JP2013521807A

JP2013521807A - 新規エタノール生産クロストリジウム種のｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ

Info

Publication number: JP2013521807A
Application number: JP2013500187A
Authority: JP
Inventors: ザーン，ジエイムズ・エイ; サクセナ，ジヨテイスナ
Original assignee: コスカタ・インコーポレーテツド
Priority date: 2010-03-19
Filing date: 2011-03-16
Publication date: 2013-06-13
Anticipated expiration: 2031-03-16
Also published as: EP2547759A4; WO2011116124A2; WO2011116124A3; CN102939372A; US8802405B2; ZA201206842B; US8143037B2; US20120156747A1; US20110229947A1; AU2011227281A1; CA2793204A1; BR112012023534A2; EP2547759A2; KR20130009808A; CN102939372B; EA201290917A1; NZ602201A; AU2011227281B2; JP5680180B2; KR101474230B1

Abstract

新規クロストリジウム細菌種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１０５２２、「ＰＳ０２」）を提供する。嫌気性条件下で、Ｃ．ｃｏｓｋａｔｉｉは、ＣＯおよび／もしくはＨ_２ならびに／またはＣＯ_２をエタノールまたは酢酸に変換することができる。したがって、この新規細菌は、廃ガス（例えば、合成ガスおよび精製所の廃棄物）を有用な生成物に変換することができる。
【選択図】なし

Description

本出願は、２０１０年３月１９日に出願された米国実用出願第１２／７２７，３２０号の優先権の利益に関し、その利益を主張し、この開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

配列表の記載
配列表は電子フォーマットでのみ本出願で提出され、参照により本明細書に組み込まれる。この配列表のテキストファイル「０９−１２０２＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ.ｔｘｔ」は、２０１０年４月１２日に作成され、サイズは４，８６３バイトである。

本発明の分野は、水素（Ｈ_２）および二酸化炭素（ＣＯ_２）、ならびに／または一酸化炭素（ＣＯ）からなるガス混合物からエタノールを生産することができる新規細菌種に関する。特に、本発明は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１０５２２の識別特性を有する新規クロストリジウム種のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）、ならびにこの新規クロストリジウム種を用いてＨ_２および／もしくはＣＯ_２、ならびに／またはＣＯのガスからエタノールおよび他の有用な生成物を合成する方法を提供する。

現在、バイオ燃料生産の主要な方法（バイオマスからのエタノールなどの燃料の生産）は直接発酵を介するもので、米国におけるエタノール産出量の９０％の割合を占める（Ｌｉｃｈｔ，Ｆ．Ｏ．（２００１）ＷｏｒｌｄＥｔｈａｎｏｌＭａｒｋｅｔｓ，ＡｎａｌｙｓｉｓａｎｄＯｕｔｌｏｏｋ，Ｋｅｎｔ，ＵＫ）。直接発酵は、酵母または細菌などの糖分解微生物が糖をエタノールに変換するプロセスである。これらの糖は、単一（すなわち、グルコース）または複合物（すなわち、デンプン、セルロース、ヘミセルロース）であり得る。コーンスターチは、今日、エタノール生産植物の中で用いられる主要な基質である。エタノールの直接発酵生産においてコーンスターチを用いる一つの欠点は、トウモロコシが多くのヒトおよび動物の食物の成分であるということである。したがって、エタノール生産のためにトウモロコシを用いると、ヒトおよび動物の消費のための供給量からそのトウモロコシを奪うことになる。

リグノセルロース系バイオマス（すなわち、草、低木、紙くず、またはおがくず）などの他の基質もまた、バイオ燃料の直接発酵に使用するために研究されている。しかし、これらにも限界がある。リグノセルロースはセルロース、ヘミセルロース、ペクチン、およびリグニンで構成され、微生物が基質を利用することができる前に、このバイオマスをその個々の糖成分に分解する前処理プロセスを必要とする。これにより、材料、プラント設計、および廃棄物管理の分野においてより多くのコストがかかる。さらに、リグノセルロース画分の約２２〜３５％は、現在の直接発酵法によって利用することができないリグニンで構成され、扱いにくい廃棄物としてこのプロセスから廃棄される。

バイオ燃料生産のもう一つの代替方法は、間接発酵である。Ｈ_２およびＣＯなどの電子源、ならびにＣＯおよびＣＯ_２などの炭素源を提供することができる高エネルギーガスが、炭素を含有するが食物ではない農業廃棄物および産業廃棄物から生産され、その後、バイオリアクターに転送され、そこで嫌気性細菌がこれらのガスをバイオ燃料に変換するプロセスが間接発酵である。リグノセルロース系バイオマスが熱分解（燃焼）されたときに発生するガスは、間接発酵に利用することができる排ガスの種類の一例であろう。（「合成ガス（ｓｙｎｇａｓ）」ともいう）合成ガス（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｇａｓ）（主に、
ＣＯ、Ｈ_２、およびＣＯ_２）は、熱分解されたバイオマスまたは石炭の生成物であり、バイオマスを燃料アルコールにする間接発酵におけるその潜在的な役割について認識されている（Ｚｅｉｋｕｓ，Ｊ．Ｇ，ＡｎｎｕＲｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３４：４２３−４６４（１９８０））。高エネルギー廃ガスの別の供給源は、ＣＯが７０％、Ｈ₂が１〜２％、およびＣＯ_２が１０〜１５％からなる大量の排ガスを生産する基本的な酸素製鋼（ＬＤコンバータ）プロセスであり、これも、この間接発酵プロセスを用いてバイオ燃料を生産するのに適している。

酢酸生成菌などの嫌気性微生物は、間接発酵プロセスを介して、廃ガスをエタノールおよびｎ−ブタノールなどの有用な生成物に変換することができるルートを提供する。このような細菌は、ＣＯおよびＨ_２を用いるフィッシャー・トロプシュ法、または他の化学バイオ燃料の生産プロセスによって達成できる時よりもより高い特異性、より高い収量およびより低いエネルギーコストで、Ｈ_２およびＣＯ_２ならびに／またはＣＯのバイオ燃料への変換を触媒する。廃ガスおよび他の基質からバイオ燃料を生産することができるいくつかの微生物が同定されており、以下で議論される。

基質として合成ガスの３つの主成分（Ｈ_２＋ＣＯ_２、もしくはＣＯ、またはＨ_２＋ＣＯ_２およびＣＯ）のうちの少なくとも１つを用いて、バイオ燃料、エタノール、ｎ−ブタノール、またはこれらのアルコールの混合物の生産に、６種類の酢酸生成菌を用いることについて記載されている。これらには、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｇｒｅｔｈｌｅｉｎｅｔａｌ．，１９９０；Ｊａｉｎｅｔａｌ．，１９９４ｂ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｒａｇｓｄａｌｅｉ（Ｈｕｈｎｋｅｅｔａｌ．，２００８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ（Ｌｉｏｕ，ｅｔａｌ．，２００５）、ＭｏｏｒｅｌｌａｓｐｅｃｉｅｓＨＵＣ２２−１（Ｉｎｏｋｕｍａ，ｅｔａｌ．，２００７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（Ａｂｒｉｎｉｅｔａｌ．，１９９４）、ならびにＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（Ａｒｏｒａｅｔａｌ，１９９５；Ｂａｒｉｋｅｔａｌ．，１９８８；Ｂａｒｉｋｅｔａｌ．１９９０；およびＴａｎｎｅｒｅｔａｌ．，１９９３）が含まれる。これらの代表のうち、３種類のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｒａｇｓｄａｌｅｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍだけが、ＣＯ、もしくはＣＯの混合物ならびに／またはＨ_２およびＣＯ_２を酢酸とエタノールに変換することが知られている。したがって、それらは、合成ガス流の全ての成分を同時に用いながら、単一アルコール（エタノール）最終生成物を形成することができる唯一知られている生物である。クロストリジウムエタノロジェン（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎｓ）として本文書で言及されるこの細菌グループは、間接発酵プロセスの経済的利点が以下によってもたらされるので、意味のある商業的な重要性を有する：（ａ）Ｈ_２およびＣＯを一緒に用いることによって、合わせた変換率が９０％を超えること、ならびに（ｂ）簡易化された安価なバイオ燃料回収システムの使用を可能にする単一アルコールの生産。

６種類のクロストリジウムエタノロジェンが、合成ガスからバイオ燃料を生産することについて文献に記載されている：
（１）ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＰＥＴＣ^Ｔ（ＡＴＣＣ番号４９５８７およびＤＳＭＺ番号１３５２８）：この生物は、寄託されたこの種の原型株である（Ｔａｎｎｅｒｅｔａｌ．，１９９３）。米国特許第５，１７３，４２９号を参照されたい。
（２）ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＥＲＩ−２（ＡＴＣＣ番号５５３８０）：この生物の系統発生状況は、それが明らかにＰＥＴＣ型株と同一ではないが、細菌学名承認リストのリストには含まれないので、不明なままである。（Ｓｋｅｒｍａｎ
ｅｔａｌ．，１９８９）。米国特許第５，５９３，８８６号を参照されたい。
（３）ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＣ−０１；（ＡＴＣＣ番号５５９８８）：この生物の系統発生状況は、それが明らかにＰＥＴＣ型株と同一ではないが、細菌学名承認リストのリストには含まれないので、不明なままである。（Ｓｋｅｒｍａｎ
ｅｔａｌ．，１９８９）。米国特許第６，１３６，５７７号を参照されたい。
（４）ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＯ−５２；（ＡＴＣＣ番号５５９８９）：この生物の系統発生状況は、それが明らかにＰＥＴＣ型株と同一ではないが、細菌学名承認リストのリストには含まれないので、不明なままである。（Ｓｋｅｒｍａｎ
ｅｔａｌ．，１９８９）。米国特許第６，１３６，５７７号を参照されたい。
（５）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｒａｇｓｄａｌｅｉ；（ＡＴＣＣ番号ＢＡＡ−６２２）：米国特許公開第２００８００５７５５４号（ＥＰ２０６１８７２Ａ２）を参照されたい。
（６）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ；（ＤＳＭＺ番号１００６１）この分離株は、ＣＯ、Ｈ_２、およびＣＯ_２の混合物からエタノールおよび酢酸を生産するとして、Ａｂｒｉｎｉら，１９９４によって記載された。

上記で定義したとおり、バイオ燃料生産のために特定のエタノール生産クロストリジウムを用いることについて記載している特許に加えて、合成ガスなどの廃ガスからバイオ燃料を生産するための以下のプロセス特許が存在する。特定の特許は、廃ガスから複数のアルコール（主に、エタノールおよびｎ−ブタノール）を生産することが知られる微生物（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ）も対象とする：
（１）Ｌｅｗｉｓらの米国特許公開第２００７０２７５４４７号は、合成ガスなどの廃ガスからエタノールおよびｎ−ブタノールを含むバイオ燃料を合成することができる新規嫌気性クロストリジウム細菌種であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓＡＴＣＣ番号ＢＡＡ−６２４を開示している。
（２）Ｊａｉｎらの米国特許第５，１９２，６７３号は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｙｔｙｌｉｃｕｍの変異株およびその株を用いてブタノールを生産するプロセスを開示している。
（３）Ｇａｄｄｙらの米国特許第５，５９３，８８６号は、基質として廃ガス（例えば、カーボンブラック廃ガス）を用いて、酢酸およびエタノールを生産するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＡＴＣＣ番号５５３８０を用いるプロセスを開示している。
（４）Ｇａｄｄｙらの米国特許第５，８０７，７２２号は、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＡＴＣＣ番号５５３８０などの嫌気性細菌を用いて、廃ガスを有機酸およびアルコールなどの有用な生成物に変換する方法および装置を開示している。
（５）Ｇａｄｄｙらの米国特許第６，１３６，５７７号は、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＡＴＣＣ番号５５９８８および５５９８９などの嫌気性細菌を用いて、廃ガスを有機酸およびアルコールなどの有用な生成物に変換する方法および装置を開示している。
（６）Ｇａｄｄｙらの米国特許第６，１３６，５７７号は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの嫌気性細菌を用いて、廃ガスを有機酸およびアルコール（特に、酢酸）などの有用な生成物に変換する方法および装置を開示している。
（７）Ｇａｄｄｙらの米国特許第６，７５３，１７０号は、酢酸の生産のための嫌気性微生物発酵プロセスを開示している。
（８）Ｇａｄｄｙらの米国特許第７，２８５，４０２号は、エタノール生産のための嫌気性微生物発酵プロセスを開示している。

バイオ燃料の生産における微生物の利用に関する当技術分野の知識にもかかわらず、間接発酵プロセスを用いてバイオ燃料などの有用な生成物を生産することができる追加の微生物を発見する、かつ／または開発する継続的な必要性が残っている。特に、化学的に定義されるかまたは有機炭素の低い増殖条件下で培養したときに、増殖特性の改善および高
いバイオ燃料収量を示す新しいエタノール生産クロストリジウムを発見することが好都合であろう。具体的には、細菌の増殖培地から酵母エキス、牛肉エキス、コーンスティープリカー、または大豆トリプトンなどの複合有機炭素源を除去することは、合成ガス発酵を介したバイオ燃料の生産に望ましいと考えることができる。なぜならば、（１）これらの成分がバイオ燃料の生産コストにさらなる費用を加え、かつ（２）複合有機炭素源が、バイオ燃料生産発酵槽の中の外来性細菌の増殖を支持し、バイオ燃料収量およびプロセス経済に負の影響を与えるからである。

本発明は、新たに発見されたエタノール生産クロストリジウム種であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）の生物学的に純粋な培養物を対象とする。このクロストリジウム種は、他の既知のクロストリジウム種と区別できる表現的特徴および遺伝的特徴を有する新しいクロストリジウム種である。

本発明の別の実施形態は、このクロストリジウム種が、ＣＯおよび／またはＨ_２および／またはＣＯ_２のガス源からエタノールおよび酢酸を生産する特有の能力を有することである。

本発明の別の実施形態において、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉは、酵母エキスなどの複合有機炭素源の非存在下で、独自にエタノール生産ができる。

ネガティブ染色／相の、倍率２５，０００倍の透過電子顕微鏡の写真である。棒は１．０μｍである。静止期のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）細胞の、倍率１０倍の位相差光学顕微鏡写真である。棒は１４．６３μｍである。後期対数増殖期に収集したＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）細胞の、倍率１０，０００倍の走査電子顕微鏡写真である。棒は１．０μｍである。光学密度に基づいて、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍと比較したＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）のバッチ培養の増殖至適ｐＨを示すグラフである。最終生成物のエタノールおよび酢酸の容積濃度に基づく、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）のバッチ培養の増殖至適ｐＨを示すグラフである。光学密度に基づくＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）の増殖至適温度を示すグラフである。エタノール生産クロストリジウム：（Ａ）Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＰＥＴＣ；（Ｂ）Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ；（Ｃ）Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉ；（Ｄ）Ｃ．ｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）の脂肪酸メチルエステルプロファイルの比較を示すグラフである。化合物および対応するピーク：（１）ドデカン酸メチル（８．１６１分）；（２）テトラデカナール（１０．０４６分）；（３）テトラデカン酸メチル（１２．６１分）；（４）１，１−ジメトキシドデカン（１３．８８１分）；（５）１−メチルドデシルアミン（１５．１７６分）；（６）（Ｚ）−１３−オクタデセナール（１７．６３８分）；（７）メチルヘキサデカン酸（１８．１３８分）；（８）メチル−６，６−ジメトキシオクタン酸（１８．９７３分）；（９）１，１−ジメトキシテトラデカン（１９．５０６分）；（１０）シクロプロパンオクタン酸、２−ヘキシルメチルエステル（２０．７３５分）；（１１）１，１−ジメトキシヘキサデカン（２２．１１３分）；（１２）２−オキソ−３−メチル−シス−ペルヒドロ−１，３−ベンゾオキサジン（２３．３６３分）。図７ａの脂肪酸メチルエステルプロファイルの直線関係の強度をまとめた相関係数の行列である。図７ｂの脂肪酸メチルエステルプロファイルの直線関係の強度を示す散布図行列である。α＝０．９９Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉの１６ＳｒＤＮＡ配列である配列番号３の配列である。連続配列中のギャップは、図８ｂに示す配列に対するアライメントによって生じた。クロストリジウム種の１６ＳｒＤＮＡ節約樹（ｐａｒｓｉｍｏｎｙｔｒｅｅ）を示す。棒は、１００配列位置あたり１ヌクレオチド置換に相当する。他の選択されたクロストリジウムクラスターＩの代表に対するエタノール生産クロストリジウムクラスター（Ｃ．ｃｏｓｋａｔｉｉＰＳ０２）の距離は、Ｃ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ：９５．１８％；Ｃ．ｍａｇｎｕｍ：９３．０１％；Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ：９２．９６％；Ｃ．ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ：９２．５２％である。エタノール生産クロストリジウムの１６ＳｒＤＮＡ配列の類似度を示す１６ＳｒＤＮＡ近隣系統樹距離行列スコアを示す表である。６種類のエタノール生産アセトゲンの１６ＳｒＤＮＡ配列における超可変領域の頻度を示すエントロピープロットおよびそれらの超可変領域の配列アライメントである。エタノール生産クロストリジウム種のＢＯＸ−ＰＣＲ比較を示すゲルの写真である。レーンの割当は、（１）１００ｂｐラダー；（２）Ｃ．ｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）；（３）Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉＡＴＣＣＢＡＡ−６２２；（４）Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍＤＳＭＺ１００６１；（５）Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＰＥＴＣＤＳＭＺ１３５２８；（６）Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＣ−０１ＡＴＣＣ５５９８８；（７）Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＥＲＩ−２ＡＴＣＣ５５３８０；（８）１００ｂｐラダー；（９）ｐＵＣ１９／Ｓａｕ３Ａマーカー。エタノール生産クロストリジウム種のＢＯＸ−ＰＣＲによって生じた増幅産物の解析のための節約樹およびピアソンＵＰＧＭＡ類似度行列スコアを示す表である。エタノール生産クロストリジウム種のＲＥＰ−ＰＣＲ比較を示すゲルの写真である。レーンの割当は、（１）１００ｂｐラダー；（２）Ｃ．ｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）；（３）Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉＡＴＣＣＢＡＡ−６２２；（４）Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍＤＳＭＺ１００６１；（５）Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＰＥＴＣＤＳＭＺ１３５２８；（６）Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＣ−０１ＡＴＣＣ５５９８８；（７）Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＥＲＩ−２ＡＴＣＣ５５３８０；（８）１００ｂｐラダー；（９）ｐＵＣ１９／Ｓａｕ３Ａマーカー。エタノール生産クロストリジウム種のＲＥＰ−ＰＣＲによって生じた増幅産物の解析のための節約樹およびピアソンＵＰＧＭＡ類似度行列のスコアを示す表である。エタノール生産クロストリジウム種のＥＲＩＣ−ＰＣＲ比較を示すゲルの写真である。レーンの割当は、（１）１００ｂｐラダー；（２）Ｃ．ｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）；（３）Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉＡＴＣＣＢＡＡ−６２２；（４）Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍＤＳＭＺ１００６１；（５）Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＰＥＴＣＤＳＭＺ１３５２８；（６）Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＣ−０１ＡＴＣＣ５５９８８；（７）Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＥＲＩ−２ＡＴＣＣ５５３８０；（８）１００ｂｐラダー；（９）ｐＵＣ１９／Ｓａｕ３Ａマーカー。エタノール生産クロストリジウム種のＥＲＩＣ−ＰＣＲによって生じた増幅産物の解析のための節約樹およびピアソンＵＰＧＭＡ類似度行列スコアを示す表である。２．０日の平均細胞保持時間を用いて、（ａ）前定常状態条件（指数増殖期）の下、および（ｂ）エタノール生産段階（後期指数期から静止期）の下、アセトゲンＣ５培地を用いた時および合成ガスを供給したＣＳＴＲ中のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）の特異的増殖速度測定を示すグラフである。継続時間＝４３．７５日。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）細胞中に存在する主成分を示すＸ線スペクトルである。アセトゲンＣ５培地を用い、２．０日の平均細胞保持時間を用い、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）を含む、合成ガスを供給したＣＳＴＲ中で生産されたエタノールおよび酢酸の容積濃度を示すグラフである。継続時間＝４３．７５日。エタノロゲンＣ５培地、２．０日の平均細胞保持時間を用いた時で、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）を含む、合成ガスを供給したＣＳＴＲ（図２１に示す生成物）のガス取り込み率を示すグラフである。継続時間＝４３．７５日。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）の増殖の定常状態時に合成ガス発酵の培養液相中に存在する揮発性物質のＧＣ−ＭＳ全イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムである。挿入図：代謝（ギ酸、エチルエステル）または酸触媒による化学反応（酢酸エチル）によって生成された微量の不純物を示すクロマトグラフのベースラインを２８倍したものである。４７０時間の定常状態期間、アセトゲンＣ５培地、２．０日の平均細胞保持時間を用い、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）を含む、合成ガスを供給したＣＳＴＲ中の平均ガス取り込み速度の統計分析。継続時間＝４３．７５日。Ａ）ＣＯの取り込み、Ｂ）Ｈ_２の取り込み、およびＣ）ＣＯ_２の取り込み。４７０時間の定常状態期間、アセトゲンＣ５培地、２．０日の平均細胞保持時間を用い、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）を含む、合成ガスを供給したＣＳＴＲ中の平均ガス取り込み速度の統計分析の続きである。継続時間＝４３．７５日。Ａ）容量エタノール濃度、ミリモル／Ｌ、Ｂ）容量エタノール濃度、ミリモル／Ｌ、およびＣ）培養液から排出された全エタノール、ミリモル／Ｌ。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉを含む、合成ガスを供給したＣＳＴＲによるエタノール生産および酢酸生産に対する有機炭素（酵母エキス）添加の効果を示すグラフである。（Ａ）化学的に定義された最小培地（アセトゲンＣ５）、または０．１ｇ／Ｌの酵母エキスを補充した同じ培地を受け取る２ＬのＣＳＴＲ（Ｄ＝０．５日^−１）中のエタノール生産。（Ｂ）化学的に定義された最小培地、または０．１ｇ／Ｌの酵母エキスを補充した同じ培地を受け取る２ＬのＣＳＴＲ（Ｄ＝０．５日^−１）中の酢酸生産。

本発明の細菌は、本明細書で「Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）」と呼ぶ、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１０５２２によって表される特徴を示す新規エタノール生産クロストリジウム種である。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）の系統発生学的、形態学的および生化学的特性を解析し、以下の実施例の欄に記載する。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）のいくつかの特性は他のクロストリジウム種と似ているが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）は、この属の新種であることを裏付ける特有の特徴を有する。実施例に含まれるデータは、この細菌がクロストリジウム属の新しい代表であることを示す。

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）は、嫌気性条件下、基質ＣＯ＋Ｈ_２Ｏ、またはＨ_２＋ＣＯ_２、またはＣＯ＋Ｈ_２＋ＣＯ_２から酢酸およびエタノールを生産する能力を有する。酢酸およびエタノールを生産する反応に、ＣＯまたはＣＯ_２が炭素源を提供し、Ｈ_２またはＣＯが電子源を提供する。以下の反応に従って、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）によるＣＯおよび／またはＨ_２ならびにＣＯ_２の発酵によって生産される一次生成物はエタノールである。

６ＣＯ＋３Ｈ_２Ｏ→Ｃ_２Ｈ_５ＯＨ＋４ＣＯ_２（１）
６Ｈ_２＋２ＣＯ_２→Ｃ_２Ｈ_５ＯＨ＋３Ｈ_２Ｏ（２）

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）は酢酸も生産することができる。酢酸生産は以下の反応によって起こる。

４ＣＯ＋２Ｈ_２Ｏ→ＣＨ_３ＣＯＯＨ＋２ＣＯ_２（３）
４Ｈ_２＋２ＣＯ_２→ＣＨ_３ＣＯＯＨ＋２Ｈ_２Ｏ（４）

ＣＯ、ＣＯ_２およびＨ_２の多くの供給源は、本発明のクロストリジウムによって利用され得る。例えば、これらの基質のうちの好ましい供給源には、合成ガス、石油精製廃ガス、製鋼業廃ガス、天然ガスの自己熱改質、および石炭ガス化などの「廃」ガスが含まれる。供給源には、酵母、クロストリジウム発酵、およびガス化セルロース系材料によって生産される（いくぶんかＨ_２を含む）ガスも含まれる。あるいは、このようなガス基質は、必ずしも他のプロセスの副産物として生産されるわけではないが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）を利用する本発明の発酵反応での使用のために特別に生産され得る。この細菌が発酵反応を実行するのに適する条件下で、十分な量の基質ガスをＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉに提供することができる限り、基質ガスの全ての供給源を本発明の実施に使用することができることを当業者なら認識するであろう。

本発明の一つの好ましい実施形態において、ＣＯ、ＣＯ_２およびＨ_２の供給源は合成ガスである。基質として使用するための合成ガスは、例えば、石炭のガス化のガス副産物として得ることができる。もう一つの方法として、合成ガスは、特に細菌発酵の目的のために容易に入手できる低コストの農産物原料をガス化することによって生産することができ、それによって、バイオマスの燃料アルコールへの間接発酵の経路を提供することができる。植物のほとんどの種類をこの目的に使用することができたように、合成ガスに変換することができる原料には多くの例がある。好ましい原料には、スイッチグラスなどの多年生草、トウモロコシ茎葉などの作物残渣、おがくずなどの処理廃棄物などが含まれるが、これらに限定されない。当業者なら、このような出発物質から合成ガスを産生することに精通している。一般的に、合成ガスは、ガス化装置内で、主に、熱分解、部分酸化、および水蒸気改質によって乾燥バイオマスから産生され、一次生成物はＣＯ、Ｈ_２およびＣＯ_２である。「ガス化」および「熱分解」という用語は類似のプロセスを表し、両方のプロセスとも、バイオマスが暴露される酸素量を制限する。「ガス化」という用語は、ガス化と熱分解の両方を含むように用いられる場合がある。

間接発酵プロセス中に供給される基質ガスの供給源の組み合わせを利用して、バイオリアクターからベントストリーム中の成分の濃度を変化させることもできる。例えば、ＣＯ、ＣＯ_２およびＨ_２の一次供給源は、一般的に、ＣＯが３７％、Ｈ_２が３５％、およびＣＯ_２が１８％である濃度比を示す合成ガスであってもよいが、この合成ガスは、ＣＯ（すなわち、製鉄所の廃ガスはＣＯに富む）またはＨ_２のレベルを高めるために他の供給源からガスを補充することができる。

本発明のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉは、嫌気性条件下で培養しなければならない。「嫌気性条件」とは、気相中の酸素（Ｏ_２）のレベルが０．５ｐｐｍ未満であることを意味する。

式（１）または（３）によって表される反応のＨ_２Ｏの供給源は、一般的には、生物が培養される水性培地である。

一般に、本発明のアセトゲンを培養するための最適化されたエタノール生産培地は、化学的に定義された液体培地である。しかし、Ｈ_２：ＣＯ_２またはＣＯ：ＣＯ_２雰囲気下で、初期ｐＨが６の代替培地、例えば、ＡＴＣＣ培地１０４５を利用することができることを当業者なら認識するであろう。さらに、任意のいくつかの目的のために、様々な培地補助剤、例えば、緩衝剤、金属類、ビタミン類、および塩類を加えてもよい。特に、当業者は、バイオ生成物の収量の増加または収量の最適化をもたらす栄養操作および生理学的適応のような技術に精通している。例えば、「制限増殖」条件（すなわち、細菌の増殖および繁殖の速度を遅くする条件）下で溶媒生産微生物を培養すると、エタノールなどの高度に還元された発酵生成物の生産が増加する。これは、おそらく、制限増殖条件下、利用可能な炭素に対する利用可能な還元当量（還元されたフェリドキシン（ｆｅｒｒｉｄｏｘｉｎ）、ＮＡＤＨ、またはＮＡＤＰＨ）の比が増加し、還元力の増加がアセチルＣｏ−Ａまたは有機酸の化学的還元に転用され、アルコールを形成するからである。制限増殖条件の例として、例えば、最適ではない温度またはｐＨで培養を維持すること、ならびに栄養および炭素源の制限が挙げられる。一般に、培養中、所望の細菌密度に達した後に、非増殖条件が実行される。当業者は、所望の生成物の生産を最適化するための手段に精通しており、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）を用いる全てのこのような最適化された手順は、本発明に包含されると意図される。

特に、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）は、バルチ（Ｂａｌｃｈ）技術を用いて培養することができる（ＢａｌｃｈａｎｄＷｏｌｆｅ，１９７６，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：７８１−７９１；Ｂａｌｃｈｅｔａｌ，１９７９，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４３：２６０−２９６）。これは、いかなるガス相も密閉された管または容器内での培養が望まれることを達成するために、培養材料を調製するための嫌気性チャンバーおよびガス交換マニホールドの助けを必要とする。酸性ｐＨの使用などの、溶媒生産アセトゲンの培養についてのより具体的な詳細は、Ｔａｎｎｅｒｅｔａｌ，１９９３，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４３：２３２−２３６およびＬｉｏｕｅｔａｌ，２００５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５：２０８５−２０９１の中で見られる。エタノール生産を向上させる方法には、（鉄、リンおよびビタミン類などの）主要な培地成分の最適化、培養ｐＨの制御、細菌のランダム突然変異誘発に続くクローンスクリーニング、または細菌の遺伝子操作が含まれる。

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）による発酵に供給するガス（ＣＯおよび／またはＨ_２ならびにＣＯ_２）の代謝は、追加の改良の有無にかかわらず、当業者に知られる様々な種類の装置のいずれか、または現在開発中の他のスタイルの発酵設備の中で行うことができる。例として、気泡塔反応器、２段階バイオリアクター、トリクルベッド反応器、膜反応器、固定化された細胞を含む充填床反応器などが挙げられるが、これらに限定されない。このような装置の主な必要条件には、以下のものが含まれる：
（１）無菌性（Ａｘｅｎｉｃｉｔｙ）；
（２）嫌気的条件；
（３）温度、圧力、およびｐＨの維持に適した条件；
（４）十分な量の基質が培養に供給されること；
（５）発酵の最終生成物が、容易に細菌培養液から回収できること。

反応器は、例えば、従来の攪拌槽型反応器、固定化または懸濁された細胞を含むカラム発酵槽、連続フロー型反応器、高圧反応器、細胞再循環型懸濁細胞反応器、および以前に記載された他の例であってもよい。さらに、反応器を、前述の反応器のいずれかを含む直列型および／または並列型反応器システムに配置してもよい。例えば、複数の反応器が、ある一連の条件下で細胞を増殖させ、別の一連の条件下で最低限の増殖でエタノール（ま
たは他の生成物）を産生するのに有用であり得る。

一般に、発酵は、エタノールなどの生成物が培地中に所望のレベル生産されるまで継続することが可能である。一般的には、エタノールのこのレベルは、少なくとも１５ｇ／培地１Ｌ〜５０ｇ／Ｌの範囲であり、少なくとも３０ｇ／Ｌのレベルが好ましい。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）は生きたままで、少なくとも６０ｇ／Ｌのエタノール濃度で増殖する。あるいは、一定の生産率が達成された時、例えば、所望の生成物の生産率が、例えば、細菌の排出物の集積、基質利用性の低下、生成物によるフィードバック阻害、生菌数の減少、または当業者に知られるいくつかの他の理由のいずれかにより減少した時に、生産は停止してもよい。さらに、新鮮な培地の継続的な補充と共に、培地の中に任意の液体生成物を含む使用済み培地の同時除去を可能にする連続培養技術（すなわち、ケモスタットモード）が存在する。

本発明の細菌が生産する生成物を、当業者に知られるいくつかの方法のいずれかによって培養物から取り除き、精製することができる。例えば、エタノールを、例えば、溶媒抽出法、共沸混合物への蒸留に続く共沸蒸留、モレキュラーシーブ脱水、パーベーパレーション法、またはフロースルーゼオライトチューブによって取り除き、さらに処理することができる。蒸留に続くエタノール脱水のための２つの主要な工業技術が共沸蒸留およびモレキュラーシーブ脱水であることを当業者なら認識するであろう。さらに、生成物の数に応じて、いくつかの分離技術が、いくつかの純粋な生成物を得るために用いられる必要がある場合がある。同様に、酢酸を、同様のプロセスによって取り除き、さらに処理することができる。

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）は、以前に記載された手順（Ｂｒｙａｎｔ，１９７２）によって、ＣＯ：Ｈ_２：Ｎ_２：ＣＯ_２（７：３７：３３：２３モル％）の雰囲気下、初期ｐＨ６．０で、以下に記載するアセトゲンＣ３培地を用いて、マサチューセッツ州ナンタケット島にあるＣｏｓｋａｔａ−Ｃｏａｔｕｅ野生生物保護区から収集された河口堆積物を１２５ｍＬの血清バイアル中に接種した嫌気性濃縮から得た。マスターセルバンクは、アセトゲンＣ３培地およびＨ_２（５％）、ＣＯ_２（１０％）、およびＮ_２（８５％）の雰囲気を用いて、寒天含有（１５％ｗ：ｖ）ペトリ皿から採取した単一コロニー分離株から獲得したバイオマスから調製した。この細菌を、２００９年１２月１０日に、株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１０５２２としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託した。

嫌気性細菌のいくつかの系統学的に多様なグループは、ＣＯ、ＣＯ_２およびＨ_２を、酢酸、エタノール、酪酸、ブタノール、および水素を含む様々な商業的に重要な生成物に変換する能力を有する。厳選したサブグループのエタノール生産クロストリジウムは、炭素源として二酸化炭素を用いながら、水素および一酸化炭素を同時に利用して、少量の酢酸と共にエタノールを形成する特有の能力を示す。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）の系統発生学的、形態学的、生化学的特性を解析し、他の類似のクロストリジウム種と比較した。

これらの比較研究に利用した他のクロストリジウム種に、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｌｊｕｎｄａｈｌｉｉＰＥＴＣ（ＡＴＣＣ番号４９５８７またはＤＳＭＺ番号１３５２８）；Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉ（ＡＴＣＣＢＡＡ−６２２）；Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（ＤＳＭＺ番号１００６１）；Ｃ．ｌｊｕｎｄｇａｈｌｉｉＥＲＩ−２（ＡＴＣＣ番号５５３８０）；およびＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＣ−０１（ＡＴＣＣ番号５５９８８）を含めた。ＡＴＣＣ試料は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ;マナッサス、バージニア州）から入手した。ＤＳＭＺ試料は、ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｋ
ｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）ＧｍｂＨ（ブラウンシュヴァイク、ドイツ）から入手した。しかし、２０１０年２月１日現在、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＯ−５２は、寄託者がアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションと共に供給活動を終了したので、もはや公的に利用可能ではない。

実施例１−細胞形態
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）のコロニーは円形であり、色は半透明の白色で、わずかにアセトゲンＣ３寒天プレートの中央を隆起させた。このコロニーは６〜７日を超えると、色が黄褐色または淡褐色まで暗くなった。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）の細胞は、まれに運動性があり、棒状で、グラム陽性染色され、単独でまたは鎖になって生じた。４０から４５ｎｍの細胞壁と一致する外側細胞構造が、Ｃ．ｃｏｓｋａｔｉｉ細胞の薄い切片の電子顕微鏡写真で見られ、これは、グラム陽性の割当を支持する。初期の指数関数増殖では、細胞は０．７５μｍから３〜４μｍまでであり、周毛性の鞭毛を有していた（図１）。胞子はまれに生じたが、存在する時は、中間末端から末端が隆起しているように見え、ほとんどの場合、外観はクラブ様をしていた（図２）。胞子形態のこの特性はＭｏｏｒｅｌｌａｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ（Ｄｒａｋｅｅｔａｌ．，２００６）に似ていたが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（Ａｂｒｉｎｉｅｔａｌ．，１９９４）またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｒａｇｓｄａｌｅｉ（Ｈｕｈｎｋｅｅｔａｌ．，２００８）に観察される非膨潤型の胞子形態と顕著に異なっていた。初期および後期の指数関数増殖期の細胞の電子顕微鏡写真を比較すると、後の増殖相中に、細胞の長さが増加することが明らかになった（図３）。高容積エタノール濃度を呈する古いバッチ培養については、２０〜３０μｍまで細胞の伸長が観察され、新鮮な培地に移した時、これらに細胞は容易に回収されないので、生理的ストレスに関連しているように思われた。伸長した細胞において胞子形成は観察されなかったことが、おそらく、これらの細胞を回収できない一因である。

アセトゲンＣ３培地を用いて、凍結乾燥または凍結させたマスターセルバンク（１ｍＬ当量）から採取した保存培養を開始した。この実施例で用いる培養物を、１００ｒｐｍ（５ｃｍの振盪振幅）のオービタルシェーカーで、３７℃の温度で増殖させた。以下の表Ａ、Ｂ、Ｄ、およびＥに記載したとおり、この培地を、ＢａｌｃｈおよびＷｏｌｆｅ（１９７６）によって記載される厳密な嫌気性技術を用いて調製した。滅菌後、嫌気性ビタミン溶液（表Ｃ）を無菌的にボトルに加え、最終圧力１０４キロパスカル（１５ｐｓｉｇ）を用いて、各ボトルのヘッドスペースをＣＯ：Ｈ_２：Ｎ_２：ＣＯ_２（７：３７：３３：２３モル％）からなるガス混合物と交換した。標準的な接種サイズは１０％（ｖ／ｖ）であり、中期から後期の指数増殖期に増殖していた保存培養から移した。

バッチ発酵のｐＨを、２０ｇ／Ｌ（ｐＨ６．０）の濃度の２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ；３７℃でｐＫ_ａ＝５．９７）を用いて調節した。ＭＥＳの代わりに、以下の緩衝液を２０ｇ／Ｌの濃度で用いて、増殖至適ｐＨの研究を行った：ＭＥＳ（ｐＨ４〜６．５）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ；３７℃でｐＨ６．６〜７．５；ｐＫ_ａ＝６．６６）、およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ；３７℃でｐＨ７．５〜８．５；ｐＫ_ａ＝７．７２）。

アセトゲンＣ３培地で増殖させた指数増殖期の細胞またはＣＳＴＲ中アセトゲンＣ５培地で増殖させた後期指数増殖期の細胞を、走査型および透過型電子顕微鏡に用いた。アセトゲンＣ５培地は、硫化ナトリウム、酵母エキス、およびＭＥＳ緩衝液を除いたこと、および消泡剤Ａ（シグマケミカル、セントルイス、ミズーリ州）などの消泡剤を最終濃度２０ｍｇ／Ｌで培地に加えたことを除いて、基本的に、アセトゲンＣ３培地と同じであった。これらの試料を、細菌細胞の画像および元素の同時分析のために、デルタ４量子薄窓Ｘ線検出器（Ｄｅｌｔａ４Ｑｕａｎｔｕｍｔｈｉｎ−ｗｉｎｄｏｗＸ−ｒａｙｄｅｔｅｃｔｏｒ）を装備したＨｉｔａｃｈｉＳ−５７０走査型電子顕微鏡を用いて調べた。透過型電子顕微鏡については、細胞（約１×１０^２０）を、ＰＢＳ中４％グルタルアルデヒドを含む溶液で固定し、炭素被覆フォームバーグリッド（Ｆｏｒｍｖａｒｇｒｉｄ）に広げ、０．５％リンタングステン鉱（ｐＨ７．０）で染色した。細胞を、ＪＥＯＬ１２００ＥＸＦＸ透過型電子顕微鏡を用いて調べ、撮影した。光学顕微鏡は、Ｎｉｋｏｎ
ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ画像取得ソフトウエア（ニコンインスツルメンツ、メルビル、ニューヨーク州）を装備したＮｉｋｏｎＥｃｌｉｐｓｅ５０ｉ顕微鏡写真機を用いて、発酵培養液のウェットマウント調製を行った。

実施例２−生理学
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）は絶対嫌気性であった。酵母エキスを含まない状態での化学合成独立栄養増殖が、Ｈ_２＋ＣＯ_２またはＣＯで生じた。以下の基質を用いた時に化学有機栄養増殖が観察された：ピルビン酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース、サラシン（ｓａｌａｃｉｎ）、アルギニン、グルタミン酸、ヒスチジン、グルタミン、セリン、アラニン、α-ケトグルタル酸、オキサロ酢酸、ホスホエノールピルビン酸、シキミ酸、イソクエン酸、ショ糖、およびマロン酸。表Ｆは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）間の基質マトリックス比較を示す。

６種類の有機基質が、３種類のエタノール生産クロストリジウムであるＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＰＥＴＣ、Ｃ．ｒａｇｓｇａｌｅｉ、およびＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉとＣ．ｃｏｓｋａｔｉｉを区別した。これらの区別する基質には、Ｄ−グルコン酸、クエン酸、マレイン酸、ラムノース、アルギニン、およびオキサロ酢酸が含まれた（表Ｆ）。これらの違いは、これらの４種類の細菌間で、これらの基質の代謝に必要な代謝調節遺伝子または異化遺伝子の違いを示す。
（１）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）およびＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍは、Ｃ．ｃｏｓｋａｔｉｉがＤ−グルコン酸およびラムノースでは増殖できないこと、かつＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍもクエン酸では増殖できないことによって区別できた。
（２）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）およびＣ．ｒａｇｓｄａ
ｌｅｉは、Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉがクエン酸塩、マレイン酸、ヒスチジン、オキサロ酢酸、およびアルギニンでは増殖できないことによって区別できた。
（３）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）およびＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＰＥＴＣは、Ｃ．ｃｏｓｋａｔｉｉがＤ−グルコン酸およびラムノースでは増殖できないこと、かつＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＰＥＴＣもクエン酸では増殖できないことによって区別できた。

増殖を、６００ｎｍで、分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ２０Ｄ；ＭｉｌｔｏｎＲｏｙ）で測定した。炭素基質の利用は、各炭素源１ｇ／Ｌを含む培地に連続的に移した後の増殖に基づく。炭素基質については、Ｎ_２：ＣＯ_２（８０％：２０％）の雰囲気下でスクリーニングを行った。積極的な増殖反応を０．２ＡＵを超えるＯＤ６００で記録した。クエン酸については、追加の^１３Ｃ標識アイソトープ実験を行い、Ｂｒｕｋｅｒ社のＵｌｔｒａＳｈｉｅｌｄＡｖａｎｃｅ４００ＭＨｚ核磁気共鳴分光計を用いるカーボンＮＭＲによって、０．２μｍで濾過した最終生成物試料の分析により生成物の性質を決定した。

実施例３−抗生物質感受性
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）の抗生物質感受性を、１００μｇ／ｍＬの濃度で、アセトゲンＣ３培地中で１７種類の抗生物質に対して評価した（表Ｇ）。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）は、エリスロマイシン、ナリジクス酸、スペクチノマイシン、コリスチン、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびクロラムフェニコールに耐性を示した。３種類の抗生物質が、３種類のエタノール生産クロストリジウムであるＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＰＥＴＣ，Ｃ．ｒａｇｓｇａｌｅｉ、およびＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍとＣ.ｃｏｓｋａｔｉｉを区別した。
これらの区別する抗生物質には、エリスロマイシン、カルベニシリン、およびクロラムフェニコールが含まれた（表Ｊ）。エリスロマイシンおよびカルベニシリンに対する耐性は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＰＥＴＣが共有していたが、クロラムフェニコールに対する耐性はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）のみが示した特色であった。

抗生物質感受性は、各抗生物質を１００μｇ／ｍＬ含有する培地中での増殖に基づく。雰囲気は、ＣＯが３７％、Ｈ_２が３５％、ＣＯ_２が２２％であり、バランスガスはＮ_２であった。積極的な増殖反応を０．２ＡＵを超えるＯＤ６００で記録した。

実施例４−至適ｐＨおよび至適温度
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）は、初期ｐＨが５．８〜６．５の間で最適に増殖し、４．８〜８．０の間の初期ｐＨ値で増殖が起きた（図１３ａ）。初期ｐＨが６．０の非緩衝培地で培養した時、最終ｐＨは４．５と測定された。濃度が５０ｍＭを超えた時、細胞の増殖は非解離酢酸によって顕著に阻害された。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍと比較した時、ｐＨ４．５〜５．５の間でより良好な増殖特性を示した（図４）。この特色は、工業プロセスに特に有用である可能性がある。

様々なｐＨのポイントでの細胞密度測定値の収集に加えて、最終発酵産物（酢酸およびエタノール）も、４．０〜８．５のｐＨ範囲で緩衝化発酵培地を用いるバッチ発酵について測定した。酢酸生産の至適ｐＨ条件はｐＨ５．８５であり、そのｐＨで、容積濃度が１１．０ｇ／Ｌの酢酸が１２０時間で生産された。エタノール生産の至適ｐＨ範囲は６．０〜６．５であり、そのｐＨで、容積濃度が９．９ｇ／Ｌのエタノールが１２０時間で生産された（図５）。

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉの増殖の至適温度は３７℃であり、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）が増殖する温度範囲は２６〜４３℃であった（図６）。

発酵培養液を、ＮｏｖａＢｉｏｐｒｏｆｉｌｅ３００Ａ生化学分析装置（ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いて、アンモニア、オルトリン酸、ナトリウム、カリウム、乳酸、および浸透圧について分析した。有機酸およびアルコールの分析は、５ｍＭのＨ_２ＳＯ_４水溶液で流速１ｍＬ／分で平衡化したＨｉ−ＰｌｅｘＨ分析用ＨＰＬＣカラム（３００×７．７ｍｍ；ＰＬ１１７０−６８３０；ＰｏｌｙｍｅｒＬａｂｓ、パロアルト、カリフォルニア州）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ１２００液体クロマトグラフを用いて行った。培養液画分中の有機酸およびアルコールの同定ならびに確認を、５９７５Ｂ電子衝撃質量分析計（ＭＳ）およびＤＢＦＦＡＰキャピラリーカラム（１５ｍ×２５０μｍ×０．２５μｍフィルム、＃１２２−３２１２、ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、サンタクララ、カリフォルニア州）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ６８９０Ｎガスクロマトグラフ（ＧＣ）で行った。ガスクロマトグラフィーの条件は以下のとおりであった：入口＝２３０℃；３７°／分でのオーブンプログラミング＝３５〜１８０℃、ＭＳインターフェイス＝２４０℃、ヘリウム流＝１．７ｍＬ／分。

実施例５−脂肪酸メチルエステルの分析
細胞バイオマスの脂肪酸メチルエステル組成を、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）、Ｃｌｏｓｔｉｄｉｕｍｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉについて調べた。ペアワイズ比較の相関係数は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）が、細胞膜の脂質組成に基づいて、他のエタノール生産クロストリジウムより５％〜７％の範囲で分岐したことを示した。分岐は、５種類の脂質成分：１，１−ジメトキシヘキサデカン；２−ヘキシル−シクロプロパンオクタン酸，メチルエステル；（Ｚ）−１３−オクタデセナール；１，１−ジメトキシドデカン；およびメチルテトラデカン酸の濃度によって促進された。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの単独測定は、方法の再現性を示すと報告されている（図７ａ、７ｂ、および７ｃ）。

脂肪酸メチルエステルの分析を、ＳｈｕｔｔｅｒおよびＤｉｃｋ（２０００）のＭＩＤＩの方法に従って、５９７５Ｂ電子衝撃質量分析計（ＭＳ）およびＵｌｔｒａ２キャピラリーカラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ６８９０ＮＧＣで行った。ピークの同一性を、細菌の脂肪酸メチルエステル標準物質（４７０８０Ｕ、スペルコ、ベルフォンテ、ペンシルバニア州）を用いて確認した。

実施例６−１６ＳｒＲＮＡ配列
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）の１６ＳｒＤＮＡ配列（配列番号３；図８ａ）の系統発生学的解析は、この生物がクロストリジウムｒＤＮＡ相同性グループ１に属することを示した（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｔ．ａｌ．，１９９４；Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｆｒａｎｃｉｓ１９７５）。エタノール生産クロストリジウムクラスターの代表の１６ＳｒＤＮＡ配列において全般的に高レベルの保存があった。エタノール生産クロストリジウムクラスターの代表についての１６ＳｒＲＮＡ配列のペアワイズ解析は、全ての比較で９９．２７％の類似度を超えた。このクラスターにおいて、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）は、５種類の他のクロストリジウムであるＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＣ−０１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＵ１３９５５０）、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｉｉＥＲＩ−２（ＧＵ１２９５５１）、Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉ（ＡＹ１７０３７８）、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＰＥＴＣ（ＧＵ１３９５５２）およびＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（Ｙ１８１７８）のグループ内に位置した（図８ｂ）。この解析に基づくと、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）は、クロストリジウムｒＤＮＡホモロジーグループ１の中の他のエタノール生産アセトゲンと密接に関連しており、近隣結合／ＵＰＧＭＡ法に基づくと、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ
ＥＲＩ−２と最も密接に関連している（９９．８６％）（図９）。

この１６ＳｒＤＮＡ遺伝子の一次構造は高度に保存されており、７０％以上のゲノムＤＮＡ類似性を有する種は、通常、１６ＳｒＤＮＡ遺伝子について９７％以上の配列同一性を有する（ＳｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔａｎｄＧｏｅｂｅｌ，１９９４）。他の生物と同様に、これらの違いは１６ＳｒＤＮＡ配列の全体にランダムに分散しておらず、特定の超可変領域に集中していた。これらの超可変領域は分類群に特異的であることが知られており、唯一配列解析によって決定することができる。１６ＳｒＤＮＡアライメントのエントロピーの２つの領域は、６種類のエタノール生産アセトゲンのそれぞれについて配列の特徴を特定した。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）は、１６ＳｒＤＮＡ配列の超可変領域内の重要な識別させるＤＮＡ塩基の存在によって独自に特定することができた（表Ｈおよび図１０参照）。これらの特有な配列の特質が、この生物の特徴を特定する。

本研究に提示する６種類のクロストリジウムエタノロジェンの１６ＳｒＲＮＡ解析は、これらの細菌が系統発生レベルで密接に関連していることを示し、個々の種を決定するための９７％配列同一性の閾値要件を超えている。９７％未満異なる生物について新種を確立するための１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の有用性は、十分に確立されている。９７％を超えるスコアは明らかにされておらず、ＤＮＡ−ＤＮＡの再結合、またはＤＮＡフィンガープリンティングなどのより高い分解能を有する方法を使用する必要がある（ＪａｎｄａａｎｄＡｂｂｏｔ，２００７；ＫｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｓａｎｄＴｉｅｄｊｅ，２００５）。

ゲノムＤＮＡを、製造業者によって供給される指示書を用いてＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃ
ｈ（登録商標）ｇＤＮＡミニ細菌キット（ＭｉｎｉＢａｃｔｅｒｉａｌＫｉｔ）（＃ＣＳ１１３０１、インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いてエタノール生産クロストリジウムから単離した。完全な１６ＳｒＤＮＡ配列は、Ｃｈａｎｄｌｅｒら（１９９７年）によって記載された手順に従って行った。使用したユニバーサルプライマーは、１５００塩基対（ｂｐ）配列について０００５Ｆと１５１３Ｒの位置に対応していた。１６Ｓ増幅産物のサイクルシーケンシングを、ＤＮＡポリメラーゼおよびダイターミネーター化学（ｄｙｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を用いて行った。これらの試料を、ＡＢＩ３１００ＡＶＡＮＴ遺伝子分析計で電気泳動した。配列のアライメントおよび分析は、ＢｉｏＥｄｉｔソフトウェアバージョン７．０（Ｈａｌｌ、１９９９）を用いて完了した。報告された配列について、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃは、それぞれグアニン、アデニン、チアミン、シトシンを表している。あいまいな塩基に用いられるコードは以下のとおりである：Ｒ（ＡまたはＧ）、Ｙ（ＣまたはＴ）、Ｗ（ＡまたはＴ）、Ｓ（ＣまたはＧ）、Ｋ（ＧまたはＴ）。シーケンシング結果の再現性を、各生物に対して３回の独立したシーケンシングの実行を比較することによって確認した。それらは、以前に寄託された配列と関連するシーケンシングギャップを埋め、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＣ−０１の場合は、配列が以前にＧｅｎＢａｎｋに存在していなかったので、３つの１６ＳｒＤＮＡ配列をＧｅｎＢａｎｋに寄託した。これらの配列は、以下の獲得番号の下に寄託された：Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＣ−０１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＵ１３９５５０）、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｉｉＥＲＩ−２（ＧＵ１２９５５１）、およびＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＰＥＴＣ（ＧＵ１３９５５２）。

実施例７−ＰＣＲベースのＤＮＡフィンガープリンティング
密接に関連する生物を比較するための１つの方法は、ＲＥＰ−ＰＣＲによるＤＮＡフィンガープリンティングである。この方法は、ほとんどの細菌中に複数コピーで存在する天然の高度に保存された反復ＤＮＡ配列と相補的なＤＮＡプライマーを利用する。ＰＣＲから生じた増幅産物の長さおよび濃度は、密接に関連した種を区別することができるか、または遺伝的に同一である生物を確立するために使用することができる非常に特異的なＤＮＡフィンガープリントを提供する。

３つのＲＥＰ−ＰＣＲ法が、エタノール生産アセトゲンのＤＮＡフィンガープリンティングに用いられ、これらには、反復遺伝子外パリンドロームエレメント（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｅｘｔｒａｇｅｎｉｃｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｅｌｅｍｅｎｔ）（ＲＥＰ−ＰＣＲ）、保存された反復ＤＮＡエレメント（ＢＯＸ−ＰＣＲ）および腸内細菌反復ＰＣＲ遺伝子間コンセンサス配列（ＥＲＩＣ−ＰＣＲ）が含まれた。

ＢＯＸ−ＰＣＲでは、６種類のエタノール生産クロストリジウムのＰＣＲ産物を作製し、比較した（図１１）。全ての生物が、約１１２２ｂｐ、５８７ｂｐおよび３２３ｂｐのバンドを共通して持っていた。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）は、約８６８ｂｐ、７１４ｂｐ、３６２ｂｐおよび３０１ｂｐのバンドを欠いていた。ＰＣＲ増幅産物のピアソンＵＰＧＭＡ相関（ＰｅａｒｓｏｎＵＰＧＭＡｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）による統計分析は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（７６．１％）およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＰＥＴＣ（７５．７％；図１２）と最も密接に関連していることを示した。ＢＯＸ−ＰＣＲによって作製された増幅産物間の違いの規模は、作製された増幅産物の数が少ないこと、およびそれらの質量が似ていることにより最も情報が少ないように思えた。この結果は、これらのゲノム中に存在する標的ＢＯＸパリンドロームエレメントの数が少ないこと、かつこれらの要素が、ＲＥＰ−ＰＣＲおよびＥＲＩＣ−ＰＣＲによって作製されたものよりも高度に保存されていることを示唆している。それにもかかわらず、全てのエタノール生産クロストリジウムが異なること、かつ２４％〜９０．１％の範囲で類似度が変化することは、ＢＯＸ−ＰＣＲによっていぜん容易
に示された。

６種類のエタノール生産クロストリジウムからＲＥＰ−ＰＣＲ産物を作製し、比較した（図１３）。ＲＥＰ−ＰＣＲ法を用いて、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）から７つの主要なＰＣＲ増幅産物が作製された。それらは、１８８４ｂｐ、１４３６ｂｐ、１１３９ｂｐ、８６０ｂｐ、７８５ｂｐ、２８４ｂｐ、および１８５ｂｐであった。２８４ｂｐの増幅産物は全てのエタノール生産クロストリジウムに共通であったが、６種類の生物間で強度が変化した。さらに、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）の１８５ｂｐに位置する増幅産物は、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＰＥＴＣおよびＥＲＩ−２にも存在していたが、強度が非常に低かった。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）の残りのＰＣＲ産物は、この生物に特有であった。ＰＣＲ増幅産物のピアソンＵＰＧＭＡ相関による統計分析は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）が、４０．９％の類似度でＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｒａｇｓｄａｌｅｉと最も密接に関連していたことを示した。ＲＥＰ−ＰＣＲ類似度スコアの範囲は、２．６％〜４０．９％の間で類似度が変化した（図１４）。ＲＥＰ−ＰＣＲ法は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉ（ＰＳ０２）および他のエタノール生産クロストリジウム間の区別を最高レベルで提供し、将来の細菌タイピング研究に好ましいＤＮＡフィンガープリンティング法であろう。

６種類のエタノール生産クロストリジウムからＥＲＩＣ−ＰＣＲ産物を作製し、比較した（図１５）。１７個以上の主要なＰＣＲ増幅産物が、ＲＥＰ−ＰＣＲ法を用いてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）から作製された。最適化した条件下で、ＥＲＩＣ−ＰＣＲ法は、おそらくプローブの特異性の欠如により、ＰＣＲ産物のより高いバックグラウンドをもたらした。それにもかかわらず、ピアソンＵＰＧＭＡ相関による増幅産物パターンの統計解析は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）が、７３．５％の類似度でＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＰＥＴＣと最も密接に関連していることを示した。ＲＥＰ−ＰＣＲの類似度スコアの範囲（４２．７％〜７３．５％）は他の方法よりもはるかに狭く、ＲＥＰ−ＰＣＲが、エタノール生産アセトゲンの細菌タイピングのためのＲＥＰ−ＰＣＲ法よりもあまり望ましくない可能性があることを示した。

ゲノムＤＮＡを、製造業者によって供給される指示書を用いてＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ（登録商標）ｇＤＮＡミニ細菌キット（＃ＣＳ１１３０１、インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いてエタノール生産クロストリジウムから単離した。３つのＲＥＰ−ＰＣＲ法を用いて、ゲノムＤＮＡから増幅産物を作製した。これらは、反復ＤＮＡエレメント（ＢＯＸ−ＰＣＲ）、反復遺伝子外パリンドロームエレメント（ＲＥＰ−ＰＣＲ）、および腸内細菌反復遺伝子間コンセンサス配列（ＥＲＩＣ−ＰＣＲ法）であった。これらの３つの方法のＲＥＰ−ＰＣＲを、ＭａｃＣａｎｎｅｌら（２００６）によって提案された改良を用いて、Ｒａｈｍａｔｉら（２００５）によって記載されているとおりに行った。プライマーは、Ｒａｈｍａｔｉら（２００５）により提供された配列を用いて、インビトロジェン社によって合成された。増幅産物パターンの分子タイピングおよび統計解析を、ＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓ４．０１ソフトウエア（ＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈｓ、フォートワース、テキサス州）を用いて完了した。２つの分子量マーカー（１００ｂｐＤＮＡラダー、１０４８８−０５８、インビトロジェン；およびｐＵＣ１９／Ｓａｕ３Ａ１消化物、ＡＭ７７６０、インビトロジェン）を、約０．１〜０．３μgの濃度でゲルにロードしたが、分子量の割当はＡＭ７７６０標準物質に基づいた。

実施例８−ＤＮＡのＧ＋Ｃ含有量の比較
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）のＤＮＡのＧ＋Ｃモル％は、３２．５％±０．５％Ｇ＋Ｃであり（ｎ＝５）、他の既知のエタノール生産クロストリジ
ウムよりも３〜１０％高かった。これらの細菌のＧ＋Ｃ含量量は、Ｇ＋Ｃ含有量が低いグラム陽性細菌の期待される範囲内に収まる（Ｄｒａｋｅ，ｅｔａｌ．，２００２；およびＤｒａｋｅｅｔａｌ．，２００６）。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）および（ＤＮＡフィンガープリンティングに従って）３種類の最も密接に関連するエタノール生産クロストリジウムのＧ＋Ｃ含有量を表Ｉに提供する。

細菌細胞をフレンチ圧力セルで破砕し、ＤＮＡをＣａｓｈｉｏｎら（１９７７）の手順に従ってヒドロキシアパタイトで精製した。次に、このＤＮＡを、Ｐ１ヌクレアーゼで加水分解し、ヌクレオチドをウシアルカリフォスファターゼで脱リン酸化した（Ｍｅｓｂａｈｅｔａｌ．１９８９）。得られたデオキシリボヌクレオチドをＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣシステム（島津製作所、日本）は、以下のモジュールからなっていた：ＬＣ−２０ＡＤ溶媒送達モジュール、ＤＧＵ−３Ａオンライン脱気装置、ＣＴＯ−１０ＡＣカラムオーブン、ＳＩＬ−２０Ａ自動サンプルインジェクター、およびＳＰＤ−６ＡのＵＶ分光光度検出器。クロマトグラムは、ＣＬＡＲＩＴＹ（バージョン２．４．１．９３）ソフトウェアパッケージ（ＤａｔａＡｐｅｘＬｔｄ、チェコ共和国）を用いて分析した。分析カラムは、ガードカラム２０１ＧＤ５４Ｈ（Ｖｙｄａｃ、ヘスペリア、カリフォルニア９２３４５、ＵＳＡ）を装備したＶＹＤＡＣ２０１ＳＰ５４、Ｃ_１８、５μｍ（２５０×４．６ｍｍ）であった。液体クロマトグラフィーの条件は、温度４５℃、試料１０μｌ、溶媒０，３Ｍの（ＮＨ_４）Ｈ_２Ｐ０_４／アセトニトリル、４０：１（ｖ／ｖ）、ｐＨ４．４、１．３ｍｌ／分であった（Ｔａｍａｏｋａ＆Ｋｏｍａｇａｔａ，１９８４から適合させた）。システム・キャリブレーションに用いられる参照ＤＮＡには、非メチル化ラムダＤＮＡ（シグマ社）、ＧＣ含有量４９．８５８モル％（Ｍｅｓｂａｈｅｔａｌ．，１９８９）、ならびに完全なゲノム配列が公開された３つのＤＮＡ（ｈｔｔｐ：／／ｅｒｇｏ．ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ／ＧＯＬＤ／）：枯草菌ＤＳＭＺ４０２（４３．５１８モル％Ｇ＋Ｃ）；斑点細菌病菌ＤＳＭＺ３５８６^Ｔ（６５．０６９モル％Ｇ＋Ｃ）；およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒＤＳＭＺ
４０７８３（７２．１１９モル％Ｇ＋Ｃ）が含まれていた。Ｇ＋Ｃの値は、Ｍｅｓｂａｈら（１９８９）の方法に従って、デオキシグアノシン（ｄＧ）およびチミジン（ｄＴ）の比から算出した。

実施例９−ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション
ＤＮＡフィンガープリンティング研究は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＰＥＴＣ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｒａｇｓｄａｌｅｉと最も密接に関連することを示した。これらの結果に基づいて、ゲノムＤＮＡの類似度を決定するために、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション研究を、これらの生物を用いて行った。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションは、明らかに、提示さ
れた新しい種に好ましい方法および不明瞭な性質を有する生物の正しい分類単位への最終的な割当に好ましい方法である（Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔｅｔａｌ．，２００２）。種の系統発生学的定義には、（ａ）精製されたＤＮＡ分子が７０％以上のＤＮＡ−ＤＮＡ関連性を示し（ｂ）ヘテロ２本鎖分子の安定性について５℃以下のΔＴｍを有し、かつ（ｃ）表現型の特徴がこの定義と一致すべきであることが含まれる（Ｗａｙｎｅｅｔａｌ，１９８７；ＳｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔａｎｄＧｏｅｂｅｌ，１９９４）。

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉの全てのペアリングは、７０％のＤＮＡ−ＤＮＡ類似度の閾値を用いた時に種の要件を満たした（表Ｊ）。この結果は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）が新しい細菌種を表すことを示した。全ての他のペアリングは、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍを除いて７０％未満の閾値であり、そのため、信頼区間は７０％の閾値で重なった。

ゲノムＤＮＡを剪断し、Ｃａｓｈｉｏｎら（１９７７）によって記載されるとおり、フレンチ圧力セル（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）を用いて細菌細胞から取り出し、ヒドロキシアパタイトのクロマトグラフィーによって精製した。ペルチェサーモスタット６×６マルチセルチェンジャー（Ｐｅｌｔｉｅｒ−ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔｔｅｄ６×６ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｃｈａｎｇｅｒ）およびインサイツ温度プローブ（ｉｎ−ｓｉｔｕｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｐｒｏｂｅ）（バリアン）を有する温度制御装置を備えたモデルＣａｒｙ１００ＢｉｏＵＶ／ＶＩＳ分光光度計を用いて、Ｈｕｓｓら（１９８３）によって記載される改良を考慮し、ＤｅＬｅｙら（１９７０）によって記載されるとおりにＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションを行った。結果を、２つの独立した分析からの平均値として報告し、これらは１０％未満異なっていた。類似度の値は、報告された値の約１０％の範囲で再現性があった。

実施例１０−エタノール生産力および酢酸生産力
長期（１，０００時間を超える）連続攪拌槽型反応器（ＣＳＴＲ）実験は、定常状態の発酵条件下で、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）のエタノール生産力および酢酸生産力を決定するために行った。シンプルで安価な化学的に定義された培地で、ＣＳＴＲモードで増殖させ、電子源および炭素源として合成ガスを用いながら、この生物の発酵バランスを決定した。定常状態の条件時に、微量金属の利用度を測定して、化学的に定義された培地を用いて栄養不足を調査した。

ＢａｌｃｈおよびＷｏｌｆｅ（１９７６）によって記載される絶対嫌気性の技術を用いて調製したアセトゲンＣ５培地を利用して、３７℃で、ＳａｒｔｏｒｉｏｕｓＢｉｏｓｔａｔＢＣＳＴＲを動作させた。この培地は、硫化ナトリウム、酵母エキス、およびＭＥＳ緩衝液を除いたこと、および消泡剤Ａ（シグマケミカル、セントルイス、ミズーリ州）などの消泡剤を最終濃度２０ｍｇ／Ｌでこの培地に加えたことを除いて、基本的に、アセトゲンＣ３培地と同じであった。発酵のｐＨは、５Ｍ水酸化ナトリウムを用いて、プロセスの期間中、５．２０±０．１に調節した。

ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎＰｒｉｍａ δＢプロセスガス質量分析計を用いて、ＣＯ、Ｈ_２、ＣＯ_２、Ｎ_２、ＣＨ_４、およびエタノールの入口ならびに出口のガス濃度の半連続的（２０分間隔の）分析を行った。反応器の作動は２つの主要なプロセス：バッチ条件下で完了する反応器の起動、およびＣＳＴＲエタノール生産段階に分かれていた。１０％の接種菌液をこの反応器に接種した後、細胞密度が培養液１Ｌあたり細胞乾燥重量０．２ｇ（ｇＤＣＷ／Ｌ）に増加するまで、この反応器をバッチモードで動作させた。その時点で、希釈率（Ｄ）０．２日^−１を用いて、アセトゲンＣ５培地からなる連続供給を開始した。起動中およびエタノール生産段階の間中、ＣＯが３７％、ＣＯ_２が２１．６８％、Ｈ_２が３５．１％およびＮ_２が６．２２％の組成で、ＣＯ、Ｈ_２およびＣＯ_２からなる合成ガスまたは廃ガスをバイオリアクターに連続的に導入した。７０％を超える水素取り込みを維持する速度で、ガスを流し、撹拌した。最後に、培地の供給速度は、細胞密度が０．６０ｇＤＣＷ／Ｌを超えた後、４８時間にわたって、Ｄ＝０．５日^−１の最終値まで増加した。

アセトゲンＣ５培地を用いた時、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）の初期対数増殖期の間、前定常状態のケモスタット培養の最大倍加時間は０．０６４時間^−１であった。エタノール生産段階、および定常状態のケモスタット増殖の間、増殖速度は７５〜１００倍減少し、ＣＳＴＲ作動の最大１１５０時間の間安定であった（図１７）。

Ｃ．ｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）のＣＳＴＲ発酵から収集したバイオマスの成分プロファイルを、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＰＥＴＣ（Ｔａｎｎｅｒｅｔａｌ．，１９９３）について公表された結果と比較した。Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉＰＥＴＣと比較した時、Ｃ．ｃｏｓｋａｔｉｉバイオマスの試料はかなり多くのリンおよび硫黄を含んでいたが、カリウムおよび酸素は同様のレベルであった（図１８）。この結果は、これらの２種類のエタノール生産クロストリジウムには、細胞の成分組成に著しい違いがあることを示した。

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）によるガスの取り込み、バイオマス生産、生成物の形成を、１１５０時間にわたるＣＳＴＲについて測定した（図１９および２０）。この期間中、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉを、ＣＯが３７％、ＣＯ_２が２１．６８％、Ｈ_２が３５．１％およびＮ_２が６．２２％の下で、１Ｌあたりシステイン遊離塩基を０．１ｇ含むアセトゲンＣ５培地で増殖させた。約２００時間までに、ガス流、撹拌、希釈率、および細胞密度は、それぞれ、０．２７ｖｖｍ、９００ｒ
ｐｍ、０．５日^−１、および１．７３３ｇＤＣＷ／Ｌの最終的な定常状態の値に達した。ＣＳＴＲ動作の１０日後、この反応器の定常状態の条件である希釈率０．５日^−１に達した（４４０時間の時点）。培養液のＬＣ分析およびＧＣ−ＭＳ分析の両方は、２つの主要生成物が発酵から生産されたこと、それらが酢酸およびエタノールであったことを示した（図２１）。代謝中間体（ギ酸塩）または最終生成物（酢酸およびエタノール）の酸性触媒による化学反応生成物である酢酸エチルおよびギ酸、エチルエステルも微量存在した（図２１）。

定常状態の条件に達した後、発酵のマスバランスを完了させ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｃｏｓｋａｔｉｉがアセチルＣｏＡ経路を用いていることを確認した。ＣＯ、およびＨ_２の取り込みの平均値および標準偏差ならびにＣＯ_２およびエタノール蒸気の放出を、４４０時間の時点で開始し、９１０時間で終了する４７０時間の間計算した。この期間、ガス化合物の測定に加えて、培養液画分中のバイオマス、エタノール、酢酸の量および発酵量を測定した（図２２ａおよび２２ｂ）。このマスバランスの平均値は以下のとおりであった：
・エタノール生産：５．３６５ミリモル／Ｌ／ｈｒ
・酢酸生産：３．７４５ミリモル／Ｌ／ｈｒ
・放出されたエタノール：０．１４４ミリモル／Ｌ／ｈｒ
・バイオマス生産：０．０５３３ミリモル／Ｌ／ｈｒ
・ＣＯの取り込み：２８．２７ミリモル／Ｌ／ｈｒ
・Ｈ_２の取り込み：２０．５８ミリモル／Ｌ／ｈｒ
・ＣＯ_２の取り込み：−８．５２ミリモル／Ｌ／ｈｒ（負の取り込み）

表Ｋの電子バランスは、プロセス中に供給される電子供与体の濃度と細菌から生産される電子受容体（酢酸およびエタノール）の濃度の間の一致が優れていることを示す。電子バランスを１．０４％まで閉鎖すると、他の主要な生成物が発酵培養液中に存在しなかったことを確証する（表Ｋ）。

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）などのクロストリジウムエタノロジェンの炭素バランスは、ＣＯおよびＨ_２の混合物が共に代謝される時（５ページの反応を参照されたい）、ＣＯ_２の消費反応およびＣＯ_２の生産反応の両方があるという事実によって複雑になる。一酸化炭素デヒドロゲナーゼによるＣＯの酸化は、最小培地条件下でＣＯ_２を生産する主反応であり、ヒドロゲナーゼによるＨ_２の酸化を介して派生する電子を用いるアセチルＣｏ−Ａ経路は、ＣＯ_２の取り込みの主な消費経路である。酢酸に
対するエタノールのモル比がおおよそ１：１で生産されている生化学系では、酸化されるＨ_２の全モルは、アセチルＣｏ−Ａに固定されるＣＯ_２の０．４１６６６モルになる（この値は、酢酸生産（２：１）およびエタノール生産（３：１）についての平均のＣＯ_２に対するＨ_２の比から計算される）。以下の実施例では、ヒドロゲナーゼから獲得される電子を介して消費されるＣＯ_２の量は、利用される水素の全ミリモルを２．４０で割ることによって推定することができる。

このＣＳＴＲ発酵の炭素バランスを表Ｌに示す。この炭素バランスは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）の代謝が酢酸生産モデルに適合することを示す。さらに、この実験の測定誤差が１％未満であることは、重ねて、全ての反応物質および生成物が正確に測定されていること、かつこの合成ガス発酵で生産されている他の主要な生成物はないことを確証する。

実施例１１−エタノール生産力および酢酸生産力に対する有機炭素源の効果−化学的に定義された最小培地の検証
有機炭素源である酵母エキスの効果を、定常状態の発酵条件下で、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉを含む長期（７００時間を超える）連続攪拌槽型反応器（ＣＳＴＲ）で評価した。これらの研究を通して、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉが複合有機炭素源の非存在下で十分増殖することが示された。この特色は、他の既知のクロストリジウムエタノロジェンについて以前に証明されておらず、そのため、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉに特有であった。ＣＳＴＲ研究を、化学的に定義された最小培地、および０．１ｇ／Ｌの酵母エキスを補充した培地を用いて完了し、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉによるエタノール生産および酢酸生産に対する複合有機炭素源の効果をさらに特徴づけた。

ＳａｒｔｏｒｉｏｕｓＢｉｏｓｔａｔＢＣＳＴＲを、実施例１０に前記したとおり、アセトゲンＣ５培地を利用して、３７℃で動作させた。反応器の条件および動作手順は、実施例１０に前記したものと同一であった。

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ（ＰＳ０２）によるエタノール生産および
酢酸生産に対する酵母エキスの効果を、７２０時間にわたって、２つのＣＳＴＲについて測定した（図２３）。反応器の起動中および定常状態の条件の確立の前に、供給培地に酵母エキスを含まない対照反応器、および０．１ｇ／Ｌの酵母エキスを補充した反応器についての酢酸生産およびエタノール生産は同じであった。接種菌液からの栄養分の持ち越しにより、反応器の起動中の生産動向は類似していた。これらの持ち越し栄養分は、０．２日^−１の希釈率に基づいて、１９２時間の時点で栄養分の元の濃度の６０％を上回って枯渇し、この時点で酢酸およびエタノールの動向の違いが著しくなった。希釈率は、２００時間の時点で０．５日^−１まで増加し、対照反応器においてはエタノール濃度が２４ｇ／Ｌの定常状態の条件まで増加したが、０．１ｇ／Ｌの酵母エキスを補充した反応器においては１ｇ／Ｌ未満まで低下したという点で、酢酸生産およびエタノール生産の違いはより顕著になった。エタノール生産におけるこれらの変化は、０．１ｇ／Ｌの酵母エキスを補充した反応器については酢酸生産の２倍の増加（２３ｇ／Ｌ）と関連したが、対照反応器の酢酸レベルは、この実験の期間中、約１２ｇ／Ｌの一定な定常状態レベルのままであった。これらのデータは、アセトゲンＣ５培地に相当する化学的に定義された最小培地が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉを用いる合成ガス発酵によるバイオ燃料の生産に最適であることを示す。

本発明は、その好ましい実施形態に関して記載してきたが、本発明のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ細菌は、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内の様々な方法で利用できることを当業者なら認識するであろう。したがって、本発明は、上記に記載の特定の実施形態に限定されるべきではない。

Claims

ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１０５２２の識別特性の全てを有する微生物Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉの生物学的に純粋な培養物。
嫌気的条件下で、一酸化炭素、二酸化炭素および水素またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるガス基質からエタノールを生産する能力を有する微生物Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１０５２２の生物学的に純粋な培養物。
前記ガス基質が合成ガスによって提供される、請求項２に記載の生物学的に純粋な培養物。
嫌気的条件下で、一酸化炭素、二酸化炭素および水素またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるガス基質から酢酸を生産する能力を有する微生物Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１０５２２の生物学的に純粋な培養物。
前記ガス基質が合成ガスによって提供される、請求項４に記載の生物学的に純粋な培養物。
炭素源を含む嫌気性水性栄養培地からエタノールを生産する能力を有する微生物Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１０５２２の生物学的に純粋な培養物。
前記炭素源が有機複合炭素源ではない、請求項６に記載の生物学的に純粋な培養物。
前記炭素源が酵母エキスではない、請求項６に記載の生物学的に純粋な培養物。
有機炭素源で構成される嫌気性水性栄養培地から酢酸を生合成する能力を有する微生物Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉ、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１０５２２の生物学的に純粋な培養物。
配列番号１、配列番号２、および配列番号３に記載される１６ＳｒＤＮＡ配列を有する微生物Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉの生物学的に純粋な培養物。
１００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール系抗生物質の存在下で増殖する能力を有する微生物Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉの生物学的に純粋な培養物。
エタノールを生産する方法であって、前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉが前記炭素源をエタノールに変換することができる条件下で、炭素源、電子源およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｓｋａｔｉｉを組み合わせるステップを含む方法。
前記炭素源がＣＯ_２である、請求項１０に記載の方法。
前記炭素源が有機炭素である、請求項１０に記載の方法。
前記電子源がＨ_２またはＣＯである、請求項１０に記載の方法。