CN102703416B

CN102703416B - 一种固定化酶载体的制备方法

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Publication number: CN102703416B
Application number: CN201210212493.6A
Authority: CN
Inventors: 张全香; 皮国佩; 苑晓威; 闫志军; 李彦军; 卢广明; 刘保朝; 卢照金
Original assignee: CANGZHOU BON ADSORBER TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: CANGZHOU BON ADSORBER TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2012-06-26
Filing date: 2012-06-26
Publication date: 2014-10-01
Anticipated expiration: 2032-06-26
Also published as: CN102703416A

Abstract

本发明公开了一种固定化酶载体的制备方法，属于酶固定化载体技术领域。其包括下述步骤：（1）配制水相；（2）配制油相；（3）聚合：将油相加入水相中进行分散，用0.5-1.5小时逐步升温到65-75℃，然后保温4-8小时进行聚合，得到载体粗品；（4）水洗、干燥；（5）筛分、漂球；（6）乙醇提取；（7）稳定反应，得到成品。本发明采用一步正相悬浮聚合合成固定化酶载体，大大缩短了合成周期，降低了成本，并且操作简单，原料易得；克服了反相聚合法树脂珠体易粘结成块、珠体大小不好控制、不易得到大孔树脂的缺点；大大提高了固定化酶载体的活性和机械强度，载酶时间短。

Description

一种固定化酶载体的制备方法

技术领域

本发明涉及酶固定化载体技术领域，尤其是一种固定化酶载体的制备方法。

背景技术

固定化酶经过几十年的发展，已经得到广泛应用，有的已经可进行工业性运转，被广泛用于食品生产与检测、生物制药、生物传感器、医药工业、环保技术及生物技术等多种领域。

酶的结构是蛋白质，在催化作用中具有高选择性、高催化性、反应条件温和、环保无污染等优点。尤其是催化反应的反应性专一、副产物较少。但游离状态的酶对于热、强酸、强碱、高离子强度、有机溶剂等条件的稳定性较差，易失活。另外在催化反应后容易混入产物中难以分离，影响产物的纯度。游离酶不能重复使用。为了克服这些缺点，开发了固定化生物催化剂的研究，因此固定化酶技术已成为酶工程研究的重点和热点之一。

固定化酶也可认为是在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行催化反应，且可重复使用的酶。其优点是可以长期重复使用，反应过程可以严格控制，有助于提高酶的稳定性，被固定的酶易于和底物分离，增加产物的收率，提高产物的质量，降低成本等。固定化细胞就是被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理、化学等因素的约束或限制在一定的空间界限内，仍保留催化活性且在反复或连续使用后仍具有催化活力的细胞。固定化细胞保持了酶系的原始状态与天然环境，有效地利用游离细胞的完整酶洗脱和细胞膜的选择通透性，既具有固定化酶的优点，又具有其自身的优越性。

酶的固定化方法有：吸附法、交联法、包埋法、偶联法等，其中通过载体上的环氧基与酶分子的氨基或巯基反应使酶分子通过共价键固载于载体上的方法应用最广泛，因此在固定化酶方面具有普适性。载体应具备的条件：1）对细胞无毒，具有高的载体活性；2）具有良好的传质性能；3）具有高的细胞容量；4）具有生物、化学及热力学稳定性，机械强度较高，有较长的使用寿命；5）原料易得，制备工艺简便可行，适用于大规模生产。文献报道的含环氧基的固定化酶材料多采用分三步合成的方法，虽然载酶性能可以，但合成步骤增多无疑延长了生产过程，增加了成本，而且给工人操作带来了更多的不便。另有报道采用反相合成的方法制备这类的载体，这种反相合成不但不利于控制产品的粒度，使悬浮聚合的成球率很低，而且也不易得到大孔的产品，产品的后处理也很繁琐，如果后处理不好会将连续相带到产品里面。

发明内容

本发明提供一种固定化酶载体的制备方法，采用一步正相悬浮聚合合成固定化酶载体，大大缩短了合成周期，降低了成本，并且操作简单，原料易得；克服了反相聚合法树脂珠体易粘结成块、珠体大小不好控制、不易得到大孔树脂的缺点；大大提高了固定化酶载体的活性和机械强度，载酶时间短。

本发明所采取的技术方案是：

一种固定化酶载体的制备方法，其特征在于包括下述步骤：

（1）配制水相：将明胶加入到质量分数为5-15%的盐溶液中，使明胶的质量浓度为0.5-3%，升温至30-50℃搅拌溶解；所述盐溶液中的盐为氯化钠、氯化钙、硫酸镁、碳酸钠中的一种；

（2）配制油相：20-35重量份的二乙烯苯、65-80重量份的GMA、0.5-2重量份的偶氮二异丁腈混合均匀，加入100-150重量份致孔剂，常温下混合均匀；

（3）聚合：将油相加入水相中进行分散，用0.5-1.5小时逐步升温到65-75℃，然后保温4-8小时进行聚合，得到载体粗品；油相和水相的重量比为1：2-6；

（4）水洗、干燥；

（5）筛分、漂球；

（6）乙醇提取；

（7）稳定反应，得到产品。

步骤（2）中所述致孔剂为环己醇和乙酸乙酯的重量比为1:1-3的混合物。

步骤（4）中水洗为：用70-90℃的纯水洗涤树脂直到流出水清澈为止。

步骤（6）中乙醇提取为：加入乙醇至没过产品，升温到65-75℃，搅拌提取20-40分钟，反复5-8次。

步骤（7）中稳定反应为：在质量分数为0.5-2%戊二醛乙醇溶液中保持20-30℃搅拌20-24小时，抽净戊二醛溶液，常温水洗5-8次。

反相聚合是油包水的体系，连续相都是有机油类，当分散相的比重较大时，油的密度相对较低，在分散过程中液珠容易下沉，难以分散，易导致反应中珠体黏结，而且树脂成型后处理时，树脂产品难以洗涤干净。

正相聚合的连续相为水，分散相为油相，油的密度一般都比水轻，容易形成悬浮聚合的分散体系，加上合适的分散剂和搅拌速度能有效避免树脂珠体粘结成块、珠体大小易控、易得到大孔树脂。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

1.本发明采用一步正相悬浮聚合合成固定化酶载体，大大缩短了合成周期，降低了成本，并且操作简单，原料易得，克服了多步合成生产路线长、成本高的缺点。

2.本发明采用正相聚合得到产品，克服了反相聚合法树脂珠体易粘结成块、珠体大小不好控制、不易得到大孔树脂的缺点。

3.本发明的方法大大提高了固定化酶载体的机械强度，载酶时间短。

具体实施方式

实施例1

（1）配制水相：将明胶加入到质量分数为10%的氯化钠溶液中，使明胶的质量浓度为2%，升温至40℃搅拌溶解。

（2）配制油相：30重量份的二乙烯苯、70重量份的GMA、1重量份的偶氮二异丁腈混合均匀，加入100重量份致孔剂，常温下混合均匀；致孔剂中环己醇和乙酸乙酯的重量比为1:1。

（3）聚合：将油相加入水相中进行分散，用1小时逐步升温到70℃，然后保温5小时进行聚合，得到载体粗品；油相和水相的重量比为1：4。

（4）用70-90℃的纯水洗涤载体粗品直到流出水清澈，50℃以下干燥到载体粗品能自然流动。

（5）用50目和130目两层筛分，把小球，碎渣充分筛除；然后将筛分好的产品投入乙醇，把漂浮在液面的碎球和漂浮物漂除。

（6）加入乙醇至没过载体粗品，升温到65-75℃，搅拌提取20分钟，反复6次。

（7）将载体粗品在质量分数为1%戊二醛乙醇溶液中保持20-30℃搅拌22小时，抽净戊二醛溶液，常温水洗6次，制得成品。

实施例2

（1）配制水相：将明胶加入到质量分数为5%的氯化钙溶液中，使明胶的质量浓度为1.5%，升温至30℃搅拌溶解。

（2）配制油相：35重量份的二乙烯苯、72重量份的GMA、0.5重量份的偶氮二异丁腈混合均匀，加入120重量份致孔剂，常温下混合均匀；致孔剂中环己醇和乙酸乙酯的重量比为1:2。

（3）聚合：将油相加入水相中进行分散，用0.5小时逐步升温到65℃，然后保温8小时进行聚合，得到载体粗品；油相和水相的重量比为1：2。

（5）用50目和130目两层筛分，把小球，碎渣充分筛除；然后将筛分好的载体粗品投入乙醇，把漂浮在液面的碎球和漂浮物漂除。

（6）加入乙醇至没过载体粗品，升温到65-75℃，搅拌提取30分钟，反复7次。

（7）将载体粗品在质量分数为1.5%戊二醛乙醇溶液中保持20-30℃搅拌23小时，抽净戊二醛溶液，常温水洗8次，制得成品。

实施例3

（1）配制水相：将明胶加入到质量分数为8%的硫酸镁溶液中，使明胶的质量浓度为1%，升温至50℃搅拌溶解。

（2）配制油相：20重量份的二乙烯苯、68重量份的GMA、0.8重量份的偶氮二异丁腈混合均匀，加入110重量份致孔剂，常温下混合均匀；致孔剂中环己醇和乙酸乙酯的重量比为1:2。

（3）聚合：将油相加入水相中进行分散，用1.5小时逐步升温到80℃，然后保温4小时进行聚合，得到载体粗品；油相和水相的重量比为1：3。

（6）加入乙醇至没过载体粗品，升温到65-75℃，搅拌提取40分钟，反复6次。

（7）将载体粗品在质量分数为0.5%戊二醛乙醇溶液中保持20-30℃搅拌21小时，抽净戊二醛溶液，常温水洗5次，制得成品。

实施例4

（1）配制水相：将明胶加入到质量分数为15%的氯化钠溶液中，使明胶的质量浓度为0.5%，升温至35℃搅拌溶解。

（2）配制油相：25重量份的二乙烯苯、80重量份的GMA、1.5重量份的偶氮二异丁腈混合均匀，加入140重量份致孔剂，常温下混合均匀；致孔剂中环己醇和乙酸乙酯的重量比为1:3。

（3）聚合：将油相加入水相中进行分散，用1.2小时逐步升温到78℃，然后保温5小时进行聚合，得到载体粗品；油相和水相的重量比为1：6。

（6）加入乙醇至没过载体粗品，升温到65-75℃，搅拌提取25分钟，反复5次。

（7）将载体粗品在质量分数为0.8%戊二醛乙醇溶液中保持20-30℃搅拌24小时，抽净戊二醛溶液，常温水洗7次，制得成品。

实施例5

（1）配制水相：将明胶加入到质量分数为12%的碳酸钠溶液中，使明胶的质量浓度为3%，升温至45℃搅拌溶解。

（2）配制油相：32重量份的二乙烯苯、65重量份的GMA、2重量份的偶氮二异丁腈混合均匀，加入150重量份致孔剂，常温下混合均匀；致孔剂中环己醇和乙酸乙酯的重量比为1:1.5。

（3）聚合：将油相加入水相中进行分散，用0.8小时逐步升温到70℃，然后保温6小时进行聚合，得到载体粗品；油相和水相的重量比为1：5。

（6）加入乙醇至没过载体粗品，升温到65-75℃，搅拌提取35分钟，反复8次。

（7）将载体粗品在质量分数为2%戊二醛乙醇溶液中保持20-30℃搅拌20小时，抽净戊二醛溶液，常温水洗6次，制得成品。

实施例1得到的固定化酶载体与进口和国内市售的产品相比，在固定化酶活力、强度和载酶时间等方面的性能均有所提高，对比数据见表1。

表1

样品	固定化酶活力（u/g）	摩擦介质浊度	载酶时间（min）
				进口	361.3	100	70
国内市售	363.8	70	80
				本发明的载体	426.1	30-40	60

其中，载体的强度通过测定摩擦介质浊度的测定，摩擦介质浊度越小，机械强度越高；载酶时间越短，说明载体的活性越高。

由表1可以看出，本发明的方法制备的固定化酶载体的载酶时间明显变短，固定化酶活力明显提高；摩擦介质浊度降低，机械强度提高。

Claims

1.一种固定化酶载体的制备方法，其特征在于包括下述步骤：

（2）配制油相：20-35重量份的二乙烯苯、65-80重量份的GMA、0.5-2重量份的偶氮二异丁腈混合均匀，加入100-150重量份致孔剂，常温下混合均匀；所述致孔剂为环己醇和乙酸乙酯的重量比为1:1-3的混合物；

（4）水洗、干燥；

（5）筛分、漂球；

（6）乙醇提取：加入乙醇至没过载体粗品，升温到65-75℃，搅拌提取20-40分钟，反复5-8次；

（7）稳定反应，得到产品；所述稳定反应为将载体粗品在质量分数为0.5-2%戊二醛乙醇溶液中保持20-30℃搅拌20-24小时，抽净戊二醛溶液，常温水洗5-8次。

2.根据权利要求１所述的一种固定化酶载体的制备方法，其特征在于所述步骤（4）中水洗为：用70-90℃的纯水洗涤载体粗品直到流出水清澈为止。