CN115872964A - 脉冲电场与低共熔试剂协同降解柚皮苷制备柚皮素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了脉冲电场与低共熔试剂协同降解柚皮苷制备柚皮素的方法；该方法先将氯化胆碱和草酸按照摩尔比混合，搅拌至形成澄清透明的低共熔试剂；将柚皮苷溶解于低共熔试剂后混匀；将溶解了柚皮苷的低共熔试剂放入脉冲电场设备中处理，脉冲频率为5‑10Hz，处理场强为2‑3kV/cm；加入超纯水，冷藏；将离心分离，洗涤后冻干，得柚皮素。相较于传统酸水解法，本发明不需要长时间高温处理和使用酸性有机溶液，能耗低、效率高且较为环保；相较于生物转化法，本发明不需要繁琐的菌株孵育步骤，也不需要使用价格昂贵的糖苷酶，生产成本显著降低。本发明柚皮素转化得率高，得率超过98％，具有副产物少，产物分离操作简单等优点。
Description
技术领域
本发明涉及柚皮素的制备，具体涉及一种脉冲电场与低共熔试剂协同降解柚皮苷制备柚皮素的方法。
背景技术
柚皮素(naringenin，4',5,7-三羟基黄酮)是一种类黄酮，具有多种活性功能，如抗菌、抗氧化、抗炎症、抗癌细胞增殖、抗病毒、抗糖尿病及保护心血管等功效。柚皮素由于其优异的生物活性被广泛应用于食品、制药和化妆品行业中。在自然界中，柚皮素大多以其糖苷的形式(柚皮苷)广泛存在于柑橘类水果的果皮中。所以目前柚皮素主要还是通过水解其糖苷柚皮苷来制备。
现有关于降解柚皮苷制备柚皮素的方法主要有酸水解法和生物转化法。采用酸水解法水解柚皮苷需要长时间的高温处理，能耗成本高，步骤繁琐，同时反应过程中所产生的酸性有机废液还会污染环境。例如中国发明专CN104829579B公开了的一种柚皮素的制备方法：将柚皮苷边搅拌边加入有机酸溶液中，加热水解，将水解后的反应液冷却，对反应液；进行抽滤，淋洗滤饼至中性，获得柚皮素粗品；还包括纯化步骤：将得到的柚皮素粗品溶解在含有活性炭的乙醇溶液中，加热搅拌脱色除杂，并趁热滤除活性炭，得到脱色除杂后的滤液；将滤液冷却析晶，抽滤收集析出的白色针状结晶，干燥，获得柚皮素；其中，有机酸为柠檬酸、富马酸、酒石酸、苹果酸中的一种或多种。该技术的柚皮苷需要在高压蒸汽反应釜中反应1-4小时后才会水解为柚皮素，并且该方法水解得到的柚皮素纯度不高，还需经过活性炭脱色、过滤、冷却结晶等多个步骤后才能得到纯度较高的柚皮素。此外，酸水解过程中所产生的酸性有机废液(含有2％ H2SO4的乙醇、丙酮、甲醇废液)还需使用氢氧化钡进行中和处理，显著增加了企业的生产成本。
生物转化法主要分为纯酶法和全细胞法，这两种方法条件温和、产物单一且无有毒废物产生，但采用生物转化法水解柚皮苷时同样也存在步骤繁琐，成本昂贵以及水解效率不高等问题。例如中国发明专利CN105838622B中使用了一种胞外酶去水解柚皮苷制备柚皮素，该方法所使用的胞外酶需要经过微生物培养、发酵、提取纯化等多个步骤后获取，工艺复杂且生产成本较高，不利于工业化生产。为了降低纯酶法水解柚皮苷的成本，中国发明专利申请CN107119085A中提出了一种基于黑曲霉全细胞催化柚皮苷水解制备柚皮素的解决方案。该方法虽然有效的降低了柚皮苷水解的成本，同时也解决了酶回收再利用问题，但该方法水解效率较低，在反应48小时后，只有33％的柚皮苷发生了水解。
上述现有技术可见，酸水解法一般需要90-130℃高温，处理1-4h，能耗较高。酸水解法中还需要使用到酸性有机溶剂，对坏境也造成了污染。酶解柚皮苷所使用的β-糖苷酶价格昂贵，如最常见的β-糖苷酶(来源于黑曲霉)，价格高达3333元/g(数据来源于sigma试剂公司官网：https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh)，也增加了水解柚皮苷的成本。使用生物转化法虽然能降低使用纯酶水解柚皮苷的成本，但其效率较低，仅为2.08％/h。
发明内容
为了克服现有技术上的不足及缺陷，本发明的目的在于提供一种利用脉冲电场与低共熔试剂联用水解柚皮苷制备柚皮素的方法，实现了低能耗，低成本、高效率且绿色环保无有机酸性废液的产生，为柚皮素等黄酮苷元的绿色制备提供了指导。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
脉冲电场与低共熔试剂协同降解柚皮苷制备柚皮素的方法，包括如下步骤：
1)将氯化胆碱和草酸按照摩尔比混合，搅拌至形成澄清透明的低共熔试剂；
2)将柚皮苷溶解于低共熔试剂后混匀；
3)将溶解了柚皮苷的低共熔试剂放入脉冲电场设备中处理，脉冲频率为5-10Hz，处理场强为2-3kV/cm，处理脉宽为40-50μs；
4)加入超纯水，冷藏；将离心分离，洗涤后冻干，得柚皮素。
为进一步实现本发明目的，优选地，步骤1)中，所述的氯化胆碱和草酸摩尔比为1:1-1.4:1。
优选地，步骤1)中，所述的搅拌在85-95℃水浴中进行。
优选地，步骤1)中，所述的低共熔试剂还包括用超纯水稀释。
优选地，所述的超纯水稀释至低共熔试剂占溶液体积的97％-100％。
优选地，步骤3)中，所述的溶解了柚皮苷的低共熔试剂放入脉冲电场设备中处理的次数为2500-3000次。
优选地，步骤4)中，所述的超纯水加入量为低共熔试剂体积的10-12倍。
优选地，步骤4)中，所述的冷藏温度为2-4℃，冷藏时间为3-5小时。
优选地，步骤4)中，所述的洗涤使用超纯水进行，洗涤的次数为3-5次。
优选地，步骤4)中，通过离心分离回收低共熔试剂。
优选地，所述的回收低共熔试剂是收集离心分离后的液体，倒入旋转蒸发装置，50-55℃温度下旋转蒸发出水分；直至混合液中水分全部蒸干，收集的高黏度组分为回收成功的低共熔试剂组分。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果。
1)现有技术酸水解法水解柚皮苷需要长时间的高温处理，能耗成本高，步骤繁琐，同时反应过程中所产生的酸性有机废液还会污染环境，且水解得到的柚皮素纯度不高；本发明发现，针对水解柚皮苷制备柚皮素，氯化胆碱(Choline chloride，Ch)和草酸(Oxalicacid，Oxa)形成的低共熔试剂(Ch/Oxa)能很好的充当柚皮苷的溶剂，同时其质子提供能力要大于盐酸、硫酸等强酸，使该低共熔试剂具有在柚皮苷水解反应中完全替代酸性有机溶剂的能力；但是并不是任意低共熔试剂都能做到不需要长时间高温处理，能耗低，效率高，成本较低；通过对比例发现仅仅是氯化胆碱和草酸形成的低共熔试剂才能实现上述目的，而同样是低共熔试剂的氯化胆碱和柠檬酸、氯化胆碱和乙酰丙酸、氯化胆碱和酒石酸均达不到上述目的。
2)本发明特定点低共熔试剂与脉冲电场处理形成协同配合作用，如实施例测试，脉冲电场与低共熔试剂(Ch/Oxa)配合柚皮苷转化率最高(99.75％)，而脉冲电场联用酸水解法降解柚皮苷仅能使2.23％的柚皮苷转化为柚皮素，水热联用低共熔试剂(Ch/Oxa)柚皮苷的转化率虽然达到97.56％，但耗时4h，显著长于脉冲电场配合Ch/Oxa的30min，降解同样体积浓度柚皮苷时，脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Oxa)处理时间仅6.6min，处理时间要远低于水热联用酸水解法(4h)、纯酶法(8h)和全细胞法(48h)，其水解效率分别是这三种方法的36倍，72倍和436倍。
3)本发明利用脉冲电场结合低共熔试剂的方法降解柚皮苷制备柚皮素，相较于传统酸水解法，不需要使用甲醇乙醇等有机溶剂，也不需要使用硫酸盐酸等强酸，所使用的低共熔试剂可回收，是一种绿色环保的制备工艺。
4)本发明利用脉冲电场结合低共熔试剂的方法降解柚皮苷制备柚皮素，相较于传统酸水解法和生物转化法，该方法不需要长时间高温处理，能耗低，效率高，并且该方法也不需要使用酶，成本较低。
附图说明
图1是本发明脉冲电场与低共熔试剂(Ch/Oxa)协同降解柚皮苷制备柚皮素反应示意图。
图2是柚皮苷和柚皮素的标准品液相色谱图。
图3是本发明实施例1中柚皮苷未处理前的色谱峰图。
图4是本发明实施例1中柚皮苷经过脉冲电场与低共熔试剂协同处理后的色谱峰图。
图5是本发明实施例2中柚皮苷未处理前的色谱峰图。
图6是本发明实施例2中柚皮苷经过脉冲电场与低共熔试剂协同处理后的色谱峰图。
图7是本发明实施例3中柚皮苷未处理前的色谱峰图。
图8是本发明实施例3中柚皮苷经过脉冲电场与低共熔试剂协同处理后的色谱峰图。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的实施方式不限如此。
实施例中，所用的脉冲电场设备为广州市心安食品科技有限公司的PEF-EX-19002型脉冲电场设备。
实施例1
一种脉冲电场与低共熔试剂协同降解柚皮苷制备柚皮素的方法，包括如下步骤：
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和草酸按照摩尔比1:1混合，随后置于85℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Oxa，将Ch/Oxa配置成97％体积浓度的反应液备用。
脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Oxa)降解柚皮苷：将20mg柚皮苷标准品溶于20mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入脉冲处理室中进行处理。处理条件为脉冲次数为2500次，脉冲频率为5Hz，处理场强为2kV/cm，处理脉宽为40μs。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定柚皮苷和柚皮素含量变化情况。
脉冲电场处理时间＝处理次数/频率，通过计算脉冲电场处理总时间为6分40秒。
分离样品与回收低共熔试剂：往脉冲电场处理过后的低共熔试剂样品中加入10倍体积的超纯水，随后在2℃低温下冷藏3小时。将沉淀离心分离，用超纯水洗涤三次后冻干得到柚皮素。收集离心分离后的液体，倒入旋转蒸发装置，50℃温度下旋转蒸发分离混合液中水分。直至混合液中水分全部蒸干分离后，收集的高黏度组分即为回收成功的低共熔试剂组分。
对比例1
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和柠檬酸按照摩尔比1:1混合，随后置于85℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Cit，加入超纯水将低共熔试剂Ch/Cit配置成97％体积浓度的反应液备用。
脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Cit)降解柚皮苷：将20mg柚皮苷标准品溶于20mL配制好的低共熔试剂Ch/Cit中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入脉冲处理室中进行处理。处理条件为脉冲次数为2500次，脉冲频率为5Hz，处理场强为2kV/cm，处理脉宽为40μs。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定柚皮苷和柚皮素含量变化情况。
脉冲电场处理时间＝处理次数/频率，通过计算脉冲电场处理总时间为6分40秒。
对比例2
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和乙酰丙酸按照摩尔比1:1混合，随后置于85℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Lev，加入超纯水将低共熔试剂Ch/Lev配置成97％体积浓度的反应液备用。
脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Lev)降解柚皮苷：将20mg柚皮苷标准品溶于20mL配制好的低共熔试剂Ch/Lev中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入脉冲处理室中进行处理。处理条件为脉冲次数为2500次，脉冲频率为5Hz，处理场强为2kV/cm，处理脉宽为40μs。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定柚皮苷和柚皮素含量变化情况。
脉冲电场处理时间＝处理次数/频率，通过计算脉冲电场处理总时间为6分40秒。
对比例3
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和酒石酸按照摩尔比1:1混合，随后置于85℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Tar，加入超纯水将低共熔试剂Ch/Tar配置成97％体积浓度的反应液备用。
脉冲电场与低共熔试剂(Ch/Tar)联用降解柚皮苷：将20mg柚皮苷标准品溶于20mL配制好的低共熔试剂Ch/Tar中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入脉冲处理室中进行处理。处理条件为脉冲次数为2500次，脉冲频率为5Hz，处理场强为2kV/cm，处理脉宽为40μs。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定柚皮苷和柚皮素含量变化情况。
脉冲电场处理时间＝处理次数/频率，通过计算脉冲电场处理总时间为6分40秒。
对比例4
脉冲电场联用酸水解法水解柚皮苷：将20mg柚皮苷标准品溶于20mL含有2％H2SO4的甲醇溶液，随后置于处理室中进行处理。处理条件为脉冲次数为2500次，脉冲频率为5Hz，处理场强为2kV/cm，处理脉宽为40μs。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定柚皮苷和柚皮素含量变化情况。
脉冲电场处理时间＝处理次数/频率，通过计算脉冲电场处理总时间为6分40秒。
对比例5
水热联用低共熔试剂水解柚皮苷：将20mg柚皮苷标准品溶于20mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入水浴锅中95℃加热处理30分钟，随后采用高效液相色谱法测定柚皮苷和柚皮素含量变化情况。
对比例6
水热联用酸水解法水解柚皮苷：将20mg柚皮苷标准品溶于20mL含有2％H2SO4的甲醇溶液，随后置于水浴锅中95℃加热处理4小时，随后采用高效液相色谱法测定柚皮苷和柚皮素含量变化情况。
对比例7
纯酶法水解柚皮苷：将20mg柚皮苷标准品和β-葡萄糖糖苷酶(来源于黑曲霉)溶于磷酸缓冲液-甲醇混合溶液(pH 6.0)，于37℃孵育8小时后，采用高效液相色谱法测定柚皮苷和柚皮素含量变化情况。
对比例8
全细胞法水解柚皮苷：将20mg柚皮苷标准品溶于20mL甲醇-柠檬酸混合溶液(柠檬酸体积浓度0.2mol/L，pH为3.0)，混合均匀后，加入黑曲霉细胞GIM 3.25(广东省微生物研究所)，35℃振荡速率60r/min条件下孵育催化48小时后，采用高效液相色谱法测定柚皮苷和柚皮素含量变化情况。
柚皮苷的转化情况和柚皮素的生成情况采用高效液相色谱法进行检测。吸取样品100μL(与900μL色谱级甲醇混匀后，过0.45μm尼龙膜后备用。检测设备为安捷伦1260Infinity高效液相色谱仪，色谱柱型号为Thermo Accucore XL C18(250mm×4.6mm,4μm)，0.2％乙酸水和乙腈作为检测流动相。检测程序为：0.00-2.00min,B:5-5％,2.00-10.00min,B:5-30％,10.00-12.00min,B:30-100％,12.00-18.00min,B:100-100％,18.00-20.00min,B:100-5％,20.00-25.00min,B:5-5％。流速为0.8mL/min，检测波长为210nm，检测温度为25℃。柚皮苷降解为柚皮素的效率用转化率和转化比两个指标来评价。
柚皮苷转化率(％)＝消耗的柚皮苷质量/柚皮苷总质量×100
柚皮苷转化比＝消耗柚皮苷的摩尔质量/生成柚皮素的摩尔质量
图3是本发明实施例1中柚皮苷未处理前的色谱峰图。图4是本发明实施例1中柚皮苷经过脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Oxa)处理后的色谱峰图。对比图2的柚皮苷和柚皮素的标准品液相色谱图，可以标定实施例中柚皮苷和柚皮素在液相色谱中的出峰位置。从图3和图4可见，脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Oxa)处理前后的样品中柚皮苷和柚皮素变化情况。经过脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Oxa)处理后，样品中的柚皮苷信号峰都变成了柚皮素信号峰，这说明经过处理后，溶液中的柚皮苷都降解成了柚皮素。
如图1所示，本发明柚皮苷在Ch/Oxa中其糖苷键首先会被质子攻击发生质子化使其糖苷键断裂，生成苷元和糖的阳碳离子中间体(过渡态)，阳碳离子中间体溶剂化脱去质子形成糖分子。将溶于柚皮苷的Ch/Oxa放入脉冲电场中进行处理时，反应体系中粒子在电场作用下其扩散系数增加，增加了溶液中质子接触到柚皮苷糖苷键的几率，使糖苷键更容易发生质子化断裂。在电场作用下，能显著降低柚皮苷脱糖苷以及形成过渡态产物所需的活化能，提高反应效率，实现柚皮苷的高效降解。待反应后，往低共熔试剂中加入水，使柚皮素析出。由于水即是氢键的受体也是氢键的供体，水的加入会破坏低共熔试剂的稳定性使其溶解性下降。而柚皮素因其水溶性较差，在低共熔试剂稳定性被破坏的情况下会被析出沉淀。待收集分离沉淀后的柚皮素后，将溶液旋蒸使水分分离后即又可对低共熔试剂实现回收再利用，从而实现整个反应过程无废液产生。
实施例1与对比例1-3的转化率和转化比结果如表1所示。由表1可知四种方法的柚皮苷转化比都接近1，这说明四种降解方法中，降解的柚皮苷几乎都转化成了柚皮素。相较于其它三种酸基低共熔溶剂(Ch/Lev，Ch/Cit和Ch/Tar)，脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Oxa)柚皮苷转化率最高(99.75％)。这可能是由于Ch/Oxa相较于其它三种酸基低共熔溶剂其提供质子的能力更强所致。
表1.不同低共熔溶剂对脉冲电场转化柚皮苷的影响
表2.不同柚皮苷降解方法的转化率和转化比结果
实施例1与对比例4-8共六种柚皮苷降解方法的转化率和转化比结果如表2所示。由表2可知六种方法的柚皮苷转化比都接近1，这说明六种降解方法中，降解的柚皮苷几乎都转化成了柚皮素。六种方法中，脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Oxa)柚皮苷转化率最高(99.75％)。其中，脉冲电场联用酸水解法降解柚皮苷的效果最差，仅能使2.23％的柚皮苷转化为柚皮素，而水热联用低共熔试剂(Ch/Oxa)柚皮苷的转化率虽然较高(97.56％)但耗时长于脉冲电场联用Ch/Oxa(30min)，这说明脉冲电场与Ch/Oxa配合在转化柚皮苷上效果最好。降解同样体积浓度柚皮苷时，脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Oxa)处理时间最短，整个处理过程仅耗时6.6min，其处理时间要远低于水热联用酸水解法(4h)、纯酶法(8h)和全细胞法(48h)，其水解效率分别是这三种方法的36倍，72倍和436倍。尤其是脉冲电场与Ch/Oxa配合处理过程中，相较于酶解法中所使用的糖苷酶(来源于黑曲霉，3333元/g)，本方法中使用的草酸和氯化胆碱价格低至0.212元/g和0.176元/g(数据来源于sigma试剂公司官网：https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh)，成本低廉，具有费城显著的成本优势，工业化价值明显高。还要特别强调的是，本发明方法在处理过程中不需要使用酸性有机溶剂，所使用的低共熔溶剂还能够回收再利用，减少了酸性有机废液的产生对环境较为友好。
上述实施例1可见，相较于传统酸水解法，本发明不需要长时间高温处理和使用酸性有机溶液，能耗低、效率高且较为环保；相较于生物转化法，该方法操作简单，不需要繁琐的菌株孵育步骤，并且本发明也不需要使用价格昂贵的糖苷酶，有助于降低柚皮素生产成本。同时本发明方法的柚皮素转化得率高，平均得率超过98％，具有副产物少，产物分离操作简单等优点。
实施例2
一种脉冲电场与低共熔试剂协同降解柚皮苷制备柚皮素的方法，包括如下步骤：
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和草酸按照摩尔比1.2:1混合，随后置于95℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Oxa，将Ch/Oxa配置成98％体积浓度的反应液备用。
脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Oxa)降解柚皮苷：将20mg柚皮苷标准品溶于20mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入脉冲处理室中进行处理。处理条件为脉冲次数为2750次，脉冲频率为7.5Hz，处理场强为2.5kV/cm，处理脉宽为45μs。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定柚皮苷和柚皮素含量变化情况。
脉冲电场处理时间＝处理次数/频率，通过计算脉冲电场处理总时间为6分6秒。
分离样品与回收低共熔试剂：往脉冲电场处理过后的低共熔试剂样品中加入11倍体积的超纯水，随后在3℃低温下冷藏4小时。将沉淀离心分离，用超纯水洗涤三次后冻干得到柚皮素。收集离心分离后的液体，倒入旋转蒸发装置，52℃温度下旋转蒸发分离混合液中水分。直至混合液中水分全部蒸干分离后，收集的高黏度组分即为回收成功的低共熔试剂组分。
对比例9
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和柠檬酸按照摩尔比1:1混合，随后置于85℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Cit，加入超纯水将低共熔试剂Ch/Cit配置成98％体积浓度的反应液备用。
脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Cit)降解柚皮苷：将20mg柚皮苷标准品溶于20mL配制好的低共熔试剂Ch/Cit中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入脉冲处理室中进行处理。处理条件为脉冲次数为2750次，脉冲频率为7.5Hz，处理场强为2.5kV/cm，处理脉宽为45μs。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定柚皮苷和柚皮素含量变化情况。
脉冲电场处理时间＝处理次数/频率，通过计算脉冲电场处理总时间为6分6秒。
对比例10
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和乙酰丙酸按照摩尔比1:1混合，随后置于85℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Lev，加入超纯水将低共熔试剂Ch/Lev配置成98％体积浓度的反应液备用。
脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Lev)降解柚皮苷：将20mg柚皮苷标准品溶于20mL配制好的低共熔试剂Ch/Lev中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入脉冲处理室中进行处理。处理条件为脉冲次数为2750次，脉冲频率为7.5Hz，处理场强为2.5kV/cm，处理脉宽为45μs。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定柚皮苷和柚皮素含量变化情况。
脉冲电场处理时间＝处理次数/频率，通过计算脉冲电场处理总时间为6分6秒。
对比例11
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和酒石酸按照摩尔比1:1混合，随后置于85℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Tar，加入超纯水将低共熔试剂Ch/Tar配置成98％体积浓度的反应液备用。
脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Tar)降解柚皮苷：将20mg柚皮苷标准品溶于20mL配制好的低共熔试剂Ch/Tar中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入脉冲处理室中进行处理。处理条件为脉冲次数为2750次，脉冲频率为7.5Hz，处理场强为2.5kV/cm，处理脉宽为45μs。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定柚皮苷和柚皮素含量变化情况。
脉冲电场处理时间＝处理次数/频率，通过计算脉冲电场处理总时间为6分6秒。
对比例12
脉冲电场联用酸水解法水解柚皮苷：将20mg柚皮苷标准品溶于20mL含有2％H2SO4的甲醇溶液，随后置于处理室中进行处理。处理条件为脉冲次数为2750次，脉冲频率为7.5Hz，处理场强为2.5kV/cm，处理脉宽为45μs。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定柚皮苷和柚皮素含量变化情况
脉冲电场处理时间＝处理次数/频率，通过计算脉冲电场处理总时间为6分6秒。
对比例13
水热联用低共熔试剂水解柚皮苷：将20mg柚皮苷标准品溶于20mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入水浴锅中95℃加热处理30分钟，随后采用高效液相色谱法测定柚皮苷和柚皮素含量变化情况。
对比例14
水热联用酸水解法水解柚皮苷：将20mg柚皮苷标准品溶于20mL含有2％H2SO4的甲醇溶液，随后置于水浴锅中95℃加热处理4小时，随后采用高效液相色谱法测定柚皮苷和柚皮素含量变化情况。
对比例15
纯酶法水解柚皮苷：将20mg柚皮苷标准品和β-葡萄糖糖苷酶(来源于黑曲霉)溶于磷酸缓冲液-甲醇混合溶液(pH 6.0)，于37℃孵育8小时后，采用高效液相色谱法测定柚皮苷和柚皮素含量变化情况。
对比例16
全细胞法水解柚皮苷：将20mg柚皮苷标准品溶于20mL甲醇-柠檬酸混合溶液(柠檬酸体积浓度0.2mol/L，pH为3.0)，混合均匀后，加入黑曲霉细胞GIM 3.25(广东省微生物研究所)，35℃振荡速率60r/min条件下孵育催化48小时后，采用高效液相色谱法测定柚皮苷和柚皮素含量变化情况。
柚皮苷的转化情况和柚皮素的生成情况采用高效液相色谱法进行检测。吸取样品100μL(与900μL色谱级甲醇混匀后，过0.45μm尼龙膜后备用。检测设备为安捷伦1260Infinity高效液相色谱仪，色谱柱型号为Thermo Accucore XL C18(250mm×4.6mm,4μm)，0.2％乙酸水和乙腈作为检测流动相。检测程序为：0.00-2.00min,B:5-5％,2.00-10.00min,B:5-30％,10.00-12.00min,B:30-100％,12.00-18.00min,B:100-100％,18.00-20.00min,B:100-5％,20.00-25.00min,B:5-5％。流速为0.8mL/min，检测波长为210nm，检测温度为25℃。柚皮苷降解为柚皮素的效率用转化率和转化比两个指标来评价。
柚皮苷转化率(％)＝消耗的柚皮苷质量/柚皮苷总质量×100
柚皮苷转化比＝消耗柚皮苷的摩尔质量/生成柚皮素的摩尔质量
图5是本发明实施例2中柚皮苷未处理前的色谱峰图。图6是本发明实施例2中柚皮苷经过脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Oxa)处理后的色谱峰图。对比图2的柚皮苷和柚皮素的标准品液相色谱图，可以标定实施例中柚皮苷和柚皮素在液相色谱中的出峰位置。图5和图6显示了脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Oxa)处理前后的样品中柚皮苷和柚皮素变化情况。由图5和图6可知，经过脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Oxa)处理后，样品中的柚皮苷信号峰都变成了柚皮素信号峰，这说明经过处理后，溶液中的柚皮苷都降解成了柚皮素。
实施例2与对比例9-11的转化率和转化比结果如表3所示。由表3可知四种方法的柚皮苷转化比都接近1，这说明四种降解方法中，降解的柚皮苷几乎都转化成了柚皮素。相较于其它三种酸基低共熔溶剂(Ch/Lev，Ch/Cit和Ch/Tar)，脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Oxa)柚皮苷转化率最高(99.95％)。这可能是由于Ch/Oxa相较于其它三种酸基低共熔溶剂其提供质子的能力更强所致。
表3.不同低共熔溶剂对脉冲电场转化柚皮苷的影响
表4.不同柚皮苷降解方法的转化率和转化比结果
实施例2与对比例12-16共六种柚皮苷降解方法的转化率和转化比结果如表2所示。六种柚皮苷降解方法的转化率和转化比结果如表4所示。由表4可知六种方法的柚皮苷转化比都接近1，这说明六种降解方法中，降解的柚皮苷几乎都转化成了柚皮素。六种方法中，脉冲电场与低共熔试剂(Ch/Oxa)协同的柚皮苷转化率最高(99.95％)。其中，脉冲电场联用酸水解法降解柚皮苷的效果最差，仅能使3.21％的柚皮苷转化为柚皮素，而水热联用低共熔试剂(Ch/Oxa)柚皮苷的转化率虽然较高(94.65％)但耗时长于脉冲电场联用Ch/Oxa(30min)，这说明脉冲电场与Ch/Oxa联用在转化柚皮苷上效果最好。降解同样体积浓度柚皮苷时，脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Oxa)处理时间最短，整个处理过程仅耗时6.1min，其处理时间要远低于水热联用酸水解法(4h)、纯酶法(8h)和全细胞法(48h)，其水解效率分别是这三种方法的39倍，78倍和472倍。此外，脉冲电场与Ch/Oxa联用处理过程中，相较于酶解法中所使用的糖苷酶(来源于黑曲霉，3333元/g)，本方法中使用的草酸和氯化胆碱价格低至0.212元/g和0.176元/g(数据来源于sigma试剂公司官网：https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh)，成本低廉。并且该方法在处理过程中不需要使用酸性有机溶剂，所使用的低共熔溶剂还能够回收再利用，减少了酸性有机废液的产生对环境较为友好。
实施例3
一种脉冲电场与低共熔试剂协同降解柚皮苷制备柚皮素的方法，包括如下步骤：
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和草酸按照摩尔比1.4:1混合，随后置于95℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Oxa，将Ch/Oxa配置成100％体积浓度的反应液备用。
脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Oxa)降解柚皮苷：将20mg柚皮苷标准品溶于20mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入脉冲处理室中进行处理，处理条件为脉冲次数为3000次，脉冲频率为10Hz，处理场强为3.0kV/cm，处理脉宽为50μs。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定柚皮苷和柚皮素含量变化情况。
脉冲电场处理时间＝处理次数/频率，通过计算脉冲电场处理总时间为5分钟。
分离样品与回收低共熔试剂：往脉冲电场处理过后的低共熔试剂样品中加入11倍体积的超纯水，随后在4℃低温下冷藏5小时。将沉淀离心分离，用超纯水洗涤三次后冻干得到柚皮素。收集离心分离后的液体，倒入旋转蒸发装置，55℃温度下旋转蒸发分离混合液中水分。直至混合液中水分全部蒸干分离后，收集的高黏度组分即为回收成功的低共熔试剂组分。
对比例17
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和柠檬酸按照摩尔比1:1混合，随后置于85℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Cit，加入超纯水将低共熔试剂Ch/Cit配置成100％体积浓度的反应液备用。
脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Cit)降解柚皮苷：将20mg柚皮苷标准品溶于20mL配制好的低共熔试剂Ch/Cit中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入脉冲处理室中进行处理。处理条件为脉冲次数为3000次，脉冲频率为10Hz，处理场强为3.0kV/cm，处理脉宽为50μs。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定柚皮苷和柚皮素含量变化情况。
脉冲电场处理时间＝处理次数/频率，通过计算脉冲电场处理总时间为5分钟。
对比例18
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和乙酰丙酸按照摩尔比1:1混合，随后置于85℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Lev，加入超纯水将低共熔试剂Ch/Lev配置成100％体积浓度的反应液备用。
脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Lev)降解柚皮苷：将20mg柚皮苷标准品溶于20mL配制好的低共熔试剂Ch/Lev中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入脉冲处理室中进行处理。处理条件为脉冲次数为3000次，脉冲频率为10Hz，处理场强为3.0kV/cm，处理脉宽为50μs。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定柚皮苷和柚皮素含量变化情况。
脉冲电场处理时间＝处理次数/频率，通过计算脉冲电场处理总时间为5分钟。
对比例19
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和酒石酸按照摩尔比1:1混合，随后置于85℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Tar，加入超纯水将低共熔试剂Ch/Tar配置成100％体积浓度的反应液备用。
脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Tar)降解柚皮苷：将20mg柚皮苷标准品溶于20mL配制好的低共熔试剂Ch/Tar中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入脉冲处理室中进行处理。处理条件为脉冲次数为3000次，脉冲频率为10Hz，处理场强为3.0kV/cm，处理脉宽为50μs。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定柚皮苷和柚皮素含量变化情况。
脉冲电场处理时间＝处理次数/频率，通过计算脉冲电场处理总时间为5分钟。
对比例20
脉冲电场联用酸水解法水解柚皮苷：将20mg柚皮苷标准品溶于20mL含有2％H2SO4的甲醇溶液，随后置于处理室中进行处理。处理条件为脉冲次数为3000次，脉冲频率为10Hz，处理场强为3.0kV/cm，处理脉宽为50μs。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定柚皮苷和柚皮素含量变化情况。
脉冲电场处理时间＝处理次数/频率，通过计算脉冲电场处理总时间为5分钟。
对比例21
水热联用低共熔试剂水解柚皮苷：将20mg柚皮苷标准品溶于20mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入水浴锅中95℃加热处理30分钟，随后采用高效液相色谱法测定柚皮苷和柚皮素含量变化情况。
对比例22
水热联用酸水解法水解柚皮苷：将20mg柚皮苷标准品溶于20mL含有2％H2SO4的甲醇溶液，随后置于水浴锅中95℃加热处理4小时，随后采用高效液相色谱法测定柚皮苷和柚皮素含量变化情况。
对比例23
纯酶法水解柚皮苷：将20mg柚皮苷标准品和β-葡萄糖糖苷酶(来源于黑曲霉)溶于磷酸缓冲液-甲醇混合溶液(pH 6.0)，于37℃孵育8小时后，采用高效液相色谱法测定柚皮苷和柚皮素含量变化情况。
对比例24
全细胞法水解柚皮苷：将20mg柚皮苷标准品溶于20mL甲醇-柠檬酸混合溶液(柠檬酸体积浓度0.2mol/L，pH为3.0)，混合均匀后，加入黑曲霉细胞GIM 3.25(广东省微生物研究所)，35℃振荡速率60r/min条件下孵育催化48小时后，采用高效液相色谱法测定柚皮苷和柚皮素含量变化情况。
柚皮苷的转化情况和柚皮素的生成情况采用高效液相色谱法进行检测。吸取样品100μL(与900μL色谱级甲醇混匀后，过0.45μm尼龙膜后备用。检测设备为安捷伦1260Infinity高效液相色谱仪，色谱柱型号为Thermo Accucore XL C18(250mm×4.6mm,4μm)，0.2％乙酸水和乙腈作为检测流动相。检测程序为：0.00-2.00min,B:5-5％,2.00-10.00min,B:5-30％,10.00-12.00min,B:30-100％,12.00-18.00min,B:100-100％,18.00-20.00min,B:100-5％,20.00-25.00min,B:5-5％。流速为0.8mL/min，检测波长为210nm，检测温度为25℃。柚皮苷降解为柚皮素的效率用转化率和转化比两个指标来评价。
柚皮苷转化率(％)＝消耗的柚皮苷质量/柚皮苷总质量×100
柚皮苷转化比＝消耗柚皮苷的摩尔质量/生成柚皮素的摩尔质量
图7是本发明实施例3中柚皮苷未处理前的色谱峰图。图8是本发明实施例3中柚皮苷经过脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Oxa)处理后的色谱峰图。对比图2的柚皮苷和柚皮素的标准品液相色谱图，可以标定实施例中柚皮苷和柚皮素在液相色谱中的出峰位置。图7和图8显示了脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Oxa)处理前后的样品中柚皮苷和柚皮素变化情况。由图7和图8可知，经过脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Oxa)处理后，样品中的柚皮苷信号峰都变成了柚皮素信号峰，这说明经过处理后，溶液中的柚皮苷都降解成了柚皮素。
实施例3与对比例17-19的转化率和转化比结果如表5所示。由表5可知四种方法的柚皮苷转化比都接近1，这说明四种降解方法中，降解的柚皮苷几乎都转化成了柚皮素。相较于其它三种酸基低共熔溶剂(Ch/Lev，Ch/Cit和Ch/Tar)，脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Oxa)柚皮苷转化率最高(99.98％)。这可能是由于Ch/Oxa相较于其它三种酸基低共熔溶剂其提供质子的能力更强所致。
表5.不同低共熔溶剂对脉冲电场转化柚皮苷的影响
实施例3与对比例20-24共六种柚皮苷降解方法的转化率和转化比结果如表2所示。六种柚皮苷降解方法的转化率和转化比结果如表6所示。由表6可知六种方法的柚皮苷转化比都接近1，这说明四种降解方法中，降解的柚皮苷几乎都转化成了柚皮素。六种方法中，脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Oxa)柚皮苷转化率最高(99.98％)。其中，脉冲电场联用酸水解法降解柚皮苷的效果最差，仅能使2.95％的柚皮苷转化为柚皮素，而水热联用低共熔试剂(Ch/Oxa)柚皮苷的转化率虽然较高(96.77％)但耗时长于脉冲电场联用Ch/Oxa(30min)，这说明脉冲电场与Ch/Oxa联用在转化柚皮苷上效果最好。降解同样体积浓度柚皮苷时，脉冲电场与低共熔试剂联用(Ch/Oxa)处理时间最短，整个处理过程仅耗时5min，其处理时间要远低于水热联用酸水解法(4h)、纯酶法(8h)和全细胞法(48h)，其水解效率分别是这三种方法的48倍，96倍和576倍。此外，脉冲电场与Ch/Oxa联用处理过程中，相较于酶解法中所使用的糖苷酶(来源于黑曲霉，3333元/g)，本方法中使用的草酸和氯化胆碱价格低至0.212元/g和0.176元/g(数据来源于sigma试剂公司官网：https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh)，成本低廉。并且该方法在处理过程中不需要使用酸性有机溶剂，所使用的低共熔溶剂还能够回收再利用，减少了酸性有机废液的产生对环境较为友好。
表6.不同柚皮苷降解方法的转化率和转化比结果
Claims (10)
1.脉冲电场与低共熔试剂协同降解柚皮苷制备柚皮素的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)将氯化胆碱和草酸按照摩尔比混合，搅拌至形成澄清透明的低共熔试剂；
2)将柚皮苷溶解于低共熔试剂后混匀；
3)将溶解了柚皮苷的低共熔试剂放入脉冲电场设备中处理，脉冲频率为5-10Hz，处理场强为2-3kV/cm，处理脉宽为40-50μs；
4)加入超纯水，冷藏；将离心分离，洗涤后冻干，得柚皮素。
2.根据权利要求1所述的脉冲电场与低共熔试剂协同降解柚皮苷制备柚皮素的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的氯化胆碱和草酸摩尔比为1:1-1.4:1。
3.根据权利要求1所述的脉冲电场与低共熔试剂协同降解柚皮苷制备柚皮素的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的搅拌在85-95℃水浴中进行；所述的低共熔试剂还包括用超纯水稀释。
4.根据权利要求3所述的脉冲电场与低共熔试剂协同降解柚皮苷制备柚皮素的方法，其特征在于，所述的超纯水稀释至低共熔试剂占溶液体积的97％-100％。
5.根据权利要求1所述的脉冲电场与低共熔试剂协同降解柚皮苷制备柚皮素的方法，其特征在于，步骤3)中，所述的溶解了柚皮苷的低共熔试剂放入脉冲电场设备中处理的次数为2500-3000次。
6.根据权利要求1所述的脉冲电场与低共熔试剂协同降解柚皮苷制备柚皮素的方法，其特征在于，步骤4)中，所述的超纯水加入量为低共熔试剂体积的10-12倍。
7.根据权利要求1所述的脉冲电场与低共熔试剂协同降解柚皮苷制备柚皮素的方法，其特征在于，步骤4)中，所述的冷藏温度为2-4℃，冷藏时间为3-5小时。
8.根据权利要求1所述的脉冲电场与低共熔试剂协同降解柚皮苷制备柚皮素的方法，其特征在于，步骤4)中，所述的洗涤使用超纯水进行，洗涤的次数为3-5次。
9.根据权利要求1所述的脉冲电场结合低共熔试剂降解柚皮苷制备柚皮素的方法，其特征在于，步骤4)中，通过离心分离回收低共熔试剂。
10.根据权利要求9所述的脉冲电场与低共熔试剂协同降解柚皮苷制备柚皮素的方法，其特征在于，所述的回收低共熔试剂是收集离心分离后的液体，倒入旋转蒸发装置，50-55℃温度下旋转蒸发出水分；直至混合液中水分全部蒸干，收集的高黏度组分为回收成功的低共熔试剂组分。
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