JPWO2020077227A5

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Publication number: JPWO2020077227A5
Application number: JP2021519846A
Authority: JP
Publication date: 2022-10-19

Claims

鋳型に依存しないＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、以下：
（ａ）イニシエーターオリゴヌクレオチドを提供すること、ここで、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡである；
（ｂ）ポリ（Ｎ）ポリメラーゼを提供すること；
（ｃ）イニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端への少なくとも１つの修飾ヌクレオチドの付加のために十分な条件下において、イニシエーターオリゴヌクレオチド、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼ、および１つ以上の修飾ヌクレオチドを組み合わせること；
を含む、前記方法。
ポリ（Ｎ）ポリメラーゼが、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ポリ（Ｃ）ポリメラーゼ、またはポリ（Ｇ）ポリメラーゼ；またはそれらの変異体、またはそれらのホモログである、請求項１に記載の方法。
ポリ（Ｎ）ポリメラーゼが、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、またはそれらの変異体、またはそれらのホモログである、請求項１または２に記載の方法。
ポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、野生型Schizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、またはそれらの変異体、またはそれらのホモログである、請求項３に記載の方法。
修飾ヌクレオチドが、２’－修飾された可逆性ターミネーターヌクレオチドである、または、修飾ヌクレオチドが、３’修飾された可逆性ターミネーターヌクレオチドである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
鋳型に依存しないＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、以下：
（ａ）イニシエーターオリゴヌクレオチドを提供すること、ここで、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡである；
（ｂ）ポリ（Ｕ）ポリメラーゼを提供すること；
（ｃ）イニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端への２’および／または３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドの付加のために十分な条件下において、イニシエーターオリゴヌクレオチド、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、ならびに２’および／または３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドを、組み合わせること；
（ｄ）ステップ（ｃ）において２’および／または３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドの保護された２’および／または３’－Ｏ－位において形成されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを脱保護すること；ならびに
（ｅ）任意に、所望されるＲＮＡ配列が得られるまで、ステップ（ａ）～（ｄ）を繰り返すこと；
を含む、前記方法。
可逆性ターミネーターヌクレオチドが、２’－Ｏ位において酸素保護基により保護された２’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドである、または、
可逆性ターミネーターヌクレオチドが、３’－Ｏ位において酸素保護基により保護された３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドである、
請求項６に記載の方法。
２’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－シリル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｏ－アジドメチル、２’－Ｏ－ベンジル、２’－Ｏ－クマリニル、または２’－Ｏ－カーボネート修飾ヌクレオチドである、または
３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドが、３’－Ｏ－アルキル、３’－Ｏ－シリル、３’－Ｏ－アリル、３’－Ｏ－アジドメチル、３’－Ｏ－ベンジル、３’－Ｏ－クマリニル、または３’－Ｏ－カーボネート修飾ヌクレオチドである、
請求項６または７に記載の方法。
２’および／または３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドが、
以下の式：

式中：
Ｙは、ＯまたはＳであり；
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ^Ｐの各々の場合は、水素、酸素保護基、任意置換アシル、またはアミノ酸であるか、または２個のＲ^Ｐは、介在する原子と一緒になって連結されて、任意置換ヘテロシクリルを形成する；ただし、少なくとも１つのＲ^Ｐは、酸素保護基、任意置換アシル、またはアミノ酸であり；および
「塩基」は、天然または非天然のヌクレオチド塩基である
のもの、またはその塩である；あるいは
３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドが、以下の式：

式中：
Ｙは、ＯまたはＳであり；
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ^Ｐは、酸素保護基、任意置換アシル、またはアミノ酸であり；
Ｒは、水素、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＯ_２、－Ｎ_３、任意置換アルキル、任意置換アルケニル、任意置換アルキニル、任意置換アリール、任意置換ヘテロアリール、任意置換カルボシクリル、任意置換ヘテロシクリル、任意置換アシル、任意置換ヒドロキシル、任意置換アミノ、または任意置換チオールであり；および
「塩基」は、天然または非天然のヌクレオチド塩基である
のもの、またはその塩である；あるいは
３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドが、以下の式：

式中：
Ｙは、ＯまたはＳであり；
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ^Ｐは、酸素保護基、任意置換アシル、またはアミノ酸であり；および
「塩基」は、天然または非天然のヌクレオチド塩基である
のもの、またはその塩である、
請求項６に記載の方法。
鋳型に依存しないＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、以下：
（ａ）イニシエーターオリゴヌクレオチドを提供すること、ここで、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡである；
（ｂ）ポリ（Ｕ）ポリメラーゼを提供すること；
（ｃ）イニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端への少なくとも１つの加水分解性ヌクレオチドの付加のために十分な条件下において、イニシエーターオリゴヌクレオチド、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、１つ以上のヌクレオチド、および１つ以上の非加水分解性ヌクレオチドを組み合わせること、ここで、非加水分解性ヌクレオチドの濃度は、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼによる１つ以上のヌクレオチドの付加の速度を阻害するために十分である；
を含み、
任意に、
（ｄ）所望されるＲＮＡ配列が得られるまで、ステップ（ａ）～（ｃ）を繰り返すこと；
をさらに含む、前記方法。
非加水分解性ヌクレオチドが、修飾された三リン酸基を含む、請求項１０に記載の方法。
ＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、以下：
（ａ）第１のオリゴヌクレオチドを提供すること、ここで、第１のオリゴヌクレオチドは、５’－三リン酸基を含む；
（ｂ）第２のオリゴヌクレオチドを提供すること；
（ｃ）ポリ（Ｕ）ポリメラーゼを提供すること；
（ｄ）第２のオリゴヌクレオチドの３’末端への第１のオリゴヌクレオチドのライゲーションのために十分な条件下において、第１および第２のオリゴヌクレオチドならびにポリ（Ｕ）ポリメラーゼを組み合わせること；
を含む、前記方法。
ポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、野生型Schizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、またはそれらの変異体である、請求項６～１２のいずれか一項に記載の方法。
以下のステップ：
（ｆ）結果として生じるＲＮＡオリゴヌクレオチドに対して、逆転写プライミング部位、プライマーおよび逆転写酵素を用いて逆転写を行い、それにより相補的一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡを生成すること；
をさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法であって、
任意に、以下のステップ：
（ｇ）ステップ（ｆ）において生成された相補的一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼで増幅し、それにより二本鎖ＤＮＡを生成すること；
をさらに含む、前記方法。
ステップ（ｃ）が、クラウディング剤の存在下において行われる；および／または
ステップ（ｃ）が、さらなるポリ（Ｎ）ポリメラーゼの存在下において行われる；および／または
ステップ（ｃ）が、酵母の無機ピロホスファターゼ（ＰＰＩ－アーゼ）の存在下において行われる；および／または
ステップ（ｃ）が、ＲＮａｓｅ阻害剤の存在下において行われる；および／または
ステップ（ｃ）が、非加水分解性ヌクレオチドの存在下において行われる、
請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
ポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼである、請求項３～１５のいずれか一項に記載の方法。
変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、
Ｈ３３６Ａ、Ｈ３３６Ｃ、Ｈ３３６Ｄ、Ｈ３３６Ｅ、Ｈ３３６Ｆ、Ｈ３３６Ｇ、Ｈ３３６Ｉ、Ｈ３３６Ｋ、Ｈ３３６Ｌ、Ｈ３３６Ｍ、Ｈ３３６Ｔ、Ｈ３３６Ｖ、Ｈ３３６Ｗ、Ｈ３３６Ｙ、Ｈ３３６Ｎ、Ｈ３３６Ｐ、Ｈ３３６Ｑ、Ｈ３３６Ｒ、Ｈ３３６ＳおよびＨ３３６Ｗからなる群より選択されるＨ３３６変異；および／または
Ｎ１７１Ｅ、Ｎ１７１Ｌ、Ｎ１７１Ｑ、Ｎ１７１Ｓ、Ｎ１７１Ｍ、Ｎ１７１Ｄ、Ｎ１７１Ｇ、Ｎ１７１Ｃ、Ｎ１７１Ａ、Ｎ１７１Ｗ、Ｎ１７１Ｔ、Ｎ１７１Ｉ、Ｎ１７１Ｖ、Ｎ１７１Ｐ、Ｎ１７１Ｒ、Ｎ１７１Ｈ、およびＮ１７１Ｋからなる群より選択されるＮ１７１変異；および／または
Ｔ１７２Ｅ、Ｔ１７２Ｌ、Ｔ１７２Ｑ、Ｔ１７２Ｓ、Ｔ１７２Ｍ、Ｔ１７２Ｄ、Ｔ１７２Ｇ、Ｔ１７２Ｃ、Ｔ１７２Ａ、Ｔ１７２Ｗ、Ｔ１７２Ｔ、Ｔ１７２Ｉ、Ｔ１７２Ｖ、Ｔ１７２Ｐ、Ｔ１７２Ｒ、Ｔ１７２ＨおよびＴ１７２Ｋからなる群より選択されるＴ１７２変異
を含む、請求項１６に記載の方法。
請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法により調製される、ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
以下の式：

式中：
Ｙは、ＯまたはＳであり；
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ^Ｐの各々の場合は、水素、酸素保護基、任意置換アシル、またはアミノ酸であるか、または２個のＲ^Ｐは、介在する原子と一緒になって連結されて、任意置換ヘテロシクリルを形成する；ただし、少なくとも１つのＲ^Ｐは、酸素保護基、任意置換アシル、またはアミノ酸であり；および
「塩基」は、天然または非天然のヌクレオチド塩基である；あるいは
以下の式：

式中：
Ｙは、ＯまたはＳであり；
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ^Ｐは、酸素保護基、任意置換アシル、またはアミノ酸であり；
Ｒは、水素、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＯ_２、－Ｎ_３、任意置換アルキル、任意置換アルケニル、任意置換アルキニル、任意置換アリール、任意置換ヘテロアリール、任意置換カルボシクリル、任意置換ヘテロシクリル、任意置換アシル、任意置換ヒドロキシル、任意置換アミノ、または任意置換チオールであり；および
「塩基」は、天然または非天然のヌクレオチド塩基である；あるいは
以下の式：

式中：
Ｙは、ＯまたはＳであり；
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒ^Ｐは、酸素保護基、任意置換アシル、またはアミノ酸であり；および
「塩基」は、天然または非天然のヌクレオチド塩基である、
で表される化合物、またはその塩。
化合物が、３’－Ｏ－アリル－ＮＴＰ、３’－Ｏ－アジドメチル－ＮＴＰ、３’－Ｏ－アリルカーボネート－ＮＴＰ、３’－Ｏ－アリルカーボネート－ｄＮＴＰ、３’－Ｏ－アジドメチルカーボネート－ＮＴＰ、または３’－Ｏ－アジドメチルカーボネート－ｄＮＴＰである、あるいは
化合物が、２’－Ｏ－アリル－ＮＴＰまたは２’－Ｏ－アジド－メチル－ＮＴＰである、
請求項１９に記載の化合物。
化合物が、図２８～３４において列挙される式のうちのいずれか１つのものである、請求項１９または２０に記載の化合物。
Ｈ３３６、Ｎ１７１およびＴ１７２から選択される１つ以上の位置において変異を含む、変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼである、ポリメラーゼ。
変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、
Ｈ３３６Ａ、Ｈ３３６Ｃ、Ｈ３３６Ｄ、Ｈ３３６Ｅ、Ｈ３３６Ｆ、Ｈ３３６Ｇ、Ｈ３３６Ｉ、Ｈ３３６Ｋ、Ｈ３３６Ｌ、Ｈ３３６Ｍ、Ｈ３３６Ｔ、Ｈ３３６Ｖ、Ｈ３３６Ｗ、Ｈ３３６Ｙ、Ｈ３３６Ｎ、Ｈ３３６Ｐ、Ｈ３３６Ｑ、Ｈ３３６Ｒ、Ｈ３３６ＳおよびＨ３３６Ｗからなる群より選択されるＨ３３６変異；および／または
Ｎ１７１Ｅ、Ｎ１７１Ｌ、Ｎ１７１Ｑ、Ｎ１７１Ｓ、Ｎ１７１Ｍ、Ｎ１７１Ｄ、Ｎ１７１Ｇ、Ｎ１７１Ｃ、Ｎ１７１Ａ、Ｎ１７１Ｗ、Ｎ１７１Ｔ、Ｎ１７１Ｉ、Ｎ１７１Ｖ、Ｎ１７１Ｐ、Ｎ１７１Ｒ、Ｎ１７１Ｈ、およびＮ１７１Ｋからなる群より選択されるＮ１７１変異；および／または
Ｔ１７２Ｅ、Ｔ１７２Ｌ、Ｔ１７２Ｑ、Ｔ１７２Ｓ、Ｔ１７２Ｍ、Ｔ１７２Ｄ、Ｔ１７２Ｇ、Ｔ１７２Ｃ、Ｔ１７２Ａ、Ｔ１７２Ｗ、Ｔ１７２Ｔ、Ｔ１７２Ｉ、Ｔ１７２Ｖ、Ｔ１７２Ｐ、Ｔ１７２Ｒ、Ｔ１７２ＨおよびＴ１７２Ｋからなる群より選択されるＴ１７２変異
を含む、請求項２２に記載のポリメラーゼ。
請求項１９～２１のいずれか一項に記載の化合物および／または請求項２２または２３に記載のポリメラーゼを含む、キット。