JP2009201388A

JP2009201388A - エタノール生産方法

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Publication number: JP2009201388A
Application number: JP2008045184A
Authority: JP
Inventors: Masayuki Toyama; 正幸遠山; Kazue Takaoka; 一栄高岡; Sadazo Yoshino; 貞蔵吉野
Original assignee: Kyushu University NUC; Mitsui Engineering and Shipbuilding Co Ltd
Current assignee: Kyushu University NUC; Mitsui Engineering and Shipbuilding Co Ltd
Priority date: 2008-02-26
Filing date: 2008-02-26
Publication date: 2009-09-10
Anticipated expiration: 2028-02-26
Also published as: JP5410685B2

Abstract

【課題】エタノールを生成する能力を有するＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属に属する微生物を用いて、エタノールを生産する方法を提供すること。
【構成】一酸化炭素、または二酸化炭素と水素からなる合成ガスを基質として導入し、嫌気的環境下で、エタノール生成能を有するバイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）属に属する微生物によってエタノールを生成するエタノールの生産方法において、微生物に特異的な酸化還元メディエータを添加することを特徴とする。
【選択図】なし

Description

本発明はエタノールの生産方法に関し、エタノールを生成する能力を有するＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属に属する微生物を用いて、エタノールを生産する方法に関する。

温暖化対策や、化石燃料の消費抑制のため、新たなエネルギーに関する研究が進められている。

産業排ガスや木質系バイオマスのガス化・改質にともなって排出されるガスに含まれる気体状の二酸化炭素や一酸化炭素などを原料として微生物による発酵を行い、酢酸やエタノールなどの有用物を回収する技術がある。

特に、エタノールは近年、燃料としての需要が高まっており、有用物としての価値が高い。さらに、二酸化炭素は温暖化ガスのひとつであるので、二酸化炭素を炭素源として利用できる菌が得られれば、温暖化ガスの削減効果が期待できる。

過去に、二酸化炭素や一酸化炭素を基質として酢酸やエタノールなどの有用物を生産する微生物としては、主にクロストリジウム属菌が知られているに過ぎなかった（特許文献１〜４）。
特開平１−９８４７２号公報アセトバクテリウム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属米国特許第５１７３４２９号明細書クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属特表２００４−５０４０５８号公報クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属特開２００３−３３９３７１号公報クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属又はその派生属特開平７−１８４６６７号公報クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、アセトバクテリウム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、デスルホビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）属

本発明者らは、微生物の単離とスクリーニングを重ね、二酸化炭素や一酸化炭素を基質として、酢酸やエタノールを生成する能力を有するバイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）属に属するＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｓｐ．ＳｔｒａｉｎＧ１１微生物を選抜したが、この菌株も通常の培養環境では、エタノールより酢酸生成の方が上回ることが判った。

微生物が二酸化炭素などの気体状の炭化水素をエタノールにする経路は知られており、酸化還元物質を添加することでエタノール生産経路の化学的あるいは電気的均衡を調節し、エタノール生産性を向上させることができる場合があるので（特許文献３、５等）、参考にしたがエタノール生産性をあげることができなかった。

そこで、本発明者らは、さらに、研究を重ねた結果、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｓｐ．ＳｔｒａｉｎＧ１１株に対して特異的に作用する酸化還元物質を見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明の課題は、エタノールを生成する能力を有するＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属に属する微生物を用いて、エタノールを生産する方法を提供することにある。

本発明の他の課題は以下の記載によって明らかになる。

上記課題は以下の各発明によって解決される。

（請求項１）
一酸化炭素、または二酸化炭素と水素からなる合成ガスを基質として導入し、嫌気的環境下で、エタノール生成能を有するバイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）属に属する微生物によってエタノールを生成するエタノールの生産方法において、微生物に特異的な酸化還元メディエータを添加することを特徴とするエタノールの生産方法。

（請求項２）
微生物が、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｓｐ．ＳｔｒａｉｎＧ１１（寄託番号ＮＩＴＥＰ−４７１）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されているものである請求項１記載のエタノールの生産方法。

（請求項３）
微生物に特異的な酸化還元メディエータが、４−ジメチルアミノアゾベンゼン−２−カルボン酸（メチルレッド）であることを特徴とする請求項１又は２記載のエタノールの生産方法。

（請求項４）
酸化還元メディエータとして、４−ジメチルアミノアゾベンゼン−２−カルボン酸（メチルレッド）を１０ｐｐｍ以上３０ｐｐｍ以下の濃度で添加することを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載のエタノールの生産方法。

本発明によれば、エタノールを生成する能力を有するＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属に属する微生物を用いて、エタノールを生産する方法を提供することができる。

以下、本発明の実施の形態を説明する。

本発明で用いるバイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）属に属する新規微生物は、以下、必要に応じて「本菌株」と称する。

本菌株は、福岡市下水処理場のメタン発酵処理分画より単離した菌株であり、二酸化炭素や一酸化炭素を基質として酢酸とエタノールを生成する能力を持つ、バイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）属に属する新種である。

本菌株は、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｓｐ．ＳｔｒａｉｎＧ１１（寄託番号ＮＩＴＥＰ−４７１）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されており、以下のような性質を有する。なお、＋は陽性又は有を示し、−は陰性又は無を示している。

Ａ．形態的性質
（１）細胞の形及び大きさ：約０．３μｍの球菌
（２）運動性の有無：−
（３）胞子の有無：−

Ｂ．培養的性質
（１）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（ＣＬ）培地寒天平板培養（※１）
３７℃、培養日数２日で直径１〜２ｍｍの円形のコロニーを形成する
ｉ）色：灰白色
ｉｉ）表面の形状：スムーズ
ｉｉｉ）透明度：半透明
ｉｖ）変異によるコロニー形態の変化：−
ｖ）培養条件や生理的状態によるコロニー形態の変化：−
※１Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ培地の培地組成を下記に示す。
ＮＨ_４Ｃｌ１．００ｇ
ＫＣｌ０．１０ｇ
ＭｇＳＯ_４０．２０ｇ
ＮａＣｌ０．８０ｇ
ＫＨ_２ＰＯ_４０．１０ｇ
ＣａＣｌ_２０．０２ｇ
Ｎａ_２ＷＯ_４０．２０ｍｇ
ＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ１．００ｇ
ＮａＨＣＯ_３１．００ｇ
Ｆｒｕｃｔｏｓｅ５．００ｇ
Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ＨＣｌ０．３０ｇ
Ｎａ_２Ｓ０．３０ｇ
Ｔｒａｃｅｅｌｅｍｅｎｔｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉ）１０ｍｌ
Ｖｉｔａｍｉｎｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＩＩ）１０ｍｌ
Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄｗａｔｅｒ１０００ｍｌ
Ａｇａｒ１５ｇ
ｐＨ５．９
なお、上記の（Ｉ）Ｔｒａｃｅｅｌｅｍｅｎｔｓｏｌｕｔｉｏｎ及び（ＩＩ）Ｖｉｔａｍｉｎｓｏｌｕｔｉｏｎは以下の組成である。
（Ｉ）Ｔｒａｃｅｅｌｅｍｅｎｔｓｏｌｕｔｉｏｎ
Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃａｃｉｄ１．５ｇ
ＭｇＳＯ_４３．０ｇ
ＭｎＳＯ_４０．５ｇ
ＮａＣｌ１．０ｇ
ＦｅＳＯ_４０．１ｇ
ＣｏＳＯ_４０．１８ｇ
ＣａＣｌ_２０．１ｇ
ＺｎＳＯ_４０．１８ｇ
ＣｕＳＯ_４０．０１ｇ
ＫＡｌ（ＳＯ_４）_２０．０２ｇ
Ｈ_３ＢＯ_３０．０１ｇ
Ｎａ_２ＭｏＯ_４０．０１ｇ
ＮｉＣｌ_２０．０２５ｇ
Ｎａ_２ＳｅＯ_３０．３ｍｇ
Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄｗａｔｅｒ１０００ｍｌ
（ＩＩ）Ｖｉｔａｍｉｎｓｏｌｕｔｉｏｎ
Ｂｉｏｔｉｎ２．０ｍｇ
Ｆｏｌｉｃａｓｉｄ２．０ｍｇ
Ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ−ＨＣｌ１０ｍｇ
Ｔｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌ５．０ｍｇ
Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ５．０ｍｇ
Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃａｃｉｄ５．０ｍｇ
Ｄ−Ｃａ−ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ５．０ｍｇ
ＶｉｔａｍｉｎＢ₁₂ ０．１ｍｇ
Ｐ−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ５．０ｍｇ
Ｌｉｐｏｉｃａｃｉｄ５．０ｍｇ
Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄｗａｔｅｒ１０００ｍｌ
（２）ゼラチン穿刺培養
ｉ）ゼラチン液化：−
（３）リトマス・ミルク
ｉ）反応：リトマス還元
ｉｉ）凝固：＋
（４）Ｂ．Ｃ．Ｐ．ミルク
ｉ）反応：アルカリ性

Ｃ．生理学的性質
（１）グラム染色性：−
（２）硝酸塩の還元：＋
（３）インドールの生成：−
（４）硫化水素の生成：−
（５）デンプンの加水分解：−
（６）ウレアーゼ：−
（７）カタラーゼ：−
（８）生育の範囲
ｉ）至適ｐＨ：７．２
ｉｉ）温度：２０〜４２℃で良好に生育
（９）酸素に対する態度：偏性嫌気性
（１０）Ｏ−Ｆテスト：酸化型
（１１）糖類からの酸及びガスの生成
ｉ）Ｌ−アラビノース：酸（−）／ガス（−）
ｉｉ）Ｄ−キシロース：酸（−）／ガス（−）
ｉｉｉ）グルコース：酸（＋）／ガス（−）
ｉｖ）Ｄ−マンノース：酸（−）／ガス（−）
ｖ）フラクトース：酸（＋）／ガス（−）
ｖｉ）マルトース：酸（−）／ガス（−）
ｖｉｉ）ラクトース：酸（−）／ガス（−）
ｖｉｉｉ）Ｄ−トレハロース：酸（−）／ガス（−）
ｉｘ）Ｄ−ソルビトール：酸（−）／ガス（−）
ｘ）Ｄ−マンニトール：酸（−）／ガス（−）
ｘｉ）グリセリン：酸（−）／ガス（−）
ｘｉｉ）Ｄ−セロビオース：酸（−）／ガス（−）
ｘｉｉｉ）エスクリン：酸（−）／ガス（−）
ｘｉｖ）サリシン：酸（−）／ガス（−）
ｘｖ）Ｄ−メレチトース：酸（−）／ガス（−）
ｘｖｉ）Ｄ−ラフィノース：酸（−）／ガス（−）
ｘｖｉｉ）Ｌ−ラムノース：酸（＋）／ガス（−）

Ｄ．その他の特徴酵素反応
ｉ）アルギニンジヒドロラーゼ：＋
ｉｉ）α−ガラクトシダーゼ：−
ｉｉｉ）β−ガラクトシダーゼ：−
ｉｖ）β−ガラクトシダーゼ６−フォスフェート：−
ｖ）α−グルコシダーゼ：−
ｖｉ）β−グルコシダーゼ：−
ｖｉｉ）α−アラビノシダーゼ：−
ｖｉｉｉ）Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ：−
ｉｘ）グルタミン酸デカルボキシラーゼ：−
ｘ）α−フッコシダーゼ：−
ｘｉ）アルカリフォスファターゼ：−
ｘｉｉ）アルギニンアリルアミダーゼ：−
ｘｉｉｉ）Ｐプロリンアリルアミダーゼ：−
ｘｉｖ）ロイシルグリシンアリルアミダーゼ：−
ｘｖ）フェニルアラニンアリルアミダーゼ：−
ｘｖｉ）ロイシンアリルアミダーゼ：−
ｘｖｉｉ）ピログルタミン酸アリルアミダーゼ：−
ｘｖｉｉｉ）チロシンアリルアミダーゼ：−
ｘｉｘ）アラニンアリルアミダーゼ：−
ｘｘ）グリシンアリルアミダーゼ：−
ｘｘｉ）ヒスチジンアリルアミダーゼ：−
ｘｘｉｉ）グルタミルグルタミン酸アリルアミダーゼ：−
ｘｘｉｉｉ）セリンアリルアミダーゼ：−

Ｅ．１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく分子系統解析
１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を決定し、ＤＮＡデータベース（ＤＤＢＪ）にアクセスし、ＢＲＡＳＴプログラムを用いて１６ＳｒＤＮＡの塩基配列の相同性検索を行った結果、いずれのＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属細菌とも１６ＳｒＤＮＡの相同性が９７％未満であった。

Ｆ．分類・同定の結果
本菌株の表現形質による分類学的性質に基づき、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｎ．Ｒ．Ｋｒｉｅｇ，Ｊ．Ｇ．Ｈｏｌｔ（ｅｄ），Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８４）およびＢｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａｌｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（９ｔｈｅｄ．），Ｊ．Ｇ．Ｈｏｌｔ，Ｎ．Ｒ．Ｋｒｉｅｇ，Ｐ．Ｈ．Ａ．Ｓｎｅａｔｈ，Ｊ．Ｔ．Ｓｔａｌｅｙ，Ｓ．Ｔ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ（ｅｄ），Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９９４）を参考に分類・同定を行った結果、本菌株はＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属と同定された。

Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属には基準種Ｖ．ｐａｒｖｕｌａの他に、Ｖ．ａｔｙｐｉｃａ、Ｖ．ｄｉｓａｐａｒ、Ｖ．ｃｒｉｃｅｔｉ、Ｖ．ｒａｔｔｉなどが知られている。知られているＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属菌は、Ｖ．ｃｒｉｃｅｔｉにのみフルクトース発酵能があるが、一般的には糖類を発酵することなく、ピルビン酸や乳酸などの有機酸の発酵能を有するのみである。

一方、本菌株は、フルクトースで生育可能（発酵能有）であり、さらにグルコースに対しても発酵能を有する点で他のＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属菌と分類学的に異なる。

また、一般に、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく分子系統解析では、相同性が９５％以上であれば同属、９７％以上であれば類縁関係があり、９９％以上であれば同種とみなすことができるとされている。

本菌株の１６ＳｒＤＮＡの結果では他のＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属の菌との相同性は９７％未満であったので、公知のＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属菌株とは分子生物学的にも別の種であることが示された。

本菌株は、グルコース、フラクトースから酢酸の他にエタノールを生成するほか、一酸化炭素、または二酸化炭素と水素を基質として、酢酸の他にエタノールを生成することを特徴とする。通常の状態では、酢酸生成に比べてエタノール生成量は少ないが、本菌株に特異的な酸化還元物質を添加することで、エタノール生成量を向上させることができる。

以下に、エタノールを生成する能力を有するＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属に属する微生物を用いて、エタノールを生産する方法を説明する。

本発明のエタノールを生産する装置としては、例えば図１に示す装置を用いて行うことができる。

図１において、１は耐圧式の発酵槽であり、攪拌機１１を備えている。２は、微生物に必要なビタミン等を補給する培地（ブイヨン）タンクであり、培地は、必要な際にポンプ２１により発酵槽１内に供給される。

３はスパージャーであり、フィルター３１を通して滅菌された合成ガス（基質）を発酵槽１内に供給する。３２はブロワーである。

なお、図１は図示しないｐＨ、温度、圧力を測定し調整する手段及び酸化還元電位測定手段を備えている。生産方式は、バッチ式でも連続生産式でもよい。

図１の装置における培養条件は、本菌株の生育に好ましい条件であり、温度は、２５〜４０℃、好ましくは３０〜３８℃、圧力（ゲージ圧）は０．１〜０．２５ＭＰａ、好ましくは０．１〜０．２ＭＰａ、ｐＨは６〜７．５、好ましくは６．５〜７である。

基質として提供するガスは、一酸化炭素、あるいは二酸化炭素と水素からなる合成ガスである。

図２は、本菌株が二酸化炭素等を資化して、エタノールを生成する経路の略式図である。この経路で、一酸化炭素は、図２の右側の経路、二酸化炭素は左右何れかの経路からアセチルＣｏＡを経て、酢酸やエタノール、或いは細胞を形成する有機物を得る。

二酸化炭素を基質とした場合は、左右何れかの経路の上から反応が始まるので、二酸化炭素からアセチルＣｏＡに至るまでには水素が必要である。一方、一酸化炭素を基質とした場合には、右経路の中段から反応が始まるので、水素は必要ない。

そのため、基質として一酸化炭素を用いる場合は、単独で供給しても良いし、二酸化炭素と混合してもよい。発酵槽内で起きる他の反応で生じた水素をエタノール生産に利用することができるからである。一酸化炭素：二酸化炭素の混合割合は、１０：０〜８：２が好ましい。

二酸化炭素を基質とする場合、水素は必須である。二酸化炭素と水素からなる合成ガスの二酸化炭素：水素の混合割合は、１：１〜８：２が好ましい。

本発明では、発酵槽内のブイヨンに、４−ジメチルアミノアゾベンゼン−２−カルボン酸（メチルレッド）を１０〜３０ｐｐｍ、好ましくは５〜１５ｐｐｍ添加することを特徴とする。

前述のように、一酸化炭素、または二酸化炭素と水素からなる合成ガスは、アセチルＣｏＡを経て、酢酸やエタノール、或いは細胞を形成する有機物を得るが、通常は酢酸になる割合が最も高い。

４−ジメチルアミノアゾベンゼン−２−カルボン酸（メチルレッド）を１０〜３０ｐｐｍ、好ましくは５〜１５ｐｐｍ添加すると、アセチルＣｏＡからの酢酸の合成を阻害（抑制）して、アセチルＣｏＡからエタノールへの合成を促進する。

本菌株に対して、酢酸生成阻害およびエタノール生成亢進作用は、この４−ジメチルアミノアゾベンゼン−２−カルボン酸（メチルレッド）が特異的であり、ほかの酸化還元物質を用いた場合はエタノール生成亢進作用は認められない。

以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はかかる実施例によって限定されない。

参考例１〈メチルレッド添加なしのエタノール生成〉
まず、本菌株を接種した滅菌済ＣＬ培地２０ｍｌを５０ｍｌ耐圧バイアルに入れＣＯ／ＣＯ_２ガス（ＣＯ：ＣＯ_２＝８：２）を封入し、１５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で２４〜４８時間培養し、培養液を作製した。

培養液を、図１に示す実験装置（発酵槽の実効体積１Ｌ）に加圧状態のまま移し、ＣＯ／ＣＯ_２ガスを再封入した。ｐＨを７．０、温度３７℃、攪拌を１００ｒｐｍとし、ＣＯ／ＣＯ_２ガス循環が０．１ｖｖｍの条件で３日間エタノール生成実験を行った。

実施例１〈メチルレッド添加ありのエタノール生成〉
酸化還元電位調節剤として発酵槽内にメチルレッドを１０ｐｐｍ添加した以外は参考例１と同様にしてエタノール、酢酸の生成量を調査した。

比較例１
酸化還元電位調節剤として発酵槽内にパントテン酸カルシウムを１０ｐｐｍ添加した以外は参考例１と同様にしてエタノール、酢酸の生成量を調査した。

比較例２
酸化還元電位調節剤として発酵槽内にベンジルビオロゲンを１０ｐｐｍ添加した以外は参考例１と同様にしてエタノール、酢酸の生成量を調査した。

参考例１、実施例１、比較例１及び２の結果を表２に示す。

比較例１及び２では、エタノール生成亢進作用は認められない上、酢酸生成もみられなくなった。

本発明を用いてエタノール生産を行うことができる装置の例を示す模式図二酸化炭素等を資化して、エタノールを生成する経路の略式図

符号の説明

１：発酵槽
１１：攪拌機
２：培地タンク
２１：ポンプ
３：スパージャー
３１：フィルター
３２：ブロワー

Claims

一酸化炭素、または二酸化炭素と水素からなる合成ガスを基質として導入し、嫌気的環境下で、エタノール生成能を有するバイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）属に属する微生物によってエタノールを生成するエタノールの生産方法において、微生物に特異的な酸化還元メディエータを添加することを特徴とするエタノールの生産方法。
微生物が、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｓｐ．ＳｔｒａｉｎＧ１１（寄託番号ＮＩＴＥＰ−４７１）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されているものである請求項１記載のエタノールの生産方法。
微生物に特異的な酸化還元メディエータが、４−ジメチルアミノアゾベンゼン−２−カルボン酸（メチルレッド）であることを特徴とする請求項１又は２記載のエタノールの生産方法。
酸化還元メディエータとして、４−ジメチルアミノアゾベンゼン−２−カルボン酸（メチルレッド）を１０ｐｐｍ以上３０ｐｐｍ以下の濃度で添加することを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載のエタノールの生産方法。