CN106222218B - 一种酶法制备红景天苷的方法 - Google Patents
一种酶法制备红景天苷的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106222218B CN106222218B CN201610613563.7A CN201610613563A CN106222218B CN 106222218 B CN106222218 B CN 106222218B CN 201610613563 A CN201610613563 A CN 201610613563A CN 106222218 B CN106222218 B CN 106222218B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rhodioside
- process prepares
- enzyme process
- buffer
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
Abstract
本发明提供了一种酶法制备红景天苷的方法。具体是以氯化胆碱和甘油加热搅拌合成的低共熔溶剂(DES)作为反应溶剂，采用β‑D‑葡萄糖苷酶生物催化糖基化合成红景天苷，底物(葡萄糖计)转化率可达30％以上。本发明所采用的DES绿色无毒，对于反应底物溶解度较高，且具有良好的生物相容性。本发明制备方法具有操作简单，高效环保，条件温和，成本低廉等优点。
Description
技术领域
本发明涉及合成红景天苷的方法，具体是一种酶法制备红景天苷的方法。
背景技术
红景天(Rhodiola rosea L.)，多年生草本植物，生长在海拔1800-2500米高寒无污染地带，其生长环境恶劣，因而具有很强的生命力和特殊的适应性。可作药用，能够补气清肺，益智养心，是一味作用广泛的中药；亦有很大的美容效果，可作护肤品，也可食用。
红景天苷(Salidroside)，分子式C14H20O7，结构式：
是红景天中的主要有效成分，具有抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗辐射和延缓机体衰老、防止老年疾病的功能，在军事医学、航天医学、运动医学和保健医学等方面具有十分重要的应用价值，是一种极具开发前景的环境适应药物，近年来备受关注。植物体中红景天苷含量低，经过多步分离纯化后得率很低，且野生红景天由于过度采挖资源匮乏，不耐高温无法人工大面积栽培，因而限制了从天然植物中大量提取的可行性，目前主要通过愈伤组织悬浮培养和化学合成的方法获取红景天苷。以上获取方法主要缺点为产物浓度低、纯度低，成本较高以及反应时间较长，因而难以投入实际应用。
化学合成红景天苷大多都需要进行选择性保护、活化或使用昂贵的金属催化剂，而生物合成具有反应条件温和，立体选择性高，反应过程简单，环境污染少等特点，在合成红景天苷方面显示了一定的优越性。虽然前期已有相关研究工作成功进行糖苷类化合物的酶催化生物合成(Tong et al.,2004；KatSumi et al.,2004；Hiroyuki Akita et al.,2006)，但由于β-D-葡萄糖苷酶本质上属于糖苷水解酶类，在传统水相中因受水解-糖基化反应热力学平衡的限制而导致反应转化率低下，红景天苷浓度较低，成为酶催化合成糖苷类化合物的一大瓶颈。因此，以传统有机溶剂作为共反应介质成为近年来酶催化生物合成的一大研究热点。尽管如此，但在红景天苷生物合成反应中，由于酶、底物以及产物均难溶于有机溶剂，且酶的活性和稳定性较差，因此并不利于反应的进行，对于合成结果并没有太大改善作用。因此，选择一类合适的反应介质得以解决上述困难，是实现红景天苷高效合成的关键所在。
发明内容
本发明的目的在于针对酶催化生物合成红景天苷的现有技术中存在的问题，提供一种合成简单、成本低廉、环境友好的酶法制备红景天苷的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明将低共熔溶剂(DES)体系用于β-D-葡萄糖苷酶催化糖基化合成红景天苷，反应过程操作简单，条件温和，实现了高效环保合成的宗旨。
本发明反应路线：
本发明提供的一种酶法制备红景天苷的方法，包括以下步骤：
(1)将氢键供体化合物和氢键受体化合物按摩尔比1:0.5-3均匀混合，在80-100℃加热搅拌至形成均一透明液体，P2O5干燥两周，得到低共熔溶剂(DES)；所述的氢键受体化合物为季铵盐或两性离子化合物，氢键供体化合物为多元醇。
(2)按摩尔比1:5-10取无水D-葡萄糖和酪醇，充分溶解于以pH 4.0-7.0缓冲液配制的体积含量为70-90％的DES水溶液中，制得50mM D-葡萄糖和250-500mM酪醇的底物溶液，再按30-60U/mL加入45℃预先孵育的壳聚糖微球固定化的β-D葡萄糖苷酶，混合均匀，加热至40-70℃，保温、搅拌反应96-120h，反应结束后，过滤，制得含有红景天苷的滤液。
用去离子水清洗过滤出的壳聚糖固定化的β-D葡萄糖苷酶微球，重复三次，4℃条件保存，可重复利用。
所述步骤(1)中的季铵盐优选为氯化胆碱，多元醇优选为甘油。
所述步骤(2)中的缓冲液为乙酸-乙酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液中的任一种，优选为0.1M pH5.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。
所述步骤(2)中葡萄糖与酪醇的摩尔比优选为1:10。
所述步骤(2)中体系中DES体积含量优选为80％。
所述步骤(2)中反应温度优选为40-50℃。
所述步骤(2)中壳聚糖微球固定化的β-葡萄糖苷酶用量优选为35-50U/mL。
所述步骤(2)中壳聚糖微球固定化的β-D葡萄糖苷酶，通过如下方法制得：将壳聚糖溶解于稀冰乙酸中，制得5mg/mL壳聚糖胶体溶液，超声驱除气泡，进一步制成1.5mm左右大小的干燥微球，加至3％戊二醛溶液中，50℃下震荡交联2h，洗去多余戊二醛后，加入β-D葡萄糖苷酶液，25℃、150rpm条件下震荡吸附24h，用pH5.8柠檬酸-磷酸盐缓冲液洗去固定化酶表面的游离酶，4℃保存备用。
与现有技术相比本发明的有益效果：
本发明采用的低共熔溶剂(DES)是一类廉价易得、原子经济，可循环使用的新型绿色溶剂，具有低挥发性、无毒性、可设计性以及生物降解性高等优点，是一种新颖的绿色环保溶剂，在酶催化生物转化领域有着广阔的应用前景。在β-D葡萄糖苷酶催化合成红景天苷反应中，DES对于极性底物葡萄糖以及中极性底物酪醇均具有良好的溶解性，保持了酶的较高催化活性，并且酶的热稳定性也得到提高，这些因素保障了酶的长时间反应的活力，并且可重复利用。最佳工艺条件下，红景天苷酶催化合成反应中底物的转化率可达38.2％，平行试验三次，RSD为3.46％。该工艺条件较温和，且高效简便，重复性良好。
附图说明
图1实施例1合成产物HPLC图谱
图2实施例2合成产物HPLC图谱
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步地说明，本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
实施例1
A.低共熔溶剂的合成：准确称取13.97g氯化胆碱，量取14.56mL甘油，混合加入500mL圆底烧瓶中，于集热式磁力搅拌器中加热搅拌，温度为80-100℃，转速为300rpm。反应10h后，形成均一透明液体，制得约30mL DES。
B.壳聚糖微球固定化β-D葡萄糖苷酶制备：称取0.5g壳聚糖溶解于100mL 2％冰乙酸中，制得壳聚糖胶体溶液，超声驱除气泡。用注射器吸取适量上述壳聚糖溶液，滴至凝结液中，凝结液组成为7.5％NaOH溶液/95％乙醇(v/v)＝4:1，形成1.5mm左右大小的微球，经干燥后，加入到3％戊二醛溶液中，50℃下震荡交联2h，洗去多余戊二醛，加入β-D葡萄糖苷酶液，25℃下震荡吸附24h(150rpm)。用0.1M pH5.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液洗去固定化酶表面的游离酶，4℃保存备用。
C.酶催化合成红景天苷：分别准确称取无水D-葡萄糖1.8g，酪醇13.82g，搅拌使充分溶解于160mL DES中，再依次加入45℃预先孵育的40mL pH5.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，8000U壳聚糖微球固定化的β-D葡萄糖苷酶，混合均匀。将上述体系加热至50℃，保温、搅拌反应120h，反应结束后，过滤出反应液，以等体积甲醇稀释，经HPLC检测底物(葡萄糖计)转化率达38.2％。
实施例2
A.同实施例1。
B.同实施例1。
C.酶催化合成红景天苷：分别准确称取无水D-葡萄糖1.8g，酪醇11.06g，搅拌使充分溶解于180mL DES中，再依次加入45℃预先孵育的20mL pH5.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，10000U壳聚糖微球固定化的β-D葡萄糖苷酶，混合均匀。将上述体系加热至45℃，保温、搅拌反应120h，反应结束后，过滤出反应液，以等体积甲醇稀释，经HPLC检测底物(葡萄糖计)转化率达32.9％。
实施例3
A.同实施例1。
B.同实施例1。
C.酶催化合成红景天苷：分别准确称取无水D-葡萄糖1.8g，酪醇12.44g，搅拌使充分溶解于140mL DES中，再依次加入45℃预先孵育的60mL pH5.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，7000U壳聚糖微球固定化的β-D葡萄糖苷酶，混合均匀。将上述体系加热至50℃，保温、搅拌反应120h，反应结束后，过滤出反应液，以等体积甲醇稀释，经HPLC检测底物(葡萄糖计)转化率达31.8％。
实施例4
A.同实施例1。
B.同实施例1。
C.酶催化合成红景天苷：分别准确称取无水D-葡萄糖1.8g，酪醇6.91g，搅拌使充分溶解于160mL DES中，再依次加入45℃预先孵育的40mL pH5.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，10000U壳聚糖微球固定化的β-D葡萄糖苷酶，混合均匀。将上述体系加热至50℃，保温、搅拌反应120h，反应结束后，过滤出反应液，以等体积甲醇稀释，经HPLC检测底物(葡萄糖计)转化率达30.5％。
Claims (8)
1.一种酶法制备红景天苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将氢键供体化合物和氢键受体化合物按摩尔比1:0.5-3均匀混合，在80-100℃加热搅拌至形成均一透明液体，P2O5干燥两周，得到低共熔溶剂(DES)；所述的氢键受体化合物为季铵盐，氢键供体化合物为多元醇；
(2)按摩尔比1:5-10取无水D-葡萄糖和酪醇，充分溶解于以pH 4.0-7.0缓冲液配制的体积含量为70-90％的DES水溶液中，制得50mM D-葡萄糖和250-500mM酪醇的底物溶液，再按30-60U/mL加入45℃预先孵育的壳聚糖微球固定化的β-D葡萄糖苷酶，混合均匀，加热至40-70℃，保温、搅拌反应96-120h，反应结束后，过滤，制得含有红景天苷的滤液；
所述步骤(1)中的季铵盐为氯化胆碱，多元醇为甘油。
2.如权利要求1所述的一种酶法制备红景天苷的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的缓冲液为乙酸-乙酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液和柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液中的任一种。
3.如权利要求2所述的一种酶法制备红景天苷的方法，其特征在于，所述柠檬酸-磷酸盐缓冲液为0.1M pH5.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。
4.如权利要求1所述的一种酶法制备红景天苷的方法，其特征在于，所述步骤(2)中葡萄糖与酪醇的摩尔比为1:10。
5.如权利要求1所述的一种酶法制备红景天苷的方法，其特征在于，所述步骤(2)中体系中DES体积含量为80％。
6.如权利要求1所述的一种酶法制备红景天苷的方法，其特征在于，所述步骤(2)中反应温度为40-50℃。
7.如权利要求1所述的一种酶法制备红景天苷的方法，其特征在于，所述步骤(2)中壳聚糖微球固定化的β-D葡萄糖苷酶用量为35-50U/mL。
8.如权利要求1所述的一种酶法制备红景天苷的方法，其特征在于，所述步骤(2)中壳聚糖微球固定化的β-D葡萄糖苷酶，通过如下方法制得：将壳聚糖溶解于稀冰乙酸中，制得5mg/mL壳聚糖胶体溶液，超声驱除气泡，进一步制成1.5mm左右大小的干燥微球，加至3％戊二醛溶液中，50℃下震荡交联2h，洗去多余戊二醛后，加入β-D葡萄糖苷酶液，25℃、150rpm条件下震荡吸附24h，用pH5.8柠檬酸-磷酸盐缓冲液洗去固定化酶表面的游离酶，4℃保存备用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610613563.7A CN106222218B (zh) | 2016-07-31 | 2016-07-31 | 一种酶法制备红景天苷的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610613563.7A CN106222218B (zh) | 2016-07-31 | 2016-07-31 | 一种酶法制备红景天苷的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106222218A CN106222218A (zh) | 2016-12-14 |
| CN106222218B true CN106222218B (zh) | 2019-06-28 |
Family
ID=57535499
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610613563.7A Active CN106222218B (zh) | 2016-07-31 | 2016-07-31 | 一种酶法制备红景天苷的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106222218B (zh) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106749442B (zh) * | 2016-12-08 | 2019-04-19 | 河西学院 | 一种盐诱导低共熔溶剂萃取肉苁蓉中苯乙醇苷的方法 |
| CN107937457B (zh) * | 2017-11-16 | 2021-05-04 | 江南大学 | 一种酶催化正丁基-β-D-葡萄糖苷转糖苷制备红景天苷的方法 |
| CN108186575B (zh) * | 2018-03-14 | 2020-05-22 | 安徽工业大学 | 一种基于低共熔溶剂为溶剂的包埋体系 |
| CN108623642B (zh) * | 2018-07-11 | 2020-12-01 | 南京林业大学 | 一种用于同步提取红景天中红景天苷和酪醇的深共熔溶剂水混合物及其制备方法和提取方法 |
| CN109280681B (zh) | 2018-09-26 | 2020-10-30 | 西安惠博生物科技有限公司 | 一种红景天苷的制备方法 |
| CN109694892B (zh) * | 2018-11-27 | 2021-03-23 | 北京工商大学 | 制备红景天苷的方法和试剂盒 |
| CN115491398B (zh) * | 2022-11-02 | 2023-05-26 | 陕西嘉禾生物科技股份有限公司 | 一种红景天中分离得到红景天苷的方法 |
| CN116396342A (zh) * | 2023-06-08 | 2023-07-07 | 荣成市慧海创达生物科技有限公司 | 一种红景天苷的衍生物及制备方法和应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL2004835C2 (en) * | 2010-06-07 | 2011-12-08 | Univ Leiden | Process for extracting materials from biological material. |
| CN102174620A (zh) * | 2011-03-02 | 2011-09-07 | 福州大学 | 一种酶催化直接糖基化合成红景天苷的方法 |
| CN103642880B (zh) * | 2013-12-11 | 2015-09-09 | 福州大学 | 一种β-葡萄糖苷酶交联聚集体催化合成红景天苷的工艺 |
-
2016
- 2016-07-31 CN CN201610613563.7A patent/CN106222218B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106222218A (zh) | 2016-12-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106222218B (zh) | 一种酶法制备红景天苷的方法 | |
| CN101899484B (zh) | 一种京尼平的制备方法 | |
| CN103966277B (zh) | 一种固定化磷脂酶d催化制备磷脂酰丝氨酸的方法 | |
| CN103614431B (zh) | 一种利用相转移催化制备栀子蓝色素的方法 | |
| CN102146423B (zh) | 栀子苷元的制备方法 | |
| CN111876452A (zh) | 一种利用生物酶一锅法制备玻色因的方法 | |
| CN108048421A (zh) | 利用胆碱类低共熔溶剂提高果糖基转移酶催化效率和稳定性的方法 | |
| CN102952792B (zh) | 凹凸棒土负载海藻酸钠固定β-葡萄糖苷酶的制备方法 | |
| CN107022542A (zh) | 海藻酸钠接枝衍生环糊精固定化细胞及其应用 | |
| CN102925418B (zh) | 一种α-熊果苷生产过程中蔗糖磷酸化酶的回收方法 | |
| CN106755214A (zh) | 一种双相酶水解获取宝藿苷i的方法 | |
| CN112813116A (zh) | 利用生物酶解制备芹菜素的方法 | |
| CN102603901A (zh) | 利用晶种添加制备回生抗性淀粉的方法 | |
| CN105969826B (zh) | 一种微反应器专用纳米粒子固定化酶合成异槲皮苷的方法 | |
| CN104531662A (zh) | 包埋法固定大肠杆菌谷氨酸脱羧酶的方法 | |
| US9834803B2 (en) | Methods to isolate cyclodextrins | |
| CN101787038A (zh) | 一种硫酸头孢喹肟的制备方法 | |
| CN112961891B (zh) | 利用双相酶促反应制备淫羊藿苷的方法 | |
| CN109706204B (zh) | 一种固定化大肠杆菌制备胸苷的方法 | |
| CN103724524A (zh) | 一种葡萄糖壬二酸二乙烯脂/异丙基丙烯酰胺共聚物纳米颗粒的制备方法 | |
| CN103451249A (zh) | 一种硫-稀丙基-l-半胱氨酸的制备方法 | |
| CN104193632B (zh) | 一种从酶生物技术制备鸟氨酸转化液中分离鸟氨酸并形成鸟氨酸盐酸盐的方法 | |
| CN106480009A (zh) | 一种固定化氨基酸酯酰转移酶及在制备丙谷二肽中的应用 | |
| CN102703416B (zh) | 一种固定化酶载体的制备方法 | |
| CN101732326A (zh) | 维生素d3营养物复合物的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |