WO2017134378A1 - Installation pour la mise en oeuvre d'un procédé de synthèse enzymatique d'acides nucléiques - Google Patents

Installation pour la mise en oeuvre d'un procédé de synthèse enzymatique d'acides nucléiques Download PDF

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WO2017134378A1
WO2017134378A1 PCT/FR2017/050215 FR2017050215W WO2017134378A1 WO 2017134378 A1 WO2017134378 A1 WO 2017134378A1 FR 2017050215 W FR2017050215 W FR 2017050215W WO 2017134378 A1 WO2017134378 A1 WO 2017134378A1
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elongation
nucleic acid
synthesis
chamber
installation according
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PCT/FR2017/050215
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Thomas YBERT
Xavier GODRON
Sylvain GARIEL
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Dna Script
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides

Definitions

  • the present invention relates to an installation for the implementation of a process for the enzymatic synthesis of nucleic acids, in particular nucleic acids of great length, in particular a computer-controllable installation.
  • DNA or RNA nucleic acid
  • DNA or RNA DNA fragments or synthetic RNA.
  • These fragments of which the type, single-stranded or double-stranded, as well as the length, from 3 to several million bases or base pairs, may vary, must be synthesized before use.
  • nucleic acid synthesis device that is directly controlled by computer and which allows, in a simple and fast manner, to synthesize the desired nucleic acid fragment (s) in a single operation on the part of the researcher operating in a laboratory.
  • nucleic acid synthesis device that is directly controlled by computer and which allows, in a simple and fast manner, to synthesize the desired nucleic acid fragment (s) in a single operation on the part of the researcher operating in a laboratory.
  • nucleic acid synthesis device that is directly controlled by computer and which allows, in a simple and fast manner, to synthesize the desired nucleic acid fragment (s) in a single operation on the part of the researcher operating in a laboratory.
  • One of the envisaged ways is the synthesis of nucleic acid by enzymatic catalysis, the performances of which are potentially largely superior to the synthesis by chemical catalysis.
  • the chemical synthesis operations are carried out using commercially available oligo-synthesizer type devices or using robotic devices custom-made by the nucleic acid synthesis companies.
  • the experimental investigator does not have the possibility of simply and directly, by directly communicating with the synthesis device from any previously parameterized computer, to synthesize the desired nucleic acid fragment. It must go through a dedicated and often indirect procedure that does not allow it to handle both the nucleic acid in virtual form, using software dedicated to the manipulation of nucleic acid sequence, and in real form by simple command of the synthesis operation. Assembly operations are most often performed by manual experimental steps. They can nevertheless be automated by the use of custom robotic devices.
  • a first object of the invention is to provide a computer-controlled nucleic acid synthesis device enabling an experimenter to synthesize the nucleic acid required in a single operation controlled from his computer.
  • the inventors have recently developed a new method for nucleic acid synthesis using enzymatic catalysis, described in patent application WO 2015/159023.
  • the synthesis cycle that uses a polymerization enzyme is feasible in aqueous media and does not have the inherent limitations of the chemical method.
  • the enzymatic process makes it possible to synthesize, without assembly, nucleic acid fragments of great length (several hundred or even thousands of nucleotides) with a very high precision.
  • Another object of the invention is therefore to provide a computer controlled nucleic acid synthesis device for carrying out the synthesis of long nucleic acids enzymatically in an aqueous medium.
  • the present invention provides an installation for the implementation of a method for the enzymatic synthesis of nucleic acids, in particular nucleic acids of great length, comprising:
  • each elongation chamber being formed of a single reactor containing at least one fixed support for attaching nucleic acid fragments during elongation, comprising a multiplicity of reaction sites; elongation,
  • nucleic compounds comprising several steps including at least one step of enzymatic addition of the nucleotides taking place in an aqueous medium,
  • the synthesis device comprising physical means for differentiated selection of the reaction sites to be activated or deactivated before an elongation cycle, ii) a central computer system (9) including at least one control interface and a pilot software, capable of controlling the operating conditions of said synthesis device and the progress of the synthesis.
  • a central aspect of the installation according to the invention is the elongation chamber which consists of a single reactor. The operation of the synthesis device, and the operating conditions of the synthesis is thus easily controllable by a computer.
  • single reactor is meant a reactor where the successive reactions of enzymatic addition and purification take place, without requiring a transfer of nucleic acids during elongation.
  • the synthesis device comprises:
  • each elongation chamber being formed of a single reactor containing two types of attachment brackets for the fragments of nucleic acids being elongated: firstly a fixed support comprising a multiplicity of elongation reaction sites and secondly mobile supports capable of interacting with the nucleic acid fragments being elongated at level of said reaction sites,
  • This laboratory synthesis device is an autonomous and automated equipment allowing the synthesis of nucleic acid fragments whose type, single-stranded or double-stranded, as well as the length, from 3 to several million bases or base pairs, may vary. and whose sequence and characteristics are communicated by one or more computers. Unlike existing oligosynthesizers today, the synthesis device of the plant according to the invention makes it possible to carry out a synthesis which does not require steps of assembly of several oligonucleotides to synthesize a fragment of more than 150 nucleotides.
  • the synthesis device comprises physical means of differentiated selection of the reaction sites to be activated or deactivated before an elongation cycle, in order to be able to differentially control the sequence of the nucleic acids synthesized in each of these reaction sites.
  • said physical selection means may comprise an optical system including electromagnetic radiation.
  • the elongation chamber is advantageously equipped with walls that are transparent to said radiations, the optical system directing said radiations to predetermined reaction sites, said radiations preferably being chosen in the visible or infra-red range and being suitable to modify the attachment, or cause the stall, of the nucleic acid fragment on the corresponding support, by modifying the structure of the terminal nucleotide of said nucleic acid fragment.
  • said fixed support comprises at least one interchangeable matrix card, housed in operating position, in the elongation chamber, the surface of said matrix card comprising a multiplicity of reaction sites in the form of functionalized zones (for example in the form of patch) and / or cells and / or nano- well.
  • Said matrix card may comprise one or more network (s) of cells and / or nano-wells, each cell or nano-well constituting a specific reaction site of elongation.
  • each cell or nano-well has walls whose surface is functionalized and capable of fixing a first end of nucleic acid fragments, preferably the 5 'end of said nucleic acid fragments.
  • each cell or nano-well may constitute a receptacle for said mobile supports, the outer surface of said mobile supports being functionalized (by grafting or coating) and able to fix a second end of the nucleic acid fragments, preferably 3 'end of said nucleic acid fragments.
  • the nucleic acid fragments being elongated can be either "hooked" to the reaction sites of the matrix card (fixed support), or “hooked” to the mobile supports, or “hooked” to these two supports, by their ends. respective, or alternatively to one or the other of these supports, depending on the operating conditions (or operating) of the elongation chamber, depending on the corresponding step of the synthesis of said nucleic acids.
  • said movable supports are in the form of balls, preferably balls comprising a ferromagnetic material, said means for immobilizing or repulsing all or some preselected mobile supports comprising a field generator magnetic.
  • the means for modifying the operating conditions can be means of modifying the operating conditions within the elongation chamber, allowing the attachment or unhitching of the acid fragments. nuclei of the fixed support at operating conditions different from those of the mobile supports. These conditions can be physical conditions such as temperature, electromagnetic radiation, electric potential or magnetic field.
  • these means for modifying the operating conditions are means for adapting the temperature of the elongation chamber to the thermal conditions for attachment or stalling of the nucleic acid fragments of one or other of the different supports.
  • the elongation chamber comprises one or more conduits for introducing reagents, or washing solutions, or buffer solutions into the network of cells or nano-wells of the matrix card, the conduit (s) ) of introduction being disposed (s) between the face, called top face, of said card having the openings of the cells or nanowells and a cover transparent to electromagnetic radiation.
  • the bottom walls of the cells or nano-wells of the matrix card comprise orifices communicating with one or more liquid discharge conduits disposed below the face, referred to as the bottom face. of said card, the passage sections of said orifices having a diameter smaller than that of said movable supports, such as balls.
  • the unused reagents, excess buffer solution, washing solutions and / or erroneous fragments can be easily removed from the elongation chamber, while maintaining the mobile supports within the cells or nano-wells of the matrix card.
  • the installation according to the invention also comprises a device for controlling the progress of the elongation. It also includes at least one computer including the pilot software that controls the operation of the synthesis device.
  • the installation according to the present invention comprises at least one computer capable of allowing the virtual manipulation of the nucleic acid sequence (s) to be synthesized.
  • FIG. 1 represents various examples (A, B or C) of configuration of the installation according to the invention with interaction between the synthesis device and the computer (s) allowing control of the synthesis.
  • Figure 2 shows an example of a conceptual diagram of the entire installation according to the invention including the nucleic acid synthesis device.
  • Full double arrows represent the flow of information and computer data.
  • the dashed lines represent the flow of energy.
  • Double-headed double arrows represent material flows.
  • Figure 3 is a schematic diagram of an exemplary procedure showing the steps separating the virtual manipulation of the sequences of their synthesis using the computer controlled synthesis device.
  • the double frames represent operations performed by the experimenter, the simple frames represent the steps performed by the different computer systems and by the nucleic acid synthesis device.
  • Figure 4 is a partial sectional diagram of the elongation chamber in which is inserted a matrix card.
  • the top of the elongation chamber consists of a translucent material.
  • Figure 5 is a top diagram of an elongation chamber including a matrix card.
  • Figure 6 is a top view of a cylindrical nano-well.
  • Figure 7 is a sectional diagram of the synthesis device.
  • Figure 8 shows an example of an injection system reagents to the elongation chamber.
  • the elongation chamber 1 can contain a removable matrix card 21 serving as a fixed support during the synthesis of the nucleic acids.
  • This matrix card 21 is advantageously divided into several elongation sites in which nucleic acid fragments which may be of different sequences are synthesized in parallel.
  • the reagents are injected into the elongation chamber and distributed to all the elongation sites.
  • the control of the sequence of the synthesized fragments is done by a control of the physical conditions at each site. elongation.
  • These elongation sites may be functionalized patches or cells or nano-wells 22 formed in the matrix card.
  • the constituent material of the matrix may be based on one or more materials selected from steel, aluminum, silicon or any metal alloy consisting of two or more of the following elements: Fe, Se, Ge, As, Si , Au, Ar, Al, Cu, Pd, Co, Ni, Zn, Pt, Cd, Hg, Rh, Ir, Ga, In, Ti, V, Zr, and may also contain one or more of the following: Mg, Ca, B, C, O, N, S, F, Cl, P, I, Br; glass, polydimethylsiloxane, polymethyl methacrylate, cyclic olefin copolymer, polycarbonate, SU-photoresist, polyimide, polyethylene terephthalate, polyvinyl chloride, Teflon® or any organic polymer comprising halogen atoms. Facing the elongation sites disposed on the upper surface of this matrix
  • the cells or nano-wells 22 of the matrix card may be cylindrical, spherical or parallelepipedal. Their distribution on the matrix map can be organized in a network, in particular dihedral or cyclic.
  • the volume of cells or wells can vary from 1 pl_ to several milliliters.
  • a defined part of the surface of the elongation sites of the matrix card 21 advantageously has particular physicochemical properties which allow the creation of covalent bonds with nucleic acids or proteins.
  • the surfaces constituting the bottom and the walls of the nanowells 22 of the matrix card 21 which constitute said first hooking support comprise a specific surface coating 25 whose characteristics allow a functionalization of the surface.
  • the surface such as a metal oxide, a chemical functionalization or a protein coating which allows for example the establishment of covalent bonds with nucleic acid fragments or peptide fragments.
  • the second attachment support is advantageously formed by balls, movable in the elongation chamber, and whose dimensions are such that they are able to fit in the cells or nano-wells of the matrix card.
  • These beads may consist of ferromagnetic materials, polymer or resin, and covered with a specific surface coating, such as nucleic acid fragments of length between 10 and 10,000 nucleotides, a recognition protein and binding of Affinity such as antibodies, hormone receptors, avidin or any of its modified forms, neurotransmitter receptor, antidigioxin or any of its modified forms, lectin or any of its modified forms glutathione-S-transferase or any of its modified forms; a transition metal or a metal oxide comprising one or more of the following metals: Cu, Pd, Co, Ni, Zn, Pt, Cd, Hg, Rh, Ir, Ga, In, Ti.
  • the elongation chamber 1 may have in the lower part of the evacuation conduits 26 reagents and solutions (for example excess reagents or waste).
  • the matrix card 21 is arranged to create a separation of these exhaust ducts 26 from the rest of the elongation chamber 1.
  • the exhaust ducts 26 collect reagents and solutions to be eliminated, via the presence of specific orifices 27 formed at the bottom of the nano-wells 22.
  • the nano-wells may have one or more openings and the number of openings may vary from one nano-well to another.
  • the geometric section of these openings has a specific shape and size. Circular, polygonal or elliptical sections are non-limiting examples of forms that can take the openings to the exhaust ducts 26.
  • the size of the section of the openings can be calculated so that some of the elements involved in the nucleic acid synthesis process can not pass However, other reagents may borrow these orifices, which then act as filters.
  • the shape of the matrix card 21 is chosen to fit perfectly in the elongation chamber 1.
  • the synthesis device comprises supply conduits 33 in reagents, nucleotides, enzyme (s), primers, washing solutions or buffer solutions, connected to the elongation chamber 1 by one or more inlet valves (s). connected to a device for selecting said reagents involved in the synthesis process.
  • Said elongation chamber also has one or more outlet valve (s) 31 for discharging the solution contained in the elongation chamber.
  • the exhaust ducts 26 previously mentioned also have one or more outlet valves 35 for discharging the waste to be recycled or discarded.
  • one or more of the outlet valves 31 of the elongation chamber are connected to said exhaust ducts 26.
  • the valve system is organized so as to promote and accelerate the filling of the nano-wells 22 of the matrix card 21. This effect is obtained, for example, by judiciously combining the application of a pressure to certain inlet valves of the reagents with the application of a vacuum to certain outlet valves of the reagents. Control devices 3 and means for modifying the physical conditions in the elongation chamber.
  • the nucleic acid synthesis cycle requires particular physical conditions to perform with optimal performance.
  • Different parameters can be controlled in the elongation chamber: - Electromagnetic radiation. Facing the translucent wall 24 of the elongation chamber 1 is an optical system 34 which sends electromagnetic pulses to the matrix card.
  • a system with or without a mask makes it possible to select the active reaction sites to be illuminated. This system can benefit from the plasmon phenomenon described in the literature (resonance of the light wave when the wavelength coincides with the characteristic size of the sites of elongation).
  • the optical system mentioned above can also selectively heat areas of the chamber using, for example, wavelengths of the infrared range.
  • the temperature can also be controlled by Joule effect, thermoelectric effect, radiation.
  • the magnetic field can be controlled in the elongation chamber by the use of electromagnets or permanent magnets.
  • a device 2 for injecting the reagents into the elongation chamber 1 makes it possible, in particular, to ensure the proper sequential injection of the reagents 17 according to the synthesis cycle, to prevent any contamination between reagents, and to ensure the mixing of the reagents if need.
  • the injection of the reagents is made by combining pressure controllers 16 and active valves 19. In order to avoid any contamination between the reagents, all the reagent injection channels can be washed. at each stage of the synthesis cycle.
  • storage devices 4 are provided. All the reagents necessary for the process of nucleic acid synthesis. These devices, with a capacity that varies according to the reagent under consideration, are active or passive depending on the nature of the reagents to be stored.
  • the storage devices 4 are directly connected to certain input systems of the elongation chamber 1 through the reagent injection system 2. The role of the storage devices 4 is so be especially to keep the reagents in optimal conditions (temperature for example).
  • These storage devices 4 may also have sensors capable of checking the quality and the nature of the stored items. These sensors can then communicate with the central computer system 9 of the nucleic acid synthesis device.
  • the reagent storage devices 4 allow the reagents to be easily recharged, in a manner comparable to changing the ink cartridges in a paper printer. All the reagents used are advantageously in an aqueous medium.
  • the reagents used may be, in particular, nucleotides, reaction buffers, the polymerization enzyme, functionalized magnetic beads, a product for the deprotection of nucleotides, washing solutions.
  • the presence of retention devices 5 or waste recycling may be necessary.
  • the retention or recycling devices are connected to the storage devices 4 or directly to the inlet duct of the elongation chamber 1, but are, in any case, directly connected to the outputs of the chamber 1, allowing effective evacuation of these undesirable elements from the elongation chamber 1.
  • Sensors enabling verification of retained or recycled elements from the point of view of their quantity, quality and nature, can communicate with the central computer system 9 of the nucleic acid synthesis device.
  • an elongation control device 6 is present.
  • This device comprises various sensors and makes it possible to follow the process of synthesis from a kinetic point of view, the evolution of the concentrations of the different reagents, products and waste of the synthesis, to analyze the state of the various constituents present in the chamber of elongation 1, and analyze the physico-chemical parameters present in the elongation chamber 1.
  • This device is directly connected to the elongation chamber 1 and communicates with the central computer system 9. The information communicated, of very different natures, can be the subject of a partial analysis before distribution to the central computer system 9.
  • the role such a control device is to monitor the process of acid synthesis nucleic acid, to provide the necessary information for the elaboration of optimal synthesis parameters, to identify possible malfunctions in order to take measures to restore optimal functioning and to inform the operator.
  • Another particular aspect of the invention concerns the input and the holding frame of the matrix cards 7 in the elongation chamber 1.
  • the matrix card can be introduced, by means of an insertion device 7, into the synthesis device via an input or input hatch and can be maintained in the elongation chamber by a frame.
  • These elements can be independent or integral part of the elongation chamber 1, and in interaction with the various storage elements 4 retention or recycling 5 and control 6. These elements can be universal by adapting to several types of media or containers or specific to certain types of media or receptacles.
  • These elements can also be removable so as to be replaced by other elements of the same function but adapted to different types of support or receptacles. Effectors and sensors can also be part of these elements, with the role of moving the frame to allow the insertion of the support or receptacle, allow the entry of the support or receptacle, promote the proper positioning of the support or receptacle, allow the optimal connection with or optimal insertion into the elongation chamber 1.
  • These effectors and these sensors communicate advantageously with the central computer system 9 of the nucleic acid synthesis device and can be actuated directly from the control interface 8.
  • the change of matrix card in the elongation chamber can be done completely automated, like inserting a CD into a computer.
  • control interface 8 In order to be able to carry out basic commands a control interface 8 may be present. Similarly, in order to know the state of the nucleic acid synthesis device, a visual or sound interface may be present. These control and signaling elements can be connected to the central computer system 9. The role of the control interface makes it possible in particular for an operator to visualize the general state of the synthesis device, the level of the reagents, as well as the level. storage devices for the finished products and waste, the physicochemical conditions that prevail in the elongation chamber 1, the parameters of the central computer system 9 and in particular the connectivity of the nucleic acid synthesis device.
  • nucleic acid synthesis device can also allow an operator to visualize the progress of the process of elongation as well as the nature of the nucleic acid being synthesized, the origin of the control having resulted in the current synthesis, to activate the basic functions of the nucleic acid synthesis device, such as the opening and closing of the input or output devices, the return of samples, the start or the suspension of a synthesis, the switching off or on of the device, the setting of the different alarms.
  • the central computer system 9, driving the nucleic acid synthesis and allowing communication with a computer having the pilot software 10, comprises the conventional elements of a laptop, including a central processor, acquisition cards, computer ports , a RAM device, a data storage device, wired or wireless communication cards, a motherboard and a graphics device.
  • the role of the computer system is to acquire the data corresponding to the nucleic acid sequences to be synthesized as well as to control the synthesis process in the manner of a PLC.
  • the computer system can therefore communicate with all the components mentioned above in order to regulate their operation. It can also have decision-making autonomy, based on previously defined behavior, in order to guide the synthesis process in order to obtain the best possible results.
  • the computer system can therefore be parameterized by a "firmware" type control software or internal software.
  • a pilot software 10 is installed on the computers of researchers wishing to synthesize nucleic acids and wishing to manipulate nucleic acid sequences.
  • This software similar to the software dedicated to the manipulation of nucleic acid sequences, has an additional functionality allowing by activation of a simple command, to generate the synthesis, immediate or deferred, of all or part of the sequence of nucleic acid considered.
  • This software also makes it possible to set the nucleic acid synthesis device simply and quickly.
  • This software can furthermore be only an intermediate software of the "pilot software" type serving for the communication and parameterization of the device for synthesizing the nucleic acid.
  • the pilot software can be integrated into the operating system of the computer and thus allow the control of the nucleic acid synthesis device from several interfaces (see Figure 1) and other software.
  • the nucleic acid synthesis device is supplied with electricity as the main source of energy.
  • elements providing the necessary electric power 1 1 are present in the nucleic acid synthesis device. These elements may in particular comprise electrical transformers making it possible to pass from a public current to a current that can be used by the various effectors and sensors present in the nucleic acid synthesis device, electronic power and capacitance circuits, and sources of pressure allowing the injection of reagents.
  • the power elements 1 1 are controlled by the interface 8 and can supply all the devices and systems present in the nucleic acid synthesis facility.
  • nucleic acid synthesis devices can be supervised by the same computer or computer server.
  • the same nucleic acid synthesis device can receive information from several computers 13 or computer servers 14.
  • the described nucleic acid synthesis device thus stands out from current oligosynthesizers, in particular by:
  • the ability to synthesize the nucleic acid fragment (s) desires the operator in a simple and rapid manner.
  • nucleic acid fragment (s) directly and transparently for the operator, implementing the method according to WO 2015/159023 which does not require purification steps at the end of the synthesis of the nucleic acids. nucleic acid fragments, or assembly steps for synthesizing fragments larger than 150 nucleotides.
  • the programming and the control of the synthesis device are directly carried out by a software interface also allowing the operator to manipulate his nucleic acid sequences for editing, storing, revising or modifying them.
  • the device has a limited size and can take place on the majority of the benches in the laboratories of operators.
  • the diagram of Figure 1 describes an example of implementation of the installation according to the invention. Different modes of connection and use are represented. All allow one or more operators to obtain the synthesis of nucleic acids by using the acid synthesis device and a computer.
  • the computer 13 of the experimenter is directly connected to the synthesis device 15 by a wired connection.
  • the second case (B) several computers 13 of several experimenters are connected by wire connections to a server 14. The latter is itself connected to the synthesis device 15.
  • several synthesis devices 15 can be connected to the server simultaneously.
  • the third case (C) several computers 13 are connected to a server 14 with wireless technology. This connection can be direct or transit through a local intranet or even internet via a secure connection.
  • several synthesis devices can be connected to this server 14 and allow the synthesis of the desired nucleic acids.
  • the diagram in Figure 2 presents an example of a conceptual architecture of a nucleic acid synthesis facility, also presenting the different interactions between the elements of this installation.
  • the interactions presented here are essentially of three types: information and computer data flows, energy flows and material flows.
  • the operator can interact with the synthesis device in several cases: i) The operator controls the synthesis process by using a software or driver installed on his computer.
  • the operator directly controls the nucleic acid synthesis device via the control interface 8 for simple or maintenance commands. The operator is also able to know what is the status of the synthesis device by observing the different signals and information given by the same control interface. iii) The operator provides the support or receptacle in which the nucleic acid samples will be synthesized at the end of the synthesis process.
  • the operator retrieves the different nucleic acid samples for which he ordered the synthesis.
  • the power elements provide the electrical energy necessary for the operation of all the elements of the installation.
  • the central system distributes, centralizes and controls the information and commands necessary for the operation of all the elements of the synthesis device, in order to ensure optimal coordination.
  • the storage, retention, entry and exit devices ensure the transit and the supply of the materials necessary for the synthesis to the elongation chamber 1 which then constitutes the heart of the device by ensuring the synthesis of the molecules of nucleic acids.
  • the diagram of FIG. 3 presents an example of a procedure to be followed to carry out the synthesis of a nucleic acid sequence from a virtual sequence manipulated on the computer of an experimenter.
  • the experimenter manipulates the nucleic acid sequence of interest according to his desire so as to obtain a satisfactory final sequence. He then presses a proposed command in the form of a virtual button relating to the synthesis of his sequence.
  • a window proposing various parameters such as the extent of the sequence to be synthesized, the type of nucleic acid, the amount to be synthesized, or the synthesis time, allows the user to make his choices.
  • a procedure for validating the various parameters by pressing a "synthesize" or "ok” type button makes it possible to trigger the synthesis procedure.
  • the latter comprises first an encoding step by the software or driver present on the computer 13 or the server 14 of the experimenter. Then comes a phase of data transfer via different channels until the receipt of these data in operational form by the nucleic acid synthesis device. Via the central computer system 9, the latter carries out the programming and the coordination of the synthesis of the sequence according to the parameters defined by the experimenter. The synthesis of the nucleic acid molecules then begins. Depending on the chosen parameters, the experimenter can be informed in real time of the progress of the synthesis as well as the quality of the latter. He may also be informed when the finalization of his synthesis to be able to recover his samples.
  • FIG. 4 An example of an elongation chamber is shown diagrammatically in FIG. 4.
  • the card 21 in which the nano-wells 22 are located is removable and is held by seals on its edges.
  • the nano-wells 22 can be manufactured by photolithography in a conventional manner.
  • the upper wall 24 of the elongation chamber 1 may be glass, for example, to let the light.
  • the central portion made of the matrix card thus separates the exhaust ducts 26 from the rest of the elongation chamber.
  • the inner surface of the nano-wells 22 is covered with an amino-propyl-triethoxysilane (APTES) layer by soaking in a solution of 2% APTES.
  • APTES amino-propyl-triethoxysilane
  • the chamber and the matrix card shown diagrammatically in FIG. 5, are here of rectangular section, and the matrix card has 231 cylindrical nano-wells distributed in 11 lines and 21 columns in a square-based network distribution.
  • the larger diameter circles on the left and right of the elongation chamber represent the inlet and outlet valves 31 of the reagents.
  • FIG. 6 shows an example of a nano-well 22 of cylindrical shape, in the bottom 32 of which are formed cylindrical holes 27 allowing the evacuation of certain reagents or waste towards the evacuation conduit 26.
  • the nano-wells 22 as well as the holes 27 may be formed conventionally by photolithography.
  • the bottom 32 and the walls of the nano-well 22 are covered in this example of capture DNA fragments, fixed by reaction with the surface coating constituted by the APTES.
  • the schematized dashed surface represents the surface allowing the realization of a covalent bond with nucleic acid fragments or proteins.
  • An optical system comprising a source 36 of electromagnetic radiation and lenses 37, mirrors or masks, makes it possible to illuminate the nano-wells independently of one another and can be produced with or without an obstructing mask.
  • the optical system also selectively heats nano-wells using a wavelength in the infrared range.
  • the inlet valves 30 and outlet 31 of the chamber allow the reagents to enter the nano-wells and evacuate waste efficiently.
  • the magnetic field in the elongation chamber is controllable by an electromagnet (not shown) that is placed for example under the exhaust ducts 26, or under the bottom 29 of the elongation chamber.
  • the diagram of FIG. 8 shows an example of a system for injecting reagents composed of pressure paths and valves 19. This example allows the sequential injection of reagents, avoiding as much contamination as possible by means of washing steps of the channels.
  • the injection device can use syringe pumps, pressure controllers and valves.
  • the valves can be electronic or valves integrated in a microfluidic card (Quake valve or other). Each of the reagent injection channels is washed upstream of the junction with the other channels in order to avoid as much contamination as possible.
  • the synthesis device is initially prepared in the following manner.
  • a matrix card 21 is inserted into the elongation chamber 1 of the synthesis device via the wall 24 forming a transparent cover.
  • This matrix card 21 comprises n nano-well 22, n being between 1 and 10 9 .
  • Nucleic acid fragments, primers, are immobilized at the side walls 25 and bottom 32 of the nano-wells 22 having adequate functionalization.
  • a nucleotide A addition cycle in the desired nano-wells is described below:
  • the nucleic acid fragments are attached to the walls of the nano-wells 22 at their 5 'end, and to a magnetic ball 28 at their 3' end.
  • the optical system 34 is parameterized so as to focus only on the nano-wells 22 in which it is desired to add the nucleotide A during this synthesis cycle.
  • a light source of optimum wavelength is activated for a period of time allowing the nucleotide to be unprotected and
  • the various inlet valves of the reagents 30, outlet 31 of the reagents and outlet of the exhaust ducts 26 remain in the closed position throughout this stage.
  • a magnetic field generation system (not shown) attached to the bottom 29 of the elongation chamber is parametered so as to create a repulsive magnetic field for the magnetic beads within the nano-wells 22 having undergone the light source in the previous step.
  • the reagent supply conduits 33 are now parameterized so as to allow the introduction into the elongation chamber, via the open reagent inlet valve 30, of a washing solution 18. washing enters the inlet conduit 23 and allows the elimination of the magnetic balls pushed to the cover 24, through the outlet valve reagents 31 then in the open position.
  • the outlet valve of the exhaust ducts 26 remains in the closed position.
  • the temperature of the nano-wells 22 is maintained at an optimum value by means of a temperature control system (not shown) attached to the bottom 29 of the elongation chamber.
  • a temperature control system (not shown) attached to the bottom 29 of the elongation chamber.
  • the reagent supply ducts 33 resume their initial parameterization and the various inlet valves of the reagents 30, reagent outlet 31 and outlet of the evacuation ducts 26 pass or remain in the closed position .
  • the reagent supply conduits 33 are now parameterized so that the reagents comprising enzymatic catalysts and nucleotides A are introduced into the elongation chamber by via the reagent inlet valve 30 in the open position.
  • the n-nano-wells 22 that comprises the matrix card 21 are then added to the fragments being elongated the reagents necessary for the elongation of these said fragments.
  • the outlet valve 31 of the reagents is kept open.
  • the outlet valve of the discharge ducts 26 can be opened at the end of filling to ensure that the reagents penetrate to the bottom of the nano-wells 22.
  • the inlet valves 30 of the reagents, outlet 31 of the reagents and outlet of the exhaust ducts 26 close again.
  • the system attached to the bottom 29 of the elongation chamber then makes it possible to maintain the nano-wells 22 at a temperature optimized for this addition step. In nano-wells that have not been deprotected by the light source, the addition step does not take place.
  • the various inlet valves 30 of the reagents, the outlet 31 of the reagents and the outlet 35 of the evacuation conduits 26 remain in the closed position.
  • the reagent supplying means 13 resume their initial parameterization and the various inlet valves 30 of reagents, outlet 31 of reagents and outlet 35 of evacuation conduits 26 pass or remain in position closed.
  • the reagent supply lines 33 are now set to allow the introduction of a wash solution into the elongation chamber through the open reagent inlet valve 30. .
  • This washing solution penetrates all the nano-wells 22 and allows the elimination of the preceding reagents, through the holes 27 and the exhaust ducts 26 opening on the outlet valve 35 of the evacuation ducts then in open position.
  • the outlet valve 31 of the reagents remains in the closed position.
  • the temperature of the nano-wells 22 is maintained at an optimum value by means of a temperature control system attached to the bottom 29 of the elongation chamber.
  • the reagent supply ducts 33 resume their initial parameterization and the various inlet valves 30 of reagents, outlet 31 of the reagents and exit 35 of the evacuation ducts pass or remain in closed position .
  • the reagent supply conduits 33 are now parameterized so as to allow introduction into the elongation chamber 1, via the open reagent inlet valve 30, of a suspension of magnetic beads constituting the second solid support 28.
  • This magnetic beads suspension is distributed and penetrates into all nano-wells 22 and interacts with the nucleic acid fragments that have just undergone an addition step.
  • the outlet valve 31 of the reagents is kept open. Once the filling is complete, the reagent inlet and reagent inlet valves 31 close again.
  • the system attached to the bottom 29 of the elongation chamber then makes it possible to maintain the nano-wells 22 at an optimized temperature to allow the stalling of nucleic acid fragments being elongated from the first support constituted by the side walls 25 and the bottom 32 of the nano-wells 22, and their attachment to the second support 28 constituted by the magnetic beads.
  • the various inlet valves 30 of the reagents, the outlet 31 of the reagents and the outlet 35 of the evacuation conduits 26 remain in the closed position.
  • the reagent supply means 33 resume their initial setting and the various inlet valves 30 of reagents, outlet 31 of reagents and outlet 35 of exhaust ducts 26 pass or remain in closed position .
  • the reagent supply conduits 33 are now set to allow the introduction of a wash solution into the elongation chamber through the open reagent inlet valve 30. .
  • This washing solution penetrates all of the nano-wells 22 and allows the removal of the fragments, not fixed on the second support 28, through the discharge holes 27 and the exhaust ducts 26 opening on the valve output 35 then in the open position.
  • the outlet valve 31 of the reagents remains in the closed position.
  • the temperature of the nano-wells 22 is maintained at an optimum value by means of the temperature control system.
  • the reagent supply ducts 33 resume their initial parameterization and the various inlet valves 30 of reagents, outlet 31 of reagents and outlet 35 of evacuation ducts 26 pass or remain in position closed.
  • the temperature control system attached to the bottom 29 of the elongation chamber is activated so as to generate an optimum temperature within the nano-wells 22 so as to allow the attachment of the nucleic acid fragments. in the process of elongation at the sidewalls 25 and the bottom 32 of the nano-wells 22.
  • the various inlet valves 30 of the reagents 31, outlet 31 of the reagents and outlet 35 of the evacuation conduits 26 pass or stay in the closed position. All of these steps are computer controlled. The user does not intervene in the synthesis between the moment when he asks for it and the end of the synthesis.
  • each of the nano-wells contains nucleic acid fragments of different sequences.

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Abstract

Installation d'un procédé de synthèse enzymatique d'acides nucléiques de grande longueur comprenant: i) un dispositif de synthèse comportant -au moins une chambre d'élongation (1) formée d'un réacteur unique renfermant au moins un support fixe d'accrochage de fragments d'acides nucléiques en cours d'élongation comprenant une multiplicité de sites réactionnels d'élongation, -des conduits d'alimentation (33) en réactifs connectés à la chambre d'élongation, -des conduits d'évacuation (26) des excédents ou déchets de ladite chambre d'élongation, -des moyens de modification des conditions de fonctionnement du dispositif de synthèse, tels que des moyens de régulation de la température, ladite chambre d'élongation (1) étant configurée pour réaliser au moins un cycle d'élongation desdits fragments d'acides nucléiques comprenant au moins une étape d'addition enzymatique des nucléotides se déroulant en milieu aqueux, ii) un système informatique central incluant au moins une interface de contrôle et un logiciel pilote, apte à piloter les conditions de fonctionnement dudit dispositif de synthèse et le déroulement de la synthèse.

Description

Installation pour la mise en œuyre d'un procédé de synthèse enzymatique d'acides nucléiques
La présente invention concerne une installation pour la mise en œuvre d'un procédé de synthèse enzymatique d'acides nucléiques, en particulier d'acides nucléiques de grande longueur, notamment une installation pouvant être pilotée par ordinateur. DOMAINE DE L'INVENTION
La majorité des techniques d'analyse de biologie moléculaire faisant intervenir de l'acide nucléique (ADN ou ARN), ou encore la modification génétique d'êtres vivants, quelles qu'en soit les fins, impliquent l'utilisation de fragments d'ADN ou d'ARN synthétiques. Ces fragments dont le type, simple brin ou double brin, ainsi que la longueur, de 3 à plusieurs millions de bases ou paires de bases, peuvent varier, doivent être synthétisés avant utilisation.
Le processus classique de synthèse d'acide nucléique, utilisant la « chimie phosphoramidite », est long et complexe et fait intervenir plusieurs étapes dont certaines ne sont pas automatisées. Pour des fragments dont la longueur est inférieure à 150 bases ou paires de bases il est possible de synthétiser l'acide nucléique à l'aide d'un oligosynthétiseur préalablement programmé pour réaliser une séquence définie à l'avance. Pour des fragments plus longs, des étapes successives d'assemblage sont nécessaires. Dans la vaste majorité des cas, des étapes de purification intermédiaires et finales seront nécessaires pour obtenir un fragment d'acide nucléique de qualité suffisante. Dans tous les cas, le chercheur opérant dans un laboratoire n'est pas en mesure de synthétiser l'acide nucléique de façon simple et rapide à partir de son ordinateur individuel.
En conséquence, il existe un besoin, pour les activités de recherche et de développement, d'analyse ou de tout type d'activité requérant l'utilisation d'acide nucléique, d'un dispositif de synthèse d'acide nucléique qui soit contrôlé directement par ordinateur et qui permette, de manière simple et rapide, de synthétiser le ou les fragments d'acide nucléique désiré en une unique opération de la part du chercheur opérant dans un laboratoire. Il existe également un besoin d'amélioration des performances de la synthèse d'acide nucléique. Une des voies envisagées est la synthèse d'acide nucléique par catalyse enzymatique, dont les performances sont potentiellement largement supérieures à la synthèse par catalyse chimique. Il n'existe pas aujourd'hui de synthétiseur adapté à cette nouvelle technologue de synthèse.
ETAT DE LA TECHN IQUE ANTERI EU RE
Les méthodes actuelles de synthèse d'acide nucléique font toujours intervenir, suivant les besoins, des opérations de synthèse chimique de fragments de taille limitée ainsi que des opérations d'assemblage de ces fragments en fragments plus longs suivant l'usage qui leur est destiné.
Les opérations de synthèse chimique sont réalisées à partir de dispositifs de type oligo-synthétiseur vendu dans le commerce ou à l'aide de dispositifs robotisés réalisés à façon par les sociétés de synthèse d'acide nucléique. Cependant, dans les deux cas, le chercheur expérimentateur n'a pas la possibilité de simplement et directement, en communiquant directement avec le dispositif de synthèse depuis n'importe quel ordinateur préalablement paramétré, de synthétiser le fragment d'acide nucléique désiré. Il doit passer par une procédure dédiée et souvent indirecte qui ne lui permet pas de manipuler à la fois l'acide nucléique sous forme virtuelle, en utilisant un logiciel dédié à la manipulation de séquence d'acide nucléique, et sous forme réelle par simple commande de l'opération de synthèse. Les opérations d'assemblage sont le plus souvent réalisées par des étapes expérimentales manuelles. Elles peuvent néanmoins être automatisées par l'emploi de dispositif robotique sur mesure. Ces dispositifs sont alors contrôlés en fonction des étapes à réaliser et non en fonction de la séquence de l'acide nucléique à assembler. Dans les deux cas, le chercheur expérimentateur n'a pas la possibilité de simplement et directement, en communiquant directement avec le dispositif d'assemblage depuis n'importe quel ordinateur préalablement paramétré, d'assembler le fragment d'acide nucléique désiré. Il doit passer par une procédure dédiée et souvent indirecte qui ne lui permet pas de manipuler à la fois l'acide nucléique sous forme virtuelle, en utilisant un logiciel dédié à la manipulation de séquence d'acide nucléique, et sous forme réelle par simple commande de synthèse. A ce jour, aucun dispositif de laboratoire permettant la synthèse directe d'acide nucléique en une unique opération et depuis un ordinateur, préalablement paramétré et permettant de facilement manipuler virtuellement de l'acide nucléique, n'est disponible.
De plus, il n'existe aujourd'hui aucun dispositif permettant de synthétiser des acides nucléiques à façon en utilisant une catalyse enzymatique. Les synthétiseurs actuels utilisent une méthode chimique appelée phosphoramidite. Les réactifs utilisés sont organiques et néfastes pour l'environnement. De plus, des limitations inhérentes à cette méthode de synthèse chimique empêchent la synthèse de fragments de plus de 150 nucléotides.
BUTS DE l'INVENTION
Un premier but de l'invention est de proposer un dispositif de synthèse d'acide nucléique contrôlé par ordinateur et permettant à un expérimentateur de synthétiser à façon l'acide nucléique dont il a besoin en une unique opération pilotée depuis son ordinateur.
Les inventeurs ont mis au point récemment une nouvelle méthode de synthèse d'acides nucléiques mettant en œuvre une catalyse enzymatique, décrite dans la demande de brevet WO 2015/159023. Le cycle de synthèse qui utilise une enzyme de polymérisation est réalisable en milieux aqueux et ne présente pas les limitations inhérentes à la méthode chimique. Le procédé enzymatique permet de synthétiser sans assemblage des fragments d'acides nucléiques de grande longueur (plusieurs centaines voire milliers de nucléotides) avec une très grande précision.
Un autre but de l'invention est donc de proposer un dispositif de synthèse d'acide nucléique, contrôlé par ordinateur, permettant de réaliser la synthèse d'acides nucléiques de grande longueur par voie enzymatique, en milieu aqueux.
RESUME DE L'INVENTION A cet effet, la présente invention propose une installation pour la mise en œuvre d'un procédé de synthèse enzymatique d'acides nucléiques, en particulier d'acides nucléiques de grande longueur, comprenant :
i) un dispositif de synthèse comportant :
- au moins une chambre d'élongation (1 ), chaque chambre d'élongation étant formée d'un réacteur unique renfermant au moins un support fixe d'accrochage de fragments d'acides nucléiques en cours d'élongation comprenant une multiplicité de sites réactionnels d'élongation,
- des conduits d'alimentation (33) en nucléotides, enzyme(s), éventuelles amorces, solution(s) de lavage et/ou solution(s) tampon(s), lesdits conduits d'alimentation (33) étant connectés à la chambre d'élongation,
- des conduits d'évacuation (26) des excédents ou déchets de ladite chambre d'élongation (1 ),
- des moyens de modification des conditions de fonctionnement du dispositif de synthèse, tels que des moyens de régulation de la température, ladite chambre d'élongation (1 ) étant configurée pour permettre de réaliser au moins un cycle d'élongation desdits fragments d'acide nucléiques comprenant plusieurs étapes dont au moins une étape d'addition enzymatique des nucléotides se déroulant en milieu aqueux,
le dispositif de synthèse comprenant des moyens physiques de sélection différenciée des sites réactionnels à activer ou à désactiver avant un cycle d'élongation, ii) un système informatique central (9) incluant au moins une interface de contrôle et un logiciel pilote, apte à piloter les conditions de fonctionnement dudit dispositif de synthèse et le déroulement de la synthèse. Un aspect central de l'installation selon l'invention est la chambre d'élongation qui est constituée d'un réacteur unique. Le fonctionnement du dispositif de synthèse, et les conditions opératoires de la synthèse est ainsi facilement pilotable par un ordinateur.
Par réacteur unique, on entend un réacteur où ont lieu les réactions successives d'addition enzymatique et de purification, sans nécessiter un transfert des acides nucléiques en cours d'élongation.
De préférence, le dispositif de synthèse comprend :
- au moins une chambre d'élongation, chaque chambre d'élongation étant formée d'un réacteur unique renfermant deux types de supports d'accrochage des fragments d'acides nucléiques en cours d'élongation : d'une part un support fixe comprenant une multiplicité de sites réactionnels d'élongation et d'autre part des supports mobiles aptes à interagir avec les fragments d'acides nucléiques en cours d'élongation au niveau desdits sites réactionnels,
- et des moyens d'immobilisation de la totalité ou de certains supports mobiles présélectionnés.
Ce dispositif de synthèse de laboratoire est un équipement autonome et automatisé permettant la synthèse de fragments d'acide nucléique dont le type, simple brin ou double brin, ainsi que la longueur, de 3 à plusieurs millions de bases ou paires de bases, peuvent varier et dont la séquence, ainsi que les caractéristiques sont communiquées par un ou plusieurs ordinateurs. Contrairement aux oligosynthétiseurs existants aujourd'hui, le dispositif de synthèse de l'installation selon l'invention permet de réaliser une synthèse qui ne requiert pas d'étapes d'assemblage de plusieurs oligonucléotides pour synthétiser un fragment de plus de 150 nucléotides.
Le dispositif de synthèse comprend des moyens physiques de sélection différenciée des sites réactionnels à activer ou à désactiver avant un cycle d'élongation, afin de pouvoir contrôler de manière différenciée la séquence des acides nucléiques synthétisés dans chacun de ces sites réactionnels.
Par exemple, lesdits moyens physiques de sélection peuvent comprendre un système optique incluant des rayonnements électromagnétiques. Dans ce cas la chambre d'élongation est avantageusement équipée de parois transparentes auxdits rayonnements, le système optique dirigeant lesdits rayonnements sur des sites réactionnels prédéterminés, lesdits rayonnements étant choisis de préférence dans le domaine du visible ou de l'infra-rouge et étant aptes à modifier l'accrochage, ou provoquer le décrochage, du fragment d'acide nucléique sur le support correspondant, par modification de la structure du nucléotide terminal dudit fragment d'acide nucléique.
Dans le mode de réalisation de l'invention où le réacteur de la chambre d'élongation renferme deux types de supports d'accrochage des fragments d'acides nucléiques, ledit support fixe comprend au moins une carte matrice interchangeable, logée, en position de fonctionnement, dans la chambre d'élongation, la surface de ladite carte matrice comportant une multiplicité de sites réactionnels sous la forme de zones fonctionnalisées (par exemple sous la forme de patch) et/ou d'alvéoles et/ou de nano- puits.
Ladite carte matrice peut comprendre un ou plusieurs réseau(x) d'alvéoles et/ou de nano-puits, chaque alvéole ou nano-puits constituant un site spécifique réactionnel d'élongation. De manière avantageuse, chaque alvéole ou nano-puits présente des parois dont la surface est fonctionnalisée et apte à fixer une première extrémité de fragments d'acide nucléique, de préférence l'extrémité 5' desdits fragments d'acides nucléiques.
Plus particulièrement, chaque alvéole ou nano-puits peut constituer un réceptacle pour lesdits supports mobiles, la surface extérieure des dits supports mobiles étant fonctionnalisée (par greffage ou revêtement) et apte à fixer une seconde extrémité des fragments d'acides nucléiques, de préférence l'extrémité 3' desdits fragments d'acides nucléiques. Ainsi les fragments d'acides nucléiques en cours d'élongation peuvent être soit « accrochés » aux sites réactionnels de la carte matrice (support fixe), soit « accrochés » aux supports mobiles, soit « accrochés » à ces deux supports, par leurs extrémités respectives, ou encore alternativement à l'un ou à l'autre de ces supports, selon les conditions opératoires (ou de fonctionnement) de la chambre d'élongation, en fonction de l'étape correspondante de la synthèse desdits acides nucléiques.
Selon une variante avantageuse de l'invention, lesdits supports mobiles sont sous la forme de billes, de préférence de billes comprenant un matériau ferromagnétique, lesdits moyens d'immobilisation ou de répulsion de la totalité ou de certains supports mobiles présélectionnés comprenant un générateur de champ magnétique.
Ainsi les moyens de modification des conditions de fonctionnement peuvent être des moyens de modifications des conditions opératoires au sein de de la chambre d'élongation, permettant l'accrochage ou le décrochage des fragments d'acides nucléiques du support fixe à des conditions opératoires différentes de celles des supports mobiles. Ces conditions peuvent être des conditions physiques telles que température, rayonnement électromagnétique, potentiel électrique ou champ magnétique.
Par exemple, ces moyens de modifications des conditions opératoires sont des moyens d'adaptation de la température de la chambre d'élongation aux conditions thermiques d'accrochage ou de décrochage des fragments d'acides nucléiques de l'un ou l'autre des différents supports.
De manière avantageuse, la chambre d'élongation comporte un ou plusieurs conduits d'introduction des réactifs, ou solutions de lavage, ou solutions tampons dans le réseau d'alvéoles ou de nano-puits de la carte matrice, le ou les conduit(s) d'introduction étant disposé(s) entre la face, dénommée face supérieure, de ladite carte présentant les ouvertures des alvéoles ou nano-puits et un couvercle transparent aux rayonnements électromagnétiques.
Dans ce cas, de manière avantageuse, les parois de fond des alvéoles ou nano-puits de la carte matrice comportent des orifices communiquant avec un ou plusieurs conduits d'évacuation de liquides disposé(s) au-dessous de la face, dénommée face inférieure, de ladite carte, les sections de passage desdits orifices présentant un diamètre inférieur à celui desdits supports mobiles, tels que des billes.
Ainsi les réactifs non utilisés, solution tampon en excès, solutions de lavage et/ou les fragments erronés, peuvent être aisément évacués de la chambre d'élongation, tout en maintenant les supports mobiles au sein des alvéoles ou nano-puits de la carte matrice.
De préférence, l'installation selon l'invention comporte également un dispositif de contrôle du déroulement de l'élongation. Elle comprend aussi au moins un ordinateur incluant le logiciel pilote qui commande le fonctionnement du dispositif de synthèse.
En variant elle peut comprendre plusieurs ordinateurs reliés par liaison filaire ou par liaison sans fil à un serveur, et sont aptes à commander le fonctionnement du dispositif de synthèse. De manière avantageuse, l'installation selon la présente invention comprend au moins un ordinateur apte à permettre la manipulation virtuelle de la ou des séquences d'acide nucléiques à synthétiser.
DESCRIPTION DES FIGURES
L'invention sera bien comprise à la lecture de la description suivante d'exemples de réalisation, en référence aux dessins annexés dans lesquels :
La Figure 1 représente différents exemples (A, B ou C) de configuration de l'installation selon l'invention avec interaction entre le dispositif de synthèse et le ou les ordinateurs permettant le contrôle de la synthèse. La Figure 2 représente un exemple de diagramme conceptuel de l'ensemble de l'installation selon l'invention incluant le dispositif de synthèse d'acide nucléique. Les doubles flèches pleines représentent le flux d'information et de données informatiques. Les traits pointillés représentent le flux d'énergie. Les doubles flèches à double trait représentent les flux de matières.
La Figure 3 est un diagramme schématique d'un exemple de mode opératoire présentant les étapes séparant la manipulation virtuelle des séquences de leur synthèse en utilisant le dispositif de synthèse contrôlé par un ordinateur. Les doubles cadres représentent des opérations effectuées par l'expérimentateur, les cadres simples représentent les étapes réalisées par les différents systèmes informatiques et par le dispositif de synthèse d'acide nucléique.
La Figure 4 est un schéma en coupe partielle de la chambre d'élongation dans laquelle est insérée une carte matrice. Le haut de la chambre d'élongation est constitué d'un matériau translucide.
La Figure 5 est un schéma de dessus d'une chambre d'élongation comprenant une carte matrice. La Figure 6 est une vue de dessus d'un nano-puits cylindrique. La Figure 7 est un schéma en coupe du dispositif de synthèse.
La Figure 8 schématise un exemple de système d'injection des réactifs vers la chambre d'élongation.
DESCRIPTION DES MODES DE REALISATION PREFERES DE L'INVENTION
En se référant aux figures, et comme mentionné ci-dessus, la chambre d'élongation 1 peut renfermer une carte matrice 21 amovible servant de support fixe lors de la synthèse des acides nucléiques.
Cette carte matrice 21 est avantageusement divisée en plusieurs sites d'élongation dans lesquels sont synthétisés en parallèle des fragments d'acides nucléiques qui peuvent être de séquences différentes. Lors d'une étape de synthèse, les réactifs sont injectés dans la chambre d'élongation et distribués à tous les sites d'élongation Le contrôle de la séquence des fragments synthétisés se fait par un contrôle des conditions physiques au niveau de chaque site d'élongation.
Ces sites d'élongation peuvent être des patchs fonctionnalisés ou des alvéoles ou nano-puits 22 ménagés dans la carte matrice. Le matériau constitutif de la matrice peut être à base d'un ou plusieurs matériaux choisis parmi l'acier, l'aluminium, le silicium ou tout alliage métallique constitué de deux ou plus des éléments suivants: Fe, Se, Ge, As, Si, Au, Ar, Al, Cu, Pd, Co, Ni, Zn, Pt, Cd, Hg, Rh, Ir, Ga, In, Ti, V, Zr, et pouvant renfermer également un pour plusieurs des éléments ci-après : Mg, Ca, B, C, O, N, S, F, Cl, P, I, Br ; verre, polydiméthylsiloxane, polyméthylméthacrylate, copolymère d'oléfine cyclique, polycarbonate, SU-^ photoresist, polyimide, polyéthylene téréphthalate, polychlorure de vinyl, Teflon® ou tout polymère organique comprenant des atomes d'halogène. Faisant face aux sites d'élongation disposés en surface supérieure de cette carte matrice 21 peut se trouver une paroi 24 en matériau translucide.
Les alvéoles ou nano-puits 22 de la carte matrice peuvent être cylindriques, sphériques ou parallélépipédiques. Leur distribution sur la carte matrice peut être organisée en réseau, en particulier diédraux ou cycliques. Le volume des alvéoles ou puits peut varier de 1 pl_ à plusieurs millilitres.
Une partie définie de la surface des sites d'élongation de la carte matrice 21 possède avantageusement des propriétés physico-chimiques particulières qui permettent la création de liaisons covalentes avec des acides nucléiques ou des protéines. Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention les surfaces constituant le fond et les parois des nano-puits 22 de la carte matrice 21 qui constituent ledit premier support d'accrochage comportent un revêtement 25 de surface spécifique dont les caractéristiques permettent une fonctionnalisation de la surface tel qu'un oxyde métallique, une fonctionnalisation chimique ou un revêtement protéique qui permet par exemple l'établissement de liaisons covalentes avec des fragments d'acides nucléiques ou des fragments peptidiques.
Le second support d'accrochage est avantageusement formé par des billes, mobiles dans la chambre d'élongation, et dont les dimensions sont telles qu'elles sont aptes à se loger dans les alvéoles ou nano-puits de la carte matrice. Ces billes peuvent être constituées de matériaux ferromagnétique, de polymère ou de résine, et recouvertes d'un revêtement de surface spécifique, tel que des fragments d'acide nucléique de longueur comprise entre 10 et 10.000 nucléotides, une protéine de reconnaissance et fixation d'affinité telles que des anticorps, des récepteurs d'hormones, l'avidine ou l'une de ses formes modifiées, récepteur de neurotransmetteur, l'antidigioxine ou l'une de ses formes modifiées, la lectine ou l'une de ses formes modifiées, la glutathionne-S-transférase ou l'une de ses formes modifiées ; un métal de transition ou un oxyde métallique comprenant un ou plusieurs des métaux suivants: Cu, Pd, Co, Ni, Zn, Pt, Cd, Hg, Rh, Ir, Ga, In, Ti.
La chambre d'élongation 1 peut posséder dans sa partie inférieure des conduits d'évacuation 26 des réactifs et solutions (par exemple réactifs en excès ou déchets). La carte matrice 21 est disposée de façon à créer une séparation de ces conduits d'évacuation 26 d'avec le reste de la chambre d'élongation 1 . Les conduits d'évacuation 26 collectent réactifs et solutions à éliminer, via la présence d'orifices 27 spécifiques ménagés au fond des nano-puits 22. Les nano-puits peuvent posséder une ou plusieurs ouvertures et le nombre d'ouvertures peut varier d'un nano-puits à l'autre. La section géométrique de ces ouvertures possède une forme et une taille spécifique. Des sections de type circulaire, polygonale ou elliptique sont des exemples non limitatifs de formes que peuvent prendre les ouvertures vers les conduits d'évacuation 26. La taille de la section des ouvertures peut être calculée de telle sorte que certains des éléments intervenant dans le procédé de synthèse de l'acide nucléique ne puissent pas passer des sites réactionnels de la chambre d'élongation aux conduits d'évacuation 26. D'autres réactifs peuvent néanmoins emprunter ces orifices, qui agissent alors comme des filtres.
La forme de la carte matrice 21 est choisie de manière à s'insérer parfaitement dans la chambre d'élongation 1 .
Le dispositif de synthèse comporte des conduits d'alimentation 33 en réactifs, nucléotides, enzyme(s), amorces, solutions de lavage ou solutions tampon, connectées à la chambre d'élongation 1 par une ou plusieurs vanne(s) d'entrée 30 reliée(s) à un dispositif de sélection desdits réactifs qui interviennent dans le procédé de synthèse. Ladite chambre d'élongation possède également une ou plusieurs vanne(s) de sortie 31 permettant d'évacuer la solution contenue dans la chambre d'élongation.
Les conduits d'évacuation 26 précédemment cités possèdent également une ou plusieurs vannes de sortie 35 permettant d'évacuer les déchets pour pouvoir soit les recycler soit les jeter. Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, une ou plusieurs des vannes de sortie 31 de la chambre d'élongation sont reliées auxdits conduits d'évacuation 26. Dans un autre mode de réalisation préféré de la présente invention, le système de vannes est organisé de façon à favoriser et accélérer le remplissage des nano-puits 22 de la carte matrice 21 . Cet effet est obtenu par exemple en combinant judicieusement l'application d'une pression à certaines vannes d'entrée des réactifs avec l'application d'une dépression à certaines vannes de sortie des réactifs. Dispositifs de contrôle 3 et moyens de modification des conditions physiques dans la chambre d'élongation.
Le cycle de synthèse d'acide nucléique requiert des conditions physiques particulières pour s'effectuer avec des performances optimales. Différents paramètres peuvent être contrôlables dans la chambre d'élongation : - Rayonnement électromagnétique. Faisant face à la paroi 24 translucide de la chambre d'élongation 1 se trouve un système optique 34 qui permet d'envoyer vers la carte matrice des impulsions électromagnétiques. Un système avec ou sans masque permet de sélectionner les sites réactionnels actifs à éclairer. Ce système peut bénéficier du phénomène de plasmon décrit dans la littérature (résonance de l'onde lumineuse lorsque la longueur d'onde coïncide avec la taille caractéristique des sites d'élongation).
- Température. Le système optique évoqué ci-dessus peut également chauffer des zones de la chambre de manière sélective en utilisant par exemple des longueurs d'onde du domaine de l'infrarouge. La température peut également être contrôlée par effet Joule, effet thermo électrique, rayonnement.
- Champ magnétique. Le champ magnétique peut être contrôlé dans la chambre d'élongation grâce à l'utilisation d'électroaimants ou d'aimants permanents.
- Electricité. Peut être contrôlé une différence de potentiel entre les parois de la chambre d'élongation ou un courant à travers celle-ci.
Ces modules de contrôle des conditions physiques peuvent être intégrés à la chambre d'élongation elle-même. Un dispositif d'injection 2 des réactifs dans la chambre d'élongation 1 permet notamment d'assurer la bonne injection séquentielle des réactifs 17 conformément au cycle de synthèse, d'empêcher toute contamination entre réactifs, et d'assurer le mélange des réactifs si besoin. Dans une configuration préférée de l'invention, l'injection des réactifs est faite en combinant des contrôleurs de pression 16 et des vannes actives 19. Afin d'éviter toute contamination entre les réactifs, tous les canaux d'injection de réactifs peuvent être lavés à chaque étape du cycle de synthèse.
Pour que le dispositif de synthèse d'acide nucléique puisse fonctionner de manière autonome, dans une certaine mesure, pour une certaine durée et pour la synthèse d'un certain nombre de fragments d'une certaine longueur, sont prévus des dispositifs de stockage 4 de tous les réactifs nécessaires au processus de synthèse d'acide nucléique. Ces dispositifs, d'une capacité variable suivant le réactif considéré, sont actifs ou passifs suivant la nature des réactifs à stocker. Les dispositifs de stockage 4 sont directement reliés à certains systèmes d'entrée de la chambre d'élongation 1 à travers le système d'injection des réactifs 2. Le rôle des dispositifs de stockage 4 est donc être notamment de conserver les réactifs dans des conditions optimales (de température par exemple).
Ces dispositifs de stockage 4 peuvent également posséder des capteurs aptes à vérifier la qualité et la nature des éléments stockés. Ces capteurs peuvent alors communiquer avec le système informatique central 9 du dispositif de synthèse d'acide nucléique. Les dispositifs de stockage 4 des réactifs permettent de recharger facilement les réactifs, de façon comparable au changement des cartouches d'encre dans une imprimante papier. Tous les réactifs utilisés sont avantageusement en milieu aqueux. Les réactifs utilisés peuvent être en particulier, des nucléotides, des tampons de réaction, l'enzyme de polymérisation, des billes magnétiques fonctionnalisées, un produit de déprotection des nucléotides, des solutions de lavage.
Suivant la nature des déchets de synthèse et suivant la connectivité du dispositif de synthèse d'acide nucléique, la présence de dispositifs de rétention 5 ou de recyclage des déchets peut être nécessaire. Dans le cas de recyclage, les dispositifs de rétention ou de recyclage sont connectés aux dispositifs de stockage 4 ou directement au conduit d'entrée de la chambre d'élongation 1 , mais sont, dans tous les cas, directement reliés aux sorties de la chambre d'élongation 1 , en permettant l'évacuation efficace de ces éléments indésirables de la chambre d'élongation 1 . Des capteurs permettant la vérification des éléments retenus ou recyclés du point de vue de leur quantité, de leur qualité et de leur nature, peuvent communiquer avec le système informatique central 9 du dispositif de synthèse d'acide nucléique. Afin de surveiller, évaluer et contrôler l'état, la quantité ou la qualité du processus de synthèse d'acide nucléique un dispositif de contrôle de l'élongation 6 est présent. Ce dispositif comprend divers capteurs et permet de suivre le processus de synthèse d'un point de vue cinétique, l'évolution des concentrations des différents réactifs, produits et déchets de la synthèse, analyser l'état des différents constituants présents dans la chambre d'élongation 1 , et analyser les paramètres physico-chimiques présents dans la chambre d'élongation 1 . Ce dispositif est directement relié à la chambre d'élongation 1 et communique avec le système informatique central 9. Les informations communiquées, de natures très diverses, peuvent faire l'objet d'une analyse partielle avant diffusion au système informatique central 9. Le rôle d'un tel dispositif de contrôle est d'assurer un suivi du processus de synthèse des acides nucléiques, de fournir les informations nécessaires à l'élaboration de paramètres de synthèse optimaux, de repérer les disfonctionnements éventuels afin de prendre des mesures pour rétablir un fonctionnement optimal et afin d'en informer l'opérateur. Un autre aspect particulier de l'invention concerne l'entrée et le châssis de maintien des cartes matrices 7 dans la chambre d'élongation 1 . La carte matrice peut être introduite, au moyen d'un dispositif d'insertion 7, dans le dispositif de synthèse par une entrée ou trappe d'entrée et peut être maintenue dans la chambre d'élongation par un châssis. Ces éléments peuvent être indépendants ou partie intégrale de la chambre d'élongation 1 , et en interactions avec les différents éléments de stockage 4 de rétention ou recyclage 5 et de contrôle 6. Ces éléments peuvent être universels en s'adaptant à plusieurs types de supports ou réceptacles ou bien spécifiques de certains types de supports ou réceptacles. Ces éléments peuvent également être amovibles de façon à être remplacés par d'autres éléments de même fonction mais adaptés à différents types de support ou réceptacles. Des effecteurs et des capteurs peuvent aussi faire partie de ces éléments, avec pour rôle de déplacer le châssis afin de permettre l'insertion du support ou réceptacle, permettre l'entrée du support ou réceptacle, favoriser le bon positionnement du support ou réceptacle, permettre la liaison optimale avec ou l'insertion optimale dans, la chambre d'élongation 1 . Ces effecteurs et ces capteurs communiquent avantageusement avec le système informatique central 9 du dispositif de synthèse d'acide nucléique et peuvent être actionnés directement depuis l'interface de contrôle 8. Le changement de carte matrice dans la chambre d'élongation peut se faire de manière totalement automatisée, à la manière de l'insertion d'un CD dans un ordinateur.
Afin de pouvoir réaliser des commandes basiques une interface de contrôle 8 peut être présente. De même, afin de connaître l'état du dispositif de synthèse d'acide nucléique, une interface visuelle ou sonore peut être présente. Ces éléments de contrôle et de signalisation peuvent être reliés au système informatique central 9. Le rôle de l'interface de contrôle permet en particulier à un opérateur de visualiser l'état général du dispositif de synthèse, le niveau des réactifs, ainsi que le niveau des dispositifs de stockage des produits finis et des déchets, les conditions physicochimiques qui régnent dans la chambre d'élongation 1 , les paramètres du système informatique central 9 et notamment la connectivité du dispositif de synthèse d'acide nucléique. Il peut aussi permettre à un opérateur de visualiser l'état d'avancement du processus d'élongation ainsi que la nature de l'acide nucléique en cours de synthèse, la provenance de la commande ayant abouti à la synthèse en cours, d'activer les fonctions basiques du dispositif de synthèse d'acide nucléique, telles que l'ouverture et la fermeture des dispositifs d'entrée ou sortie, la restitution d'échantillons, le départ ou la mise en suspens d'une synthèse, la mise hors ou sous tension de l'appareil, le paramétrage des différentes alarmes.
Le système informatique central 9, pilotant la synthèse d'acide nucléique et permettant la communication avec un ordinateur possédant le logiciel pilote 10, comprend les éléments classiques d'un ordinateur portable, notamment un processeur central, des cartes d'acquisition, des ports informatiques, un dispositif de mémoire vive, un dispositif de stockage de données, des cartes de communication filaires ou non filaires, une carte mère et un dispositif graphique. Le rôle du système informatique est destiné à acquérir les données correspondant aux séquences d'acide nucléique à synthétiser ainsi que commander le processus de synthèse à la manière d'un automate. Le système informatique peut donc communiquer avec tous les composants cités précédemment afin de réguler leur fonctionnement. Il peut également avoir une autonomie de décision, basé sur un comportement préalablement défini, afin d'orienter le processus de synthèse dans le but d'obtenir les meilleurs résultats possibles. Le système informatique peut donc être paramétré par un logiciel de contrôle de type « firmware » ou logiciel interne.
Un logiciel pilote 10 est installé sur les ordinateurs des chercheurs désirant synthétiser des acides nucléiques et désirant manipuler des séquences d'acide nucléique. Ce logiciel, similaire aux logiciels dédiés à la manipulation de séquences d'acide nucléique, possède une fonctionnalité supplémentaire permettant par activation d'une simple commande, d'engendrer la synthèse, immédiate ou différée, de tout ou d'une partie de la séquence d'acide nucléique considérée. Ce logiciel permet également de paramétrer de façon simple et rapide le dispositif de synthèse d'acide nucléique. Ce logiciel peut en outre n'être qu'un logiciel intermédiaire de type « logiciel pilote » servant à la communication et au paramétrage du dispositif de synthèse de l'acide nucléique. Le logiciel pilote pourra être intégré au système d'exploitation de l'ordinateur et ainsi permettre le contrôle du dispositif de synthèse d'acides nucléiques à partir de plusieurs interfaces (voir figure 1 ) et autres logiciels. Le dispositif de synthèse d'acide nucléique est alimenté en électricité comme source d'énergie principale. A cet effet, des éléments apportant la puissance 1 1 électrique nécessaire sont présents dans le dispositif de synthèse d'acide nucléique. Ces éléments peuvent notamment comprendre des transformateurs électriques permettant de passer d'un courant public à un courant utilisable par les différents effecteurs et capteurs présents dans le dispositif de synthèse d'acide nucléique, de circuits électroniques de puissance et de capacitance, et de sources de pression permettant l'injection des réactifs. Les éléments de puissance 1 1 sont commandés par l'interface 8 et peuvent alimenter tous les dispositifs et systèmes présents dans l'installation de synthèse d'acide nucléique.
Avantageusement plusieurs dispositifs de synthèse d'acide nucléique peuvent être supervisés par un même ordinateur ou serveur informatique. Inversement, un même dispositif de synthèse d'acide nucléique peut recevoir des informations de la part de plusieurs ordinateurs 13 ou serveurs 14 informatiques.
Le dispositif de synthèse d'acide nucléique décrit se démarque donc des oligosynthétiseurs actuels, notamment par :
La capacité à synthétiser le ou les fragments d'acide nucléique dési l'opérateur d'une façon simple et rapide.
L'utilisation d'un cycle de synthèse utilisant une catalyse enzymatique, et la réalisation de plusieurs synthèses en parallèle dans la même chambre d'élongation. Pour chaque site d'élongation, l'addition ou la non-addition d'un nucléotide à chaque injection des nucléotides dans la chambre d'élongation est gérée par un contrôle des conditions physiques au niveau de chaque site d'élongation.
L'absence d'utilisation de réactifs organiques néfastes pour l'environnement
La capacité à synthétiser le ou les fragments d'acide nucléique désirés de manière directe de façon transparente pour l'opérateur, mettant en œuvre le procédé selon WO 2015/159023 qui ne nécessite pas d'étapes de purification à la fin de la synthèse des fragments d'acide nucléique, ni d'étapes d'assemblage pour synthétiser des fragments de plus de 150 nucléotides.
La programmation et la commande du dispositif de synthèse sont directement réalisées par une interface logicielle permettant également à l'opérateur de manipuler ses séquences d'acide nucléique afin de les éditer, les stocker, les réviser ou les modifier.
- Le dispositif présente une taille limitée et peut prendre place sur la majorité des paillasses dans les laboratoires des opérateurs.
- La possibilité de programmer le dispositif de synthèse pour des travaux consécutifs de natures différentes sans devoir réaliser d'intervention sur le dispositif en lui-même. Seules des opérations de commande depuis le logiciel dédié sont nécessaires à réaliser toutes les synthèses désirées, dans la limite de disponibilité des matières premières dans leurs différents dispositifs de stockage.
EXEMPLES
Le schéma de la Figure 1 décrit un exemple de mise en œuvre de l'installation selon l'invention. Différents modes de connexion et d'utilisation sont représentés. Tous permettent à un ou des opérateurs d'obtenir la synthèse des acides nucléiques par utilisation du dispositif de synthèse d'acide et d'un ordinateur. Dans le premier cas (A), l'ordinateur 13 de l'expérimentateur est directement relié au dispositif de synthèse 15 par une connexion filaire. Dans le second cas (B), plusieurs ordinateurs 13 de plusieurs expérimentateurs sont reliés par des connexions filaires à un serveur 14. Ce dernier est lui-même relié au dispositif de synthèse 15. Bien que non représenté sur le schéma plusieurs dispositifs de synthèse 15 peuvent être reliés simultanément au serveur. Enfin, dans le troisième cas (C), plusieurs ordinateurs 13 sont reliés à un serveur 14 avec une technologie sans fil. Cette liaison peut être directe ou transiter à travers un intranet local ou même internet via une connexion sécurisée. Comme dans le second cas, plusieurs dispositifs de synthèse peuvent être reliés à ce serveur 14 et permettent la synthèse des acides nucléiques désirés.
Le diagramme de la Figure 2 présente un exemple d'architecture conceptuelle d'une installation de synthèse d'acide nucléique, en présentant également les différentes interactions entre les éléments de cette installation. Les interactions présentées ici sont essentiellement de trois natures : flux d'information et de données informatiques, flux d'énergie et flux de matière. Dans l'exemple présenté l'opérateur peut interagir avec le dispositif de synthèse dans plusieurs cas : i) L'opérateur commande le processus de synthèse par l'utilisation d'un logiciel ou d'un pilote installé sur son ordinateur.
ii) L'opérateur commande directement le dispositif de synthèse d'acide nucléique via l'interface de contrôle 8 pour des commandes simples ou de maintenance. L'opérateur est également en mesure de savoir quel est le statut du dispositif de synthèse en observant les différents signaux et informations donnés par cette même interface de contrôle. iii) L'opérateur apporte le support ou réceptacle dans lequel les échantillons d'acide nucléique seront synthétisés à l'issue du processus de synthèse.
iv) L'opérateur récupère les différents échantillons d'acide nucléique dont il a commandé la synthèse.
v) L'opérateur, lors d'opérations de maintenance périodiques, remplit les dispositifs de stockage 4 de matières premières et vide les dispositifs de rétention de matière première usagée.
Les éléments de puissance fournissent l'énergie électrique nécessaire au fonctionnement de tous les éléments de l'installation. Le système central distribue, centralise et commande les informations et commandes nécessaires au fonctionnement de tous les éléments du dispositif de synthèse, et cela afin d'assurer une coordination optimale. Enfin, les dispositifs de stockage, de rétention, d'entrée et de sortie assurent le transit et la fourniture des matières nécessaires à la synthèse à la chambre d'élongation 1 qui constitue alors le cœur du dispositif en assurant la synthèse des molécules d'acides nucléiques.
Le diagramme de la Figure 3 présente un exemple de mode opératoire à suivre pour réaliser la synthèse d'une séquence d'acide nucléique à partir d'une séquence virtuelle manipulée sur l'ordinateur d'un expérimentateur. L'expérimentateur manipule selon son désir la séquence d'acide nucléique d'intérêt de façon à obtenir une séquence finale satisfaisante. Il presse ensuite une commande proposée sous forme de bouton virtuel relatif à la synthèse de sa séquence. Une fenêtre proposant différents paramètres tels que l'étendue de la séquence à synthétiser, le type d'acide nucléique, la quantité à synthétiser, ou encore le délai de synthèse, permet à l'utilisateur de faire ses choix. Finalement une procédure de validation des différents paramètres par pression sur un bouton de type « synthétiser » ou « ok » permet de déclencher la procédure de synthèse. Cette dernière comporte d'abord une étape d'encodage par le logiciel ou pilote présent sur l'ordinateur 13 ou le serveur 14 de l'expérimentateur. Vient ensuite une phase de transfert de données via différents canaux jusqu'à la réception de ces données sous forme opérationnelle par le dispositif de synthèse d'acide nucléique. Via le système informatique central 9, ce dernier réalise la programmation et la coordination de la synthèse de la séquence suivant les paramètres définis par l'expérimentateur. La synthèse des molécules d'acide nucléique commence alors. Suivant les paramètres choisis l'expérimentateur pourra être informé en temps réel de l'état d'avancement de la synthèse ainsi que de la qualité de cette dernière. Il pourra également être informé lors de la finalisation de sa synthèse afin de pouvoir récupérer ses échantillons.
Un exemple de chambre d'élongation est schématisé sur la figure 4. La carte 21 dans laquelle se trouvent les nano-puits 22 est amovible et est tenue par des joints sur ses arêtes. Lorsque la carte est en Silicium, les nano-puits 22 peuvent être fabriqués par photolithographie de manière classique. La paroi 24 supérieure de la chambre d'élongation 1 peut-être en verre, par exemple, pour laisser passer la lumière. La partie centrale constituée de la carte matrice sépare ainsi les conduits d'évacuation 26 du reste de la chambre d'élongation. La surface interne des nano-puits 22 est recouverte d'une couche d'amino-propyl-triéthoxy-silane (APTES) par trempage dans une solution d'APTES à 2 %.
La chambre et la carte matrice, schématisées à la figure 5, sont ici de section rectangulaire, et la carte matrice possède 231 nano-puits cylindriques répartis en 1 1 lignes et 21 colonnes selon une distribution en réseau à base carrée. Les cercles de plus grand diamètre sur la gauche et la droite de la chambre d'élongation représentent les vannes d'entrée 30 et de sortie 31 des réactifs.
La Figure 6 montre un exemple de nano-puits 22 de forme cylindrique, dans le fond 32 duquel sont ménagés des trous 27 cylindriques permettant l'évacuation de certains réactifs ou déchets vers le conduit d'évacuation 26. Les nano-puits 22 comme les trous 27 peuvent être formés de manière classique par photolithographie. Le fond 32 et les parois du nano-puits 22 sont recouverts dans cet exemple de fragments d'ADN de capture, fixés par réaction avec le revêtement de surface constituée par le APTES. La surface schématisée en pointillés représente la surface permettant la réalisation d'une liaison covalente avec des fragments d'acides nucléiques ou des protéines.
Un système optique (Figure 7) comprenant une source 36 de rayonnements électromagnétiques et des lentilles 37, miroirs ou masques, permet d'illuminer les nano-puits indépendamment les uns des autres et peut être réalisé avec ou sans masque obstruant. Le système optique permet également de chauffer les nano-puits de manière sélective en utilisant une longueur d'onde dans le domaine de l'infrarouge. Les vannes d'entrée 30 et de sortie 31 de la chambre permettent de faire entrer les réactifs dans les nano-puits et d'évacuer les déchets de manière efficace. Le champ magnétique dans la chambre d'élongation est contrôlable par un électroaimant (non représenté) que l'on place par exemple sous les conduits d'évacuation 26, ou sous le fond 29 de la chambre d'élongation. Le schéma de la Figure 8 présente un exemple de système d'injection des réactifs composé de voies de pression et de vannes 19. Cet exemple permet l'injection séquentielle de réactifs, en évitant au maximum les contaminations grâce à des étapes de lavage des canaux micro-fluidiques entre chaque injection de réactif au moyen de solution de lavage 18. Le dispositif d'injection peut utiliser des pousse- seringues, des contrôleurs de pression et des vannes.
Les vannes peuvent être électroniques ou des vannes intégrées à une carte micro- fluidique (vanne Quake ou autre). Chacun des canaux d'injection des réactifs est lavé en amont de la jonction avec les autres canaux afin d'éviter au maximum les contaminations.
Un exemple de réalisation détaillée d'une synthèse d'acides nucléiques au moyen d'une installation conforme à la présente invention, est décrit ci-après.
Le dispositif de synthèse est initialement préparé de la manière suivante. Une carte matrice 21 est insérée dans la chambre d'élongation 1 du dispositif de synthèse par l'intermédiaire de la paroi 24 formant couvercle transparent. Cette carte matrice 21 comporte n nano-puits 22, n étant compris entre 1 et 109. Des fragments d'acides nucléiques, amorces, sont immobilisés aux parois latérales 25 et au fond 32 des nano-puits 22 possédant une fonctionnalisation adéquate. Au cours de la synthèse d'acide nucléique, un cycle d'addition d'un nucléotide A dans les nano-puits désirés est décrit ci-après :
Avant le début de chaque cycle de synthèse, les fragments d'acide nucléique sont fixés aux parois des nano-puits 22 à leur extrémité 5', et à une bille magnétique 28 à leur extrémité 3'.
Déprotection lumineuse Le système optique 34 est paramétré de façon à ne focaliser que sur les nano-puits 22 dans lesquels on souhaite ajouter le nucléotide A au cours de ce cycle de synthèse. Pour chacun de ces nano-puits 22, par l'intermédiaire du couvercle transparent formant la paroi 24 supérieure de la chambre d'élongation, un puise lumineux d'une longueur d'onde optimale est activé pendant une durée permettant de déprotéger le nucléotide et le décrocher de la bille magnétique 28. Les différentes vannes d'entrée des réactifs 30, de sortie 31 des réactifs et de sortie des conduits d'évacuation 26 restent en position fermée durant toute cette étape.
Lavage pour élimination des billes magnétiques Un système de génération de champs magnétiques (non représenté) accolé au fond 29 de la chambre d'élongation est paramétré de façon à créer un champ magnétique répulsif pour les billes magnétiques au sein des nano-puits 22 ayant subit le puise lumineux lors de l'étape précédente. Les conduits d'alimentation en réactif 33 sont maintenant paramétrés de façon à permettre l'introduction dans la chambre d'élongation, par l'intermédiaire de la vanne d'entrée des réactifs 30 ouverte, d'une solution de lavage 18. Cette solution de lavage pénètre dans le conduit d'entrée 23 et permet l'élimination des billes magnétiques repoussées vers le couvercle 24, par l'intermédiaire de la vanne de sortie des réactifs 31 alors en position ouverte. La vanne de sortie des conduits d'évacuation 26 reste en position fermée. Durant cette étape de lavage la température des nano-puits 22 est maintenue à une valeur optimale par l'intermédiaire d'un système de contrôle de la température (non représenté) accolé au fond 29 de la chambre d'élongation. A la fin de cette étape, les conduits d'alimentation en réactifs 33 reprennent leur paramétrage initial et les différentes vannes d'entrée des réactifs 30, de sortie des réactifs 31 et de sortie des conduits d'évacuation 26 passent ou restent en position fermée.
Introduction des réactifs d'élongation Les conduits d'alimentation en réactifs 33 sont maintenant paramétrés de telle sorte que les réactifs comportant des catalyseurs enzymatiques et des nucléotides A soient introduits dans la chambre d'élongation par l'intermédiaire de la vanne d'entrée des réactifs 30 en position ouverte. Dans les n nano-puits 22 que comporte la carte matrice 21 , viennent alors s'ajouter aux fragments en cours d'élongation les réactifs nécessaires à l'élongation de ces dits fragments. Durant le remplissage des nano-puits 22 la vanne de sortie 31 des réactifs est maintenue ouverte. La vanne de sortie des conduits d'évacuation 26 peut être ouverte en fin de remplissage pour s'assurer que les réactifs pénètrent jusqu'au fond des nano-puits 22. Une fois le remplissage terminé, les vannes d'entrée 30 des réactifs, de sortie 31 des réactifs et de sortie des conduits d'évacuation 26 se referment. Le système accolé au fond 29 de la chambre d'élongation permet ensuite de maintenir les nano-puits 22 à une température optimisée pour cette étape d'addition. Dans les nano-puits qui n'ont pas été déprotégés par le puise lumineux, l'étape d'addition n'a pas lieu. Les différentes vannes d'entrée 30 des réactifs, de sortie 31 des réactifs et de sortie 35 des conduits d'évacuation 26 restent en position fermée. A la fin de cette étape, les moyens d'alimentation en réactifs 13 reprennent leur paramétrage initial et les différentes vannes d'entrée 30 des réactifs, de sortie 31 des réactifs et de sortie 35 des conduits d'évacuation 26 passent ou restent en position fermée.
Lavage des réactifs en excès Les conduits d'alimentation en réactif 33 sont maintenant paramétrés de façon à permettre l'introduction d'une solution de lavage dans la chambre d'élongation, par l'intermédiaire de la vanne d'entrée 30 des réactifs ouverte. Cette solution de lavage pénètre dans la totalité des nano-puits 22 et permet l'élimination des réactifs précédents, par l'intermédiaire des trous 27 et des conduits d'évacuation 26 débouchant sur la vanne de sortie 35 des conduits d'évacuation alors en position ouverte. La vanne de sortie 31 des réactifs reste en position fermée. Durant cette étape de lavage la température des nano-puits 22 est maintenue à une valeur optimale par l'intermédiaire d'un système de contrôle de la température accolé au fond 29 de la chambre d'élongation. A la fin de cette étape, les conduits d'alimentation en réactif 33 reprennent leur paramétrage initial et les différentes vannes d'entrée 30 des réactifs, de sortie 31 des réactifs et de sortie 35 des conduits d'évacuation passent ou restent en position fermée.
Introduction des billes magnétiques Les conduits d'alimentation en réactifs 33 sont maintenant paramétrés de façon à permettre l'introduction dans la chambre d'élongation 1 , par l'intermédiaire de la vanne d'entrée 30 des réactifs ouverte, d'une suspension de billes magnétiques constituant le second support solide 28. Cette suspension de billes magnétiques se répartit et pénètre dans tous les nano-puits 22 et interagit avec les fragments d'acides nucléiques qui viennent de subir une étape d'addition. Durant le remplissage des nano-puits 22 la vanne de sortie 31 des réactifs est maintenue ouverte. Une fois le remplissage terminé, les vannes d'entrée 30 des réactifs et de sortie 31 des réactifs se referment. Le système accolé au fond 29 de la chambre d'élongation permet ensuite de maintenir les nano-puits 22 à une température optimisée pour permettre le décrochage des fragments d'acides nucléiques en cours d'élongation du premier support, constitué par les parois latérales 25 et le fond 32 des nano-puits 22, et leur accrochage au second support 28 constitué par les billes magnétiques. Les différentes vannes d'entrée 30 des réactifs, de sortie 31 des réactifs et de sortie 35 des conduits d'évacuation 26 restent en position fermée. A la fin de cette étape les moyens d'alimentation en réactif 33 reprennent leur paramétrage initial et les différentes vannes d'entrée 30 des réactifs, de sortie 31 des réactifs et de sortie 35 des conduits d'évacuation 26 passent ou restent en position fermée.
Lavage des fragments non élongués Les conduits d'alimentation en réactifs 33 sont maintenant paramétrés de façon à permettre l'introduction d'une solution de lavage dans la chambre d'élongation, par l'intermédiaire de la vanne d'entrée 30 des réactifs ouverte. Cette solution de lavage pénètre dans la totalité des nano-puits 22 et permet l'élimination des fragments, non fixés sur le second support 28, par l'intermédiaire des trous d'évacuation 27 et des conduits d'évacuation 26 débouchant sur la vanne de sortie 35 alors en position ouverte. La vanne de sortie 31 des réactifs reste en position fermée. Durant cette étape de lavage la température des nano-puits 22 est maintenue à une valeur optimale par l'intermédiaire du système de contrôle de la température. A la fin de cette étape, les conduits d'alimentation en réactif 33 reprennent leur paramétrage initial et les différentes vannes d'entrée 30 des réactifs, de sortie 31 des réactifs et de sortie 35 des conduits d'évacuation 26 passent ou restent en position fermée.
Liaison au premier support Le système de contrôle de la température accolé au fond 29 de la chambre d'élongation est activé de façon à générer une température optimale au sein des nano-puits 22 de façon à permettre l'accrochage des fragments d'acides nucléiques en cours d'élongation aux parois latérales 25 et au fond 32 des nano-puits 22. Durant cette étape, les différentes vannes d'entrée 30 des réactifs, de sortie 31 des réactifs et de sortie 35 des conduits d'évacuation 26 passent ou restent en position fermée. L'ensemble de ces étapes est contrôlé par ordinateur. L'utilisateur n'intervient pas dans la synthèse entre le moment où il la demande et la fin de la synthèse.
Une fois la synthèse de l'acide nucléique terminée, l'utilisateur récupère la carte matrice dont chacun des nano-puits contient des fragments d'acides nucléiques de séquences différentes.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Installation pour la mise en œuvre d'un procédé de synthèse enzymatique d'acides nucléiques, en particulier d'acides nucléiques de grande longueur, comprenant :
i) un dispositif de synthèse comportant :
- au moins une chambre d'élongation (1 ), chaque chambre d'élongation étant formée d'un réacteur unique renfermant au moins un support fixe d'accrochage de fragments d'acides nucléiques en cours d'élongation comprenant une multiplicité de sites réactionnels d'élongation,
- des conduits d'alimentation (33) en nucléotides, enzyme(s), éventuelles amorces, solution(s) de lavage et/ou solution(s) tampon(s), lesdits conduits d'alimentation (33) étant connectés à la chambre d'élongation,
- des conduits d'évacuation (26) des excédents ou déchets de ladite chambre d'élongation (1 ),
- des moyens de modification des conditions de fonctionnement du dispositif de synthèse, tels que des moyens de régulation de la température, ladite chambre d'élongation (1 ) étant configurée pour permettre de réaliser au moins un cycle d'élongation desdits fragments d'acide nucléiques comprenant plusieurs étapes dont au moins une étape d'addition enzymatique des nucléotides se déroulant en milieu aqueux,
le dispositif de synthèse comprenant des moyens physiques de sélection différenciée des sites réactionnels à activer ou à désactiver avant un cycle d'élongation, ii) un système informatique central (9) incluant au moins une interface de contrôle et un logiciel pilote, apte à piloter les conditions de fonctionnement dudit dispositif de synthèse et le déroulement de la synthèse.
2. Installation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le dispositif de synthèse comprend :
- au moins une chambre d'élongation (1 ), chaque chambre d'élongation étant formée d'un réacteur unique renfermant deux types de supports d'accrochage des fragments d'acides nucléiques en cours d'élongation : d'une part un support fixe comprenant une multiplicité de sites réactionnels d'élongation et d'autre part des supports mobiles (28) aptes à interagir avec les fragments d'acides nucléiques en cours d'élongation au niveau desdits sites réactionnels, - et des moyens d'immobilisation de la totalité ou de certains supports mobiles présélectionnés.
3. Installation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que lesdits moyens physiques de sélection comprennent un système optique (34) incluant des rayonnements électromagnétiques et en ce que la chambre d'élongation est équipée de parois (24) transparentes auxdits rayonnements, le système optique (34) dirigeant lesdits rayonnements sur des sites réactionnels prédéterminés, lesdits rayonnements étant choisis de préférence dans le domaine du visible ou de l'infrarouge et étant aptes à modifier l'accrochage, ou provoquer le décrochage, du fragment d'acide nucléique sur le support correspondant, par modification de la structure du nucléotide terminal dudit fragment d'acide nucléique.
4. Installation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit support fixe comprend au moins une carte matrice (21 ) interchangeable, logée, en position de fonctionnement, dans la chambre d'élongation, la surface de ladite carte matrice comportant une multiplicité de sites réactionnels sous la forme de zones fonctionnalisées (patch) et/ou d'alvéoles et/ou de nano-puits.
5. Installation selon la revendication 4, caractérisée en ce que ladite carte matrice (21 ) comprend un ou plusieurs réseau(x) d'alvéoles et/ou de nano-puits (22), chaque alvéole ou nano-puits constituant un site spécifique réactionnel d'élongation.
6. Installation selon la revendication 4 ou 5, caractérisée en ce que chaque alvéole ou nano-puits (22) présente des parois dont la surface est fonctionnalisée et apte à fixer une première extrémité de fragments d'acide nucléique, de préférence l'extrémité 5' desdits fragments d'acides nucléiques.
7. Installation selon la revendication 5 ou 6, caractérisée en ce que chaque alvéole ou nano-puits constitue un réceptacle pour lesdits supports mobiles, la surface extérieure des dits supports mobiles étant fonctionnalisée et apte à fixer une seconde extrémité des fragments d'acides nucléiques, de préférence l'extrémité (3') desdits fragments d'acides nucléiques.
8. Installation selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisée en ce que lesdits supports mobiles (28) sont sous la forme de billes, de préférence de billes comprenant un matériau ferromagnétique, lesdits moyens d'immobilisation ou de répulsion de la totalité ou de certains supports mobiles présélectionnés comprenant un générateur de champ magnétique.
9. Installation selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, caractérisée en ce que les moyens de modification des conditions de fonctionnement sont des moyens de modifications des conditions opératoires au sein de de la chambre d'élongation, permettant l'accrochage ou le décrochage des fragments d'acides nucléiques du support fixe à des conditions opératoires différentes de celles des supports mobiles.
10. Installation selon la revendication 9, caractérisée en ce que lesdits moyens de modifications des conditions opératoires sont des moyens d'adaptation de la température de la chambre d'élongation aux conditions thermiques d'accrochage ou de décrochage des fragments d'acides nucléiques de l'un ou l'autre des différents supports.
1 1 . Installation selon l'une quelconque des revendications 4 à 10, caractérisée en ce que la chambre d'élongation comporte un ou plusieurs conduits d'introduction des réactifs, ou solutions de lavage, ou solutions tampons dans le réseau d'alvéoles ou de nano-puits de la carte matrice, le ou les conduit(s) d'introduction étant disposé(s) entre la face, dénommée face supérieure, de ladite carte présentant les ouvertures des alvéoles ou nano-puits et un couvercle transparent aux rayonnements électromagnétiques.
12. Installation selon la revendication 1 1 , caractérisée en ce que les parois de fond des alvéoles ou nano-puits de la carte matrice comportent des orifices (27) communiquant avec un ou plusieurs conduits d'évacuation (26) de liquides disposé(s) au-dessous de la face, dénommée face inférieure, de ladite carte, les sections de passage desdits orifices présentant un diamètre inférieur à celui desdits supports mobiles, tels que des billes.
13. Installation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comporte également un dispositif de contrôle (du déroulement) de l'élongation.
14. Installation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un ordinateur (13) incluant le logiciel pilote qui commande le fonctionnement du dispositif de synthèse.
15. Installation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend plusieurs ordinateurs (13) reliés par liaison filaire ou par liaison sans fil à un serveur, et sont aptes à commander le fonctionnement du dispositif de synthèse.
16. Installation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un ordinateur (13) apte à permettre la manipulation virtuelle de la ou des séquences d'acide nucléiques à synthétiser.
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US20020012930A1 (en) * 1999-09-16 2002-01-31 Rothberg Jonathan M. Method of sequencing a nucleic acid
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