FR2906613A1

FR2906613A1 - Dispositif et procede pour deceler de petites concentrations de substance.

Info

Publication number: FR2906613A1
Application number: FR0706698A
Authority: FR
Inventors: Walter Gumbrecht; Peter Paulicka
Original assignee: Siemens AG
Current assignee: Siemens AG
Priority date: 2006-09-29
Filing date: 2007-09-25
Publication date: 2008-04-04
Anticipated expiration: 2027-09-25
Also published as: US8062502B2; US20080087555A1; DE102006046776B4; GB0719030D0; DE102006046776A1; FR2906613B1; GB2442353B; GB2442353A

Abstract

Dispositif de détection qui comprend :a) un espace (10, 10') de détection ayant des moyens de détection d'un produit détectable ;b) des moyens d'évacuation de l'espace de détection ; etc) une commande conçue pour relever un premier signal de détection, pour actionner les moyens d'évacuation de l'espace de détection et, après l'évacuation de l'espace de détection, pour relever un deuxième signal de détection.

Description

1 L'invention concerne un procédé de détection d'un produit détectable

qui, pour augmenter la sensibilité du procédé, subit un enrichissement avant la mesure.

L'invention concerne, en outre, un dispositif pour effectuer ce procédé. Un but de l'analyse chimique et biochimique consiste à développer des procédés de détection ayant une plus grande sensibilité. Notamment dans l'analyse biochimique, on a développé des procédés d'analyse sensibles et très spécifiques, fondés sur des interactions moléculaires, par exemple d'acides nucléiques ou de protéines. On utilise des procédés de ce genre, par exemple, dans l'analyse de processus dans le diagnostic moléculaire, dans la recherche en biologie moléculaire, dans le diagnostic clinique, dans l'analyse des aliments et dans l'analyse de l'environnement. Le fascicule de brevet DE 100 583 94 Cl décrit un capteur électrochimique qui peut être utilisé pour l'analyse d'acides nucléiques. Ce capteur a des électrodes sur lesquelles est déposé un dispositif de micro-matrice d'oligonucléotides de capture, qui peuvent fixer spécifiquement les acides nucléiques à déceler. Ces acides nucléiques à déceler peuvent être repérés ou marqués par un enzyme qui transforme un substrat en un produit pouvant être décelé par voie électrochimique. Lors de la formation du produit, on peut mesurer une augmentation du courant aux électrodes. Pour augmenter la sensibilité de ce procédé de mesure, le DE 100 583 94 Cl enseigne l'utilisation d'espaces de détection de petit volume pour renforcer l'augmentation locale de concentration du produit détectable par voie électrochimique et augmenter ainsi la sensibilité.

2906613 2 La sensibilité de procédés de mesure de ce genre est limitée, d'une part, par des bruits de signal et, d'autre part, par ce que l'on appelle la dérive de ligne de base (base Line drift), qui entraîne au cours du temps 5 un déplacement de la ligne de base, de sorte, que pour des concentrations d'analyte très petites, on ne peut pas décider d'une augmentation du signal par rapport à la ligne de base. Ce problème de la dérive de la ligne de base se pose non seulement dans des procédés de mesure 10 électrochimiques, mais aussi dans d'autres procédés, par exemple optiques, magnétiques et autres. La dérive de la ligne de base est due à de nombreuses causes, par exemple à des fluctuations de température, à des effets d'interface, à l'interface du capteur avec le volume de 15 l'échantillon, notamment lorsque l'on utilise des électrodes de mesure, en raison des effets de polarisation sur l'électrode de mesure et la solution d'échantillon et à d'autres effets. La présente invention vise un procédé de 20 détection, qui permet d'avoir une mesure indépendante de la dérive de ligne de base et qui, en outre, a une sensibilité plus grande que les procédés connus. L'invention a donc pour objet un procédé de détection d'un produit détectable, caractérisé par les 25 stades suivants, dans lesquels : a) on effectue un enrichissement en produit détectable par une réaction d'enrichissement dans un espace de détection pendant un premier laps de temps ; b) on relève un premier signal de détection du 30 produit détectable pendant le premier laps de temps ; c) on met fin à l'enrichissement pendant le premier laps de temps en évacuant le produit détectable de l'espace de détection ; et 2906613 3 d) après l'évacuation, on relève un deuxième signal de détection et un dispositif pour la mise en oeuvre du procédé, caractérisé en ce qu'il comprend a) un espace de détection ayant des moyens de 5 détection d'un produit détectable ; b) des moyens d'évacuation de l'espace de détection par du fluide ; et c) une commande qui est conçue pour relever un premier signal de détection, pour actionner les moyens 10 d'évacuation de l'espace de détection et, après l'évacuation de l'espace de détection, pour relever un deuxième signal de détection. L'invention repose sur l'idée que pour résoudre des problèmes provoqués par la dérive de la ligne de 15 base, il est opportun de mesurer dans un espace de détection, non pas une augmentation du signal, mais de laisser s'écouler un certain temps pour enrichir en un produit détectable (phase d'enrichissement), puis de mesurer un premier signal de détection et de ne mesurer 20 le signal de ligne de base qu'après avoir évacué l'espace de détection et enlevé le produit enrichi en tant que deuxième signal de détection. Déceler le produit enrichi ne s'obtient pas ainsi à partir d'une augmentation du signal par rapport à une ligne de base, mais à partir 25 d'une différence entre le premier et le deuxième signal de détection. Le procédé suivant l'invention de détection d'un produit détectable a les stades suivants : a) on effectue un enrichissement en produit 30 détectable par une réaction d'enrichissement dans un espace de détection pendant un premier laps de temps ; b) on relève un premier signal de détection du produit détectable pendant le premier laps de temps ; 2906613 4 c) on met fin à l'enrichissement pendant le premier laps de temps en évacuant le produit détectable de l'espace de détection ; et d) après l'évacuation, on relève un deuxième 5 signal de détection. La détection du deuxième signal de détection s'effectue, suivant un aspect préféré de l'invention, après expiration d'un deuxième laps de temps, qui commence avec l'évacuation de l'espace de détection, le 10 premier laps de temps étant plus long que le deuxième laps de temps. La réaction d'enrichissement est une réaction chimique dans laquelle on transforme un substrat ou un éduit en un produit détectable en ayant un enrichissement 15 en le produit détectable au cours du temps par la réaction d'enrichissement. De préférence, on détecte le premier signal de détection à la fin du premier laps de temps. De préférence, le premier laps de temps est au 20 moins 3 fois plus long que le deuxième laps de temps, le mieux étant qu'il soit au moins 10 fois plus long et, encore mieux, qu'il soit au moins 20 fois plus long. L'enrichissement du produit peut s'effectuer d'autant plus longtemps et la mesure être d'autant plus sensible 25 que le premier laps de temps est plus long. Lorsque l'on décèle des concentrations extrêmement petites, on peut songer aussi à ce que le premier laps de temps soit 100 fois plus long que le deuxième laps de temps et même encore plus.

30 L'évacuation du produit fermé de l'espace de détection peut s'effectuer par une solution de lavage mais, opportunément, elle s'effectue avec la même solution de substrat que celle qui a été introduite avant le début du laps de temps d'enrichissement dans la 2906613 5 chambre de détection. On assure ainsi, lors de la mesure du premier et du deuxième signal de détection, un décalage de la ligne de fond aussi petit que possible puisque, à l'exception du produit formé, il y a dans 5 l'espace de détection la même solution et on a ainsi, lors de l'évacuation, sur le capteur les mêmes conditions chimiques. Lorsque le premier laps de temps (phase d'enrichissement) est suffisamment long avant le relevé du premier signal de détection, il importe peu que 10 pendant le deuxième laps de temps (après l'évacuation et avant le relevé du deuxième signal de détection), il se forme dans certaines circonstances, déjà à nouveau, du produit détectable nouveau dans l'espace de détection puisque le deuxième laps de temps est relativement court 15 et qu'il ne peut guère ainsi se former du produit détectable nouveau. De préférence, le deuxième laps de temps est inférieur ou égal à 5 secondes et mieux encore n'est pas plus long que 3 secondes et, ce qui est le mieux, est qu'il ne soit pas plus long que 1 seconde.

20 D'une manière correspondante, le premier laps de temps peut être compris, par exemple, entre 10 secondes et 100 secondes ou 1000 secondes et plus. La longueur du premier laps de temps est limitée surtout par la nécessité d'avoir une durée de mesure globale petite.

25 Suivant un aspect préféré de la présente invention, pendant une phase de mesure, qui contient le passage du premier au deuxième laps de temps, on mesure en continu des signaux de détection, le premier et le deuxième signal de détection étant choisis parmi les 30 signaux de détection relevés pendant la phase de mesure. De préférence, on choisit le premier et le deuxième signal de détection de façon à obtenir une différence maximum d'intensité du signal entre le premier et le deuxième signal de détection.

2906613 6 Suivant un aspect préféré de la présente invention, la réaction d'enrichissement est une réaction catalysée par voie enzymatique. On utilise souvent dans l'analyse biochimique des procédés à couplage 5 enzymatique. L'enrichissement en le produit détectable s'effectue, de préférence, par un enzyme qui est couplé à l'analyte à déceler. La réaction d'enrichissement est, de préférence, une réaction catalysée par voie enzymatique. L'analyte à déceler est, de préférence, une 10 matière biologique, par exemple une cellule, un constituant d'une cellule, un virus, une bactérie, une protéine, un peptide ou un acide nucléique. L'enrichissement en le produit à déceler s'effectue, de préférence, par un enzyme qui est couplé à un analyte à 15 déceler ou qui est couplé à l'analyte par une réaction de détection, par exemple par une liaison covalente, par la formation d'un complexe, par une interaction acide nucléique-acide nucléique, par une interaction protéine-protéine ou par une interaction protéine-acide nucléique.

20 On peut songer aussi, en variante, à ce qu'un éduit du produit détectable soit couplé à l'analyte et donne, par la réaction d'enrichissement, le produit détectable. Il est préféré que l'analyte à déceler soit fixé à une phase solide dans l'espace de détection. De préférence, 25 l'analyte à déceler est fixé à une phase solide dans l'espace de détection par une molécule de capture fixant spécifiquement l'analyte. Cela peut être obtenu, par exemple, en prévoyant, pour déceler des analytes dans l'espace de détection, une micro-matrice de molécules de 30 capture qui peuvent fixer spécifiquement des analytes à déceler. Ce peut être, par exemple, une micro-matrice d'oligonucléotides pour déceler des analytes d'acide nucléique ou une matrice d'anticorps pour déceler des analytes de protéine.

2906613 7 Suivant un autre aspect de la présente invention, on détecte, de préférence, le produit par voie électrochimique. Mais, on peut songer aussi à détecter le produit par un autre principe de détection, par exemple 5 de façon optique. De préférence, l'espace de détection est fermé pendant le premier laps de temps (phase d'enrichissement), de sorte qu'aucun échange de fluide ne peut avoir lieu vers l'extérieur. L'espace de détection 10 peut être, par exemple, constitué sous la forme d'une cuvette, une couche d'étanchéité étant mise de manière étanche sur le bord de la cuvette pour la fermeture en y étant, par exemple, pressée. L'évacuation du produit détectable formé s'effectue, de préférence, en mettant la 15 chambre de détection en communication avec un réservoir de fluide et/ou en actionnant une pompe, la pompe pouvant pomper un fluide dans l'espace de détection pour l'évacuation. Il s'est avéré que la mesure sur le capteur 20 électrochimique est influencée suivant que l'espace de détection est à l'état ouvert ou à l'état fermé. C'est pourquoi, suivant un aspect préféré de la présente invention, on ferme l'espace de détection pendant une phase d'enrichissement (premier laps de temps), de 25 manière à ce qu'il y ait un enrichissement en le produit détectable dans l'espace de détection. Pour évacuer le produit détectable, on ouvre l'espace de détection ou on ménage une communication de fluide avec un réservoir de fluide, de façon à pouvoir évacuer 1' l'espace de 30 détection, puis on referme l'espace de détection et on effectue la mesure ou le relevé du deuxième signal de détection à nouveau, alors que l'espace de détection est fermé, à la fin du deuxième laps de temps.

2906613 8 Suivant un aspect préféré de la présente invention, pour quantifier le produit on forme une différence ou un quotient entre le premier et le deuxième signal. La quantification peut s'effectuer, en outre, au 5 moyen de procédés connus, par exemple, en établissant une courbe d'étalonnage au moyen d'un étalon de concentration connue. Suivant un autre aspect du procédé suivant l'invention, pendant le premier laps de temps on relève 10 plusieurs premiers signaux de détection et on extrapole une intensité de signal jusqu'à l'instant du relevé du deuxième signal. On peut encore augmenter la sensibilité du procédé en maintenant à une petite valeur le volume de l'espace de détection et/ou en maintenant petit le 15 rapport du volume de l'espace de détection à une surface active sur laquelle s'effectue la réaction d'enrichissement en le produit. Il est donc préféré que le volume total de l'espace de détection, notamment pendant la phase d'enrichissement, soit inférieur ou égal 20 à 1 pi, de préférence inférieur ou égal à 10 nl et mieux encore inférieur ou égal à 1 nl. Il est, en outre, préféré que le quotient du volume de l'espace de détection à la surface active sur laquelle a lieu la réaction d'enrichissement, soit inférieur ou égal à 1 mm, 25 de préférence inférieur ou égal à 0,1 mm et mieux encore inférieur ou égal à 0,01 mm. Le procédé suivant l'invention est ainsi prévu notamment en vue d'être utilisé dans des espaces de détection petits. On effectue, de préférence, le procédé dans des dispositifs 30 microfluidiques, par exemple dans des cartouches microfluidiques, comme cela est décrit dans le DE 1011457 Al.

2906613 9 L'invention concerne, en outre, un dispositif pour la mise en œuvre du procédé suivant l'invention, décrit ci-dessus, ayant les caractéristiques suivantes : a) un espace de détection ayant des moyens de 5 détection d'un produit détectable ; b) des moyens d'évacuation de l'espace de détection par du fluide ; et c) une commande qui est conçue pour relever un premier signal de détection, pour actionner des moyens 10 d'évacuation de l'espace de détection et, après l'évacuation de l'espace de détection, pour relever un deuxième signal de détection. De préférence, l'espace de détection a un dispositif de micro-réseau constitué de molécules de 15 capture qui peuvent fixer une matière biologique. De préférence, l'espace de détection peut être fermé sélectivement en pressant, par exemple, une couche de fermeture sur une ouverture de l'espace de détection. De préférence, l'espace de détection peut communiquer 20 sélectivement avec un réservoir de fluide. De préférence, les moyens de détection comprennent un capteur électrochimique. Celui-ci peut être sous la forme d'un dispositif d'électrodes, comme cela est décrit, par exemple, dans les documents DE 100 25 583 97 Al, DE 101 263 41A1 ou DE 100 583 94 Cl. La commande peut comprendre une commande par microprocesseur et peut être, par exemple, assistée par ordinateur. Par la commande, on peut fixer la longueur du premier laps de temps et du deuxième laps de temps ainsi 30 que les instants de mesure de l'ensemble des signaux de détection. Le dispositif suivant l'invention peut avoir une pluralité d'espaces de détection. Ces espaces de détection peuvent être séparés les uns des autres. Des 2906613 10 espace de détection peuvent être déposés sous forme de dispositifs planaires sur un substrat en silicium, les espaces de réaction étant séparés les uns des autres, de préférence, par une couche de polymère déposée sur du 5 silicium. D'autres avantages, caractéristiques et propriétés de la présente invention apparaîtront nettement à l'aide des exemples de réalisation et des dessins annexés, dans lesquels : 10 la figure 1 est une représentation schématique d'une réaction d'enrichissement en un produit détectable qui peut être utilisée dans un procédé suivant l'invention; la figure 2 est une représentation schématique 15 d'un dispositif d'espace de détection qui peut être utilisé dans le procédé suivant l'invention ; la figure 3 est une courbe de l'intensité du signal en fonction du temps, qui illustre l'effet du procédé suivant l'invention ; 20 la figure 4 est une courbe de l'intensité du signal en fonction du temps, qui illustre un autre mode de réalisation du procédé suivant l'invention ; la figure 5 est une courbe de l'intensité du signal en fonction du temps, qui illustre encore un autre 25 mode de réalisation du procédé suivant l'invention. La figure 1 représente schématiquement une réaction d'enrichissement et une réaction de détection qui peuvent être utilisées dans le procédé suivant l'invention. Sur un support 1 qui peut être, par exemple, 30 une puce de silicium, sont déposées des électrodes 2, 3 de détection ainsi qu'une couche 5 support sur laquelle des oligonucléotides d'ADN 100 sont immobilisés. On peut aussi songer à immobiliser les oligonucléotides directement sur les électrodes. Les oligonucléotides 100 2906613 11 servent de molécules de capture d'un analyte 200 à déceler, qui est une molécule d'acide nucléique, qui peut être fixé spécifiquement par la molécule 100 de capture. La molécule 200 d'acide nucléique est marquée par un 5 enzyme 300. L'enzyme 300 transforme un substrat 400 en un produit 500 détectable. Comme enzyme 300, on peut utiliser une phosphatase alcaline, qui peut hydrolyser comme substrat 400 la substance phosphate de paminophényle en le produit 400 détectable p-aminophénol.

10 Le p-aminophénol s'oxyde d'une façon connue sur l'électrode 2 en quinonimine et sur la contre-électrode 3, la quinonimine formée est re-réduite en p-aminophénol. Ce processus connu sous le nom de redoxcycling provoque, lors de l'application d'une tension, une augmentation 15 mesurable du courant sur les électrodes 2, 3. Au début de l'opération de mesure, la chambre de détection est inondée d'une solution de substrat et ensuite est fermée. Pendant un premier laps de temps, c'est-à-dire pendant la phase d'enrichissement, l'enzyme 20 transforme continuellement le substrat, de sorte qu'il y a un enrichissement en produit détectable. L'espace de détection est fermé pendant cette phase d'enrichissement. On mesure alors un premier signal de détection. On ouvre ensuite l'espace de détection et on l'inonde de solution 25 fraîche de substrat. Le produit détectable formé est ainsi évacué et il se produit une diminution du flux de courant aux électrodes 2, 3. On mesure alors une deuxième fois. On obtient ainsi un deuxième signal de détection, le premier signal de détection étant alors comparé non à 30 la ligne de base d'origine, mais au deuxième signal de détection. La figure représente un dispositif d'espaces 10, 10' de détection qui sont formés sur une puce 1 de silicium et qui sont séparés par des parois 11, 11'. Les 2906613 12 espaces 10', 10' de détection peuvent être produits en déposant une couche de polymère et en ménageant des cavités, les parois 11, 11' étant constituées de la matière polymère qui n'a pas été éliminée.

5 Les espaces 10, 10' de détection peuvent, à la figure 2, être fermés par une partie 8 de boîtier au moyen d'un poinçon 6 mécanique. La partie supérieure de boîtier peut être sous la forme d'une couche de fermeture en une matière élastique, par exemple en une silicone ou, 10 de préférence, en un matériau rigide, par exemple en polycarbonate, qui est monté (suspendu) élastiquement. Dans ce mode de réalisation, les espaces 10, 10' de détection sont emplis d'abord, alors que la partie 8 supérieure du boîtier est ouverte, d'une solution 7 de 15 substrat, l'espace 9 au-dessus des espaces 10, 10' de détection constituant un réservoir de la solution de substrat. Après avoir rempli les espaces 10, 10' de détection de la solution 7 de substrat on met, au moyen du poinçon 6, la partie 8 supérieure du boîtier, qui peut 20 être par exemple constituée d'une membrane en silicone ou, de préférence, en un matériau rigide, par exemple en polycarbonate qui est monté (suspendu) élastique, sur les parois 11, 11' qui sont, par exemple, en polyamide et on ferme ainsi les espaces 10, 10' de réaction. Il peut 25 maintenant se produire pendant un premier laps de temps la phase d'enrichissement dans laquelle le produit détectable se forme dans les espaces 10, 10' de détection qui s'enrichissent en ce produit. A la fin de la phase d'enrichissement, on relève le premier signal de 30 détection. On ouvre ensuite, en retirant le poinçon 6, les espaces 10, 10' de détection de la solution 7 fraîche de substrat s'écoulant et, en raison de tourbillonnements, le produit détectable formé étant évacué des espaces 10, 10' de détection. L'évacuation 2906613 13 peut être favorisée ou réalisée également en actionnant ou en mettant en circuit une pompe qui envoie de la solution fraîche de substrat. On relève alors un deuxième signal de détection. A partir de la différence entre le 5 premier signal de détection et le deuxième signal de détection, on peut tirer des conclusions sur la présence de produit détectable formé. Le relevé des signaux de détection et l'actionnement du poinçon sont réalisés par une commande 10 (non représentée). Cette commande fait partie du dispositif suivant l'invention. La figure 3 représente le mode d'action du procédé suivant l'invention au moyen de représentations graphiques des intensités des signaux en fonction du 15 temps. Le procédé s'effectue dans un dispositif comme décrit ci-dessus ayant un capteur électrochimique. La courbe 3 a) représente une mesure dans laquelle il ne se produit pas de dérive de ligne de base. A l'instant t0, on ferme l'espace de détection et on commence la phase 20 d'enrichissement. A l'instant tl, on relève un premier signal de détection et ensuite on évacue la chambre de détection. Comme le produit détectable est ainsi éloigné des électrodes, l'intensité du courant s'abaisse et à l'instant t2 on relève un deuxième signal de détection.

25 La différence A S d'intensité des signaux est donnée par A S = S (tl) - S (t2). La courbe 3 b) représente une situation à dérive linéaire de ligne de base, c'est-à-dire que la ligne de base s'abaisse continuellement pendant la mesure. A 30 l'instant t0, la chambre de détection est fermée et la phase d'enrichissement commence. En raison de la dérive de la ligne de base, l'augmentation du signal (c'est-à- dire l'élévation de la courbe) est plus petite dans le cas 3 b) que dans le cas 3 a). On re-mesure alors de la 2906613 14 façon décrite ci-dessus en tl, on évacue, puis on mesure en t2. Bien que l'augmentation du signal pendant la mesure soit dans l'ensemble plus faible, la différence A S (b) d'intensité du signal est exactement aussi grande 5 que la différence A S (a) d'intensité du signal. La courbe 3 c) représente une situation à dérive de ligne de base qui se prononce, c'est-à-dire que la ligne de base s'abaisse d'abord lentement, puis de plus en plus au cours du temps. Dans ce cas aussi, 10 l'augmentation des intensités de signal est plus petite que dans la courbe 3 a), mais la différence A S (c) des intensités de signal est exactement aussi grande que la différence A S (a) d'intensité du signal. On voit, sans autre difficulté, qu'en utilisant 15 le procédé on compense des erreurs dues à la dérive de la ligne de base. On obtient, en outre, par l'enrichissement en le produit détectable, un signal plus intense, de sorte que le procédé suivant l'invention est très sensible.

20 Dans le capteur électrochimique décrit dans l'exemple de réalisation ci-dessus, un bruit de fond de l'ordre de grandeur de 1 pA est habituel, c'est-à-dire que le signal peut varier dans cet ordre de grandeur. Lorsque l'on décèle une concentration d'analytes assez 25 grande, des augmentations de courant de quelques nA/s peuvent être mesurées. En même temps, la dérive de ligne de base est de l'ordre de grandeur de quelques 10 pA/s. Pour un signal de plusieurs nA/s cette dérive de ligne de base ne pose donc pas problème. Mais, lorsque l'on décèle 30 des quantités d'analytes très petites, il peut se faire que l'augmentation du signal soit de l'ordre de grandeur de seulement quelques 100 à quelques 100 pA/s et qu'ainsi l'augmentation du signal se trouve dans un ordre de grandeur analogue à la fluctuation de la ligne de base en 2906613 15 raison de sa dérive. Cela entraîne des erreurs de mesure qui ne peuvent pas être admises. Lors de l'utilisation du procédé suivant l'invention on compense toutefois des erreurs dues à la dérive de la ligne de base. Le procédé 5 suivant l'invention permet, en outre, d'augmenter la sensibilité par rapport à des procédés, dans lesquels l'augmentation du signal est mesurée de plusieurs ordres de grandeur. La figure 4 représente schématiquement l'effet 10 d'un autre mode de réalisation du procédé suivant l'invention, qui donne une sensibilité encore plus grande. Dans la mesure, on applique aux électrodes 2, 3 (figure 1) une tension, de manière à former un champ électrique. Lors de la mesure du premier signal de 15 détection, l'espace de détection est fermé, c'est-à-dire que le poinçon 6 représenté à la figure 2 est abaissé, de sorte que la membrane 6 en silicone ferme les espaces 10, 10' de réaction. L'abaissement du poinçon influe sur le champ électrique formé entre les électrodes et provoque 20 une légère diminution de l'intensité du signal. Lorsque l'espace de détection est ouvert, on mesure, indépendamment de la concentration en produit détectable, une intensité plus grande de signal puisque maintenant le poinçon et la membrane de silicone n'interfèrent plus 25 avec le champ électrique formé entre les électrodes 2, 3. Suivant un perfectionnement du procédé selon l'invention, il est préféré d'ouvrir d'abord l'espace de détection pour permettre une évacuation du produit formé, puis de rabaisser le poinçon 6 et de refermer ainsi l'espace de 30 détection et seulement alors de relever le deuxième signal de détection. Cela est représenté schématiquement dans la courbe de la figure 4, à l'instant tl le premier signal de détection est relevé, ensuite l'espace de détection est ouvert, de sorte que le produit détectable 2906613 16 est évacué de l'espace de détection. A l'instant t2, l'espace de détection est refermé et le deuxième signal de détection est relevé seulement à l'instant t3. La différence A S (t2-tl) d'intensité du signal est plus 5 petite que la différence A S (t3-tl) de l'intensité du signal. On rend ainsi possible une augmentation supplémentaire de la sensibilité. La figure 5 illustre schématiquement un autre mode de réalisation du procédé suivant l'invention.

10 Pendant la phase d'enrichissement, entre les instants t0 et 1', on relève plusieurs premiers signaux tl et tl' de détection. En partant de ceci, on extrapole une intensité de signal qui serait présente si la phase d'enrichissement était détectable jusqu'à l'instant t2, 15 auquel on relève le deuxième signal de détection, si l'évacuation n'avait pas eu lieu. Comme différence A S d'intensité du signal on utilise la différence entre l'intensité du signal extrapolée et l'intensité du signal effectivement mesurée en t2 après l'évacuation de la 20 chambre de détection. On peut ainsi obtenir une augmentation supplémentaire de la sensibilité. On soulignera que les exemples de réalisation représentés ont été donnés simplement à titre d'exemple et d'illustration. L'invention ne doit pas être limitée à 25 la détection électrochimique décrite, mais peut être utilisée pour tout procédé, dans lequel on peut effectuer un enrichissement en un produit détectable pendant une phase d'enrichissement, indépendamment du principe de détection. D'autres variations et modifications du 30 procédé suivant l'invention et dudispositif suivant l'invention sont possibles.

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé de détection d'un produit caractérisé par les stades suivants, dans effectue un enrichissement en produit détectable par une réaction d'enrichissement dans un espace de détection pendant un premier laps de temps ; b) on relève un premier signal de détection du produit détectable pendant le premier laps de temps ; 10 c) on met fin à l'enrichissement pendant le premier laps de temps en évacuant le produit détectable de l'espace de détection ; et d) après l'évacuation, on relève un deuxième signal de détection. 15

2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue le relevé du deuxième signal de détection après expiration d'un deuxième laps de temps, qui commence avec l'évacuation de l'espace de détection, le premier laps de temps étant plus long que 20 le deuxième laps de temps.

3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que le premier laps de temps est au moins trois fois plus long que le deuxième laps de temps.

4. Procédé suivant la revendication 2, 25 caractérisé en ce que le premier laps de temps est au moins dix fois plus long que le deuxième laps de temps.

5. Procédé suivant l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on relève le premier signal de détection à la fin du premier laps de temps. 30

6. Procédé suivant l'une des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que pendant une phase de mesure, qui contient le passage du premier au deuxième laps de temps, on mesure en continu des signaux de détection, le premier et le deuxième signal de détection étant choisis parmi 1. détectable, lesquels : a) on 2906613 18 les signaux de détection relevés pendant la phase de mesure.

7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que l'on choisit le premier et le 5 deuxième signal de détection de façon à obtenir une différence maximum d'intensité du signal entre le premier et le deuxième signal de détection.

8. Procédé suivant l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la réaction d'enrichissement est une réaction catalysée par voie enzymatique.

9. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que l'on effectue l'enrichissement par une enzyme qui est couplée à un analyte à déceler.

10. Procédé suivant la revendication 9, caractérisé en ce que l'analyte à déceler est fixé à une phase solide dans l'espace de détection.

11. Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce que l'analyte à déceler est fixé à une phase solide dans l'espace de détection par une molécule de capture fixant spécifiquement l'analyte.

12. Procédé suivant l'une des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que l'analyte à déceler est une matière biologique.

13. Procédé suivant l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on effectue l'enrichissement en fermant l'espace de détection.

14. Procédé suivant la revendication 13, caractérisé en ce que l'on effectue l'évacuation en ouvrant l'espace de détection et/ou en actionnant une pompe.

15. Procédé suivant l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on effectue 2906613 19 l'évacuation en mettant l'espace de détection en communication avec un réservoir de fluide.

16. Procédé suivant la revendication 14, caractérisé en ce que l'on effectue le relevé du deuxième 5 signal de détection après avoir refermé l'espace de détection.

17. Procédé suivant l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que, pour quantifier le produit, on forme une différence ou un quotient entre le 10 premier et le deuxième signal.

18. Procédé suivant l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que pendant le premier laps de temps on relève plusieurs premiers signaux de détection et on extrapole une intensité de signal jusqu'à 15 l'instant du relevé du deuxième signal.

19. Procédé suivant l'une des revendications 2 à 18, caractérisé en ce que le deuxième laps de temps est inférieur ou égal à 5 secondes.

20. Procédé suivant l'une des revendications 20 précédentes, caractérisé en ce que l'on effectue la détection dans un espace de détection qui a une surface active, sur laquelle la réaction d'enrichissement du produit s'effectue et le quotient du volume à la surface active est inférieur ou égal à 0,1 mm. 25

21. Dispositif de détection pour la mise en oeuvre du procédé suivant l'une des revendications 1 à 19, caractérisé en ce qu'il comprend a) un espace (10, 10') de détection ayant des moyens de détection d'un produit détectable ; 30 b) des moyens d'évacuation de l'espace de détection par du fluide ; et c) une commande qui est conçue pour relever un premier signal de détection, pour actionner les moyens d'évacuation de l'espace de détection et, après 2906613 20 l'évacuation de l'espace de détection, pour relever un deuxième signal de détection.

22. Dispositif suivant la revendication 21, caractérisé en ce que l'espace de détection a un 5 dispositif de micro-matrice, constitué de molécules de capture qui peuvent fixer une matière biologique.

23. Dispositif suivant la revendication 21 ou 22, caractérisé en ce que l'espace de détection peut être fermé sélectivement. 10

24. Dispositif suivant l'une des revendications 21 à 23, caractérisé en ce que l'espace de détection peut communiquer sélectivement avec un réservoir de fluide.

25. Dispositif suivant l'une des revendications 21 à 24, caractérisé en ce que l'espace de détection a 15 une surface active sur laquelle une réaction d'enrichissement du produit peut s'effectuer et le quotient du volume à la surface active est inférieur ou égal à 0,1 mm.

26. Dispositif suivant l'une des revendications 20 21 à 25, caractérisé en ce que l'espace de détection a un volume de moins de 10 ml.

27. Dispositif suivant l'une des revendications 21 à 26, caractérisé en ce que les moyens de détection comprennent un capteur électrochimique.