KR102133062B1 - 합성가스 발효 방법 및 배지 - Google Patents

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Abstract

합성가스 발효 방법 및 발효 배지는 이전에 필수적인 것으로 여겨졌던 배지 성분을 제거하면서 높은 에탄올 생산성을 제공한다. 상기 방법은 적어도 약 1 g 에탄올/(L·일·그램 세포) 의 비 STY 를 제공하는데 효과적이다. 이 양태에서, 발효 배지는 약 1.04 ppm 미만의 붕소, 약 0.16 ppm 미만의 망간, 약 0.26 ppm 미만의 몰리브덴, 또는 약 0.16 ppm 미만의 구리를 가진다.

Description

합성가스 발효 방법 및 배지 {SYNGAS FERMENTATION PROCESS AND MEDIUM}
본 출원은 2012 년 5 월 22 일자로 출원된 미국 가출원 번호 61/650,098, 61/650,093, 61/650,077, 61/650,084 및 2012 년 11 월 14 일자로 출원된 미국 가출원 번호 61/726,225 에 대해 우선권을 주장하며 이는 모두 본원에 전체 내용이 참조로 포함된다.
합성가스의 발효에 관한 방법 및 배지가 제공된다. 보다 구체적으로는, 이전에 필수적이거나 또는 특정한 농도 수준으로 요구된다고 여겨졌던 성분의 제거 또는 농도 저하 후에도 높은 수준의 에탄올 생산성을 제공하는 방법 및 배지가 제공된다.
발효는 한정된 액체 배지에서 일어난다. 이들 배지는 통상 발효 성능을 개선시키는데 있어서 중요한 각종 매크로- 및 마이크로-영양소 공급원을 포함하는 것이다. 기체상 기질 등 일반적이지 않은 기질과 관련하여 사용되는 배지는, 성능을 최적화시키기 위해 잘 한정된 배지를 필요로 한다. 혐기성 발효 역시 잘 한정된 배지를 필요로 한다.
혐기성 미생물은 기체상 기질의 발효를 통해 일산화탄소 (CO) 로부터 에탄올을 생성시킬 수 있다. 클로스트리디움 (Clostridium) 속으로부터의 혐기성 미생물을 사용하는 발효로, 에탄올 및 기타 유용한 생성물이 제조된다. 예컨대, 미국특허 제 5,173,429 호는 합성 가스로부터 에탄올 및 아세테이트를 생성하는 혐기성 미생물인 클로스트리디움 융달리 (Clostridium ljungdahlii) ATCC No. 49587 을 기재하고 있다. 미국특허 제 5,807,722 호는 클로스트리디움 융달리 ATCC No. 55380 을 이용하여 폐가스를 유기산과 알코올로 전환시키는 방법 및 장치를 기재하고 있다. 미국특허 제 6,136,577 호는 클로스트리디움 융달리 ATCC No. 55988 및 55989 를 이용하여 폐가스를 에탄올로 전환시키는 방법 및 장치를 기재하고 있다.
미국 특허 제 7,285,402 호는 에탄올을 생성하는 기체상 기질의 혐기성 발효에서 사용하기 위해 공지된 배지를 기재하고 있다. 배지 내 각종 성분 및 성분 농축물은 높은 수준의 에탄올 생산성을 제공하는데 효과적이다. 에탄올 생산성을 유지하면서 특정 성분을 없애고 기타 성분의 요구 농도 수준을 저하시키면 특히 상업적 규모 발효에서 현저한 비용 절감을 제공할 수 있다.
개요
합성가스 발효 방법 및 발효 배지는 이전에 필수적인 것으로 생각되었던 배지 성분을 제거하면서 높은 에탄올 생산성을 제공한다. 특정 배지 성분의 제거 및 다른 배지 성분의 농도 저하는 상업적 규모에서 현저한 조업 비용 절감을 제공한다.
한 양태에서, 발효 방법은 발효 배지 중에서의 합성가스의 발효를 포함한다. 상기 방법은 적어도 약 1 g 에탄올/(L·일·그램 세포) 의 비 STY (specific STY) 를 제공하는데 효과적이다. 상기 양태에서, 발효 배지는 약 1.04 ppm 미만의 붕소, 약 0.16 ppm 미만의 망간, 약 0.26 ppm 미만의 몰리브덴, 또는 약 0.16 ppm 미만의 구리를 가진다.
또다른 양태에서, 발효 배지는 생성된 세포 1 그램 당 적어도 약 112 mg 의 질소, 생성된 세포 1 그램 당 적어도 약 10.5 mg 의 인, 또는 생성된 세포 1 그램 당 적어도 약 26 mg 의 칼륨을 포함한다. 또다른 양태에서, 발효 배지는 약 1.04 ppm 미만의 붕소, 약 0.16 ppm 미만의 망간, 약 0.26 ppm 미만의 몰리브덴, 또는 약 0.16 ppm 미만의 구리를 가진다.
또다른 양태에서, 발효 방법은 발효 배지 중에서의 합성가스의 발효를 포함한다. 상기 방법은 적어도 약 1 g 에탄올/(L·일·그램 세포) 의 비 STY 를 제공하는데 효과적이다. 발효 배지는 약 625:1 이상의 NH4 + 대 B 의 중량비, 또는 약 4050:1 이상의 NH4 + 대 Mn 의 중량비, 또는 약 2500:1 이상의 NH4 + 대 Mo 의 중량비, 또는 약 4050:1 이상의 NH4 + 대 Cu 의 중량비를 갖거나; 또는 발효 배지는 약 30:1 이상의 P 대 B 의 중량비, 또는 약 190:1 이상의 P 대 Mn 의 중량비, 또는 약 120:1 이상의 P 대 Mo 의 중량비, 또는 약 190:1 이상의 Mn 대 Cu 의 중량비를 갖거나; 또는 발효 배지는 약 35:1 이상의 K 대 B 의 중량비, 또는 약 245:1 이상의 K 대 Mn 의 중량비, 또는 약 150:1 이상의 K 대 Mo 의 중량비, 또는 약 245:1 이상의 K 대 Cu 의 중량비를 가진다.
상세한 설명
이하의 설명은 제한적인 의미로 여겨지지 않으며 예시 양태의 일반적인 원리를 기술하기 위한 것일 뿐이다. 본 발명의 범위는 청구범위를 참조하여 결정되어야만 한다.
놀랍고 예상치 않게, 이전에는 필수적이거나 특정 농도 수준으로 요구된다고 생각되었던 성분 1 종 이상을 제거 또는 농도 저하시킨 후에도 고수준의 에탄올 생산성을 제공하는 방법 및 배지 조성물이 제공된다. 이 양태에서, 배지는 B, Mn, Mo, 및 Cu 를 포함하는 하나 이상의 영양소의 농도 수준이 저하될 수 있다. 배지 중 영양소 농도는 다음과 같을 수 있다:
B: 약 1.04 ppm 미만의 B, 또다른 양태에서, 약 1.0 ppm 미만의 B, 또다른 양태에서, 약 0.75 ppm 미만의 B, 또다른 양태에서, 약 0.5 ppm 미만의 B, 및 또다른 양태에서, 약 0.025 ppm 미만의 B;
Mn: 약 0.16 ppm 미만의 Mn, 또다른 양태에서, 약 0.15 ppm 미만의 Mn, 또다른 양태에서, 약 0.10 ppm 미만의 Mn, 또다른 양태에서, 약 0.05 ppm 미만의 Mn, 및 또다른 양태에서, 약 0.0025 ppm 미만의 Mn;
Mo: 약 0.26 ppm 미만의 Mo, 또다른 양태에서, 약 0.25 ppm 미만의 Mo, 또다른 양태에서, 약 0.20 ppm 미만의 Mo, 또다른 양태에서, 약 0.10 ppm 미만의 Mo, 및 또다른 양태에서, 약 0.001 ppm 미만의 Mo; 또는
Cu: 약 0.16 ppm 미만의 Cu, 또다른 양태에서, 약 0.15 ppm 미만의 Cu, 또다른 양태에서, 약 0.10 ppm 미만의 B, 또다른 양태에서, 약 0.05 ppm 미만의 B, 및 또다른 양태에서, 약 0.01 ppm 미만의 B.
또다른 양태에서, 중량비는 다음과 같을 수 있다:
NH4 + 대 B: 약 625:1 이상, 또다른 양태에서, 약 650:1 이상, 또다른 양태에서, 약 675:1 이상, 또다른 양태에서, 약 700:1 이상, 또다른 양태에서, 약 750:1 이상, 및 또다른 양태에서, 약 800:1 이상; 또는
NH4 + 대 Mn: 약 4050:1 이상, 또다른 양태에서, 약 4100:1 이상, 또다른 양태에서, 약 4200:1 이상, 또다른 양태에서, 약 4300:1 이상, 또다른 양태에서, 약 4400:1 이상, 및 또다른 양태에서, 약 4500:1 이상; 또는
NH4 + 대 Mo: 약 2500:1 이상, 또다른 양태에서, 약 2600:1 이상, 또다른 양태에서, 약 2700:1 이상, 또다른 양태에서, 약 2800:1 이상, 또다른 양태에서, 약 2900:1 이상, 및 또다른 양태에서, 약 3000:1 이상; 또는
NH4 + 대 Cu: 약 4050:1 이상; 또다른 양태에서, 약 4100:1 이상, 또다른 양태에서, 약 4200:1 이상, 또다른 양태에서, 약 4300:1 이상, 또다른 양태에서, 약 4400:1 이상, 및 또다른 양태에서, 약 4500:1 이상; 또는
P 대 B: 약 30:1 이상, 또다른 양태에서, 약 35:1 이상, 또다른 양태에서, 약 40:1 이상, 또다른 양태에서, 약 45:1 이상, 또다른 양태에서, 약 50:1 이상, 및 또다른 양태에서, 약 100:1 이상; 또는
P 대 Mn: 약 190:1 이상, 또다른 양태에서, 약 200:1 이상, 또다른 양태에서, 약 225:1 이상, 또다른 양태에서, 약 250:1 이상, 또다른 양태에서, 약 275:1 이상, 및 또다른 양태에서, 약 300:1 이상; 또는
P 대 Mo: 약 120:1 이상, 또다른 양태에서, 약 130:1 이상, 또다른 양태에서, 약 140:1 이상, 또다른 양태에서, 약 150:1 이상, 또다른 양태에서, 약 175:1 이상, 및 또다른 양태에서, 약 200:1 이상; 또는
P 대 Cu: 약 190:1 이상; 또다른 양태에서, 약 200:1 이상, 또다른 양태에서, 약 225:1 이상, 또다른 양태에서, 약 250:1이상, 또다른 양태에서, 약 275:1 이상, 및 또다른 양태에서, 약 300:1 이상; 또는
K 대 B: 약 35:1 이상, 또다른 양태에서, 약 40:1 이상, 또다른 양태에서, 약 45:1 이상, 또다른 양태에서, 약 50:1 이상, 또다른 양태에서, 약 75:1 이상, 및 또다른 양태에서, 약 100:1 이상; 또는
K 대 Mn: 약 245:1 이상, 또다른 양태에서, 약 250:1 이상, 또다른 양태에서, 약 260:1 이상, 또다른 양태에서, 약 270:1 이상, 또다른 양태에서, 약 280:1 이상, 및 또다른 양태에서, 약 300:1 이상; 또는
K 대 Mo: 약 150:1 이상, 또다른 양태에서, 약 250:1 이상, 또다른 양태에서, 약 260:1 이상, 또다른 양태에서, 약 270:1 이상, 또다른 양태에서, 약 280:1 이상, 및 또다른 양태에서, 약 300:1 이상; 또는
K 대 Cu: 약 245:1 이상, 또다른 양태에서, 약 250:1 이상, 또다른 양태에서, 약 260:1 이상, 또다른 양태에서, 약 270:1 이상, 또다른 양태에서, 약 280:1 이상, 및 또다른 양태에서, 약 300:1 이상.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 개시를 위해 본 명세서 걸쳐 사용된 이하의 용어는 다음과 같이 정의되고, 이는 이하에 한정되는 정의의 단수 또는 복수 형태 중 하나를 포함할 수 있다:
임의의 양을 한정하는 용어 "약" 은 현실 세계 조건, 예컨대 실험실, 파일럿 플랜트, 또는 생산 설비에서 맞닥뜨리는 그 양의 변화를 가리킨다. 예컨대, 혼합물 또는 분량에서 이용된 성분의 양 또는 측정치가 "약" 으로 수식될 경우 생산 공장 또는 실험실의 실험 조건에서의 측정시 전형적으로 채용되는 변화 및 조심 정도를 포함한다. 예컨대, 생성물의 성분의 양이, "약" 으로 수식되면, 공장 또는 실험실에서의 복수의 실험의 배치 (batch) 들 사이의 변화 및 분석 방법에 내재하는 변화를 포함한다. "약" 에 의해 수식되었건 또는 수식되지 않았건, 양은 그 양의 등가물들을 포함한다. 본원에 명시되고 "약" 에 의해 수식된 임의의 양은 본 개시에서는 또한 "약" 에 의해 수식되지 않은 양으로서 채용될 수도 있다.
용어 "합성가스" 또는 "합성 기체"는 다양한 양의 일산화탄소 및 수소를 함유하는 가스 혼합물에 주어지는 명칭인 합성 기체인 것을 의미한다. 생성 방법의 예로는, 수소를 생성하기 위한 천연 가스 또는 탄화수소의 증기 개질, 석탄 및 몇몇 타입의 폐기물-에너지 (waste-to-energy) 가스화 설비에서 가스화를 포함한다. 그 명칭은 합성 천연 가스 (SNG) 의 생성시의 중간물로서 및 암모니아 또는 메탄올의 생성을 위한 그 용도로부터 유래한다. 합성가스는 연소가능하고, 연료 공급원으로서 또는 다른 화학물질의 생성을 위한 중간물로서 종종 사용된다.
용어 "발효", "발효 방법" 또는 "발효 반응" 등은 본 방법의 성장 단계 (phase) 및 생성물 생합성 단계 둘 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 한 양태에서, 발효는 CO 의 알코올로의 전환을 지칭한다.
용어 "세포 밀도" 는 발효 브로쓰 단위 부피 당 미생물 세포의 질량, 예를 들어 그램/리터를 의미한다. 이 양태에서, 당해 방법 및 배지는 약 1.0 g/L 이상의 세포 밀도를 제공하는데 효과적이다. 세포 밀도는 약 1 내지 약 25 g/L, 또다른 양태에서, 약 1 내지 약 20 g/L, 또다른 양태에서, 약 1 내지 약 10 g/L, 또다른 양태에서, 약 2 내지 약 8 g/L, 또다른 양태에서, 약 3 내지 약 6 g/L, 및 또다른 양태에서, 약 4 내지 약 5 g/L 일 수 있다.
용어 "세포 재순환" 은 발효 브로쓰로부터의 미생물 세포 분리 및 이들 분리된 미생물 세포를 전부 또는 일부 발효기로 되돌리는 것을 의미한다. 일반적으로, 여과 장치를 사용하여 분리를 수행한다.
배지 조성
본원에 기재된 방법 및 배지는 고수준의 생산성을 제공하는데 효과적이다. 이 양태에서, 방법은 적어도 약 1, 또다른 양태에서, 약 1 내지 약 10, 또다른 양태에서, 약 2 내지 약 8, 또다른 양태에서, 약 3 내지 약 7, 및 또다른 양태에서, 약 4 내지 약 6 의 비 (specific) STY (g 에탄올/(L·일·세포 그램) 으로 나타내는 비 공시 수율) 를 제공하는데 효과적이다.
관련 양태에서, 생산성은 g 에탄올/(L·일) 로 나타내는 STY (공시 수율) 로서 나타낼 수 있다. 이 양태에서, 방법은 적어도 10 g 에탄올/(L·일) 의 STY (공시 수율) 을 제공하는데 효과적이다. 가능한 STY 값으로는 약 10 g 에탄올/(L·일) 내지 약 200 g 에탄올/(L·일), 또다른 양태에서, 약 10 g 에탄올/(L·일) 내지 약 160 g 에탄올/(L·일), 또다른 양태에서, 약 10 g 에탄올/(L·일) 내지 약 120 g 에탄올/(L·일), 또다른 양태에서, 약 10 g 에탄올/(L·일) 내지 약 80 g 에탄올/(L·일), 또다른 양태에서, 약 20 g 에탄올/(L·일) 내지 약 140 g 에탄올/(L·일), 또다른 양태에서, 약 20 g 에탄올/(L·일) 내지 약 100 g 에탄올/(L·일), 또다른 양태에서, 약 40 g 에탄올/(L·일) 내지 약 140 g 에탄올/(L·일), 및 또다른 양태에서, 약 40 g 에탄올/(L·일) 내지 약 100 g 에탄올/(L·일) 을 포함한다.
또다른 양태에서, 방법 및 배지는 적어도 약 5% 내지 약 99%, 또다른 양태에서, 약 10% 내지 약 90%, 또다른 양태에서, 약 20% 내지 약 80%, 또다른 양태에서, 약 30% 내지 약 70%, 및 또다른 양태에서, 약 40% 내지 약 90% 의 CO 전환율을 제공하는데 효과적이다.
한 양태에서, 배지는 적어도 하나 이상의 질소 공급원, 적어도 하나 이상의 인 공급원 및 적어도 하나 이상의 칼륨 공급원을 포함한다. 배지는 상기 3 가지 중 어느 하나, 3 가지의 임의의 조합을 포함할 수 있으며, 중요 양태에서는, 3 가지를 모두 포함한다. 질소 공급원은 염화암모늄, 인산암모늄, 황산암모늄, 질산암모늄, 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 질소 공급원을 포함할 수 있다. 인 공급원은 인산, 인산암모늄, 인산칼륨, 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 인 공급원을 포함할 수 있다. 칼륨 공급원은 염화칼륨, 인산칼륨, 질산칼륨, 황산칼륨, 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 칼륨 공급원을 포함할 수 있다.
한 양태에서, 배지는 철, 텅스텐, 니켈, 코발트, 마그네슘, 황 및 티아민 중 하나 이상을 포함한다. 배지는 이들 성분 중 어느 하나, 임의의 조합을 포함할 수 있고, 중요 양태에서는, 이들 성분을 모두 포함한다. 철은 염화제1철, 황산제1철, 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 철 공급원을 포함할 수 있다. 텅스텐 공급원은 텅스텐산나트륨, 텅스텐산칼슘, 텅스텐산칼륨, 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 텅스텐 공급원을 포함할 수 있다. 니켈 공급원은 염화니켈, 황산니켈, 질산니켈, 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 니켈 공급원을 포함할 수 있다. 코발트 공급원은 염화코발트, 불화코발트, 브롬화코발트, 요오드화코발트 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 코발트 공급원을 포함할 수 있다. 마그네슘 공급원은 염화마그네슘, 황산마그네슘, 인산마그네슘, 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 마그네슘 공급원을 포함할 수 있다. 황 공급원은 시스테인, 황화나트륨, 및 그 혼합물을 포함할 수 있다.
각종 성분의 농도는 다음과 같다:
Figure 112014124359485-pct00001
공정 조작은 pH 를 약 4.2 내지 약 4.8 범위에서 유지시킨다. 배지는 약 0.01 g/L 미만의 효모 추출물 및 약 0.01 g/L 미만의 탄수화물을 포함한다.
합성가스
합성가스는 임의의 공지 공급원으로부터 제공될 수 있다. 한 양태에서, 합성가스는 탄소질 재료의 가스화로부터 유래할 수 있다. 가스화는 산소의 제한적인 공급 하의 바이오매스의 부분 연소와 연관되어 있다. 수득한 가스는 주로 CO 및 H2 를 포함한다. 이 양태에서, 합성가스는 약 10 몰% 이상의 CO, 한 양태에서, 약 20 몰% 이상, 한 양태에서, 약 10 내지 약 100 몰%, 또다른 양태에서, 약 20 내지 약 100 몰% CO, 또다른 양태에서, 약 30 내지 약 90 몰% CO, 또다른 양태에서, 약 40 내지 약 80 몰% CO, 및 또다른 양태에서, 약 50 내지 약 70 몰% CO 를 함유할 것이다. 합성가스는 CO/CO2 비가 약 0.75 이상, 또다른 양태에서, 약 1.0 이상, 및 또다른 양태에서, 약 1.5 이상이다. 적절한 가스화 방법 및 장치의 일부예가 미국 특허출원 일련 번호 13/427,144, 13/427,193 및 13/427,247 에 제시되어 있으며, 이는 모두 2012 년 3 월 22 일자로 출원된 것으로 모두 본원에서 참조로 인용된다.
또다른 양태에서, 초산생성균을 증식시키는데 이용된 합성가스는 실질적으로 CO 일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "실질적으로 CO" 란 약 50 몰% 이상의 CO, 또다른 양태에서, 약 60 몰% 이상의 CO, 또다른 양태에서, 약 70 몰% 이상의 CO, 또다른 양태에서, 약 80 몰% 이상의 CO, 및 또다른 양태에서, 약 90 몰% 이상의 CO 를 의미한다.
생물반응기 조작
한 양태에 따르면, 발효 방법은 반응기 용기에 배지를 첨가함으로써 개시된다. 배지는 원치않는 미생물을 제거하기 위해 멸균처리되고, 반응기는 원하는 미생물로 접종된다. 한 양태에서, 이용된 미생물로는 초산생성균을 포함한다. 유용한 초산생성균의 예로는 클로스트리디움 (Clostridium) 속의 것들, 예컨대 WO 2000/68407, EP 117309, 미국 특허 제 5,173,429, 5,593,886 및 6,368,819 호, WO 1998/00558 및 WO 2002/08438 에서 기재된 것들을 포함하는 클로스트리디움 융달리 (Clostridium ljungdahlii) 의 균주, WO 2007/117157 및 WO 2009/151342 에서 기재된 것들을 포함하는 클로스트리디움 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum) (DSMZ, Germany 의 DSM 10061 및 DSM 19630) 의 균주 및 각각 미국 특허 제 7,704,723 호 및 ["Biofuels and Bioproducts from Biomass-Generated Synthesis Gas", Hasan Atiyeh, presented in Oklahoma EPSCoR Annual State Conference, April 29, 2010] 에서 기재된 것들을 포함하는 클로스트리디움 라그스달레이 (Clostridium ragsdalei) (P11, ATCC BAA-622) 및 알칼리바쿨룸 바치 (Alkalibaculum bacchi) (CP11, ATCC BAA-1772) 및 미국 특허 출원 번호 2007/0276447 에서 기재된 클로스트리디움 카르복시디보란스 (Clostridium carboxidivorans) (ATCC PTA-7827) 를 포함한다. 기타 적합한 미생물은 무렐라 (Moorella) 종 HUC22-1 을 포함하는 무렐라 속의 것들, 및 카르복시도테르무스 (Carboxydothermus) 속의 것들을 포함한다. 이들 각 참고문헌은 본원에 참조로 포함된다. 둘 이상의 미생물의 혼합 배양물을 사용할 수 있다.
유용한 균의 일부 예는 아세토게늄 키부이 (Acetogenium kivui), 아세토아나에로비움 노테라에 (Acetoanaerobium noterae), 아세토박테리움 우디 (Acetobacterium woodii), 알칼리바쿨룸 바치 (Alkalibaculum bacchi) CP11 (ATCC BAA-1772), 블라우티아 프로둑타 (Blautia producta), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰 (Butyribacterium methylotrophicum), 칼다나에로박테르 서브테라네우스 (Caldanaerobacter subterraneous), 칼다나에로박테르 서브테라네우스 파시피쿠스 (Caldanaerobacter subterraneous pacificus), 카르복시도테르무스 히드로게노포르만스 (Carboxydothermus hydrogenoformans), 클로스트리디움 아세티쿰 (Clostridium aceticum), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 P262 (DSMZ Germany 의 DSM 19630), 클로스트리디움 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum) (DSMZ Germany 의 DSM 19630), 클로스트리디움 오토에타노게눔 (DSMZ Germany 의 DSM 10061), 클로스트리디움 오토에타노게눔 (DSMZ Germany 의 DSM 23693), 클로스트리디움 오토에타노게눔 (DSMZ Germany 의 DSM 24138), 클로스트리디움 카르복시디보란스 (Clostridium carboxidivorans) P7 (ATCC PTA-7827), 클로스트리디움 코스카티 (Clostridium coskatii) (ATCC PTA-10522), 클로스트리디움 드라케이 (Clostridium drakei), 클로스트리디움 융달리 PETC (ATCC 49587), 클로스트리디움 융달리 ERI2 (ATCC 55380), 클로스트리디움 융달리 C-01 (ATCC 55988), 클로스트리디움 융달리 O-52 (ATCC 55889), 클로스트리디움 마그눔 (Clostridium magnum), 클로스트리디움 파스튜리아눔 (Clostridium pasteurianum) (DSMZ Germany 의 DSM 525), 클로스트리디움 라그스달리 (Clostridium ragsdali) P11 (ATCC BAA-622), 클로스트리디움 스카톨로게네스 (Clostridium scatologenes), 클로스트리디움 테르모아세티쿰 (Clostridium thermoaceticum), 클로스트리디움 울투넨세 (Clostridium ultunense), 데술포토마쿨룸 쿠즈네초비 (Desulfotomaculum kuznetsovii), 유박테리움 리모숨 (Eubacterium limosum), 제오박테르 술푸레두센스 (Geobacter sulfurreducens), 메타노사르시나 아세티보란스 (Methanosarcina acetivorans), 메타노사르시나 바르케리 (Methanosarcina barkeri), 무렐라 테르모아세티카 (Moorella thermoacetica), 무렐라 테르모오토트로피카 (Moorella thermoautotrophica), 옥소박테르 프펜니지 (Oxobacter pfennigii), 펩토스트렙토코쿠스 프로둑투스 (Peptostreptococcus productus), 루미노코쿠스 프로둑투스 (Ruminococcus productus), 테르모아나에로박테르 키부이 (Thermoanaerobacter kivui), 및 이의 혼합물을 포함한다.
접종시, 초기 주입 가스 공급율은 미생물의 초기 개체군의 공급에 유효하도록 성립된다. 유출 가스를 분석하여 유출 가스 함량을 구한다. 가스 분석 결과를 이용하여 주입 가스율을 제어한다. 원하는 수준에 도달하게 되면, 액상과 세포 물질을 반응기로부터 취출하고 배지로 다시 채운다. 이 양태에서, 생물반응기는 적어도 약 2 그램/리터, 및 또다른 양태에서, 약 2 내지 약 50 그램/리터, 각종 다른 양태에서, 약 5 내지 약 40 그램/리터, 약 5 내지 약 30 그램/리터, 약 5 내지 약 20 그램/리터, 약 5 내지 약 15 그램/리터, 약 10 내지 약 40 그램/리터, 약 10 내지 약 30 그램/리터, 약 10 내지 약 20 그램/리터, 및 약 10 내지 약 15 그램/리터의 세포 밀도를 유지하도록 조작된다. 세포 밀도는 재순환 필터를 통해 제어될 수 있다. 생물반응기 조작에 관한 추가 설명은 미국 가출원 번호 61/571,564 (2011 년 6 월 30 일자로 제출), 미국 가출원 번호 61/571,565 (2011 년 6 월 30 일자로 제출), 및 미국 가출원 번호 61/573,845 (2011 년 9 월 13 일 자로 제출) 에 개시되어 있으며, 이들은 모두 본원에 참조로 인용된다.
실시예
실시예 1: 붕소, 구리 및 망간 제한에 의한 발효
실험은 투과물 퍼지 없이 CSTR 을 통해 직렬로 조작되는 생물반응기 (New Brunswick BioFlo I 또는 IIc) 에서 실시했다. 생물반응기 조작 조건은 다음과 같았다:
배양물 유형은 클로스트리디움 융달리 (Clostridium ljungdahlii) C01 이었다.
배양물 온도는 38-39 ℃ 로 유지되었다.
교반은 아날로그 판독으로 850 rpm 이었다.
미분기된 (unroused) 배양물 체적은 ~1600-1650 ml 이었다.
배양물 pH 설정치는 4.5 이었다. 7.7% NaHCO3 의 용액을 사용하여 pH 조절하였다.
주입 가스는 15% H2, 45% N2, 30% CO 및 10% CO2 의 합성 배합물이고, 282 ml/분의 속도로 배양물에 주입되었다.
배지는 ~0.88 ml/분, 또는 ~1300 ml/일로 반응기에 주입되었다.
액체 및 세포 유지 시간은 대략 29-31 시간이었다.
사용된 출발 배지는 이하에 기재하는 바와 같았다.
Figure 112014124359485-pct00002
생물반응기는 배양물이 높은 생산성 정상 상태 (steady state) 를 얻을 때까지 작동되었다. 높은 생산성 정상 상태는 ~2.5-3 g/L 세포 밀도, 에탄올 농도 >20 g/L, CO 흡수 >3.0 mmol/분, 및 수소 흡수 >0.5 mmol/분으로서 정의되었다. 높은 생산성 정상 상태를 얻는 공정에서, CaCl2·2H2O 의 농도는 0 으로 저하되고, 암모늄 농도는 546 ppm 으로 낮아졌다.
배양물이 높은 생산성 정상 상태에 있게 되면, B, Mn 및 Cu 공급원을 배지 제제로부터 제거하였다. 상기 성분 제거 바로 전, 배양 조건/파라미터는 다음과 같았다:
세포 밀도 - 2.9 g/L
CO 전환율 - 86%
H2 전환율 - 32%
CO 흡수 - 3.0 mmol/분
H2 흡수 - 0.54 mmol/분
에탄올 - 21.8 g/L
전체 아세틸 - 2.7 g/L
부탄올 - 0.35 g/L
이후, 가스 흡수, H2 및 CO, 생성물 농도 및 세포 밀도의 배양 파라미터를 임의 악영향에 대해 모니터링하였다. B, Cu 및 Mn 의 제거가 여러 (>3) 세포 유지 시간 후에 상기 파라미터에 영향을 미치지 않는다면 이들은 배양물에 불필요한 것으로 여겨졌다.
~5.7 세포 유지 시간 (170 시간) 후, 배양 브로쓰 중의 붕소, 구리 및 망간 농도는 초기 농도의 ~0.41% 로 떨어졌다 (1.05 ppm B, 0.149 ppm Cu 및 1.67 ppm Mn 으로부터 0.0043 ppm B, 0.0006 ppm Cu, 및 0.0068 ppm Mn 으로 낮아짐). 브로쓰 중의 추정 잔여 성분 농도는, 출발 칼슘 농도, MFR, LRT 및 배지 또는 스파이크 중 하나를 통해 이들 성분을 생물반응기 내에 첨가하는 것을 이용하여 워시아웃 (washout) 계산에 의해 구하였다. 배양물 성능에는 어떠한 악영향도 없었다.
붕소, 구리 및 망간 첨가 없이 170 시간 후, 배양 파라미터/조건은 다음과 같았다:
세포 밀도 - 2.9 g/L
CO 전환율 - 86%
H2 전환율 - 36%
CO 흡수 - 3.0 mmol/분
H2 흡수 - 0.61 mmol/분
에탄올 - 21.0 g/L
전체 아세틸 - 2.9 g/L
부탄올 - 0.32 g/L
실시예 2: 코발트 제한에 의한 발효
실험은 세포 재순환 루프 없이 CSTR 을 통해 직렬로 조작되는 생물반응기 (New Brunswick BioFlo I 또는 IIc) 에서 실시했다. 생물반응기 조작 조건은 다음과 같았다:
배양물 유형은 클로스트리디움 융달리 (Clostridium ljungdahlii) C01 이었다.
배양물 온도는 37-39 ℃ 로 유지되었다.
교반은 아날로그 판독으로 850 rpm 이었다 (실제 교반은 타코미터 보정 곡선에 근거하여 931 rpm 이었다).
미분기된 배양물 체적은 ~1600-1650 ml 이었다.
분기된 배양물 체적은 ~1950 ml 이었다.
배양물 pH 설정치는 4.5 이었다. 7.7% NaHCO3 의 용액을 사용하여 pH 조절하였다.
주입 가스는 15% H2, 45% N2, 30% CO 및 10% CO2 의 합성 배합물이고, 286 ml/분의 속도로 배양물에 주입되었다.
배지는 ~0.83 내지 ~0.86 ml/분, 또는 ~1220 ml/일로 반응기에 주입되었다.
액체 및 세포 유지 시간은 대략 31-33 시간이었다.
사용된 배지는 이하에 기재하는 바와 같았다.
Figure 112014124359485-pct00003
생물반응기는 배양물이 높은 생산성 정상 상태를 얻을 때까지 작동되었다. 높은 생산성 정상 상태는 ~2.5-3 g/L 세포 밀도, 에탄올 농도 >20 g/L, CO 흡수 >3.0 mmol/분, 및 수소 흡수 >0.5 mmol/분으로서 정의되었다.
이후, 가스 흡수, H2 및 CO, 생성물 농도 및 세포 밀도의 배양 파라미터를 임의 악영향에 대해 모니터링하였다. 성분 농도 저하가 여러 (>3) 세포 유지 시간 후에 상기 파라미터에 영향을 미치지 않는다면 그 농도는 추가로 저하되지 않게 된다. 성분 농도 저하 후 배양 파라미터의 강하가 보여졌다면, 그 농도는 이전에 적절한 것으로 제시되었던 수준으로 다시 높아지게 될 것이다. 배양물이 회수되었다면, 농도가 때로는 영향을 반복하기 전과 동일 수준으로, 때로는 작동하는 수준과 문제를 일으키는 수준 사이의 어느 수준으로 다시 낮아지게 될 것이다.
실험 개시시 코발트 농도는 보통의 배지 수준 또는 0.991 ppm 이었다. 배양 파라미터는 ~3 g/L 세포 밀도; 22-26 g/L 에탄올; 2.7-3.7 g/L 아세틸; 3.1 mmol/분 CO 흡수; 및 0.5-0.7 mmol/분 H2 흡수로 안정적이었다. 코발트를 배지로부터 제거하여 t = 0 시간에서 출발하였다. 코발트가 발효기에서 워시아웃될 때, 3.1 에서 2.9 mmol/분으로 CO 흡수의 약간의 감소만 있었다. 모든 다른 파라미터는 t = 121 시간까지 대략 일정하게 유지되었다. 그 때, H2 및 CO 흡수는 각각 0.16 및 2.6 mmol/분으로 떨어졌다. 전체 아세틸도 또한 그 때 0.77 g/L 로 재빨리 떨어졌으며 이는 코발트 농도가 제한 수준으로 또는 그 아래로 떨어졌음을 시사한다. 코발트 워시아웃 계산은, 낮은 코발트 수준이 배양 파라미터에 영향을 미치는 시점까지 반응기 내 코발트 농도가 0.0222 ppm 또는 원래 농도의 2.24% 로 떨어졌음을 보여주었다. 코발트를 오직 반응기에만 첨가하여, 그 농도를 보통 수준의 23.3% 로, 또는 0.231 ppm 으로 올렸다. 그 효과는 CO 흡수, H2 흡수 및 산 농도의 증가로서 즉각적으로 보여졌다. 이때는 코발트를 다시 배지에 첨가하지 않아 반응기 내 코발트를 한번 더 제한 수준으로 낮게 다시 워싱하였다. 앞서 알 수 있는 바와 같이, 배양 파라미터는 코발트가 0.0220 ppm 아래로 워싱될 때까지 문제의 징후를 계속 나타내지 않았다. t = 210 시간에서, H2 및 CO 흡수 뿐만 아니라 산 농도는 다시 한 번 모두 떨어졌으며, 이는 코발트 제한의 영향을 보여주는 것이다. 이때 코발트를 배지 중의 20% (0.198 ppm) 및 반응기 중의 21.2% (0.21 ppm) 으로 반응기 및 배지에 다시 첨가했다. 이전과 같이, 가스 흡수와 산 농도 둘 모두에서의 즉각적인 상승이 있었다.
상기 두 상이한 시점에서, 배양물이 문제의 징후를 보일 때까지 코발트를 반응기에서 워시아웃하였으며, 그 결과 배양물에 제한적인 ~0.022 ppm 의 코발트 농도가 얻어졌다. 코발트 농도가 이제 0.023 ppm 으로 설정되면, 배양은 악영향 없이 충분히 행해졌다. 그 코발트 농도를 기준으로, 배양 성능에 대비한 영양소 첨가를 보다 잘 연관시키는데 이용된 산출 파라미터는 다음과 같았다: 가스 흡수 1 mmol 당 첨가된 코발트의 mg 은 0.005 (mg/mmol) 이었다. 생성된 세포 1 그램 당 첨가된 코발트의 μg 은 ~9 (μg/g) 이었다.
코발트 제한으로부터의 회복은 악 영향을 지속하는 일 없이 신속하였다. 파라미터가 2 차적인 문제 정도로, 즉 가스 독성 또는 산의 부존재의 정도로 떨어지기 전에 코발트가 증가된 경우에는 배양물에 영구적 손상이 이루어졌다.
코발트 수준 강하는 세포 농도의 강하를 야기하였다. 코발트 제한과 부탄올 생성 사이의 명확한 상관관계는 없었다. CO 및 H2 전환율/흡수 둘 모두 코발트 제한에 의해 영향을 받았지만, 배양물 중의 코발트 농도가 ~0.022 ppm 이하로 떨어질 때까지 영향은 거의 보여지지 않았다. 가스 전환율에서의 점진적 저하는 없었다. 그러나, 일단 코발트 농도가 제한점을 지나 떨어지게 되면, CO 및 H2 전환율 모두 매우 빠르게 떨어졌다. CO 와 H2 전환율이 떨어지기 시작하면, 배양물은 임계 코발트 농도를 이미 지났으며, 배양물을 회수하기 위해서는 코발트가 신속하게 첨가되어야만 한다. 코발트 제한의 보다 빠른 지표는 생성물 비 측면에서 산으로부터 에탄올로의 이동이다. 가스 전환율 강하가 보여지지 전이라도 산 농도가 떨어지기 시작하였고 에탄올 농도가 증가하기 시작하였다.
실시예 3: 니켈 제한에 의한 발효
실험은 투과물 퍼지 없이 CSTR 을 통해 직렬로 조작되는 생물반응기 (New Brunswick BioFlo I 또는 IIc) 에서 실시했다. 생물반응기 조작 조건은 다음과 같았다:
배양물 유형은 클로스트리디움 융달리 (Clostridium ljungdahlii) C01 이었다.
배양물 온도는 37-39 ℃ 로 유지되었다.
교반은 아날로그 판독으로 700 rpm 이었다.
미분기된 배양물 체적은 ~1500-1650 ml 이었다.
분기된 배양물 체적은 ~1900 ml 이었다.
배양물 pH 설정치는 4.5 이었다. 7.7% NaHCO3 의 용액을 사용하여 pH 조절하였다.
주입 가스는 15% H2, 45% N2, 30% CO 및 10% CO2 의 합성 배합물이고, 290 ml/분의 속도로 배양물에 주입되었다.
배지는 ~0.86 내지 ~0.88 ml/분, 또는 ~1250 ml/일로 반응기에 주입되었다.
액체 및 세포 유지 시간은 대략 27-31 시간이었다.
사용된 배지는 이하에 기재하는 바와 같았다.
Figure 112014124359485-pct00004
생물반응기는 배양물이 높은 생산성 정상 상태를 얻을 때까지 작동되었다. 높은 생산성 정상 상태는 ~2.5-3 g/L 세포 밀도, 에탄올 농도 >20 g/L, CO 흡수 >3.0 mmol/분, 및 수소 흡수 >0.5 mmol/분으로서 정의되었다.
이후, 가스 흡수, H2 및 CO, 생성물 농도 및 세포 밀도의 배양 파라미터를 임의 악영향에 대해 모니터링하였다. 성분 농도 저하가 여러 (>3) 세포 유지 시간 후에 상기 파라미터에 영향을 미치지 않는다면 그 농도는 추가로 저하되지 않게 된다. 성분 농도 저하 후 배양 파라미터의 강하가 보여졌다면, 그 농도는 이전에 적절한 것으로 제시되었던 수준으로 다시 높아지게 될 것이다. 배양물이 회수되었다면, 그 농도는 때로는 영향을 반복하기 전과 동일 수준으로, 때로는 효과가 있는 수준과 문제를 일으키는 수준 사이의 어딘가의 수준으로 다시 낮아지게 될 것이다.
실험 개시시, 반응기 내 Ni 농도는 원래 Ni 수준의 56%, 또는 0.11 ppm 으로 떨어졌다. 반응기 내 니켈 농도는, 배지 중의 Ni 농도, 배지 및/또는 반응기로의 Ni 첨가, 및 시스템을 유통하는 액체 흐름을 이용한 "워시아웃" 산출을 기준으로 하며, 이로써 시간에 따른 반응기 내 Ni 농도 변화를 산출하였다. Ni 가 지속하여 반응기에서 워시아웃될 때 배양 파라미터는 변화하지 않았다. 세포 밀도는 ~2.8 g/L 을 유지하였고; CO 흡수는 ~3.2 mmol/분이었고; H2 흡수는 ~0.7 mmol/분이었고; 에탄올 농도는 24 g/L 이었고; 및 전체 아세틸 수준은 ~2.5g/L 이었다. 그러나, 약 t = 107 시간까지, 세포 모폴로지가 악화되기 시작하였다. 기다란 세포의 백분율은 ~5% 로부터 5-10% 로 증가하였고, 기다란 세포의 길이는 증가하였다. 기다란 세포는 이제 일부 뒤틀림 (warping) 을 보였다. 평균 세포의 전체 길이가 또한 증가하지만, 뒤틀림은 단지 경미하게만 있거나 없었다. 반응기 내 Ni 농도는 세포 모폴로지가 감소하는 시점 부근에서 0.0996 ppm 으로 떨어졌다.
반응기 내 니켈 농도는 t = ~160 시간까지 50%, 0.0988 ppm 으로 워시아웃되었다. 이전과 같이, 배양 파라미터는 많이 변화하지 않았다. 그러나, 세포 모폴로지는 t = 250 시간 부근에서 관찰시 악화되었다. 기다란 세포의 백분율은 그 기다린 세포의 구부러짐 (bending) 또는 뒤틀림 정도에 따라 10-20% 로 증가하였다. 나머지 배양물은 길이가 평균 내지 약간 길었으며, 때때로 경미한 구부러짐이 있었다. 코일 또는 스프링처럼 심하게 구부러진 세포는 없었지만, 입자가 굵은 세포 및 중공체 세포가 보였다. 또, 배양 파라미터 또는 니켈 농도에 대한 변화는 이루어지지 않았다.
반응기 내 니켈 농도는 t = 1885 시간까지 50%, 또는 0.0988 ppm 으로 유지되었다. ~0.87 ml/분의 배지 유량에서, 니켈 주입율은 0.12 mg/일이었다. 배양 파라미터는 ~2.8 g/L 세포 밀도, ~3.2 mmol/분 CO 흡수, ~0.7 mmol/분 H2 흡수, ~25 g/L 에탄올, ~2.5 g/L 전체 아세틸, 및 ~0.3 g/L 부탄올로 꽤 일정하였다. 50% 니켈 주입율에서, Ni 는 생성된 세포 1 그램 당 ~34 μg 으로, 가스 흡수 1 mmol 당 ~0.022 μg 으로 첨가되었다. 세포 모폴로지는 Ni 농도가 0.0988 ppm 이 되면 악화를 지속하지 않았다. 경미한 뒤틀림이 있는 기다란 세포 ~10%, 보통의 뒤틀림이 있는 매우 기다란 세포 ~5% 를 유지하였고, 나머지 세포는 때때로 뒤틀림이 있으며 길이는 평균 내지 약간 길었다.
t = 445 시간에서, 배지 중의 Ni 농도는 원래의 25%, 또는 0.049 ppm 으로 저하하였다. 거의 즉각적으로, 배양 파라미터에 대한 느리지만 꾸준한 변화가 관찰되었다. CO 흡수는 ~3.2 mmol/분으로 일정하게 유지되었지만, H2 흡수는 Ni 저하 ~120 시간 이내에 0.7-0.8 mmol/분에서 0.6-0.7 mmol/분으로 감소하기 시작하였다. Ni 변화 ~160 시간 이내에 에탄올 농도는 ~24 g/L 에서 ~21 g/L 로 떨어지기 시작하였고, 전체 아세틸 수준 또한 ~2.5 g/L 에서 ~2.0 g/L 로 떨어지기 시작하였다. 부탄올 농도는 배지 중의 Ni 가 줄어들자 거의 곧바로 느리지만 꾸준히 증가하기 시작하였다. 상기 농도는 Ni 가 줄어든 후 ~635 시간까지 ~0.21 g/L 에서 ~0.34 g/L 로 증가하였다. 세포 모폴로지는 비교적 변함없었다. 더욱 낮아진 Ni 주입율은 이제 0.062 mg/일이었다. 상기 주입율에서, Ni 는 생성된 세포 1 그램 당 ~18 μg, 가스 흡수 1 mmol 당 ~0.011 μg 으로 첨가되었다.
배양물에 대한 낮은 Ni 농도의 영향을 가속화시키기 위해, 배지 중의 Ni 수준은 t = 638 시간에서 원래 농도의 10%, 또는 0.0198 ppm 으로 떨어졌다. 배양 파라미터에서의 동일한 경향은 이전과 같이 지속되었지만 보다 빠른 속도였다. H2 흡수 및 산 농도는 지속적으로 감소하였다. 세포 밀도 및 CO 흡수는 변화하지 않았으며, 부탄올 농도는 지속하여 상승하였다. 세포 밀도 면에서는 ~2.8 g/L 를 유지하였으므로 여전히 변화가 없었다. 수소 흡수는 ~0.5-0.6 mmol/분이었다. 일산화탄소 흡수는 여전히 ~3.2 mmol/분이었다. 생성물 농도는 ~21 g/L 에탄올, ~1.5 g/L 전체 아세틸, 및 ~0.65 g/L 부탄올이었다. 파라미터 및 세포 모폴로지에 대한 장시간 영향을 측정하기 위해 Ni 농도를 추가 86 시간 동안 10% 로 유지하였다. 배양 파라미터의 추가 감소는 없었다. 배양물 모폴로지는 다소 악화하였으며, 이는 기다린 세포수의 증가 뿐만 아니라 세포 전체 길이의 증가를 나타내었다. 대략 10-15% 의 세포가 뒤틀림 있는 기다란 것으로서 분류되었다. 나머지 세포는 짧음 내지 다소 길었으며, 대부분의 세포는 평균 길이였고 뒤틀림이 없었다. 10%, 또는 0.01975 ppm 의 배지 중의 Ni 농도에서, Ni 주입율은 0.025 mg/일이었다. 이것은 생성된 세포 1 그램 당 ~7 μg 의 Ni 첨가, 또는 가스 흡수 1 mmol 당 ~0.0048 μg 의 Ni 첨가를 제공하였다. t = 2270 시간에서, 니켈 농도는 50%, 또는 0.0988 ppm 으로 다시 증가하였다. 수소 흡수는 ~0.7 mmol/분으로 증가하였다. CO 흡수는 ~3.2 mmol/분을 유지하였다. 에탄올은 ~24 g/L 로 상승하였다. 산은 ~2.5 g/L 로 증가하였다. 부탄올은 ~0.24 g/L 로 떨어졌고, 세포 밀도는 ~2.9 g/L 로 변화없이 유지되었다. 세포 모폴로지가 또한 개선되었으며, 이는 세포 길이 뿐만 아니라 기다란 세포수의 전반적인 감소를 나타내었다. 대략 5~10% 의 세포는 경미한 뒤틀림이 있는 기다란 것으로서 분류되었다. 나머지 세포는 짧음 내지 다소 길었으며, 대부분은 때때로 경미한 뒤틀림만을 갖는 평균 길이를 가졌다.
반응기 내 Ni 농도가 0.0988 ppm, 또는 50% 로 저하하는 것은, 배양 파라미터에 있어서 인식가능한 변화를 야기하지 않았다. 그러나, 세포 모폴로지가 악화되어, 배양물의 전체 길이의 증가를 나타내었으며, 세포의 20% 까지는 경미 내지 보통의 뒤틀림을 갖는 기다란 것으로 고려되었다. 세포 모폴로지는 50% Ni 농도에서도 악화를 지속하지 않았으며, 배양물이 그 조건 하에서 정상 상태를 유지함을 보였다.
배지 중의 니켈 농도가 보통의 25%, 또는 0.049 ppm 으로 떨어진 경우, 에탄올 및 전체 아세틸 농도 및 H2 흡수 모두 떨어지기 시작하였다. 동시에, 부탄올 농도는 천천히 증가하기 시작하였다. 이들은 모두 배양물이 Ni 제한되었지만, 세포 모폴로지는 비교적 변화없이 유지됨을 시사하는 것이다.
배양 파라미터 및 세포 모폴로지가 감소하기 시작할 때 산출된 반응기 내 니켈 농도에 근거하여, Ni 가 50%, 또는 0.099 ppm 으로 낮게 워시아웃될 때 모폴로지가 먼저 악화되었다. Ni 농도가 추가로 36%, 또는 0.072 ppm 으로 떨어질 때, 부탄올 농도가 악화되었다. 29% Ni, 또는 0.057 ppm 에서, H2 흡수가 떨어지기 시작하였다. 이후, 마지막으로 25% Ni, 또는 0.050 ppm 에서, 에탄올 및 산 농도가 감소하기 시작하였다. 50% Ni 에서, 오직 배양물 모폴로지만 영향을 받았다. Ni 수준이 추가로 떨어지고 나면, 배양물 흡수 및 생산성이 감소하였다. 이것은 배지 중의 50% Ni 농도, 또는 0.12 mg/일 주입율이, Ni 제한에 매우 근접함을 의미한다. 배양 파라미터 및 0.12 mg/일 Ni 주입율을 기준으로, Ni 는 생성된 세포 1 그램 당 ~34 μg, 가스 흡수 1 mmol 당 ~0.022 μg 으로 첨가되었다.
Ni 제한의 징후는 감소된 H2 흡수, 감소된 산 수준, 및 증가된 부탄올에 이어 감소된 에탄올 농도이었다. 세포 밀도의 변화는 보여지지 않았다. 결과적으로, 세포 모폴로지가 영향을 받았으며, 이는 기다란 세포의 전체 개수 및 그 기다린 세포의 전체 길이의 증가를 보였다. 대체적으로, 세포 길이가 증가했을 때 세포는 더 구부러지거나 뒤틀리게 된다.
실시예 4: 텅스텐 제한에 의한 발효
실험은 투과물 퍼지 없이 CSTR 을 통해 직렬로 조작되는 생물반응기 (New Brunswick BioFlo I 또는 IIc) 에서 실시했다. 생물반응기 조작 조건은 다음과 같았다:
배양물 유형은 클로스트리디움 융달리 (Clostridium ljungdahlii) C01 이었다.
배양물 온도는 38-39 ℃ 로 유지되었다.
교반은 아날로그 판독으로 700 rpm 이었다.
미분기된 배양물 체적은 ~1550-1700 ml 이었다.
분기된 배양물 체적은 ~1900 ml 이었다.
배양물 pH 설정치는 4.5 이었다. 7.7% NaHCO3 의 용액을 사용하여 pH 조절하였다.
주입 가스는 15% H2, 45% N2, 30% CO 및 10% CO2 의 합성 배합물이고, 290 ml/분의 속도로 배양물에 주입되었다.
배지는 ~0.86 내지 ~0.88 ml/분, 또는 ~1250 ml/일로 반응기에 주입되었다.
액체 및 세포 유지 시간은 대략 28-31 시간이었다.
사용된 배지는 이하에 기재하는 바와 같았다.
Figure 112014124359485-pct00005
생물반응기는 배양물이 높은 생산성 정상 상태를 얻을 때까지 작동되었다. 높은 생산성 정상 상태는 ~2.5-3 g/L 세포 밀도, 에탄올 농도 >20 g/L, CO 흡수 >3.0 mmol/분, 및 수소 흡수 >0.5 mmol/분으로서 정의되었다.
이후, 가스 흡수, H2 및 CO, 생성물 농도 및 세포 밀도의 배양 파라미터를 임의 악영향에 대해 모니터링하였다. 성분 농도 저하가 여러 (>3) 세포 유지 시간 후에 상기 파라미터에 영향을 미치지 않는다면 그 농도는 추가로 저하되지 않게 된다. 성분 농도 저하 후 배양 파라미터의 강하가 보여졌다면, 그 농도는 이전에 적절한 것으로 제시되었던 수준으로 다시 높아지게 될 것이다. 배양물이 회수되었다면, 그 농도는 때로는 영향을 반복하기 전과 동일 수준으로, 때로는 효과가 있는 수준과 문제를 일으키는 수준 사이의 어딘가의 수준으로 다시 낮아지게 될 것이다.
인 시험 동안, t = 0 시간에서 배지로부터 텅스텐을 제거하였다. P 를 반응기 및 배지 제제에 다시 첨가함에도 불구하고 배양물은 인 시험 동안 참가하였으므로, 회수하지 않았다. 배양을 개선시키려는 일련의 시도가 실패한 경우, 최후의 수단으로서, t = 812 시간에서, 8 ml 의 0.2 g/l Na2WO4·2H2O 용액을 1.6 리터의 배양물에 첨가함으로써, 텅스텐을 보통 수준의 50%, 또는 0.56 ppm 으로 다시 반응기에 첨가하였다. 텅스텐 워시아웃 산출은 반응기 내 텅스텐 수준이 <0.0001 ppm 으로 워시아웃되었음을 보여주었다. 텅스텐의 첨가시, 배양물은 거의 즉각적으로 반응하였다. H2 흡수가 증가하기 시작하였다. 개선된 H2 전환율과 함께, 주입 가스 유량은 t = 885 시간까지 ~290 ml/분의 원래 설정으로 다시 증가했다. 이는 CO 및 H2 흡수를 각각 3.2 및 ~0.75 mmol/분으로 다시 증가시켰다. 증가된 가스 흡수와 함께, 세포 밀도는 ~2.7 g/L 로 증가하였고, 에탄올 수준은 ~22 g/L 로 올라갔다. 전체 아세틸 및 부탄올 수준은 각각 ~3.5 및 ~0.45 g/L 로 대략 동일하게 유지되었다. 배양물 내 또다른 변화는 세포 모폴로지의 개선이었다. 텅스텐 첨가에 의해, 전체 세포 길이가 상당히 줄었고 세포 구부러짐 및 뒤틀림이 적었다.
배양물에 의해 요구되는 텅스텐 수준을 결정하고자 하기 위해 반응기 내 수준을 다시 낮게 워싱하도록 텅스텐을 배지에 다시 첨가하지는 않았다. 텅스텐이 워시아웃되었을 때, H2 흡수는 t = 904 시간 부근에서 낮아지는 경향을 보이기 시작하였다. 텅스텐을 반응기 또는 배지 중 어디에도 첨가하지 않았다. t = 981 시간 부근에서 부탄올 농도는 천천히 증가하기 시작하였다. 그 후, t = 1030 시간 부근에서 에탄올 농도가 떨어지기 시작하였다. 아직 텅스텐을 첨가하지 않았다. t = 1100 시간까지 H2 흡수는 ~0.2 mmol/분이었고; 에탄올은 ~17g/L 이었고; 및 부탄올은 ~0.74 g/L 이었다. CO 흡수는 영향을 받지 않았으며, 세포 밀도는 거의 동일하였다.
t = 1100 시간에서, 텅스텐을 반응기에 보통의 50% 또는 0.56 ppm 으로 첨가했다. 앞서 알 수 있는 바와 같이, 배양물은 거의 즉각적으로 개선하기 시작하였다. H2 흡수가 증가하기 시작하였고; 에탄올 농도는 올라갔고; 산 수준은 떨어졌고; 세포 밀도는 약간 증가했고; 및 부탄올 밀도는 감소하기 시작하였다. 보고 기간 종료까지 세포 밀도는 ~3.3 g/L 이었고; CO 및 H2 흡수는 각각 ~3.2 및 ~0.75 mmol/분이었고; 에탄올은 22 g/L 이었고; 산은 ~2.5 g/L 이었고; 및 부탄올은 0.52 g/L 이었다. 반응기 내 텅스텐 수준은 보고 기간 종료까지 0.045 ppm 또는 원래 농도의 4.0% 으로 다시 낮게 워싱하였다.
텅스텐 제한치는 이전에 첨가된 원래 농도의 약 2.7% 또는 0.030 ppm 이었다. 배양물은 처음으로 텅스텐이 0.030 ppm 으로 낮게 다시 반응기에서 워시아웃했을 경우 H2 흡수 감소로서 문제의 징후를 나타내기 시작하였다. 그 농도에서 텅스텐은 생성된 세포 1 그램 당 10 μg, 가스 흡수 1 mmol 당 0.0068 μg 으로 첨가되었다.
실시예 5: 붕소, 구리, 망간 및 몰리브덴 제한에 의한 발효
어떠한 B, Cu, Mn 또는 Mo 도 포함하지 않은 배지 (배지 A 라고 명함) 또는 B, Cu, Mn 및 Mo 를 포함한 공지의 배지 (402 배지라고 명함) 를 함유하는 New Brunswick Bioflow Cellii Gen 115 반응기에, 활발히 생장 중인 클로스트리디움 융달리 (Clostridium ljungdahlii) C01 균주 0.39 g/L 를 접종하였다.
접종 후, 반응기 교반 속도를 800 rpm 으로 설정했다. 대략 1 시간 간격으로 반응기로부터 취한 가스 및 액체 샘플을 각종 가스 성분의 소비 또는 생성, 브로쓰 아세트산 농도, 브로쓰 에탄올 농도 및 배양물의 광학 밀도에 관하여 분석하였다. 또한 합성가스 중의 각종 가스 조성도 매일 측정하고, 반응기로의 합성가스 흐름을 반응기로의 합성가스를 조절하는 질량 흐름 제어기에 의해 실시간으로 측정했다. 실제 가스 흐름을 질량 흐름 제어기를 보정하여 얻은 식을 이용해 계산했다. 반응기 내로의 들어가는 가스 흐름 내 H2 로부터 일정한 백분율의 H2 흡수를 유지하기 위한 반응기로의 필수적인 가스 유량, 또는 다시 말해, 본 특정 시험에서는, 배양물 H2 흡수가 반응기 내로의 가스 흐름 전체 분자의 4.5% 가 되도록 유지하는 반응기 내로의 가스 흐름 속도를 측정하여 계산을 실시했다. 그 후, 반응기에는, (주입구로부터의 H2 흡수 백분율을 전체 가스 분자의 4.5% 로 유지하기 위해) 상기 계산된 유량으로 가스를 공급했다.
세가지 실험 모두에 있어서, 세포 재순환 시스템을 접종 전에 반응기에 부착하였고, 배지를 전체 실험 기간 동안 시스템을 통해 순환시켰다. 배지 A 를 이용한 첫번째 실험에 있어서, 접종 2.75 시간에서 (CO 전환율이 80% 이상에 도달한 후), 반응기로의 배지 흐름을 1.0 ml/분으로 개시하고, 투과물을 1.0 ml/분으로 반응기로부터 빼내었다. 접종 6.83 시간 후, 반응기로의 배지 흐름을 2.0 ml/분으로 증가시키고, 투과물을 2.0 ml/분으로 반응기로부터 빼내었다.
402 배지를 이용한 두번째 실험에 있어서, 접종 1.9 시간에서 (CO 가스 전환율 80% 이상에 도달한 후), 반응기로의 배지 흐름을 2.0 ml/분으로 개시하고, 투과물을 2.0 ml/분으로 반응기로부터 빼내었다.
배지 A 를 이용한 세번째 실험에 있어서, 접종 2.0 시간에서 (CO 가스 전환율이 80% 이상에 도달한 후), 반응기로의 배지 흐름을 2.0 ml/분으로 개시하고, 투과물을 2.0 ml/분으로 반응기로부터 빼내었다. 세가지 실험 모두에 있어서, 반응기 내 에탄올의 신속한 빌드업 제거를 위해 세포 재순환 시스템의 도입이 적용되었다.
배지 A 및 402 배지는 C. 융달리 (C. ljungdahlii) 에 의한 수소 흡수에 대하여 근접 내지 동일 성능을 제공하였다.
실시예 6: 몰리브덴 제한에 의한 발효
실험은 투과물 퍼지 없이 CSTR 을 통해 직렬로 조작되는 생물반응기 (New Brunswick BioFlo I 또는 IIc) 에서 실시했다. 생물반응기 조작 조건은 다음과 같았다:
배양물 유형은 클로스트리디움 융달리 (Clostridium ljungdahlii) C01 이었다.
배양물 온도는 38-39 ℃ 로 유지되었다.
교반은 아날로그 판독으로 850 rpm 이었다.
미분기된 배양물 체적은 ~1600-1650 ml 이었다.
분기된 배양물 체적은 ~1900 ml 이었다.
배양물 pH 설정치는 4.5 이었다. 7.7% NaHCO3 의 용액을 사용하여 pH 조절하였다.
주입 가스는 15% H2, 45% N2, 30% CO 및 10% CO2 의 합성 배합물이고, 282 ml/분의 속도로 배양물에 주입되었다.
배지는 ~0.88 ml/분, 또는 ~1300 ml/일로 반응기에 주입되었다.
액체 및 세포 유지 시간은 대략 29-31 시간이었다.
사용된 배지는 이하에 기재하는 바와 같았다.
Figure 112014124359485-pct00006
생물반응기는 배양물이 높은 생산성 정상 상태를 얻을 때까지 작동되었다. 높은 생산성 정상 상태는 ~2.5-3 g/L 세포 밀도, 에탄올 농도 >20 g/L, CO 흡수 >3.0 mmol/분, 및 수소 흡수 >0.5 mmol/분으로서 정의되었다.
이후, 가스 흡수, H2 및 CO, 생성물 농도 및 세포 밀도의 배양 파라미터를 임의 악영향에 대해 모니터링하였다. 성분 농도 저하가 여러 (>3) 세포 유지 시간 후에 상기 파라미터에 영향을 미치지 않는다면 그 농도는 추가로 저하되지 않게 된다. 성분 농도 저하 후 배양 파라미터의 강하가 보여졌다면, 그 농도는 이전에 적절한 것으로 제시되었던 수준으로 다시 높아지게 될 것이다. 배양물이 회수되었다면, 그 농도가 때로는 영향을 반복하기 전과 동일 수준으로, 때로는 효과가 있는 수준과 문제를 일으키는 수준 사이의 어딘가의 수준으로 다시 낮아지게 될 것이다.
몰리브덴 요건 시험은 배지 제제로부터 Na2MoO4·2H2O 를 없앰으로써 t = 0 에서 시작하였다. 상기 성분 제거 바로 전, 배양 조건/파라미터는 다음과 같았다.
세포 밀도 - 3.2 g/L
CO 전환율 - 86%
H2 전환율 - 36%
CO 흡수 - 3.0 mmol/분
H2 흡수 - 0.56 mmol/분
에탄올 - 21.8 g/L
전체 아세틸 - 2.3 g/L
부탄올 - 0.32 g/L
~9.7 세포 유지 시간 (292 시간) 후, 배양 브로쓰 중의 몰리브덴 농도는 0.238 ppm Mo 의 초기 농도의 <0.0001% 로 떨어졌다. 브로쓰 중의 추정 잔여 성분 농도는, 출발 칼슘 농도, MFR, LRT, 및 배지 또는 스파이크 중 하나를 통해 Mo 을 생물반응기 내에 첨가하는 것을 이용하여 워시아웃 계산에 의해 구하였다. 배양물 성능에는 어떠한 악영향도 없었다. 몰리브덴 첨가 없이 292 시간 후, 배양 파라미터/조건은 다음과 같았다:
세포 밀도 - 2.9 g/L
CO 전환율 - 86%
H2 전환율 - 36%
CO 흡수 - 3.0 mmol/분
H2 흡수 - 0.61 mmol/분
에탄올 - 21.0 g/L
전체 아세틸 - 2.9 g/L
부탄올 - 0.32 g/L
실시예 7: 마그네슘 제한에 의한 발효
실험은 세포 재순환 루프 없이 CSTR 을 통해 직렬로 조작되는 생물반응기 (New Brunswick BioFlo I 또는 IIc) 에서 실시했다. 생물반응기 조작 조건은 다음과 같았다:
배양물 유형은 클로스트리디움 융달리 (Clostridium ljungdahlii) C01 이었다.
배양물 온도는 37-39 ℃ 로 유지되었다.
교반은 아날로그 판독으로 880 - 890 rpm 이었다.
미분기된 배양물 체적은 ~1275 ml 이었다.
분기된 배양물 체적은 ~1900 ml 이었다.
배양물 pH 설정치는 4.2 이었다. 7.7% NaHCO3 의 용액을 사용하여 pH 조절하였다.
주입 가스는 15% H2, 45% N2, 30% CO 및 10% CO2 의 합성 배합물이고, 232 ml/분의 속도로 배양물에 주입되었다.
배지는 ~0.70 ml/분 또는 ~1008 ml/일로 반응기에 주입되었다.
액체 및 세포 유지 시간은 대략 29-31 시간이었다.
사용된 출발 배지는 이하에 기재하는 바와 같았다.
Figure 112014124359485-pct00007
생물반응기는 배양물이 높은 생산성 정상 상태를 얻을 때까지 작동되었다. 높은 생산성 정상 상태는 ~2.5-3 g/L 세포 밀도, 에탄올 농도 >20 g/L, CO 흡수 >3.0 mmol/분, 및 수소 흡수 >0.5 mmol/분으로서 정의되었다.
이후, 가스 흡수, H2 및 CO, 생성물 농도 및 세포 밀도의 배양 파라미터를 임의 악영향에 대해 모니터링하였다. 성분 농도 저하가 여러 (>3) 세포 유지 시간 후에 상기 파라미터에 영향을 미치지 않는다면 그 농도는 추가로 저하되지 않게 된다. 성분 농도 저하 후 배양 파라미터의 강하가 보여졌다면, 그 농도는 이전에 적절한 것으로 제시되었던 수준으로 다시 높아지게 될 것이다. 배양물이 회수되었다면, 그 농도는 때로는 영향을 반복하기 전과 동일 수준으로, 때로는 효과가 있는 수준과 문제를 일으키는 수준 사이의 어딘가의 수준으로 다시 낮아지게 될 것이다.
실험 개시시 마그네슘 농도는 보통 에탄올 배지 수준 또는 59.77 ppm 이었다. 배양 파라미터는 ~3.1 g/L 세포 밀도; 20.5 g/L 에탄올; 3.0 g/L 아세틸; 2.4 mmol/분 CO 흡수; 및 0.42 mmol/분 H2 흡수로 안정적이었다. 마그네슘 농도를 배지 중에서 14.97 ppm 으로 감소시켜 t = 0 시간에서 출발하였다. 마그네슘이 발효기에서 워시아웃될 때, 모든 파라미터를 배양 성능에 대한 잠재적 영향에 대해 모니터링하였다. ~300 시간 또는 ~10 세포 유지 시간 후, 배양물 성능에 대한 해로운 영향은 관찰되지 않았다. 마그네슘 감소 후 아세틸 농도의 거의 즉각적인 강하가 있었지만 이는 배지 주입 문제로 인한 것이었다. 상기 문제가 고쳐지고 나면, 아세틸 농도는 Mg 농도가 59.77 ppm 일 때 보여진 것과 유사한 수준으로 다시 증가했다. 14.97 ppm Mg 를 함유하는 배지 주입물은 ~30 시간의 세포 유지 시간에서 ~3 g/L 세포 밀도로 배양을 지탱할 수 있다는 결론을 얻었다.
59.77 ppm 의 Mg
세포 밀도 - 3.1 g/L
CO 전환율 - 84%
H2 전환율 - 32%
CO 흡수 - 2.4 mmol/분
H2 흡수 - 0.42 mmol/분
에탄올 - 20.5 g/L
전체 아세틸 - 2.4 g/L
14.94 ppm 의 Mg
세포 밀도 - 3.0 g/L
CO 전환율 - 84%
H2 전환율 - 34%
CO 흡수 - 2.4 mmol/분
H2 흡수 - 0.45 mmol/분
에탄올 - 21.0 g/L
전체 아세틸 - 2.7 g/L
마그네슘 농도를 배지 중에서 7.47 ppm 으로 추가로 감소시켜 t = 403 시간에서 출발하였다. 마그네슘이 발효기에서 워시아웃될 때, 모든 파라미터를 배양 성능에 대한 잠재적 영향에 대해 모니터링하였다. 고작 20 시간 후, 수소 전환율 및 흡수가 감소하기 시작하였다. 배양물 중의 계산된 Mg 농도는 ~11 ppm 이었다. 배양 성능은 배양물 및 배지 둘 모두에 마그네슘을 여러번 첨가함에도 불구하고 CO 전환율/흡수 저하, 아세틸 농도 증가, 에탄올 농도 감소 및 세포 밀도의 꾸준한 저하와 함께 계속 감소하였다. 배양물은 마침내 소실되었다. 7.47 ppm Mg 를 함유하는 배지 주입물은 30 시간의 세포 유지 시간에서 3 g/l 배양물을 지탱하기에 충분하지 않다는 결론을 얻었다.
실시예 8: 칼륨 제한에 의한 발효
실험은 세포 재순환 루프 없이 CSTR 을 통해 직렬로 조작되는 생물반응기 (New Brunswick BioFlo I 또는 IIc) 에서 실시했다. 생물반응기 조작 조건은 다음과 같았다:
배양물 유형은 클로스트리디움 융달리 (Clostridium ljungdahlii) C01 이었다.
배양물 온도는 38-39 ℃ 로 유지되었다.
교반은 아날로그 판독으로 950 - 1000 rpm 이었다.
분기된 배양물 체적은 ~1550 ml 이었다.
배양물 pH 설정치는 4.2 이었다. 7.5% NaHCO3 의 용액을 사용하여 pH 조절하였다.
주입 가스는 15% H2, 45% N2, 30% CO 및 10% CO2 의 합성 배합물이고, 279 ml/분의 속도로 배양물에 주입되었다.
배지는 ~0.80 - 0.85 ml/분 또는 ~1220 ml/일로 반응기에 주입되었다.
액체 및 세포 유지 시간은 대략 28-30 시간이었다.
사용된 배지는 이하에 기재하는 바와 같았다.
Figure 112014124359485-pct00008
생물반응기는 배양물이 높은 생산성 정상 상태를 얻을 때까지 작동되었다. 높은 생산성 정상 상태는 ~2.5-3 g/L 세포 밀도, 에탄올 농도 >20 g/L, CO 흡수 >3.0 mmol/분, 및 수소 흡수 >0.5 mmol/분으로서 정의되었다.
이후, 가스 흡수, H2 및 CO, 생성물 농도 및 세포 밀도의 배양 파라미터를 임의 악영향에 대해 모니터링하였다. 성분 농도 저하가 여러 (>3) 세포 유지 시간 후에 상기 파라미터에 영향을 미치지 않는다면 그 농도는 추가로 저하되지 않게 된다. 성분 농도 저하 후 배양 파라미터의 강하가 보여졌다면, 그 농도는 이전에 적절한 것으로 제시되었던 수준으로 다시 높아지게 될 것이다. 배양물이 회수되었다면, 그 농도는 때로는 영향을 반복하기 전과 동일 수준으로, 때로는 효과가 있는 수준과 문제를 일으키는 수준 사이의 어딘가의 수준으로 다시 낮아지게 될 것이다.
실험 개시시 칼륨 농도는 보통 에탄올 배지 수준 또는 78.7 ppm 이었다. 배양 파라미터는 ~3 g/L 세포 밀도; ~22 g/L 에탄올; ~2.6 g/L 아세틸; 0.5 g/L 부탄올; 3.1 mmol/분 CO 흡수; 및 0.5-0.6 mmol/분 H2 흡수로 안정적이었다. 칼륨을 배지 중에서 39.3 ppm 으로 감소시켜 t = 0 시간에서 출발하였다. 칼륨이 발효기에서 워시아웃될 때, 배양 파라미터를 변화에 대해 모니터링하였다. 대략 30 시간 후, H2 흡수가 떨어지기 시작하였고, 이어서 CO 흡수가 떨어졌다. 수소 흡수는 0.078 mmol/분으로 떨어졌고 CO 흡수는 2.8 mmol/분으로 낮게 떨어졌다. 대략 칼륨 감소 후 대략 40 시간 후 아세트산 농도도 또한 0.78 g/L 로 낮게 감소하였고 이어서 에탄올 농도도 19.2 g/L 로 떨어졌다. 부탄올 농도는 0.67 g/L 로 증가하였다. 세포 밀도도 또한 2.3 g/L 로의 저하가 보여짐에 따라 영향을 받았지만, 이는 칼륨 저하 직후 27 시간으로의 의도치 않은 세포 체류 시간 감소로 인한 것이었을 수 있다. 칼륨을 반응기에 첨가하여 농도를 78.7 ppm 으로 올렸다. 그 영향은 CO 흡수, H2 흡수, 에탄올 및 산 농도의 증가로 즉각적으로 보여졌다. 부탄올 수준은 칼륨 증가와 함께 ~0.53 g/L 로 다시 천천히 감소하였다.
배양물이 칼륨 제한 전에 관찰된 수준으로 다시 회복되는 것이 보여지고 나면, 배지 중의 칼륨 농도는 t = 139 시간에서 59.0 ppm 으로 떨어졌다. 또, 배양 파라미터를 임의의 변화에 대해 모니터링하였다. 이전과 같이, H2 흡수는 칼륨 저하 ~8 시간 후에 감소하기 시작하였다. 그러나, 이때는 CO 흡수가 영향을 받지 않았다. 부탄올은 ~0.57 g/L 로 조금 증가하였다. 아세트산 농도가 떨어졌지만, 이것은 칼륨 수준이 떨어지기 전에 보여진 감소 경향의 연속이었다. 에탄올 수준은 ~22 g/L 를 유지하였다. 세포 밀도는 조금 떨어짐을 보였으며, 칼륨 수준은 대략 3.0 g/L 에서 2.8 g/L 로 감소하였다. 데이터 분산 (scatter) 에 의해서는 오직 근사적인 세포 밀도 농도의 보고만 가능하였다. 칼륨을 반응기에 첨가하여 농도를 78.7 ppm 으로 올렸다. 그 영향은 H2 흡수, 에탄올 농도, 산 농도 및 세포 밀도의 증가로서 즉각적으로 보여졌으며, 이는 배양물이 칼륨 제한되었음을 확인시켜 주는 것이다.
59.0 ppm 으로의 칼륨 저하의 전체적인 영향은 39.3 ppm 으로 떨어진 것보다 작지만, 그 수준은 여전히 제한치인 것으로 여겨졌다. 배지 중의 78.7 ppm 의 칼륨 수준은 따라서 제한치인 것에 근접한 것으로 여겨졌다. 그 수준이 실제로 제한치인지 결정하기 위해, 배지 중의 칼륨 농도는 t = 243 시간에서 98.3 ppm 으로 증가되었다. 칼륨 증가에 따라, H2 흡수는 ~0.61 mmol/분에서 ~0.71 mmol/분으로 상승하였다. 또한 ~3.0 에서 ~3.3 g/l 로의 세포 밀도의 증가가 있었다. 아세트산은 칼륨이 78.7 ppm 일 때의 2.6 에 비하여 ~3.3 g/L 로 높았다. 부탄올 농도는 데이터 분산 내에서 대략 일정하였다. 에탄올 수준은 24 g/l 로 조금 증가를 나타낸 것으로 보였지만, 데이터 분산에 의해서는 결정짓기가 곤란하였다. 칼륨이 98.3 ppm 으로 증가하는 것으로 인한 일부 긍정적인 영향이 존재하지만, 칼륨 농도는 t = 375 시간에서 118 ppm 으로 추가 증가하였다. 배양 파라미터에 있어 보여진 오직 결정적인 영향은 ~3.9 g/L 로 추가적인 세포 밀도 증가였다. 모든 그 밖의 파라미터는 데이터 분산 내에서 일정하게 유지되었다.
실시예 9: 시스테인 제한에 의한 발효
실험은 세포 재순환 루프 없이 CSTR 을 통해 직렬로 조작되는 생물반응기 (New Brunswick BioFlo I 또는 IIc) 에서 실시했다. 생물반응기 조작 조건은 다음과 같았다:
배양물 유형은 클로스트리디움 융달리 (Clostridium ljungdahlii) C01 이었다.
배양물 온도는 38-39 ℃ 로 유지되었다.
교반은 아날로그 판독으로 900 rpm 이었다.
분기된 배양물 체적은 ~1650 ml 이었다.
배양물 pH 설정치는 4.5 이었다. 7.5% NaHCO3 의 용액을 사용하여 pH 조절하였다.
주입 가스는 15% H2, 45% N2, 30% CO 및 10% CO2 의 합성 배합물이고, 279 ml/분의 속도로 배양물에 주입되었다.
배지는 ~0.83 - 0.86 ml/분 또는 ~1220 ml/일로 반응기에 주입되었다.
액체 및 세포 유지 시간은 대략 28-30 시간이었다.
사용된 배지는 이하에 기재하는 바와 같았다.
Figure 112014124359485-pct00009
실험 개시시 시스테인 농도는 보통 에탄올 배지 수준 또는 250 ppm 이었다. 배양 파라미터는 ~3 g/L 세포 밀도; 23 g/L 에탄올; 2.4 g/L 아세틸; 3.1 mmol/분 CO 흡수; 및 0.56 mmol/분 H2 흡수로 안정적이었다. 시스테인을 배지 중에서 187.5 ppm 으로 감소시켜 t = 0 시간에서 출발하였다. 시스테인이 발효기에서 워시아웃될 때, 모든 파라미터를 제한 징후에 대해 모니터링하였다. 시스테인 농도를 167 시간 또는 5 XRT 동안 그 수준으로 고정하였다. 모든 파라미터는 일정하게 유지하였다. 187.5 ppm 농도의 시스테인은 33 시간의 세포 유지 시간에서 3 g/L 배양물을 지탱시키기에 충분하였다.
시스테인 농도를 t = 167 시간에서 187.5 ppm 으로부터 125 ppm 으로 배지 중에서 추가 감소시켰다. 거의 즉각적으로, H2 흡수 및 전환율은 떨어지기 시작함과 함께 아세트산 농도가 감소하였다. CO 흡수 및 전환율 및 세포 밀도는 일정하였다. H2 흡수는 0.36 mmol/분으로 떨어졌고, H2 전환율은 21% 로 떨어졌고, 아세트산은 1.7 g/L 로 감소하였다. 배지와 생물반응기 둘 모두 중의 시스테인 농도를 187.5 ppm 으로 이후 250 ppm 으로 증가시켰다. 배양물이 신속하게 회수되었다. 125 ppm 의 시스테인 농도는 33 시간의 세포 유지 시간에서 3 g/L 배양물을 지탱시키는데 충분하지 않았다.
배양물을 전부 회수한 후, 시스테인 제한을 다시 시험했다. t = 407 시간에서, 배지 중의 시스테인을 162.5 ppm 으로 떨어뜨렸다. 이전에 보여진 바와 같이, H2 전환율 및 흡수가 다시 거의 즉각적으로 떨어지기 시작했다. 아세트산 농도가 다시 떨어졌지만 시스테인 농도가 125 ppm 일 때와 같이 빠르거나 또는 거기까지는 아니었다. H2 흡수는 0.49 mmol/분으로 떨어지고, H2 전환율은 29% 로 떨어지고, 아세트산은 3.0 에서 2.7 g/L 로 감소하였다. 162.5 ppm 의 시스테인 농도는 33 시간의 세포 유지 시간에서 3 g/L 배양물을 지탱시키는데 충분하지 않았다.
실시예 10: 티아민 제한에 의한 발효
실험은 CSTR 을 통해 직렬로 조작되는 생물반응기 (New Brunswick BioFlo I 또는 IIc) 에서 실시했다. 생물반응기 조작 조건은 다음과 같았다:
배양물 유형은 클로스트리디움 융달리 (Clostridium ljungdahlii) C01 이었다.
배양물 온도는 38-39 ℃ 로 유지되었다.
교반은 아날로그 판독으로 950 rpm 이었다.
분기된 배양물 체적은 ~1950 ml 이었다.
배양물 pH 설정치는 4.5 이었다. 7.5% NaHCO3 의 용액을 사용하여 pH 조절하였다.
주입 가스는 15% H2, 45% N2, 30% CO 및 10% CO2 의 합성 배합물이고, 279 ml/분의 속도로 배양물에 주입되었다.
배지는 ~0.84 - 0.86 ml/분 또는 ~1220 ml/일로 반응기에 주입되었다.
액체 및 세포 유지 시간은 대략 30-32 시간이었다.
사용된 배지는 이하에 기재하는 바와 같았다.
Figure 112014124359485-pct00010
배지에 통상적으로 첨가되는 비타민 용액은 0.0505 g/L 판토텐산염, 0.040 g/L 비오틴 및 0.10 g/L 티아민의 용액이었다. 본 실험에서, 비타민 용액을 3 개의 용액으로 나누었고, 각 성분에 대해 1 개로 하였다. 상기 용액의 농도를 최초 비타민 믹스에서와 같이 동일하게 유지하였다. 이렇게 하여 각 성분의 농도는 다른 비타민 농도를 변경하지 않고 필요에 따라 조절될 수 있었다.
본 실험 개시시, 배지 중의 판토텐산 농도는 0.03535 ppm 이거나 또는 배지 1 리터 당 0.0505 g/L 판토텐산 용액 0.7 ml 이었다. 배지 중의 비오틴 농도는 배지 중의 보통의 비타민 농도의 25% 또는 0.0070 ppm 이었다. 이것은 배지 1 리터 당 첨가된 0.04 g/L 비오틴 용액 0.175 ml 에 해당하는 것이었다. 배지 중의 티아민 수준은 보통 비타민 농도의 25%, 또는 0.0175 ppm 이었다. 이것은 배지 1 리터 당 첨가된 0.10 g/L 티아민 용액 0.175 ml 에 해당하는 것이었다. t = 0 시간에서, 배지 중의 티아민 농도를 보통의 15%, 또는 0.0105 ppm 으로 떨어뜨렸다. 세포 밀도에 대한 즉각적인 영향은 보여지지 않았다. 그러나, H2 흡수, 전체 아세틸 농도, 및 에탄올 농도는 모두 거의 즉각적으로 떨어지기 시작하였으며, 이는 이전의 티아민 농도 0.0175 ppm 이 제한치에 이미 근접하였음을 시사한다. 동시에, CO 흡수가 3.1 에서 3.2 mmol/분으로 약간 증가하였다. 이것은 교반 속도가 일정하게 유지되어도 그 시간 동안 질량 전달이 증가함을 시사하는 것일 수 있다. 배양물 생산성의 저하의 원인을 밝히기 위해, t = 43 시간에서 0.5 ml 의 판토텐산 용액을 먼저 반응기에 첨가했다. 이것이 배양물에 영향을 미치지 않았다면, 0.115 ml 의 티아민 용액을 t = 84 시간에서 반응기에 다시 첨가하여, 반응기 내 티아민 수준을 ~0.0175 ppm 으로 올렸다. 이것은 배양물에 즉각적인 영향을 미쳤다. 수소 흡수, 산 수준, 및 에탄올 농도 모두 증가하기 시작하였다. 배양물은 추가 티아민을 필요로 하였다.
배지 첨가로부터 들어 오는 0.0354 ppm 판토텐산 및 0.0105 ppm 티아민으로 다시 낮아지게 첨가된 판토텐산 및 티아민을 반응기에서 워시아웃하기 위하여, 반응기에 대해 추가적인 변화를 주지는 않았다. 이어지는 228 시간에 걸쳐 비타민이 워시아웃될 때, H2 흡수는 처음에는 ~0.53 mmol/분으로 증가하였고, 이후 ~0.31 mmol/분으로 낮게 떨어졌는데 아마도 여분의 판토텐산염 및 티아민이 반응기에서 다시 워시아웃됨에 따른 것일 수 있다. 그러나, 비타민 수준 또는 다른 배양물 변화는 없었고, H2 흡수는 꾸준하게 증가하기 시작하여 t = 273 시간 부근에서 ~0.5 mmol/분에 도달하였다. 산 및 에탄올 농도는 설정 패턴을 따르지 않지만 25 g/L 에탄올 및 1.1-2.4 g/L 산 부근에서 변하였다. CO 흡수는 3.2 mmol/분에서 일정하게 유지되었고, 세포 밀도는 2.8-3.0 g/L 에서 꽤 일정하게 고정되었다.
실험 개시시, 배지 중의 티아민 수준이 0.0175 ppm 에서 0.0105 ppm 으로 떨어진 경우, 배양 파라미터에 대한 영향은 거의 즉각적이었으며, 이는 0.0175 ppm 티아민 수준이 이미 제한치에 근접하였음을 시사한다. 0.0105 ppm 티아민으로 떨어지기 전에 배양 성능에 대비한 영양소 첨가를 더욱 잘 연관짓도록 사용된 계산된 파라미터는 다음과 같았다: 가스 흡수 1 mmol 당 첨가된 티아민의 μg 은 ~0.0041 μg/mmol 이었다. 생성된 세포 1 그램 당 첨가된 티아민의 μg 은 ~6.5 μg/g 이었다. 티아민이 실제로 0.0105 ppm 에서 제한치이었다는 추가적인 확인사항은 반응기 내 티아민 수준을 일시적으로 반응기에서 0.0175 ppm 으로 증가시켰을 때의 배양 파라미터의 즉각적인 개선이었다.
본원에 개시된 발명을 특정 양태, 실시예 및 그의 응용에 의해 설명하였지만, 당업자는 청구범위에 제시된 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 수많은 수정 및 변형을 이룰 수 있다.

Claims (44)

  1. 발효 배지 중에서의 초산생성균으로 합성가스의 발효를 포함하는 발효 방법으로서,
    상기 초산생성균이 아세토게늄 키부이 (Acetogenium kivui), 아세토아나에로비움 노테라에 (Acetoanaerobium noterae), 아세토박테리움 우디 (Acetobacterium woodii), 알칼리바쿨룸 바치 (Alkalibaculum bacchi) CP11 (ATCC BAA-1772), 블라우티아 프로둑타 (Blautia producta), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰 (Butyribacterium methylotrophicum), 칼다나에로박테르 서브테라네우스 (Caldanaerobacter subterraneous), 칼다나에로박테르 서브테라네우스 파시피쿠스 (Caldanaerobacter subterraneous pacificus), 카르복시도테르무스 히드로게노포르만스 (Carboxydothermus hydrogenoformans), 클로스트리디움 아세티쿰 (Clostridium aceticum), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum), 클로스트리디움 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum) (DSMZ Germany 의 DSM 19630), 클로스트리디움 오토에타노게눔 (DSMZ Germany 의 DSM 10061), 클로스트리디움 오토에타노게눔 (DSMZ Germany 의 DSM 23693), 클로스트리디움 오토에타노게눔 (DSMZ Germany 의 DSM 24138), 클로스트리디움 카르복시디보란스 (Clostridium carboxidivorans) P7 (ATCC PTA-7827), 클로스트리디움 코스카티 (Clostridium coskatii) (ATCC PTA-10522), 클로스트리디움 드라케이 (Clostridium drakei), 클로스트리디움 융달리 PETC (ATCC 49587), 클로스트리디움 융달리 ERI2 (ATCC 55380), 클로스트리디움 융달리 C-01 (ATCC 55988), 클로스트리디움 융달리 O-52 (ATCC 55889), 클로스트리디움 마그눔 (Clostridium magnum), 클로스트리디움 파스튜리아눔 (Clostridium pasteurianum) (DSMZ Germany 의 DSM 525), 클로스트리디움 라그스달리 (Clostridium ragsdali) P11 (ATCC BAA-622), 클로스트리디움 스카톨로게네스 (Clostridium scatologenes), 클로스트리디움 테르모아세티쿰 (Clostridium thermoaceticum), 클로스트리디움 울투넨세 (Clostridium ultunense), 데술포토마쿨룸 쿠즈네초비 (Desulfotomaculum kuznetsovii), 유박테리움 리모숨 (Eubacterium limosum), 제오박테르 술푸레두센스 (Geobacter sulfurreducens), 메타노사르시나 아세티보란스 (Methanosarcina acetivorans), 메타노사르시나 바르케리 (Methanosarcina barkeri), 무렐라 테르모아세티카 (Moorella thermoacetica), 무렐라 테르모오토트로피카 (Moorella thermoautotrophica), 옥소박테르 프펜니지 (Oxobacter pfennigii), 펩토스트렙토코쿠스 프로둑투스 (Peptostreptococcus productus), 루미노코쿠스 프로둑투스 (Ruminococcus productus), 테르모아나에로박테르 키부이 (Thermoanaerobacter kivui), 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 방법은 적어도 약 1 g 에탄올/(L·일·그램 세포) 의 비 STY (specific STY) 를 제공하는데 효과적이며,
    상기 발효 배지가
    세포 1 그램 당 적어도 112 내지 125 mg 의 질소,
    세포 1 그램 당 적어도 10.5 내지 15 mg 의 인,
    세포 1 그램 당 적어도 26 내지 36 mg 의 칼륨,
    세포 1 그램 당 약 2.7 내지 약 5 mg 의 철,
    세포 1 그램 당 약 10 내지 약 30 μg 의 텅스텐,
    세포 1 그램 당 약 34 내지 약 40 μg 의 니켈,
    세포 1 그램 당 약 9 내지 약 30 μg 의 코발트,
    세포 1 그램 당 약 4.5 내지 약 10 mg 의 마그네슘,
    세포 1 그램 당 약 11 내지 약 20 mg 의 황, 및
    세포 1 그램 당 약 6.5 내지 약 20 μg 의 티아민을 포함하고,
    상기 발효 배지가 0.025 ppm 미만의 붕소, 0.0025 ppm 미만의 망간, 0.001 ppm 미만의 몰리브덴, 및 0.01 ppm 미만의 구리를 갖고,
    상기 발효 배지가 0.01 g/L 미만의 탄수화물 및 0.01 g/L 미만의 효모 추출물을 갖는 발효 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 질소가 염화암모늄, 인산암모늄, 황산암모늄, 질산암모늄, 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 질소 공급원으로부터 제공되고, 인이 인산, 인산암모늄, 인산칼륨, 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 인 공급원으로부터 제공되고, 칼륨이 염화칼륨, 인산칼륨, 질산칼륨, 황산칼륨, 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 칼륨 공급원으로부터 제공되는 발효 방법.
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서, 철이 염화제1철, 황산제1철, 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 철 공급원으로부터 제공되고, 텅스텐이 텅스텐산나트륨, 텅스텐산칼슘, 텅스텐산칼륨, 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 텅스텐 공급원으로부터 제공되고, 니켈이 염화니켈, 황산니켈, 질산니켈, 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 니켈 공급원으로부터 제공되고, 코발트가 염화코발트, 불화코발트, 브롬화코발트, 요오드화코발트 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 코발트 공급원으로부터 제공되고, 마그네슘이 염화마그네슘, 황산마그네슘, 인산마그네슘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 마그네슘 공급원으로부터 제공되고, 황이 시스테인, 황화나트륨, 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 황 공급원으로부터 제공되는 발효 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 발효 배지의 pH 가 약 4.2 내지 약 4.8 범위에서 유지되는 발효 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 합성가스가 적어도 약 0.75 의 CO/CO2 비를 갖는 발효 방법.
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서, 적어도 약 1.0 g/L 의 세포 밀도를 제공하는데 효과적인 발효 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 적어도 약 5 내지 약 99% 의 CO 전환율을 제공하는데 효과적인 발효 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 붕소, 망간, 몰리브덴 또는 구리 공급원이 배지 제제로부터 제거되는 발효 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
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