JP7007673B2

JP7007673B2 - 生合成デバイスの調製方法及び診断におけるそれらの使用

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Publication number: JP7007673B2
Application number: JP2018553919A
Authority: JP
Inventors: モリーナ，フランク; クールベ，アレクシス; シュナイダー，フランシスコサントス
Original assignee: Skillcell; Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier CHUM
Current assignee: Skillcell; Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier CHUM
Priority date: 2016-04-13
Filing date: 2017-04-13
Publication date: 2022-01-25
Anticipated expiration: 2037-04-13
Also published as: CN109074422A; CA3020221A1; WO2017178896A2; CN109074422B; JP2019520792A; IL262203A; CA3020221C; WO2017178896A3; BR112018070937A2; IL262203B1; US20190111422A1

Description

本発明は、分析する系の状態の情報を与えることができる非生存マイクロ／ナノスケール生合成デバイスの調製方法を対象とする。好ましくは、該装置は、アッセイ診断、又はリスク、疾患の予測、又は哺乳動物、好ましくはヒトの病態の分類のために使用される。本発明はまた、サンプルにおける化合物の同定及び／又は定量化のための方法に関する。最後に、本発明は、本発明の方法によって得られた生合成デバイスを含むキットを含む。

合成生物学は、予測可能で有用で新規な生物学的機能を創出するために、生物学的構成要素、デバイス、システム、及び生物を系統的かつ合理的に設計する科学になっている。

診断への応用は、最近、合成生物学者から大きな関心を集めている。確かに、価値の高い診断法、特に臨床的な価値のある診断法を開発することは、依然として医学、また、一般に環境科学の主要な技術的問題である。例えば、物資の制限された環境下でリスクのある集団を非侵襲的且つ体系的にスクリーニングしたり、患者のベッドサイドで診断したり、精密なモニタリングをしたりする医療での解決策は、このため最も重要である。

過去１０年間で、迅速性、汎用性、堅牢性、使い易さ、移動性、また最後になってしまったがコスト効率を提供する革新的な診断技術に対する関心だけでなく、疾患の予測的なバイオマーカーを特定するための重要な取り組みが見られた。しかし、医療サービスを犠牲にすることなく、患者にまで生化学のラボを分散できる新規な診断が、まだ現れていない。

最高の価値を達成するために、新規の診断装置は、高感度、特異度、堅牢性、迅速性、及びサンプルの前処理なしの複雑なマトリックスにおける直接的な分析の可能性を備える、バイオマーカーの自律的バイオ検出を行うことになる。

入力の検出、情報処理、論理操作の実行、出力の生成が可能な相互作用する構成要素のシステムとして生物学的実体を考慮した枠組（１）は、バイオ検出目的のためのインテリジェントシステムの工学につながり、従って診断で応用するべく使用される。

細胞ベースのバイオセンシングシステムの工学は、合成生物学（７）の分野で大部分の注目を集めており、生物医学的な分析で幅広い検体の検出と特性評価をするための多目的且つ広く適用可能な方法として有用であることが証明されている（８）。これらのシステムは、所与のサンプルに特定の検体が存在していることに応答して、用量依存性の検出可能な信号を生成することができる。しかし、第１世代の細胞ベースのバイオセンサは、大部分が特別な信号処理能力なしに固有の細胞センサモジュールに依存していたため、複雑なマトリクスで使用すると信号対雑音比が低く、堅牢性の低い分離信号しか検出できない。

この観点から、トップダウン式の合成生物学は、標準化され、構成可能な遺伝子部分からの合成遺伝子ネットワークの体系的なエンジニアリングに焦点を当てており、生物内で集合させている（２２）。遺伝子工学によって幅広いモジュールが出現し、感度、特異性、ダイナミックレンジ、準リアルタイム信号処理、多入力（多重化）、論理操作の変調という観点で、又は直交する生物学的及び電子的構成要素の統合に向けて、これらのシステムを強化した（９）。多重検出が可能な細胞ベースのバイオセンサにより、いくつかの信号の組み合わせによって特定される複雑な条件を分類することが可能になる。多くの概念実証は、様々な臨床用途に使用されるように、細胞の感知及びシグナリングを意思決定システムにカスタマイズするために、生物学的論理回路を使用するアルゴリズムのインビボの統合の大きな利点を強調してきた。

これらのバイオセンシング装置は、機能のために必要なリソースを供給するシャーシ又は宿主細胞により支援されている。細胞ベースのバイオセンサ装置の設計は、植物、藻類、乳腺、酵母、及び広範囲の細菌種の異なる細胞シャーシで行われてきた（１０）。

このアプローチは、多くの有用な装置を提供し、例えば、薬物製造（２３）、スマート治療（２４）、又は革新的なバイオアナライザ装置（６）の開発等、生物医学的な分野で非常に価値があることが証明されている。

しかし、細胞ベースのバイオセンシングシステムは、頻繁に、検体の細胞内受動拡散、又は転写及び翻訳プロセスの反応速度に頼っているが、それらによりセンサの応答が遅くなる。更に、非直交遺伝子回路は、シャーシの構成要素と相互作用し、予測不能でノイズの多い応答プロファイルを生じ得る、設計された細胞の負荷を構成する。

更に、医療の専門知識を統合し、スマートな分析での解決をもたらすことができる価値ある装置だと証明されても、依然として遺伝子組み換え生物の使用に依存しており、それは倫理、進化、生態学、及び工業という点での課題を抱えている（２１）。

無細胞分子生物学回路のボトムアップ式の設計は、達成可能な複雑さ、モジュール性、及びプログラム可能性の劇的な進歩を示してきた（２５）。多くの研究が、核酸又はタンパク質を利用して、インビトロ又はインビボのいずれかで分子論理ゲート及び生体計算システムを設計した（５）。そして、新規設計の合成ペプチドネットワークは、生物学的ネットワークの基本的なブール論理関数のいくつかを模倣することができることが報告されてきた（１１）。生化学的情報処理は広範に研究されてきたが、インビトロでの堅牢性と予測可能性をいかにして設計するかについて理解を進めることが、依然として重要な課題である。生化学回路は固有の複雑さを含んでおり、そのため合成システムを構築するのに遺伝子回路ほど頻繁に使用されてこなかった。

Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 410-422 (2009). Contrib. Microbiol. 16, 194-225 (2009). Anal. Bioanal. Chem. 402, 3147-3159 (2012). J. Biol. Eng. 2, 5 (2008). Biosens. Bioelectron. 40, 368-376 (2013). A review. Biosens. Bioelectron. 26, 1788-1799 (2011). Curr. Opin. Biotechnol. 35, 46-51 (2015). FEBS Lett. 588, 2537-2544 (2014). Sci. Transl. Med. 7, 289ra83-289ra83 (2015). Curr. Synth. Syst. Biol. 01, (2013). 2Nat. Chem. 7, 160-165 (2015). Nat. Rev. Genet. 13, 455-468 (2012). Bioinformatics 26, 2298-2304 (2010).

今日まで、仕様、特に意思決定のアルゴリズムを、診断の慣行に準拠している生化学的実装に変換する方法に従って、無細胞合成システムを設計及び構築するための明確な工学原理及び方法論は存在しない。

これが本発明の目的である。

本発明は、一般に、「バイオ合成デバイス」と名付けられた区画化された合成生化学的ネットワークを対象としており、この合成生化学的ネットワークは、入力（例えば、バイオマーカーの入力）及び出力（意思決定アルゴリズムの反応）から意思決定アルゴリズムを実行する。

本発明は、堅牢な意思決定アルゴリズムを実行するために前述の区画化合成生化学ネットワークを構築する方法を記載し、それに関する。

ここで、本発明者らは、非生存（無細胞）マイクロ／ナノスケール生合成デバイス（その区画化された性質と、その生物学的な情報を有する内容により、前細胞とも称される）は、疾患に関連するバイオマーカーのバイオ検出及びバイオコンピューティング操作を行うためにプログラムを作ることができ、また特定の環境的又は臨床的な問題の分析的な解決策を得るための堅牢な枠組を体系的に生成することができることを提案している。

本発明の方法論は、設計原理、インシリコの設計、及び正確なシステム予測、並びに微小流体の方法、分子オリガミマイクロ／ナノ構造、又はゲルの細孔内のカプセル化等を非限定的に含む堅牢な集合方法を使用する実験的製造に特に依存する。

糖尿病の全ての急性代謝合併症を識別し、鑑別診断を達成する完全多重化診断アルゴリズムを実施することにより、本発明者らは前述のアプローチの実現可能性を実証した。

この方法論は、インシリコの設計及び正確なシステム予測、並びに例えば、堅牢な微小流体集合法を用いた実験的生産に依拠している。本発明者らは、糖尿病のすべての急性代謝合併症を識別し、鑑別診断を達成する完全診断アルゴリズムを実施することによって、このアプローチの実現可能性を特に実証した。これらは、技術的な妥当性を実証する実験的証拠、及び特にヒトの病状を診断するための臨床サンプルにおけるこの新規な診断アプローチの利点と効率を提供する。

第１の態様において、本発明は、分析する系の状態の情報を与えることができる非生存マイクロ／ナノスケール生合成デバイスの調製方法であって、
－微小環境内で空間的に閉じ込める（又は区画化される）又はカプセル化するステップ、
－少なくとも１つの生体分子要素であって、少なくとも１つの生体分子信号のバイオセンシングを達成するために生化学反応を支援し、感知された信号の多重化及び使用者定義の信号の処理／計算／論理操作への統合を達成するため更なる生化学的反応を支援する生体分子要素；
を含み、
前述のマイクロ／ナノスケール生合成デバイスは、前述の生体分子信号に対してプログラム可能な信号処理／計算操作を実行することが可能であり、
前述の分析する系又はそのサンプルの存在下で、前述のマイクロ／ナノスケール生合成デバイスは、複雑な生物学的マトリックスにおいて検出された生体分子パラメータに従って、分析する系及び生合成デバイスの存在に起因して、前述の埋め込まれた生化学反応から少なくとも１つの出力信号を生成でき、また前述の信号処理操作を実行することができ、
前述の少なくとも１つの出力信号は、分析する系の状態を示す方法を対象とする。

本明細書において、「生合成デバイス」という用語は、区画化されている（「閉じ込められた」又は「カプセル化された」合成生化学的ネットワークという言葉遣いもする）ことを示すことを意図し、この合成生化学的ネットワークが入力（例えば、バイオマーカーの入力）及び出力（決定アルゴリズムの応答）から意思決定アルゴリズムを実行する。

本発明による非生存マイクロ／ナノスケール生合成デバイスによって、生存している細胞、細菌、ウイルス、酵母、又はそれらの組換え操作された形態を排除することが意図されている。

本明細書では、「区画化された」という用語には、「閉じ込められる」又は「カプセル化」という用語も使用される。

好ましい生合成デバイスでは、小胞の性質、又はそれに限定されないが、多孔性ゲル、多孔性ポリマービーズ、リン脂質、合成コポリマー、液滴、リポソームを有する、小胞系又は他のいずれかの種類の区画等の区画において、合成生化学ネットワークが区画化又はカプセル化され、あるいは分子オリガミ構造系に結合している。

本発明による非生存マイクロ／ナノスケール生合成デバイスによる。

好ましい実施形態では、上で定義したような前述の区画、前細胞、又は小胞系は、意思決定アルゴリズム（生化学的合成回路とも呼ばれる）を行うことができる合成生化学ネットワーク内の合成、半合成、又は天然に存在する膜によって区切られ、前述の生化学要素を含みカプセル化されている。

マイクロ／ナノスケール生合成デバイスが好ましい。

マイクロ／ナノスケール生合成デバイスにより、以下及び実施例において定義される区画、前細胞又は小胞系を含み、好ましくは５ｎｍ～２０μｍ、より好ましくは１０ｎｍ～１０μｍである大きさ（直径）を有するデバイスを指定することを意図している。

本明細書において、「微小環境」又は「区画」、「前細胞」、及びモジュールという用語は、これらの用語が小胞系、又はカプセル化される、前述の生化学的要素を含む、意思決定アルゴリズム又は生化学的合成回路を実行することができる合成生化学ネットワーク内で合成、半合成、又は天然に存在する膜によって画定された小胞の性質を有するか有さない他のいずれかの種類の区画を指定することを意図しているときに、互換的に使用することがある。

本発明の方法のより好ましい実施形態において、前述の微小環境は、カプセル化される前述の生化学的要素を含む生化学的合成回路内の合成、半合成、又は天然に存在する膜によって画定された小胞系にある。

より好ましくは、意思決定アルゴリズムを実行することができる合成生化学ネットワーク又は生化学的合成回路は、合成生化学的ネットワーク又は合成回路を含む絶縁された内部及び培地、又は（例えば、哺乳動物、好ましくはヒトの臨床サンプル又は環境サンプル）を試験するための「複雑な生物学的マトリックス」からなる外部の画定によって、空間をデジタル化することを可能にするリン脂質二重層内にカプセル化される。

多くのタイプの小胞系又は前細胞は、それらの膜の性質に関して記載されているが、それらは一般に、高次の両親媒性分子からなる。これらの両親媒性物質、例えばリン脂質又は合成コポリマーは、親水性の頭部の方向及び疎水性鎖を含み、これらは二重層に集合させることができる。水性培地と接触している親水性頭部及び各層の内部にある疎水性鎖の向きは、熱力学的に有利である。前細胞の膜二重層の物理化学的性質は、両親媒性物質の性質に強く依存する。それらは、浸透性、厚さ、安定性、又は弾性に影響を与える。

生体分子要素は、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸等の大型の巨大分子、並びに一次代謝産物、二次代謝産物、天然産物等の小分子を含む、生物内に存在する分子を指定することを意図している。

本発明の方法の好ましい実施形態において、前述の少なくとも１つの生体分子要素は、合成、半合成生体分子要素から選択されるか、天然に存在する生物学的システムから単離される。

より好ましい態様において、前述の少なくとも１つの生体分子要素は、タンパク質、核酸、好ましくは発現しない核酸、及び代謝産物からなる群から選択される。酵素及び代謝産物は、特により好ましい生体分子要素である。

驚くべきことに、これらのタンパク質、特に酵素は、これらの小胞系にカプセル化されたとき、室温でさえ非常に良好な安定性及び反応速度の向上を示し、この場合、その活性が長期間保たれる（室温で３ヶ月以上）ということが実証された。

本発明の方法の好ましい実施形態では、前述の生体分子信号は、少なくとも１つの生化学的又は分子的パラメータから選択され、より好ましくは、分析する系の状態の診断情報を与える臨床、汚染、汚濁バイオマーカーから選択される。

本発明の方法の好ましい実施形態では、前述の生体分子信号の前述のプログラム可能な信号処理／計算操作は、アナログ信号又はデジタル信号であり、任意に信号を記憶及び／又は増幅する。

本発明の方法の好ましい実施形態では、前述のマイクロ／ナノスケール生合成装置によって生成することができる前述の出力信号は、生物学的、化学的、電子的、又は光子的信号、好ましくは可読で任意に測定可能な物理化学的出力信号、又は機械的作用、又は対象の化合物の合成及び／又は分泌物の放出から選択される。

出力信号として使用できる信号の中で、特に、例えば比色、蛍光、発光、又は電気化学信号を挙げることができる。これらの例は、本発明で使用可能な出力信号を制限することを意図するものではない。その選択は、感度や技術的なリソースの観点で、アッセイの指定に大きく依存する。重要なことに、比色出力は人間が読み取り可能であり、低コストで使い易いポイントオブケア装置への統合に関する興味深い特性であり、一方で例えば発光信号は超高感度及び広いダイナミックレンジの検出を提供する。しかし、従来式のエンドポイント信号を測定するのではなく、他のバイオセンシングの枠組が存在し、生物学的システムに固有の性質のおかげで達成することができる。従って、線形、周波数、又は閾値、又は多値検出モード等、異なる読み出しモードを定義することが可能である。

別の好ましい形態では、本発明の方法において、前述の生体分子信号に対する前述のプログラム可能な信号処理／計算操作は、定義／プログラム可能な意思決定アルゴリズム、好ましくはブール（論理ゲート）アルゴリズムの使用を統合する。

本発明の方法の別の好ましい実施形態では、前述の調製された生合成デバイスは、疾患を診断する、又は疾患のリスクを予測するアッセイとして使用するため、又はヒトの病状を分類するための装置であり、及び／又は前述の生体分子要素の合理的な集合によって、分析する任意の環境の状態に関する情報を与える。

本発明の方法の別の好ましい実施形態では、少なくとも１つの生体分子信号の前述のバイオセンシングを達成するため生化学的反応を支援する前述の生体分子要素が、自動インシリコ及び実験的方法から選択され、方法は、
ａ）適切かつアクセス可能なデータベースにインシリコに記憶された前述の標準的な生体分子要素から選択することにより、使用者定義の生化学的操作を実行する適切な合成生化学反応回路の設計及び生化学的実装ステップ；
ｂ）前述のインシリコ設計された生合成デバイスの感度分析、堅牢性分析等の数学的動的モデリング及び予測ステップ；
ｃ）ステップａ）で選択された、前述の少なくとも１つの生体分子要素を含む、合成膜、微小環境、又はモジュール内にカプセル化された少なくとも１つの前述の微小環境又はモジュールを生成するステップ；並びに
ｄ）ステップｃ）において生成された前述の微小環境又はカプセル化されたモジュールを集合させることによって生合成装置を生成するステップ；
を含む。

別の好ましい実施形態において、前述の方法は、前述のステップｄ）の後に、
ｅ）分析することが望まれる任意の環境の病理／状態の疾患／分類に関して特性評価された既知の多数のサンプルを測定するステップ；及び
ｆ）最適化されたバイオマーカーを生成するための既存の診断技術と比較して、対象となるアルゴリズムの性能を更に最適化するように、生体分子要素内及び間の論理関係の最適化、並びにこれらのステップの１つ以上を繰り返し行うステップ
を更に含む。

好ましい実施形態では、前述の少なくとも１つの生体分子要素は、ステップａ）において酵素又は代謝産物中で選択される。

本発明の方法の別の好ましい実施形態では、前述の装置の前述の微小環境（又はモジュール）は、少なくとも２つの適合する生体分子要素、好ましくは２つの適合する酵素又は適合する代謝産物を含む。

本発明の方法の別の好ましい実施形態では、前述の装置は少なくとも２つの異なる微小環境（又はモジュール）を含み、この装置は少なくとも２つの異なる生体分子信号をバイオセンシングすることができる。

本発明の方法の別の好ましい実施形態では、前述の生体分子要素は、リポソーム、液滴、選択的透過性を有するポリマー支持体内、より好ましくはリポソーム内に空間的にカプセル化される。

別の態様では、本発明は、区画化された合成生化学的ネットワークを含む、本発明の方法によって得ることが可能又は得られるマイクロ／ナノスケールの生合成、好ましくは診断用の装置に一般に関し、この合成生化学的ネットワークは、好ましくは少なくとも２つの入力及び出力（好ましくは、意思決定アルゴリズムの応答に対応する）からの入力（例えば、バイオマーカー入力）から意思決定アルゴリズムを実行する。

好ましい実施形態では、本発明は、本発明の方法によって得ることが可能又は得られるマイクロ／ナノスケールの生合成、好ましくは診断用のデバイスであり、前述のデバイスは、
ａ）合成又は半合成の生体分子要素、あるいは好ましくはタンパク質、より好ましくは酵素、発現しない核酸、及び代謝産物からなる群から選択される、天然に存在する生物系から単離された要素であって、前述の生体分子要素又は要素は、選択透過性を有する合成、半合成、又は天然に存在する膜又はポリマー支持体内に空間的に閉じ込められ／区画化されている；
ｂ）複雑な生物学的マトリックスにおいて少なくとも１つの生体分子信号のバイオセンシングを達成するための生化学的反応を支援する前述の生体分子又は単離された要素；
ｃ）感知された信号の多重化及び使用者定義の信号の処理／計算／論理操作への統合を達成するため生化学的反応を支援する前記生体分子要素；
ｅ）前記装置が、生体分子信号に対してプログラム可能な信号処理／計算操作を実行することが可能であること；
ｆ）前記装置が、複雑な生物学的マトリックスにおいて検出された生体分子パラメータに従って、埋め込まれた生化学反応により少なくとも１つの可読／測定可能な物理化学的出力を生成でき、また信号処理操作を実行することができ、生物学的マトリックスポイントに関する情報を与えることができること；
を含む。

好ましい実施形態では、本発明は、本発明の方法によって得ることが可能又は得られるマイクロ／ナノスケールの生合成、好ましくは診断用のデバイスに関し、より好ましくは健康、農耕による食品又は環境診断の分野に関し、健康診断分野がより好ましい。

別の態様では、本発明は、サンプルの化合物の同定及び／又は定量のための方法を対象とし、
ａ）混合物を生成するために、本発明の方法によって得ることが可能若しくは得られるマイクロ／ナノスケール生合成デバイス、又は本発明で定義されるマイクロ／ナノスケール生合成デバイスを、前述の化合物を含有し易いサンプルと接触させるステップ；
ｂ）少なくとも１つの生化学反応の実施に適合した条件で前述の混合物をインキュベートして、少なくとも前述の出力信号、好ましくは可読／測定可能な物理化学的出力信号を生成するステップ、ここで前述の出力信号は、前述のサンプルを分析するために望まれる前述の化合物の前述の存在及び／又は前述のレベルを示す；
ｃ）ステップｂ）で生成された前述の出力信号を検出又は測定するステップ；及び
ｄ）ステップｃ）において生成／測定された前述の信号、前述の化合物の前述の存在及び／又は前述のレベルを形成し、判定するステップを含む。

別の態様では、本発明は、疾患の診断若しくは疾患のリスク予測のための方法、又はヒト病変の分類のための方法を対象とし、前述の方法は、
ａ）本発明の方法によって得ることが可能若しくは得られる１つの若しくは複数の生合成デバイス装置、又は本発明で定義されるマイクロ／ナノスケール生合成デバイスを得るステップ、ただし前述のデバイスは１つのタイプの区画、微小環境、モジュール、若しくは前細胞、又はその異なる種類を含み、（区画、微小環境、モジュール、若しくは前細胞又はデバイスの）分布が対象とする診断目的に関して予め最適化されている；
ｂ）前述の生合成デバイスを患者サンプルと接触させるステップ；
ｃ）各デバイスについてステップｂ）で生成された出力信号を検出又は測定するステップ、但し、ステップｃ）で生成／測定される前述の信号は、疾患の診断若しくは疾患のリスクの予測、又は前述の患者におけるヒトの病状の分類を示す、
を含む。

本発明による診断方法の好ましい実施形態では、前述の試験されるサンプルが、尿、血清、血液、食品、原材料、及び環境サンプルから選択される。より好ましくは、方法が、疾患の診断、又は疾患のリスクの予測、又はヒトの病状を分類するための方法であるときに、尿、血清、又は血液から選択される。

好ましくは、前述の病理に関連するバイオマーカーが知られている病理学又は疾患である。特に、糖尿病、心血管、腎臓、眼、及び治癒の病理の群から選択される。糖尿病がより好ましい。

特に好ましい態様において、本発明は、患者が糖尿病に苛まれている、前述の患者の糖尿の診断に使用するための、本発明の方法によって得ることが可能若しくは得られるマイクロ／ナノスケール生合成デバイス、又は本発明で定義されるマイクロ／ナノスケール生合成デバイスを対象とする。

血漿及び尿の分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）の濃度がインスリン抵抗性と関連し、糖尿病発症を予測する性質を有することが、多くのヒトの研究によって一貫して実証されている（ＧｉｅｓｂｅｒｔｚＰ．ｅｔａｌ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＣｌｉｎＮｕｔｒＭｅｔａｂＣａｒｅ．２０１６Ｊａｎ；１９（１）：４８－５４を参照）。

従って、別の特に好ましい態様では、本発明は、患者サンプルの分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）を測定するために使用するための、本発明による方法によって得ることが可能又は得られるマイクロ／ナノスケール生合成デバイス、あるいは本発明で定義されるマイクロ／ナノスケール生合成デバイスを対象とする。

別の好ましい態様では、本発明は、糖尿病、低血糖症、糖尿病性ケトアシドーシス、高浸透圧非ケトン性の糖尿病、乳酸アシドーシス、インスリン抵抗性、早期インスリン抵抗性、及びエチルアルコール中毒症から選択される糖尿病又は糖尿病合併症の疾患の状態の鑑別的な分類をする診断のために使用する、本発明の方法によって得ることが可能又は得られるマイクロ／ナノスケール生合成デバイス、あるいは本発明で定義されるマイクロ／ナノスケール生合成デバイスを対象とする。

好ましい実施形態では、本発明の方法によって得ることが可能若しくは得られるマイクロ／ナノスケール生合成デバイス、又は本発明で定義されるマイクロ／ナノスケール生合成装置において、前述のモジュールにカプセル化される選択された生化学要素は、
－酵素：グルコース－１－デヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ロイシンデヒドロゲナーゼ、硝酸レダクターゼ、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ；及び
－代謝産物：レサズリン、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ、ＡＢＴＳ、ＭＴＴ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）
から好ましくは選択される酵素又は代謝産物からなる群から選択される。

好ましい実施形態では、本発明の方法によって得ることが可能若しくは得られるマイクロ／ナノスケール生合成デバイス、又は本発明で定義されるマイクロ／ナノスケール生合成デバイスは、患者におけるインスリン抵抗性又は初期インスリン抵抗性の診断に使用され、前述のモジュールは、カプセル化された生化学要素として、
－酵素：ロイシンデヒドロゲナーゼ、及び任意に
－代謝産物：ＭＴＴ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ
を含む。

好ましい実施形態では、本発明の方法によって得ることが可能若しくは得られるマイクロ／ナノスケール生合成デバイス、又は本発明で定義されるマイクロ／ナノスケール生合成デバイスは、患者のインスリン抵抗性又は初期インスリン抵抗性及び糖尿病の診断のために使用され、前述の方法又はデバイスは、
ａ）カプセル化された生化学要素として、
－酵素：ロイシンデヒドロゲナーゼ；及び任意に
－代謝産物：ＭＴＴ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ；
を含む第１のモジュール、並びに
ｂ）カプセル化された生化学要素として
－酵素：グルコース－１－デヒドロゲナーゼ、又はグルコースオキシダーゼ、及び西洋わさびペルオキシダーゼ；及び任意に
－代謝産物：レサズリン
を含む第２のモジュール
という２つの異なるモジュールを実装する。

特定の実施形態では、本発明の方法によって得ることが可能若しくは得られるマイクロ／ナノスケール生合成デバイス、又は本発明で定義されるマイクロ／ナノスケール生合成デバイスは、患者におけるインスリン抵抗性又は初期インスリン抵抗性又は糖尿病の診断に使用され、前述の方法又はデバイスは、本発明による、マイクロ／ナノスケールの生合成デバイス、小胞又はリポソームとして、１つのモジュールを実装し、前述の１つのモジュールは、カプセル化された生化学要素として、
－酵素：グルコースオキシダーゼ又はグルコース１－デヒドロゲナーゼ、及びロイシンデヒドロゲナーゼの両方、及び任意に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）；並びに任意に、
－代謝産物：レザスリン、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ、及び任意にＭＴＴ；
を含む。

前述の１つのモジュールは、尿サンプル又は血液サンプルであるが、これに限定されない患者サンプルのＢＣＡＡレベル及びグルコースレベルを測定することができる。

本発明の方法によって得ることが可能若しくは得られるマイクロ／ナノスケール生合成デバイス、又は本発明で定義されるマイクロ／ナノスケール生合成デバイスでは、前述の出力信号は、化学的、生物学的、電子的、又は光子的信号、あるいは物理化学的出力信号、好ましくは可読／測定可能な信号、及び／又は機械的作用、あるいは対象の化合物の合成及び／又は分泌物の放出が実行できることが好ましい。

可読／測定可能な信号の例を特に挙げることができる：
細胞内タンパク質染色、ＲＮＡ検出、酵素免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）、蛍光定量法、蛍光染色、限界希釈アッセイを用いた定量、比色測定、指示物質、反応速度のパターン、濃度のパターン、ＥＬＩＳＡ及び類似のアッセイ、ハイスループットのゲノミクス及びプロテオミクス、分光法、又は当業者によって周知の他の信号である。

別の態様では、本発明は、本発明の方法によって得ることが可能若しくは得られる、又は本発明で定義される生合成デバイスを含むキットに関する。

好ましくは、本発明によるキットは、カプセル化された生化学要素として、
－酵素：ロイシンデヒドロゲナーゼ；及び任意に
－代謝産物：ＭＴＴ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ、
を含む、小胞、リポソーム（非生物生合成デバイス）を含むが、これに限定されない少なくとも１つのモジュール、並びに任意に、
ｂ）カプセル化された生化学要素として、
－酵素：グルコース－１－デヒドロゲナーゼ及び西洋わさびペルオキシダーゼ；並びに任意に
－代謝産物：レサズリン；
を含む第２のモジュールを含む。

特定の実施形態では、本発明によるキットは、本発明による小胞又はリポソームとしての１つのモジュールを含み、カプセル化された生化学要素として：
－酵素：グルコースオキシダーゼ、又はグルコース１－デヒドロゲナーゼ、及びロイシンデヒドロゲナーゼの両方、及び任意に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）；並びに任意に、
－代謝産物：レザスリンＮＡＤＨ、ＮＡＤ、及び任意にＭＴＴ
を含む。

特定の実施形態では、本発明によるキットは、本発明による小胞又はリポソームとしての１つのモジュールを含み、カプセル化された生化学要素として：
－酵素：グルコースオキシダーゼ、又はグルコース１－デヒドロゲナーゼ、及びロイシンデヒドロゲナーゼの両方、及び任意に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）；並びに任意に、
－代謝産物：レザスリンＮＡＤＨ、ＮＡＤ、及び任意にＭＴＴ；
を含む。

以下の実施例、図面、及び凡例は、本発明を実施及び使用することができるようにするために、当業者に完全な説明を提供するために選択された。これらの実施例は、本発明者が考える本発明の範囲を限定することを意図しておらず、また以下の実験のみが実施されたことを示すことを意図するものではない。

本発明の他の特徴及び利点は、以下に説明する実施例及び図面の記載の残りの部分で明らかになるであろう。

プロトセンサの環境制御型走査電子顕微鏡（ＥＳＥＭ）顕微鏡写真を示す。ＤＰＰＣ小胞を、ＰＢＳの２．５％グルタルアルデヒド溶液中、４℃で一晩固定し、次いで直接観察する前に水で洗浄した。個々のプロトセンサの立体顕微鏡写真を示す。プロトセンサの環境制御型走査電子顕微鏡（ＥＳＥＭ）顕微鏡写真を示す。ＤＰＰＣ小胞を、ＰＢＳの２．５％グルタルアルデヒド溶液中、４℃で一晩固定し、次いで直接観察する前に水で洗浄した。プロトセンサと相互作用する電子ビームの運動の視覚化した。左から右へ：ＤＰＰＣ二重層を溶融して、小胞体内容物を放出するのに１０秒で十分であった。（スケールバー＝１０μｍ）マイクロチャネル内でのプロトセンサの作製の低速度撮影の顕微鏡写真（左から右へ、上から下へと読み取る）。この動画は２０，０００ＦＰＳで記録され、約０．５μｓに相当する。（スケールバー＝４０μｍ）前細胞の酵素カプセル化をアッセイするためのＵＰＬＣ－質量分析実験を示す。実験は、ＴＳＱＱｕａｎｔｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ）と連結したＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）で行った。簡単に説明すると、ＥＳＩ＋検出で、Ｈ_２Ｏ＋０．０１％のギ酸及びアセトニトリル＋０．０１％のギ酸を溶出剤として含むＫｉｎｅｔｅｘＣ１８カラム（１００×２．１ｍｍ２．６ｕｍ）を流速０．５ｍｌ／ｍｌで使用した。ＰＢＳ緩衝液のＧ１ＤＨ酵素及び文献に相当する質量（約３０ｋＤａ）を有する酵素を同定することができる主ピークのＭＳスペクトルのクロマトグラムを示す。前細胞の酵素カプセル化をアッセイするためのＵＰＬＣ－質量分析実験を示す。簡単に説明すると、ＥＳＩ＋検出で、Ｈ_２Ｏ＋０．０１％のギ酸及びアセトニトリル＋０．０１％のギ酸を溶出剤として含むＫｉｎｅｔｅｘＣ１８カラム（１００×２．１ｍｍ２．６ｕｍ）を流速０．５ｍｌ／ｍｌで使用した。ＰＢＳ緩衝液のＡＯ酵素及び文献に相当する質量（約７４ｋＤａ）と酵素を同定することができる主ピークのＭＳスペクトルのクロマトグラムを示す。前細胞の酵素カプセル化をアッセイするためのＵＰＬＣ－質量分析実験を示す。簡単に説明すると、ＥＳＩ＋検出で、Ｈ_２Ｏ＋０．０１％のギ酸及びアセトニトリル＋０．０１％のギ酸を溶出剤として含むＫｉｎｅｔｅｘＣ１８カラム（１００×２．１ｍｍ２．６ｕｍ）を流速０．５ｍｌ／ｍｌで使用した。ＰＢＳ緩衝液のＧ１ＤＨ及びＡＯ酵素をカプセル化するプロトセンサ、並びに２つの酵素を同定することを可能にする主ピークのＭＳスペクトルのクロマトグラムを示す。酵素反応及び対応するＨＳＩＭ方程式のための多基質機構を示す。自然の代謝ネットワークからの使用者定義の酵素のブール論理ゲートの自動生化学的な実装の例を示す。解糖経路からの生化学反応を含む任意の代謝ネットワークを入力し、酵素論理ゲートを見つけるために利用する。論理ゲートの実装は、適切な生体分子の入力及び出力が識別されるサブネットワークである。自然の代謝ネットワークからの使用者定義の酵素のブール論理ゲートの自動生化学的な実装の例。真理値表を有する所与のブール関数を、インシリコツール（ＮｅｔＧａｔｅ及びＮｅｔｂｕｉｌｄ）に、この場合はＧｌｕＯＮｅシステムに与え、対応する連結論理ゲートが代謝ネットワークで検索される。手短に言えば、第１のステップでは、入力ネットワークに存在する論理ゲートの全ての可能な実装が列挙される。第２のステップでは、これらの実装が、与えられた真理値表に対してチェックされ、見つけられたゲートがソートされる。この例では、ソフトウェアは入力ネットワークからＧｌｕＯＮｅ生体分子論理を満たす２つの実装を見出した。最も単純なものは、本研究で選択された合成回路である。本研究で設計し使用した反応速度パラメータを有する生化学回路のトポロジーを示す。システム入力に対応する代謝産物は黄色で示されている。ＧｌｕＯＮｅシステムは、グルコース及びアセトンを培地の入力として取り込み、ＮＡＤＨ及びレゾルフィン各々の分子の形態の吸光度及び蛍光出力信号を生成するために、ＡＮＤ及びＮ－Ｉｍｐｌｙのブール論理を入力に適用する。これは４種類の酵素と２種類の代謝産物で構成されている。本研究で設計し使用した反応速度パラメータを有する生化学回路のトポロジーを示す。システム入力に対応する代謝産物は黄色で示されている。ＬａｃＯＨシステムは培地の乳酸とエタノールを入力とし、Ｎ－Ｉｍｐｌｙブール論理を入力に適用し、酸化型ＡＢＴＳの分子形態で吸光度と比色分析出力信号を生成する。それは、３つの異なる酵素と２つの異なる代謝産物を含む。本研究で設計し使用した反応速度パラメータを有する生化学回路のトポロジーを示す。システム入力に対応する代謝産物は黄色で示されている。ＧｌｕＮＯｘシステムは、グルコース及びＮＯｘを培地中の入力として取り込み、ＡＮＤブール論理を入力に適用して、ニトロシル化ＤＡＦ－２の分子形態の蛍光出力信号を生成する。それは、３つの異なる酵素と２つの異なる代謝産物を含む。臨床的な仕様による、前細胞におけるＧｌｕＯｎｅの生化学回路及び入力のバイオマーカーのマッピング満足度のランドスケープを示す。臨床的な仕様による、前細胞におけるＬａｃＯＨの生化学回路及び入力のバイオマーカーのマッピング満足度のランドスケープを示す。臨床的な仕様による、前細胞におけるＧｌｕＮＯｘの生化学回路及び入力のバイオマーカーのマッピング満足度のランドスケープを示す。各入力の組み合わせについて、それぞれのモデルの２つの最も高感度なパラメータ（例えば、ＡＤＨ及びＧ１ＤＨ）を変化させながら、１０分での時間論理式の満足度を計算した。定常状態での出力濃度閾値の時間的指定の有効領域は、各マップの下に示されている。次いで、最適化された濃度パラメータを、Ｂｉｏｃｈａｍで実施されたＣ－ＭＡＥＳ法を用いて計算した。出力信号を計算するために使用される実験的較正曲線を示す。出力の濃度と実験的な蛍光及び吸光度の測定との間の数学的関係を得るために、既知の濃度の出力分子で添加されたサンプルからの信号を測定した。ＰＢＳ緩衝液での出力の分子信号を示す。出力信号を計算するために使用される実験的較正曲線を示す。出力の濃度と実験的な蛍光及び吸光度の測定との間の数学的関係を得るために、既知の濃度の出力分子で添加されたサンプルからの信号を測定した。プロトセンサでの出力の分子信号を示す。インシリコのシミュレーションで出力信号を計算するために使用される数式を示している。インビトロでの合成生化学回路の詳細な実験的反応速度的特性評価を示す。酵素及び代謝産物をｐ９６１００μｌウェルのＰＢＳで混合し、緩やかな攪拌によって均質化し、最後に投入物を添加した。速度論的測定は、２５℃でゆっくり攪拌しながらＳｙｎｅｒｇｙＨ１プレートリーダで行った。インビトロでの合成生化学回路の詳細な実験的論理特性決定を示す。この図には、前に図９で先に詳述したように得られた測定値が示されている。前細胞における合成生化学回路の詳細な実験的反応速度特性評価を示す。ＰＢＳ緩衝液で作動するプロトセンサの実験的な真理値表を示す。プロトセンサを生成するために本研究で使用した微小流体チップを示す。（Ａ）緩衝液（ＰＢＳにおける、１０％ｖ／ｖのメタノール、１５％ｗ／ｖのグリセロール、３％ｗ／ｖのプルロニックＦ６８）、１μｌ／分、（Ｂ）オレイン酸に溶解したＤＰＰＣ、０．４μｌ／分、（Ｃ）ＰＢＳ中の酵素、０．４μｌ／分、（Ｄ）外部。上：二重エマルジョンテンプレート装置。この装置を使用して、本研究の全ての実験を行った。下：流体力学的な流れ集中装置。この装置では、リン脂質をイソプロピルアルコール緩衝液に溶解している。本研究で使用した雑多な微小流体チップを示す。（Ａ）緩衝液（ＰＢＳにおける、１０％ｖ／ｖのメタノール、１５％ｗ／ｖのグリセロール、３％ｗ／ｖのプルロニックＦ６８）、１μｌ／分、（Ｂ）オレイン酸に溶解したＤＰＰＣ、０．４μｌ／分、（Ｃ）ＰＢＳ中の酵素、０．４μｌ／分、（Ｄ）外部。左：簡素なエマルジョンテンプレート装置。内蔵タンク内の簡素なエマルジョンの安定性を生成し、視覚化するために使用される。このチップは、チップの出力が緩衝液Ａを含む溶液で移送される２段階の小胞の調製にも使用することができる。中央：以前と同じであるが、タンクの構造が異なる。右：小胞を生成するための代替の２段階のオンチップ。この装置は、前細胞を生成するために期待通りに機能するが、流速モードは本研究で使用したメインチップよりも動作が困難である。合成システムのコンピュータ支援設計を示す。生化学回路のボトムアップ設計は、システムの挙動の正式な仕様からインシリコの実装及びインビトロの試験に至るまで、設計の反復的なアプローチで進む。（ＭａｒｃｈｉｓｉｏａｎｄＳｔｅｌｌｉｎｇ（３３）から適応された）。合成システムのコンピュータ支援設計を示す。製造に至るシステム設計の反復的な円を示す。前細胞内のＡＮＤブール論理ゲートを模倣する酵素回路のモデルの例と、その動作を説明する決定論的ＯＤＥモデルの例を示す。実体として定義された各分子の各時間ステップでＨＳＩＭが実行するアルゴリズムを示す。ＰＤＭＳチップ製造用の簡単な枠組：コンセプトから実現までを示す。本研究で使用された概念実証アルゴリズムで、プロトセンサ内で統合され、糖尿病の急性合併症の鑑別診断と糖尿病のスクリーニングを達成する。糖尿病に関連する急性合併症、即ち、糖尿病性ケトアシドーシス、高血糖の高浸透圧状態、低血糖症、及び乳酸アシドーシスは、ひどい死亡率、罹患率、及び頻繁な合併症に伴う重大な医療費負担を代表する臨床的緊急事態である。ここでは、これらの合併症の診断を可能にする診断アルゴリズムと、尿中に存在するマーカーからの概念実証スクリーニングアッセイを提案する。医療診断のためのプロトセンサの一般的な設計方法論、アーキテクチャ及び操作原理を示す。特定のバイオマーカーのパターンに関連する病理を検出するための臨床的必要性に起因して、医学的診断は、インビトロでブール論理を用いて公式化され、合成生化学回路に埋め込まれた計算プロセスに抽象化することができる。このデノボ回路は、天然に存在する基本単位から組み立てられ、又はインシリコでプログラムされ、合成容器にカプセル化されて、ヒト臨床サンプルの特定のバイオマーカーのパターンを検出することができる診断装置又はプロトセンサを生成し、これらの信号を医学的意思決定アルゴリズムにおいて統合する。バイオマーカーの病理学的パターンが検出された場合、プロトセンサは比色分析出力を生成する。医療診断のためのプロトセンサの一般的な設計方法論、アーキテクチャ及び操作原理。異なる臨床的な質問に対応する異なるタイプのプロトセンサを同時に使用して、病理学的バイオマーカーの多重検出を可能にし、臨床サンプルにおける病理の鑑別診断を達成することができる。医療診断のための合成生化学回路のインシリコ設計、シミュレーション、及び実験的検証を示す。基本論理ゲート記号を使用した正式なブール式記述、生化学的な部分によるインシリコ回路の実装、及び３つのモデルの理論真理値表。医療診断のための合成生化学回路のインシリコ設計、シミュレーション、及び実験的検証。ＨＳＩＭシミュレーションを示す。医療診断のための合成生化学回路のインシリコ設計、シミュレーション、及び実験的検証。インビトロ回路の実装、実験測定、及びＨＳＩＭ予測との比較を示す。制御された高スループットの前細胞製造を達成するために、これらの実施例で探索された微小流体アプローチを示す。プロトセンサを製造するための二重エマルジョンテンプレートを示す。ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）の化学構造。プロトセンサを製造するための二重エマルジョンテンプレートを示す。微小流体流れ集中液滴発生装置は二重エマルジョンテンプレートを生成し、その後、オレイン酸を抽出してプロトセンサを生成する。プロトセンサを製造するための二重エマルジョンテンプレートを示す。０、１、２、及び３時間での抽出プロセスの可視化（スケールバー＝２．５μｍ）。前細胞の微小流体産生のための実験装置を示す。（Ａ）シリンジポンプは、微小流体装置（Ｂ）の変位駆動流を可能にする。前細胞の形成は、超高速カメラ（Ｄ）を搭載した倒立顕微鏡（Ｃ）を用いて顕微鏡制御下にある。コンピュータインターフェースは、製造プロセス（Ｅ）をリアルタイムで視覚化することを可能にし、シリンジポンプ流速に関するナノメーター制御を与える。（Ｆ）前細胞を生成するためにこれらの実施例で使用されたＰＤＭＳチップの写真。微小流体を用いたプロトセンサの実験的構築。左：二重エマルジョンテンプレート微小流体装置の構造及び操作。この方法は、Ｗ／Ｏ／Ｗ二重エマルジョンの生成に依存する。緩衝液：ＰＢＳにおける、１０％ｖ／ｖのメタノール、１５％ｗ／ｖのグリセロール、３％ｗ／ｖのプルロニックＦ６８（１μｌ／分）、Ｏｉｌ＋ＰＬ：オレイン酸に溶解したＤＰＰＣ（０．４μｌ／分）、生化学回路緩衝液：ＰＢＳにおける酵素及び代謝産物（０．４μｌ／分）。右：チップ上のプロトセンサ生成（上部、スケールバー＝２０μｍ）の微視的検証、後続分析用に分離されたプロトセンサの明視野光学検証（下、スケールバー＝１０μｍ）。微小流体を用いたプロトセンサの実験的構築を示す。ＰＢＳ（左）及びＧｌｕＮＯｘネットワーク（右）をカプセル化した後、微小流体の方法で生成されたプロトセンサの大きさの分散及び安定性。微小流体を用いたプロトセンサの実験的構築を示す。カプセル化の数か月にわたる安定性。前細胞及び蛍光にカプセル化されたＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－４８８標識ＩｇＧを、共焦点顕微鏡法によって３か月間モニタした。黄色：リン脂質色素ＤｉＩＣ１８で標識された前細胞膜蛍光。青色：ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－４８８で標識されたＩｇＧの蛍光。プロトセンサの分析特性のインシリコ及び実験的検証を示す。バイオマーカーの濃度が増加した誘導後の３つの異なるシステムについて、ＨＳＩＭモデルシミュレーションを用いて６０分で計算された出力信号を示すヒートマップ。プロトセンサの分析特性のインシリコ及び実験的検証を示す。フローサイトメトリーを用いた単一（プロト）細胞レベルでのコンピュータ予測の実験的検証を示す。ＬａｃＯＨについては、フローサイトメーターで蛍光出力信号を測定できるように、ＡＢＴＳとレゾルフィンを交換した。これらは類似している。医療用プロトセンサの堅牢な多重化バイオセンシング及び論理の実験的検証を示す。「ＯＮ」出力信号の共焦点顕微鏡による検証は、それぞれのバイオマーカーによる誘導後６０分で応答する。上から下へ：ＧｌｕＯＮｅ（Ｏｕｔｌ、Ｏｕｔ２）、ＬａｃＯＨ（Ｏｕｔ３）、ＧｌｕＮＯｘ（Ｏｕｔ４）。リン脂質二重層は、色素ＤｉＣ１８を用いて黄色で染色される。ＬａｃＯＨについては、共焦点顕微鏡法で蛍光出力信号を測定できるように、ＡＢＴＳとレゾルフィンを交換した。これらは類似している。医療用プロトセンサの堅牢な多重化バイオセンシング及び論理の実験的検証を示す。ヒト尿中で作動するプロトセンサの実験真理値表。医療用プロトセンサの堅牢な多重化バイオセンシング及び論理の実験的検証を示す。多重化の論理：予想される（サンプルに存在する分子入力による有効な分析応答）、バッチモード分析（非カプセル化合成回路）、及びプロトセンサ分析（カプセル化合成回路）の比較例。ＰＢＳ培地に複数のバイオマーカー（この場合はアセトン、エタノール、及び酸化窒素又はグルコース、アセトン、及び乳酸）を添加し、出力信号を６０分で測定した。医療用プロトセンサの堅牢な多重化バイオセンシング及び論理の実験的検証を示す。尿におけるプロトセンサの構造的堅牢性のフローサイトメトリー評価。ＧｌｕＯＮｅプロトセンサを誘導し、ヒト尿中で、２５℃で２時間インキュベートし、フローサイトメトリーを用いてレゾルフィン蛍光及び前方散乱光を記録しながら分析した。患者の臨床サンプルにおける病理学的糖尿のプロトセンサによる媒介検出を示す。左：統計分析に使用されるデータの点状のヒストグラム。右：統計的感度対（１－特異度）を表す受信者動作特性（ＲＯＣ）分析曲線。非病理学的尿で実施された７２の測定のセットは、糖尿病患者由来の尿で行われた７２の測定と比較された。このアッセイにＧｌｕＯＮｅプロトセンサを使用し、６０分後にＯｕｔｌ信号（ＮＡＤＨ吸光度）を測定した。所与の論理関数を実施する計算装置の合理的な設計を示す。異なる種類の計算単位を示す。ＡＮＤゲートは、２つの入力が真である場合にのみ真を出力する。入力の少なくとも１つが真である場合、ＯＲゲートは真を出力する。ＸＯＲゲートは、入力の１つが真の場合にのみ真を出力する。ＮＡＮＤ、ＮＯＲ、及びＸＮＯＲゲートは、ＡＮＤ、ＯＲ、及びＸＯＲゲートの反対の値をそれぞれ出力する。マイクロメトリックな前細胞でトリガされた実験的蛍光信号の例を示す。炭水化物から酸化還元センサプローブへの酵素的電子伝達（この場合、レサズリンは赤色蛍光生成物レゾルフィンに還元される）。生化学的種をカプセル化するリン脂質前細胞は、微小流体装置を用いて生成され、共焦点顕微鏡を用いて画像化された。左は、誘導をしなかった。右は、グルコースで誘導した（スケールバー＝５μｍ）。各種の前細胞ゲートの可能な実装の詳細を示す。各種の論理ゲートは、ＨＳＩＭでインシリコでシミュレートされており、一部はラボで試験中である。電子移動機構の詳細は、右下のイラストに示されている。例えば、蛍光ＮＯＲゲートは、ＮＡＤＨが前細胞に存在するとき、即ち、少なくとも１つの入力が真に設定されているとき、蛍光酸化スコポレチンを消費するために２つの酵素反応（ＮＡＤＨオキシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ）のカスケードを使用するので、電子はＮＡＤ＋の最初のプールからＮＡＤＨを作るよう移動する。標準合同標準形におけるＧ式の直接的な実装を示す。ドモルガンの法則を使用すると、同じブール関数が最終的なＡＮＤゲートの代わりにＮＯＲゲートを使用して書き換えられ、多数の入力で簡単に構築でき、複数の２及び３入力ＡＮＤゲートに元の入力の補数が供給される。式Ｇ（ａ，ｂ，ｃ）の前細胞機の１つのインスタンスの特定の付着を介した指示されたアセンブリ及び配線を示す。入力ａ、ｂ、及びｃは、式（３）に従って変数の値をインバータ又はＮＡＮＤゲートに分配する配線している前細胞（１つの入力、１つ、２つ、又はそれ以上の出力）で実施される。図３２Ｂ参照。ＮＯＲゲートは、ＡＮＤゲートの下の大きな前細胞であり、ＡＮＤゲートの出力が結合されている。小さな前細胞ａ；ｂ；ｃ＝０；１は入力変数ａ、ｂ、ｃ（左）に対する定数前細胞である。これらの入力される前細胞は、変数の全ての評価を網羅するために、一定の偽又は真の前細胞にランダムに結合される。右側では、集合した前細胞機は、評価値ａ＝１、ｂ＝０、ｃ＝０を検証する。従来のシリコンベースのコンピュータと提案された前細胞での計算との比較を示す。医療診断のための合成生化学回路のインシリコ設計を示す。正式なブール式記述は、基本論理ゲート記号（Ａ）を用いて描かれている。医療診断のための合成生化学回路のインシリコ設計を示す。初期のインスリン抵抗性の診断における分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）モデルのための生化学的な部分（Ｃ）及び理論的真理値表（Ｂ）を用いたインシリコ回路の実施。古典的試験で測定された、測定されたセリックＢＣＡＡとＨＯＭＡ（ホメオスタシスモデルインスリン抵抗性評価）パラメータとの間の強い相関を示す。多様なＨＯＭＡ（インスリン抵抗性のホメオスタシスモデル評価）及び体格指数（ＢＭＩ）を提示する一般集団からの患者由来の血清を、提案されたＢＣＡＡ酵素試験に提出した。図３６は、古典的試験で測定された、測定されたセリックＢＣＡＡとＨＯＭＡパラメータとの間に強い相関関係を示す。

実施例１：材料及び方法

研究設計

システムの堅牢性と臨床サンプルの機能性を評価するために、健常人の尿プール、並びに健常者及び糖尿病患者の尿サンプルを使用した。臨床サンプルの収集に関し、非病理学的（対照）及び糖尿（糖尿病）の尿のサンプルは、仏国モンペリエのＬａｐｅｙｒｏｎｉｅＨｏｓｐｉｔａｌの内分泌学科から得た。個々のインフォームドコンセントは、患者及び対照の個体から得た。新たに発見された非安定化糖尿病患者１０人から、糖尿病の尿サンプルを収集した。尿サンプルを使用前に－８０℃で保存した。

前細胞微小流体構築

ＰＤＭＳＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃのチップは、ＡｕｔｏＣＡＤソフトウェアを使用して設計及び試作し、スタンフォード大学の微小流体ファンドリーにより、製造が実行された。微小流体チップを、ＰＴＦＥチュービングとｎｅＭＥＳＹＳＶ２シリンジポンプ（ＣｅｔｏｎｉＧｍｂＨ、独国）と接続した。微小流体プロセスは、Ｃａｎｏｎ７５０Ｄ又はＰｈａｎｔｏｍＶ７．３超高速カメラを搭載したＬｅｉｃａＤＭＩＬ顕微鏡を使用して画像化した。

分光測定、フローサイトメトリー、及び顕微鏡

異なるシステムの操作性を検証するために、合成生化学的ネットワーク及びプロトセンサが、インデューサを含む又は含まない総量１００μｌのＰＢＳにおいて接種され、又は患者由来の尿が、９６ウェルプレートにおいて１００μｌの総量に対してＰＢＳで１：２の比で希釈された。別段に指定しなければ、１時間のインキュベーションの後、相乗Ｈ１プレートリーダを用いて蛍光及び吸光度を読み取った。製造者のプロトコルに従って、ＳｉｅｍｅｎｓＭｕｌｔｉｓｔｉｘ８ＳＧ試薬ストリップを用いて、非安定化糖尿病患者由来の尿臨床サンプルを同時に試験した。フローサイトメトリー実験は、４８８ｎｍレーザーを備えたＧｕａｖａＥａｓｙＣｙｔｅベンチトップフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ）で行い、ＦｌｏｗＪｏｖＸソフトウェアを用いて分析した。共焦点顕微鏡アッセイを、６３ｘの油浸レンズ並びに３５５ｎｍ、４８８ｎｍ、及び５６１ｎｍレーザーを備えたＬｅｉｃａＳＰ８－ＵＶで実施した。

データ分析と統計

実験値は平均±ＳＤとして報告している。全ての実験は３回実施した。データ、統計、グラフ、及び表は、ＭＡＴＬＡＢ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ）及びＳｉｇｍａＰｌｏｔ（ＳｙｓｔａｔＳｏｆｔｗａｒｅＩｎｃ．）を使用して処理及び生成された。受信者操作特性分析のために、非病理学的尿で実施された７２の測定のセットを、１％ｗ／ｖグルコースを含有する尿で行われた７２の測定と比較した。

インシリコのモデリング、シミュレーション、及び出力信号の計算

ａ）ＨＳＩＭのモデル化

全てのシミュレーションで、前細胞の直径を１０μｍとした。ヒートマップを生成するために、偶然性を平均化するために、入力された濃度の点ごとに５つのシミュレーションを実行した。図４は、シミュレーション用に使用した、関連するＨＳＩＭモデルの式を用いた、生化学的な反応のための酵素的多基質機構を示す。

ｂ）前細胞の透過性のモデル化

本研究の目的のために、膜を介して培地から前細胞の内部へ入力されたバイオマーカー代謝物の拡散速度ｄｎ／ｄｔ（ｍｏｌ／ｓ）を、ＨＳＩＭにおいて実行した。これは、膜を横切る拡散速度が透過係数Ｐ、溶液濃度の差Ｃ１ａｑ－Ｃ２ａｑ、及び前細胞の面積Ａに直接比例するというＦｉｃｋの法則の修正によって与えられる受動拡散によって駆動される。即ち、

いずれの分子についても、Ｐ値、従って受動拡散の速度は、その分配係数Ｋに比例する。

式中Ｄは膜における物質の拡散係数であり、ｘは膜の厚さである。これらの実験パラメータは、リン脂質二重層を横切って拡散する分子の広いパネルについての文献において容易に見出すことができる。ＨＳＩＭは、透過係数Ｐ（ｍ．ｓ－１）を導入する裏付けとなる。本研究では、約０．０１ｍ．ｓ－１のＤＰＰＣ二重層に受動的に拡散するエタノール及びアセトンのＰ値を使用した。リン脂質二重層は他の有機溶質に対して本来不透過性であるため、入力されたバイオマーカー代謝産物の受動的な拡散を可能にするために、前細胞の膜にブドウ球菌α－溶血素の膜孔形成タンパク質を導入した。拡散係数は、広く測定されており、またＷａｎａｔａｂｅｅｔａｌ．（１０２）による最近の測定によれば、拡散係数は５．１．１０－１１ｍ^２．ｓ－ｌと推定されており、それは興味深いことに遊離水溶液における場合のほんの約１０分の１の大きさである。ＤＰＰＣ二重層が幅３．２ｎｍ（１０３）であることを考慮すると、透過係数を計算することができ、このことから１．６．１０－２ｍ．ｓ－１を得る。更に、前細胞の表面の１／３だけが溶血素治療に利用可能であり、それは０．５．１０－３ｍ．ｓ－１の値に相当すると仮定する。

ｃ）ＢＩＯＣＨＡＭのモデル化

時間的な論理指定を満たす定常状態（秒でのＴ）での濃度閾値（Ｎ及びＲ）を抽出するために有効領域を計算した。最初に、指定の論理式と、要求されたシステムの挙動に対応する数値的な時間的特性を持つ濃度パラメータの感度分析を、パラメータの０．５の変動で行った。これにより、システムの２つの最も高感度である初期状態の濃度パラメータを識別することができ、次いでそれを、指定を満たす構成の包括的なマップを使用して設計する空間を視覚化するために使用した。次に、Ｂｉｏｃｈａｍで実行される確率論的最適化法ＣＭＡＥＳ（共分散行列適応進化戦略）に従い、自動濃度パラメータ探索を行った。例えば、モデルＧｌｕＯＮｅの場合、このプロセスではＢｉｏｃｈａｍで次のコマンドが必要になる。

病理学的閾値に対応する入力された濃度パラメータに従って、全ての解析及びインシリコモデリングを実施した。入力されたバイオマーカーに対する以下の病理学的閾値が、臨床的な要件に従って合理的に特定され、計算及びパラメータの最適化に使用された：
ケトン＞１７μＭ（１０ｍｇ／ｄｌ、＞０の場合、病理的）
グルコース＞１．３９ｍＭ（２５ｍｇ／ｄｌ、病理閾値）
乳酸＞１０μＭ（＞０の場合、病理的）
ＥｔＯＨ＞１７．４ｍＭ（８０ｍｇ／ｄｌ、ＤＩＵに相当）
ＮＯｘ＞１０００μＭ

ｄ）ＨＳＩＭ確率論的シミュレータからＢｉｏｃｈａｍＯＤＥソルバの質量作用率への確率の変換

ＨＳＩＭは、区画の体積を考慮に入れて、濃度の観点ではなくコピー数の観点で、分子を管理する。Ｂｉｏｃｈａｍは濃度を使用しており、この場合、質量作用率の要素が本質的に体積のパラメータを統合する。単分子反応の場合、ＢｉｏｃｈａｍではＫは体積／時間であり、［Ａ］はコピー数／体積であり、Ｋ＊［Ａ］は単位時間当たりに起こる反応の数である。同様に、ＨＳＩＭはその確率に一定の時間ステップを組み込む。同様に、二分子反応の場合、ＢｉｏｃｈａｍにおいてＫは、体積^２／時間であり、［Ａ］及び［Ｂ］はコピー数／体積であり、単位時間あたりの反応事象が複数得られる。従って、ＨＳＩＭの確率はＢＩＯＣＨＡＭ質量作用率に変換するべきである。ＢｉｏｃｈａｍＯＤＥソルバで使用される質量作用率（ＭＡ）は、以下に従ってＨＳＩＭ確率論的シミュレータ確率（Ｐ）と関連付けることができる。

形態Ａ＋Ｂ→Ｃ［Ｐ］（１次反応）の二分子反応については、

形態Ａ→Ｂ［Ｐ］（０次反応）の単分子反応については、

τ、Ｖ、及びａは、ＨＳＩＭ反復ステップ（１００μｓ＝１０^－４秒）、実験的比例係数、前細胞の体積にそれぞれ対応する。

ｅ）吸光度及び蛍光マップの計算

図３Ｂ及び図６Ａに示すインシリコでのシステムの蛍光及び吸光度の出力を予測するために、計算された出力濃度を実験値に較正する必要があった。これは、実験的検量線を生成することによって達成でき、その場合濃度と信号との間の数学的関係を生じるように分析することができる（図７Ａ～図７Ｃ）

合成生化学回路の完全な特性評価と反応速度測定
図８～図１１を参照

顕微鏡の大きさ分散測定

前細胞の大きさの分散を評価するために、４０倍のレンズとＣａｎｏｎ５５０Ｄカメラを光電管に取り付けたＬＥＩＣＡＤＭＩＬ逆顕微鏡を用いて、前細胞調製物のランダムな大きさの較正顕微鏡写真を撮った。次いで顕微鏡写真は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアとカスタムスクリプトを使用して処理され、前細胞の自動の大きさ分析が可能になった。大きさの分散図をプロットし、Ｍａｔｌａｂソフトウェアのａｌｌｆｉｔｄｉｓｔ．ｍスクリプトを使用して適合させた。

本研究で使用された微小流体チップ
図１３及び図１４を参照

実施例２：合成生物学のための微小流体：前細胞を製造するための方法

微小流体とプロトセンサの調製と特性評価

ＰＤＭＳ微小流体チップは、ＡｕｔｏＣＡＤソフトウェアを使用して設計及び試作され、製造はスタンフォード大学の微小流体ファンドリーによって行われた。２０のゲージ穴をＰＤＭＳチップにて打ち抜き、ＰＴＦＥチューブ接続（１／１６ＯＤ、０．８ｍｍＩＤ）用にカスタマイズされたステンレス鋼のアダプタ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＳｍａｌｌＴｕｂｅ）を使用できるようにした。微小流体チャネルでの流れは、高精度ガラスシリンジを備えたＣｅｔｏｎｉｎｅＭＥＳＹＳシリンジポンプを用いて、変位駆動流により制御された。最良のカプセル化効率を達成するために、１／０．４／０．４μｌ／ｍｉｎ（Ａ／Ｂ／Ｃ）で維持された、プロトセンサ産生量の流速に対する強い依存性を見出した。ＬＥＩＣＡＤＭＩＬ倒立顕微鏡に約２０，０００ＦＰＳで搭載された超高速カメラ（Ｐｈａｎｔｏｍｖ７．３）で撮影した動画により、これらの流速でのプロトセンサの発生周波数を、約１５００Ｈｚと見積もることができる。

以前に記載した、交互ヘリングボーンミキサー（ｓｔａｇｇｅｒｅｄｈｅｒｒｉｎｇｂｏｎｅｍｉｘｅｒ；ＳＨＭ）（６６）として知られている装置を微小流体設計に導入した。これにより、ストークス流方式下で異なる溶液間において効率的で受動的、無秩序に混合することが可能になる。Ｗｉｌｌｉａｍｓｅｔａｌ．（６６）が提示した式に従い、効率的な混合を達成するのに約５サイクルで十分であると計算したので、２倍のサイクル（即ち、１０サイクル）を導入した。層状の生化学的な勾配と濃度の空間的な異方性により影響を受ける可能性があると推測した均一な内部内容物、正確な化学量論及び効率的なカプセル化を確実にするために、カプセル化の直前に生化学種を担持する２つのＣチャネルの完全な混合を達成すべく、この装置を設計に統合した。その場合、合成生化学回路は、カプセル化直前に自発的に集合する、つまりカプセル化機構を標準化して、生化学物質の性質への依存を減らすことができる。更に、この設計は、入力される流速の制御を介する化学量論的な微調整を可能にし、プロトセンサの簡単なプロトタイプ作成のための異なるパラメータを検証するのに実用的であることが実証された。

当戦略は、水中油中水（Ｗ－Ｏ－Ｗ：ＰＢＳの生化学的回路－オレイン酸のリン脂質－保存緩衝液Ａ）二重エマルジョンを生成する微小流体の流れ集中液滴生成設計に依存する。二重エマルジョンテンプレートは、記載された流れ集中チャネルの幾何形状で生成される。ＤＰＰＣリン脂質膜は、制御された溶媒抽出プロセスの間に自己集合する（保存緩衝液Ａに存在するメタノールによってオレイン酸が抽出される）。オレイン酸のＤＰＰＣ濃度を選択するために使用する推論は、Ｔｅｈｅｔａｌ．（５６）に適合している。簡潔には、オレイン酸溶液は１．１ｍＭのＤＰＰＣからなっていた。この濃度は、直径１０μｍの小胞の周りに脂質二重層を形成するのに十分な数のリン脂質が存在するように選択した。二分子膜におけるＤＰＰＣの１分子当たりの平均面積は、０．６４ｎｍ^２の値の近くで推定される（６８）。１０μｍのリポソームの脂質面積が３．１４．１０～１０ｍ^２であることを考慮すると、リポソームの全脂質二重層を構成するには、少なくとも８．１５．１０～１６モルのＤＰＰＣが必要となる。主要な二重エマルジョンに含まれるオレイン酸の最大の厚さを５μｍと仮定して、オレイン酸の体積を３．６６５ｐＬと計算することができる。小胞の周りに脂質二重層を形成するのに必要なリン脂質の量の５倍であるのと同様に、１．３３ｍＭのＤＰＰＣ濃度で十分であろう。更に、前細胞を製造するためのＤＯＰＣ、ＤＭＰＣ及びＤＰＰＣリン脂質について簡単に調査したところ、ＤＰＰＣは見かけの安定性及び優れた産生量を達成することが分かった。

選択的なバイオマーカーの入力と、前細胞の内容物と外部の培地との間の物質／情報の交換を達成するために、受動的な膜孔形成の細菌タンパク質α－溶血素を利用した。α－溶血素の細孔は、バイオセンシング用途に適した堅牢な膜貫通チャネルであることを同定させるいくつかの特性を有する。α－溶血素膜の細孔は膜で自動集合し、集合する特定の条件を必要とせず、広範囲のｐＨ及び温度にわたって安定しており、通常の状態で開いている。α－溶血素の膜貫通細孔は、事前に測定されたように、５．５±１．５×１０^－４ｓ^－１の受動拡散速度を有する合成脂質小胞の壁を通る選択的な方法で、糖及び代謝産物又はヌクレオチド等のイオンや小型の有機化合物の送達を行う。

新たに形成されたプロトセンサを含む微小流体チップの出力チャネルを、ＰＴＦＥチューブと、氷上に保持された緩衝液Ａを含む収集バイアルに接続した。５時間の製造後に、更にメタノールが蒸発できるようになり、約１ｍｌのプロトセンサが（カプセル化される容量で）得られた。緩衝液Ａの約１：５の最終的な希釈に対応するプロトセンサを含有する最終的な溶液を、更に使用する前、１週間の最大時間の間に、４℃で保存することができた。

測定のために、プロトセンサの溶血素処理を誘導１５分前に行った。１μＭの最終濃度のために、溶血素を添加した。前細胞溶液を、試験するサンプル（例えば、尿）に１：１の割合で逆希釈した。誘導は、２５℃でゆっくり撹拌しながら行った。全ての蛍光及び吸光度の測定は、１００μｌのｐ９６マイクロウェルにおいて相乗的ＨＩプレートリーダで行った。

表１：本研究で使用したストック溶液及び濃度。全ての化学物質及び酵素は、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈから購入した。ＧＩＤＨ：グルコース－１－デヒドロゲナーゼ、ＡＤＨ：アルコールデヒドロゲナーゼ、ＡＯ：アルコールオキシダーゼ、ＮＲ：硝酸塩／亜硝酸レダクターゼ、ＨＲＰ：西洋ワサビペルオキシダーゼ、ＬＯ：乳酸オキシダーゼ、ＡＢＴＳ：２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）、ＤＡＦ－２：４，５－ジアミノフルオレセイン。本研究で使用される酵素の更なる情報については、下記の表Ｓ２を参照のこと。ストック溶液は、使用するまで－３０℃に保った。レゾルフィン及びＡＢＴＳ溶液は、アッセイと同じ日に調製したか、１週間を超える保持はしなかった

表２：生化学的回路を構築するために本研究で使用された生化学的部分及び関連する反応速度パラメータ。

実施例３：ボトムアップ合成生物学のためのコンピュータ支援設計及びモデリング

設計のコンセプトを結果の予測に変換することは、圧倒されるほど複雑な生態に直面した場合には難しい課題である。従って、いっそう複雑な生化学的回路へスケールアップするには、設計支援のための自動化されたツールが必要である。例えば、指摘するのが興味深いことに、電子設計の自動化が、電子装置の大きさと容量の急速かつ幾何学的な発展を支えていた（即ち、ムーアの法則）（３０）。コンピュータ支援のモデル化、シミュレーション、設計、モデルの確認、感度、及び堅牢性解析により、アナロジーに続き、指定に従った生物学的回路とシステムのデノボ構築が大いにサポートされ、加速される可能性がある（３１）。

この１０年の間、システム生物学は複雑な生物学的システムを理解するためのモデリング、シミュレーション用のコンピュータツールの開発に焦点を当てているため、生化学回路のトポロジーと対象の生物学的プロセスを結びつける設計の原理を探求するのに大いに支援してきた（３０）。設計すべき生物学的システムの構成／パラメータ空間内で実装するための堅牢な構成を同定するのに合成生物学者を妨げる主な理由は、実験的にサンプリングする必要のあるシステムの大きさと共に指数関数的に増加する構成の数である。インシリコのシミュレーションとモデルの予測は、設計プロセスを支援し、特定のバイオセンシングとバイオコンピューティングの課題を解決するために合成生化学回路を構築できるペースで分離する。

プログラム可能な回路の設計には、操作可能な抽象的な実体が必要である。標準になっている生化学的な部分の集合体から複雑なシステムを構築できるようにするには、設計における組み立て可能性が重要である。この目的のために、部品、モジュール、装置、システムは階層状に組織化して（２）、全水準での合理的な連結、並びに設計プロセスで実行するタスクの分散ができるようにする。コンピュータ支援設計用ツールは、特にグラフィカルユーザインターフェイスでサポートされている場合、反復ステップの効率と容易さを最適化する（図１５Ａ）。この枠組にとって重要なのは、その生物物理学的、熱力学的、及び動力学的パラメータに関して完全に特性評価されている標準の基本成分の同定である。更にこれらは、設計のプロセスをスピードアップして、モデルの較正を容易化にするために、アクセスしやすいデータベースにおいて分類することができる。このアプローチは、合成生物学において非常に重要であり、インビボでの合成遺伝子ネットワークに対して能力が優れていることを証明している（遺伝部分のＢｉｏＢｒｉｃｋレジストリを参照（４））。同様に、研究室は、堅牢な生化学的部分及び装置を保管する階層化生化学データベースのＣｏｍｐｕｂｉｏｔｉｃＤＢ３６７を開発した。これは、本発明者らが常に洗練化と増強を行っている。

設計のプロセスは、システムの仕様を数学的観点で適切に定式化することから始まり、その後、標準化された生化学的部分を使用して回路を抽象的に実装する。この設計の枠組は、数学的記述又は生化学的パラメータ（測定又は仮定）に関する情報を考慮したモデルを使用し、次いでシステムレベルでの軌道及び挙動を定性的にインシリコに計算及び分析するために使用することができる。現実性（即ち、モデルの適合化）を最良に説明する生化学的仮定を作成するプロセスは、予測の信頼性及び精度に影響を及ぼすので重大であるが、一方で過度に複雑な仮定は、計算及び最適化速度及び効率にとって有害である。このステップは、インビトロの実施前に行われ、設計空間をマッピングし、設計の選択肢を探索することを可能にする。

次いで、合成回路の設計は、性能の指定を検証するためにパラメータ及び組成空間（即ち、初期の濃度、酵素の速度定数等）の定量的な評価を受ける。いくつかの生物学的部分に関する状況での網羅的な特性評価が欠如していることで、頻繁に、洗練及び実験での一致（データとの適合の良さ）、並びに理論の反復の連続的な段階が課される（図１５Ｂ）。モデルの正しいパラメータは、予測的な解を得るのに重要であるが、反復最適化はこのプロセスを促進できる。

入出力伝達関数と回路構成に対するその感度の包括的なマッピングは、失敗モードを低減するため、及び堅牢性（即ち、構造的又は環境的な破壊が存在していても、持続的で正確に機能するための能力として定義される）を保証する生化学回路のプログラミングのために、最大限重要である（３２）。モデル分析は頻繁に、感度と堅牢の分析を含む。感度分析は、摂動させたときのモデルの性能に影響を及ぼすパラメータ源を特定するために使用される。これにより、許容可能なパラメータ変動下での性能の変動の推定が可能になる。この分析は、特に回路モデルパラメータが不確実であるか、大きな変動性があると仮定されている場合に、非常に有益である。伝達機能に影響を与えずに構造的又は動的な摂動を経て維持する異なる設計の能力は、堅牢性分析により評価することができる。この分析は、設計プロセスに貴重な情報を提供できる。

設計プロセスにはモデリングの形式論が必要であり、それはモデルを記述する言語として定義することができる。これは、グラフィカルな記述内で、回路のトポロジーとアンダーレイ機構を再現する。形式論の機構は、ブールの方法、決定論的、確率論的、エージェントベース、又はハイブリッド的な方法であり得るシミュレーションの方法を含む。この選択は、特定の形式論の記述力と予測力を調整する。次に、モデリング環境では、生化学的システムをシミュレートするために選択された形式論をインシリコに実装する。この目的のために、例えば、ＣＯＰＡＳＩ（３４）、ＣｅｌｌＤｅｓｉｇｎｅｒ（３５）、又はＳｙｎｂｉｏＳＳ（３６）、及びＳＢＭＬ（３７）（ＳｙｓｔｅｍｓＢｉｏｌｏｇｙＭａｒｋｕｐＬａｎｇｕａｇｅ）等のモデル用の標準化された交換フォーマットといった多数のソフトウェアのパッケージが、システム及び合成生物学のために開発されている。

プロセスの様々なステップを、最も一般的な決定論的モデルや確率論的モデリング等、多様な計算方法論やモデル化の枠組のタイプによりサポートすることができる。決定論的モデルは、分子の相互作用を記述する数値パラメータを含む分析用の式（ごく普通の微分方程式、ＯＤＥ又は偏微分方程式、ＰＤＥ）を使用して生化学的システムを記述することができ、その値は確かである。従って、定義上、出力は定義されたパラメータ値及び初期の条件のセットに対して正確に再現可能である。空間的に均質であることを仮定すると、ＯＤＥを使用してシステムを正確に予測することができる。ＯＤＥには、以下による生化学反応又は種の質量バランス（濃度）が記載されている。

式中、ｄＸ／ｄｔは種Ｘの濃度の変化率であり、ＸとＮは種の濃度のベクトルであり、θはパラメータのベクトルであり、Ｆ（Ｎ，ｔ；θ）は、濃度に変化率を関係付けるベクトル関数である（３８）。動的シミュレーションを通じてシステムを記述している一連の式を解くと、モデルにおける種の濃度の時間依存的な軌跡が得られる（図１６）。

確率論的モデルは、種の間でのランダムな分子の相互作用を記述する方程式及びパラメータを使用するので、生物系に固有の変動を説明することができる。これは、雑音伝播の探索とシステムのダイナミクスへの影響に関心がある場合に価値があるということが判明し得る。相互作用する種の集団間の各反応の有名なＧｉｌｌｅｐｓｉｅのアルゴリズム（３９）を用いた化学的マスター方程式又は確率論的シミュレーションアルゴリズム（ＳＳＡ）等の確率論的な比率の法則を説明するために、確率方程式が使用される。その仮定は、所定の時間枠内の生化学的システムは、反応速度に比例する比率のパラメータλで、ポアソン過程下でランダムに相互作用する分子の規則に従うということである。従って、決定論的モデルと比較して、ＳＳＡシミュレーションは離散量を操作する。

いずれの方法も利点と不都合な点が存在し得る。しかし、確率論的モデルや決定論的モデル、並びに連続的又は離散的空間のモデリングに依存すると、システムの長期の運命に関して根本的に異なる結論に到達することができる（４０）。ＯＤＥは、実装、最適化、及びシミュレーションを容易にし、モデルの広範な数学的解析を実行するのに適しているが、確率論的方法は通常大量の計算力を必要とする。しかし、確率論的モデルは、連続する値を処理するＯＤＥと比較して、離散分子の実体を考慮に入れているため、現実性のシミュレーションにより近いものをサポートしていることに留意されたい。そのうえＯＤＥは、特定のダイナミクスを捕らえる能力に限界を示したり、更には拡散などの物理法則に反したりする可能性もある。この差は、種の濃度が低い場合とは大きく異なる結果につながる可能性がある。異なるアジェンダに特化したこの２つのアプローチは、生化学回路の研究を補完する。しかし、それらは頻繁に、両立性のために元のモデルの変換を必要とする別個の入力形式が必要となる。

以下の例４では、本研究の目的で共同開発し、洗練させ、使用した２つのソフトウェアを提示及び紹介する。昨今開発されたグラフィカルインターフェイスＮｅｔＤｒａｗと共にＨＳＩＭ（３６８、５９９、６００）（ＨｙｐｅｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅＳｉｍｕｌａｔｏｒ、Ｐ．Ａｍａｒにより開発）、及びＢＩＯＣＨＡＭ（４３、４４）（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒａｃｔＭａｃｈｉｎｅ、Ｆ．Ｆａｇｅｓｅｔａｌ．により開発）である。

実施例４：ＨＳＩＭ及びＢＩＯＣＨＡＭソフトウェア

Ａ）ＨＳＩＭ

ＨＳＩＭは当初、上部構造（Ｈｙｐｅｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）と呼ばれる大きな分子集合体の凝集と解離をシミュレートするために開発された。ＨＳＩＭは前細胞にカプセル化された生化学回路の定性的及び定量的シミュレーションのために本研究で使用した汎用プラットフォームである。これは、化学反応の確率論的シミュレーション及び実体中心の（即ち、マルチエージェント）シミュレーションという２つの効率的なシミュレーション手法を利用する。実体中心のアルゴリズムは、前回の近似が間違っていたときにモデルの空間的異質性を考慮に入れることができる一方、確率論的シミュレーションアルゴリズム（ＳＳＡ）は、空間的に均質な反応物の解を仮定して使用される。計算リソースに関して、ＳＳＡ法はシミュレート可能な反応の数に限界があるのに対し、実体中心のシミュレーションは、操作できる種の量によって制限されている。

実体中心のシミュレーションでは、各分子は、それらの環境において独立して考慮され、この場合ブラウン運動によって定義されるランダムウォークに従って拡散することができる。次に、相互作用する実体の系の時空間の軌道が、特定の規則（即ち、パラメータ）、並びに体積（即ち、区画）及び他の実体（即ち、生化学的反応：複合体の形成又は解離、消失、又は分子の種類の変化）内での相互作用に従って計算される。

シミュレータは、分子間の反応の規則によって駆動される確率論的自動装置である（図１７）。ＨＳＩＭは、単分子及び二分子の２つのカテゴリーの生化学反応を操作するが、２種を超える反応物の希少な自然な反応は、２分子反応の組み合わせに還元される。単分子反応は、関連する確率で、複数の有限状態の間を移動することができる分子を説明する。２分子反応の場合、２つの反応性分子が質量作用則に従って衝突し、反応速度論に反発する確率が適用されて生成物が得られる。

ＨＳＩＭは、連続する空間の区画及び副次的な区画を管理することができ、小型リポソームから真核細胞（１００ｎｍ～１００μｍ）までの大きさを管理するために最適化されている。それは、対象の膜を横切る種の拡散の特性評価をする透過性パラメータと同様に、区画の大きさ、幾何形状の指定を可能にする。

ＨＳＩＭは、タイプ、位置、大きさ、及び相互作用に関して、分子の実際及び離散的なコンピュータ時間記録を保持する。各時間ステップにおいて、確率のルールが全分子に適用される。使用した時間ステップ（１００μｓ）は、実際の細胞基質のクラウディングで観察された分子のブラウン運動の変位の平均に従って、１０ｎｍの距離で最適化した。

巨大分子は別だが、大部分の代謝産物の分子は、大きさがブラウンの拡散率に影響を与えないと考えることができるので、ＳＳＡアルゴリズム（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ確率論的方法）を用いて大域的に容易に処理することができる。代謝産物に関する高次のコピー数の近似により、それらを容量において統計上均一に分布しているものとして扱うことが可能になる。ＨＳＩＭは、衝突の平均回数及び後続の反応を各時間ステップで計算することによって、実体と代謝産物の両方を同時に管理できる。

以下は、区画と副次的区画及び２種類の分子（代謝産物及び実体）を備えるモデルを記述するＨＳＩＭの入力の例である。

Ｂ）ＢＩＯＣＨＡＭ

ＢＩＯＣＨＡＭは、合成生化学的システムのモデル化のために開発されたソフトウェア環境である。これは、ルールベースの言語と、時間論理ベースの言語とで構成され、ブール、反応速度、及び確率論的モデルのシミュレーションと分析、時間的な論理（即ち、計算木論理（ＣＴＬ）、又は線形時相論理（ＬＴＬ））における生物学的特性の定性的及び定量的な実験知識の形成をサポートする。ＳＢＭＬ標準の形式で、分子の濃度及び反応速度の記述を伴う生化学反応系を管理する。

ＢＩＯＣＨＡＭは、モデル確認メソドロジを使用してモデルを体系的に検証、分析、最適化するために、時間的な論理で公式化された特定の挙動について、未知のモデルパラメータを最適化及び推論するためのパラメータ空間の探索を自動化する。

時間的論理式の違反度を用いた評価関数に従って、堅牢性と大域的感度の分析を行うことができる。違反度は、摂動されたシステムの挙動と、時間論理式によって公式化された特定の挙動との間の距離を表す。ＢＩＯＣＨＡＭは、決定論的又は確率論的モデルの数値シミュレーションによって、動的特性の堅牢性の推定と、得られた多数の種類の摂動を自動的に計算する。生化学的システムの性能を測定するための時間論理式の満足度の概念を導入した。システムの性能の大域的に関連する尺度として、これらの方法の範囲を広げることが可能であったが、合成及びシステム生物学の以前のモデルは、特定の挙動に焦点を当てていた。

実施例５：プロトセンサの動作原理、設計、及びアーキテクチャ

Ａ）アーキテクチャと一般的な機能

本研究で説明する前細胞は、熱力学的平衡に向かって駆動するときに医学的バイオセンシング及びバイオコンピューティングの課題を達成するように組成がプログラムされた小胞性の合成生物系である。当アーキテクチャでは、細胞と同様に、機能（即ち、信号の感知、処理、及び出力の生成）をサポートするために必要な生化学的作業は、酸化還元反応に由来する。この有用な潜在的な生化学的エネルギーは、製造中にもたらされ、カプセル化された電子供与体（例えば、ＮＡＤＨ等）として保存するか、エネルギーに富んだ分子入力（例えば、グルコース）から抽出される。

従って、プロトセンサのアーキテクチャは、合成回路を含む断熱された内部の定義によって空間をデジタル化することを可能にするリン脂質二重層内にカプセル化された生化学的合成回路と、試験する培地（例えばヒト臨床サンプル）からなる外部とからなる。

この本研究では、前細胞は、合成回路を含む複雑な水性培地をカプセル化する、生物学的な大きさの特定のタイプの小胞区画（巨大単層リポソーム（ＧｉａｎｔＵｎｉｌａｍｅｌｌａｒＶｅｓｉｃｌｅｓ）、ＧＵＶ約１０μｍとしても知られている）を指定している。多くのタイプの前細胞は、それらの膜の性質に関して記載されているが、それらは一般に、高次の両親媒性分子からなる。これらの両親媒性物質、例えばリン脂質又は合成コポリマーは、親水性の頭部の方向及び疎水性鎖を含み、これらは二重層に集合させることができる。水性培地と接触している親水性頭部及び各層の内部にある疎水性鎖の向きは、熱力学的に有利である。前細胞の膜二重層の物理化学的性質は、両親媒性物質の性質に強く依存する。それらは、浸透性、厚さ、安定性、又は弾性に影響を与える。

全ての両親媒性物質が小胞への集合を維持できるわけではなく、化学構造が膜の熱力学に重要な影響を及ぼす。無次元の充填パラメータＰは、溶液における両親媒性物質の分子形状を表し、対応する集合体の形態を規定する。次のように表すことができる。

式中、vは、図示のように、疎水性部分の体積、親水性－疎水性界面領域、及びｌは疎水性部分の長さである。安定した二層及び前細胞の小胞集合体を形成するためには、Ｐは約１でなければならない。従って、本研究では、前細胞の製造に広く用いられてきた適切な充填パラメータの共通のリン脂質、即ち、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、及びジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）の使用を調べた。

重要なことに、バイオセンシングを行うために、プロトセンサは、内部と進化する培地との間で物質と情報の交換を必要とする。この目的のために、合成回路のカプセル化の後、次の膜改質ステップを行う。３ｋＤａの質量カットオフを有する、α－溶血素膜貫通タンパク質の細孔の自己取り込みを介して、当システムで入力として機能する小さな有機分子に対して、リン脂質膜が選択的に透過性になるアプローチについて見て取れる（２８）（材料と方法を参照）。

Ｂ）急性糖尿病合併症の鑑別診断のためのインビトロなアルゴリズムのプログラミング

本発明者らの目標は、合成生化学回路を基質として用いて、ブール関数として公式化されたインビトロ診断プロセス（即ち、バイオマーカーのパターンのバイオ検出による特定の病状の診断）を実施することができる医療のプロトセンサを設計することであった（図２０Ａ）。この目的のために、糖尿病の急性代謝合併症、即ち、糖尿病性ケトアシドーシス、高血糖の高浸透圧状態、低血糖、及び乳酸アシドーシスを分類するのを可能にする臨床的に有用な医療アルゴリズムを統合する実行可能性を評価することを選択した（図１９）。これらの障害は医療の緊急事態を構成し、高い医療上の負担及び社会経済的負担と、重大な死亡率及び罹患率と関連していることが知られている。更に、糖尿病の早期発症に関するスクリーニングの解決策を実施することも意図していた。従って、本研究は新規の工学的な概念を扱うだけでなく、解決策を模索している具体的な臨床上の問題にも取り組んでいる。

これらの診断プロセスは、５つの異なる尿のバイオマーカーの存在をモニタし、尿中の特定の濃度及び組み合わせ、即ち、グルコース、ケトン、乳酸、エタノール、及び一酸化窒素の評価を介して可能である（図１９）。そこで、単純なブール演算を使用してこれらの特定の入力を処理できる合成回路を実装することに焦点を当てた。この概念の具体的な証明を念頭に置いて、他のアジェンダや病理用のプロトセンサの体系的で多目的なプログラミングを可能にする普遍的な枠組の開発にも重点を置いた。事実、インサイチュでの疾患診断を多重化するために、多数の異なるプロトセンサをプログラムして、複数であるが特定の臨床的な問いに答えることができた（図２０Ｂ）。

実施例６：前細胞の分子プログラミング：インシリコの設計から合成生化学回路の実験的検証へ

Ａ）インシリコの設計、シミュレーション、及びモデルの確認

プログラムされたバイオセンシング及び使用者定義の意思決定アルゴリズム及びバイオアクチベーションを達成するために生物学的システムを合理的に設計する能力は、体系的なアプローチの範囲内での正確なツールを必要とする。従って、生物学的部分のボトムアップの集合体から合成生化学回路の設計をサポートするインシリコの枠組を最初に開発した（図２０Ａ～図２０Ｂ）。このコンピュータ支援の枠組には、次のステップが含まれる。

対象の（医学）アルゴリズムによるブール論理と分子の入出力指定に関する抽象プログラムの設計。このステップでは、定性的及び／又は定量的な時間的論理式によって表される、予想される基準の挙動に関する合成生化学的システムの時間的な論理特性を公式化することができる（１３）。これは、初期の状態（即ち、病理学的バイオマーカー濃度閾値等）に関するパラメータの指定を含む。

分子生化学回路を使用した、以前に定義されたアルゴリズムの実施：分子的なブール論理操作を実施するためのデータベース及び文献から得られたネットワークトポロジー内の適切な酵素及び代謝産物の同定。このステップでは、失敗モードを最小限に抑えるために、構成可能で反応速度上好ましい構成要素が選択される。このプロセスは、生化学的部分の最近開発されたコンピュータ支援抽出、及び生物の代謝ネットワークからのブール論理ゲートを用いて自動化され得る（４５）。生化学的モジュールの実験的な特性評価は、このプロセスを補助することができる。使用者が扱いやすい設計と相互作用ネットワークのマッピング、反応のルール（反応速度の式の有無にかかわらず）、濃度のパラメータ、並びに体積、種の位置、及び区画の透過係数等の空間パラメータを割り当てるために使用される場合は、Ｎｅｔｄｒａｗソフトウェア。この時、Ｎｅｔｄｒａｗは、モデルのＨＳＩＭ及びＢＩＯＣＨＡＭのコードの自動生成に使用される（初期の状態の指定、数値パラメータの定義、区画の体積、不変量、事象、分子種と位置の宣言、システムの挙動の指定）。

確率論的シミュレーション（ＳＳＡ）は、ＨＳＩＭソフトウェア内で最初に実行され、反応速度的及び機能的に好ましい回路を検証し、全体の挙動を予測し、機能を評価し、設計空間を手動で探索して、洗練させるべき適したパラメータの構成を同定する。

次にＢＩＯＣＨＡＭシミュレーション（ＯＤＥソルバ）を実行して、システムの特定の挙動の有効性領域を計算し、感度の分析を実行して、その時繰り返し最適化できる感度のパラメータを特定し、特定のパラメータの変動に対する堅牢性を測定する。従って、モデルは時間的論理指定に関して評価される。感度の高いパラメータに関連する適合するランドスケープを計算することで、実験的なインビトロで実行するための堅牢なパラメータ（即ち、種の濃度、反応速度パラメータ、初期値、又は制御パラメータ等）を選択するために使用できる、特定の挙動に適合する適切なパラメータ空間を視覚化し、同定することが可能になる。所定の一連の定量的な時間特性を満たすパラメータ値に対して、Ｂｉｏｃｈａｍに統合されたＣＭＡＥＳ方法論（共分散行列適応進化戦略）（４６）を用いて、検索を自動化することができる。

使用者定義のシステムの指定を満たすパラメータが見つかると、ＨＳＩＭ確率論的シミュレータを使用して、プロトセンサの完全な伝達関数を検証し、細かくマッピングすることができる。その後、システムを実験的に実施し、その機能をインビトロで評価することができる。設計プロセスの反復は、各ステップで実行できる。

図１９に示す医療アルゴリズムを、２つのバイオマーカーを入力とする３つの単純な生化学的システム（その真理値表を図２１Ａに示す）に分割し、分配した。それらを、ＧｌｕＯＮｅ（グルコースとアセトンを入力とする）、ＬａｃＯＨ（乳酸とエタノールを入力とする）、及びＧｌｕＮＯｘ（グルコースと一酸化窒素を入力とする）と名付けた。生化学的実施（即ち、ネットワークのトポロジーを含む）は、この目的のために開発されたカスタムのコンピュータツールを使用してインシリコで支援され、使用者定義の指定を満たす酵素的なブール論理ゲート及び回路を検索するため自然の生化学的ネットワークの系統的な利用を支援する（図５Ａ～図５Ｂ）。本発明者らは、４種、３種、及び２種の異なる酵素をそれぞれ含む６種、５種、及び４種の異なる生化学的実体を必要とする、並行して作動することができる３種の独特かつ絶縁された最小の系を同定した。正式な設計を可能にした部分に関する生化学的な知識をＢＲＥＮＤＡデータベースから抽出した（更なる詳細は表１、図３Ａ～図３Ｂ及び図６Ａ～図６Ｃを参照）。これらの回路で起こる分子信号処理は、ＮＡＤＨ（出力１，３４０ｎｍ吸光度）、レゾルフィン（出力２，５７１～６００ｎｍ蛍光）、ＡＢＴＳ（出力３，４２０ｎｍ吸光度）、及びＤＡＦ（出力４，４８８～５１５ｎｍの蛍光）という測定可能な出力信号の分子の生化学的合成をもたらす。生化学的な実施と同様に、医療アルゴリズムに対応するブール形式論と真理値表を図２１Ａ（図６Ａ～図６Ｃにて詳述）に示す。

最初に、３つの回路の推定挙動を評価するためにＨＳＩＭで確率論的シミュレーションを行った（図２１Ｂ）。この目的のために、非カプセル化合成回路の最適化されていないモデルを使用した。ここで初期条件（即ち、種の濃度）は経験的に決定した。様々な濃度のバイオマーカーの入力による誘導後のシステムの状態を予測し、計算された分子出力信号をヒートマップとして表した。インシリコで計算された分子濃度と実験測定信号との間の関係は、事前に較正されていた（詳細については方法を参照）。これにより、理論的な信号の倍数変化と、近似のデジタルの応答とをかなり満たす、ブール論理操作を検証することができた。更に、これらのモデルのスイッチング閾値は、バイオマーカーの入力の有用な臨床感度と良好に一致していることが見出された（病理学的閾値：ケトン＞１７μＭ（約１０ｍｇ／ｄｌ）、グルコース＞１．３９ｍＭ（約２５ｍｇ／ｄｌ）、乳酸＞１０μＭ、ＥｔＯＨ＞１７．４ｎＭ（約８０ｍｇ／ｄｌ）、ＮＯｘ＞１０００μＭ）。

Ｂ）インビトロでの実験的検証

次に、前細胞内にカプセル化する前に、合理的に設計した合成回路の実験的挙動を調べた。本発明者らは、室温で組換え酵素及び合成代謝産物を使用して、同じ初期条件（即ち、回路の構成要素の濃縮）である、以前にシミュレートされたモデルの試験管でのインビトロの実施に進んだ。様々な初期条件（回路の構成要素の存在／不在及び入力されるバイオマーカーの病理学的濃度の存在）にある複数の実験を行い、出力信号（蛍光又は吸光度）の生成を測定した。これにより、論理操作の機能的で詳細な実験的特性評価を詳細に理解することができた（図１９Ｃ、図９、図１０）。興味深いことに、反応速度及びエンドポイントの測定は、ＨＳＩＭの予測と非常に良く一致している。加えて、時間の要件は６０分未満であり、回路は、ブール論理の指定に正確に従っていた。出力２、３、及び４は、人間が判読可能な出力信号を期待どおりに出力した。信号対雑音比（ＳＮＲ）をバイオコンピューティング効率（４７）の定量的尺度とみなすと、これらの合成生化学回路は、約２０ｄＢ、３４ｄＢ、１４ｄＢ、２６ｄＢの出力１、２、３、及び４それぞれに対して計算されたＳＮＲに関して、指定されたブール論理に従って、分子信号を処理する際に、非常に良好な能力を示すことが見出された。

本研究では、出力１のＬａｃＯＨシステムの伝達関数をインシリコで調べることに関心があったが、実験の検証にはまだ進んでいなかった。実際、出力１と出力３は、この構成ではこの吸光度が重複しているので、簡単に差し引いて二重の読み出しを得ることができた。しかし、直接的な臨床的有用性を示さなかったため、これは本研究の直接の目的ではなかった。同様に、以下の実験作業では、ＬａｃＯＨ及びＧｌｕＮＯｘ系について、出力３及び出力４を測定した。これらの系は、更なるインビトロでの特性評価の対象となる。

実施例７：プロトセンサ及びそのプロトタイプを製造するための微小流体アプローチ：前細胞における合成回路のカプセル化

Ａ）理論的考察

生物医学的な分析のための堅牢なバイオセンサとして前細胞を開発するには、物理化学的性質を最も細かく制御する必要がある。従って、明確な大きさ、脂質の組成、酵素含量、触媒の能力、及びカプセル化された生化学種の安定性を備える安定した前細胞を実現するために、パラメータの微調整を確実にする製造方法が必要とされた。

前細胞膜システムは、実際の熱力学的平衡ではなく、反応速度的に有利な状態、又は局所エネルギーの最小値内に封じられた状態で存在する（４８）。これは、製造の効率が、選択された両親媒性生化学及び物理的な集合プロセスに強く依存することを示唆している。これはまた、重要な収率及び信頼性の高いカプセル化のプロセスを得ることが、容易な技術的な行程ではないことを意味する。

穏やかな水和及び電気泳動により、１９６９年における寸法を合わせた細胞の小胞の形成の最初に公表された方法（４９）以来、最も発展した方法論は、２つの一般的な製作技術、即ち、水和及び電気泳動に分けることができる。最もよく記載され、一般的に使用される技術は、ガラス面の乾燥したリン脂質膜の水和を含む。本研究の目的のために、最初にこれらの基本的技術を調査した。このプロセスは、摂動に非常に高感度であることを示し、収率が低く、多分散性及び小胞の大きさが制御されず、再現性が低いことが実証され、最も重要なことに、様々な生化学的実体のカプセル化において正確な化学量論に対応することができなかった。

より最近の巧妙な方法がその後説明され、それは、今や油中水滴型エマルジョン移動法として知られている。それはＰａｕｔｏｔｅｔａｌ．（５０）が最初に開発したものであり、前細胞の研究の最高の利益が証明された（１４）。要するに、この技術は、油中水滴の第１のステップでの生成に依存し、リン脂質を相界面で組織化させる。次に、第２のステップにおいて、これらの液滴は、別の相界面を介して移動され、それによって二重層が生成される。興味深く、正確で汎用性の高い技術であることは証明されたが、単分散性と高いスループットの要件を満たすことが依然できずにいた。

最初の出現後、微小流体はまもなく高度の精度で調整された両親媒性小胞を設計する道を生み出した（５１）。小胞を製造するための従来の手法は、両親媒性物質の自己集合の遅くて低い効率に依存している。しかし、微小流体装置により、指向性膜の集合の正確な制御が可能になり、膨大な科学文献が作出された。流体力学的な流れの集中（５２）、パルスジェット（５３）、又はエマルジョンテンプレート（５４～５６）等の方法論が浮かび上がって、小胞の構造を設計し、特定の用途に合う新たな機会をもたらした。従って、これらの実施例では、２つの微小流体アプローチ、即ち、指向性及び非指向性の自己集合（図２２）を通じて、合成生化学回路のカプセル化を検討した。

本発明者らが非指向性自己集合に使用したアプローチは、流れ集中装置としても知られている微小流体連続フローミキサーに依拠しており、この場合対象の両親媒性物質を含む溶媒は、マイクロチャネルクロス結合の中央入口に注入されて、側部のチャネルの溶剤の流れにより、更に小さな流れに狭まる（図２２、右）。分子の拡散によって駆動される混合は、２つの流体力学的に集中した流れ（５７）の間の境界面に、流速依存的に現れる。流速は集中した流れの幅を制御し、従って、時間と空間の分解能に応じて混合し、マクロな規模の状況では達成できなかった、複雑ではあるが精密な混合プロセスを可能にする。これらの能力は、リン脂質の構造化された二重層への集合（例えば、単分散の大きさのリポソーム及びポリマーソームの設計）を制御するためのこれらの装置の使用を動機付けた。両親媒性小胞は、例えば界面でのリン脂質膜の自己集合による持続的な二重層の成長に依存する複雑な機構によって、流れの集中している流体の界面に形成できる。界面でのリン脂質濃度が流速に依存するので、単に流速を制御することによって小胞の大きさを調整することができる（５７～５９、５２）。非常に魅力的ではあるが、このアプローチを適用するとき、カプセル化効率が信頼できないことに悩まされた。カプセル化効率は、大きなタンパク質に比べて小分子が熱力学的に好ましいカプセル化を示すことができ、前細胞の集合のプログラム可能性に劇的に影響する現象であった。更に、この技術で達成可能な最大のリポソームの大きさは、約１５０ｎｍであることが示された。この大きさはカプセル化された材料の複雑さを制限する。

この文脈において、今度は、指向性自己集合及びカプセル化に依存した別の微小流体アプローチを追求することに決めた。微小流体技術を使用して、単分散の単一油中水滴型エマルジョンを生成することは容易であり、これは一般に液滴微小流体として知られている分野全体を構成する。興味深いことに、この手法は、二重の水－油－水エマルジョンを拡張することができ、エマルジョンのテンプレートの小胞を生成するために更に利用され、カプセル化効率が総計に近い均一な大きさの較正されたエマルジョンを生成するルーチンの能力によって促進される。小胞膜を模倣するために二重エマルジョンのテンプレートを生成することができ、この場合は油相からなる。次いで、薄い油相を有する二重エマルジョンを得るためにエマルジョンの生成を調整することができる。そのため、両親媒性物質が油相に溶解すると、これらのアーキテクチャは油の除去を介して実際の両親媒性二分子膜小胞に変換できる（６０、６１）（図２３Ａ～図２３Ｃ）。

この実施例で検討した主な微小流体設計は、液滴生成機構を利用する。第１の設計と同様に、それらは流れ集中装置とも説明できるが、今回は液滴を生成するために異なる相の界面でせん断を導入するために使用される。２つの相（即ち、油－水）の存在は、異なる流体から生じる慣性力、粘性力、及び界面張力が競合する系において、過剰な複雑さをもたらす（６２）。しかし、前述したように、微小流体ドメインはストーク流を取り扱い、支配的な表面張力に関連する層流の特性は均一な界面を生成する。

本発明者らは、１０年前にＵｔａｄａｅｔａｌ．（６３）によって実証された１段ステップの二重エマルジョン生成を適応させた。それ以来、多くの設計が、微小流体チャネルの幾何学形状内でこの戦略を適応させることを意図して成功させた。基礎をなす機構は、油相に入り、それ自体が別の水相に滴下する水性液滴の液滴形成レジームを利用している。これは、両方の分散相が滴下レジームにあり、せん断が同時に破損を生じる場合に起こる。チャネルの表面への濡れ性に関する異なる相の挙動は、液滴の生成にとって極めて重要である。実際には、他方の中に分散される相は、効率全体を確保する（即ち、相の反転を減少させる）ために、チャネルに対して非濡れ特性を備えるべきである。重要なことに、ＰＤＭＳ装置における濡れ特性は、例えば、本発明の場合、ポリビニルアルコール処理が完璧な水の濡れ特性を保証し、油の濡れ性がないようにする等の化学処理を用いて増加させることができる（６４）。油相と水相は速度が異なり粘性のせん断が界面に誘起される。この現象は、界面の面積を最小にし、それによって液滴を生成する傾向がある界面張力から生じる毛細管の応力によって安定化される。前述したように、この機構は毛細管の数で表すことができる。界面張力は面積により規定されるが、粘性力は体積に基づく。これは重要である。なぜなら、少ない毛細管数（即ち、マイクロチャネルの仮定）では、粘性力、従って流速が液滴の破損を引き起こす主な影響になるからである。毛細管数は表面張力に依存するので、界面活性剤の添加（即ち、表面張力及び毛細管数の減少）を介して液滴の破損を容易にし、液滴の球形を安定化させることができる。本発明者らの設計では、最高の製造スループットを保証するジェットのような構成に留まるために、高い流速を使用した。

従って、本発明者らの戦略は、水中油中水型（Ｗ－Ｏ－Ｗ：リン酸緩衝液における生化学回路－オレイン酸中のリン脂質－緩衝液）二重エマルジョンを生成する微小流体の流れ集中液滴生成設計に依拠していた。二重エマルジョンのテンプレートは、記載した流れ集中チャネルの幾何学的形状において生成される（図２５Ａ）。次いで、ＤＰＰＣリン脂質膜は、緩衝液に存在するメタノールによってオレイン酸が抽出される制御された溶媒抽出プロセスの間に自己集合する（図２３Ｂ及び図２３Ｃ）。オレイン酸のＤＰＰＣ濃度を選択するために使用する合理的な方法は、直径１０μｍの小胞の周りに脂質二重層を形成するのに十分な数のリン脂質が存在するように濃度を計算することにある（詳細な計算は材料と方法において見出せる）。オレイン酸及びメタノールは、他の無機溶媒と比較して生体適合性及び酵素に対する無毒性があるという利点を示し、有害な化学的相互作用を最小限に抑えるように選択された。

加えて、前細胞を製造するためのＤＯＰＣ、ＤＭＰＣリン脂質を調べ、ＤＰＰＣが、より明らかな安定性と優れた生産収率を達成することを見出した。ＤＰＰＣ小胞は、浸透圧のストレスに耐える能力があり、長期間の安定性及び室温での堅牢なカプセル化を示したので、前細胞構築のための最も堅牢なリン脂質であることを見出した（図２５Ｃ）。これは、アシル鎖の長さ（従って、脂質転移温度）の増加及びアシル鎖の完全な飽和が、安定性に正比例するという事実によって説明することができる。更に、ＤＰＰＣは透過性が低く、天然のタンパク質（例えば、血清タンパク質）による酸化及び破壊の影響を受けにくいため、より大きな直交性及び汎用性を提供する（６５）。

Ｂ）実験の設計及び結果

作業用微小流体装置を図２４に示す（特別な実験の詳細は材料及び方法にて見出せる）。簡潔に述べると、微小流体チャネルの流れは、高精度ガラスシリンジを備えたナノメートルシリンジポンプを用いた変位駆動流によって制御され、コンピュータインターフェースでリアルタイムに制御されていた。最良のカプセル化効率を達成するために、１／０．４／０．４μｌ／分（それぞれ保存緩衝液／油＋リン脂質／生化学的回路）で維持された流速におけるプロトセンサの収率の強い依存性を見出した。製造プロセスのリアルタイムの視覚でのモニタリングにより、製造プロセスの正確な制御が可能になった。更に、２０，０００ＦＰＳの超高速カメラから測定することで、これらの流速でプロトセンサの発生頻度を約１５００Ｈｚと推定することが可能である（図２）。

微小流体流の集中液滴生成設計を図２５Ａに示す。本発明者らの微小流体設計に、先に記載した、交互ヘリングボーンミキサー（ｓｔａｇｇｅｒｅｄｈｅｒｒｉｎｇｂｏｎｅｍｉｘｅｒ；ＳＨＭ）として知られている装置を導入した（６６）。これにより、ストークス流方式下で異なる溶液間において効率的で受動的、無秩序に混合することが可能になる。層状の生化学的な勾配と濃度の空間的異方性により影響された可能性があると推測した、均一な内部内容物、正確な化学量論、及び効率的なカプセル化を確保するために、生化学的な部分を担持する複数の上流のチャネルのカプセル化の直前に完全な混合を達成するために、この装置を本発明の設計に統合した。その場合、合成生化学回路は、カプセル化直前に自発的に集合する、つまりカプセル化機構を標準化して、生化学物質の性質への依存を減らすことができる。更に、この設計は、入力される流速の制御を介する化学量論的な微調整を可能にし、プロトセンサの簡単なプロトタイプ作成のための異なるパラメータを検証するのに実用的であることが実証された。

光透過顕微鏡法を用いて製造プロセスを特性評価するために、前細胞の大きさの分散を分析した（図２５Ｂ）。これらの流速では、大きさの平均が約１０μｍのまさに単分散である前細胞と、大きさパラメータの明らかな逆ガウス分布を得た。興味深いことに、回路のカプセル化は前細胞の大きさの分布に影響を及ぼさないことを示し、カプセル化のプロセスが生化学的内容物の複雑さから離れられることを示している。更に、３ヶ月間大きさパラメータの変化は記録されず、前細胞間の融合事象がなく、本発明の保存方法の条件（即ち、保存緩衝液において４℃）において非常に満足のいく安定性を示していた。次いで、共焦点顕微鏡法を用いてカプセル化の安定性をアッセイした。この目的のために、前細胞内に蛍光標識を有する無関係なタンパク質をカプセル化し、３ヶ月間にわたって内部の蛍光の変化を測定した。内部の蛍光が安定したままであることを発見した。これは、本発明の保存条件下で、３ヶ月後に、前細胞膜を通した測定可能なタンパク質の漏出を示さない。

また、共焦点顕微鏡観察から、前細胞の膜の特性に関する貴重な情報を得た。膜を可視化するために、二重層に特異的に取り込まれた場合に蛍光量子収率が大幅に増加するリン脂質二重層特異的色素（即ち、ＤｉＩＣ１８）を使用した（６７）。二重エマルジョンからのオレイン酸の完全な抽出及び二重層の十分に構造化された配置を示す、良好に明確な画像を得た（図２５Ｃ及び図２７Ａ）。

次に、前細胞内の生物学的酵素部分のカプセル化を検証するために、ＵＰＬＣ質量分析実験を行った。前細胞内にアルコールオキシダーゼとグルコース－１－デヒドロゲナーゼの２つの関連酵素をカプセル化した。次に前細胞についてクロマトグラフィ及びＥＳＩ質量分析を行い、正の対照と比較して、前細胞の内部の酵素の分子シグナチャを検索できることを見出した（図３Ａ～図３Ｃ）。

共焦点及び透過光学顕微鏡観察に加えて、環境電子走査顕微鏡観察を行った。この技術は、前細胞の構造、大きさ、形状を検証し、美的な画像を有効にしたが、またリン脂質二重層（図１）をプローブし、相互作用する興味深い方法を与えた。

従って、前細胞の製造のための微小流体プラットフォームの検証に成功した。この設定から、高い効率と使用者定義のプログラム可能コンテンツを備えた非常に安定した前細胞を生成することができることが証明された。

実施例８：医療用プロトセンサの構築及び分析評価

Ａ）プロトセンサ回路のインシリコの最適化

失敗モードを最小限に抑え、最も堅牢な挙動を得るために、インビトロでの実施前にまずプロトセンサのインシリコ最適化を行った。より具体的には、カプセル化された合成回路を構成する種の初期状態の濃度パラメータは、膜の選択的透過性を考慮し、対象の医療アルゴリズムに従って最速で結果をもたらすように最適化する必要がある。従って、溶血素の細孔を介して受動的に内外に拡散する分子の入力を記述するモデルに膜のパラメータを組み込んだ（詳細は材料と方法を参照）。次に、臨床的要件、即ち、病理学的閾値でバイオセンシング感度を得ることを最も満たし、特定の信号処理操作を達成し、３つのシステムについて１０分以内に測定可能な出力信号を得るという、時間的論理指定を定義した（図７Ａ～図７Ｃ、詳細は材料と方法を参照）。

ＢＩＯＣＨＡＭを使用して、まずモデルの感度分析を行い、システムの挙動に最も重要な影響を与える濃度能力パラメータを判定した。各プロトセンサモデルについて、最も高感度な成分を構成する２つの重要な生化学種を同定することができた。次いで、各システムの利用可能な生化学的設計空間を視覚化するために、これらの２つの依存性に関する２Ｄ感受性ランドスケープマップを計算した（図６Ａ～図６Ｃ）。所望の時間論理を実行する境界内の濃度のスペースを定義できることを見出した。ＧｌｕＯＮｅプロトセンサ機能は、Ｇ１ＤＨ及びＡＤＨの酵素の濃度にたいてい感受性があるようであった。興味深いことに、ＬａｃＯＨ及びＧｌｕＮＯｘについて、それらの挙動が他の酵素よりも代謝産物ＮＡＤ＋の初期濃度に対してより高感度であることを見出した。実際、３つのシステムすべてにおいて、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨのレドックス比は、２つの分子入力信号を接続する生化学的な流動として見ることができ、従って、入力閾値及び酵素レベルに一致するように微調整しなければならない。

最後になってしまったが、この計算された設計空間内で、ＢＩＯＣＨＡＭ自動パラメータ検索（ＣＭＡＥＳ法）を用いて、初期状態濃度を合理的に選択した。このアプローチは、各モデルに従った時間的論理指定を満たしながら最適化された堅牢な動作を達成することを可能にする（図７Ａ～図７Ｃ）。次いで、得られた濃度を用いて、プロトセンサに埋め込まれた３つの合成回路を実験的に構築した。

Ｂ）デジタル信号処理及び多重化論理

前細胞の挙動を検証するために、確率論的ＨＳＩＭシミュレーションを使用して、完全な伝達関数をインシリコにマッピングすることから始めた（図２６Ａ）。前述のように、分子濃度と測定信号との間の較正された数学的関係を用いて、様々な濃度のバイオマーカーの入力による誘導後の計算された出力信号のヒートマップをプロットした（図８Ａ～図８Ｂ）。ブール論理は、理論上の応答の倍率変化及びデジタルに近い鋭い応答特性をかなり満たしていることが見出された。また、これらのモデルの理論上のスイッチング閾値が、バイオマーカーの入力に対する有用な臨床的な感度に適合していることを見出した（病理学的閾値：ケトン＞１７μＭ（約１０ｍｇ／ｄｌ）、グルコース＞１．３９ｍＭ（約２５ｍｇ／ｄｌ）、乳酸＞１０μＭ、ＥｔＯＨ＞１７．４ｍＭ（約８０ｍｇ／ｄｌ））、ＮＯｘ＞１０００μＭ）。

その時、次の目標は、インビトロでプロトセンサの挙動を調べることであった。従って、前に定義したように、最適化した濃度のパラメータを用いて、ＧｌｕＯＮｅ、ＬａｃＯＨ、及びＧｌｕＮＯｘの前細胞の微小流体の製造を進めた。最初の実験では、モデルの妥当性の予備調査は、前にシミュレーションによって予測されたものと同じ伝達関数をインビトロで達成することであると推論した。そのため、３つのプロトセンサシステムを、それぞれの入力されるバイオマーカーの濃度の増大に曝してインキュベートし、フローサイトメトリーを用いてそれらの個々の出力信号応答を測定した。この技術は、単一の（前）細胞レベルでプロトセンサの挙動のより細かい検証をするために、サンプルのノイズ効果を相殺することで、最も正確な測定をもたらすと仮定した（図２６Ｂ）。興味深いことに、これらのデータをＨＳＩＭモデルのシミュレーションと比較したとき、この技術を使用して実験的に測定されたスイッチング閾値は、デジタルに近い応答と共に、予測と非常によく一致していることを示していることを見出した。このアプローチだけでは、豊富な実験でのサンプリングを必要とする様々な入力の組み合わせに応じて完全な論理の挙動をマッピングするには不十分であるが、このアプローチはこれらのシステムの有用な分析特性の予備的な一次元検証になっている。更に、進行中の実験の作業の焦点である出力１のインビトロでの応答をまだ測定していない。

次いで、出力信号の空間的及び分析的デジタル化を更に視覚化することを求めて、誘導された前細胞における出力信号生成を定量的に測定し、正確に視覚化するために共焦点顕微鏡法を用いた（図２７Ａ）。高いＳＮＲと重要な応答の倍率変化を伴う明るい画像を得た。分子出力信号はプロトセンサの内部に十分に局在しているように見えたが、漏れの可能性を定量化しなかった。これらの実験データは、以前に得られたフローサイトメトリーのデータを強く裏付けている。

次に、３つのプロトセンサシステムの実験的真理値表をマッピングすることにある複数の実験を行った。入力条件（即ち、入力されるバイオマーカーの病理学的濃度の有無）を変化させながら、集団レベルでの出力応答をイージャーにした。これにより、論理操作の機能的で詳細な実験的特性評価の詳細な理解を得ることができた（図２７Ａ、図２７Ｂ、及び図１１）。重要な倍率変化があり、時間要件が６０分未満のブール論理指定に厳密に従った明確なデジタル様の挙動が得られた（図１１）。信号対雑音比を計算し、～８、３５、５、及び１１ｄＢの出力１、２、３、及び４各々に対して非常に良好な能力のＳＮＲを示した。

分析用途はかなり満たしているが、カプセル化されていない合成生化学回路に比べてバックグラウンドノイズが大きいことが判明した。本発明者らは、界面活性剤やリン脂質等の自己蛍光種の導入、並びに溶液中の球状前細胞構造について出現する可能性のある散乱現象及び吸収現象によるものであると仮定した。

実際、カプセル化の背後にある論理的根拠は、真の構成可能かつ多重化されたブール論理を達成しながら、より優れた分析堅牢性を実現し、状況からの絶縁を得ることであった。言い換えれば、溶液の複数のタイプのプロトセンサは、互いに相互作用することなく標準化された様式で独立して動作し得るべきであり、このようにして分子環境の多重分析が達成される。この主張を実験的に検証するために、まず論理機能の多重化に取り組んだ。この目的のために、異なる実験を設定した。それにおいて、バッチモード分析（即ち、カプセル化されていない合成回路）又はプロトセンサ分析（即ち、前細胞カプセル化合成回路）において３つの合成生化学回路すべてを使用して、複数のバイオマーカーで添加された培地の出力信号を測定した。得られた測定出力信号を、予想される理論上の真の出力と比較した。単純に混在した合成生化学回路は、おそらく回路の構成要素間の分子の相互作用に起因して正しい信号処理タスクを達成することができないことを見出した。この実験では、合理的に、最も間違っている可能性が高いバイオマーカーの例示的な組み合わせを選択しているが、異なる組み合わせが真の挙動を生じさせる可能性があった。一方、３つのタイプのプロトセンサを混合しても、真のブール論理と出力信号生成を調整することができたバイオセンシング及び信号処理能力には影響しなかった（図２７Ｃ）。広範な実験作業を必要とする、可能な３２の入力の組み合わせすべてをまだ検証してはいないが、ここに示されているデータは、前細胞内の信号処理生化学回路を絶縁し、それによって同時に作動するバイオコンピュテーションの課題を平行化する規模を増大させる利益を実証するのに十分である。

次いで、フローサイトメトリーを用いて、前細胞の構造及び操作性に及ぼす臨床的な尿培地の潜在的な影響に対処しようとした（図２７Ｄ）。前方散乱光（ＦＳＣ）と共に前細胞蛍光信号を測定することは、ＦＳＣが小胞の大きさと相関し、プロトセンサの安定性についての洞察を与え、膜の完全性を有する内部蛍光を与えると推論した。誘導及び尿での長期インキュベーションは、系の安定性、構造、又は誘導性に影響しないことを見出した。更に、標準的なＰＢＳ緩衝液及び尿の培地における操作の間に差異は見出されなかった（図２７Ｂ及び図１２）。

まとめると、これらのデータは、プロトセンサが、プログラムされたバイオセンシング及び生体分子論理ゲート作動の実行を可能にし、堅牢で予測可能な挙動をインサイチュで示すことを実証している。

Ｃ）病理学的臨床サンプルのアッセイ：プロトセンサ媒介の糖尿病の診断

添加されたサンプルにおけるプロトセンサの分析能力の特性評価が成功した後、現実の診断評価を実施することを提案した。臨床でのアッセイにおいて疾患検出をするためのプロトセンサの妥当性を評価するために、患者から得た臨床サンプル中の病理学的バイオマーカーの内因性レベルを検出できる概念証明を評価しようとした。糖尿病関連の代謝合併症の大きなサンプルのライブラリから、完全に実装された診断アルゴリズムを詳細に検証することは有益ではなかったが、以前に収集した未処理の糖尿病患者の尿サンプルを処分した。これらの患者は、尿試験紙で確認されたように、陰性ケトン尿症を伴う単純糖尿病を示した。従って、これらの尿サンプル中の病理学的な糖尿をアッセイすることは、ＧｌｕＯＮｅプロトセンサのための良好な単純な試験床評価であり、興味深い診断評価（即ち、、これはＧｌｕＯＮｅアルゴリズム出力ｌ＝グルコースＡＮＤＮＯＴアセトンを満たす）を提供すると推論した。

糖尿病性尿サンプル又は非糖尿病対照尿のいずれかと、前に記載したように測定された出力信号応答とのＧｌｕＯＮｅプロトセンサのインキュベーションに進んだ（図２８）。同時に、臨床的な至適基準の尿試験紙を用いて糖尿の分析を行った。本発明者らは、プロトセンサからの出力信号と尿試験紙の目視の検査との間に非常に良好な相関があることを見出した。更に、これらのデータについて受信者動作特性（ＲＯＣ）の分析を実施し、本アッセイが糖尿病患者のサンプルにおいて、約１００％の感度及び特異度、並びに曲線下面積約０．９９８１で、糖尿を確実に検出したことを見出した。このことは、ＧｌｕＯＮｅプロトセンサを、優れた診断試験手段と定義した。総合すると、本発明者らのデータは、プロトセンサが優れた診断精度で正常な患者と糖尿病の患者とを区別できることを示した。従って、本発明者らは、プロトセンサの合理的な生体分子プログラム化を用いて、患者のサンプルにおける疾患の内因性バイオマーカーを検出するための臨床グレードのアッセイを生成することができると結論付けた。

結論及び考察

本研究は、本発明によるプロトセンサが、医学的に関連するアルゴリズムのプロセスを統合した多重化されたインビトロ診断を行うための非常に有望な手段であることを実証した。診療所のプロトタイプとして、この技術を実際の臨床での問題を解決するために成功裏に適用することができることを示し、前細胞が古典的なインビトロ診断に直面するいくつかのハードルを克服できることを実証した。これはまた、ポータブルであるが、多重化された検出機能と複雑な分析機能を提供し、専門家の意思決定と合わせて調整可能な閾値で、鋭いデジタルに近い応答プロファイルを提供する。

従来の技術的限界、即ち、設計とスケーラビリティのいくつかに取り組むことにより、合成生物学的回路の合理的プログラミングを現実世界での応用に近づけた。時間依存の定量的及び定性的な仕様による設計空間の指向的な探索を、実験的実装のための初期パラメータの自動化された堅牢性の最適化と組み合わせた系統的な計算手法を提案した。これにより、操作と機能の堅牢性が最大化され、膨大かつ包括的な酵素データベースから合成生化学回路の自動的な設計と構築が成功することが保証される。最後に、本発明者らは、プロトセンサの機能及び分析特性を評価するための定量的なインシリコの枠組を提供した。

膜境界内に生物学的複雑性を閉じ込めることによって、有害な分子短絡を防止することで、より複雑な回路を達成することができることを示した。更に、前細胞を膜に閉じ込めることで、生化学的ソフトウェアを作動させる複雑な培地とのクロスカップリングから絶縁及び分離するための堅牢なアーキテクチャが得られた。従って、複雑で感受性のある酵素活性は、標準化され絶縁された感知装置及び計算装置として、プロトセンサ内に閉じ込めることができる。

コンピュータシミュレーションと支援設計に加えて、これらの装置は、微小流体技術に依存する、直接的、多用途かつスケーラブルな方法論を使用して合成できることを実証した。微小流体技術によってプロトセンサのボトムアップ設計に付与された能力が、診療所への有効な変換へのギャップを埋めるのに役立つと考えられる。

本研究では、分子環境を感知し、分子及び細胞規模での生体分子信号処理と意思決定を可能にする一体型生化学回路を開発する道を開いた。プロトセンサは外部のレセプタを介して特定の生物学的構造や細胞について取り組むことができるため、自律的でプログラム可能な実体に依存する本研究で説明されているバイオセンサへのアプローチは、新規の種類の局所的な測定と生体内作用のために非常に重要である。更に、これらのシステムは、システムが細胞作動信号又は治療反応をインサイチュで条件付きで生成する感知作用微小機械、並びに統合された又はインターフェース接続する生存システムに設計され得る。それらはまた、複雑な表現型又は生物学的機能性のハイスループットのスクリーニングにも使用することができる。

生物学や医学におけるオープンな問題の広大な景観は、生物学的ネットワークのダイナミクスを把握できず、分子規模で情報を処理することができないため、依然未解決である。生物学的基質内で作用し、生物とインターフェース接続する分子プログラムを制御及び設計するためのボトムアップで体系的なアプローチにより、この現象の洞察を得ることは、突出した利益を与えるものであり、基礎科学と応用科学の両方に進歩をもたらし得る。

実施例９：普遍的な前細胞バイオコンピュータの設計

この例では、論理ゲートを実装する基本単位として、空間的に制約された生化学反応回路を使用する新しい種類の計算装置を紹介する。計算機のアーキテクチャは、これらの標準化され構成可能な基本単位、計算装置に依存し、複雑化されたブール関数を実行するために複数のインスタンスで使用できる。標準的な論理操作は、前細胞と呼ばれる合成小胞内にカプセル化され、絶縁された合成生化学回路によって実行される。これらの前細胞は、膜間の電子移動を介して互いにエネルギー及び情報を交換することができる。本発明者らが提案するプロトピュート（ｐｒｏｔｏｐｕｔｅ）という計算の新規パラダイムでは、機械は１つの問題のみを解決することができ、そのため、特異的に構築する必要がある。従って、標準的な計算パラダイムにおけるプログラミングのフェーズは、本発明者らのアプローチにおいて、機械自体を構成する前細胞の配線を指向する集合命令のセット（特定の取り付け）によって表される。実際の例での前細胞計算機の計算能力を実証するために、計算能力において非常に厄介なものと知られているＮＰ完全問題である３－ＳＡＴ問題を解決するために、これを適用している。与えられたブール式の充足可能性を検証できる機械の集合をプログラムする方法を示す。次に、これらの機械の大規模な並列性を使用して、入力される変数の全ての評価値を２０分未満で検証し、式が充足可能であるか、そうでない場合はまったく信号がないときに蛍光信号を出力する方法を示す。

Ａ）緒言

計算とは何であるか？１つの定義は、入力情報の表現を出力情報の表現に変換する目標指向プロセスであり得る。プロセス自体は反復可能（又は他の形式では再帰的）でも構わず、この場合はアルゴリズムと呼ばれる。しかし、ニューラルネットワークや一次論理等の他の処理形式を使用することもできる。

計算プロセスは、それが何であっても、ペンと紙を使用する人間であり得るコンピュータにより実行されるか、その目的のために特別に構築された機械によって実行されなければならない。コンピュータの最も一般的な形態は、データのデジタル表現を使用する電子装置であり、アルゴリズムを実装して結果に変換する命令のセットに従ってこの表現を操作する。このとき、命令のセットは、コンピュータプログラムと呼ばれる。電子コンピュータは、データを表すために、数、即ち整数、浮動小数点を使用する。これらの数値は、通常、２進数でコード化されている。これはまた、ブール値をエンコードするために直接使用することができ、条件付きの計算を簡単に実行できる。電子計算機は主に基本ブロック、算術、及び論理装置を構成するために相互接続される論理ゲート、メモリレジスタ、及び中央処理装置を形成するマイクロコントローラから構成され、これらは順に、主記憶装置及びＩ／Ｏコントローラと共に、コンピュータそのものを構成する。

従って、論理ゲート及びその相互接続を模倣することができる任意の技術を使用してデジタルコンピュータを構築することができる。この論文では、小胞又は前細胞に埋め込まれた合成最小生物システムを使用して単一ブール論理ゲートを実装する方法と、複雑な論理関数を計算する装置又は前細胞機を作成するためにこれらを接続する方法について示すことを意図している。本発明者らの生化学的なコンピュータ実装の根底にある計算モデルは、電子計算機のものと似ており、計算能力は同じであるものとする。

電子計算機の基本的な特徴は、プログラム可能であるため、データに対して多種多様な計算を行う、潜在可能性のある無限のアルゴリズムを実行する能力である。即ち、同一のコンピュータは、関連するデータと共に、主記憶装置に存在することができるのと同じだけ異なるプログラムを連続して（又は疑似同時に）実行できる。

ここでは、コンピュータのプログラミングが物理的な組立と類似した方法論を提案する。従って、プログラムは、集合プロセスのために与えられた一連の命令に存在する。更に、解決しにくいことが公知のクラスに属する１つの問題、即ち、ＮＰ完全問題を解決することができる種類のコンピュータを構築する（即ち、プログラムする）方法を示す。

計算複雑性理論は、所与の大きさの問題を解決するために必要な計算時間（又は記憶空間）に関して、計算問題の実行可能性を探究する。ノイマン型（標準的な電子計算機）では、各命令が実行される時間とほぼ同じ時間を要するため、計算の基本ステップ（命令）の数が計算時間と近似するように頻繁に使用される。

計算問題には２つの主なクラスがある。問題の大きさの多項式として表現できる複数のステップで、決定論的機械で解くことができるもの（クラスＰ）と、多項式時間で解くことができるが、非決定論的機械におけるもの（クラスＮＰ）である。典型的には、（ｉ）解が多項式時間で検証でき、（ｉｉ）潜在可能性のある解をすべて生成して検証することを除いて他の既知のアルゴリズムがない決定の問題は、ＮＰ問題である。ノイマン型のコンピュータでこれらの問題を解決するには、問題の大きさに関して指数関数的なステップ数が必要である。ＮＰ問題は、他のいずれかのＮＰ問題が多項式時間でこの問題に変換できる場合にＮＰ完全であると言われる（１０４）。結局１つのＮＰ完全問題が（多項式時間で）すぐに解決されると、ＮＰ問題は全て直ちに解決されるため、ＮＰ完全問題は他のいずれのＮＰ問題よりも解決が難しい。もちろん、これらの複雑さのクラスは、Ｐ＝ＮＰ（コンピュータサイエンスの大きな公然の推測の１つ）であればすべて崩壊する。

本発明者らは、前細胞コンピュータが見事に解決できるＮＰ完全問題６６０の例として、３ＳＡＴ問題、即ち、ブール論理的充足可能性問題（ＳＡＴ）の変種を選択した。これは主に、非常に小さな前細胞とその３Ｄ充填によって、与えられた３ＳＡＴの問題を解決するために特別に接続された何十億もの論理ゲートで作られた機械を構築できるようにするからである。本発明者らの前細胞機のもう１つの特徴は、一度計算が所与の入力値のセットに対して行われると、機械はもはや使えないという意味で、使い捨てであるということである。しかし、それと対応しているのが、計算に必要なエネルギーが非常に少ないということである（１９）。最後に、前細胞機の生化学的な性質により、それらが生物と接触するのが非常に容易になる。

例えば、医療の意思決定アルゴリズムに結合されたバイオセンシングを実施するための医療診断に使用することができる

Ｂ）方法

１．計算装置としての前細胞：定義

生物学的システムのボトムアップ設計は、標準化された生物学的部分、装置、システムを系統的かつ合理的に設計するために、生物学に工学原理を適用する合成生物学アプローチによって可能になる。生物学的機能の階層的抽象化は、使用者定義の機能性（１、２、３）を有する新しい生物学的システムのシステムレベルでの集合を可能にする。合成システムの挙動は予測可能であり、生物学的構成要素でそれらを実施しようとする前に、インシリコで設計を自動化することができる（３３）。更に、高度に洗練された方法で計算するための生物学的基本単位の顕著な能力により、科学者は生体分子コンピュータを設計し、工作するに至った（５）。これまでのところ、ほとんどのバイオコンピューティングは、トップダウンの観点から、即ち、既存の生物を改変することによって研究されてきた（２０）。ここで提案する戦略、プロトピュート（ｐｒｏｔｏｐｕｔｅ）は、計算を行うためにボトムアップの観点から前細胞を実装することに利益があるが、ほとんど注目されていなかった（２７、２６、１５）。

計算するための抽象的な操作から出発して、実行するための生化学種（代謝産物、酵素、核酸等）を合理的かつ系統的に選択することができる（図２９Ａ）。単純化されたブール演算、記憶装置、増幅器、アナログ－デジタル変換器、オシレータなど（図２９Ｂ）、異なるタイプの生物学的機能又は計算（３１）を実装するために、標準化された堅牢な生体分子成分及び反応を設計、試験及び最適化することができる。このプロセスは、ＣＡＤツールを使用して自動化することができる。例えば、３つの異なる酵素及び４つの異なる代謝産物を３つの生体触媒反応によって接続し、出力としてＮＡＤＨに電子を移動させるネットワークを使用して、代謝産物を入力として還元するＡＮＤ生化学論理ゲート（ＮＡＤＰＨ及びＦＡＤＨ２）を実行することができる。同様に、全てのブール論理ゲートを要約した標準化された計算装置のセットを実装できる（ＡＮＤ、ＮＯＴ、及びＮＯＲゲートの実装の例については図３１を参照）。また、電子の移動は、人間が読み取り可能な信号を生成するために様々な出力される生物学的機能に結合することができ（図３０）、あるいは更なる分析のために特定の挙動を有する機械の選択を可能にする。本発明者らは、発光又は蛍光（即ち、蛍光性のレゾルフィンへのレザスリンの還元）又はリガンド（又はその受容体）の輸送のいずれかの読み取り可能な出力を引き起こす種の特定の還元を利用することを提案する。

本発明者らのアプローチは、ブールの論理を実装する生化学ネットワークが、膜の境界によって提供される生物学的プロセスに対する高度の組織化及び制御によって区別される、合成小胞又は前細胞内にカプセル化されるという事実によって、生体分子計算システムのモジュール性を改善する（１６）。絶縁された計算装置のそのようなアーキテクチャにより、同じ論理ゲートが必要なときに、回路の任意の場所にある同じタイプの前細胞の多くのインスタンスを使用することが可能になる。更に、これにより、複数の層の前細胞を連結させると、複雑な情報処理能力を達成することができるようになる。そのようなアーキテクチャでは、入力情報は、前の前細胞との上流での接続から到着し、後続の計算装置への接続を出力する。各論理ゲートが不浸透性小胞内にカプセル化されているので、出力値を計算する反応は、非平衡の初期状態から平衡状態に移行する。従って、論理ゲートが出力を計算し終えると、それはもはや別の計算を行うことができなくなる。そのため、前細胞機のこの最初のモデルは本質的に使い捨てコンピュータの一種である。

生化学的ネットワークのカプセル化は、内部の種の化学量論及び連結のための膜タンパク質の取り込みに関して、天然の二重層膜（例えば、リン脂質二重層、リポソーム）（１４）又は操作された膜（例えば、コポリマー、ポリマーソーム）（１７）を用いて成し遂げ得る（８１、２９、１８）。また、このプロセスは、酵素を安定化させ、クロストーク、変性又はタンパク質分解を防止し、酵素特性を改善することも知られている（８２、８３）。更に、以前に議論したような微小流体に頼っているような合理化されたワークフローは、様々な基板をカプセル化する前細胞の高スループット生成用に既に利用可能である（５３、８４、８５）。本発明者らの研究室で広く使われているこの戦略により、様々な前細胞論理ゲートの実装を検証することが可能になった。そのような小胞は、そのような多小胞集合体の構築を可能にするのに十分に安定している（即ち、一緒に融合すること又は物理的破壊を起こしにくい）ことが判明している（８６、５６）。５０ｎｍ～５０μｍの範囲の調整可能な大きさが得られるが、本発明者らのアプローチでは、最高密度の計算演算子を得るために大きさをできるだけ小さく保つべきである。

２．回路の配線

所与のブール関数を実装する完全な回路を得るために、基本論理ゲートを連結して配線する必要がある。機能特有の前細胞機の設計は、計算装置の合成可能性を利用する。特定のセットの前細胞の中で、同じ論理ゲートの複数のインスタンスを一緒に配線して、使用者定義の関数を実装することができる。前細胞入力から出力まで、前細胞機の各層において連続した反応を達成する１つの方法は、電気化学ポテンシャル（例えば、酸化還元反応）を用いてそれらを駆動することである。電子計算機との類推により、電子はエネルギー担体であり、酸化還元電位は電子装置で測定できるシステムの電流である。主な違いは、前細胞内では配線が遊離分子（例えばＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤＨ２）に置き換えられ、有効な配線は酵素の化学選択性を用いて達成されることである。分子は、電子供与体又は受容体のいずれかであり、計算のために電流及びエネルギーをもたらす生物学的な酵素の規則に従う。そのようなシステムでは、ｉｎ→ｏｕｔ方向はレドックス反応の熱力学によって引き起こされる。本発明者らの例では、真の値を与える前細胞はＮＡＤＨの濃度が高い還元状態になり、次に電子を移動させて次の前細胞の入力を還元することができる。逆に、誤った値を与える前細胞はいずれの電子も出力しない。更に、電子移動は物理的に接続された前細胞間でのみ起こり、緊密な結合で密接に接触する電子移動複合体を形成し、前細胞間、従って論理ゲート間の接続を行う（図３１）。

ここでは、樹状レイアウトで集合した一連の前細胞論理ゲートから前細胞機を構築することを提案する（次のセクションを参照）。真に設定すると、機械の入力は電子移動を開始し、木の各枝を構成する前細胞の連鎖を通って根元の前細胞に至る。

これらの入力される前細胞において、電子生成は、オキシダーゼ酵素による分子種の特異的酸化によって開始される。次いで、電子は特定の分子種の電子結合（還元）を可能にする膜貫通型電子輸送複合体を介して前細胞鎖に移動する。その意味で、入力される前細胞は機械に動力を供給する発電機とみなすことができる。更に、スイッチのような挙動である燃料様前細胞は、信号を増幅して再構成し、その減衰を打ち消すために使用することができる。

特定の電子移動モジュールを実現するために、ＮＡＤＨ（複合体Ｉ）、ＦＡＤＨ２（複合体ＩＩ）、及びＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＰＨキニンオキシドレダクターゼ）に特異的な天然の膜を越える電子移動を触媒する天然の酸化的リン酸化及び光合成複合体のモジュール性及び熱力学的可逆性を利用することを提案する（８７）。これには、キノン（又は化学的に関連するもの）及びシトクロムＣシャトルが含まれ、これらは、前細胞間移動分子として使用することができる非局在化移動電子担体である。本発明者らの設計では、第１のキノン担体（又は関連するもの）が特定の出力信号（第１の複合体：Ｉ、ＩＩ．．．によって与えられる基質特異性）から近接する複合体ＩＩＩに電子を移動することができ、次いで移動性シトクロムｃを介して、これらの電子を、次の前細胞に属する複合体ＩＩＩへと送ることが提案されている。この機構は、効率的な可逆的エネルギー結合を構成し、タンパク質を横切る電子のトンネリングを介して作用することが示されている（８７）。更に、最近の研究は、効率的かつ基質特異的な合成電子輸送体用の天然の原核複合体を設計する可能性を強調している（８８～９０）。

機械のアーキテクチャは、特定の前細胞の入力と出力の機能的な配線によって制御される。これはプログラム可能結合モジュールを使用することで実現できる。プログラム可能結合モジュールは、プラグアンドプレイ方式でいずれかの前細胞機を実装するために選択できる（図３１）。これらのプログラム可能な付着物の生物学的機能は、アプタマー核酸（９１、９２）やペプチド結合剤（９３）のような高い結合親和性のリガンド／受容体の対によって支持でき、これらはＳＥＬＥＸ（９４）、又はリボソームディスプレイ（９５、９６）を各々用いた大きなコンビナトリアルの合成ライブラリにおいて、簡単に産生できる。予め作成された計算装置のストックから開始して、使用者は実装するブール関数に対応する一連の付着命令を定義できる。不可逆的構築物は、架橋する化学物質を用いて達成することができるので、結合が解除されることはない（９７、９８）。このような集合プロセスに関連する反応速度は、分のオーダーであると仮定する。いくつかの付着をランダムに設定して、異なるタイプの前細胞を特定の位置に確率論的に配線することもできる。これは、例えば、前細胞機が適合機能を計算するのに使用できる大きなパラメータ空間を通るナビゲーションを含む問題を解決するために使用できる。付加的な選択方法は、特定の挙動を示す前細胞機を単離するために実施することができる。正の選択は、例えばＦＡＣＳを用いて行うことができ、逆に、自己破壊メカニズムを介して負の選択を行うことができる。

Ｃ）事例研究

１．ブール充足可能性問題

本発明者らが解決しようとしているＮＰ完全問題は、３－ＳＡＴ問題である。この問題は単純に次のように定義できる。

句ごとに最大３つのリテラルを備える連言標準形（ＣＮＦ）のブール式があれば、その式を満たす変数の評価があるか？

言い換えれば、数式が真と評価されるように、所与のブール式の変数を真又は偽の値に一貫して置き換えることができるかどうかを尋ねる。それが当てはまる場合、その式は充足可能と呼ばれる。リテラルは変数（ｖ）か変数の否定（￢ｖ）のどちらかである。それらを接続するか、演算子（∨）に接続して句を形成する。句は、接続されるか演算子（∧）と接続され、ＣＮＦの式を取得する。

例えば：

は、ａ＝真、ｂ＝真、ｃ＝偽のときに真となるので、式Ｆ（ａ，ｂ，ｃ）は充足可能である。

逆に、式：

は、ａ；ｂ；ｃに対する８つ全ての可能な評価がＧ＝偽につながるため、充足できない。

数式が充足可能かどうかを調べるために、入力変数の評価値の組み合わせがあるのと同数の前細胞機を構築する。これを行うために、リガンド受容体結合のコンビナトリアル力を利用して、一定の前細胞（偽の値又は真の値で）を前細胞機の入力に連結し、全ての価値空間を網羅するようにする。前細胞機は、特定の式の専用であるため、電子コンピュータという意味ではプログラム可能ではない。前細胞機は、チェックしなければならない式に従って自己集合されているので、このプログラムは、本発明の手法では機械の集合を指示するプロセスである。変数の可能な評価ごとに少なくとも１つの前細胞機のインスタンスが存在することを確認する。

機械のインスタンスは、式に句があるのと同じくらい多くの入力のある大きなＡＮＤゲートに接続される、２及び３の入力ＯＲゲートを使用して、作成できる。句の各入力は、特定の開始信号が与えられたときに真又は偽を送信する変数ｖを表す前細胞に接続されるか、起動信号が与えられたときにｖの否定を送信するインバータ前細胞に送られる。ＡＮＤゲートの出力は、入力値が真であるときに蛍光を発する前細胞に接続される。例えば、Ｇ式に対応する前細胞機は、上記の式のように接続された４入力ＡＮＤゲート、２つの２入力ＯＲゲート、１つの３入力ＯＲゲート、及び３インバータから構成される（図３２Ａ）。

変数の可能な評価ごとに少なくとも１つの（またおそらくより多くの）機械のインスタンスがあるので、少なくとも１つの前細胞機が蛍光を発する場合、その式は充足可能である。逆に、蛍光が全くない場合、式は充足できるものではない。

ドモルガンの法則を使用して、大規模なＡＮＤゲートをＮＯＲゲートで置き換えることで、機械の構築を簡単にすることができる。これは、構築がより簡単で、かつ多くの入力がある場合はＡＮＤゲートより効率的である。このＮＯＲゲートの出力は機械全体の出力であるので、ゲートを実装する前細胞内に格納されたフルオロファの阻害剤を用いて、最終的なインバータを作ることができる。また、ＡＮＤゲートの入力に変数の補数を入力する必要があり、多くのインバータを使用するに至る可能性がある。しかし、これらの入力は機械全体の入力であるため、これらの入力は避けることができる。また変数のすべての評価を検証する必要があるため、これらの入力には一定の値が入力される。従って、すでに反転された定数を持つ機械のアセンブリをプログラムすることができ（図３２Ｂ）、元の公式で指定された否定変数よりも多くのインバータは必要ではなくなる。

２．機械の集合

計算前細胞機の１つのインスタンスを得るためには、式に句があるのと同じ数のＡＮＤゲート前細胞の自己集合を導く必要がある（句が１つのリテラルしか持たない場合を除く）。各ＡＮＤゲートの出力は、蛍光ＮＯＲ前細胞の入力に接続されている。各ＡＮＤゲートの入力はまた、インバータの出力に接続されるか、配線している前細胞（式の入力変数を表す）の出力に接続される。次に、式の変数の評価を検証するために、それぞれの配線している前細胞の入力は、定数値の真又は偽を出力する特別な入力不要な前細胞に接続される。機械とその入力が集合すると、開始信号が与えられた数分後に、その機械のＮＯＲゲートは、この変数の評価で式が真であれば蛍光を発し、そのため式は充足可能である。

２つ（又はそれ以上）のＡＮＤゲートの相関がある入力に、相関値が供給されるようにする必要がある。前の公式（図３２Ｂに示されているように補完された変数で、ＡＮＤのＮＯＲを用いて書き直す）において、

例えば、最初の句の最初の入力ａは、常に２番目の句の最初の入力（￢ａ）の反対であり、２つの最初の句の２番目の入力ｂは常に同じ値である。これを実現するために、インバータの前細胞と、２つ以上の出力に入力を転送できるワイヤ前細胞を使用する。

この例では、３つの変数があるため、８つの前細胞機を集合させて、８つの可能な評価のそれぞれを検証する必要がある。表３の表の各行は、８つの異なる前細胞機の１つの入力値（偽の場合は０、真の場合は１）、各々の句の補足値、及び絶えず偽である（この式は充足不可）式（３）の値を示す。

効率的な集合機構を得るために、２つのステップでプロセスを分割した。最初の式は特定の式に依存しないが、変数の最大数（Ｖｍａｘ）と句の最大数（Ｃｍａｘ）には式があり得る。本発明者らが述べた大きさの限界内で与えられたいずれかの式を試験できるようにするために、１つの前細胞型機械のインスタンスを最大で含むリザーバを構築する：
・１つのＣｍａｘ－入力ＮＯＲゲート
・Ｃｍａｘ２及び３入力ＡＮＤゲート。
・Ｖｍａｘインバータ前細胞
・２．Ｖｍａｘタイプの入力不要定数前細胞。各変数の２つの可能な値を表す定数の偽又は真を出力する。
・各定数の前細胞出力を適切なＡＮＤ入力又はインバータにキャストするために、入力を２つ（又はそれより多く）の出力に複製する、配線している前細胞の数に依存する式。

表３：変数の８つの可能な評価に対する各々の句の補完された値及び式の対応する値。

勿論、数式の複数のインスタンスを検証したい場合は、これらの基本単位のコピー数を増やすことができる。検証を望む式に応じて、ＮＯＲゲートの全てのＣｍａｘ入力は使用されず、偽の値に相当する出力には接続されず、そのためこれらの入力は計算を妨げないことが言及できる。何もそれらに結合することができないと確信しているからである。

Ｎ／Ｖｍａｘの変数とＣ／Ｃｍａｘの句から構成される数式の充足可能性を検証するためには、入力される変数の可能な評価ごとに（少なくとも）１つ、２Ｎの前細胞機インスタンスを構築する必要がある。これらの前細胞機の構築は第２のステップを構成する。このステップは特定の式に固有であるが、その原則はあらゆる式に適用できるほど一般的である。これは、標準的なコンピュータの高水準なプログラミング言語で書かれたプログラムのコンパイルする段階に似ている。

機械を集合させるために、１つのＮＯＲゲートの各入力を、２入力又は３入力ＡＮＤゲートの出力、又は配線している前細胞の１出力、又はインバータの出力に結合することをプログラムする。また、数式に応じて、変数ごとに１つの配線している前細胞をいくつかのインバータ、ＡＮＤ又はＮＯＲ入力に結合することも、プログラムする必要がある。次に、変数の所与の評価を検証するために、式の各変数に対応する定数の前細胞を、この機械の入力に結合する必要がある。

これらのプログラムされた結合は、リザーバの全ての前細胞が入力と出力に特定のタグを付けて構築されているため、可能になる。これらのタグは、それらに対処する独特な配列を有するペプチド／核酸であり得る。結合プロセス自体は、出力上のタグと、それに対応する入力上のタグとを認識して結合する環境固有の分子付着命令をすることによって行われる。これにより、特定の前細胞の結合が可能になる（図３３）。

ＮＯＲゲートの各入力には、対応する句の番号（０～Ｃｍａｘ－１）を実装するタグが付いている。同様に、各ＡＮＤゲートの出力には同じ番号が付されている。従って、１つの前細胞機のＮＯＲゲートの対応する入力にＡＮＤゲートを接続するためには、ＡＮＤゲートの出力を標識するタグを一方の端部に、ＮＯＲゲートの入力を標識するタグを他方の端部に整合させる分子付着を合成しなければならない。

同じ機構が数式の入力の変数に使用される。数式の変数に対応する配線している前細胞の入力には、変数番号（０～Ｖｍａｘ－１）を表すタグが付けられる。各変数について使用される定数の前細胞は、その出力が偽であるか真であるかにかかわらず、機械の対応する配線している前細胞と整合性のあるタグでラベル付けされる。培地には多数の定数の前細胞があるので、各変数の偽及び真の変形版は、機械の対応する入力にランダムに結合し、しばらくしてから全ての可能な評価が適用される。

接続されている入力が同等でなくても、ブール値の偽を出力する定数の前細胞を使用する必要があることに注意することが重要である。なぜなら、一部の変数が偽である評価を検証したいときに、いずれの真の定数の前細胞をもこの入力に結合することができないことを確かめなければならないからである。

３．計算処理

計算プロセスは、前細胞機の少なくとも１つのコピーが入力値の可能な組み合わせのそれぞれに結合されていることが確かなときに開始することができる。このプロセスは、例えば、光スイッチ可能な酵素（例えば、光スイッチ部分を有するように操作されたトリプトファンデヒドロゲナーゼ）を用いて真の定数の前細胞及びインバータ前細胞の全集団を、遠隔でトリガすることによって、開始される（９９、１００、１０１）。

全ての機械が同時に実行されて式の値を計算するので、計算時間の合計は、真を出力する最初の時間（蛍光になる）、又は偽を出力する最も遅い機械が終了した（この場合、全てが終了した）ことを確信できるときに必要な時間である。蛍光を発する少数の前細胞機がある場合、蛍光性の機械の濃度がより高く現れるように溶液をいくつかの部分に散乱させることにより信号／ノイズ比を高めることができ、そのためその検出に役立つ。真を出力する最初の（そしておそらくは唯一の）前細胞機を容易に検出するもう１つの方法は、この機械がその近傍の蛍光をトリガし、そのために全体の蛍光を増強させることであろう。試験を望む式とは無関係に、１つの入力から出力までに必要とされる反応の最大数は非常に少なく、１つのインバータ、少数の配線している前細胞、１つのＡＮＤ、及び１つのＮＯＲである。

これらの単純な反応のための酵素的プロセスの反応速度を考慮すると、単一の前細胞の計算時間（即ち、前細胞を介する有効な電子移動に要する時間）は、数分のオーダーであると仮定することができる。この場合、１つの前細胞機の計算時間は、その機械の層数に比例するものとする。問題を解決するために必要な前細胞機の数が何であれ、合計計算時間は２０分を超えないものとする。もちろん、これは、主に計算プロセスが大規模に並列化されていることに起因し、またそれに至らない程度、各プロセッサが、解決したい特定の問題に専念していることに起因する。

完全な前細胞機の大きさは、１ミクロンキューブの大きさのオーダー、更にはそれより低いものであるため、数ｍｌの溶液で１０^１２を超える機械を有することができる。１０^３は２^１０に概ね等しいので、理論的には数ｍｌにおよそ２^{１０（１２／３）}＝２^４０の機械がある可能性がある。従って、この手法を使用すると、数分間で最大４０の変数を含む任意の３－ＳＡＴ問題を潜在的に解決することができる。電子計算機が１つの変数の評価を生成して検証するために１μｓを必要とすると仮定すると、平均計算時間は１０^１２．１０^－６ｓのオーダーであり、これは１１日半よりも長い。更に、低電力の電子計算機は、例えば２０ワットを使用すると仮定すると、１１．５日の終わりに消費されるエネルギーは、前細胞機が数ジュールであるのと比べて、１０^６．２０＝２．１０^７Ｊ（約５．５ｋＷｈ）になる。

４．結論

ここで検討された事例は、バイオコンピューティング型前細胞機で対処できる種類の問題の例である。ここでは、核酸やペプチド結合のような、高度に誘導可能で容易に合成可能な生化学的基質に依存する機械集合機構（即ち、計算装置配線又はプログラム命令）を提案した。しかし、実際の実験に到達する前に、このアプローチの熱力学、結合、及び反応速度の妥当性を調べる必要がある。更に、この理由から、大規模な式の充足可能性を検証するために必要な前細胞機の極めて多数のインスタンスを作成することは、現時点では少し投機的である。前章で実証したように、非常に理論的であるが、前細胞計算装置の設計に使用される統治メカニズムは、既に実験室で検証中である。（図３３に示すものよりもはるかに多くの）論理ゲートの数多くの実装は、ＨＳＩＭ（１２）シミュレーションシステムを使用してインシリコで試験され、インビトロで機能していることが証明されている。

ここでは、連続的な計算の古典的なシリコンベースのアプローチ（図３４）を、非常に小規模な前細胞計算装置の利点を生かした大規模な並列化の計算戦略へとサーコンベントすることを提案する。また、特定のクラスと大きさの問題であるために従来の電子計算機より約１０００倍速いと本発明者らが主張している計算時間は、やや挑発的なものであるが、これは前細胞機の実際に大規模な並列性をどのように用いて専用の問題を解決するか、ということの例であるという事実が依然存在する（例えば、Ｎ個の変数と大きさｐの問題に対して、全ての評価を評価するのに必要な時間：直列コンピュータの場合はｔ～ｐＮ、前細胞機のコンソーシアムの場合はｔ～ｋ．ｐ）。

更に、知る限りでは、この点は最初に述べたものであり、合成生化学計算機は、電子計算機の速度と現実的に競合することができ、一方で、エネルギーという点では大幅に要求の少ないものである。それにもかかわらず、本発明者らの意見では、前細胞機の最も高揚を覚える視点は、それらが電子的そして生物学的にインターフェース可能ということである。本発明者らのアプローチでは、任意の生物学的及び／又は電子的入力により接続及びトリガでき、同様の方法で選択された出力を生成する、任意の所与のブール関数を設計することができる。かくして、それらは生物体、又はハイブリッド電子／生物系に組み込むことができる。

別の興味深い応用分野は、暗号法（例えば前細胞の暗号）に関与する。これは、疾患の診断への新たなアプローチにまで拡大することができる、なぜなら病理学的状態が実際に分子のパターンの未知の関数であり（即ち、生理学的に暗号化されている）、また特定の暗号法のアルゴリズムの解明が、診断アルゴリズムの発見に類似しているからである。

実施例１０：ＢＣＡＡ及び糖尿病

最近、早期のインスリン抵抗性に分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）が関与していることが、多くの証拠によって見出されている。患者のハイスループットのプロファイリングでは、糖尿病が発症する１２年前の段階で、リスクのある患者を予測することができる。全ての代謝産物の中で、ＢＣＡＡは、将来のインスリン抵抗性と最も重要な関連を示すものであるようである。本発明者らが設計したシステムにより、インスリン抵抗性に対する糖尿病の迅速な評価が可能になる。血液、尿、唾液等の体液に簡単に使用できる。システムは、小胞内で本発明者らの生物学的ネットワークによって実施される単純な意思決定アルゴリズムを実行した（図３５Ａ～図３５参照）。

ＢＣＡＡは、代謝され、主として脂肪組織及び筋組織に貯蔵される必須アミノ酸である。ＢＣＡＡの高い血漿レベルをもたらす異化経路の障害は、インスリンの分泌及びＴＣＡ賦形剤の刺激による脂質生成をもたらし、脂質毒性や炎症に寄与するトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）やジアシルグリセロール（ＤＡＧ）のような脂質種の結果としての蓄積をもたらすことがある。更に、分岐鎖アミノ酸代謝産物３－ヒドロキシイソ酪酸は、ＴＡＧ及びＤＡＧの細胞内蓄積に関連する内皮遊離脂肪酸輸送の刺激に関与することが示された。このシナリオでは、グルコースの利用は余分と考えられ、これらの条件下では、ｍＴＯＲ、Ｓ６Ｋ－１、ＪＮＫ、及びＩＲＳ１（インスリン受容体基質１）の慢性過剰活性化は、インスリン抵抗性をもたらし得る（１０５～１０７）。

表４：この表は、本発明による提案中のＢＣＡＡ酵素試験に提出された多様なＨＯＭＡ（インスリン抵抗性のホメオスタシスモデル評価）及び体格指数（ＢＭＩ）を示す。

多様なＨＯＭＡ（インスリン抵抗性のホメオスタシスモデル評価）及び体格指数（ＢＭＩ）を提示する一般集団からの患者由来の血清を、提案されたＢＣＡＡ酵素試験に提出した。図３６は、古典的試験で測定された、測定されたセリックＢＣＡＡとＨＯＭＡパラメータとの間に強い相関関係を示す。

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Claims

生物学的サンプルから、患者におけるインスリン抵抗性又は初期インスリン抵抗性を診断するためにインビトロで使用するための、マイクロ／ナノスケールの生合成デバイスであって、前記生合成デバイスは、
ａ）組み立てられた微小環境又はカプセル化されたモジュールを含み、ここで、前記微小環境又はモジュールは、選択透過性を有する合成、半合成、若しくは天然に存在する膜又はポリマー支持体内に封入され、且つ天然に存在する生物系から単離された生化学要素を少なくとも含み；
前記生化学要素が、複雑な生物学的マトリックスにおいて少なくとも１つの生体分子信号のバイオセンシングを達成するための生化学的反応を支援し、
前記生化学要素が、感知された信号の多重化及び使用者定義の信号の処理／計算／論理操作への統合を達成するため生化学的反応を支援し、
前記デバイスが、生体分子信号に対してプログラム可能な信号処理／計算操作を実行することが可能であり、並びに、
前記デバイスが、複雑な生物学的マトリックスにおいて検出された生体分子信号に従って、埋め込まれた生化学反応により少なくとも１つの可読／測定可能な物理化学的出力信号を生成でき、また信号処理操作を実行することができ、また前記生物学的マトリックスに関する情報を与えることができ、
前記微小環境又はモジュールが、カプセル化された生化学要素として、
－酵素：ロイシンデヒドロゲナーゼ、及び任意に
－代謝産物：ＭＴＴ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ
を含む、生物学的サンプルから患者におけるインスリン抵抗性又は初期インスリン抵抗性の診断のために、インビトロで使用するための、マイクロ／ナノスケールの生合成デバイス。
前記デバイスが
ａ）カプセル化された生化学要素として、
－酵素：ロイシンデヒドロゲナーゼ、及び任意に
－代謝産物：ＭＴＴ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ
を含む第１のモジュール、並びに
ｂ）カプセル化された生化学要素として
－酵素：グルコース－１－デヒドロゲナーゼ、又はグルコースオキシダーゼ、及び西洋わさびペルオキシダーゼ、並びに任意に
－代謝産物：レサズリン
を含む第２のモジュール
という２つの異なるモジュールを実装する、請求項１に記載のマイクロ／ナノスケールの生合成デバイス。
請求項１又は２に記載の少なくとも１つのデバイスを含む、キット。
ａ）１若しくは複数の請求項１～３のいずれか１項に記載の生合成デバイス又はキットを得るステップ；
ｂ）前記デバイスを患者サンプルと接触させることにより、出力信号を生成するステップ；
ｃ）各デバイスについてステップｂ）で生成された前記出力信号を検出又は測定するステップ、但し、ステップｃ）で生成／測定される前記信号は、インスリン抵抗性又は初期インスリン抵抗性疾患のリスクの診断又は予測を示す；
を含む、患者におけるインスリン抵抗性又は初期インスリン抵抗性疾患を示すリスクの予測又は診断のためのインビトロでの方法。
試験される前記患者サンプルが、患者からの尿、血清、血漿、及び血液サンプルからなる群から選択される、請求項４に記載のインビトロ方法。