qu'il consiste: - dans une première étape, à mettre en contact au moins un dispositif
miniature tel que défini à l'une quelconque des revendications l à 24 avec une solution
d'objets biologiques homogénéisée, en particulier avec une solution de culture de cellules biologiques, pour permettre la fixation desdits objets au fond des microcuvettes sur les zones de réception, à raison d'au plus un objet biologique par microcuvette, - puis dans une deuxième à étape à laver les objets biologiques non fixés, de facon à obtenir un dispositif miniature sur lequel sont immobilisés les objets
à isoler.
27. Procédé selon la revendication 26, caractérisé par le fait que l'on utilise un dispositif comportant des microréservoirs et qu'il comporte une troisième étape au cours de laquelle les objets fixés au fond des microcuvettes sont lysés de taçon à libérer le matériel génétique qu'ils contiennent dans le microréservoir
correspondant à la microcuvette o ils ont été fixés.
28. Procédé selon la revendication 27, caractérisé par le fait qu'il comporte une quatrième étape au cours de laquelle le matériel génétique libéré est amplifié par PCR.
29. Procédé selon la revendication 28, caractérisé par le fait que les
troisième et quatrième étapes sont réalisées simultanément.
30. Procédé selon la revendication 28 ou 29, caractérisé par le fait que les séquences amplifiées sont fixées, lors d'une cinquième étape, sur une électrode
par électropolymérisation.
31. Procédé selon l'une quelcouque des revendications 26 à 30,
caractérisé par le fait que le dispositif utilisé comporte un circuit de multiplexage et
que des mesures électriques individualisées sont effectuées dans chaque microcuvette.
32. Procédé selon l'une quelconque des revendications 26 à 31,
caractérisé par le fait que le dispositif utilisé comporte un circuit de multiplexage et
que les objets biologiques à isoler sont issus d'un panel hétérogène de cellules.
33. Utilisation d'au moins un dispositif tel que défini à l'une
quelconque des revendications 1 à 24, comme outil de criblage pour la recherche de
ligands protéiques ou nucléctidiques d'une cible donnée.
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