JP2002543793A - 基質が含有するガスからエタノールを生産するクロストリジウム菌株 - Google Patents
基質が含有するガスからエタノールを生産するクロストリジウム菌株Info
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Abstract
Description
rgy),補助金No.DE−FCO2−90CE40939およびDE−FC
O4−94AL98770によって援助された。政府は本発明におけるある種の
権利を有する。
の嫌気的発酵において有用な生物学的微生物に対向する。
じる。廃一酸化炭素、二酸化炭素および水素ガスが石油精製によって生成される
。また、一酸化炭素および/または水素は、カーボンブラック製造およびコーク
ス製造により、アンモニア工業、製鋼所により、木材の亜硫酸パルプ化およびア
ジピン酸工業により生成される。これらの廃ガス流は、一般には、燃料価値のた
めに燃焼されるか、または燃やされる。多くの場合、これらのガスは、大気中に
直接排出され、環境への重大な汚染負荷をもたらす。
I2を含む、発酵工程において潜在的に有用である種々の微生物が存在する[例
えば、米国特許第5,173,429号;同第5,593,886号および同第
5,821,111号;および本明細書において引用される文献、参照;また、
1998年1月8日にWO98/00558として公開された国際特許出願PC
T/US96/11146、参照]。しかしながら、上記廃ガスを利用し、そし
てそれから有用な生産物を生産することができる新規微生物の開発および/また
は単離に対する技術上の継続的ニーズが残されている。
タノールを生産する能力をもつ新規な微生物、O−52の生物学的に純粋な培養
を提供する。
エタノールを生産する能力をもつ新規な微生物、C−01の生物学的に純粋な培
養を提供する。
ス流もしくは廃ガスのエタノールへの発酵変換のための方法において有用である
、細菌クロストリジウム・リュングダーリイの2種の嫌気性菌株を提供する。
るガス(substrate−containing gas)」は、気体状態
において、例えば窒素およびメタンを含む他の元素もしくは化合物と混合されて
いる、一酸化炭素および/または二酸化炭素および/または水および/または水
素を意味する。そのようなガスもしくはガス流は、典型的には、直接か、または
燃焼を通して大気中に放出もしくは排出される。通常は、放出は標準的な煙突温
度および圧力下で起きる。1つの実施態様では、基質が含有するガスは、一酸化
炭素および水を含有する。その他の実施態様では、基質が含有するガスは、二酸
化炭素および水素を含有する。したがって、本発明の微生物は、これらの大気汚
染物質を有用な生産物、主としてエタノールに変換する方法において有用である
。
らの微生物が他の工程においても使用でき、そして工程における変更が調節され
て好適な結果を提供できることは、当業者にとって理解される。そのような変え
ることができるファクターは、栄養成分および濃度、培地、圧力、温度、ガスの
流速、液の流速、反応pH、撹拌速度(連続撹拌槽リアクターを利用する場合)
、種菌レベル、阻害を避ける最大基質(導入されるガス)濃度、および阻害を避
ける最大生産物濃度を含む。下記の工程の実施態様では、工程が1気圧以上にお
いて実施されるのが好適である。好ましくは、それが320気圧まで、より好ま
しくは20気圧まで、もっとも好ましくは15気圧までの圧力において実施され
るのが好適である。
おいて、変換工程の第1段階は嫌気性細菌のための栄養培地の調製である。1つ
のそのような望ましい培地が、具体的に以下の実施例2において開示される。望
ましい実施態様では、基礎培地は酵母エキスおよびトリプチカーゼ(trypt
icase)なしに使用される。しかしながら、栄養培地の内容物は当業者によ
って所望のように変えることができる。栄養物は、連続撹拌リアクター(Con
tinuously Stirred Reacter(CSTR))、固定化
細胞リアクター(Immobilized Cell Reacter(ICR
))、流下床リアクター(Trickle Bed Reacter(TBR)
)、バブルカラム、ガスリフト発酵槽、または他の適当な発酵リアクターを含む
種類の1個以上の容器および/または塔からなるバイオリアクターもしくは発酵
槽に定常的にフィードされる。バイオリアクター内には、酢酸/酢酸塩の代わり
にエタノールを生産することができる、単一種か、またはO−52、C−01お
よび可能ならば他の既知の嫌気性細菌種の混合物のいずれであってもよい微生物
培養物が存在する。一般に、低い発酵pH4.0−5.5が要求される。
は、リアクターの液相中に分散して生存するが、ICRでは、細菌は内部の充填
培養基に固着している。この充填培養基は、最大表面積、高い物質移動速度、低
い圧力損失、均一な気体および液体の分布を提供しなければならず、そして塞栓
(plugging)、目詰り(fouling)、凝集(nesting)お
よび壁のチャンネリングを最小にしなければならない。そのような培養基材の例
は、セラミックBerlサドル、Raschigリングまたは他の高性能充填材
である。
の効率を最大化する時間にわたってバイオリアクター中に滞留される。次いで、
不活性物質および未反応基質ガスを含有する排ガスが放出される。流出液が、伴
われる微生物を分別するために遠心分離器、中空糸膜、または他の濾過器に移行
される。これらの微生物は、バイオリアクターに戻されて速い反応速度を生じる
高い細胞濃度を維持することができる(細胞リサイクル)。細胞リサイクルは、
リアクター中の細胞濃度を高めるために使用されてもよいが、この操作は工程作
業を作るために必要なものではない。場合によっては、この後者の細胞リサイク
ル段階は省略することができる。
である。培地中に希薄エタノールを含有する細胞リサイクル装置からの浸透液は
、それが溶媒と接触される抽出チャンバーに移行される。溶媒は、エタノールに
対する高い分布係数、高い回収ファクター、ヒトに対する低い毒性、細菌に対す
る低い毒性、水との非混和性、適当に高い沸点をもたねばならず、そしてバイオ
リアクター成分とエマルジョンを形成してはならない。溶媒と水相間の溶質の分
布は、熱力学的可能性およびエタノールを除去するために必要な溶媒量を決定で
きる。典型的な溶媒は、適当な溶媒中第2級および第3級アミン、適当な助溶媒
中リン酸トリブチル、酢酸エチル、トリオクチルホスフィンオキシドおよび関連
化合物、長鎖アルコール、ヘキサン、シクロヘキサン、クロロホルム、およびテ
トラクロロエチレンを含む。
ール/水溶液は蒸留塔へ移行し、ここで、それらは十分な温度に加熱されてエタ
ノールおよび水から溶媒を分離する。溶媒は、蒸留塔から冷却チャンバーを通過
して抽出のために最適な温度まで低下され、次いで再使用のために抽出チャンバ
ーに戻る。エタノールと水の溶液は最終蒸留塔に移行し、ここでエタノールが水
から分離、除去される。95%エタノールが蒸留塔の上部に存在し、そして水(
消耗培地)が塔の底部に存在する。消耗培地は水のリサイクルとしてリアクター
に送り戻される。95%エタノールは分子ふるいシステムに送られて無水エタノ
ールが生産される。水は栄養調製物のために再循環される。
寄託の国際承認に関するブダペスト条約の適当な約定に従って寄託された。C.
リュングダーリイ、菌株O−52は、受託番号55989として1997年6月
27日に、アメリカン タイプ カルチャー コレクション、10801 ユニ
バーシティ ブールバード、マナッサス、VA20110−2209、USA(
American Type Culture Collection,108
01 University Boulevard,Manassas,VA2
0110−2209,USA(以前には、12301 Parklawn Dr
ive,Rockville,MD 20852,USAに置かれていた)に寄
託された。C.リュングダーリイ、菌株C−01は、受託番号55988として
1997年6月27日に、アメリカン タイプ カルチャー コレクション、1
0801 ユニバーシティ ブールバード、マナッサス、VA20110−22
09、USA(American Type Culture Collect
ion,10801 University Boulevard,Manas
sas,VA20110−2209,USA(以前には、12301 Park
lawn Drive,Rockville,MD 20852,USAに置か
れていた)に寄託された。
ノールを生産するための発酵工程において有用である。事実、嫌気性細菌のこれ
らの新規菌株は、高い効率をもって、上記のようにガス状基質からエタノールへ
の変換のための方法に関与できる。
Oおよびエタノールに対して高い耐性を示す。両微生物は、CO,CO2および
H2を使用し、そして低い副産物酢酸濃度とともに類似濃度のエタノールを生産
する。
有するガスの変換により生産物として酢酸の代わりにエタノールを生産すること
が可能である。これは、先に記述したような工程において、好ましくは酵母エキ
スとトリプチカーゼなしの基礎培地を利用することによって達成される。O−5
2は、副産物としてごく少量の酢酸とともにCSTR中でエタノールを生産する
ことが観察された。微生物としてO−52を用いる上記工程の1つの実施態様で
は、CSTR(細胞のリサイクルなし)は、ガス滞留時間45.5−50分、液
希釈率0.024−0.031/時間、温度36.5−39.0℃および撹拌速
度750−1000rpmを用いた。ガスは、65%CO、20%H2、11%
CO2および4%CH4からなった。運転条件は、微調整により変えられて最高エ
タノール濃度を得た。この方法では、COガス変換は、最高エタノール生産の間
に生じる比較的高い変換によって20〜60%の範囲であった。H2変換は約1
0%に留まった。最高細胞濃度(光学濃度として)は4.2であって、1040
時間目に達した。光学濃度(生産物濃度プロフィル)は約3.5のレベルであっ
て、これは最高エタノール生産および最低酢酸生産の時に対応した。最高エタノ
ール濃度は約5g/Lであり、対応する酢酸濃度は0.5g/Lであった。
離株O−52によるCSTRにおいて行われた。生産物安定化時期240時間に
続いて、培養は顕著な酢酸生産からエタノール生産に転移した。CO変換は85
−90%で安定であり、そしてH2変換は平均20−30%で不安定であった。
低いH2変換は、単一CSTRにおいて比較的高いエタノール濃度を得た場合に
典型的であった。エタノール濃度は、酢酸からエタノール生産への切り換え後す
ぐに20g/Lの最高に達し、次いでその後250時間にわたって10.5−1
1.0g/Lにおいて安定化した。対応する酢酸濃度は2−3g/Lであった。
乾燥細胞重量濃度は、実験を通して1.5−2.0g/Lにおいて安定であった
。
基質が含有するガスの変換からの生産物として酢酸の代わりにエタノールを生産
することが可能である。また、CSTR実験は、血清ボトル研究において酢酸に
対して高い割合のエタノールを生産した分離株C−01を用いて実施された。1
つのそのような実験では、ガスは、32%H2、34%CO、5%CH4および2
9%CO2を含有した。液滞留時間(LRT)は32時間であり、そしてガス滞
留時間は14.2分であった。リアクターは、これらの条件において約500時
間運転され続けた。COガス変換は、約85%に維持され、そしてH2変換は約
50%においてかなり一定していた。リアクターからの生産物は、エタノール2
0−24g/Lおよび酢酸3−4g/Lを含有した。乾燥細胞重量濃度は1.8
−2.4g/Lであった。
両菌株について約25g/Lであり、そしてCSTRにおける典型的な濃度はエ
タノール約23g/Lおよび酢酸約3.5g/Lであった。菌株C−01は、基
質としてのCOに対して若干耐性であり、液相におけるやや高い溶存CO濃度を
許す。分離株O−52についての典型的な比ガス取り込み率は、1時間当たり2
1mmolCO/g細胞および15mmolH2/g細胞であった。分離株C−
01についての典型的な比取り込み率は、1時間当たり25mmolCO/g細
胞および10mmolH2/g細胞であった。典型的なH2、CO、CO2基質か
らのエタノールの収率は理論量の90%であった。比生産性は,分離株O−52
では1時間当たり0.21gエタノール/g細胞、そして分離株C−01では1
時間当たり0.23gエタノール/g細胞であった。かくして、分離株は、CO
,CO2およびH2を使用してエタノールを生産するそれらの能力においてほぼ相
互に交換可能である。
し、そしてエタノールを生産することができる。硫黄は細胞質量中に組み入れら
れ、細胞重量の約1%と計算される。また、NaxS、H2Sの水相の形態は、リ
アクター内の嫌気的状態の確保を助けるために使用される。
CO,CO2およびH2の発酵によって、好適な基質としてはCOを用いてエタノ
ールを生産する。好適な基質としてのCOの指定は、より高い細胞収量がCOに
おいて得られ、そしてより高いCO変換が両COおよびH2を含有するガス混合
物において得られることを意味する。両菌株についての好適な操作pH範囲はp
H4.5〜5.5である。CO,CO2およびH2の発酵生産物はエタノールおよ
び酢酸である。両菌株は、培地組成および濃度、pH、ガスおよび液の流速、撹
拌速度、およびガス組成のほぼ同一の発酵条件により非常に類似する生産物濃度
を与える。
る方法において使用でき、価値ある化学供給源の浪費を減少するのみならず、ま
た、多くの工業の廃ガス流から有害な大気汚染物質を除去することができる。こ
れらの化学製品を生物学的に得る従来の方法は糖類の発酵に基づいていた。
、限定するものではない。他に示さなければ、本明細書および特許請求項におけ
るすべての部分およびパーセンテージは容積に基づく。
て本明細書に組み入れられている、公開PCT特許出願WO98/00558の
実施例1に記述されているように、ベンチスケールの連続変換系において例証さ
れる。約45%CO、50%H2および5%CHを含有する製油所廃ガスの混合
物が、嫌気性細菌分離株O−52ATCC寄託番号55989を含有する細胞リ
サイクルなしの1.0L連続撹拌槽リアクター中にスパージされる。製油所廃ガ
スは、例えば触媒再生器および触媒接触器、製油所において見いだされる共通の
2種のユニット操作からの気流を混合することによって製造される。リアクター
内の操作圧力は水柱数インチであり、温度は37℃である。ガス滞留時間は12
分、そして液希釈率0.042/時間である。液体培地は、エタノール生産を増
強するために栄養物制限(酵母もしくはトリプチカーゼなし)において基礎塩類
およびビタミン類を含有する。リアクター中の操作pHは5.05であり、そし
て撹拌速度は1000rpmである。これらの条件下で、CO変換は85%であ
り、そしてH2変換は50%である。リアクターからの生産物流中のエタノール
濃度は21g/Lである。酢酸副産物濃度は3g/Lである。
有する蒸留塔からの底部液が水リサイクルとして発酵槽に戻される。95%エタ
ノールを含有する蒸留からの上部生産物は、純エタノールを製造するために吸着
ユニットに送られる。
て本明細書に組み入れられている、公開PCT特許出願WO98/00558の
実施例1に記述されているように、ベンチスケールの連続変換系において例証さ
れる。N2中約14%CO、17%H2および4%CO2を含有するカーボンブラ
ック廃ガスの混合物が、1.58気圧、37℃で操作され、そして最終生産物と
してエタノールを生産することができるクロストリジウム・リュングダーリイ分
離株C−01[ATCC寄託番号55988]を含有する、細菌リサイクルなし
の1.01L連続撹拌槽リアクター中にスパージされる。流下床リアクターは、
RaschigリングもしくはBerlサドルのような市販の充填物を充填した
カラムであり、この中で液およびガスが互いにカラムを通して流れながら接触す
る。本実施例では、向流(ガスが底部にはいり、そして液が上部にはいる)も可
能ではあるが、液とガス両方が、同時方式で上部からカラムにはいる。ガス滞留
時間は0.46分に維持され、そして液体培地希釈率は0.57/時間である。
培養液にフィードされる栄養混合物は、次のとおりであった: 1.KH2PO4 3.00g/L K2HPO4 3.00g/L (NH4)2SO4 6.00g/L NaCl 6.00g/L MgSO4・2H2O 1.25g/L: からなる塩類 80.0ml 2.酵母エキス 1.0g 3.トリプチカーゼ 1.0g 4.FeCl2*4H2O 1500mg ZnSO4*7H2O 100mg MnCl2*4H2O 30mg H3BO3 300mg CoCl2*6H2O 200mg CuCl2*H2O 10mg NiCl2*6H2O 20mg NaMoO4*2H2O 30mg Na2SeO3 10mg 蒸留水 1000ml: を含有するPFN微量金属溶液(Pfenning)3.0ml 5.ピリドキサルHCl 10mg リボフラビン 50mg サイアミンHCl 50mg ニコチン酸 50mg Ca−D−パントテン酸 50mg リポ酸 60mg p−アミノ安息香酸 50mg 葉酸 20mg ビオチン 20mg シアノコバラミン 50mg 蒸留水 1000ml: のビタミンB類 10.0ml 6.システインHCl 0.5g 7.CaCl2・2H2O 0.6g 8.NaHCO3 2.0g 9.Resazurin(0.01%) 1.0ml 10.蒸留水 920.0ml。
与えられた。リアクター中の操作pHは5.05である。これらの条件下で、C
O変換は57%であり、そしてH2変換は58%である。中空糸ユニットが使用
されて、リアクター内の細胞濃度13.6g/Lを維持した。
。
の高度に効率的な改良方法が達成されることが評価されるであろう。具体的に説
明される実施態様において、本発明から逸脱することなく修飾および変更がなさ
れることが考えられ、そしてこれまでの記述から当業者にとって明らかであろう
。したがって、これまでの記述および付随する図面は好適な実施態様のみの具体
的に説明であり、それを限定するものではなく、そして本発明の真の精神および
範囲は添付された請求項を参照して決定されることを明白に意図している。
Claims (5)
- 【請求項1】 菌株C−01、ATCC寄託番号55988の特徴をもち、
そして基質が含有するガスの嫌気的発酵変換によるエタノール生産能を特徴とす
る、分離されたシー.リュングダーリイ(C.ljungdahlii)菌株。 - 【請求項2】 菌株O−52、ATCC寄託番号55989の特徴をもち、
そして基質が含有するガスの嫌気的発酵変換によるエタノール生産能を特徴とす
る、分離されたシー.リュングダーリイ(C.ljungdahlii)菌株。 - 【請求項3】 (a)バイオリアクター中の栄養培地水溶液においてシー.
リュングダーリイ(C.ljundahlii)O−52もしくはシー.リュン
グダーリイ(C.ljundahlii)C−01を用いて基質が含有するガス
を嫌気的に発酵させ; (b)該バイオリアクターから該ブロスの一定分量を連続的に取り出し、そして
(c)それからエタノールを回収する: の段階を含んでなる、エタノールの製造方法。 - 【請求項4】 基質が含有するガスが一酸化炭素および水を含有する、請求
項3記載の方法。 - 【請求項5】 基質が含有するガスが二酸化炭素および水素を含有する、請
求項3記載の方法。
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