CN112813116A - 利用生物酶解制备芹菜素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用生物酶解制备芹菜素的方法，S1、酶解：向反应容器中加入野漆树苷与水或低级醇溶液，混合均匀，加热升温至70℃以上保温，再冷却至60℃以下，加入酸调节pH值，加入复合酶进行酶解反应，复合酶包括鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶，检测野漆树苷是否反应完全，酶解反应完成后升温将复合酶灭火，获得反应液；S2、分离：将反应液过滤，获得芹菜素粗晶，将芹菜素粗晶与醇溶液混合并搅拌至芹菜素粗晶完全溶解，获得复溶液；S3、纯化：复溶液冷却结晶，过滤，获得芹菜素。本发明的利用生物酶解制备芹菜素的方法采用生物酶催化，将野漆树苷水解成芹菜素，操作简单方便，绿色无污染，适合大规模生产。

Description

利用生物酶解制备芹菜素的方法
技术领域
本发明涉及芹菜素领域，特别地，涉及一种利用生物酶解制备芹菜素的方法。
背景技术
芹菜素是天然存在的一种黄酮类化合物，以植物黄色素的形式存在于多种植物中，主要来源于伞形科植物旱芹，其他植物如洋甘菊、蜜蜂花、紫苏、马鞭草、西洋蓍草中也发现有它的存在。芹菜素的分子式为C15H10O5，分子量为270，熔点345℃～350℃，难溶于水，易溶于热乙醇、二甲基亚砜、稀碱等溶剂。具有舒张血管，降压降脂、抗肿瘤、消炎、抗氧化、预防多种癌症等生物活化。由于芹菜素具有良好的生物活化，故而在功能性食品、医药和化妆品领域具有很广泛的应用前景。
现有的芹菜素制备方法主要有两种：一是直接从植物中提取，二是以黄烷酮为原料半合成。植物提取工艺工序复杂，植物中芹菜素含量低，芹菜素纯化困难，产品是纯度和收率低，从而造成了原材料的过度消耗与浪费，成本太高，不适合规模化生产，因此，在应用过程中因纯度较低，治疗与保健效果不理想。半合成芹菜素是以柚皮素脱氢氧化或者野漆树苷酸解产生。柚皮素脱氢氧化是在碱性环境下，以柚皮素作为原料，在溶剂1,4-二氧环己烷、二甲亚砜、吡啶、二甲基甲酰胺中，50℃～130℃温度下与氧化剂碘反应，脱氢生成芹菜素。该方法使用有毒的有机溶剂和氧化剂，产生有害废水，污染环境，不符合绿色化学理念。野漆树苷酸解是高温条件下发生酸水解反应，具有不易控制、收率较低、能耗高、消耗水量大等缺点。
发明内容
本发明提供了一种利用生物酶解制备芹菜素的方法，以解决现有的芹菜素制备方法工艺复杂、收率低、能耗高的技术问题。
本发明采用的技术方案如下：
一种利用生物酶解制备芹菜素的方法，包括以下步骤：S1、酶解：向反应容器中加入野漆树苷与水或低级醇溶液，混合均匀，加热升温至70℃以上保温，再冷却至60℃以下，加入酸调节pH值，加入复合酶进行酶解反应，复合酶包括鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶，检测野漆树苷是否反应完全，酶解反应完成后升温将复合酶灭火，获得反应液；S2、分离：将反应液过滤，获得芹菜素粗晶，将芹菜素粗晶与醇溶液混合并搅拌至芹菜素粗晶完全溶解，获得复溶液；S3、纯化：复溶液冷却结晶，过滤，获得芹菜素。
进一步地，步骤S3中的过滤后的滤液进行旋转蒸发至无醇味，获得浓缩液，将浓缩液进行冷冻干燥，获得芹菜素。
进一步地，步骤S1中复合酶先进行活化，再进行酶解反应；复合酶活化包括：将鼠李糖苷酶溶于水中进行活化获得鼠李糖苷酶液，将葡萄糖苷酶溶于水中进行活化获得葡萄糖苷酶液，将鼠李糖苷酶液与葡萄糖苷酶液混合，鼠李糖苷酶液与葡萄糖苷酶液的酶比活力为10000～20000∶10000；复合酶的体积与野漆树苷的质量比为2～6∶40。
进一步地，复合酶的酶解反应时间为0.5h～72h，酶解反应温度为20℃～75℃。
进一步地，步骤S1中向反应容器中加入野漆树苷与低级醇溶液，低级醇溶液采用含碳数为Cl～C6的一元醇，二元醇或三元醇，低级醇溶液中低级醇的浓度为20％～100％，野漆树苷的质量与低级醇溶液的体积比为1∶5～40。
进一步地，步骤S1中向反应容器中加入野漆树苷与水，野漆树苷的质量与水的体积比为1∶5～40。
进一步地，步骤S1中加热升温的温度为70℃～100℃，保温的时间为1min～60min，再冷却至30℃～60℃。
进一步地，步骤S1中酸采用盐酸、硫酸、冰醋酸或甲酸中的一种；步骤S1中酸调节的pH至为2～8。
进一步地，检测野漆树苷是否反应完全具体步骤包括：复合酶的酶解反应时间为4h～12h，酶解反应2h～6h后，每间隔1h将酶解反应液在薄层层析色谱上点样，观察野漆树苷的斑点是否消失，消失判定反应完成；或者，复合酶的酶解反应时间为4h～12h，酶解反应2h～6h后，每间隔1h将酶解反应液进行高效液相色谱检测，野漆树苷吸收峰面积低于1％，判定反应完成。
进一步地，步骤S2中醇溶液采用低级醇溶液，低级醇溶液采用含碳数为Cl～C6的一元醇，二元醇或三元醇，低级醇溶液中低级醇的浓度为70％～100％；芹菜素粗晶的质量与醇溶液的体积比为1∶10～20。
进一步地，步骤S3中复溶液冷却结晶包括：复溶液冷却至室温，搅拌析晶10h～20h。
本发明具有以下有益效果：
本发明的利用生物酶解制备芹菜素的方法，通过复合酶酶解入野漆树苷，再进行芹菜素粗晶分离，再采用醇溶液对芹菜素进行重结晶，获得纯度较高、晶型较均匀的新枳属苷，且采用醇溶液进行重结晶，其操作简单，容易实现工业化生产。复合酶包括鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶，利用鼠李糖苷酶与葡萄糖苷酶的水解功能，将鼠李糖基和葡萄糖基切下以水解糖苷键，使得野漆树苷脱去鼠李糖与葡萄糖，制备成芹菜素。本发明的利用生物酶解制备芹菜素的方法，对现有芹菜素提取技术易污染、得率低，半合成使用有害试剂，废水量大，不适合大规模工业化生产的缺点，本发明的利用生物酶解制备芹菜素的方法采用生物酶催化，将野漆树苷水解成芹菜素，操作简单方便，绿色无污染，适合大规模生产。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照附图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明的芹菜素标品的液相色谱图；以及
图2是本发明优选实施例1的芹菜素的液相色谱图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
图1是本发明的芹菜素标品的液相色谱图；图2是本发明优选实施例1的芹菜素的液相色谱图。
本实施例的利用生物酶解制备芹菜素的方法，包括以下步骤：
S1、酶解：向反应容器中加入野漆树苷与水或低级醇溶液，混合均匀，加热升温至70℃以上保温，再冷却至60℃以下，加入酸调节pH值，加入复合酶进行酶解反应，复合酶包括鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶，检测野漆树苷是否反应完全，酶解反应完成后升温将复合酶灭火，获得反应液；
S2、分离：将反应液过滤，获得芹菜素粗晶，将芹菜素粗晶与醇溶液混合并搅拌至芹菜素粗晶完全溶解，获得复溶液；
S3、纯化：复溶液冷却结晶，过滤，获得芹菜素。
本发明的利用生物酶解制备芹菜素的方法，通过复合酶酶解入野漆树苷，再进行芹菜素粗晶分离，再采用醇溶液对芹菜素进行重结晶，获得纯度较高、晶型较均匀的新枳属苷，且采用醇溶液进行重结晶，其操作简单，容易实现工业化生产。复合酶包括鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶，利用鼠李糖苷酶与葡萄糖苷酶的水解功能，将鼠李糖基和葡萄糖基切下以水解糖苷键，使得野漆树苷脱去鼠李糖与葡萄糖，制备成芹菜素。本发明的利用生物酶解制备芹菜素的方法，对现有芹菜素提取技术易污染、得率低，半合成使用有害试剂，废水量大，不适合大规模工业化生产的缺点，本发明的利用生物酶解制备芹菜素的方法采用生物酶催化，将野漆树苷水解成芹菜素，操作简单方便，绿色无污染，适合大规模生产。利用生物酶解制备芹菜素的方法的反应方程式如下：
Figure BDA0002877158850000041
本实施例中，步骤S3中的过滤后的滤液进行旋转蒸发至无醇味，获得浓缩液，将浓缩液进行冷冻干燥，获得芹菜素。上述利用生物酶解制备芹菜素的方法，不使用有害溶剂和有毒试剂，其产生的废水或滤液可以重复利用，操作方便简单，反应条件温和可控。将过滤后的滤液进行旋转蒸发至无醇味，获得浓缩液，将浓缩液进行冷冻干燥，获得含量较低的芹菜素，从而将废水或滤液的芹菜素回收，以提高芹菜素的回收率
本实施例中，步骤S1中复合酶先进行活化，再进行酶解反应；复合酶活化包括：将鼠李糖苷酶溶于水中进行活化获得鼠李糖苷酶液，将葡萄糖苷酶溶于水中进行活化获得葡萄糖苷酶液，将鼠李糖苷酶液与葡萄糖苷酶液混合，鼠李糖苷酶液与葡萄糖苷酶液的酶比活力为10000～20000∶10000；复合酶的体积与野漆树苷的质量比为2～6∶40。上述复合酶包括葡萄糖苷酶和鼠李糖苷酶，葡萄糖苷酶和鼠李糖苷酶共同催化作用，以将野漆树苷的鼠李糖基和葡萄糖基去除，获得芹菜素。在酶解反应之前，需要将葡萄糖苷酶和鼠李糖苷酶进行活化，将鼠李糖苷酶溶于水中进行活化获得鼠李糖苷酶液，将葡萄糖苷酶溶于水中进行活化获得葡萄糖苷酶液，将活化后的酶液加入到野漆树苷与水或低级醇溶液的混合液中，使活化后的酶充分反应，使得酶解完全。通过前期预实验，单因素试验和正交试验，确定鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶的酶比活力。将野漆树苷与鼠李糖苷酶、葡萄糖苷酶与芹菜素-7-O-葡萄糖苷测试其反应速率确定两种酶的真实酶活力，确定两种酶共同参加酶解反应的最佳酶的比活力。本实施例中，复合酶的酶解反应时间为0.5h～72h，酶解反应温度为20℃～75℃。上述复合酶在含有野漆树苷溶液中进行酶解反应，反应时间为0.5h～72h，反应温度为20℃～75℃，以使得鼠李糖苷酶与葡萄糖苷酶水解糖苷键充分。
本实施例中，步骤S1中向反应容器中加入野漆树苷与低级醇溶液，低级醇溶液采用含碳数为Cl～C6的一元醇，二元醇或三元醇，低级醇溶液中低级醇的浓度为20％～100％，野漆树苷与低级醇溶液的体积比为1∶5～40。野漆树苷易溶于甲醇、乙醇等低级醇，充分溶解后增加野漆树苷与复合酶的接触面积，加速酶解反应进行，然而，长碳链醇的非极性增加，使得野漆树苷溶解度变小。而且，低含量的甲醇、乙醇等低级醇对鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶生物活性影响较小，其他多碳链醇、高级元醇或高浓度的低级醇可能导致鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶失活，因此采用Cl～C6的一元醇，二元醇或三元醇，并且低级醇溶液中低级醇的浓度为20％～100％，野漆树苷与低级醇溶液的体积比为1∶5～40，以适应复合酶酶解反应的发生。优选地，低级醇溶液中低级醇的浓度为30％，野漆树苷与低级醇溶液的体积比为1∶15。野漆树苷在30％乙醇溶液溶解度更大，对酶活性影响较小，有利于芹菜素生成。
本实施例中，步骤S1中向反应容器中加入野漆树苷与水，野漆树苷的质量与水的体积比为1∶5～40。上述野漆树苷也溶于水中，可在含有野漆树苷的水溶液中进行酶解反应。
本实施例中，步骤S1中加热升温的温度为70℃～100℃，保温的时间为1min～60min，再冷却至30℃～60℃。上述加热升温的温度为70℃～100℃，温度升高有利于野漆树苷与水或低级醇充分溶解，高温杀菌减少外来微生物对鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶活性影响。冷却至30℃～60℃，调节pH至为2～8，以进行酶解反应。优选地，加热升温的温度为80℃，保温的时间为10min，再冷却至55℃。
本实施例中，检测野漆树苷是否反应完全具体步骤包括：复合酶的酶解反应时间为4h～12h，酶解反应2h～6h后，每间隔1h将酶解反应液在薄层层析色谱上点样，观察野漆树苷的斑点是否消失，消失判定反应完成；或者，复合酶的酶解反应时间为4h～12h，酶解反应2h～6h后，每间隔1h将酶解反应液进行高效液相色谱检测，野漆树苷吸收峰面积低于1％，判定反应完成。酶解反应完全后可加热至80℃将复合酶灭活，停止反应，加热80℃不影响芹菜素的生成。
本实施例中，步骤S1中酸采用盐酸、硫酸、冰醋酸或甲酸中的一种。步骤S1中酸调节的pH至为2～8。优选地，采用冰醋酸，调节的pH至为4，以适应鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶的水解发生环境。鼠李糖苷酶的最适反应温度为35℃～50℃，最适反应pH值为4.0～6.0，有催化活性温度范围为10℃～80℃，有催化活性pH范围为2～9；葡萄糖苷酶的最适反应温度为20℃～65℃，最适反应pH值为4.0～5.0，有催化活性温度范围为10℃～110℃，有催化活性pH范围为2～8。为适应鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶酶解，扩大反应环境的pH值为2～8。
本实施例中，步骤S2中醇溶液采用低级醇溶液，低级醇溶液采用含碳数为Cl～C6的一元醇，二元醇或三元醇，低级醇溶液中低级醇的浓度为70％～100％。芹菜素粗晶的质量与醇溶液的体积比为1∶10～20。芹菜素属于黄酮类化合物极性较小，依据相似相容原理，芹菜素不易溶于低浓度的醇或水，而易于溶解在70％～100％的低级醇中，从而芹菜素在低级醇的浓度为70％～100％溶液中可以充分溶解，搅拌和加热80℃以上，以辅助加快芹菜素粗晶的溶解。优选地，低级醇溶液中低级醇的浓度为80％，野漆树苷的质量与低级醇溶液的体积比为1∶10。
本实施例中，步骤S3中复溶液冷却结晶包括：复溶液冷却至室温，搅拌析晶10h～20h。芹菜素在常温条件下，在低级醇溶液中溶解度较小，芹菜素从低级醇溶液中析出，析出芹菜素精制晶体后再过滤、干燥，即获得芹菜素。
实施例
芹菜素标品购自中国药品检验总所20mg 99.6％芹菜素标准品。
以上试剂均为市销。
实施例1
利用生物酶解制备芹菜素的方法，包括以下步骤：
S1、酶解：向反应容器中加入100g野漆树苷与2L 25％乙醇溶液，混合均匀，水浴加热升温至80℃，保温10min，再冷却至60℃，加入冰醋酸酸调节pH值4.5，加入10mL复合酶进行酶解反应，复合酶包括活化的鼠李糖苷酶液和活化的葡萄糖苷酶，鼠李糖苷酶液与葡萄糖苷酶液的酶比活力为12000∶10000，复合酶的酶解温度为55℃，酶解反应时间为4h，酶解反应2h后，每间隔1h将酶解反应液进行高效液相色谱检测，野漆树苷吸收峰面积低于1％，判定反应完成，升温至80℃将复合酶灭火，获得反应液；
S2、分离：将反应液过滤，获得芹菜素粗晶，加入芹菜素粗晶质量10倍体积80％乙醇溶液，加热至80℃搅拌至完全溶解，获得复溶液；，
S3、纯化：复溶液冷却至室温，搅拌析晶12hr，过滤，干燥，获得芹菜素，过滤后的滤液进行旋转蒸发至无醇味，获得浓缩液，将浓缩液进行冷冻干燥，获得少量芹菜素，收集获得芹菜素。
获得39.6g的芹菜素纯品，HPLC纯度99.1％，收率39.6％。
实施例2
利用生物酶解制备芹菜素的方法，包括以下步骤：
S1、酶解：向反应容器中加入100g野漆树苷与1.5L 30％乙醇溶液，混合均匀，水浴加热升温至80℃，保温15min，再冷却至60℃，加入冰醋酸酸调节pH值4，加入12mL复合酶进行酶解反应，复合酶包括活化的鼠李糖苷酶液和活化的葡萄糖苷酶，鼠李糖苷酶液与葡萄糖苷酶液的酶比活力为10000∶10000，复合酶的酶解温度为50℃，酶解反应时间为12h，酶解反应6h后，每间隔1h将酶解反应液进行高效液相色谱检测，野漆树苷吸收峰面积低于1％，判定反应完成，升温至80℃将复合酶灭火，获得反应液；
S2、分离：将反应液过滤，获得芹菜素粗晶，加入芹菜素粗晶质量15倍体积70％乙醇溶液，加热至80℃搅拌至完全溶解，获得复溶液；
S3、纯化：复溶液冷却至室温，搅拌析晶12hr，过滤，干燥，获得芹菜素，过滤后的滤液进行旋转蒸发至无醇味，获得浓缩液，将浓缩液进行冷冻干燥，获得少量芹菜素，收集获得芹菜素。
获得42.8g的芹菜素纯品，HPLC纯度91.7％，收率42.8％。
实施例3
利用生物酶解制备芹菜素的方法，包括以下步骤：
S1、酶解：向反应容器中加入120g野漆树苷与1.5L 30％乙醇溶液，混合均匀，水浴加热升温至80℃，保温10min，再冷却至60℃，加入冰醋酸酸调节pH值4.5，加入15mL复合酶进行酶解反应，复合酶包括活化的鼠李糖苷酶液和活化的葡萄糖苷酶，鼠李糖苷酶液与葡萄糖苷酶液的酶比活力为12000∶10000，复合酶的酶解温度为60℃，酶解反应时间为6h，酶解反应2h后，每间隔1h将酶解反应液进行高效液相色谱检测，野漆树苷吸收峰面积低于1％，判定反应完成，升温至80℃将复合酶灭火，获得反应液；
S2、分离：将反应液过滤，获得芹菜素粗晶，加入芹菜素粗晶质量20倍体积70％乙醇溶液，加热至80℃搅拌至完全溶解，获得复溶液；
S3、纯化：复溶液冷却至室温，搅拌析晶12hr，过滤，干燥，获得芹菜素，过滤后的滤液进行旋转蒸发至无醇味，获得浓缩液，将浓缩液进行冷冻干燥，获得少量芹菜素，收集获得芹菜素。
获得53.4g芹菜素纯品，HPLC纯度94.9％，收率44.5％。
实施例1、2和3的芹菜素的收率计算如下：
Figure BDA0002877158850000071
实施例1、2和3的芹菜素的HPLC纯度，通过高效液相软件对图谱进行分析，样品的峰面积占所有出峰面积的百分比为获得芹菜素的纯度。
以实施例1为例，进行芹菜素HPLC测定：
(1)芹菜素标样溶液：精密称取芹菜素标准样品18.26mg，用无水乙醇溶于100mL容量瓶中，定容、摇匀后备用。
(2)色谱条件色谱柱Diamonsil C18柱(150mm×.6mm，5μm)；流动相为乙腈∶水＝45∶55，流速1.0mL/min；检测波长270nm；柱温25℃；进样量10μL。
取实施例1制备的芹菜素以及购买的相应的标准品进行液相色谱分析。分析结果如图1和图2、表1和表2所示。其中，图1为芹菜素标准品的液相谱图，表1为芹菜素标准品的峰结果，图2为实施例1制备的芹菜素液相谱图，表2为实施例1制备的芹菜素的峰结果，芹菜素标准品的保留时间为6.150，实施例1制备的芹菜素的保留时间为6.147，二者的保留时间相近，可初步判断实施例1中利用生物酶解制备芹菜素的方法制备的产物为芹菜素。而且实施例1制备的芹菜素对应的峰面积百分数为99.18％，可见其纯度较高。
表1芹菜素标准品的峰结果
Figure BDA0002877158850000072
表2实施例1的芹菜素的峰结果
Figure BDA0002877158850000081
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种利用生物酶解制备芹菜素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、酶解：向反应容器中加入野漆树苷与水或低级醇溶液，混合均匀，加热升温至70℃以上保温，再冷却至60℃以下，加入酸调节pH值，加入复合酶进行酶解反应，复合酶包括鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶，检测野漆树苷是否反应完全，酶解反应完成后升温将复合酶灭火，获得反应液；
S2、分离：将反应液过滤，获得芹菜素粗晶，将芹菜素粗晶与醇溶液混合并搅拌至芹菜素粗晶完全溶解，获得复溶液；
S3、纯化：复溶液冷却结晶，过滤，获得芹菜素。
2.根据权利要求1所述的利用生物酶解制备芹菜素的方法，其特征在于，
步骤S3中的过滤后的滤液进行旋转蒸发至无醇味，获得浓缩液，将浓缩液进行冷冻干燥，获得芹菜素。
3.根据权利要求1所述的利用生物酶解制备芹菜素的方法，其特征在于，
步骤S1中复合酶先进行活化，再进行酶解反应；
复合酶活化包括：将鼠李糖苷酶溶于水中进行活化获得鼠李糖苷酶液，将葡萄糖苷酶溶于水中进行活化获得葡萄糖苷酶液，将鼠李糖苷酶液与葡萄糖苷酶液混合，
所述鼠李糖苷酶液与所述葡萄糖苷酶液的酶比活力为10000～20000∶10000；
所述复合酶的体积与所述野漆树苷的质量比为2～6∶40。
4.根据权利要求3所述的利用生物酶解制备芹菜素的方法，其特征在于，
所述复合酶的酶解反应时间为0.5h～72h，酶解反应温度为20℃～75℃。
5.根据权利要求1所述的利用生物酶解制备芹菜素的方法，其特征在于，
步骤S1中向反应容器中加入野漆树苷与低级醇溶液，所述低级醇溶液采用含碳数为Cl～C6的一元醇，二元醇或三元醇，所述低级醇溶液中低级醇的浓度为20％～100％，
所述野漆树苷的质量与低级醇溶液的体积比为1∶5～40。
6.根据权利要求1所述的利用生物酶解制备芹菜素的方法，其特征在于，
步骤S1中向反应容器中加入野漆树苷与水，所述野漆树苷的质量与水的体积比为1∶5～40；
步骤S1中加热升温的温度为70℃～100℃，保温的时间为1min～60min，再冷却至30℃～60℃。
7.根据权利要求4所述的利用生物酶解制备芹菜素的方法，其特征在于，
检测野漆树苷是否反应完全具体步骤包括：
复合酶的酶解反应时间为4h～12h，酶解反应2h～6h后，每间隔1h将酶解反应液在薄层层析色谱上点样，观察野漆树苷的斑点是否消失，消失判定反应完成；或者
复合酶的酶解反应时间为4h～12h，酶解反应2h～6h后，每间隔1h将酶解反应液进行高效液相色谱检测，野漆树苷吸收峰面积低于1％，判定反应完成。
8.根据权利要求1所述的利用生物酶解制备芹菜素的方法，其特征在于，
步骤S1中酸采用盐酸、硫酸、冰醋酸或甲酸中的一种；
步骤S1中酸调节的pH至为2～8。
9.根据权利要求1所述的利用生物酶解制备芹菜素的方法，其特征在于，
步骤S2中醇溶液采用低级醇溶液，所述低级醇溶液采用含碳数为Cl～C6的一元醇，二元醇或三元醇，所述低级醇溶液中低级醇的浓度为70％～100％；
所述芹菜素粗晶的质量与醇溶液的体积比为1∶10～20。
10.根据权利要求1所述的利用生物酶解制备芹菜素的方法，其特征在于，
步骤S3中复溶液冷却结晶包括：复溶液冷却至室温，搅拌析晶10h～20h。
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