CN118064340A - 一种生产二岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产二岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，属于微生物基因工程和生物合成领域。本发明通过引入质粒游离表达从头合成GDP‑岩藻糖通路的关键酶并在基因组上强化基因簇的启动子，提供充足的GDP‑岩藻糖作为供体，避免添加高成本的前体。通过优化乳糖添加量，改善了α1,2岩藻糖基转移酶和α1,3/4‑岩藻糖基转移酶共转化生产DFL时2′‑FL产量过高的问题。通过引入α1,2岩藻糖基转移酶和α1,3/4‑岩藻糖基转移酶，达到出色的搭配效果，解决了酶催化的限速问题，摆脱了乳糖抑制问题并实现了乳糖到二岩藻糖基乳糖的高效转化。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产二岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，属于微生物基因工程和生物合成领域。
背景技术
母乳低聚糖(HMOs)是母乳中第三大固体成分，其对婴幼儿有多种有益影响。2′-岩藻糖基乳糖(2′-FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、二岩藻糖基乳糖(DFL)和乳糖-N-一型岩藻五糖(LNFP I)是具有代表性的岩藻糖基型HMOs。最新研究表明，DFL和2′-FL是最具有选择性利用的碳水化合物，其次是3-FL。HMO的选择性能够促进有益微生物的繁殖和生长，同时抑制有害病原体的存活和增殖，从而有助于婴儿肠道微生物群的健康发展。2′-FL/DFL已在欧洲被批准为新型食品，在美国被普遍认为是安全的(GRAS)(GRN No.815)。
目前，微生物合成HMO已成为一种主流方法。通常，合成DFL的第一步是通过α1,2-岩藻糖基转移酶或α1,3-岩藻糖基转移酶将乳糖岩藻糖基化，随后2′-FL或3-FL被用作受体来岩藻糖基化生产DFL。在这些路径中，GDP-岩藻糖是两步连续岩藻糖基化反应的关键供体。GDP-岩藻糖的生物合成可以由两种不同的路径实现：从头合成途径和补救途径。从头合成由甘露糖6-磷酸异构酶(ManA)、磷酸甘露糖变位酶(ManB)、1-磷酸甘露糖鸟苷转移酶(ManC)、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶(Gmd)和GDP-岩藻糖合成酶(WcaG)参与，在大肠杆菌中通过连续5次级联反应将果糖6-磷酸转化为GDP-岩藻糖，而不需要额外添加GDP-岩藻糖作为底物。目前已报道的文献中，多用补救途径合成DFL，导致成本较高。因此，找到合适且适配的α1,2-岩藻糖基转移酶和α1,3-岩藻糖基转移酶，合理优化从头合成GDP-岩藻糖的通路以提供充足的前体，是显著提高DFL产量，降低成本并减少副产物的必要步骤。
发明内容
本发明提供一种重组菌株，它涉及游离过表达内源从头合成GDP-岩藻糖的通路酶及基因组上强化关键内源通路酶的启动子，并引入外源的α1,2岩藻糖基转移酶(FucT2或WbgL)和α1,3/4-岩藻糖基转移酶(HP3/4FT)，能高效生产二岩藻糖基乳糖(DFL)且能够较少的产生2′-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖。
本发明敲除竞争旁路、强化关键酶的启动子及利用游离质粒过表达通路酶和岩藻糖基转移酶表达框等策略提升工程菌的产能和减少副产物；通过选择具有杂化性和底物特异性的来源于大肠杆菌O126的α1,2-岩藻糖基转移酶WbgL，来源于幽门螺杆菌UA802的α1,2-岩藻糖基转移酶FucT2和来源于幽门螺杆菌UA948的α1,3/4-岩藻糖基转移酶HP3/4FT来减少生产DFL过程中产生的副产物FL，从而实现DFL的高产能。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌为，敲除了大肠杆菌基因组上的β-半乳糖苷酶基因lacZ和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ，并利用强组成型启动子PJ23119启动基因组上manC-manB基因簇和gmd-wcaG基因簇的表达，同时，游离表达了大肠杆菌BL21(DE3)内源的磷酸甘露糖酶基因manB、甘露糖1-鸟苷酸转移酶基因manC、GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶基因gmd和GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG，游离表达了来源于幽门螺杆菌UA948的α1,3/4-岩藻糖基转移酶基因HP3/4FT，同时游离表达了来源于幽门螺杆菌UA802的α1,2-岩藻糖基转移酶基因fucT2或来源于大肠杆菌O126的α1,2-岩藻糖基转移酶基因wbgL。
本发明提供的一种高效合成DFL的质粒大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，所述大肠杆菌在底盘细胞敲除了β-半乳糖苷酶基因lacZ和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ。利用强组成型启动子PJ23119替换基因组上manC-manB、gmd-wcaG基因簇的原始启动子中的一种或多种。所述基因工程菌游离表达了磷酸甘露糖酶基因、甘露糖1-鸟苷酸转移酶基因、GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶基因、GDP-岩藻糖合成酶基因和α1,2岩藻糖基转移酶基因和α1,3/4-岩藻糖基转移酶基因。
在本发明的一种实施方式中，所述β-半乳糖苷酶编码基因lacZ的GenBank号为NP_414878.1，编码UDP-葡萄糖脂质载体转移酶编码基因wcaJ的GenBank号为NP_416551.1。
在本发明的一种实施方式中，所述磷酸甘露糖酶编码基因manB的GenBank号为NP_416552.1；所述甘露糖1-鸟苷酸转移酶编码基因manC的GenBank号为NP_416553.1；所述GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶编码基因gmd的GenBank号为NP_416557.1；所述GDP-岩藻糖合成酶编码基因wcaG的GenBank号为NP_416556.1。
在本发明的一种实施方式中，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的PJ23119启动子分别和同时过表达了基因簇manC-manB(SEQ ID NO.5)，gmd-wcaG(SEQ ID NO.6)。
本发明的一种实施方式中，所述α1,3/4-岩藻糖基转移酶HP3/4FT来源于幽门螺杆菌UA948，α1,2-岩藻糖基转移酶FucT2来源于幽门螺杆菌UA802，另一种α1,2-岩藻糖基转移酶WbgL来源于大肠杆菌O126，三者的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，采用pCDFDuet-1载体游离表达了α1,2岩藻糖基转移酶基因wbgL或fucT2、采用pETDuet-1载体游离表达α1,3/4岩藻糖基转移酶HP3/4FT。
在本发明的一种实施方式中，采用pCDFDuet-1载体游离表达了α1,2岩藻糖基转移酶基因wbgL或fucT2、采用pETDuet-1载体游离表达α1,3/4岩藻糖基转移酶HP3/4FT。采用pRSFDuet-1载体游离表达了基因组上的基因簇manC-manB和gmd-wcaG。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌的宿主细胞包括不限于大肠杆菌BL21(DE3)。
在本发明的一种实施方式中，所述启动子PJ23119核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种制备二岩藻糖基的方法，所述方法为，以甘油为碳源，以乳糖为底物，以上述任一所述的重组大肠杆菌为发酵生产二岩藻糖基乳糖。
在本发明的一种实施方式中，以所述的两种重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为发酵菌株，在以甘油为碳源，乳糖为底物的发酵体系中生产DFL。
在本发明的一种实施方式中，在摇瓶或5L发酵罐中生产DFL。
在本发明的一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌的种子液添加至含有20g/L甘油，37℃，200rpm，培养至OD600＝0.7±0.1，加入终浓度为0.1～0.5mM IPTG，同时加入终浓度为1～5g/L乳糖，25～28℃，180～220rpm继续诱导培养不少于72h。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌添加至含有20g/L甘油的摇瓶发酵体系中，30～40℃，培养至OD600＝0.7±0.1，加入终浓度为0.1～0.5mM的IPTG和终浓度为1～5g/L乳糖，在25～28℃，180～220rpm继续诱导培养不少于72h。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌种子液添加至含有30g/L甘油的分批补料发酵体系中，30～40℃，培养至OD600＝16±1，加入终浓度为0.1～0.5mM的IPTG和终浓度为1～8g/L乳糖，在25～28℃，180～220rpm继续诱导培养不少于72h。发酵过程中补加甘油和乳糖以维持甘油和乳糖浓度均不低于2g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵体系中还含有12～15g/L磷酸二氢钾，3.0～5.0g/L磷酸氢二氨，1.0～2.0g/L柠檬酸，1.0～2.0g/L七水硫酸镁和5～15ml/L微量金属元素；微量金属元素包括：5.0～10.0g/L硫酸亚铁，2.0～3.0g/L七水硫酸锌，1.0～2.0g/L无水硫酸铜，0.3～0.5g/L一水硫酸锰，0.2～0.5g/L十水硼酸钠，0.1～0.3g/L钼酸铵，1.0～3.0g/L二水氯化钙。
在本发明的一种实施方式中，发酵体系中还含有13.5g/L磷酸二氢钾、4.0g/L磷酸氢二氨、1.7g/L柠檬酸、1.4g/L七水硫酸镁和10ml/L微量金属元素。微量金属元素母液包括：10g/L硫酸亚铁，2.25g/L七水硫酸锌，1.0g/L无水硫酸铜，0.35g/L一水硫酸锰，0.23g/L十水硼酸钠，0.11g/L钼酸铵，2.0g/L二水氯化钙。
本发明还提供了上述任一所述的重组大肠杆菌或上述方法在制备二岩藻糖基乳糖或含有二岩藻糖基乳糖产品中的应用。
本发明的一种实施方式中，所述产品可应用于食品和保健品等。
有益效果
(1)在本专利中，我们提出了一种在重组大肠杆菌BL21(DE3)中生产DFL高效且经济的策略，即通过从头合成GDP-岩藻糖，以乳糖为底物代谢合成DFL而避免添加昂贵的GDP-岩藻糖为供体。首先，通过敲除基因组上的竞争旁路，强化从头合成GDP-岩藻糖通路的关键酶基因簇manC-manB和/或gmd-wcaG，提供充足的GDP-岩藻糖作为供体。随后利用来源于大肠杆菌O126的α1,2-岩藻糖基转移酶WbgL和α1,3/4-岩藻糖基转移酶HP3/4FT构建可生产DFL的双质粒体系和三质粒体系，通过发酵验证得到最优的宿主和三质粒体系组合。
此时DFL的生产(1.308g/L)还伴随较多的副产物(2′-FL和3-FL，共3.170g/L)，为了改善该问题，通过优化乳糖添加量(1-5g/L)，调整酶与底物之间的比例，得到结果显示，在乳糖添加量为2g/L时，DFL的产量最高(3.500g/L)且副产物较低(0.200g/L)，说明WbgL和HP3/4FT的配合在较低的乳糖量下利于DFL生产。
(2)为了解决酶催化的限速问题和乳糖抑制问题，WbgL被来自幽门螺杆菌UA802的α1,2-岩藻糖基转移酶FucT2取代。FucT2具有良好的受体底物灵活性，与来源于幽门螺杆菌UA948的HP3/4FT达到出色的搭配效果，因此DFL产量显著增加。在摇瓶培养水平上，添加5g/L乳糖的情况下，DFL的滴度最高可达5.28g/L，仅有较少的2′-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖产生(1.300g/L)，体现了出乎意料的效果，实现了乳糖到二岩藻糖基乳糖的高效转化，位于目前报道生物合成DFL产量的前列，在大规模工业应用中表现出一定的生产潜力。
附图说明
图1：二岩藻糖基乳糖的代谢通路图。
图2：A和B为工程菌BLC01、BLC02、BLC03、BLC04、BLC05、BLC06、BLC07、BLC08的基因组强化示意图；C为质粒构建示意图；D为生物合成二岩藻糖基乳糖的产量比较图；E为DFL标品(上)及发酵液样品(下)的质谱MS图。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和有益效果能够更加明显易懂，下面通过列举具体实施例的方式进行详细说明。
以下实例中所使用的质粒，内切酶，PCR酶，柱式DNA抽提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒等采用商用产品，具体操作按照试剂盒说明书进行。下述感受态细胞的制备、菌落PCR、核酸琼脂糖凝胶电泳、热激转化、电转化、和细菌基因组的提取保存等实验操作按照常规方法进行。下述基因编辑的系统为pTargetF与pCas的CRISPR/Cas9双质粒系统。下述质粒和DNA产物的测序工作交予苏州金唯智生物科技有限公司完成。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
初始种子液的培养使用LB液体培养基，组成为蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。LB固体培养基另加15g/L琼脂粉。
发酵培养基：用于DFL生产的甘油定量培养基组成为：20g/L甘油，13.5g/L磷酸二氢钾，4.0g/L磷酸氢二氨，1.7g/L柠檬酸，1.4g/L七水硫酸镁，10ml/L微量金属元素(10g/L硫酸亚铁，2.25g/L七水硫酸锌，1.0g/L无水硫酸铜，0.35g/L一水硫酸锰，0.23g/L十水硼酸钠，0.11g/L钼酸铵，2.0g/L二水氯化钙)。
下述实施例中所涉及的HPLC检测配置及检测参数如下：
色谱柱：Carbohydrate Analysis(Rezex ROA organic acid H+(8％))；检测器：示差检测器；流动相：5mmol/L H2SO4水溶液；流速：0.6mL/min；柱温：60℃；进样量：10μL。
下述实施例中所涉及的引物序列如表1～表2所示：
表1：质粒构建所用的引物
表2：宿主竞争旁路的敲除及关键酶的启动子强化的构建引物
实施例1：重组表达载体的构建
具体步骤如下：
(1)质粒pRSF-CBGW的获得
基因簇manC-manB被引物manCB-F/R从大肠杆菌基因组中扩增，利用引物RSF-V-F/R扩增质粒载体pRSFDuet-1，得到PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳并纯化，得到的两DNA片段通过吉普森试剂盒(美国NEB试剂公司)连接，构建得到中间质粒pRSF-CB(pRSFDuet-1-manC-manB)。同理，利用引物RSFCB-V-F/R扩增中间质粒得载体DNA片段，利用引物F-GW-F/R扩增大肠杆菌基因组得gmd-wcaG基因簇DNA片段，两片段组装得质粒pRSF-CBGW(pRSFDuet-1-manC-manB-gmd-wcaG)。
(2)HP3/4FT基因片段的获得以及质粒pET-HP3/4FT的获得
HP3/4FT基因(SEQ ID NO.1所示)由苏州金唯智生物科技有限公司合成并插入载体pETDuet-1的酶切位点NcoⅠ和KpnⅠ之间，获得质粒pET-HP3/4FT。
(3)fuct2基因片段的获得以及质粒pCD-fuct2的构建
利用引物FucT2-F/FucT2-R扩增fuct2片段(SEQ ID NO.2所示，来源于公开号为CN116042671A的中国专利文件)，跑琼脂糖凝胶电泳并纯化，以pCD-V-F/pCD-V-R为引物扩增pCDDuet-1模板得相应的载体片段，胶回收DNA片段，将上述fucT2基因片段和载体片段通过吉普森试剂盒(美国NEB试剂公司)连接，构建得到质粒pCD-fuct2。
(4)wbgL基因片段的获得以及质粒pCD-wbgL的构建
wbgL片段(SEQ ID NO.3)是以wbgL-F/R为引物扩增于大肠杆菌O126，并胶回收DNA片段。同时以pCD-V-F/R为引物，pCDFDuet-1为模板扩增出相应的载体片段，胶回收DNA片段。利用上述扩增得到的wbgL基因片段和载体片段通过吉普森试剂盒(美国NEB试剂公司)连接，获得质粒pCD-wbgL。
实施例2：宿主竞争旁路的敲除及关键酶的启动子强化
宿主构建所用的引物列于表2中，具体步骤如下：
1.BWL菌株的构建
敲除大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中编码UDP-葡萄糖脂质载体转移酶WcaJ(NCBI序列号为NP_416551.1)的基因wcaJ，编码β-半乳糖苷酶LacZ(NCBI序列号为NP_414878.1)的基因lacZ，基因的敲除方法具体参见公开号为CN110804577A的专利，所用引物可参见表2，得到重组菌E.coli BL21(DE3)△wcaJ△lacZ，命名为BWL。
2.BWLC、BWLG和BWLCG菌株的构建
在步骤1的基础上利用CRISPR-Cas9基因编辑系统在重组菌BWL基因组上用强组成型启动子PJ23119(SEQ ID NO.4)替换基因簇manC-manB(SEQ ID NO.5)的原始启动子区域(SEQ ID NO.7)，记为菌株BWLC；用强启动子PJ23119换基因簇gmd-wcaG(SEQ ID NO.6)的原始启动子区域(SEQ ID NO.8)，记为菌株BWLG；在重组菌BWLC基因组上用强启动子PJ23119替换基因簇gmd-wcaG的原始启动子，记为菌株BWLCG。具体步骤如下：
(1)以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，使用UP-insB-F/R，DH-manC-F/R，通过PCR扩增出基因簇manC-manB的上下游片段上下游重叠区含有强组成型启动子的碱基序列，胶回收。通过重叠PCR将两片段连接，得到供体DNA片段。
(2)以原始pTargetF质粒为模板，CBN20-F为引物，采用PCR扩增将原始质粒上的N20序列替换为与manC-manB原始启动子序列互补的N20序列，得到带有靶向manC-manB原始启动子的pTargetF质粒pTargetF-CB。PCR产物采用DpnⅠ酶去除模板DNA，转化大肠杆菌JM109感受态，涂布LB平板(含壮观霉素)，37℃过夜培养后挑单菌落扩大培养提取质粒并测序。测序成功即可得到靶向manC-manB原始启动子的质粒pTargetF-CB。
(3)取pCas质粒加入大肠杆菌BWL化转感受态，轻轻混匀，冰浴20min，42℃热激90s，置于冰上5min后加入1mL LB培养基，30℃，180rpm培养1h。取200uL浓缩菌液，均匀涂布于LB平板(含卡那霉素)上，30℃倒置培养过夜成为大肠杆菌BWL/pCas。
(4)挑取大肠杆菌BWL/pCas单菌落于LB培养基中，30℃培养1h，加入终浓度为30mM/L的L-阿拉伯糖以诱导pCas-λ-red系统表达。当OD600达到0.6时，制备大肠杆菌BWL/pCas电转感受态。
(5)将200ng pTargetF-CB质粒和600ng的供体DNA片段，电转入大肠杆菌BWL/pCas电转感受态，涂布于LB平板(卡那霉素和壮观霉素)，30℃培养24h，进行PCR菌落验证。
(6)将上述阳性克隆菌落挑至4mL LB液体试管，加入终浓度为10mM的鼠李糖和30mg/L卡那霉素，30℃培养12h，去除pTargetF-CB质粒。42℃培养12h，去除pCas质粒。最终获得重组菌BWLC。
(7)利用CRISPR-Cas9基因编辑系统把重组菌BWL基因组上manC-manB或/和gmd-wcaG基因簇前的启动子替换为强启动子(PJ23119)；
得到重组菌BWLC、BWLG和BWLCG，具体步骤同上(所涉及到的引物序列见表2)。
实施例3：大肠杆菌工程菌株的构建
将实施例1所构建得到的重组质粒pCD-wbgL和pET-HP3/4FT分别转入实施例2中构建的菌株BWL、BWLC、BWLG和BWLCG中构建双质粒体系，得到工程菌株BLC01(BWL/pCD-wbgL/pET-HP3/4FT)、BLC02(BWLC/pCD-wbgL/pET-HP3/4FT)、BLC03(BWLG/pCD-wbgL/pET-HP3/4FT)、BLC04(BWLCG/pCD-wbgL/pET-HP3/4FT)。
将实施例1中构建得到的重组质粒pRSF-CBGW、pCD-wbgL和pET-HP3/4FT分别转入实施例2中构建的菌株BWL、BWLC、BWLG和BWLCG中构建三质粒体系，得到工程菌株BLC05(BWL/pRSF-CBGW/pCD-wbgL/pET-HP3/4FT)、BLC06(BWLC/pRSF-CBGW/pCD-wbgL/pET-HP3/4FT)、BLC07(BWLG/pRSF-CBGW/pCD-wbgL/pET-HP3/4FT)、BLC08(BWLCG/pRSF-CBGW/pCD-wbgL/pET-HP3/4FT)。一共得到8个不同的工程菌株(如表3所示)。
在以上构建的菌株中，将工程菌株中BLC08的质粒pCD-wbgL替换为实施例1中构建得到的质粒pCD-fucT2得到工程菌株BLC09(BWLCG/pRSF-CBGW/pCD-fucT2/pET-HP3/4FT)。
表3各工程菌详细信息
实施例4：工程菌株发酵生产二岩藻糖基乳糖
具体步骤如下：
(1)将实施例3中构建的BLC01、BLC02、BLC03、BLC04、BLC05、BLC06、BLC07、BLC08和BLC09工程菌株分别接种于LB液体培养基，37℃，200rpm，培养12h，得到种子液，取500μL种子液接入25mL发酵培养基(含20g/L甘油)，37℃，200rpm，培养至OD600为0.8，加入终浓度为0.5mM IPTG，同时加入5g/L乳糖，25℃，200rpm继续诱导培养72h。取1mL发酵液，10,000rpm，离心10min，取上清，用于HPLC测定。
(2)为了改善WbgL和HP3/4FT共转化生产DFL时2′-FL产量过高的问题，同时检验FucT2与HP3/4FT的配合效果，采用优化乳糖添加量的方式，即在诱导时分别加入不同浓度的乳糖，具体步骤同步骤(1)，区别在于，采用BLC09工程菌株进行发酵培养，具体为：将BLC09工程菌株接种于LB液体培养基，37℃，200rpm，培养12h，得到种子液，取500μL种子液接入25mL发酵培养基(含20g/L甘油)，37℃，200rpm，培养至OD600为0.8，加入终浓度为0.5mMIPTG，同时，分别加入1g/L，2g/L，3g/L，4g/L，5g/L的乳糖，25℃，200rpm继续诱导培养72h。
分别取1mL发酵液，10,000rpm，离心10min，取上清，用于HPLC测定。
结果如表4所示：
表4各工程菌摇瓶发酵详细信息
结果显示：发酵后不同工程菌株二岩藻糖基乳糖的产量差异显著，在双质粒体系中，DFL的产量均较低故后续不考虑，在三质粒体系当中，由于GDP-岩藻糖供体的增强，DFL产量有所提升。从BLC08出发，优化了乳糖添加量，结果显示，在添加2g/L乳糖时，DFL的产量最高且副产物较低，说明WbgL和HP3/4FT的配合下在较低的乳糖量下利于DFL生产。为了解决酶催化的限速问题和乳糖抑制问题，引入了来源于幽门螺杆菌UA802的α1,2岩藻糖基转移酶(FucT2)来复配HP3/4FT，结果显示，在含有重组质粒pRSF-CBGW、pCD-fucT2和pET-HP3/4FT的工程菌株BLC09中，获得了5.28g/L的最高产量(如图2所示)，且DFL产量不随乳糖添加量的增加而被抑制，体现了出乎意料的效果，为今后优化DFL生产菌株提供了一定参考。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种生产二岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌为，敲除了大肠杆菌基因组上的β-半乳糖苷酶基因lacZ和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ，并利用强组成型启动子PJ23119启动基因组上manC-manB基因簇和gmd-wcaG基因簇的表达，同时，游离表达了大肠杆菌BL21(DE3)内源的磷酸甘露糖酶基因manB、甘露糖1-鸟苷酸转移酶基因manC、GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶基因gmd和GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG，游离表达了来源于幽门螺杆菌UA948的α1,3/4-岩藻糖基转移酶基因HP3/4FT，同时游离表达了来源于幽门螺杆菌UA802的α1,2-岩藻糖基转移酶基因fucT2或来源于大肠杆菌O126的α1,2-岩藻糖基转移酶基因wbgL。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述α1,3/4-岩藻糖基转移酶基因的HP3/4FT核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述α1,2-岩藻糖基转移酶基因fucT2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述α1,2-岩藻糖基转移酶基因wbgL的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，所述β-半乳糖苷酶编码基因lacZ的GenBank号为NP_414878.1，UDP-葡萄糖脂质载体转移酶编码基因wcaJ的GenBank号为NP_416551.1，所述磷酸甘露糖酶编码基因manB的GenBank号为NP_416552.1；所述甘露糖1-鸟苷酸转移酶编码基因manC的GenBank号为NP_416553.1；所述GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶编码基因gmd的GenBank号为NP_416557.1；所述GDP-岩藻糖合成酶编码基因wcaG的GenBank号为NP_416556.1。
3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌是利用pRSFDuet-1载体游离表达磷酸甘露糖酶、甘露糖1-鸟苷酸转移酶、GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶和GDP-岩藻糖合成酶；利用pETDuet-1载体游离表达α1,3/4-岩藻糖基转移酶HP3/4FT，利用pCDFDuet-1载体游离表达α1,2-岩藻糖基转移酶FucT2或α1,2-岩藻糖基转移酶WbgL。
4.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌的宿主细胞包括不限于大肠杆菌BL21(DE3)。
5.根据权利要求4所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述启动子PJ23119核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
6.一种生产二岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，所述方法是，以乳糖为底物，以权利要求1～5任一所述重组大肠杆菌为发酵菌株，发酵生产二岩藻糖基乳糖。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌添加至含有20g/L甘油的摇瓶发酵体系中，30～40℃，培养至OD600＝0.7±0.1，加入终浓度为0.1～0.5mM的IPTG和终浓度为1～5g/L乳糖，在25～28℃，180～220rpm继续诱导培养不少于72h。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌种子液添加至含有30g/L甘油的分批补料发酵体系中，30～40℃，培养至OD600＝16±1，加入终浓度为0.1～0.5mM的IPTG和终浓度为1～8g/L乳糖，在25～28℃，180～220rpm继续诱导培养不少于72h；发酵过程中补加甘油和乳糖以维持甘油和乳糖浓度均不低于2g/L。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵体系中还含有12～15g/L磷酸二氢钾，3.0～5.0g/L磷酸氢二氨，1.0～2.0g/L柠檬酸，1.0～2.0g/L七水硫酸镁和5～15ml/L微量金属元素；微量金属元素包括：5.0～10.0g/L硫酸亚铁，2.0～3.0g/L七水硫酸锌，1.0～2.0g/L无水硫酸铜，0.3～0.5g/L一水硫酸锰，0.2～0.5g/L十水硼酸钠，0.1～0.3g/L钼酸铵，1.0～3.0g/L二水氯化钙。
10.权利要求1～5任一所述的重组大肠杆菌在制备二岩藻糖基乳糖中的应用。
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