EP1677913A1 - Dispositif de travail comprenant une zone localisee de capture d'une goutte d un liquide d'interet - Google Patents

Dispositif de travail comprenant une zone localisee de capture d'une goutte d un liquide d'interet

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EP1677913A1
EP1677913A1 EP04805769A EP04805769A EP1677913A1 EP 1677913 A1 EP1677913 A1 EP 1677913A1 EP 04805769 A EP04805769 A EP 04805769A EP 04805769 A EP04805769 A EP 04805769A EP 1677913 A1 EP1677913 A1 EP 1677913A1
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EP
European Patent Office
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liquid
interest
drop
capture
zone
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP04805769A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Gilles Marchand
Cyril Delattre
Patrick Pouteau
Patrice Caillat
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Biomerieux SA
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B60/00—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries
    • C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries

Definitions

  • the present invention relates to a working device, a wafer, a system and a chip comprising localized zones for capturing a drop of a liquid of interest.
  • the present invention makes it possible to obtain a matrix of localized drops, at high density, on a surface, from a liquid of interest. It allows for example to easily ensure the transition from a closed fluid chamber filled with a liquid of interest to a matrix of drops, or micro-volumes, perfectly located on a surface placed in said fluid chamber, when the liquid d interest is removed from said fluid chamber.
  • drop matrix is meant a determined arrangement of said drops, without requiring a particular geometric shape of said arrangement.
  • the drop matrix can be round, square, polygonal and even random, the main thing being that the drops formed are placed in a localized and determined manner on the surface in accordance with the objective achieved by the present invention.
  • localized is meant circumscribed, individualized and distinct from other drops voluntarily captured on said surface using the device of the invention.
  • Each of the drops can be subjected to one or more operations intended to analyze qualitatively and / or quantitatively one or more analyte (s) present or likely to be present in the liquid of interest, for example a molecule, an oligonucleotide, a protein, etc.
  • the analysis of the analytes in the drop can be carried out by any technique known to a person skilled in the art for carrying out analyzes, in particular in a volume of liquid as small as a drop. These can be analytical techniques used on biological chips.
  • the analysis may or may not involve the surface of the device of the invention covered by the drop, depending on the implementation of the present invention.
  • Each of the drops forms a volume in which chemical or biochemical reactions can be carried out. Any chemical or biochemical reaction known to a person skilled in the art can be carried out in this volume. These reactions may or may not involve the surface of the device of the invention covered by the drop, depending on the implementation of the present invention.
  • chemical / biochemical analysis (s) and reaction (s) can be carried out exclusively on a device in accordance with the present invention (analysis or reaction), or in a complementary manner. In the latter case, this can be simultaneously (reaction and analysis) or successively (reaction then analysis or analysis then reaction). In addition, several analyzes and / or several reactions may follow one another.
  • the device of the present invention can advantageously intervene, on the one hand in the manufacture of a card, or laboratory on a chip (for example by chemical reactions making it possible to deposit a polymer, then to functionalize it) (“lab -on-chip "), in which all the steps necessary for the qualitative and quantitative analyzes of a liquid of interest are integrated: fluid manipulation, chemical and / or biochemical reactions, optical, electrical and / or chemical detection chip, etc. ; and on the other hand in the use of this card, or laboratory on chip, to carry out qualitative and / or quantitative analyzes in drops of a liquid of interest to be analyzed (chemical / biochemical reaction (s) (s) and analysis).
  • the device of the present invention is called in the present "working device".
  • the references in square brackets [] refer to the annexed list of references.
  • aqueous phase of interest is then deposited in the form of micro-drops by an automated dispensing system.
  • These methods lead to the reproducible formation of drops and high-density matrices of studs or drops.
  • drop dispensing system including a precise movement and alignment device, as well as a device for feeding liquid.
  • the cost of this apparatus is high.
  • the maximum density of the matrices is limited by a combination between the size of the drops dispensed and the minimum inter-stud pitch of the dispensing system.
  • the hydrophilic zones described in these documents are always discs, the surface of which also represents the working zone.
  • these systems cannot be used in the context of electrical measurement or functionalization because these devices do not have an electrode.
  • micro-cuvette matrices For the formation of high density micro-cuvette matrices, two significant examples can be cited: the formation of a network of micro-cuvettes by etching in a silicon plate to carry out DNA amplifications by PCR in micro- volumes of a few picoliters, and the formation of wells or channels by photolithography on photosensitive resins deposited on a plastic substrate [3].
  • the number of wells varies from 100 to 9600 wells, with diameters from 60 to 500 ⁇ m and depths from 5 to 300 ⁇ m.
  • the edges of these bowls leaving no physical separation between the liquid phase within the bowl and that outside, therefore allow connections between the bowls, and therefore contamination between them.
  • One of the most important applications of the present invention is the electrical or electrochemical detection of biological molecules present in a liquid of interest with amplification of the signal by enzymatic accumulation.
  • electrical or electrochemical detection of biological tests a large number of electrical or electrochemical detection systems described in the literature does not make it possible to descend below the nanomolar in terms of detection limit, a limitation often due to the low number of electrons generated by each hybrid. Systems involving enzymatic accumulation allow this detection limit to be lowered around the pico-polar due to the high amplification of the number of redox species to be detected present in the reaction medium [4].
  • this amplification method creates a problem for currently known multiplot systems because the redox compound diffuses and can thus contaminate neighboring plots.
  • a working device comprising: - a substrate comprising an active surface that is substantially non-wetting with respect to 'a liquid of interest, - at least one localized capture zone of a drop of said liquid of interest formed on said active surface, - at least one working zone arranged with the capture zone in such a way that the zone of work is covered at least partially by the drop of the liquid of interest when the latter is captured by said capture zone, - means for supplying liquid of interest making it possible to leave a drop of said liquid of interest on said zone capture.
  • the present invention also meets this need, by providing a working plate comprising several working devices in accordance with the present invention, identical or different in their embodiment.
  • the present invention also meets this need by providing a biological chip comprising a working device according to the invention or a wafer according to the invention.
  • the present invention also meets this need by providing a system comprising one or more working device (s) according to the invention.
  • the present invention also meets this need by providing a working box comprising: - a container comprising means for introducing a liquid of interest into this container and of extracting the liquid of interest from this container, - a working device according to the invention or a wafer according to the invention, placed in said container, the means for introducing and extracting the liquid of interest from the container being arranged in such a way that when the liquid d interest is introduced into the container, it covers the, at least one, capture zone (s), then when the liquid of interest is extracted from the container, a drop of said liquid of interest remains captive by said capture zone.
  • the present invention also meets this need by providing a system comprising a work box according to the invention.
  • a liquid is said to be “of interest” as soon as this liquid is intended to be captured by one or more capture zones of a device according to the invention, for example to form a matrix of drops of this liquid.
  • liquid of interest is meant any liquid capable of requiring a matrix arrangement of drops on a support, for example for analytical and / or chemical and / or biochemical purposes.
  • chemical and / or biochemical goal means any chemical and / or biochemical reaction which can be carried out in a liquid.
  • analytical goal means any qualitative and / or quantitative analysis that can be performed in a liquid.
  • the liquid of interest can be organic or aqueous.
  • It can be any of the liquids currently handled in the laboratory or in industry, for example on labs on a chip. It may for example be a liquid chosen from a solution, a solvent, a reagent, a sample, a cell extract, a sample from an animal or plant organism, a sample taken from nature or from industry, etc. It can be a biological or chemical liquid.
  • This liquid of interest can be a diluted liquid, if necessary, for its use with the device of the present invention, as can be done on labs on a chip.
  • a solid product can be dissolved to constitute a liquid of interest within the meaning of the present invention.
  • This solid product can be chosen, for example, from a chemical or biochemical product, a reagent, a material to be analyzed, a sample from an animal or plant organism, a sample taken from nature or industry, etc. Those skilled in the art know how to handle such products and liquids of interest.
  • the substrate of the working device of the invention in fact constitutes the support on which the active surface is formed, the, at least one, capture zone, and the, at least one, work zone. It can be made of any material suitable for implementing the present invention. It can for example be one of the basic materials used to manufacture laboratories on a chip, biological chips, microsystems, etc.
  • the substrate may, for example, be a material chosen from the group consisting of silicon; silicon oxide; glass ; silicon nitride; polymers, for example organic polymers such as those chosen from the group comprising polycarbonates, polydimethylsiloxanes, polymethylmetacrylate s, polychlorobiphenyls and copolymers of cycloolefins; and a metal or a metal alloy, for example chosen from Al, Au, or stainless steel.
  • active surface is intended to mean the surface of the substrate on which the at least one capture zone and the at least one work area formed with said capture zone are formed.
  • the substrate may include one or more active surfaces.
  • each active surface can comprise several capture zones arranged respectively with one or more work zone (s).
  • the active surface can be made of any material which is substantially non-wetting with respect to the liquid of interest and which is suitable for implementing the present invention.
  • the operation of the device of the present invention is based in part on the fact that the active surface does not or very little retain the liquid of interest, which allows total, easy dewetting, without retention of liquid of interest on the surface, and this without drying.
  • the active surface forms a contact angle with the liquid of interest of at least 60 °.
  • the drops of liquid of interest are selectively and exclusively captured by the capture zone (s), and are circumscribed to these zones, which avoids any problem of contamination between the drops, and therefore between the zones of work.
  • the material of the active surface is therefore chosen as a function of the liquid of interest from which a drop matrix must be formed, but also as a function of the substrate, and as a function of the working and capture zones. It can be placed on the substrate by chemical modification or by deposition. It can also be the substrate itself if it is made of a material of a substantially non-wetting character vis-à-vis the liquid of interest. In the latter case, no additional chemical modification is required. For example, when the liquid of interest is aqueous, the material forming the active surface is advantageously hydrophobic.
  • the surface of the substrate can be made non-wetting, here hydrophobic, by chemical modification, for example by silanization with a silane carrying hydrophobic functions, for example 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorodecyl-trichlorosilane. It may for example also be a deposit of liquid teflon on a turntable; gas phase silanization of hydrophobic silane; the use of hydrocarbon silane, for example of the octadecyltrichlorosilane type.
  • the materials and methods which can be used for the implementation of such chemical modifications are known to those skilled in the art. An exemplary embodiment is given below.
  • the treatment allowing the surface of the substrate to be made non-wetting with respect to the liquid of interest can be carried out, before or after the formation of the capture zone (s) and / or of the , corresponding work area (s). These will be protected in case it is carried out after these.
  • the shape and size of this active surface, and therefore also of the substrate on which it is formed, do not matter for the operation of the device of the invention. They can be determined for example as a function of the number of capture zones coupled to work zones formed thereon, and optionally of their arrangement on this surface, as well as according to the desired size of the device as it will be used and cost specifications. However, in order to avoid unforeseen retentions of the liquid of interest on the surface, it is preferably chosen to be flat.
  • the active surface can have a shape and a size comparable to the wafers used for the manufacture of laboratories on a chip and of microsystems of analysis and detection known to those skilled in the art.
  • the active surface, or the substrate on which this surface is formed is modified by structuring or surface treatment in order to create the capture and working zones of the device of the invention.
  • the capture zones are very localized zones, wetting with respect to the liquid of interest, that is to say having a strong affinity for this liquid of interest.
  • the term "localized" is defined above.
  • the capture zone captures, or retains, a drop of liquid of interest, while the active surface, substantially not wetting against the liquid of interest, does not retain or very little liquid of interest.
  • the, at least one, capture zone can be a chemical, electrical or physical capture zone of a drop of liquid of interest.
  • the capture zone consists of a support material which is disposed in a determined manner on said active surface or on the substrate and which, if necessary, can be chemically modified to make it wetting with respect to the liquid of interest, for example by grafting onto it a chemical function wetting with respect to said liquid of interest.
  • this support material can consist of a material chosen from the group consisting of silicon, silicon oxide (Si0 2 ); glass ; silicon nitride (Si 3 N); polymers, for example organic polymers such as those chosen from the group comprising polycarbonates, polydimethylsiloxanes, polymethylmetacrylate s, polychlorobiphenyls and copolymers of cycloolefins; and a metal or a metal or a metal alloy, for example chosen from Al, Au, or stainless steel.
  • the wetting chemical function with respect to an aqueous liquid of interest can be chosen from the group consisting of an alcohol, alcoholate, carboxylic acid, carboxylate, sulfonic acid, sulfonate, oxyamine, hydrazine, amino function. and ammonium.
  • the following two methods (1) and (2) can be used to manufacture this type of capture zone:
  • the following steps can be carried out: i) Deposit by evaporation or spraying of one or more layers of metals (support) chosen from Ti, Pt, Au, Pd, Ni, Al, etc. with the last compulsory layer Au. However, if the working area is an electrochemical microcell (see below), the electrodes of this microcell will preferably not be gold. ii) Definition of patterns in the metal layer by photolithography then etching of the metals, for example in a chemical etching bath, or in the gas phase with a plasma, to form a capture zone.
  • Document [9] describes usable methods.
  • the capture zone in particularly when the device of the invention is intended to be used with liquids of aqueous interest and when the active surface or the substrate is based on silicon, the capture zone can consist of hydrophilic black silicon, which can be formed very easily on such a surface by etching. The etched area then becomes particularly wetting with respect to an aqueous liquid of interest. The engraved area does not require any other chemical modification to be wetting. This embodiment is therefore very economical.
  • Document [11] describes an example of a laboratory protocol that can be used to fabricate this type of capture area.
  • the capture zone can be a wetting capture electrode.
  • the capture zone here an electrode
  • the capture zone can consist for example of a material chosen from the group consisting of noble metals, for example Au, Pt, Pd, Ti, Ni, Al , etc., or a noble metal alloy; of carbon ; graphite; and indium tin oxide (ITO); said material being made wetting by electrodeposition on it of an electrically conductive polymer on which is fixed a chemical wetting function vis-à-vis the liquid of interest.
  • the electrically conductive polymer can be one of the polymers used in the manufacture of on-chip laboratories.
  • He can be chosen for example from the group consisting of polypyrrole, polyaniline, polyazulene, a polythiophene, polyindole, polyfuran, and polyfluorene.
  • the wetting chemical function may for example be one of the wetting chemical functions mentioned above. Its attachment to the monomer before polymerization or to the polymer once it is formed can be carried out by conventional chemistry techniques.
  • a process for manufacturing this type of capture zone can be summarized as follows: (3) On a substrate (insulator) chosen from materials such as Si0 2 or Si 3 N 4 , glass, polymer, the steps can be carried out following: ⁇ ) Deposit by evaporation or spraying of one or more layers of metals (support) chosen from the aforementioned metals, with as a last layer a metal chosen from Pt and Au or any other noble metal or an alloy of these metals. It can also be a deposit of carbon, graphite, ITO, etc.
  • an insulating material Si0 2 or Si 3 N 4
  • the capture zone can be a capture electrode by electro-activation of chemical functions.
  • This embodiment is substantially identical to the third embodiment mentioned above, except that the wetting chemical functions used are chosen so that they can be electro-activated or electro-deactivated.
  • it is necessary to apply an electric current to the electrode constituting the capture zone so that the wetting chemical functions of this electrode are activated and capture a drop of the liquid d 'interest. By interrupting the application of the electric current, the wetting functions are deactivated, and the drop of liquid of interest is released.
  • the capture zone can be a capture zone by electrowetting.
  • the electro-wetting making it possible to capture a drop of liquid of interest consists in applying a potential between two electrodes, one of which is covered with an insulating and non-wetting material.
  • the capture zone can be an engraving of, or a projection on, the active surface making it possible to capture the drop by capillary forces.
  • etchings or protrusions can be produced for example by direct etching of the substrate; by depositing a material on the surface of a flat substrate, for example by coating, evaporation, spraying, or electrochemical deposition, then etching in conjunction with a conventional photolithography process, for example by coating of resin, exposure and definition of patterns, or engraving; by direct definition of patterns by photolithography in photosensitive polymers, for example in the case of photosensitive resins; molding or stamping of plastic materials.
  • these engravings or projections forming zones make it possible to capture, in a localized manner in this zone, by capillary action, a drop of the liquid of interest and that this drop covers at least partially the working zone.
  • the capture zone is preferably a hydrophilic zone and the substantially non-wetting active surface is preferably hydrophobic.
  • the capture zone and the corresponding working zone (s) can be placed in a hollow (or bowl) or on a projection (or pad) relative to the active surface.
  • the capture zone and the corresponding work zone are in relief relative to the active surface, either on pads or in cuvettes.
  • these recesses and protrusions will be sufficiently distant from each other, particularly when it comes to protrusions, and of sufficient diameter, particularly when it is recesses, so that the liquid of interest is not captured by them by capillarity between the projections or in the recesses, but by the capture zones located on these projections or in these recesses. They can be obtained by stamping, molding, engraving, or any other technique known to those skilled in the art and adapted to the material constituting the substrate.
  • the capture zone can have any shape.
  • This area can be chosen, for example, from an annular, star, rectangle, square, triangle, ellipse, or polygon shape having 4 to 20 sides, or any other shape suitable for placing of the present invention.
  • the shape is annular, open or closed. In general, it is in the form of a strip.
  • this strip has a width and a thickness which are a function of the size of the device as a whole (capture zone + work zone). Indeed, this width and this thickness must allow the capture of a drop of liquid of interest. Examples of dimensions are given below.
  • the capture zone is arranged with the work zone in such a way that if a drop of liquid of interest is captured by it, this drop at least partially covers the Work zone.
  • the capture zone surrounds the work zone, this in a continuous or discontinuous manner.
  • a zone for capturing a drop of liquid of interest can surround several working zones, for example from 2 to 4 or more, provided that when a drop of liquid of interest is captured by the capture zone, this drop covers, at least partially, all the work areas that are surrounded by this capture area.
  • the working area can be an interaction zone chosen from an electric, chemical, mechanical, optical interaction zone with said drop of liquid of interest captured, or a zone at the level of which several of these interactions are used simultaneously or successively.
  • the working area can be an electrical interaction area, for example an electrochemical microcell.
  • An electrochemical microcell is a device having at least two preferentially coplanar electrodes, forming a working electrode and a counter electrode. It can also have a reference electrode. These elements are known to those skilled in the art. The manufacturing methods known to those skilled in the art can be used to manufacture this working area, for example the method described in the document referenced
  • the device of the present invention can constitute a true electrochemical microreactor which uses the drop of liquid of interest captured by the capture zone as a reaction medium, and more precisely as an electrochemical medium.
  • the electrochemical reactor according to this first embodiment of the present invention can be used to carry out any electrochemical reaction and / or analysis known to those skilled in the art.
  • This reactor can be used for example to carry out localized electropolymerization reactions of one or more monomer (s) present in the drop (polymerization or copolymerization) and / or localized electrografting of one or more several chemical molecule (s) present in the drop of the liquid of interest on one of the electrodes of the microcell.
  • the liquid of interest is then a liquid containing the reagents necessary for the desired electropolymerization or electrografting.
  • the polymerization and the grafting can advantageously be located at the level of the drop of the liquid of interest captured by the capture zone.
  • Such localized electropolymerization or grafting reactions can be used for example for the manufacture of biological chips or analysis systems.
  • This electrochemical microreactor can for example also be used to carry out electrochemical analyzes, qualitative and / or quantitative, of analytes present in the drop of a liquid of interest captured by the capture zone.
  • the electrochemical microcell of the device of the invention can be used first to “manufacture” the working area, and then to use this working area for the analysis of a drop of a liquid d 'interest.
  • the work area must include an organic polymer functionalized by a probe, for example a biological probe, it can be manufactured by electropolymerization of a conductive polymer functionalized by a probe, for example according to the process described in the document referenced [5].
  • the characteristic linked to the use of the device of the invention is that the capture zone is used to capture in a localized manner on the work zone a first drop of a first liquid of interest containing the reagents necessary for the electropolymerization (organic monomer).
  • Functionalization by the probe can be carried out simultaneously with electropolymerization, the first liquid of interest then also contains the probe (for example monomer functionalized by the probe).
  • Functionalization can also be carried out after the electropolymerization by means of a second drop of a second liquid of interest (containing the probe) captured by the same capture zone and, therefore located on the same work zone .
  • the work area thus produced can then be dried, and it can be used, still thanks to the capture area with which it is arranged, to capture a drop of a third liquid of interest to be analyzed, containing a target which interacts with the probe (for example complementary oligonucleotides).
  • a fourth liquid of interest can also be used to analyze (detection and / or assay) the probe / target interaction on said working area, and so on.
  • the electrochemical microcell of a device of the present invention is used to detect a target present in a liquid sample, for example by bringing into play an interaction of the target to be detected with a specific probe fixed on the area of work, it is possible to electrochemically detect said interaction for example with amplification of the signal by enzymatic accumulation in a drop of a liquid of interest, containing an enzymatic substrate, captured by the capture zone arranged with this work zone.
  • Document [4] sets out an operating protocol usable for this type of detection, with the device of the present invention.
  • the detection of a probe / target interaction on the work area can involve one of the other means known to those skilled in the art than the electrochemical cell, for example an optical process.
  • the electrochemical microcell can therefore be used in this case only for "manufacturing" the working area, the detection of a probe / target interaction then being carried out by another means.
  • different drops made up of different liquids of interest are therefore successively captured by the same capture area on the device of the present invention for different purposes, for example to carry out successive steps of a protocol for manufacturing the work area, for example also to carry out successive steps of detection and / or assay of an analyte in a liquid of interest.
  • the advantage linked to the present invention is that whatever the objective of the successive captures of drops of liquids of interest, the drops captured successively are all located on the work zones, thanks to their respective capture zone.
  • the probe which functionalizes the working area can be chosen for example from the group consisting of an enzyme, an enzyme substrate, a oligonucleotide, an oligonucleoside, a protein, a membrane receptor of a eukaryotic or prokaryotic cell, an antibody, an antigen, a hormone, a metabolite of a living organism, a toxin of a living organism, polynucleotide, polynucleoside, complementary DNA . It is of course chosen according to the target with which it will have to interact.
  • the outermost electrode of the microcell can be used to form the capture zone or wetting strip of the device of the invention.
  • a carrier conductive polymer wetting function intended to form the capture zone is deposited on this electrode.
  • the polymer can be electro-deposited on the electrode thanks to the electrochemical cell forming the working area.
  • the electrode forming the zone for capturing a drop of liquid of interest can operate completely independently of the working zone. It can also function in a dependent manner, being used subsequently in the function of the electrochemical microcell, for example for carrying out electrochemical measurements and / or electrochemical reactions in the captured drop.
  • the capture zone of the device of the present invention can therefore be active or not depending on the choice of implementation of the device of the invention.
  • the electrode for capturing a drop of liquid of interest can also be functionalized by a probe intended to interact with a target.
  • the conductive polymer functionalized by a chemical wetting function with respect to the liquid of interest can also be, in further, functionalized by said probe intended to interact with a target.
  • the probe is defined above for the working area.
  • the methods known to a person skilled in the art for functionalizing a conductive polymer by a probe for the manufacture of biological chips can be used for the manufacture of this particular capture zone of the present invention. These may be, by way of example, the methods described in the aforementioned documents.
  • the working zone can be a zone of chemical interaction with the drop of liquid of interest captured, without an electrochemical microcell.
  • the working area can for example include chemical or biological functions or reagents ready to react with a target of these functions or these reagents present in a liquid of interest.
  • the device of the invention can be used firstly to place these functions or these reagents on the working area, and secondly, after drying, to capture a drop of liquid of interest containing the target of these functions or of these reagents for its analysis.
  • liquids of interest may succeed one another on the device of the invention, for example to carry out successive steps of a protocol for manufacturing the working area, for example also to carry out successive stages of detection and / or for assaying an analyte in a liquid of interest.
  • This work area can be chosen from those known to those skilled in the art in the field of biological chips (chips marketed by AGILENT, CIPHERGEN, EUROGENTEC).
  • Chips marketed by AGILENT, CIPHERGEN, EUROGENTEC chips marketed by AGILENT, CIPHERGEN, EUROGENTEC.
  • This working area can be manufactured for example by silanization then immobilization of biological probes as described for example in the document referenced [12].
  • This working area can for example be an area comprising a polymer functionalized by a biological probe such as those mentioned above, in order to fix a corresponding target capable of being present in a liquid of interest to detect it, for example optically.
  • this working area can be obtained according to the methods described in the document referenced [13].
  • the chips thus functionalized can then, thanks to the capture zone of the device of the invention, be used to capture a drop of a sample to be analyzed then possibly of another liquid of interest to highlight a probe / target interaction .
  • the working area can have active or measuring devices, such as sensors or actuators.
  • active or measuring devices such as sensors or actuators.
  • This embodiment can be added to the abovementioned embodiments and variant, or be exclusive depending on the objective sought in the implementation of the present invention.
  • the active or measuring devices are advantageously located in the center of the capture zones.
  • the working area includes a sensor, it can be chosen for example from the group consisting of electrical, magnetic, electrostatic, mechanical (for example pressure sensor), thermal (for example temperature sensors), optical (for example device) sensors optical detection) and chemical.
  • an actuator it can be chosen for example from the group consisting of optical (light source), electric, magnetic, electrostatic, mechanical (mechanical displacement), thermal (heating resistance) and chemical actuators.
  • Such sensors and actuators which can be used for implementing the present invention, as well as their manufacturing process, are known to those skilled in the art, in particular in the field of microsystems. Again, the difference of the device of the present invention with these chips of the prior art lies in particular in the presence of the liquid capture area of interest arranged with said work area.
  • the, at least one, working area can be a substantially non-wetting or wetting area vis-à-vis the liquid of interest.
  • the inventors have indeed noted during their experiments that the wettability of the working area is not decisive for the operation of the device of the present invention. They have in fact noticed that, quite unexpectedly, the device of the present invention can also operate when the working area is not wetting with respect to the liquid of interest, provided that the captured drop covers at least partially said work area.
  • the present invention also relates to a method of manufacturing the device of the present invention comprising the following steps: - providing a substrate comprising a surface chosen to become the active surface, - structuring the chosen surface of the substrate in order to form thereon a work area, apply a treatment on the chosen surface in order to make it substantially non-wetting vis-à-vis the liquid of interest for which the device is intended, and - structure the chosen surface in order to form a zone for capturing a drop of liquid of interest, the steps of structuring the surface to form a working zone and structuring the surface to form the capture zone being carried out so that the work zone is arranged with the capture zone of such so that when the capture zone captures a drop of liquid of interest, the work area being covered at least partially by said drop.
  • the step consisting in structuring the surface to form the capture zone can consist in forming an electrode intended to form the capture zone, in electrodepositing on this electrode a conductive polymer carrying one or more wetting chemical function (s).
  • the step consisting in structuring the surface to form the working area may consist in: manufacturing a sensor on this surface; an actuator; an electrochemical microcell; a functionalized polymer layer, or one which can be functionalized, with a probe intended to recognize a target capable of being present in the liquid of interest.
  • the present invention also relates to a work plate comprising several identical or different work devices according to the invention.
  • the device of the present invention as presented above, can be arranged in series on a plate, for example for form a matrix, the working zones possibly being identical over the entire wafer, or different, for example in order to be able to carry out multi-parameter analyzes and chemical and biological reactions different from one zone to another, simultaneously or successively.
  • the plate may be made up of the substrate comprising the active surface (s) defined here.
  • matrix is defined above.
  • the number of devices on a working board according to the invention depends in particular on the number of analyzes to be carried out on this board.
  • the wafer comprises 1000 devices according to the invention
  • it will make it possible to capture 1000 drops of liquid of interest over 1000 working zones, or more when a capture zone surrounds several working zones, and therefore to carry out simultaneously at least 1000 analyzes of the liquid of interest.
  • It finds, for example, a utility for implementing a simultaneous multi-parameter analysis of the liquid of interest.
  • manufacture laboratories on a chip for example biological chips and microsystems for analysis.
  • the present invention therefore also relates to a biological chip comprising a device or a wafer according to the invention.
  • This chip can for example be a nucleic acid chip, an antibody chip, an antigen chip, a protein chip, a cell chip, or a chip comprising several of these functions, for example a chip nucleic acid and protein, antibody and nucleic acid chip, etc.
  • the device of the present invention can be miniaturized on the millimeter or micrometer scale, for example, from 5 ⁇ m to 5 mm.
  • the present invention also relates to a system comprising one or more working device (s) according to the invention, identical or different, or a plate according to the invention.
  • the system can for example be an analysis microsystem, for example a total analysis microsystem (MicroSysteme of Total Analysis or ⁇ TAS).
  • the manufacture of the wafer, and of the system in accordance with the present invention can be carried out in the same manner as that described above for the manufacture of the device of the invention.
  • the methods known to those skilled in the art can be used. Indeed, the difference of the device, wafer, laboratory on chip, and system of the present invention with their counterparts of the prior art lies essentially in the presence of the liquid capture zone of interest arranged with each work zone.
  • the dimensions of a capture zone can vary widely depending on the use for which it is intended and on the embodiment (one or more work zones per capture zone, one or more several device (s) of the invention on an active surface).
  • the capture zone can have a diameter ranging from 5 ⁇ m to 5 mm.
  • this strip may have a width of 1 ⁇ m to 500 ⁇ m and a thickness relative to the active surface of 0 to
  • the work area the size of which depends in particular on the capture area (the drop captured must at least partially cover this work area) can have, for example, with the aforementioned dimensions of the capture area, a diameter such that it touches the capture area that surrounds it or not.
  • the working area can have a diameter of 5 ⁇ m to 5 mm.
  • the means allowing a drop of liquid of interest to be left on said localized capture zone can be a syringe, a pipette, a micropipette, a container containing the liquid of interest and in which the device or the wafer of the invention can be immersed, etc. It can also be a dispenser of a drop of liquid of interest per capture zone. In fact, in this case, the device of the invention makes it possible to guarantee that there is no contamination between the work areas.
  • the dispensers that can be used are those usually used, for example, in the field of on-chip laboratories and microsystems.
  • the present invention also relates to a work box as defined above. In this work box, the container can be opened or closed.
  • This container can be used specially to immerse the device of the invention or the wafer of the invention in the liquid of interest, or a container which allows in addition to confine the device or the plate of the invention and / or carry out analyzes on or in the drops captured on the work areas.
  • the container is preferably closed, the working box of the present invention then constitutes a veritable miniature laboratory. It can be used in systems, such as microsystems for analysis, or form a biological chip, for example chosen from the group consisting of nucleic acid, antibody, antigen, protein and cell chips.
  • the dimensions of the container depend in particular on the dimensions of the device of the invention, or of the wafer of the invention, which must be enclosed in it, but also, if necessary, of other analysis devices or systems which can be joined in said container, for example from other laboratories on a chip. They can descend below the cm for their largest side.
  • the container can consist, for example, of a material chosen from the group consisting of an organic polymer, an elastomeric plastic, glass, metal, silicon, a photosensitive resin, or by any material known to those skilled in the art. and allowing the implementation of the present invention. For example, it may be one of the aforementioned materials forming the substrate of the working device of the present invention.
  • the material of the container is generally chosen according to the type of liquid of interest to be introduced into it, the use of the container (simply immersion of the device or wafer, or immersion and analysis) and according to the manufacturer's cost specifications. It may be a material identical to the active surface of the device of the invention or different.
  • the container is preferably sufficiently tight to prevent, for example, leaks when the device or the wafer according to the invention is immersed therein in the liquid of interest. In particular, when it is closed, it is preferably sufficiently tight to prevent, for example, contamination from entering the container, for example bacterial, chemical, etc. ; and / or to prevent the evaporation of the drop (s) captured by the capture zone (s) after the extraction of the liquid of interest from the container.
  • the substrate when the substrate and the container are made of the same material, the substrate can constitute one of the walls constituting the container.
  • the walls constituting the container can also be mounted from, and on, the active surface of the device of the invention, for example by bonding or compression.
  • the container may include a cover for mounting, but also, in certain applications, for opening or closing it, in particular in order to be able to withdraw from it the device or the plate of the invention after having brought it into contact with the liquid of interest, or after the analyzes or reactions in the drops.
  • a single container can also be used to immerse at the same time or successively one, or, depending on its design, several device (s) or plate (s) according to the invention.
  • the container can then include removable fixing means, for example clips,, or, device (s) and / or plate (s) inside thereof.
  • the container comprises a cover, it will preferably be sufficiently leaktight so as not to disturb the immersion of the device or the wafer of the invention, as explained above.
  • the cover may be made of a material such as those mentioned above for the container. It can be produced for example by molding, stamping, engraving or mechanical erosion, etc.
  • the container can then be permanently fixed to the container to close it, for example by bonding, compression, plating or by any other means known to those skilled in the art and ensuring the strength and tightness required for the use thereof. . It can also be fixed on the container in a removable manner, always ensuring the strength and tightness required for the use thereof, so that the same container thus formed can be used for the successive immersion of devices or plates according to the invention, identical or different, and / or with different liquids of interest.
  • the material of the container, and, where appropriate, of its cover is, inside this one. ci (that is to say facing the substrate and its active surface) substantially non-wetting with respect to the liquid of interest.
  • the container comprises means for introducing and extracting the liquid of interest from said container, comprising at least two openings.
  • these openings When the container is closed, there is no limitation in the position, shape and function of these openings other than these: they must allow the introduction and then the extraction of the liquid of interest from the container; and they must be arranged in such a way that when the liquid of interest is introduced into the container, it covers the capture zone (s), and when the liquid of interest is extracted from the container, a drop of liquid d interest remains captive by catching area.
  • the liquid of interest can enter and then exit the container through two different openings. It can also enter and exit the container through only one of the two openings, a second opening used to authorize the extraction of the liquid of interest, either by letting the air called by the extraction pass, or by injecting through this second opening a gaseous fluid allowing the liquid of interest to be pushed out of the container.
  • the openings for introducing and extracting the liquid of interest from the container can be placed on the cover or on the walls of the container, for example by etching, stamping, molding, exposure to light for a photosensitive resin, mechanical drilling, etc.
  • the liquid of interest can be introduced into the container by any suitable means known to a person skilled in the art for injecting a liquid into a container, in particular those used in the field of on-chip laboratories and microsystems.
  • This injection means can be for example a syringe, a pipette, a micropipette, an injection pump, etc.
  • the extraction of the liquid of interest can be done by any suitable means known to a person skilled in the art for extracting a liquid from a container.
  • the means for extracting the liquid of interest can be made up of a pump for injecting a gaseous fluid through the inlet opening so as to extract the liquid of interest by driving it out of the container through the outlet opening.
  • the pump for injecting the gaseous fluid through the inlet opening of the container can then comprise a device for saturating the gaseous fluid injected with vapor of liquid of interest. This saturation makes it possible to avoid or limit the evaporation of the drop (s) captured by the catch area (s).
  • the pump for extracting the liquid of interest from the container can consist of a suction pump arranged so as to extract the liquid of interest from the container by sucking it up through the outlet opening.
  • the progress of the process allowing the capture of a drop of liquid of interest by capture zone of the device and the wafer of the invention using the work box of the invention can be diagrammed as follows: - filling total or partial of the container, or fluidic chamber, by the liquid of interest so as to cover the capture zone or zones, then - extraction of the liquid outside the chamber. Only the capture zone or zones each retain a drop of liquid of interest, the active surface being non-wetting.
  • the use of the device, the plate or the working box of the present invention can therefore successively involve one or more operation (s) which take place (s) collectively, with one or more liquids of interest, identical or different, then individual operations at the level of each of the drops formed.
  • a first operation called collective
  • the device of the invention allows the passage of a fluidic stream of liquid of interest, for example injected into the work box, to a matrix of drops, or micro-volumes, independent of each other.
  • methods of detection and / or chemical or biochemical reactions known to those skilled in the art can be implemented individually (individual operation), in parallel or successively, in each of the drops captured by the capture zones. In multi-step methods using the device of the invention, it does not.
  • each liquid of interest may contain one or more reagent (s) necessary, for example, to carry out one of the steps of a chemical or biochemical process, for example to manufacture the working area and / or to carry out analyzes.
  • the device of the invention solves other technical problems, compared to the techniques of the prior art, in the field of laboratories on a chip, biological chips and microsystems.
  • the prior art there exist in the prior art a number of methods of localized covalent grafting of biological molecules to functionalize surfaces of biological chips. This localization is generally carried out by chemical, photochemical or else electrical means.
  • the latter technique has the drawback of requiring large volumes of expensive reagents (pyrrole carrying the biological species).
  • the device of the present invention makes it possible to solve these numerous problems of the prior art. Indeed, it makes it possible to quickly and precisely functionalize surfaces of biological chips, which have become in the present invention the working zones, thanks to a rapid and precise localization of the liquid of interest on the working zone or zones. , and precise control of the densities of immobilized probes.
  • the volumes of reagents used are much smaller due to the precise location of the reaction in the volume of the drops of reagents captured by the capture zones.
  • the device of the present invention makes it possible to work in microvolumes independent of each other, without cross contamination between the detection pads, which considerably increases the precision and the reproducibility of the analyzes.
  • the present invention allows inter alia an electrochemical or optical measurement in a confined medium, in the drop captured by the capture zone, but also a functionalization localized in the work zone by electrochemical or chemical means with expensive reagents (volume of reagents restricted to the real useful zone formed by the work zone surrounded by its capture zone according to the invention).
  • This invention currently finds its greatest interest in the case of a closed device, for example in laboratory applications on a chip and microsystems.
  • the at least one analyte to be detected can be chosen, for example, from biological or chemical molecules.
  • the biological molecules can be chosen, for example, from the group consisting of an enzyme, an enzyme substrate, an oligonucleotide, an oligonucleoside, a protein, a membrane receptor of a eukaryotic or prokaryotic cell, a virus, an antibody, an antigen.
  • the chemical molecule can be any molecule which must be analyzed qualitatively and / or quantitatively.
  • FIG. 1 schematically represent different devices in accordance with the present invention.
  • - Figure 3 shows schematically different embodiments of the device of the present invention.
  • - Figure 4 shows schematically a device of the invention in which the working area is an electrochemical microsystem.
  • - Figures 5a) and 5b) are two photographs of a device according to the invention, in which the working area is an electrochemical microcell: Figure 5a) before capturing a drop of liquid of interest, and Figure 5b) after capture of a drop of liquid of interest.
  • FIG. 6 is a graph showing the detection, at the level of a working zone, of a product of an enzymatic reaction within a drop captured by the capture zone corresponding to this working zone in a device according to the invention.
  • FIG. 7 shows cross sections of a possible embodiment of a work box according to the invention.
  • FIG. 8 shows cross sections of a schematic representation of different possible embodiments of a work box according to the invention, in particular it shows examples of arrangements of the inlet and outlet openings of the liquid interest in different work boxes in accordance with the present invention.
  • - Figure 9 is a schematic representation of a wafer according to the invention comprising several devices according to the invention arranged in a matrix.
  • Example 1 Manufacture of non-wetting active surfaces according to the invention
  • Si silicon
  • Si0 2 silicon oxide
  • a hydrophobic silane (1H, 1H, 2H, 2H perfluorodecyl-trichlorosilane) to make the surface hydrophobic.
  • the protocol is as follows: after treatment in a 3.5 M sodium hydroxide / water / ethanol mixture for 2 hours at room temperature to generate the silanol sites, the substrate is placed for 10 minutes at room temperature in an anhydrous toluene / silane mixture hydrophobic at 9 mM in silane concentration. it is then washed with toluene then acetone, then ethanol and finally cleaned with ultrasound for 5 minutes in ethanol. The substrate is then placed in an oven for 1 hour at 110 ° C. The contact angle measured with water is 110 °.
  • Example 2 fabrication of a capture zone made up of a support material placed on the active surface on an Si substrate with a layer of Si0 2 of 300 nm, realization of standard steps for a person skilled in the art of microelectronics: deposition of 300 nm of platinum (Pt) by sputtering; photolithography in a photosensitive resin with opening of a circular pattern connected to a current arrival band; in a plasma reactor, complete ion etching of Pt in areas without resin; removing the resin in a nitric acid bath; - in a plasma reactor, chemical vapor deposition of 500nm of Si0 2 ; photolithography in a photosensitive resin with opening of the circular pattern; in a plasma reactor, complete ion etching of 500nm of SiO 2 in areas without resin; and removing the resin in a nitric acid bath.
  • FIG. 3a is a schematic representation of a circular capture zone made up of a support material and surrounding a work zone.
  • Example 3 fabrication of a capture zone made up of black silicon on an Si substrate (all these steps are very well known to those skilled in the art of microelectronics): photolithography in a photosensitive resin with opening of a pattern in crown; - in a plasma reactor, reactive ion etching of approximately 3 ⁇ m of silicon according to the protocol described in document [11] to form black silicon; - cleaning of the surface at the end of etching by passage through a Plassys MDS 150 plasma reactor (company Plassis, France) with the following conditions: power 500W, reaction time 4 minutes, pressure 21.33 Pa (160 mTorrs), flow rate oxygen 25cm 3 / min., room temperature; and removing the resin in a nitric acid bath.
  • FIG. 1 and 2 schematically show different catch areas formed around their work area (s). The fine structuring was carried out so as to create a strip of black silicon, open or closed, which constitutes the capture zone (Zc), around a zone intended to form the work zone (Zt).
  • Zc capture zone
  • Zt work zone
  • a capture area is arranged around two (right) or four (left) work areas. The engraved area does not require any other chemical modification.
  • This device of the invention is intended to be used with liquids of aqueous interest.
  • EXAMPLE 4 Manufacture of a Capture Zone in the Form of a Capture Electrode by Wetting
  • Example 4 On an Si substrate with a Si0 2 layer of 300 nm, the following steps are carried out: ⁇ ) The same steps as in Example 2 are carried out to provide a electrode (support material) on the active surface. ⁇ ) Realization of the non-wetting active surface vis-à-vis the liquid of interest on the entire substrate to make it hydrophobic as in Example 1. The electrode is then cleaned chemically with a sodium hydroxide solution / water / ethanol. To do this, a drop of a 3.5 M sodium hydroxide / water / ethanol mixture is placed on the electrodes for 2 hours at room temperature. The electrodes are then washed with water and then dried.
  • FIG. 3a is a schematic representation of a device according to the invention obtained using the protocol of this example.
  • the capture zone (Zc), surrounding the work zone (Zt) is formed by an electrode covered with a polypyrrole carrying wetting functions (alcohol functions).
  • Example 5 Manufacture of a work area functionalized by a probe according to the invention
  • a chip comprising four electrodes is manufactured and used.
  • On a Si substrate with a 300 nm Si0 2 layer carrying out standard steps for a person skilled in the art of microelectronics: deposition of 300 nm of platinum (Pt) by sputtering; - photolithography in a photosensitive resin with opening of the patterns of the microcell, of the capture electrode and of the current arrival bands; in a plasma reactor, complete ion etching of Pt in areas without resin; removing the resin in a nitric acid bath; in a plasma reactor, chemical vapor deposition of 500nm Si0 2 ; - photolithography in a photosensitive resin with opening of the patterns of the electrodes of the microcell and of the capture electrode / - in a plasma reactor, complete ion etching of 500nm of SiO 2 in areas without resin; and - removal of the resin in a ni
  • a reference electrode Ag / AgCl / Cl " (Rf) is also present.
  • This electrode is obtained by depositing silver on platinum with the following protocol: - preparation of 10 ml of solution containing 0.2 M AgN0 3 , Kl 2 M, Na 2 S 2 0 3 0.5 mM; - a potential of -0.65 V vs DHW (saturated calomel electrode) is imposed for 90 seconds (followed by chronoamperometry) on the reference electrode. gray / white is obtained. The working area is then rinsed with water; and the working area with the previously modified electrode is immersed in a 0.1 M HCl solution and a potential of 0.5 V is imposed.
  • vs DHW for 30 seconds to chlorinate the silver deposit, the substrate is then rinsed with water. All of the working areas were silanized with a hydrophobic silane according to the protocol described in Example 1.
  • the hydrophilic barrier is produced on the capture electrode according to the protocol described in Example 4.1- ( ⁇ ).
  • the counter electrode (CE) is then functionalized with a conductive pyrrole / pyrrole copolymer functionalized in position 1 by the biological function (here a probe oligonucleotide) [5].
  • the electropolymerization is located on the counter electrode of the working area.
  • the probe oligonucleotide is hybridized with a target oligonucleotide (100 ⁇ M) carrying an enzymatic marker (HRP "Horse Radish Peroxidase") in a buffer (1 M NaCl / 10 mM Tris / 1 mM EDTA / Triton X100 0.05%).
  • HRP Hapse Radish Peroxidase
  • a buffer (1 M NaCl / 10 mM Tris / 1 mM EDTA / Triton 0.05%).
  • the development solution OPD + H 2 0 2 + phosphate-citrate buffer 50 mM
  • a fraction of liquid is well left in a localized manner on the work area as shown in the photographs in FIG.
  • FIG. 4 is a schematic representation of an electrochemical microcell of a device according to the invention obtained using the protocol of this example.
  • the working zone consists of the measuring electrode or working electrode (WE), the conductive polymer carrying the oligonucleotide (Po) deposited on the counter electrode (CE) and the capture zone (Zc) formed by the outermost electrode on which the polymer carrying the alcohol functions has been deposited (Pm).
  • WE measuring electrode or working electrode
  • Mo conductive polymer carrying the oligonucleotide
  • CE counter electrode
  • Zc capture zone formed by the outermost electrode on which the polymer carrying the alcohol functions has been deposited
  • Example 6 Localized Functionalization of Chip Working Zones According to the Invention with an Expensive Reagent
  • a system with four electrodes whose surface has been made hydrophobic as in Example 5.
  • the hydrophilic barrier and the grafting of the biological molecule are produced with the following protocol: A) production of the hydrophilic barrier which constitutes the capture zone: the barrier hydrophilic is carried out as in Example 4.1. B) introduction onto the component of the electrolytic solution containing the pyrrole, the pyrrole functionalized by an oligonucleotide and the support electrolyte LiC10 4 0.1 M.
  • the solution is aspirated thus leaving a drop of the electrolytic solution well located in the area of work (electrochemical microcell) giving the same result as that shown in the right photograph of FIG. 5.
  • the electropolymerization is then carried out on the counter-electrode under potentiostatic conditions (1 V vs Ag / AgCl / Cl " ) for 2 seconds
  • the polypyrrole carrying the oligonucleotide is thus deposited on the working area only.
  • the device of the invention therefore makes it possible to save reagents, in particular during the functionalization of a large area comprising several independent electrochemical devices distributed over this surface, and therefore also for confining the reagent on the electrode area.
  • a complete chip according to the invention It is also possible to thus produce a system in which the wetting strip (capture zone) surrounds a set of electrochemical microcells, that is to say several work zones, for example as in FIG. 2.
  • Example 7 Manufacture of a box according to the invention and operation of this box
  • FIG. 7 is a schematic representation of the box as obtained in this example.
  • FIG. 8 shows schematic representations of the boxes which can be obtained according to the protocol described in this example.
  • Bl, B2 and B3 represent three types of boxes according to the invention with inlet (o) and outlet (s) openings placed differently.
  • Sb, Sa, Zc, Zt have the same meaning as in the above figures.
  • the different elements which constitute the box of the invention are represented in the same way in the three diagrams.
  • Figure 9 is a schematic representation seen from above of a wafer P according to the invention which is used to manufacture a box according to the invention.
  • This plate includes 81 capture zones and corresponding work zone arranged on a non-wetting active surface in accordance with the present invention.
  • FIG. 7 shows the operation of the box Bl of Figure 8.
  • the liquid of interest E is injected into the box (7a) through one of the openings (o) until filling (7b), then extracted by the other opening (s).
  • the means of injection used is a syringe, and the means of extraction used is a syringe.
  • Filling the box is not compulsory, the main thing is that the different catching areas are covered by the liquid of interest.
  • This example shows that a matrix of drops (g) well located on the different capture zones is obtained using this device according to the present invention. List of references
  • WO 99/03684 Eapen Saji et al.
  • Azek et al. Analytical Biochemistry, 2000, 284, 107-113.
  • WO 00/36145 French Atomic Energy Commission.
  • WO 02/090573 Infineon.

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Abstract

La présente invention se rapporte à un dispositif de travail caractérisé en ce qu'il comprend une surface active (Sa) sensiblement non mouillante vis-à-vis d'un liquide d'intérêt ; au moins une zone de capture (Zc) localisée d'une goutte dudit liquide, formée sur ladite surface active ; au moins une zone de travail (Zt) arrangée avec une zone de capture de telle maniere que la zone de travail soit recouverte au moins partiellement par la goutte du liquide lorsque celle-ci est capturée par ladite zone de capture ; et des moyens permettant de laisser une goutte dudit liquide sur ladite zone de capture. Ce dispositif permet notamment de former des matrices à haute densité de gouttes dudit liquide sur une surface, dans le but notamment de pratiquer des réactions chimiques ou biochimiques et/ou d'analyser le liquide d'intérêt au niveau de chaque goutte. Elle trouve par exemple une application dans les puces biologiques.

Description

DISPOSITIF DE TRAVAIL COMPRENANT UNE ZONE LOCALISEE DE CAPTURE D'UNE GOUTTE D'UN LIQUIDE D'INTERET
Domaine technique La présente invention se rapporte à un dispositif de travail, à une plaquette, à un système et à une puce comprenant des zones localisées de capture d'une goutte d'un liquide d'intérêt. La présente invention permet d'obtenir une matrice de gouttes localisées, à haute densité, sur une surface, à partir d'un liquide d'intérêt. Elle permet par exemple d'assurer facilement la transition d'une chambre fluidique fermée et remplie par un liquide d'intérêt à une matrice de gouttes, ou micro-volumes, parfaitement localisées sur une surface placée dans ladite chambre fluidique, lorsque le liquide d'intérêt est évacué de ladite chambre fluidique. Par matrice de gouttes, on entend un arrangement déterminé desdites gouttes, sans qu'une forme géométrique particulière dudit arrangement soit exigée. La matrice de gouttes peut être ronde, carrée, polygonale et même aléatoire, l'essentiel étant que les gouttes formées soient disposées de manière localisée et déterminée sur la surface conformément à l'objectif atteint par la présente invention. Par localisée, on entend circonscrite, individualisée et distincte des autres gouttes capturées volontairement sur ladite surface grâce au dispositif de l'invention. Chacune des gouttes peut être soumise à une ou plusieurs opérations destinées à analyser qualitativement et/ou quantitativement un ou plusieurs analyte(s) présent (s) ou susceptible (s) d'être présent (s) dans le liquide d'intérêt, par exemple une molécule, un oligonucléotide, une protéine, etc. L'analyse des analytes dans la goutte peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier pour effectuer des analyses, en particulier dans un volume de liquide aussi réduit qu'une goutte. Il peut s'agir des techniques d'analyse utilisées sur les puces biologiques. L'analyse peut ou non faire intervenir la surface du dispositif de l'invention recouverte par la goutte, suivant la mise en œuvre de la présente invention. Chacune des gouttes forme un volume dans lequel des réactions chimiques ou biochimiques peuvent être réalisées . Toute réaction chimique ou biochimique connue de l'homme du métier peut être réalisée dans ce volume. Ces réactions peuvent ou non faire intervenir la surface du dispositif de l'invention recouverte par la goutte, suivant la mise en œuvre de la présente invention. Lorsque ces réactions font intervenir la surface du dispositif de l'invention recouverte par la goutte, elles peuvent le faire avec une seule goutte ou plusieurs gouttes déposées successivement sur cette surface, ces gouttes successives étant constituées d'un seul ou de plusieurs liquides d' intérêt différents suivant la mise en œuvre de la présente invention. Un exemple de réactions chimique s faisant intervenir deux liquides d' intérêt différents sur un dispositif de l'invention est le suivant : au moyen d'une goutte d'un premier liquide d'intérêt, dépôt localisé d'un film d'un polymère organique sur la surface couverte par cette goutte, puis, au moyen d'une goutte d'un deuxième liquide d'intérêt, fonctionnalisation du film polymère organique déposé sur cette surface. Selon la présente invention, analyse (s) et réaction (s) chimique (s) /biochimique (s) peuvent être mises en œuvre de manière exclusive sur un dispositif conforme à la présente invention (analyse ou réaction) , ou de manière complémentaire. Dans ce dernier cas, cela peut être simultanément (réaction et analyse) ou successivement (réaction puis analyse ou analyse puis réaction) . En outre, plusieurs analyses et/ou plusieurs réactions peuvent se succéder. Par exemple, le dispositif de la présente invention peut avantageusement intervenir, d'une part dans la fabrication d'une carte, ou laboratoire sur puce (par exemple par des réactions chimiques permettant de déposer un polymère, puis de le fonctionnaliser) (« lab-on-chip ») , dans laquelle toutes les étapes nécessaires aux analyses qualitatives et quantitatives d'un liquide d'intérêt sont intégrées : manipulation de fluide, réactions chimiques et/ou biochimiques, puce de détection optique, électrique et/ou chimique, etc. ; et d'autre part dans l'utilisation de cette carte, ou laboratoire sur puce, pour effectuer des analyses qualitatives et/ou quantitatives dans des gouttes d'un liquide d'intérêt à analyser (réaction (s) chimique (s) /biochimique (s) et analyse). Compte tenu de ces très nombreuses applications, le dispositif de la présente invention est appelé dans la présente « dispositif de travail ». Dans la présente description, les références entre crochets [ ] renvoient à la liste de références annexée.
Art antérieur Aucune antériorité n' a été relevée sur le principe de la présente invention. Toutefois, selon les applications envisagées, cette invention se rapproche de plusieurs domaines précis : formation de gouttes, travail en micro-volume (s) , matrices à haute densité de gouttes ou plots. La formation de zones localisées pour isoler une phase liquide est répandue dans le domaine des puces biologiques , et notamment des puces à ADN. Pour ces applications, le volume réactionnel est souvent très réduit pour économiser les produits biologiques et les réactifs . Pour la formation de gouttes localisées et de matrices à haute densité de gouttes, les sociétés Protogene Laboratories Inc. [1] et Affymetrix Inc. [2] ont séparément développé des méthodes pour créer des zones hydrophiles au milieu d'une surface hydrophobe. La phase aqueuse d'intérêt est ensuite déposée sous forme de micro-gouttes par un système de dispense automatisé. Ces méthodes conduisent à la formation reproductible de gouttes et de matrices à haute densité de plots ou de gouttes . Cependant, elles nécessitent toutes l'utilisation d'un système de dispense de gouttes incluant un dispositif de déplacement et d'alignement précis, ainsi qu'un dispositif pour l'alimentation en liquide. Le coût de cet appareillage est élevé. En outre, la densité maximale des matrices est limitée par une combinaison entre la taille des gouttes dispensées et le pas minimal inter-plots du système de dispense. Enfin, les zones hydrophiles décrites dans ces documents sont toujours des disques dont la surface représente également la zone de travail. De plus, ces systèmes ne sont pas utilisables dans le cadre d'une mesure ou d'une fonctionnalisation par voie électrique car ces dispositifs n'ont pas d'électrode. Pour la formation de matrices à haute densité de micro-cuvettes, deux exemples significatifs peuvent être cités : la formation d'un réseau de cuvettes micro-fabriquées par gravure dans une plaque de silicium pour réaliser des amplifications d'ADN par PCR en micro-volumes de quelques picolitres, et la formation de puits ou de canaux par photolithographie sur des résines photosensibles déposées sur un substrat en plastique [3]. Avec ces techniques, le nombre de puits varie de 100 à 9600 puits, avec des diamètres de 60 à 500 μm et des profondeurs de 5 à 300 μm. Cependant, les bords de ces cuvettes ne laissant pas de séparation physique entre la phase liquide au sein de la cuvette et celle à l'extérieur, autorisent donc des connexions entre les cuvettes, et donc des contaminations entre elles . Une des applications les plus importantes de la présente invention est la détection électrique ou électrochimique de molécules biologiques présentes dans un liquide d'intérêt avec amplification du signal par accumulation enzymatique . En ce qui concerne la détection électrique ou électrochimique de tests biologiques, un grand nombre de systèmes de détection électrique ou électrochimiques décrits dans la littérature ne permet pas de descendre sous le nanomolaire en termes de limite de détection, limitation souvent due au faible nombre d'électrons générés par chaque hybride. Les systèmes faisant intervenir une accumulation enzymatique permettent d'abaisser cette limite de détection aux environs du pico olaire du fait de l'amplification élevée du nombre d'espèces rédox à détecter présentes dans le milieu réactionnel [4] . Cependant, cette méthode d'amplification engendre un problème pour les systèmes multiplots connus actuellement car le composé rédox diffuse et peut ainsi contaminer les plots voisins. Pour éviter ce problème, il est donc nécessaire de confiner chaque plot. Dans ce but, la plupart du temps, l'utilisation de structures tridimensionnelles (utilisation de compartiments) est recommandée dans la littérature. Par exemple, Infineon [6] propose des murs en polymères et un système de migration des molécules par des forces électriques, de manière à les confiner dans un volume défini et à éviter ainsi la contamination inter-plots . Malheureusement, des problèmes de remplissage fluidique peuvent être rencontrés avec ce genre d' approche lorsqu'on souhaite par exemple travailler en veine liquide très fine. Là aussi, un dispenseur de goutte devient indispensable. II existe donc un réel besoin d'un dispositif permettant d'obtenir aisément une matrice de gouttes haute densité à partir d'un liquide d'intérêt, utilisable sans aucun appareillage de dispense de gouttes, facile à fabriquer, permettant d'éviter efficacement des contaminations entre les gouttes, et qui peut être utilisé de manière très souple avec tous les procédés actuellement connus de l'homme du métier pour analyser collectivement ou individuellement des micro-volumes, par exemple sur un laboratoire sur puce, qu'il s'agisse d'un procédé chimique, électrique ou optique ou d'une combinaison de ces procédés.
Exposé de l' invention La présente invention répond précisément à ce besoin, et à d'autres encore, expliqués ci -dessous, en fournissant un dispositif de travail comprenant : - un substrat comportant une surface active sensiblement non mouillante vis-à-vis d'un liquide d'intérêt, - au moins une zone de capture localisée d'une goutte dudit liquide d'intérêt formée sur ladite surface active, - au moins une zone de travail arrangée avec la zone de capture de telle manière que la zone de travail soit recouverte au moins partiellement par la goutte du liquide d'intérêt lorsque celle-ci est capturée par ladite zone de capture, - des moyens d'approvisionnement en liquide d'intérêt permettant de laisser une goutte dudit liquide d'intérêt sur ladite zone de capture. La présente invention répond encore à ce besoin, en fournissant une plaquette de travail comprenant plusieurs dispositifs de travail conformes à la présente invention, identiques ou différents dans leur mode de réalisation. La présente invention répond encore à ce besoin en fournissant une puce biologique comprenant un dispositif de travail selon l'invention ou une plaquette selon l'invention. La présente invention répond encore à ce besoin en fournissant un système comprenant un ou plusieurs dispositif (s) de travail selon l'invention. La présente invention répond encore à ce besoin en fournissant une boîte de travail comprenant : - un conteneur comprenant des moyens pour l'introduction d'un liquide d'intérêt dans ce conteneur et d'extraction du liquide d'intérêt de ce conteneur, - un dispositif de travail selon l'invention ou une plaquette selon l'invention, placé (e) dans ledit conteneur, les moyens d' introduction et d' extraction du liquide d'intérêt du conteneur étant disposés de telle manière que lorsque le liquide d'intérêt est introduit dans le conteneur, il couvre la, au moins une, zone (s) de capture, puis lorsque le liquide d'intérêt est extrait du conteneur, une goutte dudit liquide d'intérêt reste captive par ladite zone de capture. La présente invention répond encore à ce besoin en fournissant un système comprenant une boîte de travail selon l'invention. Dans le contexte de la présente invention, un liquide est dit « d' intérêt » dès lors que ce liquide est destiné à être capturé par une ou plusieurs zone de capture d'un dispositif selon l'invention, par exemple pour former une matrice de gouttes de ce liquide. Par « liquide d'intérêt », on entend tout liquide suscept ible de nécessiter une disposition en matrice de gouttes sur un support, par exemple dans un but analytique et/ou chimique et/ou biochimique. Par « but chimique et/ou biochimique », on entend toute réaction chimique et/ou biochimique qui peut être réalisée dans un liquide. Par « but analytique », on entend toute analyse qualitative et/ou quantitative qui peut être réalisée dans un liquide. Le liquide d'intérêt peut être organique ou aqueux. Il peut s'agir d'un quelconque des liquides actuellement manipulés en laboratoire ou dans l'industrie, par exemple sur des laboratoires sur puce. Il peut s'agir par exemple d'un liquide choisi parmi une solution, un solvant, un réactif, un échantillon, un extrait cellulaire, un prélèvement provenant d'un organisme animal ou végétal, un prélèvement effectué dans la nature ou dans l'industrie, etc. Il peut s'agir d'un liquide biologique ou chimique. Ce liquide d'intérêt peut être un liquide dilué, si nécessaire, pour son utilisation avec le dispositif de la présente invention, comme cela peut se faire sur les laboratoires sur puce. Un produit solide peut être mis en solution pour constituer un liquide d' intérêt au sens de la présente invention. Ce produit solide peut être choisi par exemple parmi un produit chimique ou biochimique, un réactif, un matériau à analyser, un prélèvement provenant d'un organisme animal ou végétal, un prélèvement effectué dans la nature ou dans l'industrie, etc. L'homme du métier connaît la manipulation de tels produits et liquides d'intérêt. Le substrat du dispositif de travail de l'invention constitue en fait le support sur lequel est formée la surface active, la, au moins une, zone de capture, et la, au moins une, zone de travail. Il peut être constitué de tout matériau approprié pour mettre en œuvre la présente invention. Il peut s'agir par exemple d'un des matériaux de base utilisés pour fabriquer les laboratoires sur puce, puces biologiques, microsystèmes, etc. Il peut s'agir par exemple d'un matériau choisi dans le groupe constitué du silicium ; de l'oxyde de silicium ; du verre ; du nitrure de silicium ; des polymères, par exemple des polymères organiques tels que ceux choisis dans le groupe comprenant les polycarbonates, les polydimethylsiloxanes, les polymethylmetacrylate s, les polychlorobiphényles et les copolymères de cyclooléfines ; et d'un métal ou d'un alliage métallique, par exemple choisi parmi Al, Au, ou l'acier inox. Par surface active, on entend surface du substrat sur laquelle est formée la, au moins une, zone de capture et la, au moins une zone, de travail arrangée avec ladite zone de capture. Selon l'invention, le substrat peut comporter une ou plusieurs surfaces actives. Selon l'invention, chaque surface active peut comprendre plusieurs zones de captures arrangées respectivement avec une ou plusieurs zone (s) de travail. La surface active peut être constituée de tout matériau sensiblement non mouillant vis-à-vis du liquide d'intérêt et approprié pour mettre en œuvre la présente invention. En effet, le fonctionnement du dispositif de la présente invention repose en partie sur le fait que la surface active ne retient pas ou très peu le liquide d'intérêt, ce qui permet un démouillage total, facile, sans rétention de liquide d'intérêt sur la surface, et ceci sans séchage. De préférence la surface active forme un angle de contact avec le liquide d'intérêt de au moins 60°. Ainsi, les gouttes de liquide d'intérêt sont capturées sélectivement et exclusivement par la, ou les, zone (s) de capture, et sont circonscrites à ces zones, ce qui évite tout problème de contamination entre les gouttes, et donc entre les zones de travail . Le matériau de la surface active est donc choisi en fonction du liquide d'intérêt à partir duquel une matrice de gouttes doit être formée, mais aussi en fonction du substrat, et en fonction des zones de travail et de capture. Il peut être disposé sur le substrat par modification chimique ou par dépôt. Il peut s'agir également du substrat lui-même s'il est constitué d'un matériau à caractère sensiblement non mouillant vis-à-vis du liquide d'intérêt. Dans ce dernier cas, aucune modification chimique supplémentaire n'est requise. Par exemple, lorsque le liquide d'intérêt est aqueux, le matériau formant la surface active est avantageusement hydrophobe. Par exemple, dans les exemples de matériaux précités constituant le substrat, la surface du substrat peut être rendue non mouillante, ici hydrophobe, par modification chimique, par exemple par silanisation avec un silane porteur de fonctions hydrophobes, par exemple 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorodécyl- trichlorosilane. Il peut s'agir par exemple aussi d'un dépôt de téflon liquide sur plateau tournant ; d'une silanisation en phase gazeuse de silane hydrophobe ; de l'utilisation de silane hydrocarboné, par exemple du type octadécyltrichlorosilane. Les matériaux et procédés utilisables pour la mise en œuvre de telle s modifications chimiques sont connus de l'homme du métier. Un exemple de réalisation est donné ci-dessous. Le traitement permettant de rendre la surface du substrat non mouillante vis-à-vis du liquide d'intérêt peut être réalisé, avant ou après la formation de la, ou des, zone (s) de capture et/ou de la, ou des, zone (s) de travail correspondantes. Ces dernières seront protégées au cas où il est réalisé après celles-ci. La forme et la taille de cette surface active, et donc aussi du substrat sur lequel elle est formée, n'ont pas d'importance pour le fonctionnement du dispositif de l'invention. Elles peuvent être déterminées par exemple en fonction du nombre de zones de capture couplées à des zones de travail formées sur celle-ci, et éventuellement de leur disposition sur cette surface, ainsi qu'en fonction de la taille désirée du dispositif tel qu'il sera utilisé et des spécifications de coût. Toutefois, afin d'éviter des rétentions non prévues du liquide d'intérêt sur la surface, de préférence, elle est choisie plane. Par exemple, la surface active peut avoir une forme et une taille comparables aux plaquettes utilisées pour la fabrication de laboratoires sur puce et des microsystèmes d' analyse et de détection connus de l'homme du métier. Selon l'invention, la surface active, ou le substrat sur laquelle cette surface est formée, est modifié par structuration ou traitement de surface afin de créer les zones de capture et de travail du dispositif de l'invention. Les zones de capture sont des zones très localisées, mouillantes vis-à-vis du liquide d'intérêt, c'est-à-dire ayant une forte affinité pour ce liquide d'intérêt. Le terme « localisé » est défini ci-dessus. Par exemple, dans une utilisation basique du dispositif, en faisant ruisseler un peu de liquide d'intérêt sur la surface active, la zone de capture capture, ou retient, une goutte de liquide d'intérêt, alors que la surface active, sensiblement non mouillante vis-à-vis du liquide d'intérêt, ne retient pas ou très peu de liquide d'intérêt . En cessant le ruissellement, seule la goutte de liquide d'intérêt retenue localement par la zone de capture reste sur la surface active. Selon l'invention, la, au moins une, zone de capture peut être une zone de capture chimique, électrique ou physique d'une goutte de liquide d'intérêt . Par exemple, suivant un premier mode de réalisation du dispositif de l'invention, la zone de capture est constituée d'un matériau support qui est disposé de manière déterminée sur ladite surface active ou sur le substrat et qui, si nécessaire, peut être modifié chimiquement pour le rendre mouillant vis-à-vis du liquide d'intérêt, par exemple par greffage sur celui-ci d'une fonction chimique mouillante vis-à-vis dudit liquide d'intérêt. Par exemple, ce matériau support peut être constitué d'un matériau choisi dans le groupe constitué du silicium, de l'oxyde de silicium (Si02) ; du verre ; du nitrure de silicium (Si3N) ; des polymères, par exemple des polymères organiques tels que ceux choisis dans le groupe comprenant les polycarbonates, les polydimethylsiloxanes, les polymethylmetacrylate s, les polychlorobiphényles et les copolymères de cyclooléfines ; et d'un métal ou d'un métal ou d'un alliage métallique, par exemple choisi parmi Al, Au, ou l'acier inox. Par exemple, la fonction chimique mouillante vis-à-vis d'un liquide d'intérêt aqueux peut être choisie dans le groupe constitué d'une fonction alcool, alcoolate, acide carboxylique, carboxylate, acide sulfonique, sulfonate, oxyamine, hydrazine, aminé et ammonium. A titre d'exemple, les deux procédés suivants (1) et (2) peuvent être utilisés pour fabriquer ce type de zone de capture :
(1) Sur un substrat choisi parmi les matériaux précités (par exemple isolant) on peut réaliser les étapes suivantes : i) Dépôt par évaporation ou pulvérisation d'une ou de plusieurs couches de métaux (support) choisis parmi Ti, Pt, Au, Pd, Ni, Al, etc. avec comme dernière couche obligatoire Au. Cependant, si la zone de travail est une microcellule électrochimique (voir ci-dessous) , les électrodes de cette microcellule seront préférentiellement pas en or. ii) Définition de motifs dans la couche métallique par photolithographie puis gravure des métaux, par exemple dans un bain de gravure chimique, ou en phase gazeuse avec un plasma, pour former une zone de capture. iii) Dépôt d'un matériau isolant (Si02 ou Si3N) sur tout le substrat puis définition de motifs par photolithographie et gravure localisée dans un bain de gravure chimique ou en phase gazeuse avec un plasma pour enlever le matériau isolant sur les zones devant être en contact avec le liquide d'intérêt. iv) Réalisation de la surface active non mouillante vis-à-vis du liquide d'intérêt sur l'ensemble du substrat, par exemple pour le rendre hydrophobe, par silanisation du Si02 ou du Si3N4 avec un silane porteur de fonctions hydrophobes, par exemple avec le 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorodécyl-trichlorosilane ; puis la zone de capture obtenue est nettoyée, par exemple par voie chimique, par exemple avec une solution de NaOH ; par voie électrochimique, par exemple par application d'un potentiel de 1,2V pendant 10s ; ou par plasma oxygène. La zone de travail si elle est déjà formée sur la surface est ensuite nettoyée si nécessaire par les mêmes moyens que ceux utilisés pour la zone de capture . v) Réalisation de la barrière hydrophile sur la zone de capture, ici en or, par physisorption de thiols, par exemple de la manière décrite dans le document [10], porteurs de fonctions mouillantes pour le liquide d'intérêt auquel est destiné ce dispositif.
(2) Lorsque le substrat est choisi parmi Si02 ou Si3N4, on peut aussi, par exemple, réaliser les étapes suivantes : x) Réalisation de la surface active non mouillante vis-à-vis du liquide d'intérêt sur l'ensemble du substrat, par exemple pour le rendre hydrophobe, par silanisation du Si02 ou du Si3N4 avec un silane porteur de fonctions hydrophobes, par exemple avec le 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorodécyl-trichlorosilane, y) Définition de motifs par photolithographie puis destruction du silane hydrophobe par voie chimique, par exemple au moyen d'une solution de NaOH, ou au moyen d'un plasma pour former la zone où sera formée la zone de capture (ou bande mouillante) , z) Réalisation de la zone de capture par exemple par silanisation avec un silane porteur de fonctions mouillantes pour le liquide d'intérêt auquel est destiné ce dispositif, par exemple avec des silanes porteurs de fonctions mouillantes pour les solutions aqueuses décrites précédemment par exemple le silane μ-aminopropyl triéthoxysilane. Le document [9] expose des procédés utilisables. Par exemple, suivant un deuxième mode de réalisation du dispositif de l'invention, en particulier lorsque le dispositif de l'invention est destiné à être utilisés avec des liquides d'intérêt aqueux et lorsque la surface active ou le substrat est à base de silicium, la zone de capture peut être constituée de silicium noir hydrophile, qui peut être formé très facilement sur une telle surface par gravure . La zone gravée devient alors particulièrement mouillante vis-à-vis d'un liquide d'intérêt aqueux. La zone gravée ne nécessite pas d'autre modification chimique pour être mouillante. Ce mode de réalisation est donc très économique. Le document [11] expose un exemple de protocole de laboratoire pouvant être utilisé pour fabriquer ce type de zones de capture. Par exemple, suivant un troisième mode de réalisation du dispositif de la présente invention, la zone de capture peut être une électrode de capture par mouillage. Suivant ce mode de réalisation de la présente invention, la zone de capture, ici une électrode, peut être constituée par exemple d'un matériau choisi dans le groupe constitué des métaux nobles, par exemple Au, Pt, Pd, Ti, Ni, Al, etc., ou un alliage de métaux nobles ; de carbone ; de graphite ; et d'oxyde d'indium et d'étain ( ITO) ; ledit matériau étant rendu mouillant par électrodéposition sur celui- ci d'un polymère conducteur d'électricité sur lequel est fixée une fonction chimique mouillante vis-à-vis du liquide d'intérêt. Selon l'invention, le polymère conducteur d'électricité peut être un des polymères utilisés dans la fabrication des laboratoires sur puce. Il peut être choisi par exemple dans le groupe constitué du polypyrrole, de la polyaniline, du polyazulene, d'un polythiophène, du polyindole, du polyfurane, et du polyfluorène. La fonction chimique mouillante peut être par exemple une des fonctions chimiques mouillantes citées ci-dessus. Sa fixation sur le monomère avant polymérisation ou sur le polymère une fois qu'il est formé peut être effectuée par les techniques classiques de chimie. Un exemple de procédé de fabrication de ce type de zone de capture peut être résumé ainsi : (3) Sur un substrat (isolant) choisi parmi les matériaux tels que Si02 ou Si3N4, verre, polymère, on peut réaliser les étapes suivantes : μ) Dépôt par évaporation ou pulvérisation d'une ou de plusieurs couches de métaux (support) choisis parmi les métaux précités, avec comme dernière couche un métal choisi parmi Pt et Au ou tout autre métal noble ou un alliage de ces métaux. Cela peut également être un dépôt de carbone, graphite, ITO, etc. β) Définition de motifs dans la couche métallique par gravure des métaux, par exemple dans un bain de gravure chimique, ou en phase gazeuse avec un plasma, pour former une ou plusieurs électrode (s) et une ou plusieurs bande (s) métallique (s) d'arrivée de courant . μ) Protection de la ou des bande (s) métallique (s) d'arrivée du courant par dépôt d'un matériau isolant (Si02 ou Si3N4) puis définition de motifs par photolithographie puis gravure localisée dans un bain de gravure chimique ou en phase gazeuse avec un plasma pour enlever le matériau isolant sur les zones devant être fonctionnalisées ou en contact avec le liquide d'intérêt. μ) Réalisation de la surface active non mouillante vis-à-vis du liquide d'intérêt sur l'ensemble du substrat, par exemple pour le rendre hydrophobe, par silanisation du Si02 ou du Si3N avec un silane porteur de fonctions hydrophobes, par exemple avec le 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorodécyl-trichlorosilane. Les électrodes sont ensuite nettoyées, par exemple par voie chimique, par exemple avec une solution de NaOH ; par voie électrochimique, par exemple par application d'un potentiel de 1,2V pendant 10s ; ou par plasma. La zone de travail si elle est déjà formée sur la surface est ensuite nettoyée si nécessaire par exemple par les mêmes moyens utilisés pour l'électrode. μ) Réalisation de la barrière hydrophile sur l'électrode la plus externe dans le cas où on a plusieurs électrodes par dispositif selon l'invention (cas où la zone de travail est une microcellule électrochimique) par électropolymérisation en conditions potentiostatiques, galvanostatiques ou en balayages récurrents d'un polymère conducteur d' électricité porteur de fonctions mouillantes pour le liquide d'intérêt auquel est destiné le dispositif. Des exemples de polymères et fonctions mouillantes sont donnés ci-dessus.
Par exemple, suivant un quatrième mode de réalisation du dispositif de la présente invention, la zone de capture peut être une électrode de capture par électro-activation de fonctions chimiques . Ce mode de réalisation est sensiblement identique au troisième mode de réalisation précité, mis à part que les fonctions chimiques mouillantes utilisées sont choisies de telle manière qu'elles puissent être électro- activées ou électro-désactivées . Ainsi, par exemple dans le cas de fonctions chimiques électro-activables, il est nécessaire d'appliquer un courant électrique à l'électrode constituant la zone de capture pour que les fonctions chimiques mouillantes de cette électrode soient activées et capturent une goutte du liquide d'intérêt. En interrompant l'application du courant électrique, les fonctions mouillantes sont désactivées, et la goutte de liquide d'intérêt est relâchée. Ce mode de réalisation permet avantageusement de placer sur les zones de travail, après la première goutte de liquide d'intérêt, une goutte d'un deuxième liquide d'intérêt (et ainsi de suite) , par exemple de rinçage ou contenant des réactifs chimiques permettant de réaliser une analyse ou une modification chimique d'analytes ou d'éléments présents à l'origine dans le premier liquide d'intérêt puis liés à des sondes fixées sur la zone de travail. La zone de travail peut alors constituer un véritable microréacteur sur lequel des étapes successives d'un protocole utilisant différentes solutions peut être mises en œuvre. Suivant un cinquième mode de réalisation, la zone de capture peut être une zone de capture par électro-mouillage. Dans ce mode de réalisation, l' électro-mouillage permettant de capturer une goutte de liquide d'intérêt consiste à appliquer un potentiel entre deux électrodes, dont une est couverte d'un matériau isolant et non mouillant. Une goutte de liquide placée entre ces deux électrodes va venir mouiller la surface non mouillante. Dans les systèmes actuels, avec deux électrodes en vis-à-vis, il est possible de retenir un liquide localement grâce à ce système. Le document référencé [7] expose des protocoles utilisables pour mettre en œuvre ce cinquième mode de réalisation de la présente invention.
Par exemple, suivant un sixième mode de réalisation du dispositif de la présente invention, la zone de capture peut être une gravure de, ou une saillie sur, la surface active permettant de capturer la goutte par des forces capillaires . Ces gravures ou saillies peuvent être réalisées par exemple par gravure directe du substrat ; par dépôt d'un matériau à la surface d'un substrat plan, par exemple par couchage, évaporation, pulvérisation, ou dépôt électrochimique, puis gravure en conjonction avec un procédé classique de photolitoghraphie, par exemple par couchage de résine, insolation et définition de motifs, ou gravure ; par définition directe de motifs par photolithographie dans des polymères photosensibles, par exemple dans le cas de résines photosensibles ; moulage ou emboutissage de matériaux plastiques. L'essentiel est que ces gravures ou saillies formant des zones permettent de capturer, de manière localisée à cette zone, par capillarité, une goutte du liquide d'intérêt et que cette goutte recouvre au moins partiellement la zone de travail . Quel que soit le mode de réalisation choisi, lorsque le liquide d'intérêt est aqueux, la zone de capture est de toute préférence une zone hydrophile et la surface active sensiblement non mouillante est de toute préférence hydrophobe . Quel que soit le mode de réalisation choisi , avantageusement, la zone de capture et la, ou les, zone (s) de travail correspondante peuvent être placées dans un creux (ou cuvette) ou sur une saillie (ou plot) par rapport à la surface active. Ainsi, la zone de capture et la zone de travail correspondante sont en relief par rapport à la surface active, soit sur des plots, soit dans des cuvettes. Cela peut permettre de mieux circonscrire la goutte capturée par chaque zone de capture, et ainsi d'améliorer encore les propriétés du dispositif de l'invention en ce qui concerne la non contamination entre les zones de travail. Ce type de creux ou saillie existe par exemple dans les laboratoires sur puces actuelles. Cependant, dans la présente invention, ces creux et saillies seront suffisamment éloignés les uns des autres, particulièrement lorsqu'il s'agit de saillies, et de diamètre suffisant, particulièrement lorsqu'il s'agit de creux, de manière à ce que le liquide d'intérêt ne soit pas capturé par ceux-ci par capillarité entre les saillies ou dans les creux, mais bien par les zones de capture situées sur ces saillies ou dans ces creux. Ils peuvent être obtenus par emboutissage, moulage, gravure, ou toute autre technique connue de l'homme du métier et adaptée au matériau constituant le substrat sur lequel la surface active de la présente invention est formée. Selon l'invention, la zone de capture peut avoir n'importe quelle forme. Cette zone peut être choisie, à titre d'exemple, parmi une forme annulaire, en étoile, en rectangle, en carré, en triangle, en ellipse, ou en polygone ayant de 4 à 20 côtés, ou toute autre forme convenant à la mise en œuvre de la présente invention. De préférence, la forme est annulaire, ouverte ou fermée. En général, elle est sous forme de bande. Généralement, cette bande a une largeur et une épaisseur qui sont fonction de la taille du dispositif dans son ensemble (zone de capture + zone de travail) . En effet, cette largeur et cette épaisseur doivent permettre la capture d'une goutte de liquide d'intérêt. Des exemples de dimensions sont donnés ci-dessous. Quoi qu'il en soit, selon l'invention, la zone de capture est arrangée avec la zone de travail de telle 'façon que si une goutte de liquide d'intérêt est capturée par celle-ci, cette goutte recouvre au moins partiellement la zone de travail. De préférence, selon l'invention, la zone de capture entoure la zone de travail, ceci de manière continue ou discontinue. Par ailleurs, selon un mode particulier de réalisation du dispositif de la présente invention, une zone de capture d'une goutte de liquide d'intérêt peut entourer plusieurs zones de travail, par exemple de 2 à 4 ou plus, pourvu que lorsqu'une goutte de liquide d'intérêt est capturée par la zone de capture, cette goutte recouvre, au moins partiellement, toutes les zones de travail qui sont entourées par cette zone de capture. Par zone de travail, on entend une zone au niveau de laquelle des opérations physiques et/ou chimiques et/ou optiques peuvent être menées dans la goutte capturée par la zone de capture avec laquelle elle est arrangée. Ainsi, selon l'invention, la, au moins une, zone de travail peut être une zone d'interaction choisie parmi une zone d'interaction électrique, chimique, mécanique, optique avec ladite goutte de liquide d'intérêt capturée , ou une zone au niveau de laquelle plusieurs de ces interactions sont utilisées simultanément ou successivement. Ainsi, suivant une première forme de réalisation de l'invention, la zone de travail peut être une zone d'interaction électrique, par exemple une microcellule électrochimique. Une microcellule électrochimique est un dispositif possédant au moins deux électrodes préférentiellement coplanaires, formant une électrode de travail et une contre-électrode. Elle peut également posséder une électrode de référence. Ces éléments sont connus de l'homme du métier. Les procédés de fabrication connus de l'homme du métier sont utilisables pour fabriquer cette zone de travail, par exemple le procédé décrit dans le document référencé
[8]. Grâce à cette forme de réalisation, le dispositif de la présente invention peut constituer un véritable microréacteur électrochimique qui utilise la goutte de liquide d'intérêt capturée par la zone de capture comme milieu réactionnel, et plus précisément comme milieu électrochimique . Le réacteur électrochimique suivant cette première forme de réalisation de la présente invention peut être utilisé pour réaliser toute réaction et/ou analyse électrochimique connue de l'homme du métier. Ce réacteur peut servir par exemple à effectuer des réactions d'electropolymerisation localisée d'un ou de plusieurs monomère (s) présent (s) dans la goutte (polymérisation ou copolymérisation) et/ou d' électro - greffage localisé d'une ou de plusieurs molécule (s) chimique (s) présente (s) dans la goutte du liquide d'intérêt sur une des électrodes de la microcellule. Dans cet exemple, le liquide d'intérêt est alors un liquide contenant les réactifs nécessaires à 1' électropolymérisation ou à l' électrogreffage désiré. La polymérisation et le greffage peuvent être avantageusement localisés au niveau de la goutte du liquide d'intérêt capturée par la zone de capture. De telles réactions d'electropolymerisation ou greffage localisés peuvent être utilisées par exemple pour la fabrication de puces biologiques ou systèmes d'analyse. Ce microréacteur électrochimique peut servir par exemple aussi à effectuer des analyses électrochimiques, qualitatives et/ou quantitatives, d'analytes présents dans la goutte d'un liquide d'intérêt capturée par la zone de capture. Il peut servir par exemple aussi à effectuer des analyses électrochimiques, qualitatives et/ou quantitatives, d'une reconnaissance moléculaire sonde/cible, la sonde étant fixée sur la zone de travail, et la cible se trouvant dans la goutte du liquide d' intérêt capturée . Dans un exemple particulier, la microcellule électrochimique du dispositif de l'invention peut être utilisée d'abord pour « fabriquer » la zone de travail, et ensuite pour utiliser cette zone de travail pour l'analyse d'une goutte d'un liquide d'intérêt. Par exemple, si la zone de travail doit comprendre un polymère organique fonctionnalisé par une sonde, par exemple une sonde biologique, elle peut être fabriquée par électropolymérisation d'un polymère conducteur fonctionnalisé par une sonde , par exemple suivant le procédé décrit dans le document référencé [5] . La particularité liée à l'utilisation du dispositif de l'invention est qu'on utilise la zone de capture pour capturer de manière localisée sur la zone de travail une première goutte d' un premier liquide d' intérêt contenant les réactifs nécessaires à l' électropolymérisation (monomère organique). La fonctionnalisation par la sonde, peut être réalisée simultanément à l' électropolymérisation, le premier liquide d'intérêt contient alors aussi la sonde (par exemple monomère fonctionnalisé par la sonde) . La fonctionnalisation peut aussi être réalisée postérieurement à l' électropolymérisation au moyen d'une deuxième goutte d'un deuxième liquide d'intérêt (contenant la sonde) capturée par la même zone de capture et, de ce fait localisée sur la même zone de travail. En outre, la zone de travail ainsi fabriquée peut ensuite être séchée, et elle peut servir, toujours grâce à la zone de capture avec laquelle elle est arrangée, à capturer une goutte d'un troisième liquide d'intérêt à analyser, contenant une cible qui interagit avec la sonde (par exemple oligonucléotides complémentaires). Un quatrième liquide d'intérêt peut encore être utilisé pour analyser (détection et/ou dosage) l'interaction sonde/cible sur ladite zone de travail, et ainsi de suite. Dans un exemple particulier, où la microcellule électrochimique d'un dispositif de la présente invention est utilisée pour détecter une cible présente dans un échantillon liquide, par exemple en mettant en jeu une interaction de la cible à détecter avec une sonde spécifique fixée sur la zone de travail, il est possible de détecter électrochimiquement ladite interaction par exemple avec amplification du signal par accumulation enzymatique dans une goutte d'un liquide d'intérêt, contenant un substrat enzymatique, capturée par la zone de capture arrangée avec cette zone de travail . Le document [4] expose un protocole opératoire utilisable pour ce type de détection, avec le dispositif de la présente invention. La détection d'une interaction sonde/cible sur la zone de travail peut faire intervenir un des autres moyens connus de l'homme du métier que la cellule électrochimique, par exemple un procédé optique. La microcellule électrochimique peut donc servir dans ce cas uniquement à « fabriquer » la zone de travail, la détection d'une interaction sonde/cible étant ensuite effectuée par un autre moyen. Dans ces exemples, différentes gouttes constituées de différents liquides d'intérêt sont donc capturées successivement par une même zone de capture sur le dispositif de la présente invention à différentes fins, par exemple pour réaliser des étapes successives d'un protocole de fabrication de la zone de travail, par exemple aussi pour réaliser des étapes successives de détection et/ou de dosage d'un analyte dans un liquide d'intérêt. L'avantage lié à la présente invention est que quel que soit l'objectif des captures successives de gouttes de liquides d'intérêt, les gouttes capturées successivement sont toutes localisées sur les zones de travail, grâce à leur zone de capture respective. Quelle que soit la mise en œuvre de cette forme de réalisation caractérisée par la présence d'une microcellule électrochimique, la sonde qui fonctionnalise la zone de travail peut être choisie par exemple dans le groupe constitué par une enzyme, un substrat d'enzyme, un oligonucléotide, un oligonucléoside, une protéine, un récepteur membranaire d'une cellule eucaryote ou procaryote, un anticorps, un antigène, une hormone, un métabolite d'un organisme vivant, une toxine d'un organisme vivant, polynucléotide, polynucléoside, ADN complémentaire. Elle est bien entendu choisie en fonction de la cible avec laquelle elle devra interagir. Avantageusement, suivant cette première forme de réalisation du dispositif de l'invention, l'électrode la plus externe de la microcellule, peut être utilisée pour former la zone de capture ou bande mouillante du dispositif de l'invention. Dans ce cas, comme exposé ci-dessus, un polymère conducteur porteur de la fonction mouillante destiné à former la zone de capture est déposé sur cette électrode. Pour ce dépôt, le polymère peut être électro-déposé sur l'électrode grâce à la cellule électrochimique formant la zone de travail . Des procédés utilisables pour déposer un polymère conducteur sur une électrode et y lier une fonction chimique mouillante sont décrits ci-dessus dans le troisième mode de réalisation de la zone de capture selon l'invention. La forme de cette électrode n'a pas d'importance dès lors qu'elle entoure la zone de travail conformément à la présente invention. Selon l'invention, l'électrode formant la zone de capture d'une goutte de liquide d'intérêt peut fonctionner de manière totalement indépendante de la zone de travail. Elle peut aussi fonctionner de manière dépendante en étant utilisée par la suite dans la fonction de la microcellule électrochimique, par exemple pour effectuer des mesures électrochimiques et/ou des réactions électrochimiques dans la goutte capturée. La zone de capture du dispositif de la présente invention peut donc être active ou non suivant le choix de mise en oeuvre du dispositif de 1' invention. Avantageusement aussi , l'électrode de capture d'une goutte de liquide d'intérêt peut en outre être fonctionnalisée par une sonde destinée à interagir avec une cible. Par exemple, lorsque la zone de capture est constituée suivant le troisième mode de réalisation de la présente invention, le polymère conducteur fonctionnalisé par une fonction chimique mouillante vis-à-vis du liquide d'intérêt peut également être, en outre, fonctionnalisé par ladite sonde destinée à interagir avec une cible. La sonde est définie ci- dessus pour la zone de travail. Les procédés connus de l'homme du métier pour fonctionnaliser un polymère conducteur par une sonde pour la fabrication de puces biologiques sont utilisables pour la fabrication de cette zone de capture particulière de la présente invention. Il peut s'agir à titre d'exemple des procédés exposés dans les documents précités .
Suivant une deuxième forme de réalisation de l'invention, la zone de travail peut être- une zone d' interaction chimique avec la goutte de liquide d'intérêt capturée, sans microcellule électrochimique. La zone de travail peut par exemple comporter des fonctions ou des réactifs chimiques ou biologiques prêts à réagir avec une cible de ces fonctions ou de ces réactifs présente dans un liquide d'intérêt. De même que pour la première forme de réalisation, le dispositif de l'invention peut servir dans un premier temps à placer ces fonctions ou ces réactifs sur la zone de travail, et dans un deuxième temps, après séchage, à capturer une goutte de liquide d'intérêt contenant la cible de ces fonctions ou de ces réactifs pour son analyse. De même que pour la première forme de réalisation, plusieurs liquides d'intérêt pourront se succéder sur le dispositif de l'invention, par exemple pour réaliser des étapes successives d'un protocole de fabrication de la zone de travail, par exemple aussi pour réaliser des étapes successives de détection et/ou de dosage d'un analyte dans un liquide d'intérêt. Les avantages sont les mêmes que ceux précités. Cette zone de travail peut être choisie parmi celles connues de l'homme du métier dans le domaine des puces biologiques (puces commercialisées par AGILENT, CIPHERGEN, EUROGENTEC) . La différence du dispositif de la présente invention avec ces puces de l'art antérieur réside surtout en la présence de la zone de capture d'une goutte de liquide d'intérêt arrangée avec ladite zone de travail. Cette zone de travail peut être fabriquée par exemple par silanisation puis immobilisation de sondes biologiques comme cela est décrit par exemple dans le document référencé [12] . Cette zone de travail peut être par exemple une zone comportant un polymère fonctionnalisé par une sonde biologique telles que celles précitées, dans le but de fixer une cible correspondante susceptible d'être présente dans un liquide d'intérêt pour la détecter, par exemple optiquement. Par exemple, sur un substrat tels que ceux précités, cette zone de travail peut être obtenue selon des méthodes décrites dans le document référencé [13]. Les puces ainsi fonctionnalisées peuvent ensuite, grâce à la zone de capture du dispositif de l'invention, servir à capturer une goutte d'un échantillon à analyser puis éventuellement d'un autre liquide d'intérêt pour mettre en évidence une interaction sonde/cible.
Suivant une troisième forme de réalisation de l'invention, la zone de travail peut posséder des dispositifs actifs ou de mesure, tels que des capteurs ou des actionneurs . Cette forme de réalisation peut s'ajouter aux formes de réalisation et variante précitées, ou être exclusive suivant l'objectif visé dans la mise en œuvre de la présente invention. Les dispositifs actifs ou de mesure sont avantageusement situés au centre des zones de capture . Lorsque la zone de travail comprend un capteur, il peut être choisi par exemple dans le groupe constitué des capteurs électriques, magnétiques, électrostatiques, mécaniques (par exemple capteur de pression) , thermiques (par exemple capteurs de température) , optiques (par exemple dispositif de détection optique) et chimiques. Lorsque la zone de travail comprend un actionneur, il peut être choisi par exemple dans le groupe constitué des actionneurs optiques (source lumineuse) , électriques, magnétiques, électrostatiques, mécaniques (déplacement mécanique) , thermiques (résistance chauffante) et chimiques. De tels capteurs et actionneurs, utilisables pour la mise en œuvre de la présente invention, ainsi que leur procédé de fabrication sont connus de l'homme du métier, notamment dans le domaine des microsystèmes . Là encore, la différence du dispositif de la présente invention avec ces puces de l'art antérieur réside notamment en la présence de la zone de capture du liquide d'intérêt arrangée avec ladite zone de travail.
Quelle que soit la forme de réalisation, selon l'invention, la, au moins une, zone de travail peut être une zone sensiblement non mouillante ou mouillante vis-à-vis du liquide d'intérêt. Les inventeurs ont en effet noté au cours de leurs expérimentations que la mouillabilité de la zone de travail n'est pas déterminante pour le fonctionnement du dispositif de la présente invention. Ils ont en effet remarqué que, de manière tout à fait inattendue, le dispositif de la présente invention peut aussi fonctionner lorsque la zone de travail est non mouillante vis-à-vis du liquide d'intérêt, pourvu que la goutte capturée recouvre au moins partiellement ladite zone de travail.
La présente invention se rapporte également à un procédé de fabrication du dispositif de la présente invention comprenant les étapes suivantes : - fournir un substrat comportant une surface choisie pour devenir la surface active, - structurer la surface choisie du substrat afin de former sur celle-ci une zone de travail, appliquer un traitement sur la surface choisie afin de la rendre sensiblement non mouillante vis-à-vis du liquide d'intérêt auquel le dispositif est destiné, et - structurer la surface choisie afin de former une zone de capture d'une goutte de liquide d'intérêt, les étapes de structuration de la surface pour former une zone de travail et de structuration de la surface pour former la zone de capture étant réalisées afin que la zone de travail soit arrangée avec la zone de capture de telle manière que lorsque la zone de capture capture une goutte de liquide d'intérêt, la zone de travail étant recouverte au moins partiellement par ladite goutte . Le substrat, la structuration pour former la zone de travail, le traitement de la surface du substrat destiné à la rendre sensiblement non mouillante, et la structuration de la surface destinée à former la zone de capture d'une goutte de liquide d'intérêt sont définis ci-dessus. Ainsi, par exemple, l'étape consistant à structurer la surface pour former la zone de capture peut consister à former une électrode destinée à former la zone de capture, à électro-déposer sur cette électrode un polymère conducteur, porteur d'une ou plusieurs fonction (s) chimique (s) mouillante (s) . Ainsi, par exemple, l'étape consistant à structurer la surface pour former la zone de travail peut consister : à fabriquer sur cette surface un capteur ; un actionneur ; une microcellule électrochimique ; une couche de polymère fonctionnalisée, ou qui peut être fonctionnalisée, avec une sonde destinée à reconnaître une cible susceptible d'être présente dans le liquide d'intérêt. Ces étapes et les matériaux utilisables sont décrits ci-dessus.
La présente invention se rapporte également à une plaquette de travail comprenant plusieurs dispositifs de travail selon l'invention identiques ou différents. En effet, le dispositif de la présente invention, tel qu'il est présenté ci-dessus, peut être disposé en série sur une plaque, par exemple pour former une matrice, les zones de travail pouvant être identiques sur toute la plaquette, ou différentes, par exemple pour pouvoir effectuer des analyses multiparamétriques et des réactions chimiques et biologiques différentes d'une zone à l'autre, simultanément ou successivement. La plaque peut être constituée du substrat comportant la ou les sur face (s) active (s) définie (s) dans la présente. Le terme « matrice » est défini ci-dessus. Le nombre de dispositifs sur une plaquette de travail selon l'invention dépend notamment du nombre d'analyses à effectuer sur cette plaquette. Par exemple, si la plaquette comporte 1000 dispositifs selon l'invention, elle va permettre de capturer 1000 gouttes de liquide d'intérêt sur 1000 zones de travail, ou plus lorsqu'une zone de capture entoure plusieurs zones de travail, et donc de réaliser simultanément au moins 1000 analyses du liquide d'intérêt. Elle trouve donc par exemple une utilité pour mettre en œuvre une analyse multiparametrique simultanée du liquide d'intérêt. Elle permet notamment de fabriquer des laboratoires sur puce, par exemple des puces biologiques et microsystèmes d'analyse. La présente invention se rapporte donc également à une puce biologique comprenant un dispositif ou une plaquette selon l'invention. Cette puce peut être par exemple une puce à acide nucléique, une puce à anticorps, une puce à antigènes, une puce à protéine, une puce à cellules, ou une puce comprenant plusieurs de ces fonctions, par exemple une puce à acide nucléique et à protéine, une puce à anticorps et à acide nucléique, etc. Le dispositif de la présente invention pouvant être miniaturisé à l'échelle millimétrique ou micrométrique, à titre d'exemple, de 5 μm à 5 mm. La présente invention se rapporte également à un système comprenant un ou plusieurs dispositif (s) de travail selon l'invention, identiques ou différents, ou une plaquette selon l'invention. Le système peut être par exemple un microsystème d'analyse, par exemple un microsystème d'analyse totale (MicroSysteme d'Analyse Totale ou μTAS) . La fabrication de la plaquette, et du système conformes à la présente invention peut être réalisée de la même manière que celle exposée ci-dessus pour la fabrication du dispositif de l'invention. Pour les parties de ces puces et systèmes qui sont distinctes de la présente invention, les procédés connus de l'homme du métier sont utilisables. En effet, la différence du dispositif, plaquette, laboratoire sur puce, et système de la présente invention avec leurs homologues de l'art antérieur réside essentiellement en la présence de la zone de capture de liquide d'intérêt arrangée avec chaque zone de travail. Aucune contrainte n'est imposée sur le choix du (ou des) matériau (x) , ce choix étant guidé essentiellement par l'application envisagée et par les spécifications de coût : matériau classique de microélectronique utilisés pour les microsystèmes (silicium, verre, oxyde de silicium, nitrure de silicium, etc.), matériau composite de type polymère technique disponible pour les circuits imprimés, etc. Dans le domaines des microsystèmes, où la dimension caractéristique du dispositif de l'invention est proche de 100 μm, l'orientation du dispositif n'a pas d'importance car les forces de gravité deviennent négligeables devant les forces de capture de la goutte par les zones de capture issues d'interactions à courte distance. En revanche, pour des applications visant des échelles de taille plus élevées pour la mise en œuvre de la présente invention, le dispositif de l'invention est bien entendu préférentiellement placé horizontalement avec une structuration de la surface active pour former les zones de capture et de travail vers le haut. Dans la mise en œuvre de la présente invention, les dimensions d'une zone de capture peuvent varier largement en fonction de l'utilisation à laquelle est destinée et du mode de réalisation (une ou plusieurs zones de travail par zone de capture, un ou plusieurs dispositif (s) de l'invention sur une surface active). Par exemple pour un microsystème, la zone de capture peut avoir un diamètre allant de 5 μm à 5 mm. Lorsque la zone de capture est sous forme de bande, cette bande peut avoir une largeur de 1 μm à 500 μm et une épaisseur par rapport à la surface active de 0 à
500 μm . La zone de travail, dont la dimension dépend notamment de la zone de capture (la goutte capturée devant recouvrir au moins partiellement cette zone de travail) peut avoir par exemple, avec les dimensions précitées de la zone de capture, un diamètre tel qu'il touche la zone de capture qui l'entoure ou non. Par exemple, la zone de travail peut avoir un diamètre de 5 μm à 5 mm. Pour que la, ou les, zone (s) de capture capturent une goutte de liquide d'intérêt, il est nécessaire de mettre en contact le liquide d'intérêt avec ladite ou lesdites zones de capture. Pour cela, il est possible par exemple de faire ruisseler le liquide d'intérêt sur la ou les zone (s) de capture ou d'immerger cette (ces) dernière (s) dans le liquide d'intérêt. Selon l'invention, les moyens permettant de laisser une goutte de liquide d'intérêt sur ladite zone de capture localisée peuvent être une seringue, une pipette, une micropipette, un récipient contenant le liquide d'intérêt et dans lequel le dispositif ou la plaquette de l'invention peut être plongé, etc. Il peut s'agir également d'un dispenseur d'une goutte de liquide d'intérêt par zone de capture. En effet, dans ce cas, le dispositif de l'invention permet de garantir qu'il n'y a pas de contamination entre les zones de travail. Les dispenseurs utilisables sont ceux habituellement utilisés par exemple dans le domaine des laboratoires sur puce et des microsystèmes . La présente invention se rapporte également à une boîte de travail telle qu'elle est définie ci- dessus . Dans cette boîte de travail, le conteneur peut être ouvert ou fermé. Ce conteneur peut être utilisé spécialement pour immerger le dispositif de l'invention ou la plaquette de l'invention dans le liquide d'intérêt, ou un conteneur qui permet en plus de confiner le dispositif ou la plaquette de l'invention et/ou d' effectuer des analyses sur ou dans les gouttes capturées sur les zones de travail. Dans ces deux derniers cas, le conteneur est de préférence fermé, la boîte de travail de la présente invention constitue alors un véritable laboratoire miniature. Elle pourra être utilisée dans des systèmes, tels que des microsystèmes d'analyse, ou former une puce biologique par exemple choisie dans le groupe constitué des puces à acide nucléique, à anticorps, à antigènes, à protéine et à cellules. Les dimensions du conteneur dépendent notamment des dimensions du dispositif de l'invention, ou de la plaquette de l'invention, qui doit être enfermé dans celui-ci, mais aussi, le cas échéant, d'autres dispositifs d'analyse ou systèmes qui peuvent être joints dans ledit conteneur, par exemple d'autres laboratoires sur puce. Elles peuvent descendre en dessous du cm pour leur côté le plus grand. Le conteneur peut être constitué par exemple d'un matériau choisi dans le groupe constitué par un polymère organique, une matière plastique élastomère , un verre, du métal, du silicium, une résine photosensible, ou par tout matériau connu de l'homme du métier et permettant la mise en œuvre de la présente invention. Par exemple, il peut s'agir d'un des matériaux précités formant le substrat du dispositif de travail de la présente invention. Le matériau du conteneur est généraleme nt choisi en fonction du type de liquide d'intérêt à introduire dans celui-ci, de l'utilisation du conteneur (simplement immersion du dispositif ou de la plaquette, ou immersion et analyse) et en fonction des spécifications de coût du fabriquant. Il peut s'agir d'un matériau identique à la surface active du dispositif de l'invention ou différent . Le conteneur est de préférence suffisamment étanche pour éviter par exemple les fuites lors de l'immersion dans celui-ci du dispositif ou de la plaquette selon l'invention dans le liquide d'intérêt. En particulier, lorsqu'il est fermé, il est de préférence suffisamment étanche pour empêcher, par exemple, que des contaminations entrent dans le conteneur, par exemple bactérienne, chimiques, etc. ; et/ou pour empêcher l' évaporation de la, ou des, goutte (s) capturée (s) par la, ou les, zone (s) de capture après l'extraction du liquide d'intérêt du conteneur. L'homme du métier saura adapter l'étanchéité et utiliser les matériaux appropriés suivant l'utilisation qu'il fait de la présente invention. Selon un mode de réalisation particulier de la boîte de travail de la présente invention, lorsque le substrat et le conteneur sont constitués d'un même matériau, le substrat peut constituer une des parois constituant le conteneur. Les parois constituant le conteneur peuvent aussi être montées à partir de, et sur, la surface active du dispositif de l'invention, par exemple par collage ou compression. Le conteneur peut comprendre un capot pour son montage, mais aussi, dans certaines applications, pour l'ouvrir ou le fermer, notamment afin de pouvoir retirer de celui-ci le dispositif ou la plaquette de l'invention après l'avoir mis en contact avec le liquide d'intérêt, ou après les analyses ou réactions dans les gouttes. En effet, un seul conteneur peut également servir pour immerger en même temps ou successivement un, ou, suivant sa conception, plusieurs dispositif (s) ou plaquette (s) selon l'invention. Le conteneur peut alors comprendre des moyens de fixation amovibles, par exemple des clips, du, ou des, dispositif (s) et/ou plaquette (s) à l'intérieur de celle-ci. Si le conteneur comprend un capot, il sera de préférence suffisamment étanche pour ne pas perturber l'immersion du dispositif ou de la plaquette de l'invention, comme cela est expliqué ci-dessus. Le capot peut être constitué d'un matériau tel que ceux précités pour le conteneur. Il peut être fabriqué par exemple par moulage, par emboutissage, par gravure ou par érosion mécanique, etc. Il peut ensuite être fixé définitivement sur le conteneur pour le fermer, par exemple par collage, compression, plaquage ou par tout autre moyen connu de l'homme du métier et assurant la tenue et l'étanchéité requise pour l'utilisation de celui-ci. Il peut aussi être fixé sur le conteneur de manière amovible, toujours en assurant la tenue et l'étanchéité requise pour l'utilisation de celui-ci, afin que le même conteneur ainsi constitué puisse servir à l'immersion successive de dispositifs ou plaquettes selon l'invention, identiques ou différents, et/ou avec différents liquides d'intérêt. De préférence, le matériau du conteneur, et, le cas échéant, de son capot, est, à l'intérieur de celui- ci (c'est à dire en regard du substrat et de sa surface active) sensiblement non mouillant vis-à-vis du liquide d'intérêt. En effet, ceci permet d'éviter que des gouttes adhèrent aux surfaces internes du conteneur, après l'extraction du liquide d'intérêt, et tombent sur la surface active et viennent gêner les analyses et réactions sur les zones de travail dans les gouttes capturées par les zones de capture. Des traitements de surface peuvent être nécessaires pour obtenir ce résultat, comme pour la surface active du dispositif de l'invention. Ces traitements peuvent être par exemple ceux précités pour la fabrication de la surface active. Le conteneur comprend des moyens d' introduction et d'extraction du liquide d'intérêt dudit conteneur, comprenant au moins deux ouvertures . Lorsque le conteneur est fermé, il n'y a pas de limitation dans la position, la forme et la fonction de ces ouvertures autres que celles-ci : elles doivent permettre l'introduction puis l'extraction du liquide d'intérêt du conteneur ; et elles doivent être disposées de telle manière que lorsque le liquide d'intérêt est introduit dans le conteneur, il couvre la ou les zone (s) de capture, et lorsque le liquide d'intérêt est extrait du conteneur, une goutte de liquide d'intérêt reste captive par zone de capture. Le liquide d'intérêt peut entrer puis sortir du conteneur par deux ouvertures différentes. Il peut aussi entrer puis sortir du conteneur par une seule des deux ouvertures, une deuxième ouverture servant à autoriser l'extraction du liquide d'intérêt, soit en laissant passer l'air appelé par l'extraction, soit en injectant par cette deuxième ouverture un fluide gazeux permettant de pousser le liquide d'intérêt hors du conteneur. Les ouvertures d' introduction et d' extraction du liquide d'intérêt du conteneur peuvent être disposées sur le capot ou sur les parois du conteneur, par exemple par gravure, emboutissage, moulage, exposition à la lumière pour une résine photosensible, perçage mécanique, etc. L'introduction du liquide d'intérêt dans le conteneur peut se faire par tout moyen approprié connu de l'homme du métier pour injecter un liquide dans un conteneur, notamment ceux utilisés dans le domaine des laboratoires sur puce et des microsystèmes . Ce moyen d'injection peut être par exemple une seringue, une pipette, une micropipette, une pompe d'injection, etc. L'extraction du liquide d'intérêt peut se faire par tout moyen approprié connu de l'homme du métier pour extraire un liquide d'un conteneur. L'essentiel est que la ou les goutte (s) capturée (s) par la zone de capture ne soient pas emportées lors de l'extraction du liquide d' intérêt. Par exemple, selon l'invention, le moyen d'extraction du liquide d'intérêt peut .être constitué d'une pompe d'injection d'un fluide gazeux par l'ouverture d'entrée de manière à extraire le liquide d'intérêt en le chassant du conteneur par l'ouverture de sortie. Avantageusement, la pompe d'injection du fluide gazeux par l'ouverture d'entrée du conteneur peut alors comprendre un dispositif de saturation du fluide gazeux injecté en vapeur de liquide d'intérêt. Cette saturation permet d' éviter ou de limiter l'évaporation de la, ou des, goutte (s) capturée (s) par la, ou les, zone (s) de capture. Par exemple aussi, la pompe d'extraction du liquide d'intérêt du conteneur peut être constituée d'une pompe aspirante disposée de manière à extraire le liquide d'intérêt du conteneur en l'aspirant par l'ouverture de sortie. Le déroulement du procédé permettant la capture d'une goutte de liquide d'intérêt par zone de capture du dispositif et de la plaquette de l'invention en utilisant la boîte de travail de l'invention peut être schématisé de la manière suivante : - remplissage total ou partiel du conteneur, ou chambre fluidique, par le liquide d'intérêt de manière à couvrir la ou les zone (s) de capture, puis - extraction du liquide à l'extérieur de la chambre . Seule (s) la ou les zones de capture retiennent chacune une goutte de liquide d'intérêt, la surface active étant non mouillante. L'utilisation du dispositif, de la plaquette ou de la boîte de travail de la présente invention peut donc faire intervenir successivement une ou plusieurs opération (s) qui se déroule (nt) collectivement, avec un ou plusieurs liquides d'intérêt, identiques ou différents, puis des opérations individuelles au niveau de chacune des gouttes formées . Ainsi, par exemple dans une première opération, dite collective, le dispositif de l'invention permet le passage d'une veine fluidique de liquide d'intérêt, par exemple injectée dans la boîte de travail, à une matrice de gouttes, ou micro-volumes, indépendantes les unes des autres. Ensuite, des procédés de détection et/ou de réactions chimiques ou biochimiques connues de l'homme du métier peuvent être mis en oeuvre individuellement (opération individuelle) , en parallèle ou successivement, dans chacune des gouttes capturées par les zones de capture. Dans des procédés à plusieurs étapes utilisant le dispositif de l'invention, il n'. est pas nécessaire que toutes les étapes conduisent à la formation de gouttes. En effet, rien n'empêche que certaines étapes soient réalisées en couvrant la totalité des zones de capture et de travail par un liquide puis en vidant la boîte de ce liquide de telle manière qu' il ne reste pas de gouttes captives par les zones de capture, par exemple par injection dans la boîte d'un gaz sous pression, par agitation énergique, etc. Sur une même zone de travail du dispositif de la présente invention, il est possible de capturer successivement différentes gouttes d'un ou de plusieurs liquides d'intérêt, grâce à la zone de capture qui l'entoure. Chaque liquide d'intérêt peut contenir un ou plusieurs réactif (s) nécessaire (s) par exemple à réaliser une des étapes d'un procédé de chimie ou biochimie, par exemple pour fabriquer la zone de travail et/ou ou effectuer des analyses. En conséquence, la succession des différentes gouttes sur une même zone de travail permet de réaliser les étapes successives du procédé mis en œuvre. L'ensemble de ces étapes de procédé sera donc avantageusement localisé sur cette zone de travail grâce à la zone de capture. Dans des expérimentations liées à la mise en œuvre de la présente invention, les inventeurs ont noté que le dispositif de l'invention résout d'autres problèmes techniques, par rapport aux techniques de l'art antérieur, dans le domaines des laboratoires sur puce, puces biologiques et microsystèmes . En particulier, il existe dans l'art antérieur un certain nombre de méthodes de greffage covalent localisé de molécules biologiques pour fonctionnaliser des surfaces de puces biologiques . Cette localisation est en général réalisée par voie chimique, photochimique ou bien électrique. Par voie chimique, l'immobilisation d'un élément biologique (sonde) se fait par dépôt localisé (« spotting ») ou synthèse in situ ce qui est contraignant en termes de temps. Par voie photochimique, il est possible de réaliser des synthèses d' oligonucléotides à l'aide de groupements photolabiles [4] : ici encore, des limitations en termes de temps de synthèse et de volumes de réactifs coûteux sont souvent rencontrées. De plus, des réactions radicalaires non sélectives peuvent avoir lieu. Par voie électrique, la synthèse d' oligonucléotides sur support solide avec groupement électro-labile rencontre les mêmes limitations. Par voie électrochimique [3], par copolymérisation de pyrrole et de pyrrole porteur d'une espèce biologique sur une électrode métallique. Cette dernière technique présente l'inconvénient de requérir des volumes importants de réactifs coûteux (pyrrole porteur de l'espèce biologique). Le dispositif de la présente invention permet de résoudre ces nombreux problèmes de l'art antérieur. En effet, il permet de fonctionnaliser rapidement et précisément des surfaces de puces biologiques , qui sont devenues dans la présente invention les zones de travail, grâce à une localisation rapide et précise du liquide d'intérêt sur la ou les zone (s) de travail, et un contrôle précis des densités de sondes immobilisées. En outre, par rapport aux procédés de l'art antérieur, les volumes de réactifs utilisés sont nettement moins importants du fait de la localisation précise de la réaction dans le volume des gouttes de réactifs capturées par les zones de capture. En outre, les expérimentations des inventeurs ont montré que le dispositif de la présente invention permet de travailler en micro-volumes indépendants les uns des autres, sans contamination croisée entre les plots de détection, ce qui augmente considérablement la précision et la reproductibilité des analyses. Ainsi, la présente invention permet entre autre une mesure électrochimique ou optique en milieu confiné, dans la goutte capturée par la zone de capture, mais également une fonctionnalisation localisée sur la zone de travail par voie électrochimique ou chimique avec des réactifs coûteux (volume des réactifs restreints à la vraie zone utile formée par la zone de travail entourée par sa zone de capture selon l'invention). Cette invention trouve actuellement son plus grand intérêt dans le cas d'un dispositif fermé, par exemple dans les applications laboratoire sur puce et microsystèmes. Cependant, il est à noter que cette invention peut également être appliquée dans le cas d'une dispense de liquide par un robot afin de maintenir parfaitement localisé un liquide d'intérêt. Selon l'invention, des détections de différentes molécules susceptibles d'être présentes dans le liquide d'intérêt peuvent être réalisées en parallèle, simultanément ou successivement, dans différentes gouttes de liquide d'intérêt captives sur ladite surface active dans la boîte. Selon l'invention, le, au moins un, analyte à détecter peut être choisi par exemple parmi les molécules biologique ou chimique. Les molécules biologiques peuvent être choisies par exemple dans le groupe constitué par une enzyme, un substrat d'enzyme, un oligonucléotide, un oligonucléoside, une protéine, un récepteur membranaire d'une cellule eucaryote ou procaryote, un virus, un anticorps, un antigène, une hormone, un métabolite d'un organisme vivant, une toxine d'un organisme vivant, un nucléotide, un nucléoside, un ADN complémentaire. La molécule chimique peut être toute molécule qui doit être analysée qualitativement et/ou quantitativement.
D'autres caractéristiques et avantages apparaîtront encore à l'homme du métier à la lecture des exemples qui suivent donnés à titre illustratif et non limitatif en référence aux figures annexées .
Brève description des figures - Les figures 1 et 2 représentent schématiquement différents dispositifs conformes à la présente invention. - La figure 3 représente schématiquement différents modes de réalisation du dispositif de la présente invention. - La figure 4 représente schématiquement un dispositif de l'invention dans lequel la zone de travail est un microsystème électrochimique. - Les figures 5a) et 5b) sont deux photographie d'un dispositif selon l'invention, dans lequel la zone de travail est une microcellule électrochimique : la figure 5a) avant capture d'une goutte de liquide d'intérêt, et la figure 5b) après capture d'une goutte de liquide d'intérêt. - La figure 6 est un graphique montrant la détection, au niveau d'une zone de travail, d'un produit d'une réaction enzymatique au sein d'une goutte capturée par la zone de capture correspondant à cette zone de travail dans un dispositif selon l'invention. - La figure 7 représente des coupes transversales d'un mode de réalisation possible d'une boîte de travail selon l'invention. - La figure 8 représente des coupes transversales d'une représentation schématique de différents modes de réalisations possibles d'une boîte de travail selon l'invention, en particulier elle représente des exemples de dispositions des ouvertures d'entrée et de sortie du liquide d'intérêt sur différentes boîtes de travail conformes à la présente invention . - La figure 9 est une représentation schématique d'une plaquette selon l'invention comportant plusieurs dispositifs selon l' invention disposés en matrice .
EXEMPLES
Exemple 1 : fabrication de surfaces actives non mouillantes selon l'invention Un substrat de silicium (Si) avec une couche supérieure d'oxyde de silicium (Si02) de 300 nm est traité avec un silane hydrophobe (1H, 1H, 2H, 2H perfluorodecyl-trichlorosilane) pour rendre la surface hydrophobe . Le protocole est le suivant : après traitement dans un mélange soude/eau/éthanol à 3,5 M pendant 2 heures à température ambiante pour générer les sites silanols, le substrat est placé pendant 10 minutes à température ambiante dans un mélange toluène anhydre/silane hydrophobe à 9 mM en concentration de silane. il est ensuite lavé avec du toluène puis de l'acétone, puis de l'éthanol et finalement nettoyé aux ultrasons pendant 5 minutes dans l'éthanol. Le substrat est ensuite placé dans une étuve pendant 1 heure à 110°C. L'angle de contact mesuré avec l'eau est de 110°.
Exemple 2 : fabrication d'une zone de capture constituée d'un matériau support disposé sur la surface active Sur substrat de Si avec une couche de Si02 de 300 nm, réalisation d'étapes standard pour l'homme du métier de la microélectronique : dépôt de 300 nm de platine (Pt) par pulvérisation ; photolithographie dans une résine photosensible avec ouverture d'un motif circulaire relié à une bande d'arrivée de courants ; dans un réacteur à plasma, gravure ionique complète du Pt dans les zones sans résine ; retrait de la résine dans un bain d'acide nitrique ; - dans un réacteur à plasma, dépôt chimique en phase vapeur de 500nm de Si02 ; photolithographie dans une résine photosensible avec ouverture du motif circulaire ; dans un réacteur à plasma, gravure ionique complète de 500nm de SiO 2 dans les zones sans résine ; et retrait de la résine dans un bain d' acide nitrique . La figure 3a est une représentation schématique d'une zone de capture circulaire constituée d'un matériau support et entourant une zone de travail .
Exemple 3 : fabrication d'une zone de capture constituée de silicium noir Sur un substrat de Si (toutes ces étapes sont très bien connues de l'homme du métier de la microélectronique) : photolithographie dans une résine photosensible avec ouverture d'un motif en couronne ; - dans un réacteur à plasma, gravure réactive ionique d'environ 3μm de silicium suivant le protocole décrit dans le document [11] pour former du silicium noir ; - nettoyage de la surface en fin de gravure par passage dans un réacteur à plasma Plassys MDS 150 (société Plassis, France) avec les conditions suivantes : puissance 500W, temps de réaction 4 minutes, pression 21,33 Pa (160 mTorrs) , débit d'oxygène 25cm3/min., température ambiante ; et retrait de la résine dans un bain d' acide nitrique . Le silicium noir formé sur ces zones déterminées est fortement hydrophile, tandis que le silicium est sensiblement non mouillant vis-à-vis des liquides d'intérêt aqueux (échantillons). Les figures 1 et 2 montrent schématiquement différentes zones de captures formées autour de leur zone (s) de travail. La structuration fine a été réalisée de manière à créer une bande de silicium noir, ouverte ou fermée, qui constitue la zone de capture (Zc) , autour d'une zone prévue pour former la zone de travail (Zt) . Sur la figure 2, une zone de capture est aménagée autour de deux (à droite) ou quatre (à gauche) zones de travail. La zone gravée ne nécessite pas d'autre modification chimique. Ce dispositif de l'invention est destiné à être utilisés avec des liquides d'intérêt aqueux Exemple 4 : fabrication d'une zone de capture sous forme d'une électrode de capture par mouillage
4.1 ZONE DE CAPTURE SOUS FORME D'UNE ELECTRODE DE CAPTURE : Sur un substrat de Si avec une couche de Si02 de 300 nm, les étapes suivantes sont réalisées : α) Les mêmes étapes que dans l'exemple 2 sont réalisées pour disposer une électrode (matériau support) sur la surface active. β) Réalisation de la surface active non mouillante vis-à-vis du liquide d'intérêt sur l'ensemble du substrat pour le rendre hydrophobe comme dans l'exemple 1. L'électrode est ensuite nettoyée par voie chimique avec une solution de soude/eau/éthanol. Pour ce faire, une goutte d'un mélange soude/eau/éthanol à 3,5 M est déposée sur les électrodes pendant 2 heures à température ambiante. Les électrodes sont ensuite lavées à l'eau puis séchées. γ) Dans des expérimentations supplémentaires, une barrière hydrophile a été réalisée sur l'électrode par électropolymérisation en conditions potentiostatiques d'un pyrrole porteur de fonctions alcools (fonctions mouillantes vis-à-vis d'un liquide d'intérêt aqueux) en position 3. Ce polypyrrole est généré à partir d'une solution de pyrrole-3- éthanol 100 mM et de perchlorate de lithium (LiC104) 0,5 M. Un potentiel de I V vs Ag/AgCl/Cl" est appliqué pendant 5 secondes . L'angle de contact mesuré avec l'eau sur l'électrode est de 53°. La figure 3a est une représentation schématique d'un dispositif selon l'invention obtenu en utilisant le protocole de cet exemple. Sur cette figure, la zone de capture (Zc) , entourant la zone de travail (Zt) , est formée par une électrode recouverte d'un polypyrrole porteur de fonctions mouillantes (fonctions alcools) .
4.2 ZONE DE CAPTURE SOUS FORME D'UNE BANDE MOUILLANTE : Sur un substrat de Si avec une couche de Si02 de 300nm, les étapes suivantes ont été réalisées : α) Réalisation de la surface active non mouillante vis-à-vis du liquide d'intérêt sur l'ensemble du substrat pour le rendre hydrophobe comme dans 1 ' exemple 1. β) Photolithographie dans une résine photosensible de type négative (référence NFR-015 du fournisseur Shipley) avec une ouverture d'un motif en couronne, pour former la zone de capture (ou bande mouillante) ; γ) Destruction du silane hydrophobe dans les motifs ouverts de la résine photosensible par passage dans un réacteur à plasma Plassys MDS 150 (société Plassys, France) avec les conditions suivantes : puissance 500 , temps de réaction 4 minutes, pression 21,33 Pa (160 mTorrs) , débit d'oxygène 25cm3/min., température ambiante ; et δ) Réalisation de la zone de capture par silanisation avec un silane porteur de fonctions aminés (fonctions mouillantes pour le liquide d' intérêt aqueux) . Le substrat est placé dans une solution de μ-aminopropyl triéthoxysilane à 10% en volume dans l'éthanol. Après une nuit à température ambiante, le substrat est lavé à l'éthanol et enfin laissé pendant trois heures dans une étuve à 110°C.
Exemple 5 : Fabrication d'une zone de travail fonctionnalisée par une sonde selon l'invention Dans cet exemple, une puce comprenant quatre électrodes est fabriquée et utilisée. Sur un substrat de Si avec une couche de Si02 de 300 nm, réalisation d'étapes standard pour l'homme du métier de la microélectronique : dépôt de 300 nm de platine (Pt) par pulvérisation ; - photolithographie dans une résine photosensible avec ouverture des motifs de la microcellule, de l'électrode de capture et des bandes d'arrivée de courants ; dans un réacteur à plasma, gravure ionique complète du Pt dans les zones sans résine ; retrait de la résine dans un bain d'acide nitrique ; dans un réacteur à plasma, dépôt chimique en phase vapeur de 500nm Si02 ; - photolithographie dans une résine photosensible avec ouverture des motifs des électrodes de la microcellule et de l'électrode de capture / - dans un réacteur à plasma, gravure ionique complète de 500nm de SiO 2 dans les zones sans résine ; et - retrait de la résine dans un bain d' acide nitrique . L'électrode de travail (We) , la contre- électrode (CE) et l'électrode annexe utilisée pour former la zone de capture (Zc) sont en platine (dépôt
5000 A environ) (voir fig. 4) . Une électrode de référence Ag/AgCl/Cl" (Rf) est également présente. Cette électrode est obtenue par dépôt d'argent sur le platine avec le protocole suivant : - préparation de 10 ml de solution contenant AgN03 0,2 M, Kl 2 M, Na2S203 0,5 mM ; - un potentiel de -0,65 V vs ECS (électrode au calomel saturé) est imposé pendant 90 secondes (suivi par chronoampérométrie) sur l'électrode de référence. Un dépôt gris/blanc est obtenu. La zone de travail est ensuite rincée à l'eau ; et la zone de travail avec l'électrode modifiée précédemment est plongée dans une solution de HC1 0,1 M et on impose un potentiel de 0,5 V vs ECS pendant 30 secondes pour chlorer le dépôt d'argent. Le substrat est ensuite rincé à 1 ' eau. L'ensemble des zones de travail a été silanisé avec un silane hydrophobe suivant le protocole décrit dans 1 ' exemple 1. La barrière hydrophile est réalisée sur l'électrode de capture selon le protocole décrit dans 1 ' exemple 4.1- (γ) . La contre-électrode (CE) est ensuite fonctionnalisée avec un copolymère conducteur pyrrole/pyrrole fonctionnalisé en position 1 par la fonction biologique (ici un oligonucleotide sonde) [5] . L' électropolymérisation est localisée sur la contre- électrode de la zone de travail . Pour tester cette zone de travail, l' oligonucleotide sonde est hybride avec un oligonucleotide cible (100 pM) porteur d'un marqueur enzymatique (HRP "Horse Radish Peroxidase") dans un tampon (NaCl 1 M/Tris 10 mM/EDTA 1 mM/Triton X100 0,05%) . Après des lavages dans le même tampon mais sans triton, la solution de révélation (OPD + H202 + tampon phosphate-citrate 50 mM) est introduite sur le dispositif de la présente invention puis aspirée. Une fraction de liquide est bien laissée de manière localisée sur la zone de travail comme le montrent les photographies de la figure 5 : - à gauche, avant que le dispositif ne soit recouvert de la solution de révélation, on distingue le dispositif de la présente invention sans la goutte ; et - à droite, après que la solution de révélation ait été aspirée, on distingue le dispositif de la présente invention ayant capturé grâce à sa zone de capture (bande hydrophile) une goutte de la solution de révélation. Après 5 minutes de révélation, le produit enzymatique est détecté par voltampérométrie puisée différentielle sur l'électrode de mesure ( E) . Les résultats de cette détection sont représentés par le graphique de la figure 6 annexée . La figure 4 est une représentation schématique d'une microcellule électrochimique d'un dispositif selon l'invention obtenu en utilisant le protocole de cet exemple. Sur cette figure, la zone de travail est constituée de l'électrode de mesure ou électrode de travail (WE) , du polymère conducteur porteur de 1' oligonucleotide (Po) déposé sur la contre-électrode (CE) et de la zone de capture (Zc) formée par l'électrode la plus externe sur laquelle le polymère porteur des fonctions alcools a été déposé (Pm) . L'ensemble est réalisé sur la surface active (Sa) non mouillante.
Exemple 6 : Fonctionnalisation localisée de zones de travail de puces selon l'invention avec un réactif coûteux Dans cet exemple, on utilise un système à quatre électrodes dont la surface a été rendue hydrophobe comme dans 1 ' exemple 5. La barrière hydrophile et le greffage de la molécule biologique sont réalisés avec le protocole suivant : A) réalisation de la barrière hydrophile qui constitue la zone de capture : la barrière hydrophile est réalisée comme dans l'exemple 4.1. B) introduction sur le composant de la solution électrolytique contenant le pyrrole, le pyrrole fonctionnalisé par un oligonucleotide et l'électrolyte support LiC104 0,1 M. La solution est aspirée laissant ainsi une goutte de la solution électrolytique bien localisée sur la zone de travail (microcellule électrochimique) donnant le même résultat que celui qui est montré sur la photographie de droite de la figure 5. L' électropolymérisation est alors réalisée sur la contre-électrode en conditions potentiostatiques (1 V vs Ag/AgCl/Cl") pendant 2 secondes. Le polypyrrole porteur de l' oligonucleotide est ainsi déposé sur la zone de travail exclusivement.
Le dispositif de l'invention permet donc bien d'économiser les réactifs notamment lors d'une fonctionnalisation d'une grande surface comprenant plusieurs dispositifs électrochimiques indépendants répartis sur cette surface, et donc aussi pour confiner le réactif sur la zone d'électrodes d'une puce complète selon l'invention. Il est également possible de réaliser ainsi un système dans lequel la bande mouillante (zone de capture) entoure un ensemble de microcellules électrochimiques, c'est-à-dire plusieurs zones de travail, par exemple comme sur la figure 2. Exemple 7 : Fabrication d'une boîte selon l'invention et fonctionnement de cette boîte
7.1 Fabrication de la boîte Un capot creux en polydimét ylsiloxane (PDMS) est fabriqué par moulage sur un moule en verre avec un motif carré en surépaisseur de 1 mm. Sur un dispositif de la présente invention plan comme ceux obtenus dans les exemples précédents, ce capot creux est fixé de manière hermétique par collage avec de la colle réticulant par insolation aux rayons ultraviolets (VITRALIT 6181) . Les connexions pour les entrées et sorties des fluides sont réalisées par perçage du capot avec des aiguilles de faible diamètre. L'aiguille d'entrée est reliée à des tubes de transport de fluide et à une seringue pleine du liquide d'intérêt. L'ensemble final est testé pour détecter d'éventuelles fuites, sachant que le liquide doit passer uniquement par les connexions prévues à cet effet. La figure 7 est une représentation schématique de la boîte telle obtenue dans cet exemple. D'autres dispositions des connexions d'entrée et de sortie peuvent facilement être réalisées, et la figure 8 reprend des représentations schématiques des boîtes qui peuvent être obtenues suivant le protocole décrit dans cet exemple . Sur cette figure 8 , Bl, B2 et B3 représentent trois types de boîtes selon l'invention avec des ouvertures d'entrée (o) et de sortie (s) placées différemment. Sb, Sa, Zc, Zt ont la même signification que sur les figures précitées . les différents éléments qui la constituent la boîte de l'invention sont représentés de la même manière sur les trois schémas. La figure 9 est une représentation schématique vue du dessus d'une plaquette P selon l'invention qui est utilisée pour fabriquer une boîte selon l'invention. Cette plaquette comporte 81 zones de capture et zone de travail correspondantes agencées sur une surface active non mouillante conformément à la présente invention.
7.2 Fonctionnement de la boîte et résultats Le fonctionnement des boîtes précitées est testé. La figure 7 représente le fonctionnement de la boîte Bl de la figure 8. Le liquide d'intérêt E est injecté dans la boîte (7a) par une des ouvertures (o) jusqu'à remplissage (7b), puis extrait par l'autre ouverture (s). Le moyen d'injection utilisé est une seringue, et le moyen d'extraction utilisé est une seringue . Le remplissage de la boîte n'est pas obligatoire, l'essentiel est que les différentes zones de capture soient couvertes par le liquide d'intérêt. Cet exemple montre qu'une matrice de gouttes (g) bien localisées sur les différentes zones de capture est obtenue grâce à ce dispositif conforme à la présente invention. Liste des références
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[12] FR-A-2 818 662.
[13] EP-B-561 722.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif de travail comprenant : un substrat comportant une surface active (Sa) sensiblement non mouillante vis-à-vis d'un liquide d'intérêt, - au moins une zone de capture (Zc) localisée d'une goutte dudit liquide d'intérêt formée sur ladite surface active, - au moins une zone de travail (Zt) arrangée avec la zone de capture pour que ladite zone de capture entoure la zone de travail de manière continue ou discontinue, de telle manière que la zone de travail soit recouverte au moins partiellement par la goutte du liquide d'intérêt lorsque celle-ci est capturée par ladite zone de capture, des moyens d'approvisionnement en liquide d'intérêt permettant de laisser une goutte dudit liquide d'intérêt sur ladite zone de capture.
2. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel au moins une zone de capture a une forme ouverte ou fermée choisie parmi une forme annulaire, en étoile, en rectangle, en carré, en triangle, en ellipse, ou en polygone ayant de 4 à 20 côtés, et entoure la, au moins une, zone de travail.
3. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel une zone de capture d'une goutte de liquide d'intérêt entoure plusieurs zones de travail.
4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la zone de capture est une zone de capture chimique, électrique ou physique d'une goutte de liquide d'intérêt.
5. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel la zone de capture est un creux de, ou une saillie sur, la surface active permettant de capturer la goutte par des forces capillaires .
6. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel la, au moins une, zone de capture est une électrode de capture par mouillage.
7. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel la, au moins une, zone de capture est constituée de silicium noir.
8. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel la, au moins une, zone de capture est une électrode de capture par électro-mouillage.
9. Dispositif selon la revendication 6, dans lequel l'électrode de capture par mouillage est constituée d'un matériau choisi dans le groupe constitué des métaux nobles, des alliages de métaux nobles, de carbone, de graphite, d'ITO, ledit matériau étant rendu mouillant par électrodéposition sur celui- ci d'un polymère conducteur d'électricité sur lequel est fixée une fonction chimique mouillante vis-à-vis du liquide d' intérêt .
10. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel la zone de capture est constituée d'un matériau rendu mouillant par greffage sur celui-ci d'une fonction chimique mouillante vis-à-vis du liquide d'intérêt.
11. Dispositif selon la revendication 10, dans lequel le matériau est choisi dans le groupe constitué du silicium, de l'oxyde de silicium, du verre, du nitrure de silicium, des polymères organiques ; et d'un métal ou d'un alliage métalique.
12. Dispositif selon la revendication 11, dans lequel le greffage sur le matériau est réalisé par silanisation avec un silane porteur de la fonction chimique mouillante.
13. Dispositif selon la revendication 6, dans lequel l'électrode de capture par mouillage est une électrode en or rendue mouillante par physisorption d'un thiol sur lequel est fixée une fonction chimique mouillante vis-à-vis du liquide d'intérêt.
14. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, dans lequel, le liquide d'intérêt étant aqueux, la fonction chimique mouillante vis-à-vis du liquide d'intérêt est choisie dans le groupe constitué d'une fonction alcool, alcoolate, acide carboxylique, carboxylate, acide sulfonique, sulfonate, oxyamine, hydrazine, aminé, ammonium.
15. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel, le liquide d'intérêt étant aqueux, la, au moins une, zone de capture est une zone hydrophile et la surface active sensiblement non mouillante est hydrophobe .
16. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la zone de capture et la, ou les, zone (s) de travail arrangée (s) avec elle peuvent être placées dans un creux ou sur une saillie par rapport à la surface active.
17. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la, au moins une, zone de travail est une zone d'interaction électrique et/ou chimique avec ladite goutte de liquide d' intérêt capturée .
18. Dispositif selon la revendication 17, dans lequel la, au moins une, zone de travail est une microcellule électrochimique.
19. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, dans lequel la, au moins une, zone de travail est une zone de détection d' au moins une espèce chimique ou biologique susceptible d'être présente dans la goutte de liquide d'intérêt lorsqu'elle est capturée.
20. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, dans lequel la, au moins une, zone de travail est une zone fonctionnalisée par une sonde destinée à interagir avec une cible susceptible d'être présente dans la goutte de liquide d'intérêt lorsqu'elle est capturée.
21. Dispositif selon la revendication 18 lorsqu'elle dépend de l'une quelconque des revendications 6, 9 à 14, dans lequel l'électrode de capture d'une goutte de liquide d'intérêt par mouillage sert également d'électrode pour le fonctionnement de la microcellule électrochimique de la zone de travail.
22. Dispositif selon la revendication 17 ou 18 lorsqu'elle dépend de la revendication 9, dans lequel l'électrode de capture d'une goutte de liquide d'intérêt par mouillage sert également d'électrode pour le fonctionnement de la microcellule électrochimique de la zone de travail, et dans lequel ladite électrode est fonctionnalisée par une sonde destinée à interagir avec une cible susceptible d'être présente dans la goutte de liquide d'intérêt.
23. Dispositif selon la revendication 22, dans lequel la sonde est fixée sur le polymère conducteur d'électricité porteur d'une fonction mouillante.
24. Dispositif selon la revendication 9, 22 ou 23, dans lequel le polymère conducteur d'électricité est choisi dans le groupe constitué du polypyrrole, de la polyaniline, du polyazulene, d'un polythiophène, d'un polyindole, d'un polyfurane, d'un polyfluorène .
25. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 20, 22 à 24, dans lequel la sonde est choisie dans le groupe constitué par une enzyme, un substrat d'enzyme, un oligonucleotide, un oligonucléoside, une protéine, un récepteur membranaire d'une cellule eucaryote ou procaryote, un anticorps, un antigène, une hormone, un métabolite d'un organisme vivant, une toxine d'un organisme vivant, un polynucléotide, un polynucléoside, un ADN complémentaire .
26. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, dans lequel la, au moins une, zone de travail est un capteur choisi dans le groupe constitué des capteurs optiques, électriques, magnétiques, électrostatiques, mécaniques, thermiques et chimiques.
27. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, dans lequel la, au moins une, zone de travail est un actionneur choisi dans le groupe constitué des actionneurs optiques, électriques, magnétiques, électrostatiques, mécaniques, thermiques et chimiques .
28. Dispositif selon la revendication 1, . dans lequel la, au moins une, zone de travail est une zone sensiblement non mouillante vis-à-vis du liquide d'intérêt.
29. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la surface active est une surface constituée d'un matériau choisi dans le groupe constitué du silicium ; de l'oxyde de silicium ; du verre ; du nitrure de silicium ; d'un polymère organique ; d'un métal ou d'un alliage métallique.
30. Plaquette de travail comprenant plusieurs dispositifs de travail identiques ou différents selon l'une quelconque des revendications 1 à 29.
31. Plaquette de travail selon la revendication 30, dans laquelle les dispositifs de travail forment une matrice.
32. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 29, ou plaquette selon la revendication 30 ou 31, dans lequel les moyens permettant de laisser une goutte de liquide d'intérêt sur ladite zone de capture localisée est un dispenseur d'une goutte de liquide d'intérêt par zone de capture.
33. Boîte de travail comprenant : - un conteneur comprenant des moyens pour l'introduction d'un liquide d'intérêt dans le conteneur et d'extraction de liquide d'intérêt du conteneur, - un dispositif de travail selon la revendication 1, ou une plaquette selon la revendication 30 ou 31, placé (e) dans ledit conteneur, les moyens d'introduction et d'extraction du liquide d'intérêt du conteneur étant disposés de telle manière que lorsque le liquide d'intérêt est introduit dans le conteneur, il couvre la, au moins une, zone (s) de capture, puis lorsque le liquide d'intérêt est extrait du conteneur, une goutte de liquide d'intérêt reste captive par ladite zone de capture.
34. Boîte de travail selon la revendication 33, dans lequel les moyens d'extraction du liquide d'intérêt du conteneur sont constitués d'une pompe d'injection d'un fluide gazeux par une ouverture d'entrée de manière à extraire le liquide d'intérêt en le chassant du conteneur par une ouverture de sortie.
35. Boîte de travail selon la revendication 34, dans lequel la pompe d'injection du fluide gazeux par l'ouverture d'entrée du conteneur comprend un dispositif de saturation du fluide gazeux injecté en vapeur du liquide d'intérêt.
36. Boîte de travail selon la revendication 33, dans lequel les moyens d'extraction de liquide d'intérêt du conteneur sont constitués d'une pompe aspirante disposée de manière à extraire le liquide d'intérêt du conteneur en l'aspirant.
37. Système comprenant un ou plusieurs dispositif (s) de travail selon l'une quelconque des revendications 1 à 29, ou une plaquette selon la revendication 30 ou 31.
38. Système comprenant une boîte de travail selon l'une quelconque des revendications 33 à 36.
39. Puce biologique comprenant un dispositif de travail selon l'une quelconque des revendications 1 à
29, ou une plaquette selon la revendication 30 ou 31.
40. Puce biologique selon la revendication 39, ladite puce étant choisie dans le groupe constitué des puces à acide nucléique, à anticorps, à antigènes, à protéine et à cellules .
41. Boîte comprenant une puce biologique selon la revendication 39 ou 40.
42. Procédé de fabrication d'un dispositif selon la revendication 1, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : - fournir un substrat comportant une surface choisie pour devenir la surface active, - structurer la surface choisie du substrat afin de former sur celle-ci une zone de travail, - appliquer un traitement sur la surface choisie afin de la rendre sensiblement non mouillante vis-à-vis du liquide d'intérêt auquel le dispositif est destiné, et structurer la surface choisie afin de former une zone de capture d'une goutte de liquide d'intérêt, les étapes de structuration de la surface pour former une zone de travail et de structuration de la surface pour former la zone de capture étant réalisées afin que la zone de travail soit arrangée avec la zone de capture pour que la zone de capture entoure la zone de travail de manière continue ou discontinue de telle manière que lorsque la zone de capture capture une goutte de liquide d'intérêt la zone de travail soit recouverte au moins partiellement par ladite goutte.
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