CN102492731A - 固定化酶连续水解白藜芦醇苷制备白藜芦醇的方法 - Google Patents
固定化酶连续水解白藜芦醇苷制备白藜芦醇的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102492731A CN102492731A CN2011104107555A CN201110410755A CN102492731A CN 102492731 A CN102492731 A CN 102492731A CN 2011104107555 A CN2011104107555 A CN 2011104107555A CN 201110410755 A CN201110410755 A CN 201110410755A CN 102492731 A CN102492731 A CN 102492731A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- glucosidase
- resveratrol
- beta
- polydatin
- trans
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/10—Process efficiency
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种固定化酶连续水解白藜芦醇苷制备白藜芦醇的方法，涉及白藜芦醇的制备方法。本发明以市售的赖氨酸修饰的壳聚糖微球阴离子交换树脂、β-葡萄糖苷酶、白藜芦醇苷和XAD-7HP大孔吸附树脂为原料，先制备固定化β-葡萄糖苷酶，后装柱成柱式酶反应器，再经连续水解、吸附、洗脱、结晶而得产品。本发明生产过程的工艺，设备及操作简单；反应条件温和，节约能源；在生产过程中的物料都采用循环处理回收利用或再生反复使用，无废物排放，有利于环境保护；生产成本低，便于推广应用，有利于可持续发展。本发明可广泛应用于制备白藜芦醇，采用本发明方法制备出的产品，可广泛应用于医药、食品处理、化妆品等行业中。
Description
技术领域
本发明属于白藜芦醇技术领域，具体涉及白藜芦醇的制备方法。
背景技术
白藜芦醇(化学名为芪三酚)是含有芪类结构的非黄酮多酚类化合物，是植物在受到应激时自身合成的一种抗毒素，难溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等有机溶剂。主要有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、抗自由基、保护肝脏、保护心血管和抗心肌缺血等功能，被广泛应用于食品保健品、化妆品及医药领域。
目前白藜芦醇的生产主要是植物提取法。提取白藜芦醇的植物有葡萄、花生、桑葚、虎杖等。然而，植物中的白藜芦醇含量非常低，使得其分离纯化成本偏高。而白藜芦醇类似物白藜芦醇苷在植物中的含量为白藜芦醇的7～12倍，如果将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇，白藜芦醇的产率可大大提高。酶法水解白藜芦醇苷转化为白藜芦醇，因条件温和，反应产物较单一，产率高，而被广泛采用。
现有的制备白藜芦醇的方法，如2008年9月3日公开的公开号为CN101255449的“β-葡萄糖苷酶在转化白藜芦醇苷制备白藜芦醇中的应用”专利，公开的是以含白藜芦醇苷的植物为原料，先利用微生物法发酵制得β-葡萄糖苷酶，再经酶转化、离心、乙醇提纯而得产品。该方法的主要缺点是：①利用微生物法发酵制得的β-葡萄糖苷酶在水解反应中是以游离状态发挥催化作用，游离状态的酶在水溶液中不稳定，对热、强酸、强碱、高离子浓度、及有机溶剂等均敏感，容易失活。②游离状态的酶难以与反应产物分离，导致产物纯化困难，增加生产成本。③游离状态的酶只能使用一次，酶的用量较大，不利于节约能源。④不能连续进行生产，延长了生产周期，对原料的利用率低。
发明内容
本发明的目的是针对现有制备白藜芦醇方法的不足之处，提供一种固定化酶连续水解白藜芦醇苷制备白藜芦醇的方法。具有操作简单实用、设备通用、酶稳定性好、重复利用率高、节约能源、无有害物质排放，清洁安全，生产成本低，可连续生产等特点。
本发明的主要原理是：在适宜条件下，以二醛类化合物与接枝赖氨酸壳聚糖微球的游离氨基及β-葡萄糖苷酶的游离氨基发生交联反应，就将游离β-葡萄糖苷酶束缚于接枝赖氨酸壳聚糖微球载体，即制备出固定化酶；固定化酶具备与游离酶同样的水解特性，可反复使用，连续水解白藜芦醇苷，生成白藜芦醇。
实现本发明目的的技术方案是：一种固定化酶连续水解白藜芦醇苷制备白藜芦醇的方法，以市售的赖氨酸修饰的壳聚糖微球阴离子交换树脂、β-葡萄糖苷酶、白藜芦醇苷和XAD-7HP大孔吸附树脂为原料，先制备出固定化β-葡萄糖苷酶，后装柱成柱式酶反应器，再经连续水解，吸附，洗脱，结晶得到白藜芦醇产品。其具体步骤如下：
(1)配制β-葡萄糖苷酶缓冲溶液
以市售的β-葡萄糖苷酶为原料，按照β-葡萄糖苷酶的质量(mg)∶缓冲溶液体积(L)比为1∶0.5～1.5的比例，将β-葡萄糖苷酶加入缓冲溶液中，搅拌混合均匀，就制备出β-葡萄糖苷酶缓冲溶液。其中，所述的缓冲溶液为pH值6.0～8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液。
(2)制备固定化β-葡萄糖苷酶
第(1)步完成后，以市售的赖氨酸修饰的壳聚糖微球阴离子交换树为原料，按照赖氨酸修饰的壳聚糖微球阴离子交换树脂的质量(g)∶第(1)步制备出得β-葡萄糖苷酶缓冲溶液的体积(mL)∶1％的戊二醛溶液的体积(mL)比为1∶10～20∶1～3的比例，先将赖氨酸修饰的壳聚糖微球阳离子交换树脂加入到β-葡萄糖苷酶缓冲溶液中，搅拌吸附1～3小时后再加入戊二醛溶液，反应1～3小时后将反应产物放置于真空过滤器中，进行真空过滤，分别收集滤液和滤渣。对于收集的滤液，用于回收缓冲溶液。对于收集的滤渣，按照滤渣的质量(g)∶缓冲溶液体积(mL)之比为1∶10～50的比例，用缓冲溶液对糖渣进行洗涤，分别收集洗涤液和洗涤后的滤渣。再按洗涤后的滤渣的质量(g)∶缓冲溶液的体积(mL)之比为1∶10～50的比例，再用缓冲溶液对洗涤后的滤渣进行洗涤，分别收集洗涤液和洗涤后的滤渣。如此重复，直至洗涤液中检测不出酶蛋白质为止。最后合并各次收集的洗涤液和第(2)步收集的滤液，用于回收缓冲溶液。对于洗涤后的滤渣，即为制得的固定化β-葡萄糖苷酶，用于组装固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器。其中，所述的缓冲溶液为pH值6.0～8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液
(3)制备白藜芦醇苷水解液
第(2)步完成后，以市售的白藜芦醇苷为原料，先将第(2)步制得的固定化β-葡萄糖苷酶装入夹套保温层析柱中，升温至30～60℃，就组装出固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器，用于水解白藜芦醇苷。再按照市售的白藜芦醇苷的质量(g)∶乙醇体积浓度为30～50％的乙醇溶液体积(L)之比为1∶0.5～1.5的比例，将市售的白藜芦醇苷加入到乙醇溶液中，搅拌至溶解，就制备出白藜芦醇苷溶液，用于制备白藜芦醇水解液。然后，将制得的白藜芦醇苷溶液泵入到组装的固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器中，控制白藜芦醇苷溶液的泵入速度为固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器体积(mL)的2～6倍/小时(BV/h)，进行连续水解反应26～40小时。分别收集固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器的流出液和固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器，对于收集的固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器，可再生利用；对于收集的固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器的流出液，即为白藜芦醇苷水解液，用于吸附分离白黎芦醇。
(4)再生固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器
第(3)步完成后，向第(3)步收集的固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器中，泵入纯净水进行清洗，控制纯净水泵入速度为固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器体积(mL)的2～6倍/小时(BV/h)，直至清洗液中无白藜芦醇苷和白黎芦醇时止，分别收集清洗液和清洗后的固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器。对收集的清洗液，因含有大量的白藜芦醇苷和白藜芦醇，用于下步处理；对收集的清洗后的固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器，即为再生的固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器，可再使用。使用后又用纯净水清洗再生，又再使用。如此使用-清洗再生-再使用……，可反复使用，充分利用固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器，且清洗液又回收利用。因此，操作简便，又降低了生产成本，并有利于环保。
(5)制备白藜芦醇晶体
第(4)步完成后，以市售的活化的XAD-7HP大孔吸附树脂为原料，先将市售活化的XAD-7HP大孔吸附树脂装入中压层析柱中，先泵入第(3)步收集的白藜芦醇苷水解液，控制白藜芦醇苷水解液泵入速度为XAD-7HP大孔吸附树脂柱体积的2～6倍/小时(BV/h)，直至流出液中出现白藜芦醇为止。分别收集流出液和吸附白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂柱，对于收集的流出液，含有葡萄糖，用于制备葡萄糖酸。再将收集的吸附白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂柱泵入等树脂柱体积的蒸馏水进行洗涤，用于洗涤夹杂于树脂间的杂质。分别收集洗涤液及洗涤后的吸附有白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂柱。收集的洗涤液，用于第(3)步配制白藜芦醇苷溶液。对于收集的洗涤后吸附有白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂柱，按照XAD-7HP大孔吸附树脂质量(g)∶乙醇体积浓度为50～90％的乙醇溶液体积(mL)之比为1∶40～80的比例，向洗涤后的吸附白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂柱泵入流速为2～6倍树脂体积/小时(BV/h)的乙醇溶液。分别收集洗脱流出液和洗脱吸附有白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂。对于收集的洗脱吸附有白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂，用蒸馏水进行洗涤再生，分别收集洗涤液和洗涤后的XAD-7HP大孔吸附树脂。对收集的洗涤后得XAD-7HP大孔吸附树脂，即为再生XAD-7HP大孔吸附树脂，可再使用。使用后，再用蒸馏水洗涤再生，再次使用，如此可反复使用；然后合并洗脱流出液和再生XAD-7HP大孔吸附树脂的洗涤液，并将该合并液泵入真空浓缩器中，在真空度为-0.6～-0.9MPa，温度为75～90℃下，进行真空浓缩，直至浓缩液中无乙醇气味时为止，分别收集白藜芦醇浓缩液和蒸发液(即回收的乙醇)。对于回收的乙醇，调节其浓度后可再次用于洗脱白藜芦醇；最后将收集的白藜芦醇浓缩液，泵入结晶罐中，进行结晶24～36小时。结晶完成后，进行过滤，分别收集滤渣和滤液。对于收集的滤液，为结晶母液，可用于与第(5)中收集的洗脱流出液和再生XAD-7HP大孔吸附树脂的洗涤液合并后再结晶，再用于制备白藜芦醇晶体。对于收集的晶体，置于真空烘箱中，于60-80℃干燥2-3小时，就制备出纯度高达98-99％的白藜芦醇晶体产品。
本发明采用上述技术方案后，主要有以下效果：
(1)本发明生产过程的加工工艺和设备通用性强，操作简单实用。本发明仅使用酶水解、真空过滤、真空浓缩等通用设备及简单工艺，总体节约能源，生产成本低。
(2)本发明的生产过程反应条件温和，节约能源；工艺全过程无废物排放，全部物料都采用循环后回收利用，并进一步降低生产成本，有利于保护环境。
(3)本发明制备出固定化β-葡萄糖苷酶催化剂，显著增加了β-葡萄糖苷酶的稳定性，可在更广泛的条件下使用。固定化β-葡萄糖苷酶可反复使用，再生效果好，减少了对酶的需求量，再进一步降低了生产成本，有利于可持续发展。
(4)本发明实现了白藜芦醇苷在固定化β-葡萄糖苷酶树脂柱中连续进行水解反应，减少了生产周期与工艺步骤，提高了转化效率，降低了生产成本，能实现白藜芦醇的规模化生产与连续生产，便于推广使用。
(5)本发明制得的固定化β-葡萄糖苷酶反应器和吸附白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂能反复再生利用，进一步降低了生产成本，并有利于环境保护。
本发明可广泛应用于制备白藜芦醇，采用本发明制备出的白藜芦醇产品可广泛应用于食品保健、医药、化妆品等行业中。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步说明本发明。
实施例1
一种固定化酶连续水解白藜芦醇苷制备白藜芦醇的方法，具体步骤如下：
(1)配制β-葡萄糖苷酶缓冲溶液
以市售的β-葡萄糖苷酶为原料，按照β-葡萄糖苷酶的质量(mg)∶缓冲溶液体积(L)比为1∶0.5的比例，将β-葡萄糖苷酶加入缓冲溶液中，搅拌混合均匀，就制备出β-葡萄糖苷酶缓冲溶液。其中，所述的缓冲溶液为pH值6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液。
(2)制备固定化β-葡萄糖苷酶
第(1)步完成后，以市售的赖氨酸修饰的壳聚糖微球阴离子交换树为原料，按照赖氨酸修饰的壳聚糖微球阴离子交换树脂的质量(g)∶第(1)步制备出的β-葡萄糖苷酶缓冲溶液的体积(mL)∶1％的戊二醛溶液的体积(mL)比为1∶10∶1的比例，先将赖氨酸修饰的壳聚糖微球阳离子交换树脂加入到β-葡萄糖苷酶缓冲溶液中，搅拌吸附1小时后再加入戊二醛溶液，反应1小时后将反应产物放置于真空过滤器中，进行真空过滤，分别收集滤液和滤渣。对于收集的滤液，用于回收缓冲溶液。对于收集的滤渣，按照滤渣的质量(g)∶缓冲溶液体积(mL)之比为1∶10的比例，用缓冲溶液对滤渣进行洗涤，分别收集洗涤液和洗涤后的滤渣。再按洗涤后的滤渣的质量(g)∶缓冲溶液的体积(mL)之比为1∶10的比例，再用缓冲溶液对洗涤后的滤渣进行洗涤，分别收集洗涤液和洗涤后的滤渣。如此重复，直至洗涤液中检测不出酶蛋白质为止。最后合并各次收集的洗涤液和第(2)步收集的滤液，用于回收缓冲溶液。对于洗涤后的滤渣，即为制得的固定化β-葡萄糖苷酶，用于组装固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器。其中，所述的缓冲溶液为pH值6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液
(3)制备白藜芦醇苷水解液
第(2)步完成后，以市售的白藜芦醇苷为原料，先将第(2)步制得的固定化β-葡萄糖苷酶装入夹套保温层析柱中，升温至30℃，就组装出固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器，用于水解白藜芦醇苷。再按照市售的白藜芦醇苷的质量(g)∶乙醇体积浓度为30％的乙醇溶液体积(L)之比为1∶0.5的比例，将市售的白藜芦醇苷加入到乙醇溶液中，搅拌至溶解，就制备出白藜芦醇苷溶液，用于制备白藜芦醇水解液。然后，将制得的白藜芦醇苷溶液泵入到组装的固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器中，控制白藜芦醇苷溶液的泵入速度为固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器体积(mL)的2倍/小时(BV/h)，进行连续水解反应26小时。分别收集固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器的流出液和固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器，对于收集的固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器，可再生利用；对于收集的固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器的流出液，即为白藜芦醇苷水解液，用于吸附分离白黎芦醇。
(4)再生固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器
第(3)步完成后，向第(3)步收集的固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器中，泵入纯净水进行清洗，控制纯净水泵入速度为固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器体积(mL)的2倍/小时(8V/h)，直至清洗液中无白藜芦醇苷和白黎芦醇时止，分别收集清洗液和清洗后的固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器。对收集的清洗液，因含有大量的白藜芦醇苷和白藜芦醇，用于下步处理；对收集的清洗后的固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器，即为再生的固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器，可再使用。使用后又用纯净水清洗再生，又再使用。如此使用-清洗再生-再使用……，可反复使用，充分利用固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器，且清洗液又回收利用。因此，操作简便，又降低了生产成本，并有利于环保。
(5)制备白藜芦醇晶体
第(4)步完成后，以市售的活化的XAD-7HP大孔吸附树脂为原料，先将市售活化的XAD-7HP大孔吸附树脂装入中压层析柱中，先泵入第(3)步收集的白藜芦醇苷水解液，控制白藜芦醇苷水解液泵入速度为XAD-7HP大孔吸附树脂柱体积的2倍/小时(BV/h)，直至流出液中出现白藜芦醇为止。分别收集流出液和吸附白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂柱，对于收集的流出液，含有葡萄糖，用于制备葡萄糖酸。再将收集的吸附白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂柱泵入等树脂柱体积的蒸馏水进行洗涤，用于洗涤夹杂于树脂间的杂质。分别收集洗涤液及洗涤后的吸附有白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂柱。收集的洗涤液，用于第(3)步配制白藜芦醇苷溶液。对于收集的洗涤后吸附有白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂柱，按照XAD-7HP大孔吸附树脂质量(g)∶乙醇体积浓度为50％的乙醇溶液体积(mL)之比为1∶40的比例，向洗涤后的吸附白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂柱泵入流速为2倍树脂体积/小时(BV/h)的乙醇溶液。分别收集洗脱流出液和洗脱吸附有白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂。对于收集的洗脱吸附有白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂，用蒸馏水进行洗涤再生，分别收集洗涤液和洗涤后的XAD-7HP大孔吸附树脂。对收集的洗涤后得XAD-7HP大孔吸附树脂，即为再生XAD-7HP大孔吸附树脂，可再使用。使用后，再用蒸馏水洗涤再生，再次使用，如此可反复使用；然后合并洗脱流出液和再生XAD-7HP大孔吸附树脂的洗涤液，并将该合并液泵入真空浓缩器中，在真空度为-0.6MPa，温度为75℃下，进行真空浓缩，直至浓缩液中无乙醇气味时为止，分别收集白藜芦醇浓缩液和蒸发液(即回收的乙醇)。对于回收的乙醇，调节其浓度后可再次用于洗脱白藜芦醇；最后将收集的白藜芦醇浓缩液，泵入结晶罐中，进行结晶24小时。结晶完成后，进行过滤，分别收集滤渣和滤液。对于收集的滤液，为结晶母液，可用于与第(5)中收集的洗脱流出液和再生XAD-7HP大孔吸附树脂的洗涤液合并后再结晶，再用于制备白藜芦醇晶体。对于收集的晶体，置于真空烘箱中，于60℃干燥2小时，就制备出纯度高达98％的白藜芦醇晶体产品。
实施例2
一种固定化酶连续水解白藜芦醇苷制备白藜芦醇的方法，同实施例1，其中：
第(1)步中，β-葡萄糖苷酶的质量(mg)∶缓冲溶液体积(L)比为1∶1，缓冲溶液pH值为7.0。
第(2)步中，赖氨酸修饰的壳聚糖微球阴离子交换树脂的质量(g)∶β-葡萄糖苷酶缓冲溶液体积(mL)∶1％的戊二醛溶液体积(mL)比为1∶15∶2，搅拌吸附时间为2小时，反应时间为2小时，滤渣的质量(g)∶缓冲溶液体积(mL)之比为1∶30，洗涤后的滤渣的质量(g)∶缓冲溶液的体积(mL)之比为1∶30，缓冲溶液pH值为7.0。
第(3)步中，升温至45℃，市售的白藜芦醇苷的质量(g)∶乙醇体积浓度为40％的乙醇溶液体积(L)之比为1∶1，泵入速度为固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器体积(mL)的4倍/小时，水解反应时间为33小时。
第(4)步中，泵入速度为固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器体积(mL)的4倍/小时。
第(5)步中，泵入速度为XAD-7HP大孔吸附树脂柱体积的4倍/小时，XAD-7HP大孔吸附树脂质量(g)∶乙醇体积浓度为70％的乙醇溶液体积(mL)之比为1∶60，泵入流速为4倍树脂体积/小时，真空度为-0.7MPa，温度为83℃，结晶时间为30小时，干燥温度为70℃，干燥时间为2.5小时，产品纯度为98.3％。
实施例3
一种固定化酶连续水解白藜芦醇苷制备白藜芦醇的方法，同实施例1，其中：
第(1)步中，β-葡萄糖苷酶的质量(mg)∶缓冲溶液体积(L)比为1∶1.5，缓冲溶液pH值为8.0。
第(2)步中，赖氨酸修饰的壳聚糖微球阴离子交换树脂的质量(g)∶β-葡萄糖苷酶缓冲溶液体积(mL)∶1％的戊二醛溶液体积(mL)比为1∶20∶3，搅拌吸附时间为3小时，反应时间为3小时，滤渣的质量(g)∶缓冲溶液体积(mL)之比为1∶50，洗涤后的滤渣的质量(g)∶缓冲溶液的体积(mL)之比为1∶50，缓冲溶液pH值为8.0。
第(3)步中，升温至60℃，市售的白藜芦醇苷的质量(g)∶乙醇体积浓度为50％的乙醇溶液体积(L)之比为1∶1.5，泵入速度为固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器体积(mL)的6倍/小时，水解反应时间为40小时。
第(4)步中，泵入速度为固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器体积(mL)的6倍/小时。
第(5)步中，泵入速度为XAD-7HP大孔吸附树脂柱体积的6倍/小时，XAD-7HP大孔吸附树脂质量(g)∶乙醇体积浓度为90％的乙醇溶液体积(mL)之比为1∶80，泵入流速为6倍树脂体积/小时，真空度为-0.9MPa，温度为90℃，结晶时间为36小时，干燥温度为80℃，干燥时间为3小时，产品纯度为99％。
Claims (1)
1.一种固定化酶连续水解白藜芦醇苷制备白藜芦醇的方法，其特征在于所述方法的具体步骤如下：
(1)配制β-葡萄糖苷酶缓冲溶液
以市售的β-葡萄糖苷酶为原料，按照β-葡萄糖苷酶的质量∶缓冲溶液体积比为1mg∶0.5～1.5L的比例，将β-葡萄糖苷酶加入缓冲溶液中，搅拌混合均匀，其中，所述的缓冲溶液为pH值6.0～8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液；
(2)制备固定化β-葡萄糖苷酶
第(1)步完成后，以市售的赖氨酸修饰的壳聚糖微球阴离子交换树为原料，按照赖氨酸修饰的壳聚糖微球阴离子交换树脂的质量∶第(1)步制备出的β-葡萄糖苷酶缓冲溶液的体积∶1％的戊二醛溶液的体积比为1g∶10～20mL∶1～3mL的比例，先将赖氨酸修饰的壳聚糖微球阳离子交换树脂加入到β-葡萄糖苷酶缓冲溶液中，搅拌吸附1～3小时后再加入戊二醛溶液，反应1～3小时后将反应产物放置于真空过滤器中，进行真空过滤，分别收集滤液和滤渣，对于收集的滤渣，按照滤渣的质量∶缓冲溶液体积之比为1g∶10～50mL的比例，用缓冲溶液对滤渣进行洗涤，分别收集洗涤液和洗涤后的滤渣，再按洗涤后的滤渣的质量∶缓冲溶液的体积之比为1g∶10～50mL的比例，再用缓冲溶液对洗涤后的滤渣进行洗涤，分别收集洗涤液和洗涤后的滤渣，如此重复，直至洗涤液中检测不出酶蛋白质为止，最后合并各次收集的洗涤液和第(2)步收集的滤液，所述的缓冲溶液为pH值6.0～8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液；
(3)制备白藜芦醇苷水解液
第(2)步完成后，以市售的白藜芦醇苷为原料，先将第(2)步制得的固定化β-葡萄糖苷酶装入夹套保温层析柱中，升温至30～60℃，再按照市售的白藜芦醇苷的质量∶乙醇体积浓度为30～50％的乙醇溶液体积之比为1g∶0.5～1.5L的比例，将市售的白藜芦醇苷加入到乙醇溶液中，搅拌至溶解，然后，将制得的白藜芦醇苷溶液泵入到组装的固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器中，控制白藜芦醇苷溶液的泵入速度为固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器体积mL的2～6倍/小时，进行连续水解反应26～40小时，分别收集固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器的流出液和固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器；
(4)再生固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器
第(3)步完成后，向第(3)步收集的固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器中，泵入纯净水进行清洗，控制纯净水泵入速度为固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器体积mL的2～6倍/小时，直至清洗液中无白藜芦醇苷和白黎芦醇时止，分别收集清洗液和清洗后的固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器；
(5)制备白藜芦醇晶体
第(4)步完成后，以市售的活化的XAD-7HP大孔吸附树脂为原料，先将市售活化的XAD-7HP大孔吸附树脂装入中压层析柱中，先泵入第(3)步收集的白藜芦醇苷水解液，控制白藜芦醇苷水解液泵入速度为XAD-7HP大孔吸附树脂柱体积的2～6倍/小时，直至流出液中出现白藜芦醇为止，分别收集流出液和吸附白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂柱，再将收集的吸附白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂柱泵入等树脂柱体积的蒸馏水进行洗涤，分别收集洗涤液及洗涤后的吸附有白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂柱，对于收集的洗涤后吸附有白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂柱，按照XAD-7HP大孔吸附树脂质量∶乙醇体积浓度为50～90％的乙醇溶液体积之比为1g∶40～80mL的比例，向洗涤后的吸附白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂柱泵入流速为2～6倍树脂体积/小时的乙醇溶液，分别收集洗脱流出液和洗脱吸附有白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂，然后合并洗脱流出液和再生XAD-7HP大孔吸附树脂的洗涤液，并将该合并液泵入真空浓缩器中，在真空度为-0.6～-0.9MPa，温度为75～90℃下，进行真空浓缩，直至浓缩液中无乙醇气味时为止，分别收集白藜芦醇浓缩液和蒸发液，最后将收集的白藜芦醇浓缩液，泵入结晶罐中，进行结晶24～36小时，结晶完成后，进行过滤，分别收集滤渣和滤液，对于收集的晶体，置于真空烘箱中，于60-80℃干燥2-3小时，就制备出纯度高达98-99％的白藜芦醇晶体产品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011104107555A CN102492731B (zh) | 2011-12-12 | 2011-12-12 | 固定化酶连续水解白藜芦醇苷制备白藜芦醇的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011104107555A CN102492731B (zh) | 2011-12-12 | 2011-12-12 | 固定化酶连续水解白藜芦醇苷制备白藜芦醇的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102492731A true CN102492731A (zh) | 2012-06-13 |
| CN102492731B CN102492731B (zh) | 2013-10-02 |
Family
ID=46184593
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2011104107555A Expired - Fee Related CN102492731B (zh) | 2011-12-12 | 2011-12-12 | 固定化酶连续水解白藜芦醇苷制备白藜芦醇的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102492731B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102911928A (zh) * | 2012-07-06 | 2013-02-06 | 西南药业股份有限公司 | 一种肌酸激酶固定化的方法 |
| CN110372770A (zh) * | 2018-04-12 | 2019-10-25 | 耿兆翔 | 天然含羟基或/和羧基化合物的高效提取方法 |
| CN111374933A (zh) * | 2020-04-06 | 2020-07-07 | 陕西斯戴木生物科技有限公司 | 一种改进的高保水性、高祛斑活性的蚕丝面膜 |
| CN115353445A (zh) * | 2022-08-22 | 2022-11-18 | 刘想欢 | 一种白藜芦醇的生物萃取方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101735999A (zh) * | 2010-01-19 | 2010-06-16 | 曹庸 | 一种固定化酶法转化虎杖材料提高白藜芦醇含量的方法 |
-
2011
- 2011-12-12 CN CN2011104107555A patent/CN102492731B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101735999A (zh) * | 2010-01-19 | 2010-06-16 | 曹庸 | 一种固定化酶法转化虎杖材料提高白藜芦醇含量的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 《哈尔滨商业大学学报》 20101215 李笑梅等 壳聚糖固定化beta-葡萄糖苷酶酶学性质研究 第688页摘要、左栏第1段、右栏第1段，第690页讨论部分 1 第26卷, 第6期 * |
| 李笑梅等: "壳聚糖固定化β-葡萄糖苷酶酶学性质研究", 《哈尔滨商业大学学报》, vol. 26, no. 6, 15 December 2010 (2010-12-15) * |
| 郭丽冰等: "常用大孔吸附树脂的主要参数和应用情况", 《中国现代中药》, vol. 8, no. 4, 16 April 2006 (2006-04-16) * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102911928A (zh) * | 2012-07-06 | 2013-02-06 | 西南药业股份有限公司 | 一种肌酸激酶固定化的方法 |
| CN102911928B (zh) * | 2012-07-06 | 2014-10-08 | 西南药业股份有限公司 | 一种肌酸激酶固定化的方法 |
| CN110372770A (zh) * | 2018-04-12 | 2019-10-25 | 耿兆翔 | 天然含羟基或/和羧基化合物的高效提取方法 |
| CN111374933A (zh) * | 2020-04-06 | 2020-07-07 | 陕西斯戴木生物科技有限公司 | 一种改进的高保水性、高祛斑活性的蚕丝面膜 |
| CN115353445A (zh) * | 2022-08-22 | 2022-11-18 | 刘想欢 | 一种白藜芦醇的生物萃取方法 |
| CN115353445B (zh) * | 2022-08-22 | 2023-09-15 | 诺德溯源(广州)生物科技有限公司 | 一种白藜芦醇的生物萃取方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102492731B (zh) | 2013-10-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101781346B (zh) | 一种从生物催化转化液中分离尿苷酸的方法 | |
| CN101899484B (zh) | 一种京尼平的制备方法 | |
| CN102492731B (zh) | 固定化酶连续水解白藜芦醇苷制备白藜芦醇的方法 | |
| CN112979482B (zh) | 一种高纯度l-缬氨酸及其制备方法和其应用 | |
| CN104087646A (zh) | 一种甘草次酸的制备方法 | |
| CN100478451C (zh) | 游离细胞或固定化细胞催化合成α-熊果苷的方法 | |
| CN103709235B (zh) | 一种减少溶媒使用的提取高纯度恩拉霉素的方法 | |
| CN103849665A (zh) | 羧基功能化离子液体溶液预处理木质纤维素的方法 | |
| CN102559781B (zh) | 一种制备r-扁桃酸的方法 | |
| CN102267906B (zh) | 一种绿原酸的提取方法 | |
| CN102517361A (zh) | 脂肪酶催化合成熊果苷的方法 | |
| CN103058871A (zh) | 一种烟草绿原酸的分离纯化方法 | |
| CN104628587A (zh) | 一种回收阿莫西林生产废液中d-对羟基苯甘氨酸的方法 | |
| CN110698472B (zh) | 一种吡咯喹啉醌的纯化方法 | |
| CN101709037A (zh) | 制备高纯度d―氨基酸的方法 | |
| CN101709323B (zh) | 生物催化与分离耦合法生产r-扁桃酸 | |
| CN102557980A (zh) | 结晶制备高纯辣椒碱单体的方法 | |
| CN101792476B (zh) | 一种提取分离夫西地酸的方法 | |
| CN102172371B (zh) | 一种用接枝槲皮素交联壳聚糖树脂分离荞麦黄酮的方法 | |
| CN102863433A (zh) | 莫匹罗星的一种纯化方法 | |
| CN102504958B (zh) | 一种基于可逆反应的组合络合分离蚕蛹油中不饱和脂肪酸的方法 | |
| CN1528916A (zh) | 一种蔗糖原料高收率联产结晶果糖与甘露醇的工艺 | |
| CN1915980A (zh) | 肌肽类似物制备方法 | |
| CN101781211A (zh) | 一种葵花粕中绿原酸提取方法 | |
| CN103694159B (zh) | 一种(s)-4-羟基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20131002 Termination date: 20151212 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |