JP2015519060A - シンガス発酵プロセス及び培地 - Google Patents
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Abstract
シンガスの発酵プロセス及び発酵培地は、以前は不可欠であると考えられていた培地成分を除去しながら高いエタノール生産性を与える。本プロセスは、少なくとも約1gのエタノール/(L・日・グラム細胞)の比STYを与えるのに有効である。この態様では、発酵培地は、約1.04ppm未満のホウ素、約0.16ppm未満のマンガン、約0.26ppm未満のモリブデン、又は約0.16ppm未満の銅を有する。【選択図】なし
Description
この出願は、全て2012年5月22日に出願された米国仮特許出願第61/650,098号、第61/650,093号、第61/650,077号、第61/650,084号及び2012年11月14日に出願された米国仮特許出願第61/726,225号の利益を主張する。なお、これら全ての内容全体を参照によって本明細書に援用する。
シンガス発酵のためのプロセス及び培地を提供する。さらに詳しくは、以前は不可欠であるか又は特定濃度レベルで必要とされると考えられていた成分を除去するか又はその濃度を低減した後でさえ、高レベルのエタノール生産性を与えるプロセス及び培地を提供する。
シンガス発酵のためのプロセス及び培地を提供する。さらに詳しくは、以前は不可欠であるか又は特定濃度レベルで必要とされると考えられていた成分を除去するか又はその濃度を低減した後でさえ、高レベルのエタノール生産性を与えるプロセス及び培地を提供する。
背景
発酵は、定義された液体培地内で起こる。これらの培地は典型的に、発酵性能の改善に重要な種々のマクロ及びミクロ栄養源を含むであろう。ガス状基質等のあまり一般的でない基質に関連して用いられる培地は、性能を最適化するように明確に定義された培地を必要とする。嫌気的発酵も明確に定義された培地を必要とする。
嫌気性微生物は二酸化炭素(CO)からガス状基質の発酵によってエタノールを生産することができる。クロストリジウム属由来の嫌気性微生物を用いた発酵はエタノール及び他の有用な生成物をもたらす。例えば、米国特許第5,173,429号は、合成ガスからエタノール及びアセタートを生成する嫌気性微生物クロストリジウム・リュングダリイ(Clostridium ljungdahlii)ATCC No.49587について記載している。米国特許第5,807,722号は、クロストリジウム・リュングダリイATCC No.55380を用いて廃ガスを有機酸とアルコールに変換するための方法及び装置について記載している。米国特許第6,136,577号は、クロストリジウム・リュングダリイATCC No.55988及び55989を用いて廃ガスをエタノールに変換するための方法及び装置について記載している。
米国特許第7,285,402号は、エタノールを生産するためのガス状基質の嫌気的発酵に用いることで知られている培地について記載している。培地中の種々の成分及び成分濃度は高レベルのエタノール生産性を与えるために有効である。エタノール生産性を維持しながら特定成分を排除し、また他の成分の所要濃度を減らすと、特に商業規模の発酵で、顕著な経費削減を実現することができる。
発酵は、定義された液体培地内で起こる。これらの培地は典型的に、発酵性能の改善に重要な種々のマクロ及びミクロ栄養源を含むであろう。ガス状基質等のあまり一般的でない基質に関連して用いられる培地は、性能を最適化するように明確に定義された培地を必要とする。嫌気的発酵も明確に定義された培地を必要とする。
嫌気性微生物は二酸化炭素(CO)からガス状基質の発酵によってエタノールを生産することができる。クロストリジウム属由来の嫌気性微生物を用いた発酵はエタノール及び他の有用な生成物をもたらす。例えば、米国特許第5,173,429号は、合成ガスからエタノール及びアセタートを生成する嫌気性微生物クロストリジウム・リュングダリイ(Clostridium ljungdahlii)ATCC No.49587について記載している。米国特許第5,807,722号は、クロストリジウム・リュングダリイATCC No.55380を用いて廃ガスを有機酸とアルコールに変換するための方法及び装置について記載している。米国特許第6,136,577号は、クロストリジウム・リュングダリイATCC No.55988及び55989を用いて廃ガスをエタノールに変換するための方法及び装置について記載している。
米国特許第7,285,402号は、エタノールを生産するためのガス状基質の嫌気的発酵に用いることで知られている培地について記載している。培地中の種々の成分及び成分濃度は高レベルのエタノール生産性を与えるために有効である。エタノール生産性を維持しながら特定成分を排除し、また他の成分の所要濃度を減らすと、特に商業規模の発酵で、顕著な経費削減を実現することができる。
概要
シンガスの発酵プロセス及び発酵培地は、以前は不可欠であると考えられていた培地成分を除去しながら、高いエタノール生産性を実現する。特定培地成分の除去及び他の培地成分の濃度低減は、商業規模での顕著な運用経費削減を可能にする。
シンガスの発酵プロセス及び発酵培地は、以前は不可欠であると考えられていた培地成分を除去しながら、高いエタノール生産性を実現する。特定培地成分の除去及び他の培地成分の濃度低減は、商業規模での顕著な運用経費削減を可能にする。
一態様では、発酵プロセスはシンガスを発酵培地内で発酵させる工程を含む。このプロセスは、少なくとも約1gのエタノール/(L・日・グラム細胞)の比STYを与えるのに有効である。この態様では、発酵培地は、約1.04ppm未満のホウ素、約0.16ppm未満のマンガン、約0.26ppm未満のモリブデン、又は約0.16ppm未満の銅を有する。
別の態様では、発酵培地は、生成細胞1グラム当たり少なくとも約112mgの窒素、生成細胞1グラム当たり少なくとも約10.5mgのリン、又は生成細胞1グラム当たり少なくとも約26mgのカリウムを含む。別の態様では、発酵培地は、約1.04ppm未満のホウ素、約0.16ppm未満のマンガン、約0.26ppm未満のモリブデン、又は約0.16ppm未満の銅を有する。
別の態様では、発酵プロセスは、発酵培地内でシンガスを発酵させる工程を含む。このプロセスは、少なくとも約1グラムのエタノール/(L・日・グラム細胞)の比STYを与えるのに有効である。発酵培地は、約625:1以上のNH4 +対Bの質量比、又は約4050:1以上のNH4 +対Mnの質量比、又は約2500:1以上のNH4 +対Moの質量比、又は約4050:1以上のNH4 +対Cuの質量比を有し;或いは発酵培地は、約30:1以上のP対Bの質量比、又は約190:1以上のP対Mnの質量比、又は約120:1以上のP対Moの質量比、又は約190:1以上のMn対Cuの質量比を有し；或いは発酵培地は、約35:1以上のK対Bの質量比、又は約245:1以上のK対Mnの質量比、又は約150:1以上のK対Moの質量比、又は約245:1以上のK対Cuの質量比を有する。
詳細な説明
下記説明を限定的意味に解釈すべきでなく、典型的態様の一般原理を説明するという目的のためだけに説明する。請求項を参照して本発明の範囲を決定すべきである。
以前は不可欠であるか又は特定濃度レベルで必要とされると考えられていた1種以上の成分の除去又は濃度の低減後でさえ、驚くべきことに、かつ予想外に、高レベルのエタノール生産性を与えるプロセス及び培地を提供する。この態様では、B、Mn、Mo及びCuを含め、培地の1種以上の栄養素の濃度を低減し得る。培地中の栄養素濃度は以下の通りであり得る：
B：約1.04ppm未満のB、別の態様では、約1.0ppm未満のB、別の態様では、約0.75ppm未満のB、別の態様では、約0.5ppm未満のB、別の態様では、約0.025ppm未満のB；
Mn：約0.16ppm未満のMn、別の態様では、約0.15ppm未満のMn、別の態様では、約0.10ppm未満のMn、別の態様では、約0.05ppm未満のMn、別の態様では、約0.0025ppm未満のMn；
Mo：約0.26ppm未満のMo、別の態様では、約0.25ppm未満のMo、別の態様では、約0.20ppm未満のMo、別の態様では、約0.10ppm未満のMo、別の態様では、約0.001ppm未満のMo；又は
Cu：約0.16ppm未満のCu、別の態様では、約0.15ppm未満のCu、別の態様では、約0.10ppm未満のCu、別の態様では、約0.05ppm未満のCu、別の態様では、約0.01ppm未満のCu。
下記説明を限定的意味に解釈すべきでなく、典型的態様の一般原理を説明するという目的のためだけに説明する。請求項を参照して本発明の範囲を決定すべきである。
以前は不可欠であるか又は特定濃度レベルで必要とされると考えられていた1種以上の成分の除去又は濃度の低減後でさえ、驚くべきことに、かつ予想外に、高レベルのエタノール生産性を与えるプロセス及び培地を提供する。この態様では、B、Mn、Mo及びCuを含め、培地の1種以上の栄養素の濃度を低減し得る。培地中の栄養素濃度は以下の通りであり得る：
B：約1.04ppm未満のB、別の態様では、約1.0ppm未満のB、別の態様では、約0.75ppm未満のB、別の態様では、約0.5ppm未満のB、別の態様では、約0.025ppm未満のB；
Mn：約0.16ppm未満のMn、別の態様では、約0.15ppm未満のMn、別の態様では、約0.10ppm未満のMn、別の態様では、約0.05ppm未満のMn、別の態様では、約0.0025ppm未満のMn；
Mo：約0.26ppm未満のMo、別の態様では、約0.25ppm未満のMo、別の態様では、約0.20ppm未満のMo、別の態様では、約0.10ppm未満のMo、別の態様では、約0.001ppm未満のMo；又は
Cu：約0.16ppm未満のCu、別の態様では、約0.15ppm未満のCu、別の態様では、約0.10ppm未満のCu、別の態様では、約0.05ppm未満のCu、別の態様では、約0.01ppm未満のCu。
別の態様では、質量比は以下の通りであってよい：
NH4 +対B：約625:1以上、別の態様では、約650:1以上、別の態様では、約675:1以上、別の態様では、約700:1以上、別の態様では、約750:1以上、別の態様では、約800:1以上；又は
NH4 +対Mn：約4050:1以上、別の態様では、約4100:1以上、別の態様では、約4200:1以上、別の態様では、約4300:1以上、別の態様では、約4400:1以上、別の態様では、約4500:1以上；又は
NH4 +対Mo：約2500:1以上、別の態様では、約2600:1以上、別の態様では、約2700:1以上、別の態様では、約2800:1以上、別の態様では、約2900:1以上、別の態様では、約3000:1以上；又は
NH4 +対Cu：約4050:1以上、別の態様では、約4100:1以上、別の態様では、約4200:1以上、別の態様では、約4300:1以上、別の態様では、約4400:1以上、別の態様では、約4500:1以上；又は
P対B：約30:1以上、別の態様では、約35:1以上、別の態様では、約40:1以上、別の態様では、約45:1以上、別の態様では、約50:1以上、別の態様では、約100:1以上；又は
P対Mn：約190:1以上、別の態様では、約200:1以上、別の態様では、約225:1以上、別の態様では、約250:1以上、別の態様では、約275:1以上、別の態様では、約300:1以上；又は
P対Mo：約120:1以上、別の態様では、約130:1以上、別の態様では、約140:1以上、別の態様では、約150:1以上、別の態様では、約175:1以上、別の態様では、約200:1以上；又は
P対Cu：約190:1以上、別の態様では、約200:1以上、別の態様では、約225:1以上、別の態様では、約250:1以上、別の態様では、約275:1以上、別の態様では、約300:1以上；又は
K対B：約35:1以上、別の態様では、約40:1以上、別の態様では、約45:1以上、別の態様では、約50:1以上、別の態様では、約75:1以上、別の態様では、約100:1以上；又は
K対Mn：約245:1以上、別の態様では、約250:1以上、別の態様では、約260:1以上、別の態様では、約270:1以上、別の態様では、約280:1以上、別の態様では、約300:1以上；又は
K対Mo：約150:1以上、別の態様では、約250:1以上、別の態様では、約260:1以上、別の態様では、約270:1以上、別の態様では、約280:1以上、別の態様では、約300:1以上；又は
K対Cu：約245:1以上、別の態様では、約250:1以上、別の態様では、約260:1以上、別の態様では、約270:1以上、別の態様では、約280:1以上、別の態様では、約300:1以上。
NH4 +対B：約625:1以上、別の態様では、約650:1以上、別の態様では、約675:1以上、別の態様では、約700:1以上、別の態様では、約750:1以上、別の態様では、約800:1以上；又は
NH4 +対Mn：約4050:1以上、別の態様では、約4100:1以上、別の態様では、約4200:1以上、別の態様では、約4300:1以上、別の態様では、約4400:1以上、別の態様では、約4500:1以上；又は
NH4 +対Mo：約2500:1以上、別の態様では、約2600:1以上、別の態様では、約2700:1以上、別の態様では、約2800:1以上、別の態様では、約2900:1以上、別の態様では、約3000:1以上；又は
NH4 +対Cu：約4050:1以上、別の態様では、約4100:1以上、別の態様では、約4200:1以上、別の態様では、約4300:1以上、別の態様では、約4400:1以上、別の態様では、約4500:1以上；又は
P対B：約30:1以上、別の態様では、約35:1以上、別の態様では、約40:1以上、別の態様では、約45:1以上、別の態様では、約50:1以上、別の態様では、約100:1以上；又は
P対Mn：約190:1以上、別の態様では、約200:1以上、別の態様では、約225:1以上、別の態様では、約250:1以上、別の態様では、約275:1以上、別の態様では、約300:1以上；又は
P対Mo：約120:1以上、別の態様では、約130:1以上、別の態様では、約140:1以上、別の態様では、約150:1以上、別の態様では、約175:1以上、別の態様では、約200:1以上；又は
P対Cu：約190:1以上、別の態様では、約200:1以上、別の態様では、約225:1以上、別の態様では、約250:1以上、別の態様では、約275:1以上、別の態様では、約300:1以上；又は
K対B：約35:1以上、別の態様では、約40:1以上、別の態様では、約45:1以上、別の態様では、約50:1以上、別の態様では、約75:1以上、別の態様では、約100:1以上；又は
K対Mn：約245:1以上、別の態様では、約250:1以上、別の態様では、約260:1以上、別の態様では、約270:1以上、別の態様では、約280:1以上、別の態様では、約300:1以上；又は
K対Mo：約150:1以上、別の態様では、約250:1以上、別の態様では、約260:1以上、別の態様では、約270:1以上、別の態様では、約280:1以上、別の態様では、約300:1以上；又は
K対Cu：約245:1以上、別の態様では、約250:1以上、別の態様では、約260:1以上、別の態様では、約270:1以上、別の態様では、約280:1以上、別の態様では、約300:1以上。
定義
特に定義のない限り、本開示のためにこの明細書全体を通じて使用する下記用語は以下の定義通りであり、下記定義の単数形又は複数形のいずれをも包含し得る。
いずれの量をも修飾する用語「約」は、実社会条件、例えば、研究室、パイロットプラント、又は生産施設で遭遇する当該量の変動を表す。例えば、「約」によって修飾されているときの混合物又は量に使われる成分又は測定の量には、生産プラント又は研究室における実験条件で測定するのに典型的に利用される変動及び注意の度合が含まれる。例えば、「約」によって修飾されているときの生成物の成分の量には、プラント又は研究室における複数実験のバッチ間の変動及び分析法に固有の変動が含まれる。「約」によって修飾されていてもいなくても、量は当該量に等価な量を包含する。本明細書で言及され、「約」によって修飾されているいずれの量をも、「約」によって修飾されていない量として本開示で使用することもできる。
特に定義のない限り、本開示のためにこの明細書全体を通じて使用する下記用語は以下の定義通りであり、下記定義の単数形又は複数形のいずれをも包含し得る。
いずれの量をも修飾する用語「約」は、実社会条件、例えば、研究室、パイロットプラント、又は生産施設で遭遇する当該量の変動を表す。例えば、「約」によって修飾されているときの混合物又は量に使われる成分又は測定の量には、生産プラント又は研究室における実験条件で測定するのに典型的に利用される変動及び注意の度合が含まれる。例えば、「約」によって修飾されているときの生成物の成分の量には、プラント又は研究室における複数実験のバッチ間の変動及び分析法に固有の変動が含まれる。「約」によって修飾されていてもいなくても、量は当該量に等価な量を包含する。本明細書で言及され、「約」によって修飾されているいずれの量をも、「約」によって修飾されていない量として本開示で使用することもできる。
用語「シンガス」又は「合成ガス」は、各種量の一酸化炭素及び水素を含有するガス混合物に与えられる名称である合成ガスを意味する。生産方法の例には、水素を生産するための天然ガス又は炭化水素の水蒸気改質、石炭のガス化があり、いくつかのタイプの廃棄物発電(waste-to-energy)ガス化施設がある。この名称は、合成天然ガス(SNG)を生成する際の中間体として、またアンモニア又はメタノールを生産するための中間体として使用することに由来する。シンガスは可燃性であり、燃料源として又は他の化学薬品製造用の中間体として使用されることが多い。
用語「発酵」、「発酵プロセス」又は「醗酵反応」等は、プロセスの成長期と産物生合成期の両方を包含することを意図する。一態様では、発酵は、COのアルコールへの変換を意味する。
用語「細胞密度」は、発酵ブロスの単位体積当たりの微生物細胞の質量、例えば、グラム/リットルを意味する。この態様では、プロセス及び培地は少なくとも約1.0g/Lの細胞密度を与えるのに有効である。細胞密度は約1〜約25g/L、別の態様では、約1〜約20g/L、別の態様では、約1〜約10g/L、別の態様では、約2〜約8g/L、別の態様では、約3〜約6g/L、別の態様では、約4〜約5g/Lであり得る。
用語「細胞リサイクル」は、微生物細胞を発酵ブロスから分離し、その分離した微生物細胞の全て又は一部を発酵槽に戻すことを意味する。一般に、ろ過装置を用いて分離を達成する。
培地組成
本明細書に記載のプロセス及び培地は高レベルの生産性の実現に有用である。この態様では、プロセスは、少なくとも約1、別の態様では、約1〜約10、別の態様では、約2〜約8、別の態様では、約3〜約7、別の態様では、約4〜約6の比STY(エタノールのg数/(L・日・グラム細胞)として表される比時空収量)を与えるのに有効である。
本明細書に記載のプロセス及び培地は高レベルの生産性の実現に有用である。この態様では、プロセスは、少なくとも約1、別の態様では、約1〜約10、別の態様では、約2〜約8、別の態様では、約3〜約7、別の態様では、約4〜約6の比STY(エタノールのg数/(L・日・グラム細胞)として表される比時空収量)を与えるのに有効である。
関連態様では、生産性をSTY(エタノールのg数/(L・日)として表される時空収量)として表すことができる。この態様では、プロセスは、約10gのエタノール/(L・日)のSTY(時空収量)を与えるのに有効である。可能なSTY値としては、約10gのエタノール/(L・日)〜約200gのエタノール/(L・日)、別の態様では、約10gのエタノール/(L・日)〜約160gのエタノール/(L・日)、別の態様では、約10gのエタノール/(L・日)〜約120gのエタノール/(L・日)、別の態様では、約10gのエタノール/(L・日)〜約80gのエタノール/(L・日)、別の態様では、約20gのエタノール/(L・日)〜約140gのエタノール/(L・日)、別の態様では、約20gのエタノール/(L・日)〜約100gのエタノール/(L・日)、別の態様では、約40gのエタノール/(L・日)〜約140gのエタノール/(L・日)、別の態様では、約40gのエタノール/(L・日)〜約100gのエタノール/(L・日)がある。
別の態様では、プロセス及び培地は、少なくとも約5%〜約99%、別の態様では、約10%〜約90%、別の態様では、約20%〜約80%、別の態様では、約30%〜約70%、別の態様では、約40%〜約90%のCO転化率を与えるのに有効である。
一態様では、培地は、少なくとも1種以上の窒素源、少なくとも1種以上のリン源及び少なくとも1種以上のカリウム源を含む。培地は、これら3つの任意の1つ、これら3つの任意の組み合わせを含んでよく、重要な態様では、3つ全てを含む。窒素源としては、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、及びその混合物から成る群より選択される窒素源が挙げられる。リン源としては、リン酸、リン酸アンモニウム、リン酸カリウム、及びその混合物から成る群より選択されるリン源が挙げられる。カリウム源としては、塩化カリウム、リン酸カリウム、硝酸カリウム、硫酸カリウム、及びその混合物から成る群より選択されるカリウム源が挙げられる。
一態様では、培地は、鉄、タングステン、ニッケル、コバルト、マグネシウム、硫黄及びチアミンの1つ以上を含む。培地は、これら成分の任意の1つ、任意の組み合わせを含んでよく、重要な態様では、これらの成分全てを含む。鉄としては、塩化第一鉄、硫酸第一鉄、及びその混合物から成る群より選択される鉄源が挙げられる。タングステン源としては、タングステン酸ナトリウム、タングステン酸カルシウム、タングステン酸カリウム、及びその混合物から成る群より選択されるタングステン源が挙げられる。ニッケル源としては、塩化ニッケル、硫酸ニッケル、硝酸ニッケル、及びその混合物から成る群より選択されるニッケル源が挙げられる。コバルト源としては、塩化コバルト、フッ化コバルト、臭化コバルト、ヨウ化コバルト及びその混合物から成る群より選択されるコバルト源が挙げられる。マグネシウム源としては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、及びその混合物から成る群より選択されるマグネシウム源が挙げられる。硫黄源としては、システイン、硫化ナトリウム、及びその混合物が挙げられる。
種々の成分の濃度は以下の通り：
プロセス操作は、pHを約4.2〜約4.8の範囲で維持する。培地は約0.01g/L未満の
酵母エキス及び約0.01g/L未満の炭水化物を含む。
酵母エキス及び約0.01g/L未満の炭水化物を含む。
シンガス
シンガスは、いずれの既知源からも供給され得る。一態様では、炭素質材料のガス化から供給され得る。ガス化は、酸素供給を制限した状態でのバイオマスの部分燃焼を伴う。結果として生じるガスは主にCOとH2を含む。この態様では、シンガスは少なくとも約10モル%のCO、一態様では、少なくとも約20モル%、一態様では、約10〜約100モル%、別の態様では、約20〜約100モル%のCO、別の態様では、約30〜約90モル%のCO、別の態様では、約40〜約80モル%のCO、別の態様では、約50〜約70モル%のCOを含有するであろう。シンガスは、少なくとも約0.75、別の態様では、少なくとも約1.0、別の態様では、少なくとも約1.5のCO/CO2比を有するであろう。適切なガス化方法及び装置のいくつかの例は、全て2012年3月22日に出願された米国出願第13/427,144号、第13/427,193号及び第13/427,247号（全てその内容を参照によってここに援用する）に提供されている。
シンガスは、いずれの既知源からも供給され得る。一態様では、炭素質材料のガス化から供給され得る。ガス化は、酸素供給を制限した状態でのバイオマスの部分燃焼を伴う。結果として生じるガスは主にCOとH2を含む。この態様では、シンガスは少なくとも約10モル%のCO、一態様では、少なくとも約20モル%、一態様では、約10〜約100モル%、別の態様では、約20〜約100モル%のCO、別の態様では、約30〜約90モル%のCO、別の態様では、約40〜約80モル%のCO、別の態様では、約50〜約70モル%のCOを含有するであろう。シンガスは、少なくとも約0.75、別の態様では、少なくとも約1.0、別の態様では、少なくとも約1.5のCO/CO2比を有するであろう。適切なガス化方法及び装置のいくつかの例は、全て2012年3月22日に出願された米国出願第13/427,144号、第13/427,193号及び第13/427,247号（全てその内容を参照によってここに援用する）に提供されている。
別の態様では、酢酸生成菌を増殖させるために利用するシンガスは実質的にCOであってよい。本明細書では、「実質的にCO」は、少なくとも約50モル%のCO、別の態様では、少なくとも約60モル%のCO、別の態様では、少なくとも約70モル%のCO、別の態様では、少なくとも約80モル%のCO、別の態様では、少なくとも約90モル%のCOを意味する。
バイオリアアクタ操作
一態様によれば、反応容器への培地の添加によって発酵プロセスを開始する。培地を滅菌して望ましくない微生物を除去し、所望の微生物をリアクタに播種する。一態様では、利用する微生物は酢酸生成菌を含む。有用な酢酸生成菌の例としては、WO 2000/68407、EP 117309、米国特許第5,173,429号、第5,593,886号及び第6,368,819号、WO 1998/00558及びWO 2002/08438号に記載されているものを含め、クロストリジウム・リュングダリイ株等のクロストリジウム属のもの、WO 2007/117157及びWO 2009/151342に記載されているものを含め、クロストリジウム・オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)株(DSMZ, GermanyのDSM 10061及びDSM 19630)並びにそれぞれ米国特許第7,704,723号及び“Biofuels and Bioproducts from Biomass-Generated Synthesis Gas”, Hasan Atiyeh（2010年4月29日にOklahoma EPSCoR Annual State Conferenceで提示された）に記載されているものを含め、クロストリジウム・ラグスダレイ(Clostridium ragsdalei)(P11、ATCC BAA-622)及びアルカリバクルム・バッキ(Alkalibaculum bacchi)(CP11、ATCC BAA-1772)並びに米国特許出願第2007/0276447号に記載されているクロストリジウム・カルボキシジボランス(Clostridium carboxidivorans)(ATCC PTA-7827)が挙げられる。他の適切な微生物には、ムーレラ種(Moorella sp.)HUC22-1を含め、ムーレラ属のもの、及びカルボキシドサーマス(Carboxydothermus)属のものが挙げられる。これらの各参考文献は、参照によって本明細書に援用される。2種以上の微生物の混合培養物を使用してもよい。
一態様によれば、反応容器への培地の添加によって発酵プロセスを開始する。培地を滅菌して望ましくない微生物を除去し、所望の微生物をリアクタに播種する。一態様では、利用する微生物は酢酸生成菌を含む。有用な酢酸生成菌の例としては、WO 2000/68407、EP 117309、米国特許第5,173,429号、第5,593,886号及び第6,368,819号、WO 1998/00558及びWO 2002/08438号に記載されているものを含め、クロストリジウム・リュングダリイ株等のクロストリジウム属のもの、WO 2007/117157及びWO 2009/151342に記載されているものを含め、クロストリジウム・オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)株(DSMZ, GermanyのDSM 10061及びDSM 19630)並びにそれぞれ米国特許第7,704,723号及び“Biofuels and Bioproducts from Biomass-Generated Synthesis Gas”, Hasan Atiyeh（2010年4月29日にOklahoma EPSCoR Annual State Conferenceで提示された）に記載されているものを含め、クロストリジウム・ラグスダレイ(Clostridium ragsdalei)(P11、ATCC BAA-622)及びアルカリバクルム・バッキ(Alkalibaculum bacchi)(CP11、ATCC BAA-1772)並びに米国特許出願第2007/0276447号に記載されているクロストリジウム・カルボキシジボランス(Clostridium carboxidivorans)(ATCC PTA-7827)が挙げられる。他の適切な微生物には、ムーレラ種(Moorella sp.)HUC22-1を含め、ムーレラ属のもの、及びカルボキシドサーマス(Carboxydothermus)属のものが挙げられる。これらの各参考文献は、参照によって本明細書に援用される。2種以上の微生物の混合培養物を使用してもよい。
有用な細菌のいくつかの例としては、アセトゲニウム・キブイ(Acetogenium kivui)、アセトアナエロビウム・ノテラエ(Acetoanaerobium noterae)、アセトバクテリウム・ウッディイ(Acetobacterium woodii)、アルカリバクルム・バッキCP11(ATCC BAA-1772)、ブラウティア・プロダクタ(Blautia producta)、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム(Butyribacterium methylotrophicum)、カルダナエロバクター・サブテラネウス(Caldanaerobacter subterraneous)、カルダナエロバクター・サブテラネウス・パシフィカム(Caldanaerobacter subterraneous pacificus)、カルボキシドテルムス・ヒドロゲノホルマンス(Carboxydothermus hydrogenoformans)、クロストリジウム・アセチカム(Clostridium aceticum)、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム・アセトブチリカムP262(DSMZ GermanyのDSM 19630)、クロストリジウム・オートエタノゲナム(DSMZ GermanyのDSM 19630)、クロストリジウム・オートエタノゲナム(DSMZ GermanyのDSM 10061)、クロストリジウム・オートエタノゲナム(DSMZ GermanyのDSM 23693)、クロストリジウム・オートエタノゲナム(DSMZ GermanyのDSM 24138)、クロストリジウム・カルボキシジボランスP7(ATCC PTA-7827)、クロストリジウム・コスカティイ(Clostridium coskatii)(ATCC PTA-10522)、クロストリジウム・ドラケイ(Clostridium drakei)、クロストリジウム・リュングダリイPETC(ATCC 49587)、クロストリジウム・リュングダリイERI2(ATCC 55380)、クロストリジウム・リュングダリイC-01(ATCC 55988)、クロストリジウム・リュングダリイO-52(ATCC 55889)、クロストリジウム・マグナム(Clostridium magnum)、クロストリジウム・パストゥリアナム(Clostridium pasteurianum)(DSMZ GermanyのDSM 525)、クロストリジウム・ラグスダリ(Clostridium ragsdali)P11(ATCC BAA-622)、クロストリジウム・スカトロゲネス(Clostridium scatologenes)、クロストリジウム・サーモアセチカム(Clostridium thermoaceticum)、クロストリジウム・ウルツネンセ(Clostridium ultunense)、デスルホトマクルム・クズネツォビイ(Desulfotomaculum kuznetsovii)、ユーバクテリウム・リモーサム(Eubacterium limosum)、ゲオバクター・スルフレデュセンス(Geobacter sulfurreducens)、メタノサルシナ・アセチボランス(Methanosarcina acetivorans)、メタノサルシナ・バーケリ(Methanosarcina barkeri)、モーレラ・サーモアセチカ(Morrella thermoacetica)、モーレラ・サーモオートトロフィカ(Morrella thermoautotrophica)、オキソバクター・フェニギイ(Oxobacter pfennigii)、ペプトストレプトコッカス・プロダクツス(Peptostreptococcus productus)、ルミノコッカス・プロダクツス(Ruminococcus productus)、サーモアナエロバクター・キブイ(Thermoanaerobacter kivui)、及びその混合物が挙げられる。
播種時に、微生物の初期集団を供給するのに有効な初期フィードガス供給速度を確立する。流出ガスを分析して流出ガスの内容を判定する。ガス分析の結果を用いてフィードガス速度を調節する。所望レベルに達したら、液相と細胞材料をリアクタから引き出し、培地を補充する。この態様では、バイオリアクタを操作して少なくとも約2グラム/リットル、別の態様では、約2〜約50グラム/リットル、種々の他の態様では、約5〜約40グラム/リットル、約5〜約30グラム/リットル、約5〜約20グラム/リットル、約5〜約15グラム/リットル、約10〜約40グラム/リットル、約10〜約30グラム/リットル、約10〜約20グラム/リットル、及び約10〜約15グラム/リットルの細胞密度を維持する。リサイクルフィルターを介して細胞密度を調節することができる。バイオリアクタ操作のさらなる詳細は、2011年6月30日に出願された米国仮特許出願第61/571,564号、2011年6月30日に出願された米国仮特許出願第61/571,565号、及び2011年9月13日に出願された米国仮特許出願第61/573,845号（全ての内容を参照によってここに援用する）に記述されている。
実施例1：ホウ素、銅及びマンガンを制限した発酵
実験は、透過パージ(permeate purge)なしで直線状のCSTRとして作動するバイオリアクタ(New Brunswick BioFlo I又はIIc)で行なった。バイオリアクタ操作条件は以下の通りだった：
培養菌タイプはクロストリジウム・リュングダリイC01であった。
培養温度は38〜39℃で維持した。
撹拌はアナログ読み取りで850rpmであった。
かき回されない(unroused)培養体積は約1600〜1650mlであった。
培養pH設定点は4.5であった。pH調節のため7.7%のNaHCO3溶液を用いた。
フィードガスは、15%のH2、45%のN2、30%のCO及び10%のCO2の合成ブレンドであり、282ml/分の速度で培養に供給した。
培地は、約0.88ml/分、又は約1300ml/日でリアクタに供給した。
液体及び細胞の保持時間は約29〜31時間であった。
実験は、透過パージ(permeate purge)なしで直線状のCSTRとして作動するバイオリアクタ(New Brunswick BioFlo I又はIIc)で行なった。バイオリアクタ操作条件は以下の通りだった：
培養菌タイプはクロストリジウム・リュングダリイC01であった。
培養温度は38〜39℃で維持した。
撹拌はアナログ読み取りで850rpmであった。
かき回されない(unroused)培養体積は約1600〜1650mlであった。
培養pH設定点は4.5であった。pH調節のため7.7%のNaHCO3溶液を用いた。
フィードガスは、15%のH2、45%のN2、30%のCO及び10%のCO2の合成ブレンドであり、282ml/分の速度で培養に供給した。
培地は、約0.88ml/分、又は約1300ml/日でリアクタに供給した。
液体及び細胞の保持時間は約29〜31時間であった。
用いた開始培地は以下の通りだった。
* Na+濃度はNaCl由来のみである。それはNa2WO4・2H2O等の他成分由来のNa+を含まない。
** Ca2+濃度は、他のソースとして微量又は有意でない量のカルシウムしか与えないパントテン酸、カルシウム塩由来のカルシウムを含まない。
** Ca2+濃度は、他のソースとして微量又は有意でない量のカルシウムしか与えないパントテン酸、カルシウム塩由来のカルシウムを含まない。
培養が高生産性定常状態を得るまでバイオリアクタを操作した。高生産性定常状態は、約2.5〜3g/Lの細胞密度、>20g/Lのエタノール濃度、>3.0mmol/分のCO取り込み、及び>0.5mmol/分の水素取り込みと定義した。高生産性定常状態を得るプロセスでは、CaCl2・2H2O濃度をほぼゼロまで減らし、アンモニウム濃度を546ppmまで下げた。
培養が高生産性定常状態になったら、培地調合液からB、Mn及びCu源を排除した。当該成分を除去する直前の培養条件／パラメータは以下の通りだった：
細胞密度−2.9g/L
CO転化率−86%
H2転化率−32%
CO取り込み−3.0mmol/分
H2取り込み−0.54mmol/分
エタノール−21.8g/L
総アセチル−2.7g/L
ブタノール−0.35g/L
細胞密度−2.9g/L
CO転化率−86%
H2転化率−32%
CO取り込み−3.0mmol/分
H2取り込み−0.54mmol/分
エタノール−21.8g/L
総アセチル−2.7g/L
ブタノール−0.35g/L
次にガス取り込みH2及びCO、生成物濃度並びに細胞密度の培養パラメータをいずれの悪影響についてもモニターした。B、Cu及びMnの除去が、数(>3)細胞保持時間後の当該パラメータに影響を及ぼさなかった場合、それらは培養に不要であるとみなした。
約5.7細胞保持時間(170時間)後、培養ブロス中のホウ素、銅及びマンガン濃度は初期濃度の約0.41%まで低下した(1.05ppmのB、0.149ppmのCu及び1.67ppmのMnから0.0043ppmのB、0.0006ppmのCu及び0.0068ppmのMnに低下)。ブロス中の推定残存成分濃度は、開始カルシウム濃度、MFR、LRT及び培地又はスパイクによる当該成分のバイオリアクタへの任意の添加を利用して洗い出し計算によって決定した。培養性能への悪影響はなかった。
ホウ素、銅及びマンガンを添加せずに170時間後、培養パラメータ／条件は以下の通りだった：
細胞密度−2.9g/L
CO転化率−86%
H2転化率−36%
CO取り込み−3.0mmol/分
H2取り込み−0.61mmol/分
エタノール−21.0g/L
総アセチル−2.9g/L
ブタノール−0.32g/L
細胞密度−2.9g/L
CO転化率−86%
H2転化率−36%
CO取り込み−3.0mmol/分
H2取り込み−0.61mmol/分
エタノール−21.0g/L
総アセチル−2.9g/L
ブタノール−0.32g/L
実施例2：コバルトを制限した発酵
実験は、細胞リサイクルループのない直線状のCSTRとして作動するバイオリアクタ(New Brunswick BioFlo I又はIIc)で行なった。バイオリアクタ操作条件は以下の通り：
培養菌タイプはクロストリジウム・リュングダリイC01であった。
培養温度は37〜39℃で維持した。
撹拌はアナログ読み取りで850rpmであった(実際の撹拌は、タコメータ較正曲線に基づいて931rpmであった)。
かき回されない(unroused)培養体積は約1600〜1650mlであった。
かき回された(roused)培養体積は約1950mlであった。
培養pH設定点は4.5であった。pH調節のため7.7%のNaHCO3溶液を用いた。
フィードガスは、15%のH2、45%のN2、30%のCO及び10%のCO2の合成ブレンドであり、286ml/分の速度で培養に供給した。
培地は、約0.83〜約0.86ml/分、又は約1220ml/日でリアクタに供給した。
液体及び細胞の保持時間は約31〜33時間であった。
実験は、細胞リサイクルループのない直線状のCSTRとして作動するバイオリアクタ(New Brunswick BioFlo I又はIIc)で行なった。バイオリアクタ操作条件は以下の通り：
培養菌タイプはクロストリジウム・リュングダリイC01であった。
培養温度は37〜39℃で維持した。
撹拌はアナログ読み取りで850rpmであった(実際の撹拌は、タコメータ較正曲線に基づいて931rpmであった)。
かき回されない(unroused)培養体積は約1600〜1650mlであった。
かき回された(roused)培養体積は約1950mlであった。
培養pH設定点は4.5であった。pH調節のため7.7%のNaHCO3溶液を用いた。
フィードガスは、15%のH2、45%のN2、30%のCO及び10%のCO2の合成ブレンドであり、286ml/分の速度で培養に供給した。
培地は、約0.83〜約0.86ml/分、又は約1220ml/日でリアクタに供給した。
液体及び細胞の保持時間は約31〜33時間であった。
用いた培地は以下の通りだった。
* Na+濃度はNaCl由来のみである。それは、Na2WO4・2H2O等の他成分由来のNa+を含まない。
培養が高生産性定常状態を得るまでバイオリアクタを操作した。高生産性定常状態は、約2.5〜3g/Lの細胞密度、>20g/Lのエタノール濃度、>3.0mmol/分のCO取り込み、及び>0.5mmol/分の水素取り込みと定義した。
次にガス取り込みH2及びCO、生成物濃度並びに細胞密度の培養パラメータをいずれの悪影響についてもモニターした。成分濃度の低減が、数(>3)細胞保持時間後の当該パラメータに影響を及ぼさなかった場合、その濃度をさらに減らすことになる。成分濃度の低減後に培養パラメータの低下が見られた場合、その濃度を上昇させて、以前に十分であると示されたレベルに戻すことになる。培養が回復した場合、再び濃度を時にはその影響を繰り返す前と同レベルまで、時には正常に機能するレベルと問題を起こすレベルとの間のどこかのレベルまで下げることになる。
実験の最初は、コバルト濃度は通常の培地レベル、つまり0.991ppmであった。培養パラメータは約3g/Lの細胞密度；22〜26g/Lのエタノール；2.7〜3.7g/Lのアセチル；3.1mmol/分のCO取り込み；及び0.5〜0.7mmol/分のH2取り込みで安定していた。t=0時間で開始したときにコバルトを培地から除去した。コバルトを発酵槽から洗い出したとき、CO取り込みだけが3.1から2.9mmol/分にわずかに低下した。全ての他のパラメータは、t=121時間まで大体一定のままだった。当該時間に、H2及びCO取り込みはそれぞれ0.16及び2.6mmol/分に低下した。当該時間に総アセチルも急速に0.77g/Lまで低下した。これはコバルトレベルが限界レベル以下に低下したことを示している。コバルト洗い出し計算は、低コバルト濃度が培養パラメータに影響を与えるまでに、リアクタ内のコバルト濃度は約0.0222ppm、つまり当初濃度の2.24%まで低下したことを示した。コバルトのみをリアクタ中に添加して濃度を通常レベルの23.3%、つまり0.231ppmまで上昇させた。この効果は、CO取り込み、H2取り込み及び酸濃度の増加として即座に見られた。この時にコバルトを培地中に添加せずに、もう一度リアクタ内のコバルトを限界レベルまで洗い出した。以前に見られたように、コバルトが0.0220ppm未満に洗い出されるまで、培養パラメータは継続して窮迫の兆候を示さなかった。t=210時間で、H2及びCO取り込み並びに酸濃度が全て再度低下した。これはコバルト制限の効果を示している。この時にコバルトをリアクタ及び培地に添加して培地中20%(0.198ppm)及びリアクタ内21.2%(0.21ppm)に戻した。以前のように、この効果はブロスガス取り込みと酸濃度の即時増加であった。
培養が窮迫の兆候を示すまでコバルトをリアクタから洗い出した2つの異なる時間により、培養にとって限界として約0.022ppmのコバルト濃度という結果になった。そこでコバルト濃度を0.023ppmに設定すると、何ら悪影響なく培養はうまく機能した。当該コバルト濃度に基づいて、栄養素添加対培養性能の相互関係をよく示すために用いた計算パラメータは以下の通り：ガス取り込み1mmolの当たり添加したコバルトのmg数は0.005(mg/mmol)であった。生成細胞1グラム当たり添加したコバルトのμg数は約9(μg/g)であった。
コバルト制限からの回復は、悪影響が持続することなく迅速であった。二次的な問題、すなわちガス毒性又は酸不在のポイントまでパラメータが低下する前にコバルトを増やせば、培養に対して永久的損失が加えられることはなかった。
コバルトレベルを下げると、細胞濃度を低下させた。コバルト制限とブタノール生産との間には明らかな相関関係はなかった。COとH2の転化率／取り込みは両方ともコバルト制限によって影響を受けたが、培養中のコバルト濃度が約0.022ppm以下に低下するまではほとんど又は全く影響が見られなかった。ガス転化率の漸次低下はなかった。しかしながら、コバルト濃度が限界点を超えて低下するとすぐに、CO及びH2の両転化率が非常に急速に低下した。CO及びH2の転化率が低下し始めると、培養は既に臨界コバルト濃度を過ぎており、培養を回復させるためには迅速にコバルトを添加しなければならない。コバルト限界の初期の指標は、生成物比の酸からエタノールへのシフトであった。ガス転化率の低下が見られる前に酸濃度が低下し始め、エタノール濃度が増加し始めた。
実施例3：ニッケルを制限した発酵
実験は、透過パージなしで直線状のCSTRとして作動するバイオリアクタ(New Brunswick BioFlo I又はIIc)で行なった。バイオリアクタ操作条件は以下の通り：
培養菌タイプはクロストリジウム・リュングダリイC01であった。
培養温度は37〜39℃で維持した。
撹拌はアナログ読み取りで700rpmであった。
かき回されない培養体積は約1500〜1650mlであった。
かき回された培養体積は約1900mlであった。
培養pH設定点は4.5であった。pH調節のため7.7%のNaHCO3溶液を用いた。
フィードガスは、15%のH2、45%のN2、30%のCO及び10%のCO2の合成ブレンドであり、290ml/分の速度で培養に供給した。
培地は、約0.86〜約0.88ml/分、又は約1250ml/日でリアクタに供給した。
液体及び細胞の保持時間は約27〜31時間であった。
実験は、透過パージなしで直線状のCSTRとして作動するバイオリアクタ(New Brunswick BioFlo I又はIIc)で行なった。バイオリアクタ操作条件は以下の通り：
培養菌タイプはクロストリジウム・リュングダリイC01であった。
培養温度は37〜39℃で維持した。
撹拌はアナログ読み取りで700rpmであった。
かき回されない培養体積は約1500〜1650mlであった。
かき回された培養体積は約1900mlであった。
培養pH設定点は4.5であった。pH調節のため7.7%のNaHCO3溶液を用いた。
フィードガスは、15%のH2、45%のN2、30%のCO及び10%のCO2の合成ブレンドであり、290ml/分の速度で培養に供給した。
培地は、約0.86〜約0.88ml/分、又は約1250ml/日でリアクタに供給した。
液体及び細胞の保持時間は約27〜31時間であった。
用いた培地は以下の通りだった。
* Na+濃度はNaCl由来のみである。それは、Na2WO4・2H2O等の他成分由来のNa+を含まない。
** Ca2+濃度は、パントテン酸、カルシウム塩由来のカルシウムを含まない。
** Ca2+濃度は、パントテン酸、カルシウム塩由来のカルシウムを含まない。
培養が高生産性定常状態を得るまでバイオリアクタを操作した。高生産性定常状態は、約2.5〜3g/Lの細胞密度、>20g/Lのエタノール濃度、>3.0mmol/分のCO取り込み、及び>0.5mmol/分の水素取り込みと定義した。
次にガス取り込みH2及びCO、生成物濃度並びに細胞密度の培養パラメータをいずれの悪影響についてもモニターした。成分濃度の低減が、数(>3)細胞保持時間後の当該パラメータに影響を及ぼさなかった場合、その濃度をさらに減らすことになる。成分濃度の低減後に培養パラメータの低下が見られた場合、その濃度を上昇させて、以前に十分であると示されたレベルに戻すことになる。培養が回復した場合、再び濃度を時にはその影響を繰り返す前と同レベルまで、時には正常に機能するレベルと問題を起こすレベルとの間のどこかのレベルまで下げることになる。
この実験の開始時にはリアクタ内のNi濃度は当初のNiレベルの56%、つまり0.11ppmに低下していた。リアクタ内のニッケル濃度は、培地中のNi濃度、培地及び／又はリアクタへのNi添加、並びにシステムを通る液体流を用いて、リアクタ内の経時的に変化するNi濃度を計算する「洗い出し」計算に基づいた。Niをリアクタから洗い出し続けている間に培養パラメータは変化しなかった。細胞濃度は約2.8g/Lを維持し；CO取り込みは約3.2mmol/分；H2取り込みは約0.7mmol/分；エタノール濃度は24g/L；及び総アセチルは約2.5g/Lであった。しかしながら、ほぼt=107時間までに細胞形態が悪化し始めた。長細胞の割合が約5%から5〜10%に増加し、長細胞の長さは増加していた。今や長細胞はいくらかのゆがみを示していた。平均的細胞の全長も増加していたが、ゆがみはごく穏やか又はなかった。細胞形態が低下した前後にリアクタ内のNi濃度は約0.0996ppmに降下した。
リアクタ内のニッケル濃度は、t=約160時間までに約50%である0.0988ppmに洗い出された。前述同様に、培養パラメータはあまり変わらなかった。しかしながら、ほぼt=250時間を観測したときには細胞形態が悪くなった。長細胞の割合は、当該長細胞の屈曲又はゆがみの度合と共に約10〜20%増えた。培養物の残りは、長さが平均的乃至わずかに長く、時折屈曲を有した。コイル又はバネのように激しく屈曲した細胞はなかったが、いくつかのザラザラした細胞及び中空体化細胞が見られた。この場合もやはり、培養パラメータ又はニッケル濃度の変化は起きなかった。
t=1885時間までリアクタ内のニッケル濃度は50%、つまり0.0988ppmを維持した。約0.87ml/分の培地流速では、ニッケル供給速度は0.12mg/日であった。培養パラメータは約2.8g/Lの細胞密度、約3.2mmol/分のCO取り込み、約0.7mmol/分のH2取り込み、約25g/Lのエタノール、約2.5g/Lの総アセチル、及び約0.3g/Lのブタノールでほぼ一定していた。50%のニッケル供給速度では、生成細胞1グラム当たり約34μg、ガス取り込み1mmol当たり約0.022μgでNiが添加された。Ni濃度が0.0988ppmになった時点で細胞形態の悪化は続かなかった。細胞形態は、穏やかなゆがみのある約10%の長細胞、中程度のゆがみのある約5%の極長細胞を維持し、残余の細胞は長さが平均的乃至わずかに長く、時折ゆがみを有した。
t=445時間では、培地中のNi濃度は、当初の25%、つまり0.049ppmに減少した。ほぼ即座に、緩徐であるが定常的な変化が培養パラメータに観察された。CO取り込みは約3.2mmol/分で一定のままであったが、H2取り込みは、Ni減少の約120分以内に0.7〜0.8mmol/分から0.6〜0.7mmol/分に低減し始めた。Ni変化の約160時間以内にエタノール濃度は約24g/Lから約21g/Lに低下し始め、総アセチルレベルも約2.5g/Lから約2.0g/Lに低下し始めた。Niが培地中で低下したのとほぼ同時に、ブタノール濃度は緩徐であるが定常的な増加が始まった。この濃度は、Niの減少後約635時間までに約0.21g/Lから約0.34g/Lに上昇した。細胞形態は相対的に変化しなかった。より低いNi供給速度は今や0.062mg/日であった。当該供給速度では、Niは、生成細胞1グラム当たり約18μg、ガス取り込み1mmol当たり約0.011μg添加された。
低Ni濃度の培養への効果を促進させるため、t=638時間に培地中のNiレベルを10%又は当初濃度、つまり0.0198ppmまで下げた。培養パラメータには前述と同じ傾向が続いたが、より高速であった。H2取り込み及び酸濃度は減少し続けた。細胞密度及びCO取り込みは変化せず、ブタノール濃度は上昇し続けた。細胞密度は約2.8g/Lを維持したまま、未だに変化しなかった。水素取り込みは約0.5〜0.6mmol/分であった。二酸化炭素取り込みはまだ約3.2mmol/分であった。生成物濃度は約21g/Lのエタノール、約1.5g/Lの総アセチル、及び約0.65g/Lのブタノールであった。Ni濃度をさらに86時間10%で保って、パラメータ及び細胞形態への長期的影響を判断した。培養パラメータのさらなる低下はなかった。培養形態はいくらか悪化しなかったが、長細胞数の増加並びに細胞の全長の増加を示した。約10〜15%の細胞が、ゆがみのある長細胞と分類された。残余の細胞は短い乃至わずかに長く、過半数の細胞が平均的長さを有し、ゆがみがなかった。10%、つまり0.01975ppmの培地中のNi濃度では、Ni供給速度は0.025mg/日であった。これにより生成細胞1グラム当たり約7μgのNi、又はガス取り込み1mmol当たり約0.0048μgのNiが添加された。t=2270時間に、ニッケル濃度は増加して約50%、つまり0.0988ppmに戻った。水素取り込みは約0.7mmol/分に増加した。CO取り込みは約3.2mmol/分のままだった。エタノールは約24g/Lに上昇した。酸は約2.5g/Lに増加した。ブタノールは約0.24g/Lに低下し、細胞密度は約2.9g/Lで不変のままであった。細胞形態も改善し、細胞の長さ及び長細胞数の全体的減少を示した。約5〜10%の細胞が、穏やかなゆがみのある長い細胞と分類された。残余の細胞は、長さが短い乃至わずかに長く、それらの大部分は平均的長さで、時折わずかなゆがみを有するだけであった。
リアクタ内のNi濃度を0.0988ppm、つまり50%に下げても、培養パラメータに識別可能な変化は生じなかった。しかしながら、細胞形態は悪化し、細胞の20%までが穏やか乃至中程度のゆがみのある長い細胞とみなされる、培養の全体的長さの増加を示した。細胞形態は悪化し続けることはなく、50%のNi濃度で培養は当該条件下で定常状態を保つであろうことを示した。
培地中のニッケル濃度が標準の25%、つまり0.049ppmまで低下したとき、エタノール及び総アセチル濃度並びにH2取り込みは全て低下し始めた。同時に、ブタノール濃度はゆっくり増加し始めた。これらは全て、培養はNi制限されているが、細胞形態は相対的に不変のままだったことを示している。
培養パラメータ及び細胞形態が低下し始めたときに計算されたリアクタ内のニッケル濃度に基づくと、Niが50%、つまり0.099ppmまでに洗い出されたとき、形態が最初に悪化した。Ni濃度がさらに36%、つまり0.072ppmに低下したときに、ブタノール濃度が悪化した。29%のNi、つまり0.057ppmでは、H2取り込みが低下し始めた。そして最後に25%のNi、つまり0.050ppmで、エタノール及び酸濃度が低下し始めた。50%のNiだけで、培養形態が影響を受けた。Niレベルがさらに低下した時点で、培養の取り込み及び生産性が低下した。これは、培地中50%のNi濃度、又は0.12mg/日の供給速度がNi限界に非常に近いことを示している。培養パラメータ及び0.12mg/日のNi供給速度に基づいて、Niは、生成細胞の1グラム当たり約34μg、ガス取り込み1mmol当たり約0.022μgで添加された。
Ni限界の兆候は、H2取り込みの低減、酸レベルの低下、ブタノール濃度の上昇後のエタノール濃度の低下であった。細胞密度には変化が見られなかった。最終的に細胞形態は影響を受け、長細胞の総数及び当該長細胞の全長の増加を示した。一般的に、細胞の長さが増加するにつれて、細胞はさらに曲がるか又はゆがんで来る。
実施例4：タングステンを制限した発酵
実験は、透過パージなしで直線状のCSTRとして作動するバイオリアクタ(New Brunswick BioFlo I又はIIc)で行なった。バイオリアクタ操作条件は以下の通り：
培養菌タイプはクロストリジウム・リュングダリイC01であった。
培養温度は38〜39℃で維持した。
撹拌はアナログ読み取りで700rpmであった。
かき回されない培養体積は約1500〜1700mlであった。
かき回された培養体積は約1900mlであった。
培養pH設定点は4.5であった。pH調節のため7.7%のNaHCO3溶液を用いた。
フィードガスは、15%のH2、45%のN2、30%のCO及び10%のCO2の合成ブレンドであり、290ml/分の速度で培養に供給した。
培地は、約0.86〜約0.88ml/分、又は約1250ml/日でリアクタに供給した。
液体及び細胞の保持時間は約28〜31時間であった。
実験は、透過パージなしで直線状のCSTRとして作動するバイオリアクタ(New Brunswick BioFlo I又はIIc)で行なった。バイオリアクタ操作条件は以下の通り：
培養菌タイプはクロストリジウム・リュングダリイC01であった。
培養温度は38〜39℃で維持した。
撹拌はアナログ読み取りで700rpmであった。
かき回されない培養体積は約1500〜1700mlであった。
かき回された培養体積は約1900mlであった。
培養pH設定点は4.5であった。pH調節のため7.7%のNaHCO3溶液を用いた。
フィードガスは、15%のH2、45%のN2、30%のCO及び10%のCO2の合成ブレンドであり、290ml/分の速度で培養に供給した。
培地は、約0.86〜約0.88ml/分、又は約1250ml/日でリアクタに供給した。
液体及び細胞の保持時間は約28〜31時間であった。
用いた培地は以下の通りだった。
* Na+濃度はNaCl由来のみである。それは、Na2WO4・2H2O等の他成分由来のNa+を含まない。
** Ca2+濃度は、パントテン酸、カルシウム塩由来のカルシウムを含まない。
** Ca2+濃度は、パントテン酸、カルシウム塩由来のカルシウムを含まない。
培養が高生産性定常状態を得るまでバイオリアクタを操作した。高生産性定常状態は、約2.5〜3g/Lの細胞密度、>20g/Lのエタノール濃度、>3.0mmol/分のCO取り込み、及び>0.5mmol/分の水素取り込みと定義した。
次にガス取り込みH2及びCO、生成物濃度並びに細胞密度の培養パラメータをいずれの悪影響についてもモニターした。成分濃度の低減が、数(>3)細胞保持時間後の当該パラメータに影響を及ぼさなかった場合、その濃度をさらに減らすことになる。成分濃度の低減後に培養パラメータの低下が見られた場合、その濃度を上昇させて、以前に十分であると示されたレベルに戻すことになる。培養が回復した場合、再び濃度を時にはその影響を繰り返す前と同レベルまで、時には正常に機能するレベルと問題を起こすレベルとの間のどこかのレベルまで下げることになる。
リン試験中、t=0時間でタングステンを培地から除去した。Pのリアクタ及び培地調合液への添加にもかかわらず、リン試験中に期待されたようには培養は回復していなかった。培養を改善するための一連の試みが失敗したときには、t=812時間に最後の手段として0.2g/lのNa2WO4・2H2O溶液8mlを1.6リットルの培養に添加することによって、リアクタにタングステンを添加して標準レベルの50%、つまり0.56ppmに戻した。タングステン洗い出し計算は、リアクタ内のタングステンレベルを<0.0001ppmに洗い出したこと示した。タングステンを添加すると、培養はほとんど即座に反応した。H2取り込みが増加し始めた。H2変換の改善により、フィードガス流速は上昇してt=885時間までに当初設定の約290ml/分に戻った。それはCO及びH2取り込みを増やしてそれぞれ3.2及び約0.75mmol/分に戻した。ガス取り込みの増加により、細胞密度は約2.7g/Lに増加し、エタノールレベルは約22g/Lに上昇した。総アセチル及びブタノールレベルは、それぞれ約3.5及び約0.45g/Lでほぼ同じままだった。培養の別の変化は、細胞形態の改善であった。タングステン添加によって、全体的な細胞長が顕著に減少し、細胞の屈曲及びゆがみは少なかった。
培養が必要とするタングステンのレベルを試して判定するため、培地にタングステンを戻さないでリアクタ内のレベルを洗い出して引き下げた。タングステンが洗い出されるにつれて、t=904時間あたりでH2取り込みが下降線をたどり始めた。リアクタにも培地にもタングステンを添加しなかった。t=981時間あたりでブタノール濃度がゆっくり上昇し始めた。そしてt=1030時間あたりでエタノール濃度が下降し始めた。まだタングステンを添加しなかった。t=1100時間までにH2取り込みは約0.2mmol/分；エタノールは約17g/L；及びブタノールは約0.74g/Lであった。CO取り込みは影響を受けず、細胞密度はほぼ同じだった。
t=1100時間に、標準の50%、つまり0.56ppmでタングステンをリアクタに添加した。以前に見られたように、培養はほとんど即座に改善し始めた。H2取り込みは増加し始め；エタノール濃度は上昇し；酸レベルは低下し；細胞密度はわずかに増加し；ブタノール濃度は減少し始めた。調査報告期間の最後に細胞密度は約3.3g/L；CO及びH2取り込みはそれぞれ約3.2及び約0.75mmol/分；エタノールは22g/L；酸は約2.5g/L；ブタノールは0.52g/Lであった。調査報告期間の最後までに、リアクタ内のタングステンレベルは洗い出されて0.045ppm、つまり当初濃度の4.0%に低減した。
タングステン限界は、以前に添加した当初濃度の約2.7%、つまり0.030ppmであった。タングステンがリアクタから洗い出されて0.030ppmまで下がったとき、培養は最初に、減少するH2取り込みとして窮迫の兆候を示し始めた。当該濃度で、生成細胞1グラム当たり10μg、ガス取り込み1mmol当たり0.0068μgでタングステンを添加した。
実施例5：ホウ素、銅、マンガン及びモリブデンを制限した発酵
如何なるB、Cu、Mn又はMoをも含まない培地(培地Aと命名)又はB、Cu、Mn及びMoを含む既知培地(402培地と命名)を含有するNew Brunswick Bioflow Cellii Gen 115リアクタに、活発に成長するクロストリジウム・リュングダリイCO-1株0.39g/Lを播種した。
如何なるB、Cu、Mn又はMoをも含まない培地(培地Aと命名)又はB、Cu、Mn及びMoを含む既知培地(402培地と命名)を含有するNew Brunswick Bioflow Cellii Gen 115リアクタに、活発に成長するクロストリジウム・リュングダリイCO-1株0.39g/Lを播種した。
播種後、リアクタの撹拌速度を800rpmに設定した。約1時間間隔でリアクタから採取したガス及び液体サンプルを種々のガス成分の消費又は生成、ブロス酢酸濃度、ブロスエタノール濃度及び培養物の光学密度について分析した。またシンガス中の種々のガスの組成を毎日測定し、リアクタへのシンガスを調節するマスフローコントローラによって、リアクタへのシンガス流量を実時間測定した。マスフローコントローラを較正することによって得た方程式を用いて実際のガス流量を計算した。計算を行なって、リアクタへの流入ガス中のH2から一定割合のH2取り込みを維持するために必要リアクタへのガス流速を決定した。或いは言い換えると、この特定実験では、H2の培養取り込みが、リアクタ中に流れるガスの総分子の4.5%であるように、リアクタ中に流れるガスの速度を維持した。そして、上で計算した速度でリアクタにガスを供給した(入口からのH2の取り込みの割合を総ガス分子の4.5%に維持するため)。
3つ全ての実験では、播種前に細胞リサイクルシステムをリアクタに取り付け、該システムは、実験の全持続時間システム中を循環する培地を有した。培地Aを用いた第1実験では、播種後(CO転化率が80%以上に達した後)2.75時間で、リアクタへの培地流を1.0ml/分で開始し、リアクタから1.0ml/分で透過流(permeate)を引き出した。播種後6.83時間で、リアクタへの培地流を2.0ml/分に増やし、リアクタから2.0ml/分で透過流を引き出した。
402培地を用いた第2実験では、播種後(CO転化率が80%以上に達した後)1.9時間で、リアクタへの培地流を2.0ml/分で開始し、リアクタから2.0ml/分で透過流を引き出した。
培地Aを用いた第3実験では、播種後(CO転化率が80%以上に達した後)2.0時間で、リアクタへの培地流を2.0ml/分で開始し、リアクタから2.0ml/分で透過流を引き出した。3つ全ての実験では、細胞リサイクルシステムの導入を行なって、リアクタ内におけるエタノールの急速な蓄積を排除した。
培地A及402培地は、クロストリジウム・リュングダリイによる水素取り込みに対してほぼ等価な性能をもたらした。
実施例6：モリブデンを制限した発酵
実験は、透過パージなしで直線状のCSTRとして作動するバイオリアクタ(New Brunswick BioFlo I又はIIc)で行なった。バイオリアクタ操作条件は以下の通り：
培養菌タイプはクロストリジウム・リュングダリイC01であった。
培養温度は38〜39℃で維持した。
撹拌はアナログ読み取りで850rpmであった。
かき回されない培養体積は約1600〜1650mlであった。
かき回された培養体積は約1900mlであった。
培養pH設定点は4.5であった。pH調節のため7.7%のNaHCO3溶液を用いた。
フィードガスは、15%のH2、45%のN2、30%のCO及び10%のCO2の合成ブレンドであり、282ml/分の速度で培養に供給した。
培地は、約0.88ml/分、又は約1300ml/日でリアクタに供給した。
液体及び細胞の保持時間は約29〜31時間であった。
実験は、透過パージなしで直線状のCSTRとして作動するバイオリアクタ(New Brunswick BioFlo I又はIIc)で行なった。バイオリアクタ操作条件は以下の通り：
培養菌タイプはクロストリジウム・リュングダリイC01であった。
培養温度は38〜39℃で維持した。
撹拌はアナログ読み取りで850rpmであった。
かき回されない培養体積は約1600〜1650mlであった。
かき回された培養体積は約1900mlであった。
培養pH設定点は4.5であった。pH調節のため7.7%のNaHCO3溶液を用いた。
フィードガスは、15%のH2、45%のN2、30%のCO及び10%のCO2の合成ブレンドであり、282ml/分の速度で培養に供給した。
培地は、約0.88ml/分、又は約1300ml/日でリアクタに供給した。
液体及び細胞の保持時間は約29〜31時間であった。
用いた培地は以下の通りだった。
* Na+濃度はNaCl由来のみである。それは、Na2WO4・2H2O等の他成分由来のNa+を含まない。
** Ca2+濃度は、パントテン酸、カルシウム塩由来のカルシウムを含まない。
** Ca2+濃度は、パントテン酸、カルシウム塩由来のカルシウムを含まない。
培養が高生産性定常状態を得るまでバイオリアクタを操作した。高生産性定常状態は、約2.5〜3g/Lの細胞密度、>20g/Lのエタノール濃度、>3.0mmol/分のCO取り込み、及び>0.5mmol/分の水素取り込みと定義した。
次にガス取り込みH2及びCO、生成物濃度並びに細胞密度の培養パラメータをいずれの悪影響についてもモニターした。成分濃度の低減が、数(>3)細胞保持時間後の当該パラメータに影響を及ぼさなかった場合、その濃度をさらに減らすことになる。成分濃度の低減後に培養パラメータの低下が見られた場合、その濃度を上昇させて、以前に十分であると示されたレベルに戻すことになる。培養が回復した場合、再び濃度を時にはその影響を繰り返す前と同レベルまで、時には正常に機能するレベルと問題を起こすレベルとの間のどこかのレベルまで下げることになる。
t=0でNa2MoO4・2H2Oを培地調合液から排除することによって、モリブデン要求試験を開始した。当該成分を除去する直前に、培養条件／パラメータは以下の通りだった。
細胞密度−3.2g/L
CO転化率−86%
H2転化率−36%
CO取り込み−3.0mmol/分
H2取り込み−0.56mmol/分
エタノール−21.8g/L
総アセチル−2.3g/L
ブタノール−0.32g/L
細胞密度−3.2g/L
CO転化率−86%
H2転化率−36%
CO取り込み−3.0mmol/分
H2取り込み−0.56mmol/分
エタノール−21.8g/L
総アセチル−2.3g/L
ブタノール−0.32g/L
約9.7の細胞保持時間(292時間)後、培養ブロス中のモリブデン濃度は、0.238ppmのMoという最初の濃度の<0.0001%まで低下した。ブロス中の推定残存成分濃度は、開始カルシウム濃度、MFR、LRT及び培地又はスパイクによるMoのバイオリアクタへの任意の添加を利用して洗い出し計算によって決定した。培養性能への悪影響はなかった。モリブデンを添加せずに292時間後、培養パラメータ／条件は以下の通りだった：
細胞密度−2.9g/L
CO転化率−86%
H2転化率−36%
CO取り込み−3.0mmol/分
H2取り込み−0.61mmol/分
エタノール−21.0g/L
総アセチル−2.9g/L
ブタノール−0.32g/L
細胞密度−2.9g/L
CO転化率−86%
H2転化率−36%
CO取り込み−3.0mmol/分
H2取り込み−0.61mmol/分
エタノール−21.0g/L
総アセチル−2.9g/L
ブタノール−0.32g/L
実施例7：マグネシウムを制限した発酵
実験は、細胞リサイクルループなしで直線状のCSTRとして作動するバイオリアクタ(New Brunswick BioFlo I又はIIc)で行なった。バイオリアクタ操作条件は以下の通り：
培養菌タイプはクロストリジウム・リュングダリイC01であった。
培養温度は37〜39℃で維持した。
撹拌はアナログ読み取りで880〜890rpmであった。
かき回されない培養体積は約1275mlであった。
かき回された培養体積は約1900mlであった。
培養pH設定点は4.2であった。pH調節のため7.7%のNaHCO3溶液を用いた。
フィードガスは、15%のH2、45%のN2、30%のCO及び10%のCO2の合成ブレンドであり、232ml/分の速度で培養に供給した。
培地は、約0.70ml/分、又は約1008ml/日でリアクタに供給した。
液体及び細胞の保持時間は約29〜31時間であった。
実験は、細胞リサイクルループなしで直線状のCSTRとして作動するバイオリアクタ(New Brunswick BioFlo I又はIIc)で行なった。バイオリアクタ操作条件は以下の通り：
培養菌タイプはクロストリジウム・リュングダリイC01であった。
培養温度は37〜39℃で維持した。
撹拌はアナログ読み取りで880〜890rpmであった。
かき回されない培養体積は約1275mlであった。
かき回された培養体積は約1900mlであった。
培養pH設定点は4.2であった。pH調節のため7.7%のNaHCO3溶液を用いた。
フィードガスは、15%のH2、45%のN2、30%のCO及び10%のCO2の合成ブレンドであり、232ml/分の速度で培養に供給した。
培地は、約0.70ml/分、又は約1008ml/日でリアクタに供給した。
液体及び細胞の保持時間は約29〜31時間であった。
用いた培地は以下の通りだった。
* Na+濃度はNaCl由来のみである。それは、Na2WO4・2H2O等の他成分由来のNa+を含まない。
培養が高生産性定常状態を得るまでバイオリアクタを操作した。高生産性定常状態は、約2.5〜3g/Lの細胞密度、>20g/Lのエタノール濃度、>3.0mmol/分のCO取り込み、及び>0.5mmol/分の水素取り込みと定義した。
次にガス取り込みH2及びCO、生成物濃度並びに細胞密度の培養パラメータをいずれの悪影響についてもモニターした。成分濃度の低減が、数(>3)細胞保持時間後の当該パラメータに影響を及ぼさなかった場合、その濃度をさらに減らすことになる。成分濃度の低減後に培養パラメータの低下が見られた場合、その濃度を上昇させて、以前に十分であると示されたレベルに戻すことになる。培養が回復した場合、再び濃度を時にはその影響を繰り返す前と同レベルまで、時には正常に機能するレベルと問題を起こすレベルとの間のどこかのレベルまで下げることになる。
実験の最初には、マグネシウム濃度は標準エタノール培地レベル、つまり59.77ppmであった。培養パラメータは約3.1g/Lの細胞密度；20.5g/Lのエタノール；3.0g/Lのアセチル；2.4mmol/分のCO取り込み；及び0.42mmol/分のH2取り込みで安定していた。t=0時間で開始して培地中のマグネシウム濃度を14.97ppmまで減少させた。発酵槽からマグネシウムを洗い出しながら、培養性能への影響の可能性について全てのパラメータをモニターした。約300時間又は約10細胞保持時間後、培養性能に有害な影響は観察されなかった。マグネシウムの低減後にほぼ即座にアセチル濃度が低下したが、これは培地フィード問題のためであった。この問題が是正されるとすぐに、アセチル濃度は上昇して、Mg濃度が59.77ppmであったときに見られた濃度と同様のレベルに戻った。14.97ppmのMgを含有する培地フィードは、約30時間の細胞保持時間で約3g/Lの細胞密度で培養を持続できると結論づけた。
59.77ppmのMg
細胞密度−3.1g/L
CO転化率−84%
H2転化率−32%
CO取り込み−2.4mmol/分
H2取り込み−0.42mmol/分
エタノール−20.5g/L
総アセチル−2.4g/L
14.94ppmのMg
細胞密度−3.0g/L
CO転化率−84%
H2転化率−34%
CO取り込み−2.4mmol/分
H2取り込み−0.45mmol/分
エタノール−21.0g/L
総アセチル−2.7g/L
細胞密度−3.1g/L
CO転化率−84%
H2転化率−32%
CO取り込み−2.4mmol/分
H2取り込み−0.42mmol/分
エタノール−20.5g/L
総アセチル−2.4g/L
14.94ppmのMg
細胞密度−3.0g/L
CO転化率−84%
H2転化率−34%
CO取り込み−2.4mmol/分
H2取り込み−0.45mmol/分
エタノール−21.0g/L
総アセチル−2.7g/L
t=403時間で開始して培地中のマグネシウム濃度をさらに7.47ppmまで減少させた。発酵槽からマグネシウムを洗い出しながら、培養性能への影響の可能性について全てのパラメータをモニターした。たった20時間後に水素の転化率及び取り込みが減少し始めた。培養中の計算Mg濃度は約11ppmであった。培養にも培地にもマグネシウムを数回添加したにもかかわらず、COの転化率／取り込みの低下、アセチル濃度の上昇、エタノール濃度の低下及び細胞密度の定常的降下を伴って培養性能は低下し続けた。培養は最終的に失われた。7.47ppmのMgを含有する培地フィードは、30時間の細胞保持時間で3g/lの培養を持続するのに十分でないと結論づけた。
実施例8：カリウムを制限した発酵
実験は、細胞リサイクルループなしで直線状のCSTRとして作動するバイオリアクタ(New Brunswick BioFlo I又はIIc)で行なった。バイオリアクタ操作条件は以下の通り：
培養菌タイプはクロストリジウム・リュングダリイC01であった。
培養温度は38〜39℃で維持した。
撹拌はアナログ読み取りで950〜1000rpmであった。
かき回された培養体積は約1550mlであった。
培養pH設定点は4.2であった。pH調節のため7.5%のNaHCO3溶液を用いた。
フィードガスは、15%のH2、45%のN2、30%のCO及び10%のCO2の合成ブレンドであり、279ml/分の速度で培養に供給した。
培地は、約0.80〜0.85ml/分、又は約1220ml/日でリアクタに供給した。
液体及び細胞の保持時間は約28〜30時間であった。
実験は、細胞リサイクルループなしで直線状のCSTRとして作動するバイオリアクタ(New Brunswick BioFlo I又はIIc)で行なった。バイオリアクタ操作条件は以下の通り：
培養菌タイプはクロストリジウム・リュングダリイC01であった。
培養温度は38〜39℃で維持した。
撹拌はアナログ読み取りで950〜1000rpmであった。
かき回された培養体積は約1550mlであった。
培養pH設定点は4.2であった。pH調節のため7.5%のNaHCO3溶液を用いた。
フィードガスは、15%のH2、45%のN2、30%のCO及び10%のCO2の合成ブレンドであり、279ml/分の速度で培養に供給した。
培地は、約0.80〜0.85ml/分、又は約1220ml/日でリアクタに供給した。
液体及び細胞の保持時間は約28〜30時間であった。
用いた培地は以下の通りだった。
* Na+濃度はNaCl由来のみである。それは、Na2WO4・2H2O等の他成分由来のNa+を含まない。
培養が高生産性定常状態を得るまでバイオリアクタを操作した。高生産性定常状態は、約2.5〜3g/Lの細胞密度、>20g/Lのエタノール濃度、>3.0mmol/分のCO取り込み、及び>0.5mmol/分の水素取り込みと定義した。
次にガス取り込みH2及びCO、生成物濃度並びに細胞密度の培養パラメータをいずれの悪影響についてもモニターした。成分濃度の低減が、数(>3)細胞保持時間後の当該パラメータに影響を及ぼさなかった場合、その濃度をさらに減らすことになる。成分濃度の低減後に培養パラメータの低下が見られた場合、その濃度を上昇させて、以前に十分であると示されたレベルに戻すことになる。培養が回復した場合、再び濃度を時にはその影響を繰り返す前と同レベルまで、時には正常に機能するレベルと問題を起こすレベルとの間のどこかのレベルまで下げることになる。
実験の最初に、カリウム濃度は標準エタノール培地レベル、つまり78.7ppmであった。培養パラメータは約3g/Lの細胞密度；約22g/Lのエタノール；約2.6g/Lのアセチル；0.5g/Lのブタノール；3.1mmol/分のCO取り込み；及び0.5〜0.6mmol/分のH2取り込みで安定していた。t=0時間で開始して培地中のカリウム濃度を39.3ppmまで減少させた。発酵槽からカリウムを洗い出しながら、変化について培養性能をモニターした。約30時間後、H2取り込みが低下し始めた後、CO取り込みが降下した。水素取り込みは0.078mmol/分まで低下し、CO取り込みは2.8mmol/分の低さまで落ちた。カリウム減少後約40時間で酢酸濃度も0.78g/Lの低さまで落ちた後、エタノール濃度が19.2g/Lに低下した。ブタノール濃度は0.67g/Lに上昇した。2.3g/Lへの低下によって分かるように細胞密度も影響を受けたが、それは、カリウムの減少直後に意図していない細胞保持時間の27時間への減少の結果であったかもしれない。リアクタにカリウムを添加して濃度を78.7ppmに上昇させた。この効果は即座にCO取り込み、H2取り込み、エタノール及び酸濃度の増加として見られた。ブタノールレベルは、カリウムの増加と共にゆっくり減少して約0.53g/Lに戻った。
カリウムを制限する前に観察されたレベルまで培養が回復されたようにみえたらすぐに、t=139時間で培地中のカリウム濃度を59.0ppmまで下げた。再び、いずれの変化についても培養パラメータをモニターした。カリウムの減少後約8時間で前述のようにH2取り込みが減少し始めた。しかしながら、この時にはCO取り込みは影響されなかった。約0.57g/Lまでブタノールが少し増加した。酢酸濃度が降下したが、これは、カリウムレベルの低下前に見られた減少傾向の続きであった。エタノールレベルは約22g/Lのままだった。細胞密度は、カリウムレベルの低下と共に約3.0g/Lから2.8g/Lまで少し低下した。データの分散は、近似的細胞密度濃度のみを報告できるようにした。カリウムをリアクタ中に加えて濃度を78.7ppmに上昇させた。この効果は即座にH2取り込み、エタノール濃度、酸濃度及び細胞密度の増加として見られ、培養がカリウム制限されたことを確証する。
カリウムを59.0ppmまで減らすことの全体的影響は、それが39.3ppmまで低下するより少なかったが、当該レベルはまだ制限的とみなされた。従って培地中78.7ppmというカリウムレベルが限界に近いとみなされた。当該レベルが本当に限界であるかどうかを判定するため、t=243時間で培地中のカリウム濃度を98.3ppmに高めた。カリウム濃度の増加と共に、H2取り込みは約0.61mmol/分から約0.71mmol/分へ増加した。細胞密度も約3.0から約3.3g/lに増加した。酢酸は、カリウムが78.7ppmの時の2.6g/Lに比べて約3.3g/Lで高かった。ブタノール濃度はデータ分散の範囲内で多かれ少なかれ一定していた。エタノールレベルは、24g/lまで少し増加を示すようだったが、データの分散がそれを判定するのを困難にした。カリウムを98.3ppmに増やすことかからは何らかのプラス効果があったので、t=375時間でカリウム濃度をさらに118ppmまで高めた。培養パラメータへの唯一の最も信頼できる効果は、約3.9g/Lまでのさらなる細胞密度の増加であった。全ての他のパラメータはデータ分散の範囲内で一定のままだった。
実施例9：システインを制限した発酵
実験は、細胞リサイクルループなしで直線状のCSTRとして作動するバイオリアクタ(New Brunswick BioFlo I又はIIc)で行なった。バイオリアクタ操作条件は以下の通り：
培養菌タイプはクロストリジウム・リュングダリイC01であった。
培養温度は38〜39℃で維持した。
撹拌はアナログ読み取りで900rpmであった。
かき回された培養体積は約1650mlであった。
培養pH設定点は4.5であった。pH調節のため7.5%のNaHCO3溶液を用いた。
フィードガスは、15%のH2、45%のN2、30%のCO及び10%のCO2の合成ブレンドであり、279ml/分の速度で培養に供給した。
培地は、約0.83〜0.86ml/分、又は約1220ml/日でリアクタに供給した。
液体及び細胞の保持時間は約28〜30時間であった。
実験は、細胞リサイクルループなしで直線状のCSTRとして作動するバイオリアクタ(New Brunswick BioFlo I又はIIc)で行なった。バイオリアクタ操作条件は以下の通り：
培養菌タイプはクロストリジウム・リュングダリイC01であった。
培養温度は38〜39℃で維持した。
撹拌はアナログ読み取りで900rpmであった。
かき回された培養体積は約1650mlであった。
培養pH設定点は4.5であった。pH調節のため7.5%のNaHCO3溶液を用いた。
フィードガスは、15%のH2、45%のN2、30%のCO及び10%のCO2の合成ブレンドであり、279ml/分の速度で培養に供給した。
培地は、約0.83〜0.86ml/分、又は約1220ml/日でリアクタに供給した。
液体及び細胞の保持時間は約28〜30時間であった。
用いた培地は以下の通りだった。
* Na+濃度はNaCl由来のみである。それは、Na2WO4・2H2O等の他成分由来のNa+を含まない。
実験の最初に、システイン濃度は標準エタノール培地レベル、つまり250ppmだった。培養パラメータは約3g/Lの細胞密度；23g/Lのエタノール；2.4g/Lのアセチル；3.1mmol/分のCO取り込み；及び0.56mmol/分のH2取り込みで安定していた。t=0時間で開始して培地中のシステインを187.5ppmまで減らした。システインを発酵槽から洗い出しながら、限界の兆候について全てのパラメータをモニターした。システイン濃度は167時間又は5 XRT間当該レベルで保持された。全てのパラメータは一定のままだった。187.5ppm濃度のシステインは、33時間の細胞保持時間で3g/Lの培養を持続するのに十分であった。
t=167時間に培地中のシステイン濃度を187.5ppmから125ppmまでさらに減らした。ほとんどすぐに、酢酸濃度の低減と共にH2の取り込み及び転化率が降下し始めた。COの取り込み及び転化率並びに細胞密度は一定だった。H2取り込みは0.36mmol/分まで下がり、H2転化率は21%まで低下し、酢酸は1.7g/Lに減少した。培地中及びバイオリアクタ中の両システイン濃度は187.5ppmに、次に250ppmまで増加した。培養は急速に回復した。システインの125ppmという濃度は、33時間の細胞保持時間で3g/Lの培養を持続するには十分でなかった。
培養が完全に回復した後、システイン限界を再び調べた。t=407時間で、培地中のシステインを162.5ppmまで減らした。以前に見られたように、ほとんど即座にH2の転化率及び取り込みが低下し始めた。酢酸濃度もやはり低下したが、システイン濃度が125ppmであったときほどには急速でないか又はそこまでは低下しなかった。H2取り込みは0.49mmol/分まで低下し、H2転化率は29%まで降下し、酢酸は3.0から2.7g/Lへ減少した。システインの162.5ppmという濃度は、33時間の細胞保持時間で3g/Lの培養を持続するのに十分でなかった。
実施例10：チアミンを制限した発酵
実験は、直線状のCSTRとして作動するバイオリアクタ(New Brunswick BioFlo I又はIIc)で行なった。バイオリアクタ操作条件は以下の通り：
培養菌タイプはクロストリジウム・リュングダリイC01であった。
培養温度は38〜39℃で維持した。
撹拌はアナログ読み取りで950rpmであった。
かき回された培養体積は約1950mlであった。
培養pH設定点は4.5であった。pH調節のため7.5%のNaHCO3溶液を用いた。
フィードガスは、15%のH2、45%のN2、30%のCO及び10%のCO2の合成ブレンドであり、279ml/分の速度で培養に供給した。
培地は、約0.84〜0.86ml/分、又は約1220ml/日でリアクタに供給した。
液体及び細胞の保持時間は約30〜32時間であった。
実験は、直線状のCSTRとして作動するバイオリアクタ(New Brunswick BioFlo I又はIIc)で行なった。バイオリアクタ操作条件は以下の通り：
培養菌タイプはクロストリジウム・リュングダリイC01であった。
培養温度は38〜39℃で維持した。
撹拌はアナログ読み取りで950rpmであった。
かき回された培養体積は約1950mlであった。
培養pH設定点は4.5であった。pH調節のため7.5%のNaHCO3溶液を用いた。
フィードガスは、15%のH2、45%のN2、30%のCO及び10%のCO2の合成ブレンドであり、279ml/分の速度で培養に供給した。
培地は、約0.84〜0.86ml/分、又は約1220ml/日でリアクタに供給した。
液体及び細胞の保持時間は約30〜32時間であった。
用いた培地は以下の通りだった。
* Na+濃度はNaCl由来のみである。それは、Na2WO4・2H2O等の他成分由来のNa+を含まない。
標準的に培地に添加されるビタミン溶液は0.0505g/Lのパントテン酸塩、0.040g/Lのビオチン及び0.10g/Lのチアミンの溶液だった。この研究では、ビタミン溶液を3つの溶液、各成分について1つの溶液に分けた。当該溶液の濃度は当初ビタミン混合物と同一に保った。このようにして、他のビタミン濃度を変えずに各成分の濃度を必要に応じて調整することができた。
この実験の最初に、培地中のパントテン酸濃度は、0.03535ppm又は培地1リットル当たり0.0505g/Lのパントテン酸溶液0.7mlであった。培地中のビオチン濃度は、標準ビタミン濃度の25%又は培地中0.0070ppmであった。これは培地1リットル当たり0.04g/Lのビオチン溶液を0.175ml添加したのと等価だった。培地中のチアミンレベルは、標準ビタミン濃度の25%、つまり0.0175ppmであった。これは培地1リットル当たり0.10g/Lのチアミン溶液を0.175ml添加したのと等価だった。t=0時間に、培地中のチアミン濃度は標準の15%、つまり0.0105ppmまで下げた。細胞密度への即時効果は見られなかった。しかしながら、ほとんど即座にH2取り込み、総アセチル濃度、及びエタノール濃度が全て降下し始め、0.0175ppmという以前のチアミン濃度が既に限界に近いことを示してる。同時にCO取り込みは3.1から3.2mmol/分へわずかに増加した。これは、撹拌速度が一定のままだったにもかかわらず、当該時間中の物質移動の増加の兆候であり得る。培養生産性低下の原因を検証するため、t=43時間にまず0.5mlのパントテン酸溶液をリアクタに添加した。これが培養に影響を及ぼなかったとき、t=84に0.115mlのチアミン溶液をリアクタに添加してリアクタ内のチアミンレベルを0.0175ppmまで上昇させた。これは培養への即時効果を有した。水素取り込み、酸レベル、及びエタノール濃度が全て増加し始めた。培養はこの追加チアミンが必要だった。
添加したパントテン酸及びチアミンをリアクタから洗い出して、培地添加から入る0.0354ppmのパントテン酸及び0.0105ppmのチアミンに戻すため、リアクタ内にさらなる変化を起こさなかった。これらのビタミンを洗い出しながら次の228時間にわたって、まずH2取り込みは約0.53mmol/分まで上昇してから、おそらくリアクタから余分なパントテン酸塩及びチアミンが洗い出されたので、約0.31mmol/分の低さまで低下した。しかしながら、ビタミンレベルへの変化がないか又はいずれの他の培養変化があっても、H2取り込みは定常的に増加し始め、t=273時間あたりで約0.5mmol/分に達した。酸及びエタノール濃度は決まったパターンに従わなかったが、25g/Lのエタノール及び1.1〜2.4g/Lの酸あたりで変化した。CO取り込みは3.2mmol/分で一定のままであり、細胞密度は2.8〜3.0g/Lでほぼ一定に保たれた。
実験の最初に、培地中のチアミンレベルを0.0175ppmから0.0105ppmに下げたとき、培養パラメータへの影響はほとんど即座であり、0.0175ppmのチアミンレベルは既に限界に近いことを示唆している。0.0105ppmのチアミンへの降下前に栄養素添加対培養性能の相互関係をより良く示すために用いた用いた計算パラメータは以下の通りだった：ガス取り込み1mmol当たり添加したμgチアミンは約0.0041μg/mmolであった。生成細胞1グラム当たり添加したチアミンのμgは約6.5μg/gであった。チアミンが0.0105ppmで本当に限界だったというさらなる確証は、リアクタ内のチアミンレベルを一時的にリアクタ中0.0175ppmに増加させたときの培養パラメータの即時改善であった。
本明細書で開示する発明についてその特定の態様、実施例及び応用を利用して述べたが、当業者は、請求項に記載の本発明の範囲から逸脱することなく、それらに多くの修正及び変更を加えることができるであろう。
Claims (24)
- 発酵培地内でシンガスを発酵させる工程を含む発酵プロセスであって、このプロセスは、少なくとも約1グラムのエタノール/(L・日・グラム細胞)の比STYを与えるのに有効であり、前記発酵培地は、約1.04ppm未満のホウ素、約0.16ppm未満のマンガン、約0.26ppm未満のモリブデン、又は約0.16ppm未満の銅を有する、発酵プロセス。
- 前記発酵培地が下記
細胞1グラム当たり少なくとも約112mgの窒素、
細胞1グラム当たり少なくとも約10.5mgのリン、又は
細胞1グラム当たり少なくとも約26mgのカリウム
の少なくとも1つ以上を含む、請求項1記載の発酵プロセス。 - 前記発酵培地が下記
細胞1グラム当たり約112〜約125mgの窒素、
細胞1グラム当たり約10.5〜約15mgのリン、又は
細胞1グラム当たり約26〜約36mgのカリウム
の少なくとも1つ以上を含む、請求項2記載の発酵プロセス。 - 前記窒素が、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、及びその混合物から成る群より選択される窒素源から供給され、前記リンが、リン酸、リン酸アンモニウム、リン酸カリウム、及びその混合物から成る群より選択されるリン源から供給され、前記カリウムが、塩化カリウム、リン酸カリウム、硝酸カリウム、硫酸カリウム、及びその混合物から成る群より選択されるカリウム源から供給される、請求項2記載の発酵プロセス。
- 前記発酵培地が下記
細胞1グラム当たり少なくとも約2.7mgの鉄、
細胞1グラム当たり少なくとも約10μgのタングステン、
細胞1グラム当たり少なくとも約34μgのニッケル、
細胞1グラム当たり少なくとも約9μgのコバルト、
細胞1グラム当たり少なくとも約4.5mgのマグネシウム、
細胞1グラム当たり少なくとも約11mgの硫黄、及び
細胞1グラム当たり少なくとも約6.5μgのチアミン
の1つ以上を含む、請求項1記載の発酵プロセス。 - 前記発酵培地が下記
細胞1グラム当たり約2.7〜約5mgの鉄、
細胞1グラム当たり約10〜約30μgのタングステン、
細胞1グラム当たり約34〜約40μgのニッケル、
細胞1グラム当たり約9〜約30μgのコバルト、
細胞1グラム当たり約4.5〜約10mgのマグネシウム、
細胞1グラム当たり約11〜約20mgの硫黄、及び
細胞1グラム当たり約6.5〜約20μgのチアミン
の1つ以上を含む、請求項5記載の発酵プロセス。 - 前記鉄が、塩化第一鉄、硫酸第一鉄、及びその混合物から成る群より選択される鉄源から供給され、前記タングステンが、タングステン酸ナトリウム、タングステン酸カルシウム、タングステン酸カリウム、及びその混合物から成る群より選択されるタングステン源から供給され、前記ニッケルが、塩化ニッケル、硫酸ニッケル、硝酸ニッケル、及びその混合物から成る群より選択されるニッケル源から供給され、前記コバルトが、塩化コバルト、フッ化コバルト、臭化コバルト、ヨウ化コバルト、及びその混合物から成る群より選択されるコバルト源から供給され、前記マグネシウムが、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウムから成る群より選択されるマグネシウム源から供給され、前記硫黄が、システイン、硫化ナトリウム、及びその混合物から成る群より選択される硫黄源から供給される、請求項6記載の発酵プロセス。
- 前記発酵培地のpHを約4.2〜約4.8の範囲で維持する、請求項1記載の発酵プロセス。
- 前記シンガスが少なくとも約0.75のCO/CO2比を有する、請求項1記載の発酵プロセス。
- 前記発酵が、前記シンガスを1種以上の酢酸生成菌と接触させる工程を含む、請求項1記載の発酵プロセス。
- 前記酢酸生成菌が、アセトゲニウム・キブイ、アセトアナエロビウム・ノテラエ、アセトバクテリウム・ウッディイ、アルカリバクルム・バッキCP11(ATCC BAA-1772)、ブラウティア・プロダクタ、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム、カルダナエロバクター・サブテラネウス、カルダナエロバクター・サブテラネウス・パシフィカム、カルボキシドテルムス・ヒドロゲノホルマンス、クロストリジウム・アセチカム、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・アセトブチリカムP262(DSMZ GermanyのDSM 19630)、クロストリジウム・オートエタノゲナム(DSMZ GermanyのDSM 19630)、クロストリジウム・オートエタノゲナム(DSMZ GermanyのDSM 10061)、クロストリジウム・オートエタノゲナム(DSMZ GermanyのDSM 23693)、クロストリジウム・オートエタノゲナム(DSMZ GermanyのDSM 24138)、クロストリジウム・カルボキシジボランスP7(ATCC PTA-7827)、クロストリジウム・コスカティイ(ATCC PTA-10522)、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・リュングダリイPETC(ATCC 49587)、クロストリジウム・リュングダリイERI2(ATCC 55380)、クロストリジウム・リュングダリイC-01(ATCC 55988)、クロストリジウム・リュングダリイO-52(ATCC 55889)、クロストリジウム・マグナム、クロストリジウム・パストゥリアナム(DSMZ GermanyのDSM 525)、クロストリジウム・ラグスダリP11(ATCC BAA-622)、クロストリジウム・スカトロゲネス、クロストリジウム・サーモアセチカム、クロストリジウム・ウルツネンセ、デスルホトマクルム・クズネツォビイ、ユーバクテリウム・リモーサム、ゲオバクター・スルフレデュセンス、メタノサルシナ・アセチボランス、メタノサルシナ・バーケリ、モーレラ・サーモアセチカ、モーレラ・サーモオートトロフィカ、オキソバクター・フェニギイ、ペプトストレプトコッカス・プロダクツス、ルミノコッカス・プロダクツス、サーモアナエロバクター・キブイ、及びその混合物から成る群より選択される、請求項10記載の発酵プロセス。
- 前記プロセスが少なくとも約1.0g/Lの細胞密度を与えるのに有効である、請求項1記載の発酵プロセス。
- 前記プロセスが少なくとも約5〜約99%のCO転化率を与えるのに有効である、請求項1記載の発酵プロセス。
- 前記発酵培地が約0.01g/L未満の酵母エキスを有する、請求項1記載の発酵プロセス。
- 前記発酵培地が約0.01g/L未満の炭水化物を有する、請求項1記載の発酵プロセス。
- 下記：
細胞1グラム当たり少なくとも約112mgの窒素、
細胞1グラム当たり少なくとも約10.5mgのリン、又は
細胞1グラム当たり少なくとも約26mgのカリウム
を含んでなる発酵培地であって、
前記発酵培地が、約1.04ppm未満のホウ素、約0.16ppm未満のマンガン、約0.26ppm未満のモリブデン、又は約0.16ppm未満の銅を有する、発酵培地。 - 前記発酵培地が、
細胞1グラム当たり約112〜約125mgの窒素、
細胞1グラム当たり約10.5〜約15mgのリン、又は
細胞1グラム当たり約26〜約36mgのカリウムを含む、
請求項16記載の発酵培地。 - 前記窒素が、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、及びその混合物から成る群より選択される窒素源から供給され、前記リンが、リン酸、リン酸アンモニウム、リン酸カリウム、及びその混合物から成る群より選択されるリン源から供給され、前記カリウムが、塩化カリウム、リン酸カリウム、硝酸カリウム、硫酸カリウム、及びその混合物から成る群より選択されるカリウム源から供給される、請求項17記載の発酵培地。
- 前記発酵培地が下記
細胞1グラム当たり少なくとも約2.7mgの鉄、
細胞1グラム当たり少なくとも約10μgのタングステン、
細胞1グラム当たり少なくとも約34μgのニッケル、
細胞1グラム当たり少なくとも約9μgのコバルト、
細胞1グラム当たり少なくとも約4.5mgのマグネシウム、
細胞1グラム当たり少なくとも約11mgの硫黄、及び
細胞1グラム当たり少なくとも約6.5μg のチアミン
の1つ以上を含む、請求項16記載の発酵培地。 - 前記発酵培地が下記
細胞1グラム当たり約2.7〜約5mgの鉄、
細胞1グラム当たり約10〜約30μgのタングステン、
細胞1グラム当たり約34〜約40μgのニッケル、
細胞1グラム当たり約9〜約30μgのコバルト、
細胞1グラム当たり約4.5〜約10mgのマグネシウム、
細胞1グラム当たり約11〜約20mgの硫黄、及び
細胞1グラム当たり約6.5〜約20μgのチアミン
の1つ以上を含む、請求項19記載の発酵培地。 - 前記鉄が、塩化第一鉄、硫酸第一鉄、及びその混合物から成る群より選択される鉄源から供給され、前記タングステンが、タングステン酸ナトリウム、タングステン酸カルシウム、タングステン酸カリウム、及びその混合物から成る群より選択されるタングステン源から供給され、前記ニッケルが、塩化ニッケル、硫酸ニッケル、硝酸ニッケル、及びその混合物から成る群より選択されるニッケル源から供給され、前記コバルトが、塩化コバルト、フッ化コバルト、臭化コバルト、ヨウ化コバルト、及びその混合物から成る群より選択されるコバルト源から供給され、前記マグネシウムが、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウムから成る群より選択されるマグネシウム源から供給され、前記硫黄が、システイン、硫化ナトリウム、及びその混合物から成る群より選択される硫黄源から供給される、請求項20記載の発酵培地。
- 前記発酵培地が約4.2〜約4.8のpHを有する、請求項16記載の発酵培地。
- 前記発酵培地が約0.01g/L未満の酵母エキスを有する、請求項16記載の発酵培地。
- 前記発酵培地が約0.01g/L未満の炭水化物を有する、請求項16記載の発酵培地。
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