CN104561196B - 磁性交联酶聚集体催化合成苯丙烯基β-D-葡萄糖苷的方法 - Google Patents
磁性交联酶聚集体催化合成苯丙烯基β-D-葡萄糖苷的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供磁性交联酶聚集体催化合成苯丙烯基β‑D‑葡萄糖苷的方法，属于生物催化领域，利用底物苯丙烯醇与D‑葡萄糖在酶的作用下糖基化合成苯丙烯基β‑D‑葡萄糖苷，反应体系为非水相体系。利用磁性交联β‑葡萄糖苷酶聚集体催化糖基化合成苯丙烯基β‑D‑葡萄糖苷的报道还未有所见，本发明具有独特新颖的自主创新性，在非水相体系中，能保证酶的活力与稳定性，以及使热力学平衡朝逆水解反应方向进行。该体系简单，可一步直接合成苯丙烯基β‑D‑葡萄糖苷，产物易分离纯化，纯度高。本反应所选用的底物均为廉价的化工原料，与从红景天属植物中提取苯丙烯基β‑D‑葡萄糖苷的传统方法比，大大节约了成本，适用于工业化生产。
Description
技术领域
本发明具体涉及磁性交联酶聚集体催化合成苯丙烯基β-D-葡萄糖苷的方法，属于生物催化领域。
背景技术
苯丙烯基β-D-葡萄糖苷又名络塞（Rosin），是中药红景天提取物中含量很低的一种有效成分。红景天为景天科红景天属多年生草木或亚灌木植物，曾被用于传统的中草药材中，具有多种生理学活性，红景天提取物的主要成分为红景天苷。但近年来的研究表明，苯丙烯基β-D-葡萄糖苷也具有抗疲劳、抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力等功能，这使苯丙烯基β-D-葡萄糖苷同样受到了药学界的关注。并非所有的红景天属植物中都含有苯丙烯基β-D-葡萄糖苷，据相关文献报道，只有玫瑰红景天属植物中才含有苯丙素类活性物质，因此苯丙烯基β-D-葡萄糖苷已成为玫瑰红景天属植物的标志性物质。
目前，市面上的苯丙烯基β-D-葡萄糖苷主要是从玫瑰红景天属植物中提取的，但由于提取工艺复杂、产量低、成本高，并不适用于工业化生产。苯丙烯基β-D-葡萄糖苷可由苯丙烯醇与D-葡萄糖脱一分子水而得到，因此，本发明通过希望通过利用β-葡萄糖苷酶催化苯丙烯醇与D-葡萄糖直接糖基化合成苯丙烯基β-D-葡萄糖苷。
尽管化学法也能合成苯丙烯基β-D-葡萄糖苷，但大多数需要选择性保护，活化和昂贵的生产设备及催化剂。苯丙烯基β-D-葡萄糖苷的生物法合成具有反应过程简单，条件温和，立体选择性高，环境污染少等特点，且酶法合成的糖苷还能产生很高的附加值，生物活性也有所提高。在生物酶法合成苯丙烯基β-D-葡萄糖苷中，能够缩短合成周期，提高产物的产率，产物糖苷活性更强，毒副作用小。
磁性交联酶聚集体是一种以金属氧化物、混合物等铁磁性材料为核心，利用酶分子聚集交联而形成的具有一定磁性特殊核-壳式结构固定化酶的一种方法。本发明使用磁性交联β-葡萄糖苷酶聚集体（M-CLGAs）催化糖基化合成苯丙烯基β-D-葡萄糖苷。利用磁性铁氧化物颗粒对β-葡萄糖苷酶聚集体进行固定化，这样可使β-葡萄糖苷酶快速充分地回收利用，提高了酶的使用效率。
β-葡萄糖苷酶是一种水解酶，它能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出D-葡萄糖与相应的配基。β-葡萄糖苷酶除了水解作用外，在低水环境中还能发生逆水解反应，这是一种单糖与底物醇的聚合反应，缩合后脱去一分子水，生成相应的糖苷，该反应受热力学平衡的影响导致苯丙烯基β-D-葡萄糖苷难以提高，需严格控制反应体系的水含量。在传统的有机溶剂中酶容易失活且底物D-葡萄糖的溶解性差，不利于反应进行，因此本发明采用了有机溶剂-缓冲溶液构成的非水相体系，既保证酶反应所需要的水含量又保证反应的热力学平衡向逆水解方向进行。
发明内容
本发明提供了磁性交联β-葡萄糖苷酶聚集体（Magnetic Cross-linked β-glucosidase aggregates，M-CLGAs）催化糖基化合成苯丙烯基β-D-葡萄糖苷的方法，发明内容新颖，国内外关于苯丙烯基β-D-葡萄糖苷的研究报道相当之少，具有很高的研究价值。本发明的方法就目前传统获得苯丙烯基β-D-葡萄糖苷而言，操作简单，生成的产物附加值高，毒副作用小，且M-CLEAs最大的优点是能够借助外部磁场方便地回收，避免了传统离心、过滤等分离方法造成酶活力的损失，同时还可通过外部磁场控制固定化酶在反应体系中的分布以取代机械搅拌的繁琐过程，因而有很好的工业应用前景。
为实现上述目的，本发明是通过如下技术内容实施的：
磁性交联β-葡萄糖苷酶聚集体（M-CLGAs）催化直接糖基化合成苯丙烯基β-D-葡萄糖苷的方法，利用底物苯丙烯醇与D-葡萄糖在β-葡萄糖苷酶的作用下于非水相体系即有机溶剂-缓冲溶液体系中合成苯丙烯基β-D-葡萄糖苷，反应在特定的条件下进行。
在10 mL的磨口三角瓶中，加入一定量的苯丙烯醇和D-葡萄糖，再加入预定量的有机溶剂、柠檬酸-磷酸缓冲溶液、离子液体，使得反应体系的总体积为2 mL。将三角瓶置于50℃的恒温水浴中摇匀10 min后立即向三角瓶中加入M-CLGAs使反应体系的酶活为15 U/mL，盖上橡胶塞。最后将三角瓶置于恒温振荡培养箱中在一定的条件下反应特定的时间后取样进行HPLC检测。
其中，上述步骤所述的有机溶剂可采用乙腈、1,4-二氧六环、叔丁醇、二甲基亚砜（DMSO）、乙酸乙酯、丙酮六种中的任意一种，最佳为1,4-二氧六环与乙腈。
所述缓冲液为0.1 M的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，pH范围为4~7。
溶解有D-葡萄糖的柠檬酸-磷酸缓冲溶液， D-葡萄糖在最终反应体系中浓度达100 g/L，缓冲液在每个体系中含量分别为0、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%，最佳含量为15%。
缓冲液pH范围为4~7，最佳pH为5.5。
苯丙烯醇与D-葡萄糖的摩尔浓度比为1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1。
反应温度为30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃。
所述反应的时间进程为24~96h，最佳为60~84h。
离子液体C4Mim•PF6含量分别为 0 mL、0.15 mL、0.3 mL、0.45 mL、0.6 mL。
所述的有机溶剂的的体积含量为0~100%。
所述的有机溶剂的的体积含量为60~95%。
所述反应的苯丙烯醇浓度为20~300g/L，D-葡萄糖浓度为50~150g/L。
所述反应在恒温振荡器中进行，反应的转速为150~300rpm，所述反应的温度为40~60℃，最佳转速为250rpm，最佳温度为50~55℃。
所述反应的酶的浓度为3g/L，采用的酶为β-葡萄糖苷酶。
实验表明，1,4-二氧六环-缓冲溶液体系是一种较为合适的β-葡萄糖苷酶催化合成苯丙烯基β-D-葡萄糖苷的非水相体系，对产物的合成有促进作用。当反应介质为1,4-二氧六环/柠檬酸-磷酸缓冲液/离子液体(C4Mim•PF6) (8:2:1)、苯丙烯醇和D-葡萄糖的浓度为298 g/L和100 g/L、pH为6、温度50 ℃、250 rpm、反应体系酶活力为15 U/mL时，60 h后产物浓度可达到8.037 g/L。
本发明的优点为：（1）与传统的从红景天提取物中提取苯丙烯基β-D-葡萄糖苷相比，反应过程简单，条件温和，立体选择性高，环境污染少；（2）采用本发明的方法合成苯丙烯基β-D-葡萄糖苷，能够缩短合成的周期，提高产物的产率，生成的产物纯度高，未反应的底物苯丙烯醇可回收利用，降低了成本；（3）β-葡萄糖苷酶通过磁性交联β-葡萄糖苷酶聚集体（M-CLGAs）磁性固定化之后，使该酶也能够快速充分地回收，提高了酶的使用效率，适用于苯丙烯基β-D-葡萄糖苷的工业化生产。
附图说明
图1 苯丙烯基β-D-葡萄糖苷的结构式。
图2 苯丙烯基β-D-葡萄糖苷的核磁共振图谱。1H NMR图谱数据如下：1H NMR(DMSO-d6，ppm)：7.43-7.45(d，J=7Hz，2H，H3)；7.32-7.35 (t，J=7.75Hz，2H，H2)；7.23-7.25(t，1H，J=8Hz，H1)；6.65-6.69 (d，J=16Hz，1H，H4)；6.34-6.39 (m，1H，H5)；5.07 (s，1H，H7)；4.91-4.96 (d，J=22.5Hz，2H，H13，14)；4.52 (s，1H，H15)；4.42-4.46 (m，1H，H16)；4.19-4.24 (m，2H，H6)；3.44-3.75 (m，2H，H12)；2.99-3.16 (m，4H，H8，9，10，11)。由1H NMR图谱可知产物为苯丙烯基β-D-葡萄糖苷。
具体实施方式
磁性交联β-葡萄糖苷酶聚集体（M-CLGAs）催化直接糖基化合成苯丙烯基β-D-葡萄糖苷的方法，利用底物苯丙烯醇与D-葡萄糖在β-葡萄糖苷酶的作用下于非水相体系即有机溶剂-缓冲溶液体系中合成苯丙烯基β-D-葡萄糖苷，反应在特定的条件下进行。
通过简单的浓缩萃取工艺，从反应液中分离出苯丙烯基β-D-葡萄糖苷，同时对未反应的底物苯丙烯醇进行回收利用，以降低成本。分离出的产物的核磁共振图谱如图2所示。
实施例1
磁性交联β-葡萄糖苷酶聚集体M-CLGAs的制备：
（1）将1.351 g FeCl3、0.685 g FeSO4•7H2O及25 mL的去离子水室温下混匀，加氨水至沉淀不增加，多次离心后用去离子水洗涤至pH值为7.0，90 ℃烘干2 h得到未硅烷化的磁性铁氧化物颗粒。取上述烘干后未硅烷化的磁性铁氧化物颗粒0.02 g，加入2.5 mL甲醇、100 μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷、25 μL去离子水，混合均匀后超声30 min，再加入1.5 mL甘油，90 ℃下剧烈振荡6 h，将混合液离心处理后经100 ℃烘干即可得稳定硅烷化后的磁性铁氧化物粒子。
（2）5 mL带塞离心管中加入1 mL以pH 5.0的柠檬酸-磷酸缓冲溶液配制的2 mg/mLβ-葡萄糖苷酶酶液和一定量的磁性铁氧化物颗粒，以不同有机溶剂作沉降剂，混匀后于6℃、200 r/min下振荡10 min。后加入交联剂戊二醛使其在反应体系中达到不同浓度，于6℃、200 r/min继续振荡一定时间后以磁铁吸附固定化酶，弃上清液，固形物用去离子水洗涤数次后得到M-CLGAs，并加入缓冲溶液重悬待用。
实施例2
在10mL的磨口三角瓶中加入D-葡萄糖100mg，苯丙烯醇220mg，再加入1,4-二氧六环1.6mL，pH为5.5的柠檬酸-磷酸缓冲液0.4mL，使整个反应体系的总体积为2mL。将三角瓶置于50℃恒温水浴摇匀10min后立即向三角瓶中加入磁性交联β-葡萄糖苷酶聚集体15 U/mL引发反应，盖上橡胶塞。最后将三角瓶置于恒温振荡培养箱中以50℃，250rpm的条件反应72h。
反应结束后取样100μL，加入1.9mL的乙腈稀释反应液并超声波震荡20min，10000rpm离心5min，上清液用0.45μm的滤膜进行过滤，利用高效液相色谱仪对产物苯丙烯基β-D-葡萄糖苷进行检测，HPLC检测条件：Waters 2996紫外检测器；Wonda Sil C18反相液相色谱柱（4.6mm×150mm×5μm）；检测波长为250nm；进样量20μL；流动相为甲醇/水（5:5，V/V）；流速1mL/min；以峰面积对照苯丙烯基β-D-葡萄糖苷标准曲线计算产物含量。经检测反应体系的苯丙烯基β-D-葡萄糖苷浓度为7.02g/L。
实施例3
在10mL的磨口三角瓶中加入D-葡萄糖100mg，苯丙烯醇120mg，再加入1,4-二氧六环1.4mL，pH为5.5的柠檬酸-磷酸缓冲液0.6mL，使整个反应体系的总体积为2mL。将三角瓶置于50℃恒温水浴摇匀10min后立即向三角瓶中加入磁性交联β-葡萄糖苷酶聚集体15 U/mL引发反应，盖上橡胶塞。最后将三角瓶置于恒温振荡培养箱中以50℃，250rpm的条件反应72h。
采用实施例2相同的检测方法对产物苯丙烯基β-D-葡萄糖苷进行检测，产物浓度可达1.92g/L。
实施例4
在10mL的磨口三角瓶中加入D-葡萄糖100mg，苯丙烯醇298mg，再加入乙腈1.7mL，pH为5.5的柠檬酸-磷酸缓冲液0.3mL，使整个反应体系的总体积为2mL。将三角瓶置于50℃恒温水浴摇匀10min后立即向三角瓶中加入磁性交联β-葡萄糖苷酶聚集体15 U/mL引发反应，盖上橡胶塞。最后将三角瓶置于恒温振荡培养箱中以50℃，250rpm的条件反应72h。
采用实施例2相同的检测方法对产物苯丙烯基β-D-葡萄糖苷进行检测，产物浓度可达6.74g/L。
实施例5
在10mL的磨口三角瓶中加入D-葡萄糖100mg，苯丙烯醇200mg，再加入丙酮1.6mL，pH为5.5的柠檬酸-磷酸缓冲液0.4mL，使整个反应体系的总体积为2mL。将三角瓶置于50℃恒温水浴摇匀10min后立即向三角瓶中加入磁性交联β-葡萄糖苷酶聚集体15 U/mL引发反应，盖上橡胶塞。最后将三角瓶置于恒温振荡培养箱中以55℃，250rpm的条件反应96h。
采用实施例2相同的检测方法对产物苯丙烯基β-D-葡萄糖苷进行检测，产物浓度可达3.16g/L。
实施例6
在10mL的磨口三角瓶中加入D-葡萄糖50mg，苯丙烯醇150mg，再加入1,4-二氧六环1.6mL，pH为5.5的柠檬酸-磷酸缓冲液0.4mL，使整个反应体系的总体积为2mL。将三角瓶置于50℃恒温水浴摇匀10min后立即向三角瓶中加入磁性交联β-葡萄糖苷酶聚集体15 U/mL引发反应，盖上橡胶塞。最后将三角瓶置于恒温振荡培养箱中以50℃，250rpm的条件反应48h。
采用实施例2相同的检测方法对产物苯丙烯基β-D-葡萄糖苷进行检测，产物浓度可达3.91g/L。
实施例7
在10mL的磨口三角瓶中加入D-葡萄糖100mg，苯丙烯醇298mg，再加入1,4-二氧六环1.6mL，pH为5.5的柠檬酸-磷酸缓冲液0.4mL，使整个反应体系的总体积为2mL。将三角瓶置于50℃恒温水浴摇匀10min后立即向三角瓶中加入磁性交联β-葡萄糖苷酶聚集体15 U/mL引发反应，盖上橡胶塞。最后将三角瓶置于恒温振荡培养箱中以50℃，250rpm的条件反应24h。
采用实施例2相同的检测方法对产物苯丙烯基β-D-葡萄糖苷进行检测，产物浓度可达4.21g/L。
实施例8
在10mL的磨口三角瓶中加入D-葡萄糖100mg，苯丙烯醇220mg，再加入1,4-二氧六环1.7mL，pH为5.5的柠檬酸-磷酸缓冲液0.3mL，使整个反应体系的总体积为2mL。将三角瓶置于50℃恒温水浴摇匀10min后立即向三角瓶中加入磁性交联β-葡萄糖苷酶聚集体15 U/mL引发反应，盖上橡胶塞。最后将三角瓶置于恒温振荡培养箱中以60℃，180rpm的条件反应72h。
采用实施例2相同的检测方法对产物苯丙烯基β-D-葡萄糖苷进行检测，产物浓度可达3.64g/L。
实施例9
取8个10 mL的磨口三角瓶，向其中加入预定量的苯丙烯醇，使其在最终反应体系中浓度达到298 g/L，然后分别向8个三角瓶中加入预定量的1,4-二氧六环1.7 mL与一定浓度溶解D-葡萄糖的pH5.0的柠檬酸-磷酸缓冲溶液0.3 mL，使整个反应体系的体积为2 mL，D-葡萄糖在最终反应体系中浓度达100 g/L。然后将反应体系置于50 ℃、250 rpm的条件下预热20 min，使底物充分分散于反应体系中，最后向反应体系中加入预定量M-CLGAs使反应体系的酶活为15 U/mL，在50 ℃、250 rpm条件下反应不同的时间（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h）。反应结束后以磁铁吸附M-CLGAs，以2.2.2中的方法测定M-CLGAs的酶活回收率，用等量未反应的M-CLGAs测定酶活力为100%作对照。反应时间为24 h后，M-CLGAs的酶活回收率为94.9%，48 h后酶活回收率为90.3%，72 h后M-CLGAs的酶活回收率为84.4%，96 h后M-CLGAs的酶活回收率为78.6%。
实施例10
采用扩散法测定非水相体系的水活度。取4个康威氏皿测定体系的水活度。在其中3个康威氏皿的内室中放置5 mL培养皿所盛的1.0 g左右的非水相反应体系（85%1,4-二氧六环、15%柠檬酸-磷酸缓冲溶液、298 g/L的苯丙烯醇、100 g/L的D-葡萄糖、2.5 g M-CLGAs），并用电子分析天平精确称量，外室中分别加入5 mL饱和氯化钠、饱和氯化镁、饱和氯化钡溶液，以外室中加入同样非水相体系的康威氏皿作空白对照，于恒温培养箱中25 ℃保温放置，直至每个内室培养皿的质量差不发生变化为止。以三种标准饱和溶液的水活度为横坐标，内室培养皿中反应体系的最终增减量为纵坐标作图，得到的直线与横轴交点的横坐标即为该反应体系的水活度。经测定，非水相体系中的水活度约为0.72，而β-葡萄糖苷酶催化逆水解反应的适宜水活度范围在0.53-0.96之间，最适水活度为0.62左右，故在非水相体系中热力学平衡能向合成苯丙烯基β-D-葡萄糖苷的方向移动，从而获得较高的产物平衡浓度。
实施例11
反应结束后将反应液以滤纸过滤，滤液置于超声波下震荡30min，加入适量的乙醇后旋转蒸发除去溶剂，所得的固体用乙酸乙酯萃取3次，萃取液离心后再取上清旋转蒸发除去溶剂得到产物。得到的产物得率为67.8%，纯度达90%以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (3)
1.磁性交联酶聚集体催化合成苯丙烯基β-D-葡萄糖苷的方法，其特征在于：此方法是利用底物苯丙烯醇与D-葡萄糖在酶的作用下于非水相体系即有机溶剂-缓冲溶液体系中合成苯丙烯基β-D-葡萄糖苷，反应在特定的条件下进行；
所述的有机溶剂采用乙腈、1,4-二氧六环、丙酮中的任意一种；
所述的有机溶剂的体积含量为60~95%；
所述缓冲液为0.1 M的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，pH范围为4~7；
所述反应的苯丙烯醇浓度为20~300g/L，D-葡萄糖浓度为50~150g/L；
所述磁性交联酶聚集体的制备方法为：
（1）将1.351 g FeCl3、0.685 g FeSO4•7H2O及25 mL的去离子水室温下混匀，加氨水至沉淀不增加，多次离心后用去离子水洗涤至pH值为7.0，90 ℃烘干2 h得到未硅烷化的磁性铁氧化物颗粒；取上述烘干后未硅烷化的磁性铁氧化物颗粒0.02 g，加入2.5 mL甲醇、100μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷、25 μL去离子水，混合均匀后超声30 min，再加入1.5 mL甘油，90 ℃下剧烈振荡6 h，将混合液离心处理后经100 ℃烘干即得稳定硅烷化后的磁性铁氧化物粒子；
（2）5 mL带塞离心管中加入1 mL以pH 5.0的柠檬酸-磷酸缓冲溶液配制的2 mg/mL β-葡萄糖苷酶酶液和一定量的磁性铁氧化物颗粒，以有机溶剂作沉降剂，混匀后于6 ℃、200r/min下振荡10 min；后加入交联剂戊二醛使其在反应体系中达到不同浓度，于6 ℃、200r/min继续振荡一定时间后以磁铁吸附固定化酶，弃上清液，固形物用去离子水洗涤数次后得到磁性交联酶聚集体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述磁性交联酶聚集体催化合成苯丙烯基β-D-葡萄糖苷的反应在恒温振荡培养箱中进行，反应的转速为150~300rpm，所述反应的温度为40~60℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述磁性交联酶聚集体催化合成苯丙烯基β-D-葡萄糖苷的反应的时间进程为24~144h。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |