CN101250543A - 日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因及其编码的蛋白质和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因及其编码的蛋白质与用途，本发明所提供的日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因编码的蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。本发明提供的异胡豆苷合成酶基因可以通过基因工程技术提高日本蛇根草或喜树等资源植物中抗癌成分喜树碱的含量，可用于利用转基因技术来提高喜树碱含量的研究和产业化中，有助于促进喜树碱药源严重匮乏问题的解决，具有很好的应用前景。

Description

日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因及其编码的蛋白质和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是涉及在日本蛇根草中表达的异胡豆苷合成酶基因及其编码的蛋白质和应用。

背景技术

喜树碱(Camptothecins，CPT)是一种最初由Wall等从中国特有的喜树中分离得到的活性物质，是目前最有效的天然抗癌药物之一。研究发现CPT是通过阻断拓朴异构酶I(topoisomerase I，topo I)的合成而发挥其抗癌作用的，这一独特抗癌机理的发现引起了人们对喜树碱及其类似物的研究与开发热潮。目前已有4种以CPT为前体合成的喜树碱衍生物CPT-II(Irinotecan)、TPT(Topotecan)、9-AC(9-aminocamptothecin)及9-NC(9-nitrocamptothecin)获得美国食品和药物管理局(FDA)批准，用于临床治疗结肠癌、直肠癌和复发性卵巢癌。喜树碱及喜树碱衍生物已成为继紫杉醇后的第二种木本类抗肿瘤药，目前全球市场需求十分巨大。现代工业化生产中的喜树碱主要靠从喜树等天然植株中提取而获得。然而喜树生长十分缓慢，且喜树碱及其类似物在植物体内含量较低，所以从天然的喜树中提取喜树碱的方法远远不能满足人们对喜树碱日益增长的需要。因此，喜树碱药源的严重匮乏，已经成为制约喜树碱相关产业发展的最大障碍。

近年来植物基因工程技术的飞速发展和广泛应用，为利用现代生物技术提高喜树碱或其前体的含量开辟了一条崭新的途径。利用现代生物技术将喜树碱生物合成途径中的关键酶基因(或转录因子)导入日本蛇根草中，获得转基因的细胞系、组织或再生植株，并进行大规模的培养，是实现从根本上提高喜树碱含量的最佳途径。喜树碱在结构上属于一种喹啉类生物碱，但其生物合成来自于萜类吲哚生物碱(Terpenoid indole alkaloids，TIA)。和其他吲哚类生物碱类似，喜树碱也是由TIA合成的主要共用中间体异胡豆苷(Strictosidine，也称次番木鳖苷)衍生而来。由莽草酸途径来的色胺(Tryptamine)与由1-去氧木糖-5-磷酸(DXP)途径经多步反应生成的裂环马钱子苷(Secologanin)，在异胡豆苷合成酶(Strictosidine synthase，STR)催化下形成吲哚生物碱的共同前体异胡豆苷，异胡豆苷进而转变成Strictosamide。再经过几步酶促反应后最终生成喜树碱。研究表明异胡豆苷合成酶(STR)是喜树碱生物合成途径中的公认的关键酶，是利用基因工程技术代谢调控喜树碱生物合成的关键靶点之一。

药用植物日本蛇根草(Ophiorrhiza japonica)，为茜草科多年生草本植物，主要分布于我国南方地区。在我国民间常用于平血散瘀，跌打损伤。最近我们发现在日本蛇根草中能够产生喜树碱等活性成分，由于日本蛇根草作为一种产喜树碱的草本植物比木本植物喜树具有更多的研究优势如生长快周期短，易于遗传转化及植株再生等，这无疑为研究喜树碱的生物合成及其分子调控提供了一种新的优质生药来源。

在对现有文献的分析中，“Plant Cell and Physiology(植物细胞与生理)，2003，44，395-403”报道了从短小蛇根草中克隆了异胡豆苷合成酶，但至今尚未有从药物植物日本蛇根草中分离克隆出异胡豆苷合成酶基因的文献报道。由于这个基因编码的酶对于喜树碱的生物合成具有显著影响，因此，这一步是利用基因工程技术来调控喜树碱生物合成的关键切入点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因及其编码的蛋白质与用途，以填补从我国药物植物日本蛇根草中分离克隆出异胡豆苷合成酶的空白。

本发明所提供的日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因，是具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。

本发明所提供的日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因编码的蛋白质，是具有SEQID No.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。

含有本发明的日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因全序列或部分片段的质粒和植物表达载体均属于本发明的保护范围。

一种宿主细胞，该细胞含有本发明的日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因、所述质粒或植物表达载体的基因序列。

所述宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞、烟草细胞或其它植物细胞。

所述宿主细胞优选大肠杆菌细胞或农杆菌细胞或日本蛇根草发根细胞。

本发明的日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因的应用，包括用所述的植物表达载体转化日本蛇根草细胞或者用所述的农杆菌与日本蛇根草细胞共培养或者用所述的日本蛇根草发根细胞培育雄性不育植株或者用所述的异胡豆苷合成酶基因序列提供一种转基因日本蛇根草。

本发明技术方案中涉及的概念具体内容如下：

本发明所说的日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因的DNA分子包括：编码具有日本蛇根草异胡豆苷合成酶活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第65-1126位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第65-1126的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第65-1126位的核苷酸序列。

本发明分离出的日本蛇根草异胡豆苷合成酶多肽包括：具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。

本发明中的DNA分子包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

本发明中术语“日本蛇根草异胡豆苷合成酶(或多肽)基因”指：编码具有日本蛇根草异胡豆苷合成酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中第65-1126位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框第65-1126位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中第65-1126位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ IDNO.1中从核苷酸第65-1126位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQID NO.1中从核苷酸第65-1126位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。还包括能编码具有与天然的日本蛇根草异胡豆苷合成酶相同功能的蛋白的SEQ ID NO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

本发明中术语“日本蛇根草异胡豆苷合成酶蛋白或多肽”指：具有日本蛇根草异胡豆苷合成酶活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与天然日本蛇根草异胡豆苷合成酶相同功能的SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括日本蛇根草异胡豆苷合成酶的活性片段和活性衍生物，还包括能够可操作地连于信号肽、启动子或者核糖体结合位点序列所组成的衍生物。

本发明的日本蛇根草异胡豆苷合成酶多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与日本蛇根草异胡豆苷合成酶DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用日本蛇根草异胡豆苷合成酶多肽的血清获得的多肽或蛋白。

本发明中日本蛇根草异胡豆苷合成酶保守性变异多肽指：与SEQ ID NO.2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

表1.保守性变异多肽中的取代残基：

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala (A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg (R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn (N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp (D)	Glu	Glu
			Cys (C)	Ser	Ser
Gln (Q)	Asn	Asn
			Glu (E)	Asp	Asp
Gly (G)	Pro；Ala	Ala
			His (H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile (I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu (L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys (K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met (M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe (F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
			Thr (T)	Ser	Ser
Trp (W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr (Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val (V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还包括日本蛇根草异胡豆苷合成酶或多肽的类似物。这些类似物与天然异胡豆苷合成酶多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。所述修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的日本蛇根草异胡豆苷合成酶多肽时，可以将日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，从而形成日本蛇根草异胡豆苷合成酶表达载体。所述“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

本发明中宿主细胞为原核细胞或者真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌；常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。

本发明还可用Northern印迹法技术分析日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因产物的表达，即分析日本蛇根草异胡豆苷合成酶的RNA转录物在细胞中的存在和数量。

此外，本发明中可用作探针的核酸分子通常具有日本蛇根草异胡豆苷合成酶核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码日本蛇根草异胡豆苷合成酶的核酸分子。

本发明涉及检测样品中是否存在日本蛇根草异胡豆苷合成酶核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于日本蛇根草异胡豆苷合成酶核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。此外，根据本发明的日本蛇根草异胡豆苷合成酶核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选日本蛇根草异胡豆苷合成酶源基因或同源蛋白。

为了得到与日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因相关的日本蛇根草cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选日本蛇根草cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用³²P对日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自日本蛇根草的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别与日本蛇根草异胡豆苷合成酶的基因家族的核苷酸序列。

本发明的日本蛇根草异胡豆苷合成酶核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-PhasePeptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。利用本发明的日本蛇根草异胡豆苷合成酶，通过各种常规筛选方法，可筛选出与日本蛇根草异胡豆苷合成酶发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮剂等。

本发明提供的异胡豆苷合成酶基因是首次从日本蛇根草中克隆制备的，可以通过基因工程技术用来提高日本蛇根草等植物中喜树碱的含量，转基因结果显示，日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因对促进喜树碱含量的提高有明显作用，日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因可用于利用转基因技术来提高喜树碱含量的研究和产业化中，尤其可用于中药材日本蛇根草(或喜树)的品质改良，对于缓解喜树碱药源严重匮乏问题具有较好的促进作用，因此本发明具有很好的应用前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1(日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因的克隆)

1.组织分离(isolation)

日本蛇根草植株来源于福建，采取幼嫩根后立即置于液氮中冷冻保存。

2.RNA的分离(RNA isolation)

取部分组织用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

3.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)

根据长春花，萝芙木及其它已克隆得到的异胡豆苷合成酶氨基酸保守序列，设计简并引物，利用同源性基因克隆原理，采用Smart-RACE方法(Clonetech试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：

(1)3′-RACE

PCR(UPM+F2)得到OjSTR F2’(766bp)，回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，结果表明其核酸序列及编码蛋白与已知异胡豆苷合成酶基因(如短小蛇根草异胡豆苷合成酶基因等)的同源性很高，故初步认为它是一个异胡豆苷合成酶基因。

(2)5′-RACE

根据3′RACE结果，设计反向特异引物R2，经PCR(UPM+R2)得到OjSTR R2′(492bp)(过程同(1))。回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。将测序结果与3′RACE结果比序并进行拼接，得到全长片段序列。

(3)将5′RACE测序结果与3′RACE测序结果比序并进行拼接，得到全长片段序列信息，并设计一对特异引物OjSTRKF1：5′-ATGGGTAGTTCAGAAGCCATGG-3′(SEQ ID NO.3)和5′-TCAGAAAGAAGAAAATTCCTTG-3′OjSTRKR1(SEQ ID NO.4))进行PCR扩增OjSTR编码区得到OjSTR编码区(1062bp)(过程同步骤(1))。

BLAST的结果证明从日本蛇根草中新得到的基因确为一个异胡豆苷合成酶基因。研究表明异胡豆苷合成酶基因对于萜类吲哚生物碱如长春碱等的代谢合成具有重要影响，故推测新克隆的基因具有相似的功能。

通过组合使用上述3种方法，获得了候选的日本蛇根草OjSTR蛋白的全长编码序列。在拼接得到全长(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物OjSTRF1：5′-TTTGTTTCTCCAAATTCAAATAAG-3′为正向引物，寡核苷酸OjSTRR1：5′-GACAATGAAAAGTAACATTTTATTT-3′为反向引物，以总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，F1/R2的PCR条件为94℃5分钟，随之以94℃1分钟、60℃1分钟和72℃2分钟进行35个循环，最后以72℃延伸10分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为1097bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序，获得SEQ ID NO.1所示的序列。

实施例2(日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因的序列信息与同源性分析)

本发明新的日本蛇根草异胡豆苷合成酶全长cDNA的长度为1258bp，详细序列见SEQ ID NO.1，其中开放读框位于65-1126位核苷酸。根据全长cDNA推导出日本蛇根草异胡豆苷合成酶的氨基酸序列，共353个氨基酸残基，分子量39.3KD，pI为5.7，详细序列见SEQ ID NO.2。

将日本蛇根草异胡豆苷合成酶的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与短小蛇根草STR基因(GenBank Accession No.AB060341)具有95％的同源性(见表2)；在氨基酸水平上，它与短小蛇根草STR(GenBank Accession No.BAB47180)的第1-353位氨基酸残基有94％的相同性和96％的相似性(见表3)。由上可见，日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因与短小蛇根草异胡豆苷合成酶基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。故可以认为日本蛇根草异胡豆苷合成酶在提高资源植物中喜树碱的含量上具有显著促进作用。

表2.本发明的日本蛇根草OjSTR与短小蛇根草(O.pumila)OpSTR的核苷酸序列的同源比较(GAP)表

其中：Query表示日本蛇根草OjSTR的核酸序列；Subject表示短小蛇根草OpSTR的核酸序列(GenBank Accession No.AB060341)。

结果：在1250个核苷酸的比对中两者有95％的相似性。

表3.本发明的日本蛇根草OjSTR与短小蛇根草OpSTR氨基酸序列的同源比较(FASTA)表

其中：Query表示日本蛇根草OjSTR的氨基酸序列；Subject表示短小蛇根草OpSTR的氨基酸序列(GenBank Accession No.BAB47180)；相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。

结果：在353个氨基酸的比对中，两者分别有94％的相同性和96％的相似性。实施例3(日本蛇根草异胡豆苷合成酶或多肽在大肠杆菌中进行原核表达及提纯)

在该实施例中，将全长的日本蛇根草OjSTR编码序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以表达和提纯重组蛋白。

1、原核表达载体的构建以及转化大肠杆菌

根据日本蛇根草OjSTR的核苷酸序列，设计扩增出蛋白编码区的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pET32a(+)载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将日本蛇根草OjSTR基因在保证阅读框正确的前提下克隆至pET32a(+)载体(Novagen)。鉴定好的表达载体利用CaCl₂方法转入大肠杆菌BL21，筛选鉴定得到含有pET32a(+)-OjSTR表达载体的工程菌BL21-pET32a(+)-OjSTR。

2、表达Trx-OjSTR重组蛋白的工程菌的分离鉴定

挑取单菌落的BL21-pET32a(+)-OjSTR工程菌于3mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1∶100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中培养约3小时，至OD₆₀₀达0.5后，加入IPTG至终浓度1mmol/L继续于37℃分别培养0，1，2，3小时。取培养时间不同的1mL菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上样缓冲液50μL，蒸馏水45μL，二巯基乙醇5μL)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，上清加入12％SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达Trx-OjSTR融合蛋白的工程菌。

3、Trx-OjSTR融合蛋白的提取纯化及酶活性验证

按上述方法诱导表达Trx-OjSTR融合表达蛋白的工程菌BL21-pET32a(+)-OjSTR，经离心沉淀收集菌体，并根据厂家(Novagen)的说明书以BugBuster试剂和Benzonase核酸酶来纯化包涵体。包涵体可用溶解缓冲液(50mM CAPS，pH 11.0，0.3％N-lauroylsarcosine)来溶解，再用透析缓冲液(200mM Tris-HCl，pH8.5)来透析。然后用组氨酸结合(His·Bind)树脂进行亲和层析，并经洗脱缓冲液(1M imidazole，500mM NaCl，20mM Tris-HCl pH 7.9)洗脱来收集Trx-OjSTR融合蛋白。融合蛋白经肠激酶20℃酶切16小时后即可分离获的OjSTR的表达蛋白。此表达蛋白分子量为39.3KD，pI为5.7。按Yamazaki等(Phytochemistry，2003，62：461-470)的方法对表达纯化的日本蛇根草异胡豆苷合成酶蛋白进行酶活力的测定。结果表明，表达的蛋白的确具有催化色胺(Tryptamine)与裂环马钱子苷(Secologanin)生成异胡豆苷的酶活性。

实施例4(日本蛇根草异胡豆苷合成酶或多肽在日本蛇根草或喜树中进行真核细胞表达及转基因发根中喜树碱含量测定)

含目的基因(日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因)的表达载体的构建，根据日本蛇根草异胡豆苷合成酶的全长序列(SEQ ID NO.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因cDNA克隆到双元表达载体(如pBI121)，将其转入农杆菌中，遗传转化资源植物日本蛇根草或喜树。利用发根农杆菌Ri质粒介导的日本蛇根草(或喜树)的遗传转化：

1)发根农杆菌ATCC15834。使用前自冰箱取出，传代2次，传代用固体培养基为YEB培养基。菌种在使用前接种于YEB液体培养基中，28℃培养过夜。

2)生长8周左右的日本蛇根草无菌嫩叶片(或喜树下胚轴)。

3)经过夜培养的菌液，用转化液稀释为100个细菌/mL。取无菌日本蛇根草叶片，用无菌的解剖刀划以“+”字形伤口，放入上述转化中，60rpm/min振荡培养8h取出，用无菌水冲洗3次，放入含250-500mg/L卡那霉素和不同浓度6-BA(0.5mg/L-3mg/L)的B5培养基中，每2周转移到新鲜培养基中1次，待长出毛状根后分离毛状根，转移至含250-500mg/L卡那霉素无激素的B5培养基中培养，转移4-5次直至无细菌为止，然后再转移至不含卡那霉素的无激素B5培养基中培养。

4)把在固体培养基中的毛状根的继代培养物，接种于装有100mL无激素B5，培养基的500mL三角瓶中，培养温度、光照、转速等培养条件与愈伤组织液体悬浮培养条件相同，培养20天，将毛状根从培养基上取出放入冷冻干燥机中进行干燥，然后称重，贮存于-70℃备用。

5)含日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因的转基因发根的喜树碱含量测定按Yamazaki等(Phytochemistry，2003)的方法对表达日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因的转基因发根进行喜树碱含量测定。结果表明，在表达日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因的转基因发根中喜树碱含量比非转基因对照提高了2.1倍(P＜0.05)。因此转基因结果证明，日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因对促进喜树碱含量的提高有明显作用，日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因可用于利用转基因技术来提高喜树碱含量的研究和产业化中，具有很好的应用前景。

核苷酸序列表

Claims (9)

1.一种日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因，其特征在于：所述基因具有以下核苷酸序列之一：

1)具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

2)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列；

3)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列等位基因及其衍生的核苷酸序列。

2.一种权利要求1所述的日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因编码的蛋白质，其特征在于：

1)所述蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；

2)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。

3.一种质粒，其特征在于：所述质粒含有权利要求1所述的日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因全序列或部分片段。

4.一种植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体含有权利要求1所述的日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因全序列或部分片段。

5.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞含有本发明的日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因序列。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞、长春花细胞、喜树细胞或日本蛇根草细胞。

7.一种权利要求1所述的日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因的应用，其特征在于：用权利要求4所述的植物表达载体转化日本蛇根草细胞或喜树细胞。

8.一种权利要求1所述的日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因的应用，其特征在于：用权利要求7所述的农杆菌细胞与日本蛇根草细胞或喜树细胞共培养或者用所述的日本蛇根草细胞或喜树细胞培育雄性不育植株。

9.一种权利要求1所述的日本蛇根草异胡豆苷合成酶基因的应用，其特征在于：用权利要求1所述的异胡豆苷合成酶基因序列提供一种转基因日本蛇根草。