WO2001049413A1 - Appareil d'analyse a compartiment reactionnel a geometrie variable, procede de mixage et de guidage de liquides - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un appareil d'analyse (1) permettant la mise en oeuvre d'un procédé de mélange et de mise en contact, ainsi qu'un tel procédé de mélange et de mise en contact d'un échantillon biologique à tester (6) mais également d'un liquide de lavage sur cet appareil d'analyse (1). L'invention concerne également un procédé de guidage de liquides au sein d'un appareil d'analyse. Elle consiste en un appareil d'analyse (1) essentiellement constitué d'un contenant (2), d'une puce biologique (3) et d'un moyen, qui peut être déplacé et/ou déformé, dit moyen de mixage (4); le contenant (2), la puce (3) et le moyen (4) délimitent un compartiment réactionnel (5) de volume variable, pouvant recevoir un échantillon biologique à tester (6) ou un liquide de lavage, la puce (3) étant constituée d'un support solide qui comporte des ligands sur sa face active tournée vers le compartiment réactionnel (5), les ligands peuvent être spécifiques d'analytes présents dans l'échantillon biologique à tester (6). L'invention trouve une application préférentielle dans le domaine du diagnostic.
Description
Appareil d'analyse à compartiment réactionnel à géométrie variable, procédé de mixage et de guidage de liquides
DESCRIPTION
La présente invention concerne un appareil d'analyse permettant la mise en œuvre d'un procédé de mélange et de mise en contact ainsi qu'un tel procédé de mélange et de mise en contact d'un échantillon biologique à tester mais également d'un liquide de lavage sur cet appareil d'analyse. L'invention concerne également un procédé de guidage de liquides au sein d'un appareil d'analyse. L'appareil d'analyse comprend essentiellement une puce biologique et un contenant, ladite puce ayant une structure et étant fixée au contenant de telle manière que le procédé de mélange peut être effectué.
L 'état de la technique est constitué par le document WO-A-95/33846 qui décrit un consommable pour effectuer des analyses biologiques, dans lequel une puce à ADN est fixée sur un support plastique. Cette puce à ADN, de forme parallélépipédique, comprend deux faces opposées et circonscrit une cavité d'analyse présente au sein du consommable. Sur l'une de ses faces, qui est tournée vers la cavité, un grand nombre, généralement plusieurs milliers jusqu'à plusieurs centaines de milliers, d' oligonucléotides est positionné à des endroits prédéterminés. Cette face constitue la face active de la puce à ADN, et les oligonucléotides portés par la puce à ADN font office de sondes de capture pour des oligonucléotides complémentaires en solution dans l'échantillon testé. En fonction de la position des hybridations réalisées, il est possible de déterminer la nature des oligonucléotides présents dans l'échantillon biologique de départ.
L'inconvénient essentiel de ce type de consommable réside dans le volume relativement important de la cavité qui va permettre le transit et le contact de l'échantillon à tester, ainsi que le liquide de lavage, avec la puce biologique ou biopuce. Sachant que l'épaisseur de la couche d' oligonucléotides de capture, ou couche de ligands, portée par ladite puce biologique est de quelques dizaines de nanomètres alors
que l'épaisseur de la lame liquide constituée par l'échantillon à tester au sein de la cavité est de quelques millimètres, il existe un rapport de un (1) pour dix mille (10000) entre ces épaisseurs. Il n'est donc pas évident que l'hybridation des oligonucléotides en solution sur les oligonucléotides de capture s'effectue aisément, il convient donc d'augmenter le temps de mise en contact entre ledit échantillon et la puce et d'effectuer une agitation permanente de cet échantillon afin que tous les oligonucléotides libres aient une opportunité de s'hybrider sur la puce biologique, si tant est qu'un oligonucléotide de capture complémentaire existe. Ceci induit donc, d'une part, une durée de mélange relativement longue, ce qui est incompatible avec la rapidité des analyses biologiques attendue par l'emploi de puces biologiques, et d'autre part, une machinerie plus importante, volumineuse et coûteuse autour de la puce à ADN, afin de faciliter le mélange, qui ne doit pas être trop fort pour ne pas arracher les oligonucléotides de capture, ni trop faible ce qui peut réduire les possibilités d'hybridation. La demande de brevet EP-A-0.891.811 concerne un procédé et un appareil pour mélanger un film mince de liquide. La solution technique proposée par ce document consiste à éloigner la surface flexible de la surface de la chambre fluidique, ce qui augmente l'espace et concentre le liquide au point où l'épaisseur est la plus forte.
Néanmoins, ce principe est différent de ce que nous proposons puisque le déposant éloigne et non rapproche la surface flexible de la surface de la chambre fluidique. Cette caractéristique de rapprochement des surface dans le cas de notre invention est particulièrement intéressante car il s'agit d'une déformation :
• plus aisée à réaliser avec moins de risque de destruction,
• utilisable avec de plus petit volume de liquide, et • sans ouverture directe sur l'extérieur, ce qui est préjudiciable pour les traitements à effectuer sur des acides nucléiques.
Le document US-A-5.658.723 propose un appareil d'immuno-dosages utilisant des courants de convection forcés. Au sein d'un volume réactionnel, et selon un premier mode de réalisation (figure 31), un écran par amagnétique est présent et peut subir une déformation translationnelle ou pliage. L 'excitation de l 'écran est réalisée par des électro-aimants connectés à une source de puissance électrique.
Contrairement à notre invention, cet écran ne délimite pas le volume réactionnel , une déformation par simple pression mécanique n'est donc pas possible.
Pourtant un deuxième mode de réalisation (figure 32), plus pertinent, est présenté dans lequel l'écran est remplacé par un aimant permanent situé à l'extérieur du volume réactionnel, qui délimite ainsi indirectement le volume réactionnel, d'ailleurs le couvercle bouge en même temps que l'aimant. De plus, il est prévu que le couvercle et l'aimant ne fasse qu'un. Selon un troisième mode de réalisation (figure 33), un solénoïde avec un piston et une bobine est utilisé. Le piston déforme le couvercle. Un quatrième mode de réalisation (figure 34) utilise un doigt presseur porté par un disque. Enfin le cinquième mode, non représenté sur les figures, est constitué par un couvercle constitué par un matériau piézo-électrique ou contenant un tel matériau.
Une différence importante existe, elle réside dans le fait que selon ces modes de réalisation, l'espace réactionnel est entièrement rempli par le liquide, alors que notre quantité de liquide est très inférieur au volume total du compartiment réactionnelle. Une fois encore, notre invention est particulièrement adapté aux traitements des acides nucléiques.
Un brevet US-A-4.007.010 a pour objet un appareil pour tester des échantillons fluidiques. Celui-ci a une forme de sandwich avec une couche supérieure et une couche inférieure. Ces deux couches sont liées l'une à l'autre par un fin film de liquide. Il est ainsi possible en éloignant les deux couches d'avoir des cloques contenant du liquide.
Ce document exclut la présence d'air entre lesdites couches, comme indiqué dans sa description en colonne 4 lignes 64 à 67. De plus, l'appareil selon notre invention précise bien que le moyen de guidage déformé entraîne le rapprochement dudit moyen par rapport à la face active du support et permet la prise en compte et le déplacement d'un échantillon biologique à tester et/ou d'un réactif.
Enfin, le US-A-5.856.174 traite d'un dispositif de diagnostic à acides nucléiques intégrés, pouvant contenir une chambre réactionnelle, également chambre d'hybridation, où est mixé un liquide. Ce document n'est pas pertinent car la chambre n'est pas à volume variable, le mélange est simplement réalisé par un élément PZT, constitué de cuivre, zirconium et
titane, en contact avec la face externe de ladite chambre. Cet élément agit par vibrations soniques.
La présente invention évite ces inconvénients en proposant un appareil d'analyse permettant la mise en œuvre d'un procédé de mélange et de mise en contact ainsi qu'un tel procédé de mélange et de mise en contact d'un échantillon biologique à tester sur cet appareil d'analyse. Le volume de la chambre réactionnelle est faible et l'agitation de l'échantillon à tester, qui contient les analytes, est optimisé. Mais ce principe, développé pour le mélange et la mise en contact, peut aussi être mis en œuvre dans un procédé pour permettre le déplacement de liquides au sein d'un appareil d'analyse.
Un certain nombre de termes utilisés dans la présente invention est explicité ci- dessous.
Par « appareil d'analyse », on entend tout appareil permettant l'analyse d'un échantillon liquide ou gazeux ou de plusieurs échantillons liquides ou gazeux différents, dans lequel on cherche à identifier un ou plusieurs analytes selon tous les processus simples ou complexes d'analyse mettant en jeu un ou plusieurs réactifs différents selon la nature chimique, physique ou biologique du ou des analytes recherchés. Les principes techniques définis ci-après ne sont pas limités à un analyte particulier, la seule condition requise étant que l'analyte soit distribué dans l'échantillon à analyser en suspension ou en solution. En particulier, le processus d'analyse mis en œuvre peut être effectué, sous forme homogène ou hétérogène ou mixte. Un exemple d'application des techniques d'analyse concerne les immuno-essais, quelque soit leur format, par analyse directe ou par compétition. Un autre exemple d'application concerne la détection et/ou la quantification d'acides nucléiques comprenant l'ensemble des opérations nécessaires à cette détection et/ou cette quantification à partir d'un prélèvement quelconque contenant les acides nucléiques cibles. Parmi ces différentes opérations on peut citer la lyse, la fluidification, la concentration, les étapes d'amplification enzymatique des acides nucléiques, les étapes de détection incorporant une étape d'hybridation. La demande de brevet WO-A-97/02357 ou la demande de brevet déposée par la demanderesse sous le numéro FR99/00111, dont le contenu de la
description est incorporé dans la présente demande, explicite différentes étapes nécessaires dans le cas d'analyse d'acides nucléiques.
Par « puce biologique » ou « biopuce », on entend tout support solide sur lequel sont fixés des ligands. La fixation des ligands peut être réalisée de différentes manières et notamment par adsorption ou covalence, comme par exemple, la synthèse in situ par les techniques de photolithographie ou par un système piézo-électrique, par dépôt capillaire de ligands préformés. A titre d'illustration, des exemples de ces biopuces sont donnés dans les publications de G. Ramsay, Nature Biotechnology, 16, p40-44, 1998; F. Ginot, Human Mutation, 10, pl-10, 1997 ; J. Cheng et al, Molecular diagnosis, 1(3), pl83-200, 1996 ; T. Livache et al, Nucleic Acids Research, 22(15), ρ2915-2921, 1994 ; J. Cheng et al, Nature Biotechnology, 16, p541-546, 1998 ou dans les brevets US-A- 4,981,783 (Augenlicht), US-A-5,700,637 (Southern), US-A-5,445,934 (Fodor), US-A- 5,744,305 (Fodor), US-A-5,807,522 (Brown).
Par « ligand », on entend toute espèce biologique ou chimique susceptible de réagir spécifiquement avec un récepteur présent sur l'analyte. A titre d'exemple de ligand on peut citer un antigène, un fragment d'antigène, un peptide, un anticorps, un fragment d'anticorps, un haptène, un acide nucléique, un fragment d'acide nucléique, un polynucléotide, une hormone, une vitamine, un sucre, un polysaccharide, un chélateur, une drogue, un cofacteur, une molécule chimique capable de lier par covalence ou par adsorption. Avantageusement les ligands fixés sur la biopuce sont des acides nucléiques, et préférentiellement des oligonucléotides, et sont fixés sur la biopuce par couplage covalent. Dans un mode préférentiel de réalisation, au moins 400 séquences différentes d' oligonucléotides et préférentiellement au moins 1000 sont fixées par cm2 du support solide de la biopuce. L'ensemble de ligands constitue la couche bio-spécifique.
La puce biologique doit être adapté à la fixation des ligands. Des matériaux naturels ou de synthèse, modifiés ou non chimiquement peuvent être utilisés comme support solide, notamment des polymères, tels que polychlorures de vinyle, polyéthylènes, polystyrènes, polyacrylates, polyamides ou des copolymères à base de monomères du type styrène, esters d'acides carboxyliques insaturés, chlorure de vinylidène, diènes ou composés présentant des fonctions nitrile (comme l'acrylonitrile),
des matériaux inorganiques tels que la silice, le quartz, des verres, des céramiques ; des dérivés métalliques. En particulier, le support solide est réalisé en matériau non poreux. Dans un mode particulier de réalisation, le support solide est réalisé dans un matériau perméable à la lumière et notamment le verre ou dérivés. La biopuce possède une forme quelconque en trois dimensions dans lequel deux surfaces sensiblement planes sont présentes, une surface dite active sur laquelle sont fixés les ligands et une surface opposée. La surface active et la surface opposée sont reliées par une surface ou un ensemble de surfaces. Dans un mode de réalisation particulier la surface opposée est sensiblement parallèle à la surface active. Avantageusement, la biopuce est un parallélépipède à base rectangulaire ou carrée, de préférence carrée, dont la surface active est inférieure à 100 mm et avantageusement inférieure à 65 mm2 et préférentiellement inférieure à 30 mm2, et dont l'épaisseur est inférieure à 5 mm, et avantageusement inférieure à 1 mm.
Par « contenant », on entend une pièce ou un ensemble de pièces permettant de mettre en œuvre l'analyse et sur lequel est fixé la biopuce. Notamment, ce contenant doit permettre l'introduction d'un fluide et notamment du liquide dans lequel se trouve le ou les analytes à analyser. Dans un mode préférentiel de réalisation, le contenant est dans un matériau plastique tel que le polypropylène ou le polystyrène ou polycarbonate, et il est obtenu par moulage ou par extension. Par « compartiment réactionnel », il faut comprendre un espace délimité par le contenant et la biopuce. Le compartiment réactionnel favorise la réaction entre les ligands et le ou les analytes. La fixation de la biopuce sur le contenant assure l'étanchéité du compartiment réactionnel. Préférentiellement, la surface active est tournée à l'intérieur du contenant pour permettre le contact entre le milieu liquide dont on veut analyser le contenu et les ligands fixés sur cette surface active et la surface opposée est tournée vers l'extérieur du contenant. A titre d'exemple, ce contenant est un consommable à usage unique tel que décrit dans les demandes de brevet O-A- 95/33846, WO-A-97/02357 et WO-A-97/27324, ou dans les demandes de brevet de la demanderesse FR96/07381, FR99/03032, FR99/03033, FR99/03034 et FR99/03035. Le contenu de la description de ces demandes de brevet est considéré comme incorporé dans la description de la présente demande de brevet.
En fait selon l'invention, le compartiment réactionnel est délimité par le contenant et la puce biologique, ainsi que par un moyen permettant le mélange de la solution au niveau du compartiment réactionnel, afin de permettre le contact des analytes avec les ligands. Ce moyen permettant le mélange est également appelé mélangeur, il peut être de structure solide ou souple. Un « mélangeur solide » est un élément qui peut être déplacé par rapport au contenant afin de faire varier le volume du compartiment réactionnel. Un « mélangeur souple » est un élément qui peut être déformé par rapport au contenant afin de faire varier le volume du compartiment réactionnel. Il est également possible d'avoir un « mélangeur solide et souple », dans ce cas l'élément peut être déplacé et déformé par rapport au contenant afin de faire varier le volume du compartiment réactionnel.
A l'instar du support constituant la biopuce, le mélangeur solide est un parallélépipède à base rectangulaire ou carrée, de dimension supérieure ou égale à ladite biopuce, de préférence il est de forme carrée, dont la surface fonctionnelle est inférieure à 400 mm2 et avantageusement inférieure à 200 mm2 et préférentiellement inférieure à 100 mm , et dont l'épaisseur est inférieure à 5 mm, et avantageusement inférieure à 1 mm. Les matières constituant ce mélangeur solide peuvent être identiques à ceux constituants le support de la puce biologique, néanmoins ils peuvent également être constitués par des matériaux plastiques, tel que le polypropylène ou le polystyrène ou polycarbonate, des matériaux céramiques ou des matériaux métalliques, inox ou aluminium par exemple.
En ce qui concerne le mélangeur souple, celui-ci est également un parallélépipède à base rectangulaire ou carrée, de dimension supérieure ou égale à ladite biopuce, de préférence il est de forme carrée, dont la surface fonctionnelle est inférieure à 400 mm2 et avantageusement inférieure à 200 mm2 et préférentiellement inférieure à 100 mm , et dont l'épaisseur est inférieure à 5 mm, et avantageusement inférieure à 1 mm. Les matières constituant ce mélangeur souple sont constitués par des films plastiques, tel que le polypropylène ou le polystyrène ou polycarbonate, des films polymères, comme le silicone, ou des films métalliques, par exemple en aluminium.
A cet effet, la présente invention concerne un appareil d'analyse essentiellement constitué d'un contenant, d'une puce biologique et d'un moyen, qui peut être déplacé et/ou déformé, dit moyen de mixage, le déplacement et/ou la déformation entraîne(nt) le rapprochement du moyen de mixage par rapport à la puce biologique ; le contenant, la puce et le moyen délimitent un compartiment réactionnel de volume variable, pouvant recevoir un échantillon biologique à tester ou un liquide de lavage, la quantité de liquide introduite au sein de l'appareil au niveau du compartiment réactionnel est inférieure au volume total de ce compartiment réactionnel ; la puce étant constituée d'un support solide qui comporte des ligands sur sa face active tournée vers le compartiment réactionnel, les ligands peuvent être spécifiques d'analytes présents dans l'échantillon biologique à tester.
Selon une variante préférentielle de réalisation, le moyen de mixage est de structure solide ou de structure souple et peut être déplacé et/ou déformé, ce qui entraîne la variation du volume du compartiment réactionnel. Selon une variante préférentielle de réalisation, le moyen de mixage de structure solide peut être déplacé, et le moyen de mixage de structure souple peut être déformé.
Dans tous les cas de figures, le déplacement et/ou la déformation entraîne(nt) le rapprochement du moyen de mixage par rapport à la face active de la puce biologique. La présente invention concerne également un appareil d'analyse essentiellement constitué d'un contenant, d'un support de guidage et d'un moyen, qui peut être déformé, dit moyen de guidage ; le contenant, le support et le moyen délimitent un compartiment réactionnel de volume variable ; ledit support de guidage peut recevoir au moins un échantillon biologique à tester et au moins un réactif au niveau de sa face active tournée vers le compartiment réactionnel, le moyen de guidage déformé entraîne le rapprochement dudit moyen par rapport à la face active du support et permet la prise en compte et le déplacement d'un échantillon biologique à tester et/ou d'un réactif.
Sur tout ou partie de la face active de la puce biologique ou sur une partie de la surface active du support pour le guidage, la distance séparant le moyen de mixage ou de guidage de ladite face active de ladite puce ou dudit support de guidage, avant le rapprochement, est inférieur à 2 mm, préférentiellement inférieur à 1 mm, et la distance séparant le moyen de mixage ou de guidage de la face active de la puce ou du support
de guidage, après le rapprochement, est inférieur à 100 μm, préférentiellement inférieur à 10 μm, ou encore plus préférentiellement 1 μm.
Le rapprochement permet la convergence par capillarité de l'échantillon biologique à tester et/ou du liquide de lavage et/ou du réactif sur la surface active de la puce ou du support de guidage, sans contact entre le moyen de mixage ou de guidage et ladite surface active.
Quelque soit la variante de réalisation et préférentiellement, le rapport existant entre le volume du ou des échantillons biologiques à tester ou le liquide de lavage et/ou le ou les réactifs, introduit dans le compartiment réactionnel, et le volume dudit compartiment réactionnel est compris entre 1 pour 10000 et 1 pour 10, préférentiellement entre 1 pour 1000 et 1 pour 100.
De plus, dans le cas de l'appareil d'analyse permettant le mélange, les ligands sont constitués par des oligonucléotides et les analytes par des oligonucléotides et/ou des polynucléotides. La présente invention concerne également un procédé permettant le mixage d'un échantillon biologique dans un appareil d'analyse, tel que décrit précédemment, qui consiste à :
- introduire l'échantillon dans le compartiment réactionnel de l'appareil,
- déplacer et/ou déformer au moins une fois le moyen de mixage, - évacuer ledit échantillon dudit compartiment réactionnel,
- introduire un liquide de lavage dans le compartiment réactionnel,
- évacuer le liquide de lavage du compartiment réactionnel, et
- effectuer la lecture de la puce biologique, pour établir si des liaisons entre ligands et analytes sont intervenues. La présente invention concerne aussi un procédé permettant le mixage d'un liquide de lavage dans un appareil d'analyse, tel que décrit précédemment, qui consiste à :
- introduire l'échantillon dans le compartiment réactionnel de l'appareil,
- évacuer ledit échantillon dudit compartiment réactionnel, - introduire un liquide de lavage dans le compartiment réactionnel,
- déplacer et/ou déformer au moins une fois le moyen de mixage,
- évacuer le liquide de lavage du compartiment réactionnel, et
- effectuer la lecture de la puce biologique, pour établir si des liaisons entre ligands et analytes sont intervenues.
Il est encore possible de cumuler les deux dernières solutions pour obtenir un procédé permettant le mixage d'un échantillon biologique puis d'un liquide de lavage, dans un appareil d'analyse, tel que décrit précédemment, qui consiste à :
- introduire l'échantillon dans le compartiment réactionnel de l'appareil,
- déplacer et/ou déformer au moins une fois le moyen de mixage,
- évacuer ledit échantillon dudit compartiment réactionnel, - introduire un liquide de lavage dans le compartiment réactionnel,
- déplacer et/ou déformer au moins une fois le liquide de lavage,
- évacuer le liquide de lavage du compartiment réactionnel, et
- effectuer la lecture de la puce biologique, pour établir si des liaisons entre ligands et analytes sont intervenues. La présente invention concerne enfin un procédé permettant le guidage d'un échantillon biologique à tester et/ou d'un réactif dans un appareil d'analyse, tel que décrit plus haut, qui consiste à :
- introduire le ou les échantillons et/ou le ou les réactifs dans le compartiment réactionnel de l'appareil, - déformer le moyen de guidage par l'intermédiaire d'un index jusqu'à prise en compte du ou des échantillons biologiques à tester et/ou du ou des réactifs, et
- déplacer l'index afin de déplacer ledit ou lesdits échantillons à tester et/ou ledit ou lesdits réactifs jusqu'à une autre position souhaitée.
Les figures ci-jointes sont données à titre d'exemple explicatif de deux modes de réalisation et n'ont aucun caractère limitatif. Elles permettront de mieux comprendre l'invention.
La figure 1 représente une vue en perspective d'un appareil d'analyse selon un premier mode de réalisation de l'invention. La figure 2 représente une vue en coupe selon A-A de la figure 1, l'appareil d'analyse ne contenant aucun liquide.
La figure 3 représente une vue identique à la figure 2, lorsqu'un échantillon biologique à tester a été introduit en son sein, le moyen de mixage étant au repos.
La figure 4 représente une vue identique à la figure 3, lorsqu'un échantillon biologique à tester a été introduit en son sein, le moyen de mixage étant activé. La figure 5 représente un détail B de la figure 4.
La figure 6 représente une vue identique à la figure 5, lorsque l'échantillon biologique à tester est remplacé par le liquide de lavage.
La figure 7 représente une vue en perspective d'un appareil d'analyse selon un second mode de réalisation de l'invention. La figure 8 représente une vue identique à la figure 7, lorsqu'un échantillon biologique à tester est pris en compte par un moyen de guidage, qui est lui-même déformé sous l'action d'un index de guidage.
La figure 9 représente une vue identique aux figures 7 et 8, lorsque l'échantillon biologique à tester est pris en compte et est déplacé par un moyen de guidage. Enfin, la figure 10 représente une vue de dessus du second mode de réalisation de l'invention.
La présente invention concerne donc, selon un premier mode de réalisation un appareil d'analyse 1 bien représenté sur la figure 1, dont la forme est sensiblement celle d'un parallélépipède à base carrée. De ce fait, cet appareil 1 comporte une paroi supérieure 13 ainsi qu'une paroi inférieure 14 mieux représentées sur les figures 2 à 4, et une paroi latérale 15 qui fait la liaison entre les parois supérieure 13 et inférieure 14, sur tout le pourtour dudit appareil 1. L'ensemble de ces parois 13, 14 et 15 constitue un contenant 2 monobloc. Néanmoins, il serait possible de le fabriquer en plusieurs parties et de les coller par la suite.
Les parois 13, 14 et 15 délimitent un espace intérieur de l'appareil 1, espace dans lequel les réactions biologiques et/ou les mouvements de fluide(s) vont pouvoir être effectué(e)s. Cet espace intérieur est appelé compartiment réactionnel 5. En fait, les parois supérieure 13 et inférieure 14 du contenant 2 comportent deux ouvertures situées en vis-à-vis l'une de l'autre, comme cela est bien représentée aux figures 2 à 4. La paroi supérieure 13 est fermée par l'intermédiaire d'une puce biologique 3 de structure
complexe, qui sera analysée par la suite. La paroi inférieure 14, pour sa part, est cloisonnée par un moyen de mixage 4. En général, la surface du moyen de mixage 4 est supérieur à la surface de la puce biologique 3.
En fait, les deux contacts possibles entre le compartiment réactionnel 5 et l'extérieur se situent sur l'un des côtés de la paroi latérale 15 et sont consistés par une entrée 11 et par une sortie 12. L'entrée 11 permet l'introduction selon FI de liquide dans le compartiment 5, alors que la sortie 12 permet l'évacuation de ce liquide selon F2.
On remarque également que la paroi supérieure 13 est reliée à la puce biologique 3 par l'intermédiaire d'un rebord intérieur 17, alors que le moyen 4 est fixé à la paroi inférieure 14 par l'intermédiaire d'un rebord intérieur 18. L'objectif de ces rebords intérieurs 17 et 18 est de permettre un rapprochement sans contact, des surfaces intérieures en vis-à-vis, d'une part, de la puce biologique 3, et d'autre part, du moyen de mixage 4. La puce biologique 3 est essentiellement constituée d'un support solide 7 qui constitue le corps de ladite puce 3. Ce support solide comporte une face tournée vers l'extérieur et une face tournée vers l'intérieur de l'appareil d'analyse 1. La face tournée vers l'extérieur constitue la face de lecture, son rôle est bien connu de l'état de la technique et ne sera pas discuté plus avant par la suite. La face tournée vers l'intérieur constitue la face active 9 du support 7. Le terme « actif» est utilisé pour définir cette face 9 du fait qu'il existe une couche bio-spécifique présente sur cette face 9. C'est ce qui est bien représenté aux figures 5 et 6.
Ainsi, sont présents sur la face active 9 du support solide 7 de la puce biologique 3, des ligands 8 constitués, selon la représentation des figures 5 et 6, par des oligonucléotides de capture. On note que ces oligonucléotides de capture 8 comportent tous une séquence spécifique 19, qui va permettre l'hybridation de ces ligands 8 avec des analytes 10 spécifiques qui sont présents dans un échantillon biologique à tester 6, présents au sein du compartiment réactionnel 5.
Il est à noter que la présence des analytes spécifiques 10 n'est pas toujours évidente, et qu'il peut y avoir un mélange avec des analytes non spécifiques 20 également contenus dans cet échantillon 6 et qu'ils ne peuvent se lier avec les ligands 8,
c'est ce qui est bien représenté sur la figure 5. Il peut n'y avoir également que des analytes non spécifiques 20, dans ce cas il n'y aura aucune fixation au niveau des ligands 8.
Sur la figure 6, le liquide est constitué par un liquide de lavage 16, dans ce cas les analytes non spécifiques 20, mais également les analytes spécifiques en excès par rapport au nombre de ligands 8 portés par la surface active 9 du support 7, sont éliminés par sortie selon F 2 du liquide de lavage 16, qui ainsi fait son office.
Qu'il s'agisse de la mise en contact des analytes 10 et/ou 20 avec les ligands 8 ou qu'il s'agisse du lavage par le liquide 16, on remarque que la quantité de liquide 6 ou 16 introduite au sein de l'appareil au niveau du compartiment réactionnel 5 est inférieure au volume total de ce compartiment réactionnel 5. Néanmoins, on pourrait réduire la taille dudit compartiment 5 sans aucun problème. On note sur la figure 3, que lorsque le liquide 6 ou 16 est introduit en faible quantité, il n'y a aucun contact entre ce liquide et la puce 3. Néanmoins, on pourrait également retourner de 180 degrés l'appareil 1 et n'avoir aucun contact entre le liquide 6 ou 16 et le moyen de mixage 4.
Quoiqu'il en soit sur la figure 3, le moyen de mixage 4 est au repos, c'est-à-dire qu'aucune pression n'est exercée sur lui. Sur la figure 4 par contre, une pression selon F3 est exercée sur ce moyen 4, ce qui permet le rapprochement sans contact dudit moyen 4 et de la face active 9 de la puce biologique 3. Dans ce cas, l'écartement séparant la puce 3 et le moyen 4 est tel que le liquide 6 ou 16 présent autour va confluer entre ces deux parties 3 et 4 par simple capillarité.
Il y a bien sûr nécessité à ce qu'aucun contact ne soit établi entre la puce 3 et le moyen 4 afin de ne pas détériorer les ligands 8. Il convient de noter que l'épaisseur de la surface biospécifique, c'est-à-dire de la surface contenant les ligands 8 est très faible de l'ordre de 50 à 60 nanomètres (nm), alors que l'épaisseur de l'espace entre la puce 3 et le moyen 4 est au maximum de 1 à 2 millimètres (mm), lorsque le moyen 4 est au repos et au minimum de 1 à 10 micromètres (μm), lorsque ce moyen 4 est activé par une pression selon F3.
Pour faciliter les choses, on remarque que la paroi latérale 15 associée avec la paroi inférieure 14 et avec le rebord intérieur 18 constitue un récipient pour le liquide introduit qu'il s'agisse de l'échantillon à tester 6 ou du liquide de lavage 16. De ce fait,
lorsque l'on rapproche le moyen 4 de la puce 3 par capillarité le liquide peut plus aisément venir au contact de la surface active 9 de ladite puce biologique 3.
Il convient de noter également que préférentiellement le liquide 6 ou 16 est présent sur le moyen de mixage 4, lorsque ce moyen de mixage 4 est au repos, de sorte que le rapprochement va mettre en contact le liquide 6 ou 16 avec l'espace réduit existant entre la puce 3 et le moyen 4. C'est ce que représente la figure 3.
La présente invention concerne donc également un procédé permettant soit le mixage d'un échantillon biologique 6, soit le mixage d'un liquide de lavage 16. Il peut s'agir également d'un procédé permettant à la fois le mixage d'un échantillon biologique 6 et ultérieurement d'un liquide de lavage 16.
Le procédé est constitué des étapes communes pour ces deux procédés suivantes :
- l'introduction de l'échantillon 6 dans le compartiment réactionnel 5 de l'appareil 1, - l'évacuation dudit échantillon 6 par rapport au compartiment réactionnel 5, après que l'hybridation entre les ligands 8 et les analytes 10 ait eu lieu
- l'introduction d'un liquide de lavage 16 dans le compartiment réactionnel 5,
- l'évacuation dudit liquide de lavage 16 par rapport au compartiment réactionnel 5, et enfin - la lecture de la puce biologique 3 pour établir si des liaisons entre des ligands 8 et analytes 8 sont intervenues.
Si l'on utilise une puce 3 dont la surface active 9 comporte plusieurs zones de reconnaissance, c'est-à-dire que chaque zone de reconnaissance est associée à un seul type de ligands 8, ayant les mêmes séquences spécifiques 19, en fonction de la nature des ligands constituants la couche bio-spécifique, et des zones d'hybridation, on peut déterminer la nature des analytes 10 présents dans l'échantillon biologique 6.
Dans le cas du mixage d'un échantillon biologique 6, on effectue après la première introduction de l'échantillon 6 un déplacement et/ou une déformation du moyen de mixage 4. Dans le cas du mixage du liquide de lavage 16, on effectue après la deuxième introduction du liquide de lavage 16 un déplacement et / ou une déformation du moyen de mixage 4. Il est également possible comme cela a été évoqué
précédemment d'accomplir les deux déplacement(s) et/ou déformation(s) du moyen de mixage 4 après les deux introductions, d'une part, de l'échantillon 6, d'autre part, du liquide de lavage 16.
Selon les figures 4, 5 et 6, on comprend que le moyen de mixage 4 est dans ce mode de réalisation déformé, c'est-à-dire qu'il s'agit d'une matière souple, par exemple un film plastique ou polymère ou métallique, ou même une lame de verre très fine c'est- à-dire d'épaisseur inférieure à 1 mm, et préférentiellement inférieure à 0,5 mm. Néanmoins il est tout à fait concevable que ce moyen 4 soit d'une souplesse faible voir nulle, et qu'il y ait nécessité alors pour avoir un phénomène de capillarité de déplacer le moyen de mixage 4 au plus près de la surface active 9 de la puce biologique 3. Dans ce cas, il convient d'avoir des moyens d'articulation présents sur tout le pourtour du moyen de mixage 4 pour le déplacer en direction de la puce 3. L'homme du métier est apte à établir quels types de moyens peuvent être utilisés, il peut par exemple s'agir d'un rebord en une matière élastique souple conférant à la partie rigide centrale, c'est-à- dire au moyen 4, la possibilité de se déplacer sous l'action de F3. Il peut par exemple s'agir d'un joint périphérique en silicone ou d'un parallélogramme qui peut être déformé.
Selon un second mode réalisation de l'invention, représenté sur les figures 7 à 10, un appareil d'analyse 21 permettant le déplacement d'au moins un liquide, tel qu'un échantillon biologique à tester 26 et/ou un réactif 27, est représenté.
A l'instar du mode de réalisation précédent, cet appareil 21 est en forme sensiblement de parallélépipède à base carrée. De ce fait, il 21 comporte une paroi supérieure ainsi qu'une paroi inférieure, et une paroi latérale qui fait la liaison entre les parois supérieure et inférieure, sur tout le pourtour dudit appareil 21. L'ensemble de ces parois constitue un contenant 22 monobloc, qui peut néanmoins être fabriqué en plusieurs parties et être collé par la suite.
Les parois délimitent un espace intérieur de l'appareil 21, espace dans lequel les réactions biologiques et/ou les mouvements de fluide(s) vont pouvoir être effectué(e)s. Cet espace intérieur est appelé compartiment réactionnel 25. En fait, la paroi supérieure du contenant 22 comporte une ouverture, comme cela est bien représentée aux figures 7
à 9. La paroi supérieure est fermée par l'intermédiaire d'un moyen de guidage 24 constitué d'une membrane qui peut être déformée. La paroi inférieure, pour sa part, constitue un support de guidage 23 cloisonné par le moyen de guidage 24.
De la même façon que pour le premier mode de réalisation, les deux contacts possibles entre le compartiment réactionnel 25 et l'extérieur se situent sur l'un des côtés de la paroi latérale et sont consistés par une entrée et par une sortie, non représentée sur les figures, mais qui fonctionnent de la même manière que précédemment décrit.
Le support de guidage 23, cloisonné par le moyen de guidage 24, comporte une face active 29, située en vis-à-vis dudit moyen de guidage 24. Quoiqu'il en soit sur la figure 7, le moyen de guidage 24 est au repos, c'est-à- dire qu'aucune pression n'est exercée sur lui. Sur les figures 8 et 9 par contre, une pression selon F3 est exercée sur ce moyen 4, ce qui permet le rapprochement sans contact dudit moyen 24 et de la face active 29 du support de guidage 23. Dans ce cas, l'écartement séparant le support 23 et le moyen 24 est tel qu'un liquide 26 ou 27 présent autour va confluer entre ces deux parties 23 et 24 par simple capillarité.
Il est préférable mais non obligatoire qu'aucun contact ne soit établi entre la face active 29 et le moyen de guidage 24. Il convient de noter que l'épaisseur de l'espace entre le support 23 et le moyen 24 est au maximum de 1 à 2 millimètres (mm), lorsque le moyen 24 est au repos et au minimum de 1 à 10 micromètres (μm), lorsque ce moyen 24 est déformé par une pression selon F3.
Selon la figure 10, on constate que sur un seul support peuvent être présents plusieurs échantillons biologiques à tester 26 et plusieurs réactifs 27. Il est également possible de mouvoir ces échantillons 26 et/ou réactifs 27 les uns vers les autres afin de réaliser les réactions biologiques que l'on souhaite réaliser. Ce mouvement est réalisé par l'intermédiaire d'un index de guidage 28, il pourrait également y avoir plusieurs index 28, qui est mobile selon trois axes sensiblement perpendiculaires les uns par rapport aux autres.
Ce premier mouvement est représenté sur les figures 7 et 8, il est identique au mouvement représenté sur la figure 3. Il s'agit d'une pression exercée au niveau du moyen de guidage 24. Cette pression selon F3 permet sur la figure 8 la prise en compte de l'échantillon 26, et sur la figure 9 le déplacement dudit échantillon 26.
Ce déplacement peut d'ailleurs être effectué par exemple, mais non de manière limitative, selon deux axes. Ainsi sur la figure 10, on remarque que le mouvement de l'index 28, non représenté sur cette figure, s'effectue selon F4, c'est-à-dire selon l'axe des X sur le support de guidage 23, alors que le mouvement dudit index 28 s'effectue selon l'axe des Y sur ce support de guidage 23.
Il est également possible de mouvoir les réactifs 27, ou conjointement au moins un échantillon 26 et au moins un réactif 27. L'utilisation de plusieurs index 28 est également possible. Les mouvements selon F3, F4 ou F5 sont réalisés par tous moyens connus de l'état de la technique.
REFERENCES
1. Appareil d'analyse
2. Contenant
3. Puce biologique 4. Moyen de mixage
5. Compartiment réactionnel
6. Echantillon biologique à tester
7. Support solide de la puce biologique 3
8. Ligands portés par la face active 9 9. Face active du support 7
10. Analytes spécifiques contenus dans l'échantillon 6 se liant aux ligands 8
11. Entrée permettant l'introduction de liquide dans le compartiment 5
12. Sortie permettant l'évacuation de liquide du compartiment 5
13. Paroi supérieure du contenant 2 14. Paroi inférieure du contenant 2
15. Paroi latérale du contenant 2
16. Liquide de lavage
17. Rebord intérieur de la paroi supérieure 13 portant la puce 3
18. Rebord intérieur de la paroi inférieure 14 portant le moyen 4 19. Séquence spécifique de chaque analyte spécifique 10
20. Analytes non spécifiques contenus dans l'échantillon 6 ne se liant pas aux ligands 8
21. Appareil d'analyse
22. Contenant
23. Support de guidage 24. Moyen de guidage
25. Compartiment réactionnel
26. Echantillon biologique à tester
27. Réactif
28. Index de guidage 29. Face active du support 23
FI. Introduction de l'échantillon à tester 6 ou du liquide de lavage 16 dans l'appareil 1
F2. Sortie de l'échantillon à tester 6 ou du liquide de lavage 16 de l'appareil 1 F3. Pression exercée au niveau du moyen de mixage 4 ou du moyen de guidage 24 F4. Mouvement de l'index 28 selon l'axe des X sur le support de guidage 23 F5. Mouvement de l'index 28 selon l'axe des Y sur le support de guidage 23
Claims
1. Appareil d'analyse (1) essentiellement constitué d'un contenant (2), d'une puce biologique (3) et d'un moyen, qui peut être déplacé et/ou déformé, dit moyen de mixage (4), le déplacement et/ou la déformation entraîne(nt) le rapprochement du moyen de mixage (4) par rapport à la puce biologique (3) ; le contenant (2), la puce (3) et le moyen (4) délimitent un compartiment réactionnel (5) de volume variable, pouvant recevoir un échantillon biologique à tester (6) ou un liquide de lavage (16), la quantité de liquide (6 ou 16) introduite au sein de l'appareil au niveau du compartiment réactionnel (5) est inférieure au volume total de ce compartiment réactionnel (5) ; la puce (3) étant constituée d'un support solide (7) qui comporte des ligands (8) sur sa face active (9) tournée vers le compartiment réactionnel (5), les ligands (8) peuvent être spécifiques d'analytes (10) présents dans l'échantillon biologique à tester (6).
2. Appareil, selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le moyen de mixage (4) est de structure solide ou de structure souple et peut être déplacé et/ou déformé, ce qui entraîne la variation du volume du compartiment réactionnel (5).
3. Appareil, selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que le moyen de mixage (4) de structure solide peut être déplacé, et que le moyen de mixage (4) de structure souple peut être déformé.
4. Appareil, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que le déplacement et/ou la déformation entraîne(nt) le rapprochement du moyen de mixage (4) par rapport à la face active (9) de la puce biologique (3).
5. Appareil d'analyse (21) essentiellement constitué d'un contenant (22), d'un support de guidage (23) et d'un moyen, qui peut être déformé, dit moyen de guidage (24) ; le contenant (22), le support (23) et le moyen (24) délimitent un compartiment réactionnel (25) de volume variable ; ledit support de guidage (23) peut recevoir au moins un échantillon biologique à tester (26) et au moins un réactif (27) au niveau de sa face active (29) tournée vers le compartiment réactionnel (25), le moyen de guidage (24) déformé entraîne le rapprochement dudit moyen (24) par rapport à la face active (29) du support (23) et permet la prise en compte et le déplacement d'un échantillon biologique à tester (26) et/ou d'un réactif (27).
6. Appareil, selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5, caractérisé par le fait que, sur tout ou partie de la face active (9 ou 29) de la puce biologique (3) ou du support (23), la distance séparant le moyen de mixage (4) ou de guidage (24) de ladite face active (9 ou 29) de ladite puce (3) ou dudit support de guidage (23), avant le rapprochement, est inférieur à 2 mm, préférentiellement inférieur à 1 mm, et que la distance séparant le moyen de mixage (4) ou de guidage (24) de la face active (9 ou 29) de la puce (3) ou du support de guidage (23), après le rapprochement, est inférieur à 100 μm, préférentiellement inférieur à 10 μm, ou encore plus préférentiellement 1 μm.
7. Appareil, selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé par le fait que le rapprochement permet la convergence par capillarité de l'échantillon biologique à tester (6 ou 26) et/ou du liquide de lavage (16) et/ou du réactif (27) sur la surface active (9 ou 29) de la puce (3) ou du support de guidage (23), sans contact entre le moyen de mixage (4) ou de guidage (24) et ladite surface active (9 ou 29).
8. Appareil, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que le rapport existant entre le volume du ou des échantillons biologiques à tester (6 ou 26) ou le liquide de lavage (16) et/ou le ou les réactifs (27), introduit dans le compartiment réactionnel (5 ou 25), et le volume dudit compartiment réactionnel (5 ou 25) est compris entre 1 pour 10000 et 1 pour 10, préférentiellement entre 1 pour 1000 et 1 pour 100.
9. Appareil, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou 6 à 8, caractérisé par le fait que les ligands (8) sont constitués par des oligonucléotides et les analytes (10) par des oligonucléotides et/ou des polynucléotides.
10. Procédé permettant le mixage d'un échantillon biologique dans un appareil d'analyse, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou 6 à 9, qui consiste à :
- introduire l'échantillon dans le compartiment réactionnel de l'appareil, - déplacer et/ou déformer au moins une fois le moyen de mixage,
- évacuer ledit échantillon dudit compartiment réactionnel,
- introduire un liquide de lavage dans le compartiment réactionnel,
- évacuer le liquide de lavage du compartiment réactionnel, et
- effectuer la lecture de la puce biologique, pour établir si des liaisons entre ligands et analytes sont intervenues.
11. Procédé permettant le mixage d'un liquide de lavage dans un appareil d'analyse, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou 6 à 9, qui consiste à :
- introduire l'échantillon dans le compartiment réactionnel de l'appareil, - évacuer ledit échantillon dudit compartiment réactionnel,
- introduire un liquide de lavage dans le compartiment réactionnel,
- déplacer et/ou déformer au moins une fois le moyen de mixage,
- évacuer le liquide de lavage du compartiment réactionnel, et
- effectuer la lecture de la puce biologique, pour établir si des liaisons entre ligands et analytes sont intervenues.
12. Procédé permettant le guidage d'au moins un échantillon biologique à tester et/ou d'au moins un réactif dans un appareil d'analyse, selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, qui consiste à : - introduire le ou les échantillons et/ou le ou les réactifs dans le compartiment réactionnel de l'appareil,
- déformer le moyen de guidage par l'intermédiaire d'un index jusqu'à prise en compte du ou des échantillons biologiques à tester et/ou du ou des réactifs, et
- déplacer l'index afin de déplacer ledit ou lesdits échantillons à tester et/ou ledit ou lesdits réactifs jusqu'à une autre position souhaitée.
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- 2000-12-28 WO PCT/FR2000/003705 patent/WO2001049413A1/fr active Application Filing
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