FR2835615A1

FR2835615A1 - Dispositif d'analyse d'une molecule au moyen d'un fluide venant en contact avec un support portant une molecule

Info

Publication number: FR2835615A1
Application number: FR0202628A
Authority: FR
Inventors: Antonios Vekris
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-02-07
Filing date: 2002-03-01
Publication date: 2003-08-08
Anticipated expiration: 2022-03-01
Also published as: FR2835615B1; WO2003066218A1; AU2003226866A1

Abstract

Le dispositif d'analyse d'une molécule comprend une enceinte (4), un support (6) apte à recevoir une molécule et des moyens pour mettre le support en contact avec un fluide apte à interagir avec la molécule.Le dispositif est agencé de sorte que le fluide forme un bain (32) dans l'enceinte, le support étant monté mobile dans l'enceinte de sorte qu'au moins certains portions du support s'étendent dans le bain puis hors du bain suivant une alternance temporelle.

Description

La présente invention se rapporte à l'analyse de molécule, en particulier de macromolécules biologiques.

Elle vise notamment des procédés de mesure de la liaison de composés avec des macromolécules biologiques, ainsi que des dispositifs permettant de mettre en oeuvre ces procédés.

Les puces à ADN permettent de mesurer et de visualiser très rapidement les différences d'expression entre des gènes et ceci à l'échelle d'un génome complet.

Si la mise en oeuvre de la technique est assez compliquée, son principe est très simple. Cette technique consiste à placer sur une surface de quelques millimètres ou centimètres carrés plusieurs centaines de séquences d'ADN spécifiques d'un organisme donné généralement obtenues par RT-PCR (Real Time Polymerase Chain Reaction ou PCR en temps réel) et appelées des sondes. On met ces fragments en contact avec une population de brins d'ADN dont on souhaite connaître la composition. L'hybridation éventuelle entre une sonde et de l'ADN étudié est alors observée, et indique la présence ou l'absence d'expression d'un gène, dans le cas d'utilisation d'ADN complémentaires issus de la retrotranscription d'ARN m, ou de l'organisme recherché dans le cas d'utilisation d'ADN extrait d'un échantillon biologique au sein du quel on recherche un pathogène.

On peut également développer des puces à protéines sur lesquelles on fixe par exemple des anticorps ou des antigènes et l'on détecte, dans l'échantillon biologique, la présence de, respectivement, l'antigène ou l'anticorps complémentaire.

On peut également fixer d'autres macromolécules et utiliser de tels supports pour déterminer la présence de

ligands desdites macromolécules dans des échantillons étudiés (notamment le sang, l'urine, ou tout autre fluide biologique).

Les puces à ADN présentent, par rapport aux méthodes classiques d'hybridation un avantage majeur : grâce aux techniques de miniaturisation, elles permettent l'hybridation simultanée d'un nombre de sondes considérable sur une surface totale utile inférieure à 1 cm2. Les supports sur lesquels sont fixées les sondes se présentent sous la forme de surfaces planes ou poreuses (naturellement ou percées de puits) composées de matériaux tels que : - le verre, matériau peu onéreux, inerte et mécaniquement stable. La petite plaque de verre, substrat de la puce, peut notamment être recouverte d'une grille de PTFE (qui détermine des zones hydrophiles et hydrophobes), - les polymères qui sont à la base d'autres techniques, et plus précisément le polypyrrole, le polypropylène, le polycarbonate...

- le silicium, couramment utilisé pour la fabrication des puces électroniques à cause de ses propriétés semi-conductrices ; et - les métaux, notamment l'or et le platine.

Quel que soit le support choisi, il peut être traité pour former un réseau dense et régulier de microsurfaces et sur chacune de celles-ci est greffée une sonde d'ADN synthétique. A cette fin, il existe deux méthodes : le transfert de brins d'ADN obtenu par biosynthèse ou synthèse chimique ou sa synthèse chimique in situ.

La synthèse préalable à la fixation des sondes permet de fixer des sondes relativement longues, dépassant 40 nucléotides. Le transfert de ces sondes sur la puce peut se faire au moyen de micropipettes, de micropointes, par des dispositifs de type jet d'encre ou par adressage électrochimique. Dans ce dernier cas, la puce est composée d'un support en silicium recouvert, à chaque plot, d'une mini-électrode en or. Chaque sonde rejoint un plot particulier lorsque les mini-électrodes sont mises sous tension sélective.

La synthèse in situ : dans ce cas, la construction des sondes se fait par dépôt de couches successives des quatre bases de l'ADN sur un support en verre. C'est un masque, dont la configuration varie à chaque dépôt d'une couche, qui permet aux bases de s'empiler correctement.

Avec ce procédé, utilisé notamment par la société AFFYMETRIX, les sondes comportent au maximum 30 bases. Toutefois, la société PROTOGENE a mis au point un système permettant de déposer sur la grille de téflon de la biopuce les quatre bases désirées, grâce à des injecteurs piézo-électriques, selon une technologie qui s'apparente à une synthèse d'ADN classique. C'est l'équivalent d'une imprimante à jet d'encre à quatre couleurs (chaque couleur étant en l'occurrence une base : A, G, T, C). Ce procédé est extrêmement flexible : il permet de fabriquer indifféremment telle ou telle sorte de biopuce, de même qu'une imprimante imprime indifféremment telle ou telle page, quels que soient les mots du texte.

Le rôle de chaque sonde est de reconnaître, dans un mélange appliqué à la surface de la biopuce, une séquence d'ADN. Généralement cette séquence est

amplifiée par PCR puis marquée par fluorescence, préparée en solution et mise en contact avec la biopuce.

D'autres méthodes de marquages peuvent être utilisées. On distingue généralement trois familles : a) optiques, à savoir chimioluminescents, fluorophores, chromophores, b) radioactifs et c) électromagnétiques.

La phase d'hybridation est réalisée dans un incubateur (station fluidique) et est suivie d'un lavage destiné à débarrasser la puce des cibles nucléiques non hybridées. Elle permet de déterminer à quelle sonde s'est appariée la séquence d'ADN analysée.

La plupart des procédés reposent sur l'utilisation d'un scanner qui permet de repérer les sondes d'ADN devenues fluorescentes, c'est-à-dire ayant donné lieu à une hybridation. D'autres procédés se fondent sur les modifications des charges électriques du support en silicium où sont fixées les sondes, ou sur la différence de conductivité observée après appariement. La mesure de ces modifications permet de repérer les associations spécifiques entre les sondes et l'ADN cible.

Les possibilités d'utilisation des puces à ADN, protéines et autres microsystèmes (aussi appelés microarrays) sont multiples, et couvrent plusieurs domaines : - le diagnostic, notamment les immunoessais (hormone, cancer), domaine de la microbiologie (détection de l'ADN de pathogènes ou de complexe antigène/anticorps), facteurs aggravants cardiovasculaires...

- la pharmacie, notamment le criblage de produits (étude de la liaison de composés avec leurs cibles), la mise au point de médicaments (étude des effets sur l'expression de certains gènes), la pharmacogénomique

(étude des variations génomiques, ponctuelles ou non, entre individus)...

- la recherche, avec des possibilités de séquençage et analyse de séquences, tri moléculaire, étude simplifiée des différentes voies métaboliques...

- l'agroalimentaire, notamment la classification de produits, l'étude de l'origine de certains ingrédients, l'étude et la caractérisation des contaminations...

- l'environnement, notamment l'étude des contaminations microbiologiques, des polluants, des plantes...

Le séquençage par hybridation (SPH) est différent de la méthode enzymatique (méthode de Sanger), qui peut être considérée comme une épellation de la séquence, c'est-à-dire une lecture base par base. Le SPH procède par lecture de petits blocs. L'analyse porte sur des sous-séquences chevauchantes qui sont lues et réassemblées au moyen d'un programme informatique qui reconstitue la séquence étudiée.

Le séquençage par biopuces constitue une alternative intéressante et plus précise à la méthode classique du séquençage en termes d'automatisation et de réduction des coûts et des durées d'exécution.

L'identification de cibles pour la recherche thérapeutique est effectuée par la compréhension plus fine du génome et de sa régulation apportée par les biopuces. Ainsi, grâce aux puces à ADN, ont été mis en évidence de nouveaux gènes s'exprimant spécifiquement dans le tissu cérébral de l'enfant, ou apparaissant en association à des pathologies inflammatoires rhumatismales ou intestinales. Les biopuces peuvent donc

contribuer à l'identification de cibles thérapeutiques pour la recherche pharmaceutique. Elles peuvent aussi servir à déterminer la résistance aux antibiotiques de certaines souches microbiennes pour permettre de mieux lutter contre celles-ci.

La pharmacogénétique consiste à identifier les allèles impliqués dans l'efficacité (ou l'inefficacité) d'un produit, ou ses effets indésirables. Elle conduit à une meilleure compréhension des mécanismes d'action des médicaments. En montrant qu'une molécule a sur une cible une action variable, la biopuce ouvre le champ des potentiels thérapeutiques. Elle permet aussi d'identifier les effets secondaires d'un produit et, lors des essais cliniques, de faire des mesures de toxicité. Cela est fondé sur les légères différences pouvant exister dans la séquence génomique entre les différents individus.

Le diagnostic des maladies infectieuses et génétiques s'effectue par analyse de la présence d'une séquence ou d'un antigène spécifique d'un agent infectieux donné. Les biopuces peuvent porter les déterminants spécifiques de plusieurs agents et permettre ainsi une identification rapide et précise.

Cela permet également de définir les sous-types des agents infectieux, ce qui est un avantage pour la qualité du traitement à apporter.

En dehors du secteur médical, trois secteurs industriels non négligeables offrent des débouchés aux biopuces : - L'agro-alimentaire : par exemple le suivi des bactéries productrices de ferments lactiques, ou la

détection des séquences provenant d'organismes génétiquement modifiés dans les semences.

- L'environnement : l'analyse bactérienne de l'eau de consommation, la détection des agents infectieux dans l'alimentation, l'air ou l'eau (Salmonella, Listeria, Legionnella).

- La menace bactériologique ou chimique : en déterminant par avance les modifications du fonctionnement génétique des cellules immunitaires occasionnées par des agents toxiques, on peut identifier rapidement les produits chimiques (mercure, dioxine...) ou bactériologiques (bacille du charbon ou de la diphtérie...) disséminés par un éventuel agresseur.

L'apparition de nouvelles technologies a bouleversé la recherche de nouveaux médicaments dans sa phase initiale. Celle-ci inclut tout d'abord la synthèse et l'isolement de nouvelles molécules, puis leur essai sur des systèmes biologiques permettant de présupposer un intérêt thérapeutique éventuel.

Trois approches ont profondément transformé cette recherche.

1. Les techniques conformationnelles
La théorie des récepteurs postule que c'est l'union de la molécule de médicament avec une macromolécule (une protéine en général) qui est à l'origine de l'effet pharmacodynamique et plus généralement de la réponse thérapeutique. Cette union est fortement spécifique : seules quelques molécules privilégiées en sont capables.

On dit que le médicament est comme"la clé dans la serrure". On sait maintenant déterminer la conformation dans l'espace des protéines, notamment grâce à la radiocristallographie aux rayons X, donc celle des

récepteurs. Dans certains cas, on peut donc prévoir quelles structures devront présenter les molécules pour pouvoir s'unir à eux, notamment à l'aide de la modélisation informatique (conception assistée par ordinateur).

Il est indispensable de connaître au départ le récepteur pertinent, c'est-à-dire d'avoir une hypothèse physio-pathologique et d'avoir été capable d'identifier et d'isoler la protéine qui le porte.

2. La chimie combinatoire
Il est désormais possible de synthétiser en une seule opération plusieurs centaines de molécules. C'est ce que l'on appelle la chimie combinatoire. On part de la structure de base déterminée a priori comme il vient d'être dit et l'on génère systématiquement toutes les variations possibles en greffant des radicaux chimiques, des chaînes latérales, en modifiant le squelette, etc. Cela se fait non plus étape par étape, mais en mettant en présence les réactifs nécessaires. On obtient ainsi d'un seul coup plusieurs centaines de molécules. Toutes les opérations, synthèse, isolement et identification, sont miniaturisées et automatisées. Le gain de temps et l'abaissement des coûts sont considérables. On peut ainsi constituer une bibliothèque de plusieurs milliers de dérivés en quelques mois.

3. Le criblage à haut débit
Le problème est alors d'identifier parmi toutes ces molécules celles qui sont pourvues des propriétés biologiques les plus intéressantes. Le gain de temps et l'augmentation de la productivité, apportés par la chimie combinatoire, l'auraient été en vain si la productivité de cette phase de repérage, appelée

"criblage", n'avait pas été aussi améliorée. Aux essais longs et limités de la pharmacologie expérimentale classique, a succédé une technique qui permet d'essayer dans le minimum de temps des milliers de molécules.

Le test consiste à mettre en présence la substance à tester et un système biochimique (une enzyme par exemple) et à mesurer l'importance de la réaction éventuelle. L'essai, peut être fait simultanément avec un grand nombre de systèmes de significations très diverses. En fait, tout est miniaturisé et automatisé et toutes les opérations se déroulent sans intervention humaine.

Tout est fonction du modèle utilisé, ce qui met l'accent sur l'importance des hypothèses physiopathologiques. Les systèmes biologiques testés ne sont pas indifférents : ce sont ceux dont on pense qu'ils interviennent de manière cruciale dans le déterminisme de la maladie. Ainsi, cette recherche appliquée, dont les progrès sont si remarquables, elle est totalement tributaire de la recherche fondamentale en amont.

On sélectionne enfin les macromolécules les plus prometteuses, compte tenu de leurs résultats aux tests, mais aussi d'autres considérations comme leur facilité de synthèse ou leur pharmacocinétique.

Ainsi, il est essentiel de pouvoir passer au crible les nouvelles molécules réalisées par chimie combinatoire et d'obtenir les meilleures données notamment de liaison au récepteur le plus rapidement possible. On réalise alors un criblage à haut débit, consistant à identifier les molécules actives par mise en contact avec la cible biologique. Ces cibles peuvent

par exemple être des protéines dont on a identifié expérimentalement l'implication dans tel ou tel processus pathologique.

Jusqu'au début des années 1990, les essais traditionnels en éprouvette permettaient à une personne de tester 2000 composés par an. L'emploi de microplaques à 96 puits a ensuite permis de réaliser 6 000 essais par jour et par robot sur une même cible. Aujourd'hui les microplaques comportent 384 puits, certaines pouvant aller jusqu'à 1 536 puits. Ces progrès ont permis de multiplier les tests et, également, de réduire les coûts car les essais sont"miniaturisés"et utilisent des volumes d'échantillons très réduits.

Le criblage à haut-débit se caractérise par l'utilisation de robots capables de gérer simultanément de grands nombres de microplaques, facilement manipulables et stockables, où sont effectués des milliers de tests par jour.

Le criblage à haut-débit est issu des progrès de la robotique. Il repose sur des systèmes capables de réaliser des taches séquentielles indépendantes telles que dilution, pipetage et répartition de composés dans des cupules ou puits, agitation, incubation et lecture des résultats. Ils sont pilotés par des logiciels spécifiquement adaptés au type d'analyse à réaliser. Les essais sont effectués dans des microplaques standard identifiées par un code à barres et manipulées par la "main"d'un robot : celle-ci prend la plaque vide, ajoute les réactifs nécessaires et les composés à tester, gère le temps de la réaction puis passe la plaque à un lecteur pour connaître le résultat. Pour visualiser les réactions issues de la mise en contact, dans les puits,

de la molécule et de la cible, on utilise des méthodes basées sur la radioactivité ou, bien souvent, la fluorescence. Ces résultats sont stockés et analysés grâce à des ordinateurs.

Ainsi qu'on l'a vu ci-dessus, il est extrêmement important de pouvoir disposer d'un système pour étudier les liaisons entre des composés et leurs cibles, ainsi que les cinétiques de liaison. Les systèmes existant actuellement ne permettent pas d'effectuer une telle étude, dans la mesure où l'analyse des liaisons entre les macromolécules fixées sur un support solide et les macromolécules en solution est effectuée en général après plusieurs étapes de rinçage pour réduire les liaisons non spécifiques et le risque de faux-positifs.

Il est donc impossible avec les systèmes actuels de pouvoir réaliser de façon simple et rapide une analyse de cinétique de liaison entre des molécules en solution et des molécules sur support solide.

La présente invention se propose de répondre aux besoins ainsi démontrés en fournissant un dispositif et un procédé permettant d'effectuer des études de liaison de composés à grande échelle, en augmentant la vitesse et en réduisant les coûts de fonctionnement. Ce système peut être aisément automatisé et peut être mis en oeuvre pour toutes les utilisations ci-dessus énoncées.

Il est important de noter qu'aux exemples définis de façon préférentielle ci-dessous, et notamment les supports, on peut aisément substituer des supports fabriqués avec des matériaux tels que décrits ci-dessus.

L'exposé qui précède n'est destiné qu'à rappeler le contexte et le domaine d'application de l'invention ainsi que les connaissances de l'homme du métier

concernant la fabrication, l'utilisation et les procédés d'analyse des micro-supports biologiques.

En vue de la réalisation de ce but, on prévoit selon l'invention un dispositif d'analyse d'une molécule, comprenant : - une enceinte ; - un support apte à recevoir unemolécule ; et - des moyens pour mettre le support en contact avec un fluide apte à interagir avec la molécule, le dispositif étant agencé de sorte que le fluide forme un bain dans l'enceinte, le support étant monté mobile dans l'enceinte de sorte qu'au moins certaines portions du support s'étendent dans le bain puis hors du bain suivant une alternance temporelle.

Ainsi, l'analyse des interactions de la molécule fixée au support avec une molécule présente dans le fluide peut être effectuée lorsque la portion du support portant la molécule est située hors du bain et ce sans interrompre la mise en oeuvre du procédé. De plus, on peut modifier la composition du fluide au cours du temps et suivre en direct l'évolution de l'analyse, ce qui donne de surcroît des résultats beaucoup plus précis.

Selon les cas, on pourra prévoir que la molécule à analyser, en général une molécule organique, voire une macromolécule organique, sera fixée au support pour mise en contact avec une ou plusieurs molécules contenues dans le bain, ou au contraire contenue initialement dans le bain pour mise en contact avec une ou plusieurs molécules fixées initialement au support.

Avantageusement, le support est mobile de sorte qu'à chaque instant, au cours du mouvement du support,

certaines portions du support s'étendent dans le bain pendant que d'autres portions du support s'étendent hors du bain.

Ainsi, l'analyse peut se dérouler sans interrompre l'interaction avec le fluide de la ou des différentes molécules situées sur le support.

Le dispositif pourra présenter en outre au moins l'une des caractéristiques suivantes : - le support est mobile à rotation dans l'enceinte ;

- le support présente un axe de rotation s'étendant hors du bain ; - le support est plat et présente un axe principal, notamment un axe de rotation perpendiculaire à son épaisseur ; - le support a une forme cylindrique, et de préférence présente une longueur L suivant un axe du cylindre plus grande qu'un quart d'un rayon r du cylindre ; - le cylindre a une section circulaire dans un plan transversal à un axe principal du cylindre ; - la molécule est fixée à une face du support perpendiculaire à un axe principal du support ; - la molécule est fixée à une face du support parallèle à un axe principal du support ou ayant une génératrice parallèle à un axe principal du support ; l'enceinte présente un axe géométrique principal parallèle à un axe principal du support et non coaxial à celui-ci ;

il comprend des moyens d'entraînement pour mettre le support en mouvement dans l'enceinte ; et le support comprend une ou plusieurs parties aptes à coopérer de façon magnétique ou électromagnétique avec les moyens d'entraînement pour mettre le support en mouvement.

Avantageusement, l'axe de rotation est incliné par rapport à la direction verticale et, notamment, est horizontal.

Ainsi, lorsque le fluide est un liquide, il s'écoule par gravité le long de chaque fraction du support à la sortie du bain de sorte que la surface correspondante du support est essentiellement ou totalement exempte de liquide, une fois arrivée en partie haute de sa trajectoire, en vue de l'analyse par exemple. L'analyse peut donc avoir lieu immédiatement, dès la sortie du bain de la portion à analyser et sans interrompre le mouvement du support.

Avantageusement, l'axe de rotation est incliné par rapport à la direction horizontale, et est notamment vertical.

Dans ce cas également, on peut obtenir dans certaines conditions que la portion de support sortant du bain soit au moins essentiellement exempte de fluide.

Cela sera le cas, par exemple, lors de l'utilisation de l'effet de capillarité décrit plus loin ou bien si des moyens d'étanchéité sont prévus en sortie du bain.

Le dispositif pourra également présenter au moins l'une des caractéristiques suivantes : - Le fluide est un liquide ;

- L'enceinte présente au moins une paroi s'étendant en regard d'au moins une face du support et délimitant le bain, la paroi s'étendant à une distance de cette face telle que le liquide situé entre la paroi et la face est maintenu dans le bain par effet de capillarité au contact de la paroi et de la face ; le support comporte une membrane apte à recevoir la molécule.

- Il comprend des moyens pour introduire le fluide dans l'enceinte et/ou extraire le fluide de l'enceinte ; - les moyens pour introduire ou extraire un fluide comprennent un orifice unique débouchant à l'intérieur de l'enceinte ; - les moyens pour introduire ou extraire le fluide comprennent un élément et une aiguille apte à déboucher dans l'enceinte à travers l'élément ; - Le dispositif est apte à mettre le support en contact avec plusieurs fluides suivant une alternance temporelle ; - Il comprend des moyens différents du support pour mettre le fluide en mouvement dans l'enceinte ; - Il comprend des moyens d'analyse d'une interaction de la molécule fixée au support avec le fluide, ces moyens s'étendant en regard d'une zone du support située hors du bain ; - les moyens d'analyse s'étendent en regard d'une face du support perpendiculaire à un axe principal du support ;

- les moyens d'analyse s'étendent en regard d'une face du support parallèle à un axe principal du support ou ayant une génératrice parallèle à un axe principal du support ; - L'interaction comprend une liaison de la molécule avec une molécule présente dans le fluide ; - Les moyens d'analyse sont sensibles à un rayonnement, notamment optique, électromagnétique ou radioactif, résultant de l'interaction ; et l'enceinte comprend une zone de paroi formant un organe optique, par exemple une lentille, apte à modifier un rayonnement traversant la paroi.

On prévoit également selon l'invention un procédé d'analyse d'une molécule comprenant les étapes consistant à fixer une molécule sur un support, puis mettre le support en mouvement dans un bain d'un fluide apte à interagir avec la molécule de sorte qu'au moins certaines portions du support s'étendent dans le bain puis hors du bain suivant une alternance temporelle.

Le procédé pourra également présenter au moins l'une des caractéristiques suivantes : - On met le support en mouvement de sorte qu'à chaque instant, au cours du mouvement du support, certaines portions du support s'étendent dans le bain pendant que d'autres portions du support s'étendent hors du bain ; - On introduit le fluide dans l'enceinte et/ou on extrait le fluide de l'enceinte durant le mouvement du support ;

- On met le fluide en mouvement dans l'enceinte durant le mouvement du support ; - On analyse une interaction de la molécule au niveau d'une zone du support située hors du bain ; - On effectue l'analyse pendant le mouvement du support ; - On analyse l'interaction, puis on modifie la composition du fluide, puis on analyse à nouveau une interaction de la molécule avec le fluide ; - On introduit un liquide de lavage dans l'enceinte et on met le support en mouvement dans le liquide ; - La molécule est un acide nucléique, une protéine, un peptide ou toute autre molécule que l'on peut par exemple fixer sur le support sans altérer de façon significative ses propriétés d'interaction avec les molécules du bain ; - la molécule fixée au support est la molécule à analyser ; et - la molécule à analyser se trouve initialement dans le bain et est destinée à interagir avec la molécule fixée au support. La présente invention permet notamment de mesurer la cinétique de liaison entre les molécules présentes dans le fluide et la molécule fixée sur le support. Le support présentera en général à sa surface un nombre important de molécules différentes.

Un avantage que présente le procédé selon l'invention, par rapport aux procédés connus, est que la mesure peut être effectuée de façon dynamique, durant les réactions de liaison. En effet, le support étant en

mouvement, une partie de celui-ci est alors plongée dans le fluide contenant des composés, permettant alors les différentes réactions de liaison avec des molécules fixées sur le support, tandis que l'on effectue la lecture sur la partie non immergée du support.

Il apparaît que le support en question est avantageusement un disque, et que ladite rotation est effectuée par rapport à un axe passant par le centre dudit disque. On utilise également de préférence un disque au format CD (compact disc ou disque compact), ou un disque DVD (digital versatil disque). On pourra appeler celui-ci dans la suite de cette demande CircArray .

L'utilisation du dispositif objet de l'invention, pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention présente plusieurs avantages, parmi lesquels : - manipulation du support
Le grand problème des arrays sur membrane est en effet la difficulté de leur manipulation, surtout quand ils sont imbibés et qu'ils doivent être manipulés derrière un écran protecteur si le marqueur utilisé est radioactif. Le support est ici en mouvement, et n'a pas besoin d'être manipulé au cours de l'analyse.

- facilité de production du support
Le choix en faveur des CircArray est orienté par le fait que les disques sont capables de supporter des températures élevées (polycarbonate) et qu'ils portent des signaux d'adressage ah hoc pour le repérage des sondes. Les surfaces des disques présentent une région annulaire d'environ 90 cm2 utile, qui est à comparer avec celle des membranes dites Atlas , de 8xll=88 cm2. Le polycarbonate lui-même ou tout autre polymère

que l'on peut adapter à la surface peut servir d'amorce pour la fixation covalente de bio-molécules. Des films fins de matière peuvent être obtenus, par exemple par aspersion du support pendant qu'il est en rotation pour profiter de la force centrifuge.

- faible prix de revient du support
Par exemple, le prix des CD du commerce est quasiment négligeable comparé avec le prix des membranes que l'on peut y coller.

- facilité de dépôt des sondes
Les CircArray peuvent être considérés de la même façon que les supports actuels pour la réalisation des dépôts et la fixation de sondes. Les techniques de dépôt actuellement disponibles peuvent être utilisées, qu'il s'agisse de dépôt direct sur les CircArray ou directe par l'accolage d'autre supports (membranes, glass arrays).

Le support envisagé dans la présente invention est préférentiellement un support rigide, présentant une surface poreuse ou non, traitée pour faciliter la fixation des sondes ou des cibles suivant les besoins spécifiques d'une application, de format circulaire, du type CD, avec une base en polycarbonate. Ces disques sont disponibles commercialement et le dépôt de macromolécules est facilité par la rigidité du support et la possibilité de recouvrir la surface avec un matériau souple.

Le composé présent dans le fluide sera de préférence marqué, afin de pouvoir détecter sa présence à un point précis du support, correspondant à une molécule données, ce qui renseigne sur la liaison existant entre les deux molécules. La cinétique de

liaison est étudiée en fonction de l'intensité du signal lu à une position donnée.

Inversement, on peut également marquer les molécules fixées sur le support de telle sorte qu'un signal soit émis lorsqu'un composé se lie à elles.

La mesure s'effectue alors par le moyen d'un signal optique (par exemple de fluorescence), radioactif ou magnétique, l'une des molécules ou les deux molécules impliquées dans la liaison étant marquées de façon appropriée par exemple pour mettre en oeuvre une résonance de fluorescence par transfert d'énergie, connue en elle-même.

Afin de réduire le bruit de fond et le risque de faux positifs, on peut mettre en oeuvre le procédé selon l'invention en y introduisant une ou plusieurs étapes de lavages, avec des tampons appropriés.

Le réacteur ou dispositif selon la présente invention possédera avantageusement les propriétés suivantes : - permettre une circulation de fluide, notamment dans sa partie basse. Pour ce faire, on préférera un réacteur présentant un ou plusieurs orifices, afin de faire pénétrer les fluides en son intérieur et de pouvoir les évacuer. Ces orifices peuvent être reliés à des tuyaux et/ou des pompes pour améliorer la circulation. Le réacteur selon la présente invention facilite donc les échanges de solutions, dans la mesure où peuvent être pratiqués des orifices permettant l'entrée et l'évacuation des réactifs. Par ailleurs, la rotation du support dans le réacteur assure un brassage permanent

des réactifs, ce qui est un avantage pour pouvoir effectuer les études de liaison. On peut également, grâce aux orifices présents dans le réacteur, accéder au réactif pendant la réaction.

- permettre la lecture du signal émis lors de la liaison entre le composé présent dans le fluide et la macromolécule fixée sur la surface du support. A cet effet, on pourra soit lire à travers la paroi (éventuellement après avoir effectué un passage à blanc pour définir une ligne de base), soit ménager un orifice dans la paroi.

- permettre que la surface du support, à l'endroit de la lecture, soit sèche ou relativement sèche, afin de réduire les erreurs de lecture dues à la présence de fluide portant des molécules marquées.

- permettre que le volume de fluide dans lequel le support trempe soit le plus faible possible, afin de réduire les volumes de fluide à utiliser. On essaie notamment d'utiliser un réacteur dans lequel la partie basse (contenant les différents fluides) est capillaire, et la partie haute plus large, afin de permettre le maintien du fluide dans le volume du réacteur destiné à la réaction de liaison.

Ainsi qu'il a été dit, le réacteur selon l'invention permet l'immersion partielle du support dans le milieu réactionnel. Toutefois, si l'on veut réaliser le recouvrement total du support, on peut définir un réacteur qui ne laisse qu'un espace minime entre le

support et les parois du réacteur. Ainsi, et même en minimisant le volume des réactifs utilisés, la rotation du support sur un axe horizontal garantit tout de même le recouvrement total du disque.

La lecture peut s'effectuer pendant la réaction proprement dite de liaison des composés présents dans le fluide aux molécules fixées sur le support. Il est extrêmement intéressant d'avoir ainsi accès aux résultats de liaison, mais aussi à la mesure des produits de la réaction pendant l'expérience.

De préférence, le support sera rigide et circulaire, avec une face dédiée au positionnement d'éléments utiles pour le repérage des régions de dépôt des réactifs immobilisés sur le support, sur la même ou sur l'autre face. Le traitement éventuel de la surface permet d'y faire apparaître les fonctions physicochimiques nécessaires à l'immobilisation des sondes ou des cibles. La rigidité du support facilite son traitement automatisé.

- L'enceinte pourra être globalement cylindrique avec une hauteur de cylindre proche à celle de la hauteur du support. Le dessin du réacteur tient compte du besoin d'éviter les recoins qui peuvent créer des zones de rétention des réactifs susceptibles de causer des hétérogénéités de brassage ou de lavage. Une partie du réacteur, celle destinée à accueillir les réactifs au plus faible volume, est de largeur de cylindre plus faible, pour minimiser le volume de réactif nécessaire. Ainsi, le réacteur cylindrique préféré selon l'invention ne présente pas de volume mort.

De préférence, les axes cylindriques du réacteur et du support coïncident et sont horizontaux. Ainsi, la

partie basse du réacteur peut être utilisée pour recevoir les réactifs qui couvrent de la sorte une portion de la surface annulaire utile du support. Le volume de réactif nécessaire se trouve diminué puisqu'il ne doit pas recouvrir la surface entière du support et que cette partie du réacteur a une hauteur plus faible.

De préférence, le réacteur est immobile par rapport au référentiel que constitue l'appareil. Cela permet d'y fixer aisément les tubulures nécessaires à l'échange des solutions qui viennent en contact avec le support. Le support est mobile dans le réacteur.

Le brassage permanent des réactifs est intéressant pour permettre le recouvrement de la totalité de la surface utile du support par les réactifs de façon quasi permanente. La rotation du support autour de son axe et donc sa mise en mouvement relatif par rapport au réacteur et aux réactifs permettent d'obtenir l'effet désiré. Avantageusement, le brassage est obtenu d'une part par le mouvement circulaire du support (axe commun avec le réacteur cylindrique) et d'autre part par une circulation permanente des réactifs grâce à un système de pompage sur un circuit parallèle au réacteur.

Pour améliorer d'une part le brassage des réactifs, d'autre part le recouvrement d'une partie du support à un temps t et ce en simplifiant les dispositifs de contrôle, on peut prévoir que les réactifs circulent sur un circuit parallèle à celui du réacteur, qui peut recevoir une série de capteurs permettant l'analyse des caractéristiques du réactif de façon continue et une série de points d'admission de réactifs permettant l'ajustement des propriétés du réactif au contact du

support. On peut donc analyser les réactifs à tout moment.

Comme on l'a vu, une partie du support est de préférence en permanence en dehors du réactif et disponible pour la réalisation de mesures. Le mouvement qui anime le support fait que la totalité de la surface annulaire utile se présente en face d'une ligne perpendiculaire à l'axe de rotation, par période. Dans certains cas, cette ligne est l'axe de lecture et peut recevoir le capteur ad hoc pour la réalisation des mesures (de nature adaptée au type de marqueur utilisé) et ce en l'absence d'un recouvrement de la surface par un excès de réactif portant le marqueur. Ceci donne accès à la mesure des produits de la réaction.

Dans ce cas, le bruit de fond constitué par les restes du réactif non liés de façon spécifique au support ne peut pas être évalué sur une mesure statique durant la réaction. Dès lors, deux options de mesure sont envisageables.

La première consiste à effectuer une mesure en fin de réaction, après élimination par lavage du marqueur non fixé au support. La mobilité du support par rapport au réactif administré en flux continu améliore grandement l'efficacité du lavage en minimisant le volume de la solution de lavage. La force centrifuge générée par la rotation du support facilite l'élimination de la solution de lavage contaminée par le marqueur de la surface du support. La composition de la solution de lavage peut varier de façon continue ou discontinue pour faire varier l'efficacité du lavage qui pourra ainsi affecter les fixations faibles du réactif marqué, même si celles-ci sont spécifiques.

La deuxième consiste en une mesure pendant la réaction, grâce à une évaluation dynamique de la pertinence des signaux mesurés, en termes de signal spécifique, par comparaison de leur évolution dans le temps avec celle de témoins positifs et négatifs. La partie du support non immergée dans le réactif est recouverte d'une pellicule de milieu réactionnel faible, d'autant plus faible que la nature du support le permettra (support hydrophobe et non poreux par exemple) et que la vitesse de rotation sera forte (force centrifuge accrue). Même si le bruit de fond est largement supérieur aux signaux que l'on souhaite mesurer, la comparaison dynamique de leur évolution par rapport à ceux qui sont recueillis à un emplacement du disque ne permettant pas de fixer de façon spécifique les molécules marquées et ceux qui sont recueillis à un emplacement permettant de fixer des molécules marquées témoin, permet de distinguer les produits de la réaction par soustraction du bruit de fond. Cette mesure est préférée pour étudier les caractéristiques de liaison en fonction du temps, ou en faisant varier d'autres paramètres, notamment la température.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront encore dans la description suivante de deux modes préférés de réalisation du dispositif d'analyse et de variantes donnés à titre d'exemples non limitatifs. Aux dessins annexés : - la figure 1 est une vue en coupe verticale perpendiculairement à l'axe de rotation du support d'un premier mode préféré de réalisation du dispositif ;

- la figure 2 est une vue en coupe verticale axiale suivant le plan II-II du dispositif de la figure 1 ; - la figure 3 est une vue analogue à la figure 1 illustrant une première variante du premier mode de réalisation de l'invention ; - la figure 4 est une vue analogue à la figure 1 illustrant une deuxième variante du premier mode de réalisation de l'invention ; - la figure 5 est une vue en coupe transversale de

détail suivant le plan V-V du dispositif de la figure 4 ; - la figure 6 est une vue de détail du dispositif de la figure 5 lors de son utilisation ; - la figure 7 est une vue en perspective avec arrachement partiel d'un deuxième mode préféré de réalisation du dispositif selon l'invention ; - la figure 8 est une vue en perspective illustrant la réalisation du support dans une première variante de réalisation du dispositif de la figure 7 ; et - les figures 9 et 10 sont deux vues respectives en perspective et de face illustrant deux autres variantes de réalisation du dispositif de la figure 7.

On a illustré aux figures 1 et 2 un mode premier préféré de réalisation du dispositif d'analyse d'une molécule, en l'espèce une macromolécule biologique. Il pourrait s'agir par exemple comme expliqué plus haut d'un dispositif pour l'analyse d'un génome.

Le dispositif 2 présente une enceinte 4 essentiellement fermée en forme générale de parallélépipède rectangle. Cette enceinte renferme un support 6 destiné à recevoir la macromolécule à analyser

et en l'espèce plusieurs centaines de séquences correspondant à des fragments d'ADN à analyser, correspondant eux-mêmes à un ou plusieurs génômes. Le support 6 a en l'espèce la forme d'un disque plat.

Le disque 6 est monté mobile à rotation par rapport à l'enceinte 4 autour d'un axe central 8 du disque. Le dispositif 2 comporte en référence à la figure 2 un moyen d'entraînement du disque 6 en rotation autour de son axe, comprenant notamment un arbre 12 traversant de façon étanche une paroi 14 de l'enceinte 4.

L'enceinte 4 a une forme générale plate, l'épaisseur de l'enceinte s'étendant en correspondance avec celle du disque. L'enceinte 4 présente notamment deux grandes parois verticales 14 s'étendant en regard des deux faces 16 du disque. L'intérieur de l'enceinte 4 présente en l'espèce essentiellement une zone supérieure 18 et une zone inférieure 20. Ces deux zones sont séparées l'une de l'autre par une frontière 22 essentiellement rectiligne et horizontale, visible sur les figures 1 et 2.

La frontière 22 s'étend au-dessus de l'axe de rotation 8. De la sorte, la zone inférieure 20 inclut notamment toute la moitié inférieure de l'enceinte s'étendant sous l'axe de rotation 8 ainsi que toute la moitié inférieure du disque 6.

Dans la zone supérieure 18, les faces verticales 14 de l'enceinte présentent des faces internes 24 s'étendant en regard des faces du disque et à une distance relativement grande de celles-ci. En l'espèce, le disque 6 présentant l'épaisseur d'un CD conventionnel, cette distance est égale à au moins 3 ou 4 fois l'épaisseur du disque.

Dans la zone inférieure 20, les faces 24 des parois 14 s'étendant en regard des faces 16 du disque se trouvent à une distance relativement faible de ces faces. Cette distance est très inférieure à la distance séparant ces mêmes faces dans la zone supérieure de l'enceinte. De préférence, cette distance d est inférieure à l'épaisseur du disque lui-même et est suffisamment réduite pour correspondre à une épaisseur capillaire à l'égard du fluide destiné à remplir la zone inférieure 20 comme on va le voir plus bas.

La transition entre les deux zones 18 et 20 s'effectue par le bord horizontal matérialisant la frontière 22.

Le dispositif comprend des moyens 26 en communication de fluide avec un orifice d'entrée de fluide 28 débouchant dans l'enceinte et permettant d'introduire dans la zone inférieure 20 un ou plusieurs fluides qui sont en l'espèce des liquides. Cette introduction peut être faite, sur ordre de l'utilisateur ou d'un ordinateur de commande, de façon discontinue entre les phases d'analyse ou de façon continue durant l'analyse. Le dispositif 26 est d'un type classique. Il permettra de faire varier à volonté et de façon discrète ou continue la composition du ou des fluides introduits. De même, l'enceinte 4 présente un orifice 30 de sortie de fluide associé à des moyens d'évacuation qui n'ont pas été illustrés. Les dispositifs d'entrée et de sortie de fluide dans l'enceinte seront d'un type classique et pourront comprendre des pompes, des valves, etc... Ils permettront au choix de faire stagner le liquide dans l'enceinte, ou de le faire circuler une seule fois à travers l'enceinte en circuit ouvert. Le dispositif

comprend en outre des moyens de brassage 40 du fluide dans l'enceinte permettant notamment de le faire circuler en circuit fermé. Les moyens de brassage 40 du liquide sont distincts en eux-mêmes du disque 6 qui, du fait de son mouvement, assure lui-même un certain brassage du liquide.

L'enceinte est agencée de façon que la plus grande partie de la zone inférieure 20 peut être remplie de liquide afin de constituer un bain 32 dont le niveau supérieur 34 s'étend au-dessus de l'axe de rotation 8 du disque et juste au-dessous de la frontière 22. De la sorte, toute la moitié inférieure du disque ainsi qu'une portion de la moitié supérieure contiguë à la moitié inférieure se trouve immergée dans le bain 32 de liquide.

Le dispositif 2 est agencé pour que le disque puisse être mis en rotation pendant qu'il baigne dans le liquide. Au cours de la rotation du disque 6, le liquide s'écoule rapidement le long des portions du disque sortant du bain sous l'effet de la gravité.

De plus, l'épaisseur d séparant les faces 16 et 24 au niveau de la zone inférieure 20 et qui est d'ordre capillaire est choisie de sorte que, par effet de capillarité, au niveau des portions du disque sortant du bain, le liquide tend à demeurer dans la zone 20, au contact des parois 24 et des faces 16, sans s'élever dans la zone supérieure 18 de l'enceinte. Cet effet de capillarité s'ajoute à la gravité pour faire en sorte que chaque portion du disque sortant du bain soit essentiellement voire totalement exempte de liquide, c'est-à-dire sèche, lorsque, du fait de la rotation, elle arrive dans la partie la plus haute de sa

trajectoire. Par ailleurs, la force centrifuge peut contribuer également à évacuer le liquide de cette portion.

Le dispositif comporte des moyens d'analyse 36 aptes à détecter un signal résultant de l'interaction d'un brin d'ADN fixé à la surface du disque avec un composé initialement présent dans le fluide et maintenant lié à ce brin sur le disque. Ce signal pourra être d'ordre optique, électromagnétique ou radioactif comme on l'a indiqué plus haut. Cette lecture peut par exemple s'effectuer à travers une fenêtre 38 ménagée dans une des parois verticales 14 de l'enceinte et s'étendant dans la zone supérieure 18 de l'enceinte, en regard de la zone du disque la plus haute. Typiquement, les moyens de lecture 36 permettent d'effectuer une lecture le long d'un rayon vertical du disque dans la zone supérieure par référence à l'axe 8. Ces moyens 36 seront notamment montés mobiles de façon adaptée de la même façon que des moyens de lecture associés à un CD audio.

Le dispositif qui vient d'être décrit peut par exemple être utilisé de la façon suivante pour mettre en oeuvre le procédé d'analyse selon l'invention.

Dans une première étape, on installe sur un disque 6 plusieurs centaines de fragments d'ADN à étudier.

Cette mise en place est effectuée de façon classique au moyen d'une machine d'insertion telle que celle traditionnellement utilisée pour l'analyse de fragments d'ADN sur puce. Le disque est ensuite installé dans l'enceinte 4.

On introduit ensuite au moyen du dispositif 26 un liquide dans la zone inférieure 20 de l'enceinte pour

former le bain 32. Ce liquide comprend notamment des fragments d'ADN synthétiques généralement obtenus par reverse transcription (éventuellement suivie par une PCR) et d'un type connu susceptible de s'hybrider avec les sondes représentatives du génome à étudier installées sur le disque. Ces fragments présents dans le fluide ont été marqués par l'utilisation d'amorces fluorescentes.

Une fois que le bain 32 est constitué, on met le disque 6 en rotation, et simultanément on amorce l'analyse au moyen du dispositif 36.

Durant la rotation du disque, lorsqu'une sonde d'ADN fixée au disque parcourt le bain, elle est susceptible d'interagir avec un brin complémentaire présent dans le fluide et de l'entraîner ensuite avec elle en partie supérieure émergée du disque. Le signal caractéristique qui en découle est alors relevé par les moyens d'analyse 36.

Comme on le voit, grâce à ce dispositif, la plupart des portions du disque s'étendent dans le bain puis hors du bain et ainsi de suite suivant une alternance temporelle. De plus, certaines portions du disque s'étendent dans le bain pendant que d'autres portions du disque s'étendent hors du bain. Les sondes à étudier sont ainsi mises en contact avec les composés en partie inférieure du dispositif en même temps que s'effectue l'analyse des hybridations éventuelles en partie supérieure du dispositif du fait de la rotation permanente du disque. Autrement dit, une partie du disque est en permanence en dehors du réactif et disponible pour la réalisation de mesures. Le mouvement qui anime le support fait que la totalité de la surface

annulaire utile se présente par période en face d'une ligne perpendiculaire à l'axe de rotation. Cette ligne est l'axe de lecture du capteur de réalisation des mesures et ce en l'absence d'un recouvrement de la surface par un excès de réactif portant le marqueur.

Cela donne un accès immédiat à la mesure des produits d'hybridation.

En fonction des résultats de l'analyse, on peut modifier tout ou partie de la composition du fluide pour affiner cette analyse, le liquide initial pouvant être évacué par l'orifice 30. L'introduction et l'évacuation du liquide peut être faite de façon discrète ou continue de même que la modification de sa composition.

Les moyens d'analyse 36 peuvent facilement repérer chacun des fragments d'ADN disposés à la surface du disque 6. L'analyse peut être effectuée avec une marge d'erreur très faible de sorte qu'il devient essentiellement inutile de multiplier à l'identique les sondes à analyser en vue d'obtenir une analyse redondante comme cela était d'usage auparavant.

L'augmentation de la précision de l'analyse, permettant de s'affranchir de cette redondance, est aussi permise du fait que la composition du liquide peut être modifiée pendant l'analyse permettant un suivi dynamique des résultats de l'analyse et une exploitation beaucoup plus fine de ceux-ci.

L'un des liquides introduits dans l'enceinte pourra être un liquide de lavage, par exemple en préalable à l'introduction d'un nouveau liquide destiné à interagir avec les fragments fixés au disque.

Conformément à la technologie des CDs la plus courante, l'analyse s'effectuera sur une seule face du

disque 6. Toutefois, il pourra être prévu de travailler sur les deux faces simultanément en adaptant au besoin les moyens d'analyse 36, notamment en les disposant de chaque côté de l'enceinte.

Le disque 6 sera de préférence un disque en polymère de type polycarbonate ou en verre. Cette surface sera traitée de façon connue pour permettre la fixation des échantillons (acide nucléique, protéine, coupe de tissus).

L'enceinte pourra être prévue pour être à usage unique et permettre l'archivage du CircArray. Dans une autre version, l'enceinte pourra être réutilisable et permettre le changement du disque.

Le dispositif comprendra de préférence des moyens de régulation de la température. Il sera ainsi asservi à un ordinateur de contrôle permettant la gestion de la température du volume du réactif utilisé dans l'enceinte, de la durée des réactions et de la vitesse de rotation du disque.

Cela permet notamment de mesurer des constantes de liaison et de déterminer la présence ou l'absence de polymorphismes chez un individu (SNP ou single nucleotide polymorphism).

Du fait que le réacteur est immobile par rapport au référentiel, on peut aisément y fixer les tubulures nécessaires à l'échange des solutions qui viennent en contact avec le support. La circulation des réactifs entre l'entrée et la sortie de l'enceinte permet d'améliorer d'une part le brassage des réactifs et d'autre part d'optimiser le recouvrement du disque à chaque instant et ce en simplifiant les dispositifs de contrôle. L'enceinte peut recevoir une série de capteurs

permettant l'analyse des caractéristiques du réactif de façon continue, et une série de points d'admission de réactif permettant l'ajustement des propriétés du réactif au contact du support.

On a illustré à la figure 3 une première variante 102 du dispositif selon l'invention. Cette variante se différencie du dispositif de la figure 1 par la configuration des moyens 126 pour introduire le fluide dans l'enceinte et l'en extraire.

Le niveau horizontal maximum pouvant être atteint par le bain 32 est indiqué par la ligne 142 en traits mixtes. Ce niveau s'étend sous l'axe 8. Les moyens 126 comprennent un conduit d'admission de liquide 144 débouchant par son orifice 128 dans l'encontre 104 et un conduit de contrôle de niveau 146 ayant son orifice 130 dans l'enceinte.

Les deux orifices 128 et 130 sont tangents par leur bord inférieur au niveau 142, l'orifice 130 faisant office de trop-plein.

Les moyens 126 comprennent enfin un conduit d'évacuation 148 dont l'orifice 150 débouche dans l'enceinte au point le plus bas de celle-ci. Ainsi, l'enceinte peut être vidangée sous l'effet de la gravité.

De façon non illustrée, les conduits 144,146 et 148 peuvent être raccordées entre eux, par exemple de façon temporaire pour assurer une circulation du fluide en circuit fermé, grâce aux moyens de brassage.

On peut prévoir un orifice 149 ou un conduit débouchant dans l'enceinte à son point le plus haut pour éviter les surpressions ou encore évacuer une bulle

d'air dans l'hypothèse d'un remplissage complet de l'enceinte par exemple pour son lavage.

Une deuxième variante est illustrée aux figures 4 à 6. Dans ce dispositif, les moyens d'entrée et de sortie de fluide 226 communiquent avec l'enceinte 204 par un seul orifice 230. Celui-ci est occupé coaxialement par un doigt 250, par exemple en élastomère.

L'orifice 230 s'étend dans l'une des parois verticales principales 214 du dispositif qu'il traverse de part en part. L'orifice 230 s'étend à proximité de l'axe de rotation 8 avec son axe géométrique parallèle à ce dernier. L'orifice s'étend plus bas que l'axe 8 mais plus haut que le niveau 242 prévu pour le bain.

Les moyens d'entrée de fluide 226 comprennent une aiguille 252 d'une seringue que l'utilisateur introduit coaxialement dans le doigt 250 en perçant ce dernier qui devient donc un manchon.

On peut ainsi introduire à travers la paroi 214 le ou les réactifs nécessaires 254. Cette variante sera particulièrement adaptée au cas où le disque est de petites dimensions et mis en contact avec un faible volume de réactif et au cas où le dispositif est jetable et à usage unique.

Comme on le voit sur la figure 5, l'enceinte est formée par deux demi-enceintes 260 portant chacune une paroi principale 214. Entre les deux demi-enceintes est interposé un joint 262 de forme plane s'étendant dans le plan du disque 6 ou dans un plan parallèle à celui-ci.

On a illustré sur la figure 4 la ligne 264 suivant laquelle est lu le disque 6. Cette ligne est inclinée. Elle s'étend radialement dans la moitié supérieure du disque, dans le quart de celui-ci amorçant sa descente

vers le bain de réactif, compte-tenu du sens de rotation 266. Ici encore, la partie basse du disque forme avec les parois de l'enceinte une épaisseur capillaire pour le bain de réactif, l'épaisseur étant plus grande en partie haute du disque.

Dans ces différents dispositifs, pour éviter des problèmes éventuels d'étanchéité, le disque pourra être entraîné en rotation par couplage magnétique à travers une des parois de l'enceinte, sans nécessiter par conséquent un arbre traversant 12. Le disque devra alors comprendre au moins une partie en matériau apte à un tel couplage.

Nous allons maintenant décrire en référence à la figure 7 un deuxième mode préféré de réalisation dans lequel les éléments analogues à ceux du précédent mode de réalisation portent des références numériques augmentées de 100. De plus, dans ce deuxième mode de réalisation et les variantes qui suivent, nous ne décrirons que les caractéristiques qui différencient ces dispositifs des précédents, étant entendu que les autres parties des dispositifs sont reprises ou modifiées de façon adaptée.

En référence à la figure 7, le dispositif 302 comprend cette fois un support 306 en forme de cylindre d'axe 8. En l'espèce, le cylindre a une section de forme circulaire dans un plan perpendiculaire à l'axe 8. Le cylindre a ici une longueur total L supérieure au rayon du cylindre. Cette fois, les macromolécules à analyser sont destinées à être fixées à la face latérale 370 du cylindre, c'est-à-dire la face dont les génératrices sont parallèles à l'axe 8.

L'enceinte 304 a elle-aussi une forme cylindrique à section transversale circulaire et présente une face interne 372 dont le rayon est légèrement supérieur au rayon total r du support 306. De la sorte, la face externe du cylindre et la face interne de l'enceinte définissent entre elles un espace apte à recevoir comme précédemment un bain 32 de réactif. En l'espèce ce bain monte jusqu'à un niveau situé au-dessous de l'axe de rotation 8 du cylindre. L'enceinte 304 présente des parois d'extrémité 360 obturant le bain à ses extrémités.

Ce mode de réalisation a notamment pour avantage que le volume relativement important disponible à

1 l'intérieur du support 306 en raison de la forme cylindrique peut accueillir différents éléments, en particulier des organes 374 aptes à coopérer de façon magnétique ou électromagnétique avec les moyens d'entraînement présents dans le dispositif afin de mettre le support 306 en rotation dans l'enceinte sans contact direct avec le support 306.

Suivant les circonstances, le support pourra être guidé à rotation par rapport à l'enceinte grâce à un arbre traversant coaxialement l'enceinte et le support ou être simplement maintenu en position notamment sous l'effet de la gravité compte-tenu de la forme cylindrique de l'enceinte concentrique à celle du support. Comme précédemment, on pourra prévoir que le volume disponible dans l'enceinte pour le bain 32 ménage seulement une épaisseur capillaire pour le réactif.

Les moyens d'analyse 336 sont cette fois disposés en regard de la face latérale de l'enceinte 304 et de la face latérale 370 du support. Alors que le repérage des

macromolécules sur le support pouvait être effectué par exemple en cordonnées polaires dans le premier mode de réalisation, il pourra être effectué avantageusement dans le deuxième mode de réalisation en cordonnées cylindriques respectivement désignées par 0 et l sur la figure 7. 0 désigne l'angle défini par la macromolécule considérée par rapport à l'axe 8 et à une droite fixe 375 de référence, tandis que l sert à repérer la distance de la section transversale du support portant cette macromolécule par rapport à une section de référence telle que l'extrémité du support visible sur la figure 7. Les moyens d'analyse 336 s'étendent en l'espèce dans une disposition analogue à ceux de la figure 4 à savoir qu'ils permettent la lecture de la zone du support en cours de descente vers le bain qui est donc relativement sèche. Les moyens d'analyse 336 pourront s'étendre sur toute la longueur L du dispositif ou bien être associés à des moyens de déplacement pour parcourir cette longueur au cours de la lecture. Dans le dispositif de la figure 7, compte-tenu de la présence des éléments magnétiques ou électromagnétiques 374, le support 306 est assimilable au rotor d'un moteur.

Une première variante de ce deuxième mode de réalisation est illustrée à la figure 8. Dans celle-ci, le support 306 comporte une membrane souple ou semirigide 376 recouvrant sa face latérale et définissant la face latérale 370 du support recevant les macromolécules. Cette membrane peut avoir une forme rectangulaire. Elle peut être mise en place de façon simple sur le corps du support 306 en roulant celui-ci sur la membrane préalablement disposée à plat sur un

appui plan adapté. Cette mise en place est illustrée à la figure 8.

Une deuxième variante de réalisation de ce deuxième mode est illustrée à la figure 9. Le support 306 a une forme identique à celui de la figure 7. En revanche, l'enceinte 304 qui a une forme cylindrique sur les deux tiers de sa hauteur en partant du bas a une forme particulière en partie haute. En effet, la partie supérieure de l'enceinte présente une zone 378 de forme cylindrique, l'axe 380 du cylindre correspondant étant parallèle et distant de l'axe 8. Le sens de courbure de cette zone est tel que la zone 378 s'étant entre l'axe 380 et l'axe 8. En d'autres termes, tandis que la plus grande partie inférieure de l'enceinte 304 a une paroi de forme convexe, la paroi en partie supérieure a une forme concave.

Les moyens d'analyse 336 s'étendent au-dessus de l'enceinte 304 en regard de cette zone 378. Celle-ci forme sur toute la longueur de l'enceinte une lentille apte à faire converger vers les moyens 336 une partie du rayonnement provenant du support 306 et émergeant de l'enceinte. Naturellement, la zone 378 pourrait être configurée différemment pour former en elle-même un autre type d'organe optique qu'une lentille. Il pourrait par exemple s'agir d'un filtre à l'égard de certains rayonnements.

On a illustré à la figure 10 une troisième variante du mode de réalisation de la figure 7. En l'espèce, l'enceinte 304 présente encore une forme cylindrique à section circulaire sur la plus grande partie de sa hauteur en partant de l'extrémité inférieure de l'enceinte, le support 306 ayant quant à lui une forme

intégralement cylindrique à section transversale circulaire. En l'espèce, le rayon de la paroi de l'enceinte 304 est sensiblement plus grand que celui de la face externe du support 306. De plus, les axes respectifs 8 et 382 du support 306 et l'enceinte 304 ne sont pas coaxiaux mais sont décalés. L'axe 382 de l'enceinte s'étend au-dessus de l'axe 306 du support parallèlement à celui-ci. Dans une telle configuration, il n'est cependant pas strictement nécessaire de prévoir un arbre de guidage du support pour sa rotation dans l'enceinte. En effet, le support 306 demeure en partie basse de l'enceinte sous l'effet de la gravité au cours de son mouvement de rotation.

Indépendamment de cette caractéristique, cette variante illustre une autre caractéristique particulière en ce que la zone supérieure 378 de l'enceinte a cette fois une forme plane formant dans le cylindre un pan coupé. Les moyens d'analyse 336 sont disposés au-dessus de cette zone. Cette zone exerce une influence minimale

voir nulle à l'égard du rayonnement émanant du support 1 306 en direction des moyens d'analyse 336 en contraire de la zone 378 illustrée à la figure 9 et de la zone de la paroi s'étendant en regard des moyens d'analyse dans la figure 7.

Dans le cadre du deuxième mode de réalisation et de ses variantes en particulier, il pourra être avantageux de prévoir un orifice en partie basse à une extrémité de l'enceinte et des moyens pour incliner celle-ci afin de réaliser la vidange du dispositif.

Comme on la vu, ce deuxième mode de réalisation et ses variantes sont compatibles avec la plupart des caractéristiques décrites et illustrées en référence au

premier mode et à ses propres variantes. Il s'agira en particulier des différents agencements des moyens de circulation de fluide, et de l'introduction du réactif à travers un doigt en élastomère au moyen d'une aiguille.

Dans quelconque de ces modes de réalisation, le support pourra avoir une surface poreuse ou non et traitée pour faciliter la fixation des macromolécules.

Bien entendu, on pourra apporter à l'invention de nombreuses modifications sans sortir du cadre de celleci.

On pourra prévoir que le disque 6 s'étend avec son axe 8 incliné par rapport à la direction horizontale et éventuellement avec cet axe 8 vertical. Dans ce dernier cas, la localisation du bain au niveau d'une partie seulement du disque sera obtenue soit exclusivement par l'effet de capillarité et de centrifugation, soit partiellement par cet effet et partiellement grâce à des moyens d'étanchéité isolant la zone du disque baignant dans le bain de la zone située à l'extérieur du bain.

Dans la configuration inclinée, on utilisera principalement voire exclusivement la force centrifuge pour évacuer le réactif du disque 1.

Dans certains types d'analyse ou dans certaines phases de l'analyse, le fluide utilisé pourra être un gaz. Le bain est alors un bain de gaz.

On pourra modifier la forme de l'enceinte 4 ainsi que celle du support 6.

Le mouvement du support dans l'enceinte pourra être un mouvement alternatif et non pas un mouvement continu. Il pourra s'agir d'un mouvement de translation et non pas d'un mouvement de rotation. A titre d'exemple, on

pourrait imaginer de disposer les macromolécules à analyser sur une bande conformée en une boucle sans fin dont la partie inférieure est immergée et la partie supérieure émergée, cette bande étant entraînée au moyen de deux galets respectivement disposés en parties supérieure et inférieure.

Dans le mode de réalisation de la figure 7, la face 370 du support pourra avoir une forme polygonale suivant un plan perpendiculaire à l'axe 8. Elle présentera donc des secteurs plans formant des arêtes constituant des génératrices du cylindre et parallèles à l'axe 8.

Les molécules à analyser pourront être contenues dans le bain avant sa mise en contact avec le support afin d'interagir avec des molécules du support.

Claims

Revendications

1. Dispositif (2) d'analyse d'une molécule, comprenant : - une enceinte (4 ; 104 ; 204 ; 304) ; - un support (6 ; 306) apte à recevoir une molécule ; et - des moyens pour mettre le support en contact avec un fluide apte à interagir avec la molécule, caractérisé en ce qu'il est agencé de sorte que le fluide forme un bain (32) dans l'enceinte, le support (6 ; 306) étant monté mobile dans l'enceinte de sorte qu'au moins certaines portions du support s'étendent dans le bain puis hors du bain suivant une alternance temporelle.

2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support (6 ; 306) est mobile de sorte qu'à chaque instant, au cours du mouvement du support, certaines portions du support s'étendent dans le bain (32) pendant que d'autres portions du support s'étendent hors du bain.

3. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le support (6 ; 306) est mobile à rotation dans l'enceinte (4 ; 104 ; 204 ; 304).

4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que le support (6 ; 306) présente un axe de rotation (8) s'étendant hors du bain (32).

5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 3 à 4 caractérisé en ce que l'axe de

rotation (8) est incliné par rapport à la direction verticale et notamment est horizontal.

6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que le support (6) est plat et présente un axe de principal (8) perpendiculaire à son épaisseur.

7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le support (306) a une forme cylindrique, et de préférence présente une longueur (L) suivant une axe (8) du cylindre plus grande que le quart d'un rayon (r) du cylindre.

8. Dispositif selon la revendication 7, caractérisé en ce que le cylindre (306) a une section circulaire dans un plan transversal à un axe principal (8) du cylindre.

9. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la molécule est fixée à une face (16) du support (6) perpendiculaire à un axe principal (8) du support.

10. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la molécule est fixée à une face (370) du support (306) parallèle à un axe principal du support ou ayant une génératrice parallèle à un axe principal du support.

Il. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'enceinte (304) présente un axe géométrique principal (382) parallèle à un axe principal (8) du support (306) et non coaxial à celui-ci.

12. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend

des moyens d'entraînement (10 ; 374) pour mettre le support (6 ; 306) en mouvement dans l'enceinte.

13. Dispositif selon la revendication 12, caractérisé en ce que le support (306) comprend une ou plusieurs parties (374) aptes à coopérer de façon magnétique ou électromagnétique avec les moyens d'entraînement pour mettre le support en mouvement.

14. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 caractérisé en ce que le fluide est un liquide.

15. Dispositif selon la revendication 14 caractérisé en ce que l'enceinte (4 ; 104 ; 204 ; 304) présente au moins une paroi (14 ; 214) délimitant le bain (32) et s'étendant en regard d'au moins une face (16 ; 370) du support (6 ; 306) à une distance (d) de cette face telle que le liquide situé entre la paroi et la face est maintenu dans le bain par effet de capillarité au contact de la paroi et de la face.

16. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que le support (306) comporte une membrane (376) apte à recevoir la molécule.

17. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 caractérisé en ce qu'il comprend des moyens (26 ; 126 ; 226) pour introduire le fluide dans l'enceinte et/ou extraire le fluide de l'enceinte (4).

18. Dispositif selon la revendication 17, caractérisé en ce que les moyens (226) pour introduire ou extraire un fluide comprennent un orifice unique débouchant à l'intérieur de l'enceinte (230).

19. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 17 ou 18, caractérisé en ce que les moyens (226) pour introduire ou extraire le fluide comprennent un élément (250) et une aiguille (252) apte à déboucher dans l'enceinte à travers l'élément (250).

20. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 19 caractérisé en ce que le dispositif est apte à mettre le support (6 ; 306) en contact avec plusieurs fluides suivant une succession temporelle.

21. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 20 caractérisé en ce qu'il comprend des moyens (40) différents du support (6 ; 306) pour mettre le fluide en mouvement dans l'enceinte.

22. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 21 caractérisé en ce qu'il comprend des moyens (36 ; 336) d'analyse d'une interaction de la molécule fixée au support (6 ; 306) avec le fluide, ces moyens s'entendant en regard d'une zone du support située hors du bain.

23. Dispositif selon la revendication 22, caractérisé en ce que les moyens d'analyse (336) s'étendent en regard d'une face (16) du support (6) perpendiculaire à un axe principal (8) du support.

24. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 22 ou 23, caractérisé en ce que les moyens d'analyse (336) s'étendent en regard d'une face (370) du support (306) parallèle à un axe principal (8) du support ou ayant une génératrice parallèle à un axe principal du support.

25. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 22 à 24, caractérisé en ce que

l'interaction comprend une liaison de la molécule avec une molécule initialement présente dans le fluide.

26. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 22 à 25 caractérisé en ce que les moyens d'analyse (36 ; 336) sont sensibles à un rayonnement, notamment optique, électromagnétique ou radioactif, résultant de l'interaction.

27. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 26, caractérisé en ce que l'enceinte (304) comprend une zone de paroi (378) formant un organe optique, par exemple une lentille, apte à modifier un rayonnement traversant la paroi.

28. Procédé d'analyse d'une molécule, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à fixer une molécule sur un support (6 ; 306), puis mettre le support (6 ; 306) en mouvement dans un bain (32) d'un fluide apte à interagir avec la molécule de sorte qu'au moins certaines portions du support s'étendent dans le bain puis hors du bain suivant une alternance temporelle.

29. Procédé selon la revendication 28 caractérisé en ce qu'on met le support (6 ; 306) en mouvement de sorte qu'à chaque instant certaines portions du support s'étendent dans le bain (32) pendant que d'autres portions du support s'étendent hors du bain.

30. Procédé selon l'une quelconque des revendications 28 et 29 caractérisé en ce que, le bain étant formé dans une enceinte (4 ; 104 ; 204 ; 304), on introduit le fluide dans l'enceinte et/ou on extrait le fluide de l'enceinte durant le mouvement du support (6 ; 306).

31. Procédé selon l'une quelconque des revendications 28 à 30 caractérisé en ce qu'on met le fluide en mouvement dans l'enceinte durant le mouvement du support (6).

32. Procédé selon l'une quelconque des revendications 28 à 31 caractérisé en ce qu'on analyse une interaction de la molécule au niveau d'une zone du support située hors du bain (32).

33. Procédé selon la revendication 32, caractérisé en ce qu'on effectue l'analyse pendant le mouvement du support.

34. Procédé selon l'une quelconque des revendications 32 à 33 caractérisé en ce qu'on analyse l'interaction, puis on modifie la composition du fluide, puis on analyse à nouveau une interaction de la molécule avec le fluide.

35. Procédé selon l'une quelconque des revendications 28 à 34 caractérisé en ce qu'on met le support en mouvement dans un liquide de lavage.

36. Procédé selon l'une quelconque des revendications 28 à 35 caractérisé en ce que la molécule est un acide nucléique, une protéine ou un peptide.

37. Procédé selon l'une quelconque des revendications 28 à 36, caractérisé en ce que la molécule fixée au support est la molécule à analyser.

38. Procédé selon l'une quelconque des revendications 28 à 36, caractérisé en ce que la molécule à analyser se trouve initialement dans le bain et est destinée à interagir avec la molécule fixée au support.