CN102911928A - 一种肌酸激酶固定化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种肌酸激酶固定化的方法。它以壳聚糖为原料，先制备出交联壳聚糖溶液，再制备出交联壳聚糖微球，然后制备出接枝赖氨酸交联壳聚糖树脂，最后以接枝赖氨酸交联壳聚糖树脂为载体固定化肌酸激酶。本发明的优点可以使用常规的生产设备在温和的条件下生产磷酸肌酸，工艺简单，操作简便且易于控制，生产成本低，提高了生产效率，生产过程有利于保护环境；且制备的固定化肌酸激酶对热、酸、碱、有机溶剂等条件的稳定性都有显著增加。

Description

一种肌酸激酶固定化的方法

技术领域

本发明涉及肌酸激酶固定化制备技术领域，具体涉及一种以接枝赖氨酸交联壳聚糖微球固定化肌酸激酶的方法。

背景技术

肌酸激酶是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，能可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。用于心肌梗塞的早期诊断，各种肌肉疾病的测定，以及制备磷酸肌酸等方面。游离肌酸激酶以兔肌肉为原料制备，价格昂贵，在溶液中不稳定，容易变性失活，反应后难以分离回收，无法重复利用。这极大地限制了肌酸激酶的应用，特别是用在以肌酸激酶为催化剂制备磷酸肌酸的反应中。

酶的固定化是通过物理或化学方法使游离酶束缚于水不溶介质中的过程，其目的是使被束缚的酶能连续进行反应，反应后便于回收酶并重复使用。与只能使用一次的游离酶相比，固定化酶既保留了游离酶的催化特性，又具有稳定性好、反应过程控制、可组装成酶反应器，进行多酶组合连续反应、可再生并反复使用、成本低等优点，是生物催化剂发展的热门领域。

现有的酶的固定化的工艺，例如2011年11月30号公开号为CN102260665A的“一种马来酰化壳聚糖微球固定化脲酶的制备方法”专利，公开的方法是：以一定配比的乳化剂、油相溶剂和单体组成油相，以一定配比的脲酶、引发剂和马来酰化壳聚糖溶解到水中组成水相，将水相加入油相，加入交联剂反应，再经洗涤，洗脱而制备出产品。该方法以马来酸酐交联壳聚糖氨基，在制备出马来酰化壳聚糖微球固定化载体的同时将脲酶固定于微球内，该方法的缺点是：马来酸酐在与壳聚糖游离氨基反应的同时，也与脲酶的游离氨基反应，还发生脲酶游离氨基间的交联反应，一部分固定化脲酶直接交联于丁二酰骨架上，由于丁二酰基亲水性差，会显著扰动固定化脲酶的构象，明显降低固定化脲酶与底物的亲和力；一部分通过马来酸酐自交联产生的固定化脲酶，由于体积显著增大，导致其〝刚性〞明显增加，催化活性显著降低；此外，部分壳聚糖游离氨基与马来酸酐交联，形成交联壳聚糖载体，显著减少了参与固定化脲酶的壳聚糖游离氨基，导致固定化荷载小；加之马来酸酐碳链较短、与游离氨基的反应条件较苛刻，因此，以马来酸酐为交联剂制备的脲酶蛋白偶联率低、活力回收低、与底物的亲和力低、催化活力低。

发明内容

本发明提出一种肌酸激酶固定化的方法，它能够有效地克服现有技术中的不足，可以使用常规的生产设备在温和的条件下生产磷酸肌酸，工艺简单，操作简便且易于控制，生产成本低，提高了生产效率，生产过程有利于保护环境；且制备的固定化肌酸激酶对热、酸、碱、有机溶剂等条件的稳定性都有显著增加。

本发明的技术方案是这样实现的：一种肌酸激酶固定化的方法，它以壳聚糖为原料，先制备出交联壳聚糖溶液，再制备出交联壳聚糖微球，然后制备出接枝赖氨酸交联壳聚糖树脂，最后以接枝赖氨酸交联壳聚糖树脂为载体固定化肌酸激酶。

1、制备交联壳聚糖溶液的步骤为：

（1）以壳聚糖为原料，按壳聚糖的质量：体积浓度为1～5%的盐酸溶液的体积比为1：25～50的比例，将壳聚糖溶解于盐酸溶液中，形成壳聚糖溶液；所述壳聚糖的质量按克来计量，盐酸溶液的体积按毫升来计量；

（2）再在搅拌条件下在（1）步骤中加入等体积的液体石蜡进行分散，制备出液体石蜡分散的壳聚糖溶液；

（3）然后按壳聚糖的质量：体积浓度为2.5%～5.0%的双缩水甘油醚溶液的体积比为1：10～30的比例，在液体石蜡分散的壳聚糖溶液中加入双缩水甘油醚溶液，进行交联反应20～30分钟，就制备出交联壳聚糖溶液；所述壳聚糖的质量按克来计量，双缩水甘油醚溶液的体积按毫升来计量。

2、制备交联壳聚糖微球的步骤为：

（1）将第1步中制备出的交联壳聚糖溶液，先按致孔剂碳酸钙：壳聚糖的质量比为1：1～3的比例，在交联壳聚糖溶液中加入致孔剂碳酸钙粉末，搅拌混合均匀；

（2）再用0.1～1%氢氧化钠溶液调节体系pH为9～10.5，然后升温至60～70℃，并在60～70℃恒温下反应2.5～3.5小时后，将反应物泵入抽滤机中，进行第一次抽滤，分别收集第一次抽滤渣和抽滤液；

（3）对于收集的第一次抽滤渣，先用等体积的温度为50～60℃热蒸馏水反复进行洗涤2～4次，除去残留的液体石蜡，分别收集洗涤液和洗涤后的滤渣，对于收集的洗涤液，先与收集的第一次抽滤液合并后，再泵人离心机中，在转速为2000～4000转/分下，进行离心分离，分别收集上层液体石蜡和下层清液，对于收集的上层液体石蜡，可再次用于分散壳聚糖溶液；对于收集的下层清液，经生化处理达标后排放；对于收集的洗涤后的滤渣，先加入3～6倍体积的体积浓度为2～5%的盐酸溶液，在搅拌下溶解洗涤后滤渣中的碳酸钙而形成混合液；然后将该混合液泵入抽滤机中，进行第二次抽滤，分别收集脱碳酸钙滤过液和脱碳酸钙滤渣；

（4）将收集的脱碳酸钙滤过液泵人蒸发器中，在80～100℃下，进行蒸发浓缩，回收氯化钙浓缩液，可再利用；对于收集的脱碳酸钙滤渣，先用蒸馏水反复进行洗涤至洗涤液的pH值为6.5～7.5为止，分别收集洗涤液和洗涤后的碳酸钙滤渣，洗涤后的碳酸钙滤渣即为制备出的交联壳聚糖微球，对于洗涤液经生化处理达标后排放。

3、制备接枝赖氨酸交联壳聚糖树脂的步骤为：

（1）按第2步制备出的交联壳聚糖微球中的游离氨基:二环己基碳化二亚胺:赖氨酸游离羧基的摩尔比为1:1～2:1～5的比例，先将第3（4）步骤制备出的交联壳聚糖微球加入赖氨酸的质量浓度为0.15～0.25%的赖氨酸水溶液中，搅拌进行分散后，然后加入二环己基碳化二亚胺，在常温下反应10～50分钟，反应完成后进行抽滤，分别收集滤渣和滤液；

（2）对于收集的滤液，含赖氨酸和二环己基碳化二亚胺，可再用于制备接枝壳聚糖赖氨酸树脂；对于收集的滤渣，先用3～7倍的95%的乙醇溶液洗涤，除去二环己基碳化二亚胺衍生物，再进行抽滤，分别收集95%乙醇洗涤溶液和滤渣；

（3）对收集的95%乙醇洗涤溶液，进行蒸馏回收乙醇；对收集的滤渣，装入截留分子量为1000Da～5000Da的透析袋中，对水透析过夜，除去残存的赖氨酸，次日收集透析袋内的球形颗粒，在60～80℃下进行干燥，直至恒重，即制备出交联壳聚糖-赖氨酸树脂。

4、制备交联壳聚糖-赖氨酸树脂固定化肌酸激酶的步骤为:

(1)配制肌酸激酶缓冲溶液:将肌酸激酶活性为1000U/g～10000U/g的肌酸激酶产品先用甘氨酸质量浓度为0.2mol/L的甘氨酸溶液溶解，在溶解时调节温度为4～10℃，用氢氧化钠调节pH为8～10，然后用1.0～1.5微米的微孔滤膜过滤，收集滤过液，就制备出肌酸激酶缓冲溶液，其中肌酸激酶活力为10～50U/mL，现配现用，用于制备固定化肌酸激酶；

(2)将第3步制备出的交联壳聚糖-赖氨酸树脂置于反应器中，按照交联壳聚糖-赖氨酸树脂的质量：第5（1）步骤制备出的肌酸激酶缓冲溶液的体积比为1:50～100的比例，加入第5(1)步骤制备的肌酸激酶缓冲溶液，在搅拌下处理30～60分钟；所述交联壳聚糖-赖氨酸树脂的质量按克来计量，肌酸激酶缓冲溶液的体积按毫升来计量；

（3）再按照交联壳聚糖-赖氨酸树脂的质量：戊二醛体积分数5%～10%的戊二醛溶液的体积为1：5～10的比例，再加入戊二醛溶液，在室温下搅拌反应0.5～2小时，反应完成后进行抽滤，分别收集滤渣和滤液；所述交联壳聚糖-赖氨酸树脂的质量按克来计量，戊二醛溶液的体积按毫升来计量；

（4）对于收集的滤液，含肌酸激酶、戊二醛及甘氨酸溶液，即为交联滤液，用于净化处理；对于收集的滤渣，用甘氨酸质量浓度为0.2mol/L、氢氧化钠调节pH为8～10、温度为4～10℃的甘氨酸溶液反复洗涤，直至洗涤液无双缩脲反应时止，分别收集洗涤液和洗涤滤渣；对于收集的洗涤滤渣，即为交联壳聚糖-赖氨酸树脂固定的肌酸激酶，用于合成磷酸肌酸。对于收集的洗涤液，与交联滤液合并，进行净化处理。

上述第4步所述的净化处理为：

（1）将第4步收集的交联滤液与洗涤液的合并液，泵入截留分子量为5000Da的超滤器中，在压力为0.05Mpa的条件下进行超滤分离，直至超滤截留液中出现大量沉淀时止，分别收集超滤滤过液和超滤截留液；

（2）对收集的超滤截留液，用0.22～0.5微米的微孔滤膜进行抽滤至干，弃滤渣，收集抽滤滤过液，与（1）中收集的超滤滤过液合并，即为滤过合并液，用于再生pH为8～10、温度为4～10℃的甘氨酸溶液。

再生甘氨酸溶液：当净化处理完成后，用0.1～1%氢氧化钠溶液调节净化处理后的滤过合并液的pH值，直至达到pH为8-10时止，将其置于4-10℃的冰箱中保存，就制备出再生甘氨酸溶液，可再次用于制备肌酸激酶溶液。

本发明中的固定化肌酸激酶可用于合成磷酸肌酸，包括下述步骤：

（1）配制反应液，其含有：20mM ATP、65mM肌酸、25mM盐酸氯化镁、10mM甘氨酸，pH用稀碱调节至9.0左右。

（2）取1升该反应液，加入固定化肌酸激酶50g，轻轻搅拌进行反应，同时不停补加稀碱维持PH在9.0左右。当反应液的PH不再变化时，停止反应，沉降。

（3）沉降后取上清夜为反应产物液，用HPLC仪分析反应产物液中磷酸肌酸含量，以ATP计反应产率可达70%以上。

（4）停止反应沉降后的沉淀物为固定化肌酸激酶，继续添加上述反应液，可继续得到含磷酸肌酸的反应产物液。固定化肌酸激酶可批式使用40～60次。

本发明的有益效果在于：

1、本发明使用常规的生产设备在温和的条件下进行生产，操作简便且易于控制，工艺简单，总体节约能源、生产成本低；

2、本发明的交联基团为游离羟基，保护了活性基团氨基，接枝氨基酸，改善了与酶蛋白的亲和性，增加固定化酶作用的自由度，提高了固定化酶的活性；

3、本发明的生产过程有利于保护环境。物料采用循环处理，进行回收利用，既降低生产成本，又不污染环境，充分利用物料。生产属于绿色生物化工产品制备方法；

4、本发明制备的固定化肌酸激酶对热、酸、碱、有机溶剂等条件的稳定性都有显著增加。固定化酶的活力回收高，达到60～80%，比其他用共价结合法的活力高，使用半衰期长，可批式使用40～60次，在4～10℃下的保存半衰期为120～155天。可以重复利用，可实现连续化生产，大规模生产。

本发明方法制备的产品，可广泛应用于医药、保健等行业中。在医药行业中，作为合成保护治疗心肌，肾脏等药物的原料。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的其中几个实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

一种肌酸激酶固定化的方法，它以壳聚糖为原料，先制备出交联壳聚糖溶液，再制备出交联壳聚糖微球，然后制备出接枝赖氨酸交联壳聚糖树脂，最后以接枝赖氨酸交联壳聚糖树脂为载体固定化肌酸激酶：

1.制备交联壳聚糖溶液：

（1）以壳聚糖为原料，按壳聚糖的质量（g）：体积浓度为1%的盐酸溶液的体积（mL）比为1：25的比例，先将壳聚糖溶解于盐酸溶液中，形成壳聚糖溶液；

（2）再在搅拌条件下加入等体积的液体石蜡进行分散，制备出液体石蜡分散的壳聚糖溶液；

（3）然后按壳聚糖的质量（g）：体积浓度为2.5%的双缩水甘油醚溶液的体积（mL）比为1：10的比例，在液体石蜡分散的壳聚糖溶液中加入双缩水甘油醚溶液，进行交联反应20分钟，就制备出交联反应壳聚糖溶液。

2.制备交联壳聚糖微球：

（1）第1步完成后，将第1步制备出的交联反应壳聚糖溶液，先按致孔剂碳酸钙：壳聚糖的质量（g）比为1：1的比例，在交联壳聚糖溶液中加入致孔剂碳酸钙粉末，搅拌混合均匀；

（2）再用0.1%氢氧化钠溶液调节体系pH为9，然后升温至60℃，并在60℃恒温下反应2.5小时后，将反应物泵人抽滤机中，进行第一次抽滤，分别收集第一次抽滤渣和抽滤液；

（3）对于收集的第一次抽滤渣，先用等体积的温度为50℃热蒸馏水反复进行洗涤2次，除去残留的液体石蜡，分别收集洗涤液和洗涤后的滤渣；对于收集的洗涤液，先与收集的第一次抽滤液合并后，再泵人离心机中，在转速为2000转/分下，进行离心分离，分别收集上层液体石蜡和下层清液；对于收集的上层液体石蜡，可再次用于分散壳聚糖溶液；对于收集的下层清液，经生化处理达标后排放；对于收集的洗涤后的滤渣，先加入3倍体积的体积浓度为2%的盐酸溶液，在搅拌下溶解洗涤后滤渣中的碳酸钙而形成混合液，然后将该混合液泵人抽滤机中，进行第二次抽滤，分别收集脱碳酸钙滤过液和脱碳酸钙滤渣；

（4）将收集的脱碳酸钙滤过液泵人蒸发器中，在80℃下，进行蒸发浓缩，回收氯化钙浓缩液，可再利用；对于收集的脱碳酸钙滤渣，先用蒸馏水反复进行洗涤至洗涤液的pH值为6.5为止，分别收集洗涤液和洗涤后的碳酸钙滤渣（即为制备出的交联壳聚糖微球）。对于洗涤液经生化处理达标后排放。

3.制备接枝赖氨酸交联壳聚糖树脂：

（1）第2步完成后，按第2步制备出的交联壳聚糖微球中的游离氨基:二环己基碳化二亚胺:赖氨酸游离羧基的摩尔比为1:1:1的比例，先将第2.步制备出的交联壳聚糖微球加入赖氨酸的质量浓度为0.15%的赖氨酸水溶液中，搅拌进行分散后，然后加入二环己基碳化二亚胺，在常温下反应10分钟。反应完成后进行抽滤，分别收集滤渣和滤液；

（2）对于收集的滤液，含赖氨酸和二环己基碳化二亚胺，可再用于制备接枝壳聚糖赖氨酸树脂；对于收集的滤渣，先用3倍的95%的乙醇溶液洗涤，除去二环己基碳化二亚胺衍生物，再进行抽滤，分别收集95%乙醇洗涤溶液和滤渣；

（3）对收集的95%乙醇洗涤溶液，进行蒸馏回收乙醇；对收集的滤渣，装入截留分子量为1000Da的透析袋中，对水透析过夜，除去残存的赖氨酸。次日收集透析袋内的球形颗粒，在60℃下进行干燥，直至恒重，就制备出交联壳聚糖-赖氨酸树脂；

4.制备交联壳聚糖-赖氨酸树脂固定化肌酸激酶

（1）配制肌酸激酶缓冲溶液：将肌酸激酶活性为1000U/g的肌酸激酶产品先用先用甘氨酸质量浓度为0.2mol/L的甘氨酸溶液溶解，在溶解时调节温度为4℃，用0.5%氢氧化钠溶液调节pH为8，然后用1.0微米的微孔滤膜过滤，收集滤过液，就制备出肌酸激酶缓冲溶液，其中肌酸激酶活力为10U/mL，现配现用，用于制备固定化肌酸激酶；

（2）第3步完成后，将第3步制备出的交联壳聚糖-赖氨酸树脂置于反应器中，按照交联壳聚糖-赖氨酸树脂的质量（g）：第4（1）步制备出肌酸激酶缓冲溶液的体积（mL）比为1:50的比例，加入第4（1）步制备的肌酸激酶缓冲溶液，在搅拌下处理30分钟；

（3）再按照交联壳聚糖-赖氨酸树脂的质量（g）：戊二醛体积分数5%的戊二醛溶液的体积（mL）为1：5的比例，加入戊二醛溶液，在室温下搅拌反应0.5小时，反应完成后进行抽滤，分别收集滤渣和滤液；

（4）对于收集的滤液，含肌酸激酶、戊二醛及甘氨酸溶液，即为交联滤液，用于净化处理；对于收集的滤渣，用甘氨酸质量浓度为0.2mol/L、0.5%氢氧化钠溶液调节pH为8、温度为4℃的甘氨酸溶液反复洗涤，直至洗涤液无双缩脲反应时止；分别收集洗涤液和洗涤滤渣，对收集的洗涤滤渣，即为交联壳聚糖-赖氨酸树脂固定的肌酸激酶，用于合成磷酸肌酸；对于收集的洗涤液，与交联滤液合并，进行净化处理。固定化酶的活力达到60%，可批式使用40次，在4℃下的保存半衰期为120天。

上述第4步所述的净化处理为：

（1）将第4步收集的交联滤液与洗涤液的合并液，泵入截留分子量为5000Da的超滤器中，在压力为0.05Mpa的条件下进行超滤分离，直至超滤截留液中出现大量沉淀时止，分别收集超滤滤过液和超滤截留液；

（2）对收集的超滤截留液，用0.22微米的微孔滤膜进行抽滤至干，弃滤渣，收集抽滤滤过液，与（1）中收集的超滤滤过液合并，即为滤过合并液，用于再生pH为8、温度为4℃的甘氨酸溶液。

再生甘氨酸溶液：当净化处理完成后，用1%氢氧化钠溶液调节净化处理后的滤过合并液的pH值，直至达到pH为8时止，将其置于4℃的冰箱中保存，就制备出再生甘氨酸溶液，可再次用于制备肌酸激酶溶液。

实施例2：

一种肌酸激酶固定化的方法，制备方法同实施例1，其中：

第1步中，壳聚糖的质量（g）：体积浓度为3%的盐酸溶液的体积（mL）比为1：35，壳聚糖的质量（g）：体积浓度为3.5%的双缩水甘油醚溶液的体积（mL）比为1：20，交联反应25分钟。

第2步中，致孔剂碳酸钙：壳聚糖的质量（g）比为1：2，体系pH为9.5，升温至65℃，反应3小时后，温度为55℃热蒸馏水反复进行洗涤3次，转速为3000转/分，先加入4.5倍体积的体积浓度为3.5%的盐酸溶液，在90℃下，进行蒸发浓缩，洗涤至洗涤液的pH值为7。

第3步中，交联壳聚糖微球中的游离氨基:二环己基碳化二亚胺:赖氨酸游离羧基的摩尔比为1:1.5:3，赖氨酸的质量浓度为0.2%的赖氨酸水溶液，反应30分钟。用5倍的95%的乙醇溶液洗涤，截留分子量为3000Da的透析袋中，在70℃下进行干燥。

第4步中，肌酸激酶活性为5000U/g，pH为9、温度为7℃的甘氨酸溶液，用1.25微米的微孔滤膜过滤，肌酸激酶活力为30U/mL；

交联壳聚糖-赖氨酸树脂的质量（g）：肌酸激酶缓冲溶液的体积（mL）比为1:75，搅拌处理45分钟，交联壳聚糖-赖氨酸树脂的质量（g）：戊二醛体积分数7.5%的戊二醛溶液的体积（mL）为1：7.5，搅拌反应1.5小时。pH为9、温度为7℃的甘氨酸溶液反复洗涤。固定化酶的活力回收达到70%，可批式使用50次，在7℃下的保存半衰期为135天。

净化处理时，在截留分子量为7500Da的超滤器中，在压力为0.15Mpa的条件下进行超滤分离，直至超滤截留液中出现大量沉淀时止，分别收集超滤滤过液和超滤截留液；对收集的超滤截留液，用0.45微米的微孔滤膜进行抽滤至干，弃滤渣，收集抽滤滤过液，与前面收集的超滤滤过液合并，即为滤过合并液，用于再生pH为9、温度为7℃的甘氨酸溶液。

再生甘氨酸溶液时，用1%氢氧化钠溶液调节滤过合并液的pH值，直至达到pH为9时止，将其置于7℃的冰箱中保存。

实施例3：

一种肌酸激酶固定化的方法，制备方法同实施例1，其中：

第1步中，壳聚糖的质量（g）：体积浓度为1%的盐酸溶液的体积（mL）比为1：50，壳聚糖的质量（g）：体积浓度为5.0%的双缩水甘油醚溶液的体积（mL）比为1：30，交联反应30分钟。

第2步中，致孔剂碳酸钙：壳聚糖的质量（g）比为1：3，体系pH为10.5，升温至70℃，反应3.5小时后，温度为60℃热蒸馏水反复进行洗涤4次，转速为4000转/分，先加入6倍体积的体积浓度为5%的盐酸溶液，在100℃下，进行蒸发浓缩，洗涤至洗涤液的pH值为7.5。

第3步中，交联壳聚糖微球中的游离氨基:二环己基碳化二亚胺:赖氨酸游离羧基的摩尔比为1:2:5，赖氨酸的质量浓度为0.25%的赖氨酸水溶液，反应50分钟。用7倍的95%的乙醇溶液洗涤，截留分子量为5000Da的透析袋中，在80℃下进行干燥。

第4步中，肌酸激酶活性为10000U/g，pH为10、温度为10℃的甘氨酸溶液，用1.5微米的微孔滤膜过滤，肌酸激酶活力为50U/mL；交联壳聚糖-赖氨酸树脂的质量（g）：肌酸激酶缓冲溶液的体积（mL）比为1:100，，搅拌处理60分钟，交联壳聚糖-赖氨酸树脂的质量（g）：戊二醛体积分数10%的戊二醛溶液的体积（mL）为1：10，搅拌反应2小时。pH为10、温度为10℃的甘氨酸溶液反复洗涤。固定化酶的活力回收达到80%，可批式使用60次，在10℃下的保存半衰期为155天。

净化处理时，在截留分子量为10000Da的超滤器中，在压力为0.2Mpa的条件下进行超滤分离，直至超滤截留液中出现大量沉淀时止，分别收集超滤滤过液和超滤截留液；对收集的超滤截留液，用0.5微米的微孔滤膜进行抽滤至干，弃滤渣，收集抽滤滤过液，与前面收集的超滤滤过液合并，即为滤过合并液，用于再生pH为10、温度为10℃的甘氨酸溶液。

再生甘氨酸溶液时，用0.1%氢氧化钠溶液调节滤过合并液的pH值，直至达到pH为10时止，将其置于10℃的冰箱中保存。

上述实施例1-3中制备的固定化肌酸激酶可用于合成磷酸肌酸，包括下述步骤：

（1）配制反应液，其含有：20mM ATP、65mM肌酸、25mM氯化镁、10mM甘氨酸，pH用稀碱调节至9.0左右。

（2）取1升该反应液，加入固定化肌酸激酶50g，轻轻搅拌进行反应，同时不停补加稀碱维持pH在9.0左右，温度在25-35℃左右。当反应液的pH不再变化时，停止反应，沉降。

（3）沉降后取上清夜为反应产物液，用HPLC仪分析反应产物液中磷酸肌酸含量，以ATP计反应产率可达70%以上。

（4）停止反应沉降后的沉淀物为固定化肌酸激酶，继续添加上述反应液，可继续得到含磷酸肌酸的反应产物液。固定化肌酸激酶可批式使用40～60次。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种肌酸激酶固定化的方法，其特征在于：它以壳聚糖为原料，先制备出交联壳聚糖溶液，再制备出交联壳聚糖微球，然后制备出接枝赖氨酸交联壳聚糖树脂，最后以接枝赖氨酸交联壳聚糖树脂为载体固定化肌酸激酶。

2.根据权利要求1所述的一种肌酸激酶固定化的方法，其特征在于：制备交联壳聚糖溶液的步骤为：

（1）以壳聚糖为原料，按壳聚糖的质量：体积浓度为1～5%的盐酸溶液的体积比为1：25～50的比例，将壳聚糖溶解于盐酸溶液中，形成壳聚糖溶液；所述壳聚糖的质量按克来计量，盐酸溶液的体积按毫升来计量；

（2）再在搅拌条件下在（1）步骤中加入等体积的液体石蜡进行分散，制备出液体石蜡分散的壳聚糖溶液；

（3）然后按壳聚糖的质量：体积浓度为2.5%～5.0%的双缩水甘油醚溶液的体积比为1：10～30的比例，在液体石蜡分散的壳聚糖溶液中加入双缩水甘油醚溶液，进行交联反应20～30分钟，就制备出交联壳聚糖溶液；所述壳聚糖的质量按克来计量，双缩水甘油醚溶液的体积按毫升来计量。

3.根据权利要求1所述的一种肌酸激酶固定化的方法，其特征在于：制备交联壳聚糖微球的步骤为：

（1）将制备出的交联壳聚糖溶液，先按致孔剂碳酸钙：壳聚糖的质量比为1：1～3的比例，在交联壳聚糖溶液中加入致孔剂碳酸钙粉末，搅拌混合均匀；

（2）再用0.1～1%的氢氧化钠溶液调节体系pH为9～10.5，然后升温至60～70℃，并在60～70℃恒温下反应2.5～3.5小时后，将反应物泵入抽滤机中，进行第一次抽滤，分别收集第一次抽滤渣和抽滤液；

（3）对于收集的抽滤渣，先加入3～6倍体积的体积浓度为2～5%的盐酸溶液，在搅拌下溶解洗涤后滤渣中的碳酸钙而形成混合液；然后将该混合液泵入抽滤机中，进行第二次抽滤，分别收集脱碳酸钙滤过液和脱碳酸钙滤渣；

（4）对于收集的脱碳酸钙滤渣，先用蒸馏水反复进行洗涤至洗涤液的pH值为6.5～7.5为止，分别收集洗涤液和洗涤后的碳酸钙滤渣，洗涤后的碳酸钙滤渣即为制备出的交联壳聚糖微球。

4.根据权利要求1所述的一种肌酸激酶固定化的方法，其特征在于：制备接枝赖氨酸交联壳聚糖树脂的步骤为：

（1）按制备出的交联壳聚糖微球中的游离氨基:二环己基碳化二亚胺:赖氨酸游离羧基的摩尔比为1:1～2:1～5的比例，先将第3（4）步骤制备出的交联壳聚糖微球加入赖氨酸的质量浓度为0.15～0.25%的赖氨酸水溶液中，搅拌进行分散后，然后加入二环己基碳化二亚胺，在常温下反应10～50分钟，反应完成后进行抽滤，分别收集滤渣和滤液；

（2）对于收集的滤渣，先用3～7倍的95%的乙醇溶液洗涤，除去二环己基碳化二亚胺衍生物，再进行抽滤，分别收集95%乙醇洗涤溶液和滤渣；

（3）对收集的滤渣，装入截留分子量为1000Da～5000Da的透析袋中，对水透析，除去残存的赖氨酸，收集透析袋内的球形颗粒，在60～80℃下进行干燥，直至恒重，即制备出交联壳聚糖-赖氨酸树脂。

5.根据权利要求1所述的一种肌酸激酶固定化的方法，其特征在于：制备交联壳聚糖-赖氨酸树脂固定化肌酸激酶的步骤为:

(1)配制肌酸激酶缓冲溶液:将肌酸激酶活性为1000U/g～10000U/g的肌酸激酶产品先用甘氨酸质量浓度为0.2mol/L的甘氨酸溶液溶解，在溶解时调节温度为4～10℃，用氢氧化钠调节pH为8～10；然后用1.0～1.5微米的微孔滤膜过滤，收集滤过液，就制备出肌酸激酶缓冲溶液，其中肌酸激酶活力为10～50U/mL；

(2)将制备出的交联壳聚糖-赖氨酸树脂置于反应器中，按照交联壳聚糖-赖氨酸树脂的质量：第5（1）步骤制备出的肌酸激酶缓冲溶液的体积比为1:50～100的比例，加入第5(1)步骤制备的肌酸激酶缓冲溶液，在搅拌下处理30～60分钟；所述交联壳聚糖-赖氨酸树脂的质量按克来计量，肌酸激酶缓冲溶液的体积按毫升来计量；

（3）再按照交联壳聚糖-赖氨酸树脂的质量：戊二醛体积分数5%～10%的戊二醛溶液的体积为1：5～10的比例，再加入戊二醛溶液，在室温下搅拌反应0.5～2小时，反应完成后进行抽滤，分别收集滤渣和滤液；所述交联壳聚糖-赖氨酸树脂的质量按克来计量，戊二醛溶液的体积按毫升来计量；

（4）对于收集的滤渣，用甘氨酸质量浓度为0.2mol/L、氢氧化钠调节pH为8～10、温度为4～10℃的甘氨酸溶液反复洗涤，直至洗涤液无双缩脲反应时止，分别收集洗涤液和洗涤滤渣；对收集的洗涤滤渣，即为交联壳聚糖-赖氨酸树脂固定的肌酸激酶。