CN103642880B - 一种β-葡萄糖苷酶交联聚集体催化合成红景天苷的工艺 - Google Patents
一种β-葡萄糖苷酶交联聚集体催化合成红景天苷的工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种β-葡萄糖苷酶交联聚集体（简称：β-葡萄糖苷酶CLEAs）催化合成红景天苷的工艺，其中，在红景天苷合成阶段中：反应体系为1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐/仿水溶剂/1,4-二氧六环/缓冲溶液，仿水溶剂为乙酸乙酯，β-葡萄糖苷酶CLEAs的单位酶活为1.3~1.6U/ml，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐与乙酸乙酯的体积和与1,4-二氧六环体积比为2:3~3:2，缓冲溶液的体积分数为12~18%；反应温度为48~52℃，反应5~9d。本发明能够大幅提高产物红景天苷的浓度，且可保持较高的β-葡萄糖苷酶CLEAs残余相对酶活。
Description
技术领域
本发明属于酶催化合成红景天苷领域，尤其是一种β-葡萄糖苷酶交联聚集体（简称：β-葡萄糖苷酶CLEAs）催化合成红景天苷的工艺。
背景技术
红景天苷是具有特殊生理功能的化合物，它在抗细胞缺氧、抗肿瘤、增强机体免疫力等方面均有良好效果。由于生物合成红景天苷具有选择性高、反应条件温和、产物纯度较高、产品便于分离纯化等优点，因此受到普遍关注。
鉴于酶催化合成红景天苷的反应时间比植物组织培养和细胞培养时间都要短很多，并且，反应过程无需昂贵的糖苷供体和催化剂，避免了化学合成繁琐的反应步骤，另外，反应完成后可以方便的从反应液中提取目标产物红景天苷，未反应的底物对羟基苯乙醇可再次循环使用，降低生产成本，因此，酶催化合成红景天苷为红景天苷批量生产具有非常大的经济意义和现实意义。
由于红景天苷在糖苷酶的存在下极易被水解，而生物合成红景天苷过程中所需的酶又需要水环境来保持其活性，即保持较高的红景天苷合成效率，因此，如何实现保持酶活性与抑制红景天苷水解的平衡点，成为了一大难题。陈磊在其硕士学位论文“西梅籽β-葡萄糖苷酶的分离纯化、性质及固定化研究”一文中提到了关于β-葡萄糖苷酶交联聚集体在合成红景天苷中的应用，其结论是：以β-葡萄糖苷酶交联聚集体为催化剂催化合成红景天苷的反应中，产物红景天苷的浓度大约为0.76 g/L，仅比采用粗酶粉催化合成红景天苷的产物红景天苷浓度高0.1 g/L。王梦亮等人于2009年发表了一篇“固定化β-葡萄糖苷酶催化合成红景天苷的研究”的文章，在 1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（C4MIm·PF6）离子液体/1,4-二氧六环作为反应介质，C4MIm·PF6 /1,4-二氧六环为99%（v/v），经过条件优化后，红景天苷产物浓度可达18.57 g/L，此为现阶段国内外生物合成红景天苷领域红景天苷浓度可达到的最高值。但是，产物红景天苷的浓度依然较低，无法满足工业化生产对经济利益最大化的需求，并且，酶活回收率较低。
发明内容
本发明旨在提供一种能够大幅提高产物红景天苷浓度的β-葡萄糖苷酶交联聚集体（简称：β-葡萄糖苷酶CLEAs）催化合成红景天苷的工艺，本发明反应过程无需昂贵的糖苷供体和催化剂，避免了化学合成繁琐的反应步骤，另外，反应完成后可以方便的从反应液中提取目标产物红景天苷，未反应的底物对羟基苯乙醇可再次循环使用，降低生产成本，同时解决了由于离子液体价格昂贵，离子液体的加入量在工艺中仍然很大，使得生产红景天苷的成本偏高等问题，因此，酶催化合成红景天苷为红景天苷批量生产具有非常大的经济意义和现实意义。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种β-葡萄糖苷酶交联聚集体催化合成红景天苷的工艺，包括β-葡萄糖苷酶交联聚集体的制备和红景天苷的合成两个阶段；
β-葡萄糖苷酶交联聚集体制备阶段，包括以下步骤：
（1）将沉降剂加入β-葡萄糖苷酶溶液中，振荡；
（2）再加入戊二醛；
（3）向混合液中加入硼氢化钠，振荡后，300~500rpm离心5~10min，收集沉淀，即为β-葡萄糖苷酶交联聚集体；
红景天苷的合成阶段，包括以下步骤：
（4）将β-D-葡萄糖和对羟基苯乙醇溶解于含β-葡萄糖苷酶交联聚集体的pH 为5.5~6.5的缓冲溶液中，再加入1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、仿水溶剂和1,4-二氧六环，形成1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐/仿水溶剂/1,4-二氧六环/缓冲溶液反应体系，仿水溶剂为乙酸乙酯；（5）密封，保持温度为48~52℃，转速为245~255 rpm，反应5~9d，收集反应液；
其中，步骤（4）的1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐/仿水溶剂/1,4-二氧六环/缓冲溶液反应体系中，β-D-葡萄糖与对羟基苯乙醇的摩尔比为1:1~1:3，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的单位酶活为1.3~1.6U/ml ， 1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐与乙酸乙酯的体积和与1,4-二氧六环的体积比为2:3~3:2，缓冲溶液的体积分数为12~18%。
步骤（1）中沉降剂为1,4-二氧六环，1,4-二氧六环与β-葡萄糖苷酶液的体积比为1.7:1~2.2:1，β-葡萄糖苷酶液含β-葡萄糖苷酶1.5~2.5mg/ml；步骤（2）中戊二醛的终浓度为38~43mM，交联时间为8~12min；步骤（3）中硼氢化钠的终浓度为20~25 mM；β-葡萄糖苷酶交联聚集体制备阶段整个反应过程的反应温度控制在4~6℃，pH 为5.0~5.5。
红景天苷合成阶段的步骤（4）中乙酸乙酯与1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的体积比为50%~80%。
本发明采用β-葡萄糖苷酶交联聚集体作为合成红景天苷的催化剂，在离子液体/有机溶剂体系中催化直接糖基化反应成功合成红景天苷。本发明的技术效果在于：（1）将产物红景天苷的浓度提高至21g/L以上；（2）采用β-葡萄糖苷酶交联聚集体作为催化剂，β-葡萄糖苷酶交联聚集体的残余相对酶活高(反应后β-葡萄糖苷酶交联聚集体的残余相对酶活也在84%以上)，制作简单，同时，β-葡萄糖苷酶交联聚集体通过离心即可实现高效回收，酶的回收作业简单、快捷；（3）本发明的β-葡萄糖苷酶交联聚集体催化合成红景天苷的工艺中，采用廉价的仿水溶剂（如：乙酸乙酯）来代替部分的离子液体，可在不影响产物红景天苷浓度的前提下（产物红景天苷的浓度可维持在21g/L以上），大大降低生产成本；（4）本发明通过对β-葡萄糖苷酶交联聚集体制备阶段反应条件的优化，使得β-葡萄糖苷酶交联聚集体的酶活回收率也达到了80%以上，大大降低了β-葡萄糖苷酶交联聚集体制备阶段的酶活损失，从而，降低了合成一定量红景天苷的β-葡萄糖苷酶用量，进一步缩减生产成本。
在酶催化合成红景天苷领域，由于红景天苷在糖苷酶存在下极易被水解的特性，使得提高产物红景天苷的浓度变得十分困难。本发明能够得到如此高的产物红景天苷浓度，不仅仅在于 β-葡萄糖苷酶交联聚集体在离子液体/有机溶剂体系中的酶催化效率高；另外，仿水溶剂的选择也很重要，本申请人分别采用乙酸乙酯、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺作为仿水溶剂进行试验，发现仅乙酸乙酯（本申请采用乙酸乙酯作为仿水溶剂）可使得最终制得的反应液红景天苷浓度较高；还在于，本申请人进行无数次的试验，得到了红景天苷合成过程各个反应条件的较佳值，最终，才使得本发明的产物红景天苷浓度达到21 g/L以上，高于现有的国内外所报道的最高值（18.57g/L），并且，β-葡萄糖苷酶交联聚集体的残余相对酶活也保持在较高的水平（85%以上）。再加上，本申请人通过对β-葡萄糖苷酶交联聚集体的制备过程中各个反应条件进行了优化，提高了β-葡萄糖苷酶交联聚集体的酶活回收率。
具体实施方式
实施例1
β-葡萄糖苷酶交联聚集体（简称β-葡萄糖苷酶CLEAs）催化合成红景天苷的工艺，包括β-葡萄糖苷酶CLEAs的制备和红景天苷合成两个阶段；
β-葡萄糖苷酶CLEAs的制备阶段，包括以下步骤：（1）将1.7ml 1,4-二氧六环加入1ml含β-葡萄糖苷酶2.5mg/ml的β-葡萄糖苷酶溶液中（1,4-二氧六环与β-葡萄糖苷酶液的体积比为1.7:1（v∶v）），振荡；（2）再加入戊二醛，至其终浓度为38mM，反应12min，进行交联；（3）向混合液中加入硼氢化钠（NaBH4），至NaBH4的终浓度为25mM，进行还原，振荡后，300rpm离心8min，收集沉淀，即为β-葡萄糖苷酶CLEAs；整个反应过程的反应温度控制在6℃，pH为5.2； 收集沉淀，测得β-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率为81.71%。
红景天苷的合成阶段，包括以下步骤：（4）将0.220 g β-D-葡萄糖和0.169 g对羟基苯乙醇（β-D-葡萄糖与对羟基苯乙醇的摩尔比为1:1）溶解在含β-葡萄糖苷酶CLEAs的pH为5.5的缓冲溶液中，再加入235μL 1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（C4MIm·PF6）、235μL乙酸乙酯和470μL 1,4-二氧六环（C4MIm·PF6∶乙酸乙酯∶1,4-二氧六环的体积比为2.5∶2.5∶5），形成C4MIm·PF6/乙酸乙酯（仿水溶剂）/1,4-二氧六环/缓冲溶液反应体系，其中，缓冲溶液体积分数为15%；（5）密封，保持温度为48℃，转速为250 rpm，反应9d，收集上清液。
测得反应液中红景天苷的浓度为25.32g/L，离心，收集沉淀，测得反应后β-葡萄糖苷酶CLEAs的残余相对酶活为84.61%。
β-葡萄糖苷酶CLEAs的回收处理方式为：反应液离心后，将收集得到的β-葡萄糖苷酶CLEAs 沉淀以缓冲溶液（pH为6.0的柠檬酸-Na2HPO4缓冲溶液）洗涤3次，再分别加入1mL缓冲溶液（pH为6.0的柠檬酸-Na2HPO4缓冲溶液）并振荡使之成为悬浊液，取样测定β-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活。以不经沉降剂、交联剂处理的酶液的酶活为100%，计算β-葡萄糖苷酶CLEAs制备阶段得到的β-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率。以红景天苷合成阶段前β-葡萄糖苷酶的相对水解活力为100%，计算收集得到的反应液沉淀中β-葡萄糖苷酶的残余相对酶活。
β-葡萄糖苷酶的酶活测定方法为：分别取100 μL待测β-葡萄糖苷酶CLEAs溶液与10 mM的2 mL对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（pNPG）溶液，二者混合后50℃水浴精确保温10 min，之后立即加入1 M的碳酸钠溶液2 mL以终止反应，振荡均匀后室温静置5 min，适当稀释后以紫外分光光度计测定样本在波长410 nm处的吸光值，代入pNP标准曲线计算可得pNP生成量。酶活力单位定义为：每分钟内催化pNPG 生成1μmoL pNP的酶量。其中，pNP标准曲线制作过程为本领域常见的标准曲线制作方法，在此不做赘述。
红景天苷浓度的测定方法为：将含有红景天苷的上清液，以孔径0.45 μm的有机滤膜过滤，滤液以甲醇稀释一定倍数后以高效液相色谱仪对样本中红景天苷含量进行测定。所测定的红景天苷峰面积代入红景天苷标准曲线中加以计算即可得样本中红景天苷浓度。其中， 红景天苷标准曲线制作过程为本领域常见的标准曲线制作方法，在此不做赘述。
实施例2
β-葡萄糖苷酶CLEAs催化合成红景天苷的工艺，包括β-葡萄糖苷酶CLEAs的制备和红景天苷合成两个阶段；
β-葡萄糖苷酶CLEAs的制备阶段，包括以下步骤：（1）将2.2ml 1,4-二氧六环加入1ml含β-葡萄糖苷酶1.5mg/ml的β-葡萄糖苷酶溶液中（1,4-二氧六环与β-葡萄糖苷酶液体积比为2.2:1），振荡；（2）再加入戊二醛，至其终浓度为40mM，反应8min，进行交联；（3）向混合液中加入硼氢化钠（NaBH4），至NaBH4的终浓度为20 mM，进行还原，振荡后，500rpm离心5min，收集沉淀，即为β-葡萄糖苷酶CLEAs；整个反应过程的反应温度控制在4℃，pH为5.5；收集沉淀，测得β-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率为81.65%。
红景天苷的合成阶段，包括以下步骤：（4）将0.110 g β-D-葡萄糖和0.169 g对羟基苯乙醇（β-D-葡萄糖与对羟基苯乙醇的摩尔比为1:2）溶解在含β-葡萄糖苷酶CLEAs的pH为6.5的缓冲溶液中，再加入150μL C4MIm·PF6、226μL乙酸乙酯和564μL 1,4-二氧六环（C4MIm·PF6∶乙酸乙酯∶1,4-二氧六环体积比为0.8∶1.2∶3），形成C4MIm·PF6/乙酸乙酯（仿水溶剂）/1,4-二氧六环/缓冲溶液反应体系，其中，缓冲溶液体积分数为12%；（5）密封，保持温度为52℃，转速为250 rpm，反应8d，收集反应液。
测得反应液中红景天苷的浓度为24.67g/L，离心，收集沉淀，测得反应后β-葡萄糖苷酶CLEAs的残余相对酶活为89.73%。
实施例3
β-葡萄糖苷酶CLEAs催化合成红景天苷的工艺，包括β-葡萄糖苷酶CLEAs的制备和红景天苷合成两个阶段；
β-葡萄糖苷酶CLEAs的制备阶段，包括以下步骤：（1）将2.0ml 1,4-二氧六环加入1ml含β-葡萄糖苷酶1.5mg/ml的β-葡萄糖苷酶溶液中（1,4-二氧六环与β-葡萄糖苷酶液体积比为2:1），振荡；（2）再加入戊二醛，至其终浓度为43mM，反应8min，进行交联；（3）向混合液中加入硼氢化钠（NaBH4），至NaBH4的终浓度为23 mM，进行还原，振荡后，400rpm离心5min，收集沉淀，即为β-葡萄糖苷酶CLEAs；整个反应过程的反应温度控制在5℃，pH为5.0；收集沉淀，测得β-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率为80.59%。
红景天苷的合成阶段，包括以下步骤：（4）将0.110 g β-D-葡萄糖和0.254 g对羟基苯乙醇（β-D-葡萄糖与对羟基苯乙醇的摩尔比为1:3）溶解在含β-葡萄糖苷酶CLEAs的pH为6.0的缓冲溶液中，再加入113μL C4MIm·PF6、251μL乙酸乙酯和376μL 1,4-二氧六环（C4MIm·PF6∶乙酸乙酯∶1,4-二氧六环体积比为0.6∶2.4∶2），形成C4MIm·PF6/乙酸乙酯（仿水溶剂）/1,4-二氧六环/缓冲溶液反应体系，其中，缓冲溶液体积分数为18%；（5）密封，保持温度为50℃，转速为250 rpm，反应5d，收集反应液。
测得反应液中红景天苷的浓度为24.49g/L，离心，收集沉淀，测得反应后β-葡萄糖苷酶CLEAs的残余相对酶活为88.04%。
实施例4
β-葡萄糖苷酶CLEAs催化合成红景天苷的工艺，包括β-葡萄糖苷酶CLEAs的制备和红景天苷合成两个阶段；
β-葡萄糖苷酶CLEAs的制备阶段，包括以下步骤：（1）将4.0ml1,4-二氧六环加入1ml含β-葡萄糖苷酶1.25mg/ml的β-葡萄糖苷酶溶液中（1,4-二氧六环与β-葡萄糖苷酶液体积比为4:1（v∶v）），振荡；（2）再加入戊二醛，至其终浓度为30mM，反应10min，进行交联；（3）向混合液中加入硼氢化钠（NaBH4），至NaBH4的终浓度为30mM，进行还原，振荡后，400rpm离心10min，收集沉淀，即为β-葡萄糖苷酶CLEAs；整个反应过程的反应温度控制在4℃，pH为5.0； 收集沉淀，测得β-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率为74.37%。
红景天苷的合成阶段，包括以下步骤：（4）将0.110 g β-D-葡萄糖和0.254 g对羟基苯乙醇（β-D-葡萄糖与对羟基苯乙醇的摩尔比为1:3）溶解在含β-葡萄糖苷酶CLEAs的pH为6.0的缓冲溶液中，再加入113μL C4MIm·PF6、251μL乙酸乙酯和376μL 1,4-二氧六环（C4MIm·PF6∶乙酸乙酯∶1,4-二氧六环体积比为0.6∶2.4∶2），形成C4MIm·PF6/乙酸乙酯（仿水溶剂）/1,4-二氧六环/缓冲溶液反应体系，其中，缓冲溶液体积分数为12%；（5）密封，保持温度为50℃，转速为250 rpm，反应5d，收集反应液。
测得反应液中红景天苷的浓度为23.25g/L，离心，收集沉淀，测得反应后β-葡萄糖苷酶CLEAs的残余相对酶活为87.62%。
实施例5
β-葡萄糖苷酶CLEAs催化合成红景天苷的工艺，包括β-葡萄糖苷酶CLEAs的制备和红景天苷合成两个阶段；
β-葡萄糖苷酶CLEAs的制备阶段，包括以下步骤：（1）将1.5ml 1,4-二氧六环加入1ml含β-葡萄糖苷酶3.0mg/ml的β-葡萄糖苷酶溶液中（1,4-二氧六环与β-葡萄糖苷酶液体积比为1.5:1），振荡；（2）再加入戊二醛，至其终浓度为20mM，反应10min，进行交联；（3）向混合液中加入硼氢化钠（NaBH4），至NaBH4的终浓度为15mM，进行还原，振荡后，300rpm离心10min，收集沉淀，即为β-葡萄糖苷酶CLEAs；整个反应过程的反应温度控制在5℃，pH为5.0； 收集沉淀，测得β-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率为69.57%。
红景天苷的合成阶段，包括以下步骤：（4）将0.110 g β-D-葡萄糖和0.169 g对羟基苯乙醇（β-D-葡萄糖与对羟基苯乙醇的摩尔比为1:2）溶解在含β-葡萄糖苷酶CLEAs的pH为6.0的缓冲溶液中，再加入235μL C4MIm·PF6、235μL乙酸乙酯和470μL 1,4-二氧六环（C4MIm·PF6∶乙酸乙酯∶1,4-二氧六环的体积比为2.5∶2.5∶5），形成C4MIm·PF6/乙酸乙酯（仿水溶剂）/1,4-二氧六环/缓冲溶液反应体系，其中，缓冲溶液体积分数为15%；（5）密封，保持温度为50℃，转速为250 rpm，反应8d，收集反应液。
测得反应液中红景天苷的浓度为23.11g/L，离心，收集沉淀，测得反应后β-葡萄糖苷酶CLEAs的残余相对酶活为86.94%。
实施例6
β-葡萄糖苷酶CLEAs催化合成红景天苷的工艺，包括β-葡萄糖苷酶CLEAs的制备和红景天苷合成两个阶段；
β-葡萄糖苷酶CLEAs的制备阶段，包括以下步骤：（1）将4.0ml异丙醇加入1ml含β-葡萄糖苷酶1.25mg/ml的β-葡萄糖苷酶溶液中（1,4-二氧六环与β-葡萄糖苷酶液体积比为4:1），振荡；（2）再加入戊二醛，至其终浓度为30mM，反应10min，进行交联；（3）向混合液中加入硼氢化钠（NaBH4），至NaBH4的终浓度为30mM，进行还原，振荡后，400rpm离心10min，收集沉淀，即为β-葡萄糖苷酶CLEAs；整个反应过程的反应温度控制在4℃，pH为5.0； 收集沉淀，测得β-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率为73.15%。
红景天苷的合成阶段，包括以下步骤：（4）将0.110 g β-D-葡萄糖和0.254 g对羟基苯乙醇（β-D-葡萄糖与对羟基苯乙醇的摩尔比为1:3）溶解在含β-葡萄糖苷酶CLEAs的pH为6.0的缓冲溶液中，再加入113μL C4MIm·PF6、251μL乙酸乙酯和376μL 1,4-二氧六环（C4MIm·PF6∶乙酸乙酯∶1,4-二氧六环体积比为0.6∶2.4∶2），形成C4MIm·PF6/乙酸乙酯（仿水溶剂）/1,4-二氧六环/缓冲溶液反应体系其中，缓冲溶液体积分数为12%；（5）密封，保持温度为50℃，转速为250 rpm，反应5d，收集反应液。
测得反应液中红景天苷的浓度为21.31g/L，离心，收集沉淀，测得反应后β-葡萄糖苷酶CLEAs的残余相对酶活为85.27%。
另外，本申请人还将实施例1中的乙酸乙酯替换为乙腈或N,N-二甲基甲酰胺等常见的仿水溶剂进行试验，结果为：与实施例1相比，采用乙腈作为仿水溶剂，在相同条件下，红景天苷的浓度为19.27 g/L（下降了6.05 g/L），反应后β-葡萄糖苷酶CLEAs的残余相对酶活为75.56（下降了9.05%）；而采用二甲基甲酰胺作为仿水溶剂，红景天苷的浓度为15.74 g/L（下降了9.58 g/L），反应后β-葡萄糖苷酶CLEAs的残余相对酶活为72.58（下降了12.03%）。
本发明的pNPG、pNP、杏仁β-葡萄糖苷酶（6 U/mg）购自上海源叶生物科技有限公司。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (2)
1.一种β-葡萄糖苷酶交联聚集体催化合成红景天苷的工艺，其特征在于：包括β-葡萄糖苷酶交联聚集体的制备和红景天苷的合成两个阶段；β-葡萄糖苷酶交联聚集体制备阶段，包括以下步骤：
（1）将沉降剂加入β-葡萄糖苷酶溶液中，振荡；
（2）再加入戊二醛；
（3）向混合液中加入硼氢化钠，振荡后，300~500rpm离心5~10min，收集沉淀，即为β-葡萄糖苷酶交联聚集体；
红景天苷的合成阶段，包括以下步骤：
（4）将β-D-葡萄糖和对羟基苯乙醇溶解于含β-葡萄糖苷酶交联聚集体的pH 为5.5~6.5的缓冲溶液中，再加入1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、仿水溶剂和1,4-二氧六环，形成1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐/仿水溶剂/1,4-二氧六环/缓冲溶液反应体系，仿水溶剂为乙酸乙酯；（5）密封，保持温度为48~52℃，转速为245~255 rpm，反应5~9d，收集反应液；
其中，步骤（4）的1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐/仿水溶剂/1,4-二氧六环/缓冲溶液反应体系中，β-D-葡萄糖与对羟基苯乙醇的摩尔比为1:1~1:3，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的单位酶活为1.3~1.6U/ml ， 1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐与乙酸乙酯的体积和与1,4-二氧六环的体积比为2:3~3:2，缓冲溶液的体积分数为12~18%；
红景天苷合成阶段的步骤（4）中乙酸乙酯与1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐体积比为50%~80%。
2.根据权利要求1所述的一种β-葡萄糖苷酶交联聚集体催化合成红景天苷的工艺，其特征在于：步骤（1）中沉降剂为1,4-二氧六环，1,4-二氧六环与β-葡萄糖苷酶液体积比为1.7:1~2.2:1，β-葡萄糖苷酶液含β-葡萄糖苷酶1.5~2.5mg/ml；步骤（2）中戊二醛的终浓度为38~43mM，交联时间为8~12min；步骤（3）中硼氢化钠的终浓度为20~25 mM；β-葡萄糖苷酶交联聚集体制备阶段整个反应过程的反应温度控制在4~6℃，pH 为5.0~5.5。
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| Cross-linked enzyme aggregates of b-glucosidase from Prunus domestica seeds;Lei Chen, et al.;《Biotechnol Lett》;20120522;第34卷(第9期);第1674页右栏倒数第1段-第1675页左栏第1段，第1675页左栏第2段第1-5行，Supplementary material 1，第2页第2段 * |
| 罗建平 等.交联β- 葡萄糖苷酶聚集体的制备及其性质.《食品科学》.2007,第28卷(第12期),第254-257页. * |
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